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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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1. GEBIET DER ERFINDUNG:
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweisen
oder Identifizieren eines Bakteriums auf eine spezifische und doch
einfache Art und Weise durch Verwenden eines Bakteriophagen, in
welchen ein Lichtemissionsgen eingeführt wurde. Das Verfahren der
vorliegenden Erfindung kann als ein Mittel zum Messen oder Nachweisen
eines Bakteriums verwendet werden und ist besonders nützlich auf
Gebieten der Umwelt-, Nahrungsmittel- und medizinischen Anwendungen.
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2. BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN
STANDES DER TECHNIK:
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Es
existieren zahlreiche Tests zum Bestimmen der Anwesenheit und für die Identifizierung
des Typs eines Bakteriums. Die meisten dieser Verfahren schließen das
Kultivieren einer Probe, die ein unidentifiziertes Bakterium in
einem Medium (welches von einer Reihe an Typen sein kann) enthält; und
das nachfolgende Beobachten der Kultureigenschaften, morphologischen
Eigenschaften, biologischen Eigenschaften, der Empfindsamkeit bezüglich Antibiotika,
der Absorption verschiedener Farbstoffe, serologischen Eigenschaften
etc. des unidentifizierten Bakteriums ein. Solche gewöhnlichen
Verfahren benötigen
jedoch die Selektion von Medien und Ähnliches, um das selektive
Wachstum eines relevanten Bakteriums zu bewirken, während das
Wachstum irrelevanter Bakterien verhindert wird. Wegen solcher Anforderungen
können
gewöhnliche
Verfahren eine bemerkenswerte Zeit benötigen, um einen relevanten organischen
Körper
(Bakterium) nach der Isolierung des Bakteriums zu identifizieren.
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Um
die zuvor genannten Probleme zu lösen, wurden Verfahren entwickelt,
die die Anwesenheit von Bakterien durch das Einführen eines fremden Gens zur
Herstellung eines Proteins, das eine nachweisbare Funktion exprimiert,
in ein Bakterium und indem dem eingeführten Gen ermöglicht wird,
exprimiert zu werden, so dass das Bakterium basierend auf der exprimierten
Funktion nachgewiesen werden kann, nachweisen.
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Gewöhnliche
Bakteriennachweisverfahren, die biologische Lichtemission nutzen,
erreichen die Lichtemission typischerweise durch Verwendung eines
Enzyms, das als Luciferase bekannt ist, und seines Substrates, Luciferin,
um zwischen diesen eine Reaktion zu ermöglichen in der Anwesenheit
von Adenosintriphosphat (ATP) bakteriellen Ursprungs. Gemäß solcher
gewöhnlicher
Verfahren wird eine Reaktionslösung,
in welcher Luciferase und Luciferin vermischt sind, zubereitet;
nachdem eine Probe (z. B. Fleisch) zerkleinert ist, wird die Reaktionslösung zu dem
zerkleinerten Material hinzugefügt
oder es wird nach dem Zerkleinern ein Extrakt gewonnen. Falls die
Probe ein Bakterium enthält,
kann Lichtemission beobachtet werden, da das Adenosintriphosphat (ATP),
welches in dem Bakterium enthalten war, aus dem Bakterium während dem
Zerkleinern herauslecken wird, so dass die Wirkung des leckenden
ATPs einer Lichtemission ermöglicht,
in der Reaktionslösung
zu geschehen. Das fragliche Bakterium kann durch das Nachweisen
der Intensität
der Lichtemission nachgewiesen werden (siehe Japanische Offenlegungsschrift
Nr. 5-30997). Dieses Messsystem kann jedoch auch jedes ATP messen,
das von anderen Zellen als dem Bakterium, welches verdächtigt wird, in
der Probe anwesend zu sein, stammt. Als ein Ergebnis gibt es Probleme
mit Fehlnachweismöglichkeiten
und substanzieller Verschlechterung der Sensitivität.
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Auf
der anderen Seite sind auch Verfahren bekannt, die einen Schritt
des Einführens
eines Gens, welches Luciferase exprimiert, in einen Vektor, z. B.
einen Bakteriophagen, und einen Schritt des Infizierens eines Bakteriums
mit diesem Virus einschließt.
