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CN1110571C - 细菌的检测方法及其检测器 - Google Patents

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Abstract

提供了一种极好的检测方法，通过简单而特异性地标记细菌本身，无需诉诸由可发酵底物的代谢等而引起的色调改变，就能够用鉴别法检测和检查细菌，该方法操作简单，检测时间短，检测效率高和检测准确度高。使核酸被荧光物质标记的噬菌体与宿主细菌接触，利用下列现象来判断特异性细菌的存在或不存在，即，荧光物质标记的核酸处于存在于噬菌体中的状态下的荧光强度显示出与荧光物质标记的核酸处于被注入细菌中的状态下的荧光强度具有显著差异。

Description

细菌的检测方法及其检测器
                      技术领域
本发明涉及检测如大肠杆菌等细菌的方法以及其中所用的检测器等。
                      背景技术
以细菌为代表的微生物存在于各种环境中，并且与人类的生活密切相关。但是，一些微生物造成人类或家畜的疾病。人们注意到这些病原微生物，以便预防它们对人和家畜的感染。尤其是属于病原微生物中的细菌繁殖迅速并且几乎不受环境条件、诸如低温、高温和干燥的影响，因此它们持久地存在于人体周围，并且一旦将它们暴露到适宜的条件下，其群体便极为迅速地增长，从而引起传染病。人们希望正确地保持对细菌的控制，所述的细菌不仅存在于通过食物和饮用水(包括自来水)直接摄入人体的水中，而且存在于与人体接触的水中，诸如用于食品生产过程中的水、用于洗涤餐具及其类似物的水、河水、湖水和沼泽地中的水、海水、池中的水、洗澡水、用于其它景色含水的休闲场所的休闲场所用水，以及与人类有机会接触的水(诸如污水和废水)。
在这些前提下，人们规定用于食品以及用作饮用水的自来水达到“检测不到大肠菌群”的标准，池水达到“当培养5个试管中的水样时，最多有2个试管中的10-ml水样为大肠菌群呈阳性”，同时人们规定用于景色含水的休闲场所中水的理想的标准值为“1ml中最多有10个细胞”，而对于普通的废水来说理想的标准值为“1ml中最多有3000个细胞”。
另外要指出的是，可以归结于细菌的传染病最常见的是由来源于人类和动物的细菌引起的，并且这些细菌易于带来广泛的灾难。因此，人们认为采用检验肠细菌(具体来说例如大肠杆菌和大肠菌群)存在或不存在的项目作为控制食品、饮用水或含水休闲场所设施中的休闲场所用水的标准是非常合理的。
同时，迄今为止通常通过培养的方法已经检测了食品、饮用水(自来水)、池水或用于景色含水的休闲场所中的水中的细菌。这种常规的培养方法需要一些方法，从而例如把大肠杆菌或大肠菌群与其它普通的细菌区分开来。因此在许多情况下，在测试期间将采用的检测方法中使用了其中可以选择性地增殖大肠杆菌或大肠菌群的培养基，或者使用其中采取了措施在增殖过程中改变其色调或显示出作为菌落颜色的特殊颜色的培养基。
另外要指出的是，除了前面的方法以外，还提出了一种其中简化了对大肠杆菌或大肠菌群的测试的具有特异性的酶-底物培养基方法，即以在底物存在的情况下培养样品的方式而设计的方法，其中的底物为仅仅包含在大肠杆菌或大肠菌群中的酶的底物，以便当所述细菌呈阳性时，显示出特有的颜色或荧光。
除这些方法以外，已知还有PCR法(聚合酶链式反应方法)，ATP测定法，使用放射性同位素等的方法(特开平8-154,700号)。
但是，前述的常规方法涉及到下面的问题。例如，前述的培养方法不仅要耗费时间通过培养来增殖细菌，而且判断增殖的细菌是否为大肠杆菌或大肠菌群的方法也很复杂。换言之，所述培养方法仅估计是否存在大肠杆菌或大肠菌群的污染就需要1天，决定污染物是否为大肠杆菌或大肠菌群需要2天，并且因为如果想要进行完整的检测时必须重复与细胞等的特殊染色有关的测试，因此判断要花很长的时间。
因此，按照培养方法检测细菌要花费很长的时间，从而在获得结果之前就会担心灾难出现和散布的情况。除前面的情况以外，由于培养方法通常为这样的一种方法，其中菌落在琼脂板或膜滤器上形成并且显示出的特殊性质可以用肉眼计数来定量测定、或者其中由阳性样品的最大稀释率来计算包含在最初样品中的细胞数目，因此判断显示出单一一种形式的菌落是相当含糊的。由最大稀释率确定细胞数目的方法仅仅可以提供一个大约的估算值，从而造成了不精确的定量测定的问题。
前述具有特异性的酶-底物培养基方法是很有益处的，这是因为大肠杆菌和大肠菌群的定量测定可以在24小时之内完成。但是，该方法并不能检测出所有的大肠杆菌和大肠菌群，并且如果需要的话，必须仅根据由在最大稀释率下呈阳性的数值来确定细胞数目的模式进行定量测定实验，这是由于测量方法产生的限制。