Gemäß diesem
Verfahren wird Luciferin nach der Einführung des Gens von der Außenseite des
Bakteriums auf eine invasive Art und Weise eingeführt und
Lichtemission wird durch eine enzymatische Reaktion bewirkt unter
Verwendung des ATPs in der Zelle. Das fragliche Bakterium kann nachgewiesen
werden durch Nachweisen der Intensität der Lichtemission (siehe
Japanische Veröffentlichung nach
der Prüfung
(KOKOKU) Nr. 6-34757). Diese Technik wird unausweichlich alle oder
einige der sich in der Untersuchung befindenden Zellen zerstören, da
das Einführen
von Luciferin durch ein Verfahren erreicht wird, welches für die bakteriellen
Zellen invasiv ist. Folglich ist diese Technik nicht genau zufrieden
stellend hinsichtlich Fehlnachweismöglichkeiten und der Verschlechterung
der Sensitivität.
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Die
WO-A-8504189 offenbart ein Verfahren zum Nachweisen von Bakterien
unter Verwendung eines Bakteriophagen, der mit einem fluoreszierenden
Mittel gekoppelt ist. Die Bakterien sind, wenn sie eine Konjugatphase
mit dem mit dem fluoreszierenden Mittel gekoppelten Bakteriophagen
bilden, wegen dem mit dem Bakteriophagen gekoppelten fluoreszierenden
Mittel nachweisbar. Die Bakterien emittieren kein Licht, da der
Sichtbarmacher der Bakteriophage ist, der mit dem fluoreszierenden
Mittel gekoppelt ist.
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Hennes
K. P. et al., in Appl. Environ. Microbiol., Bd. 61, Nr. 10, 1995,
Seiten 3623-3627,
offenbaren ein Verfahren zum Nachweisen spezifischer Bakterienstämme unter
Verwendung eines Bakteriophagen, dessen DNS mit einem Farbstoff
fluoreszenzgefärbt
ist.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Nachweisen oder
Identifizieren eines Bakteriums für die Messung gemäß Anspruch
1, einschließend
die folgenden Schritte: Es einem Bakteriophagen ermöglichen,
an das Bakterium zu binden, wobei der Bakteriophage in der Lage ist,
spezifisch an das Bakterium zu binden und in dem Bakterium zu wachsen,
wobei ein Gen in dem Bakteriophagen, welcher ein Lichtemissionsprotein
exprimiert, in das Bakterium eingeführt wird, so dass ein Protein
in dem Bakterium als ein Produkt des Gens hergestellt wird; und
Bereitstellen von Licht auf eine nicht-invasive Art und Weise von
der Außenseite
des Bakteriums, wobei nur das tatsächlich vorhandene Bakterium
dazu gebracht wird, Licht auf eine spezifische Art und Weise zu
emittieren.
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Gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung kann eine Lichtemissionsreaktion ohne
Zerkleinern oder anderweitige Beschädigung eines Bakteriums bewirkt
werden, so dass die Lichtemissionsreaktion nur innerhalb des Bakteriums
geschieht. Demgemäß wird eine
bakterielle Messung erreicht, welche im Wesentlichen frei von Fehlnachweismöglichkeiten
ist und welche eine hohe Sensitivität bereitstellt. Als ein Ergebnis
ermöglicht
das Ver fahren gemäß der vorliegenden
Erfindung den Nachweis oder die Identifikation eines Bakteriums
auf eine schnelle und spezifische Art und Weise, ohne dass komplizierte
Vorgänge
benötigt
werden.
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Insbesondere
wird es möglich,
indem ein Protein, das nicht irgendein Substrat für die Lichtemission
benötigt
(d. h. grün
fluoreszierendes Protein), als ein Lichtemissionsprotein genommen
wird, die invasive Einführung
eines äußeren Faktors
von der Außenseite
des Bakteriums, was ein problematischer Schritt ist, der mit gewöhnlichen
Verfahren verbunden ist, die ein Luciferase-Luciferin-System benutzen,
zu vermeiden.
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Folglich
macht die hierin beschriebene Erfindung den Vorteil möglich, ein
Verfahren zum Nachweisen oder Identifizieren einer Bakterienart
in einer Probe auf eine spezifische, hochsensitive, schnelle und
sichere Art und Weise bereitzustellen, wobei das Verfahren das Bereitstellen
eines äußeren Faktors (d.
h. Licht) für
die Bakterienzelle auf eine nichtinvasive Art und Weise involviert,
so dass der äußere Faktor
eine Lichtemissionsreaktion induziert.
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Dies
und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für Fachleute
offensichtlich werden nach dem Lesen und Verstehen der folgenden
detaillierten Beschreibung mit Bezugnahme auf die begleitenden Figuren.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die
Zeichnung ist eine Grafik, die Nachweisergebnisse für Salmonella
typhimurium beschreibt.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
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Das
Verfahren zum Nachweisen oder Identifizieren eines Bakteriums für die Messung
gemäß der vorliegenden
Erfindung schließt
ein: (Bindungsschritt) es einem Bakteriophagen (auf den hierin anschließend auch
einfach Bezug genommen wird als ein „Phage") ermöglichen, an ein Bakterium zu
binden, um ein Gen in dem Phagen für die Expression eines Lichtemissionsproteins
dazu zu bringen, in das Bakterium eingeführt zu werden; und (Lichtemissionsschritt)
Bereitstellen von Licht von der Außenseite des Bakteriums, um
nur das Bakterium von Interesse dazu zu bringen, Licht auf eine
spezifische Weise zu emittieren. Spezifisch wird in dem Bindungsschritt
ein Bakterium mit einem Bakteriophagen infiziert, der ein Gen einschließt, das
für ein
Lichtemissionsprotein kodiert. Der Bindungsschritt kann weiterhin
einen Schritt einschließen,
der es dem für
die Infektion verwendeten Phagen ermöglicht, in der Wirtszelle zu wachsen,
wobei das Gen, das für
das Lichtemissionsprotein kodiert, amplifiziert werden kann. Der
für die
Infektion verwendete Phage kann gewöhnlich bis zu wenigstens ungefähr 102 bis
ungefähr
104 Phagenpartikel/Bakterienzelle wachsen,
bis zu einem Spiegel, der knapp unter dem liegt, wo die Zerstörung der
bakteriellen Wirtszelle geschehen würde. Demgemäß kann das Gen, das für das Lichtemissionsprotein
kodiert, um wenigstens ungefähr
102- bis ungefähr 104 -mal
amplifiziert werden. Das Bakterium von Interesse kann in dem nachfolgenden
Lichtemissionsschritt nachgewiesen werden, wo dem Lichtemissionsprotein,
welches von diesem Gen erzeugt wird, ermöglicht wird, Fluoreszenzlicht
zu emittieren.
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Bakterien,
die mit dem Verfahren der Erfindung nachgewiesen werden, sind: Salmonella,
Pseudomonas und E. coli.
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Beim
Umsetzen der vorliegenden Erfindung in die Praxis ist es wünschenswert,
einen Phagen mit Eigenschaften auszuwählen, dergestalt, dass er spezifisch
an ein ausgewähltes
Bakterium für
die Messung binden (wie oben beispielhaft ausgeführt) und darin wachsen. Phagen,
die spezifisch an bestimmte Bakterien für die Messung binden, d. h.
spezifische Phagen-Bakterium-Kombinationen, sind im Stand der Technik
bekannt.
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Nützliche
Phagen sind zum Beispiel erhältlich
von dem American Type Culture Collection (ATCC). Die Details erhältlicher
Stämme
sind offenbart in „Catalogue
of Bacteria & Bacteriophages", veröffentlicht
von dem ATTC.
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Natürlich vorkommende
Bakteriophagen, die in der Erfindung verwendet werden, sind die
folgenden Bakteriophagen: T4, P2, T2, T7, λ, PM2, Φ X174, MS2, Φ6, FELIX01.
Für jeden
dieser Phagen ist von einem Bakterium bekannt, dass es spezifisch
an den Phagen bindet. Zum Beispiel sind T4-, P2-, T2-, T7-, λ -, ΦX174- und
MS2-Phagen beispielhafte Phagen, die für das Nachweisen von Enterobacteriaceae,
z. B. E. coli, wünschenswert
sind. Φ6-
und PM2-Phagen sind beispielhafte Phagen, die wünschenswert sind für den Nachweis
von Pseudomanadaceae. FELIX01-Phage ist ein beispielhafter Phage,
der wünschenswert
ist für
den Nachweis von Salmonellae.
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Heterogene
DNS kann in einen Vektor unter Verwendung einer Anzahl von Verfahren
eingeführt werden.
Zum Beispiel kann ein Gen, das für
ein Protein kodiert, welches zur Lichtemission beiträgt, in die DNS
eines Bakteriophagen unter Verwendung eines Verfahrens, das Fachleuten
bekannt ist, eingeführt werden.
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Ein
Verfahren für
das Infizieren eines Bakteriums mit einem Bakteriophagen kann unter
gewöhnlichen
Infektionsbedingungen, die im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt werden.
Da die Phageninfektion stark stammspezifisch oder speziespezifisch
ist, bestimmt die Art des Phagen allgemein, ob ein Zielgen (DNS)
in eine gegebene Bakterienzelle eingeführt werden kann oder nicht.
Etliche Phagen können
eine Anzahl von Bakterienarten, die eng verwandt sind, infizieren.
Eine Vielzahl von Phagen sind jedoch bekannt dafür, dass sie Stämme von
nur einer Art infizieren. Deswegen wird es möglich durch das Auswählen eines
bestimmten Phagen hinsichtlich solcher bekannter Infektionsspektren
von Phagen, spezifisch einen bestimmten Stamm oder eine bestimmte
Bakterienart zu identifizieren, die in einer Probe anwesend sein
könnte.
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Einem
Zielbakterium wird ermöglicht,
durch Bakteriophageninfektion einen Vektor aufzunehmen, der eine
DNS einschließt,
welche für
ein Lichtemissionsprotein kodiert. Indem dem Lichtemissionsprotein ermöglicht wird,
exprimiert zu werden, kann nur das Zielbakterium, welchem das Protein
verliehen worden war, selektiv nachgewiesen werden. Als ein Lichtemissionsprotein
wird grünes
fluoreszierendes Protein (green-fluorescent protein) (GFP) verwendet.
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GFP
ist ein Lichtemissionsprotein, das in Aequorea victorea erzeugt
wird. GFP benötigt
nicht irgendein Substrat, um seine Lichtemissionsfunktion auszuüben. Ein
Gen, das GFP kodiert, wurde aus Aequorea victorea kloniert, und
es ist bekannt, dass es ein Protein mit einem Molekulargewicht von 26.900
ist und aus 238 Aminosäuren
besteht. In dem Körper
einer Aequorea victorea geschieht grüne Fluoreszenz als Antwort
auf blaue Fluoreszenz, welche wiederum von einem anderen Lichtemissionsprotein, das
Aequorin genannt wird, erzeugt wird. Das Exzitationsspektrum hat
einen Gipfel bei ungefähr
508 nm. Die Lichtemission kann durch das Strahlen von Exzitationslicht
mit einer geeigneten Wellenlänge
auf eine transformierte Zelle, zum Beispiel E. coli, oder auf Hefen,
die transformiert worden sind, um GFP zu enthalten, erzielt werden.
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In
einem Gen, das ein Lichtemissionsprotein exprimiert, kann das Strukturgen,
welches für
das Lichtemissionsprotein kodiert, ein natürlich vorkommendes Gen oder
ein synthetisches Gen sein.
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Der
Nachweis eines Bakteriums, das dazu gebracht wird, Licht auf die
zuvor genannte Art und Weise zu emittieren, kann unter Verwendung
jeder bekannter Mittel wie einem Photometer, einem Chemilumineszenzlesegerät, einem
Luminometer oder Ähnlichem
erreicht werden. Solche Vorrichtungen können verwendet werden, um die
Photonenmenge zu messen, die in einer Lichtemissionsreaktion erzeugt
wird. Es ist auch möglich,
das Aussetzen an einen hochsensitiven Film (z. B. „611" oder „667" erhältlich von
Polaroid; „Hyper
Film MP", erhältlich von Amersham;
oder „Röntgenfilm
RX", erhältlich von Fuji
Film) zu nutzen oder einen Bildanalysevorgang zu nutzen, der eine
hochsensitive Videokamera verwendet.
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Gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung wird ein Gen, das für GFP kodiert, in einen Bakteriophagen
eingebaut, der in der Lage ist, spezifisch an ein Bakterium für die Messung
zu binden und darin zu wachsen. Der Phage wird dann mit dem Bakterium
für die
Messung bei einer geeigneten Temperatur (10° C bis 40° C) vermischt, um dem Pha gen zu
ermöglichen,
das Bakterium zu infizieren. Danach wird der äußere Faktor eingeführt, um
den Nachweis des Bakteriums für
die Messung zu ermöglichen.
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Gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung ist es nicht nur möglich, die Anwesenheit oder
das Fehlen eines Zielbakteriums nachzuweisen, sondern es ist auch
möglich,
ein Zielbakterium basierend auf Photonenmengenmessungen zu quantifizieren,
indem eine Standardkurve geschaffen wird, welche die Beziehung zwischen
der Bakterienkonzentration und den entsprechenden Photonenmengen,
die nachgewiesen werden, erläutert.
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Hierin
anschließend
wird ein Verfahren zum Nachweisen eines Bakteriums unter Verwendung
eines grün
fluoreszierenden Proteins (GFP) als ein Lichtemissionsprotein erläutert werden
als ein spezifisches Beispiel der vorliegenden Erfindung. In dem folgenden
Beispiel wurde der FELIX01-Bakteriophage verwendet, um Salmonella
typhimurium (Stamm SL1027) zu messen, an welchen der FELIX01-Bakteriophage
spezifisch bindet. Es wird geschätzt
werden, dass das folgende Beispiel nur von erläutender Art ist und in keiner
Weise den Schutzumfang der Erfindung begrenzt.
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Beispiel
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1. Medium
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Ein
Nährmedium
(„Nutrient
Broth No. 2", erhalten
von Yashima Pharmaceuticals) wurde für die Kultivierung der Bakterien
verwendet. Für
das Zubereiten einer Bakteriophagenlösung wurde das Nährmedium
mit 0,15 g/L CaCl2 ergänzt. Der pH-Wert der mit CaCl2 ergänzten
Nährlösung wurde
auf 7,0 eingestellt. Die Kultivierung und Titrierung des Bakteriophagen
wurde auf einem Agar-Medium (erhalten durch Hinzufügen von
1,5 % Agar zu dem Nährmedium)
durchgeführt.
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2. Bakterien
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S.
typhimurium (Stamm SL1027) wurde von dem American Type Culture Collection
(ATCC) erhalten.
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3. Zubereitung von Bakteriophagen-Stammlösungen
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Dem
FELIX01-Bakteriophagen (erhalten von B. A. D. Stocker, Stanford
University, Stanford, Calif.) wurde ermöglicht, S. typhimurium (Stamm
SL1027) zu infizieren und darin zu wachsen, indem der infizierte
Stamm auf der Oberfläche
des Nähragarmediums
kultiviert wird. Der Phage wurde geerntet, indem die Oberfläche des
Mediums mit 0,005 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) geflutet wurde
und der Puffer gesammelt wurde. Die Bakterien und Agarbruchstücke wurden
durch Zentrifugation bei 15.000 X g für 30 Minuten bei 0° C entfernt.
Der Bakteriophage wurde dann in einem Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradienten (1,7
und 1,5 g/cm3) durch Zentrifugation bei
62.000 X g für
90 Minuten bei 15° C
konzentriert. Die Bakteriophagenbande, wie durch Ultraviolettbestrahlung
sichtbar gemacht, wurde durch die Seite des Polyallomer-Zentrifugations
röhrchens
mit einer Nadel, die an einer Spritze befestigt war, entfernt. Das
CsCl wurde durch Übernachtdialyse
gegen 0,005 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) entfernt.
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4. Zubereitung der FELIX01-Bakteriophagen-DNS
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Ein
Kit, bezeichnet als ssPHAGETM DNA SPIN Kit
(BIO 101), welcher für
die Isolierung einzelsträngiger
DNS unter Verwendung eines PEG-Fällungsverfahrens
vorgesehen ist, wurde verwendet, um DNS aus den zuvor genannten
Bakteriophagen-Stammlösungen
zu isolieren. Unter Verwendung der resultierenden einzelsträngigen DNS
als eine Matrix wurde eine PCR-Reaktion durchgeführt mit einem Zufallsprimer,
wobei doppelsträngige
Bakteriophagen-DNS erhalten wurde.
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5. Einfügen eines
GFP-Gens in FELIX01-Bakteriophagen-DNS
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Die
auf die zuvor genannte Art und Weise erhaltene FELIX01-Phagen-DNS
wurde mit einem Restriktionsenzym HindIII verdaut. Ein Genfragment (ungefähr 1,1 kb)
von GFP (abgeleitet aus Aequorea victorea), das ebenfalls mit HindIII
verdaut worden war, wurde mit dem FELIX01-Phagen-DNS-Fragment ligiert.
Folglich wurde eine rekombinante Phagen-DNS geschaffen, die das
GFP-Gen enthält.
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6. Produktion von FELIX01-Phagenpartikeln,
die das GFP-Gen enthalten
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Es
wurden aus der zuvor genannten rekombinanten Phagen-DNS Phagenpartikel
erhalten unter Verwendung eines in-vitro-Verpackungsverfahrens, welches
das Hinzufügen
von DNS zu einer bakteriellen Virus-Protein-Mischung einschließt, um infektiöse Phagenpartikel
in einem Teströhrchen
zu erhalten (Molecular Biology of the Gene, James D. Watson et al.
1988). Den resultierenden Phagenpartikeln wurde ermöglicht,
zu wachsen, und wurden auf die in Abschnitt 3 (Zubereitung von Bakteriophagen-Stammlösungen)
beschriebene Weise aufgereinigt. Teile der Bakteriophagenpartikel,
die nicht unmittelbar verwendet werden, wurden als ein aseptisches
Lysat in einem Reagenzglas gelagert, das über flüssigem Stickstoff angeordnet
wurde, und bei einer niedrigen Temperatur aufhewahrt.
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7. Infektion von S. typhimurium
(Stamm SL1027) mit den Phagenpartikeln
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S.
typhimurium (Stamm SL1027) wurde mit FELIX01-Phage, der das GFP-Gen
enthält,
in einem Nährmedium
infiziert. Genauer, es wurden 10 ml Medium in einen 125 ml Erlenmeyerkolben
gegeben. Dieses Medium wurde mit S. typhimurium (Stamm SL1027) geimpft
und dann inkubiert, so dass die Bakterien zu ungefähr 104 bis 106 Zellen/ml
wachsen, unter Schütteln
des Kolbens in einem Wasserbad bei ungefähr 37° C. Dann wurden in denselben
Kolben Phagenpartikel zu einer Konzentration von ungefähr 3 × 108 PFU/ml hinzugefügt. Als eine Kontrolle wurde ein
Kolben, der nicht irgendeinen S. typhimurium (Stamm SL1027) enthält, demselben
Vorgehen ausgesetzt.
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Diese
Kolben wurden durch Schütteln
bei 200 rpm in einem Wasserbad (ausgestattet mit einem Schüttler) bei
ungefähr
37° C inkubiert.
Zwei Stunden später
wurde die Fluoreszenz der Nährlösung in
den Kolben gemessen.
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8. Messen der Lichtemission
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Aus
jeder Nährlösung wurde
eine 50 μl
Probe gesammelt, welche schrittweise auf Zellkonzentrationen verdünnt wurde,
die im Bereich von ungefähr
1 bis ungefähr
103 Zellen/ml liegen, und in Polystyrolküvetten gegeben.
Die Küvetten
wurden in einen tempe raturkontrollierten Küvettenhalter gegeben, der in
dem Messapparat bereitgestellt war, und spektrophotometrischer Messung
ausgesetzt. Unter Verwendung eines SLMAminco Bowman AB2 Fluoreszenzphotometers
(Fisher; Pittsburgh, PA; Katalog Nr. 14385991F) wurde Fluoreszenz
in dem Bereich von ungefähr
490 bis ungefähr
520 nm mit einer Exzitationswellenlänge von ungefähr 396 nm
gemessen.
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Die
Fluoreszenz wurde sowohl für
den Kolben gemessen, der S. typhimurium (Stamm SL1027) enthält, als
auchfür
den Kolben, der S. typhimurium (Stamm SL1027) nicht enthält. Der
für den
Kolben, der S. typhimurium (Stamm SL1027) nicht enthält, erhaltene
Messwert, wurde als ein Hintergrund verwendet, der von dem Messwert
abgezogen wurde, der für den
Kolben erhalten wurde, der die kultivierte Probe enthielt. Die resultierenden
Werte, die Lichtemissionsmengen repräsentieren, wurden gegen die
Konzentration von S. typhimurium (Stamm SL1027) aufgetragen (gezeigt
in der Figur).
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Folglich
wurde gemäß der vorliegenden
Erfindung ein hochsensitives und hochzuverlässiges Verfahren zum Nachweisen
oder Identifizieren von Bakterien bereitgestellt.
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Unter
Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Bakterien
auf eine schnelle und spezifische Art und Weise nachzuweisen und
zu messen, ohne dass komplizierte Vorgänge benötigt werden.
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Zahlreiche
andere Modifikationen werden offensichtlich sein für und leicht
gemacht werden können
von Fachleuten, ohne vom Schutzumfang dieser Erfindung abzuweichen.