PCR方法尽管在灵敏度上很灵敏，但也带来了分辨不清地检测出实际上无害的死细胞的问题，并且就定量测定而言不能对该方法期望过高。
另一方面，ATP方法尽管在操作的简易性和具体地仅特异检测活细胞的可能性方面很优越，但是该方法的检测灵敏度很低(如果有不多于1000个细胞的话，便检测不到)，就应用的条件而言由于亮度易受外来因素的影响而受到了限制，并且该方法还有不能检测特定细菌的问题。
如以上在特开平8-154,700号中所提到的方法，包括一种其中使用以放射性同位素或酶标记的噬菌体的直接标记法以及一种测定由插入噬菌体中的报道基因所生产的蛋白质的方法。这些方法很优越，即考虑到对几乎所有作为其宿主的细菌来说都存在着在地球上普通的温和条件下生存着的特异的噬菌体，以及噬菌体在识别其各自的宿主时是非常严格的、以致于与除其各自的宿主细菌之外的细菌基本上不发生吸附和连接的事实，因此如果需要进行检测的话就可以选择性地检测某种细菌。
但是，在特开平8-154,700中提出的这种方法涉及到当考虑实际的工作情况时与处理的迅速程度、处理操作的简易性、检测准确度的水平等有关的以下一些非常难于解决的问题。
更具体来说，根据使用放射性同位素作为前者直接标记法的模式方法，来源于吸附到细菌上的噬菌体中的放射性同位素标记的信号无法与来源于没有吸附到细菌上的噬菌体中的同一标记的信号区别开，因此必须把吸附的噬菌体和没有吸附的噬菌体进行物理分离的操作。而且，即使进行了该分离操作，仍存在着对非特异性地吸附到细菌上(或者吸附到分离装置上、例如滤膜)的噬菌体计数的问题。除了这些情况以外，由于通过噬菌体吸附在细菌细胞上由注入细菌细胞中的噬菌体核酸的增殖造成的溶菌作用，结果还存在着不能进行精确测定的情况。另一方面，使用酶作为直接标记法的另一种模式方法不仅涉及到与使用放射性同位素的方法同样的问题，而且还涉及到在实际使用任意的检测方式由底物中产生的现象来精确地测定痕量的酶时极其困难的问题，这是因为该方法是一种其中使用了痕量酶的活性的方法。
另一方面，人们几乎不期望采用了报道基因的后一种方法的广泛使用，这是因为必须制备出针对特异于每种相应细菌的每种噬菌体的呈基因重组形式的报道基因，并且包括该报道基因在内的噬菌体核酸必须进行复制、转录和翻译，与此同时还需要进行检测所生产的蛋白质的操作。
如上所述，所有的常规方法都涉及到各自的问题。因此，尤其是在操作的迅速程度、简易性、检测准确度等方面还存在着亟待解决的问题。
本发明的发明人已经解决了前述现有技术方法中的问题以完成本发明，根据该方法，有可能无需借助于改变色调(例如由于可发酵底物的代谢)来简单并特异地标记细菌自身，从而就可以鉴别检测并测量细菌以便在操作简单、缩短测量时间、效率和检测准确度方面得到极大的改进。
                      发明详述
本申请为实现前述目的，提供了如在前述“权利要求书”部分中的各个权利要求中所记载的发明。
本申请第1项发明的细菌检测方法，其特征在于包括使核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体与宿主细菌接触，并且用光学检测装置检测注入了色素标记的核酸或荧光标记的核酸的细菌。
本申请第15项所述发明的细菌检测器的特征在于包括用于向样本液体(水样)中装入(加入)含有噬菌体的溶液的装置，和用于检测注入了色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌的光学检测装置，上述噬菌体的核酸被色素或荧光物质标记，并且对作为检测目标的细菌具有特异的吸附能力。
另外要指出的是，在下面的描述中，本文中使用的术语“荧光物质等”是指同时包括色素和荧光物质在内的通称，而本文中使用的术语“荧光物质标记的核酸等”是指同时包括色素标记的核酸和荧光物质标记的核酸在内的通称。
在前面的描述当中，噬菌体通常为具有由DNA(单链或双链)构建的基因的DNA噬菌体，但预期也不排除具有由RNA构建的基因的RNA噬菌体。因此，荧光物质标记的核酸等可以任意为DNA或RNA。通过在加入了对噬菌体核酸(下文称作“噬菌体DNA”)具有亲和力的荧光物质等(色素或荧光物质)的培养基中增殖用噬菌体感染的细菌，可以得到具有用荧光物质等标记的核酸的DNA噬菌体或RNA噬菌体。任何能够结合到噬菌体DNA上并通过噬菌体将其注入细菌中来对细菌染色或着色的底物都可以用作荧光物质等，而没有任何特殊的限制。上述色素的实例有溴化乙锭和碘酸丙锭(propidiumiodate)，而上述荧光物质的实例包括盐酸4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。在上述荧光物质中，那些在长波长侧具有吸收谱带的荧光物质也可以用作色素。使用以这种色素标记的噬菌体能够用显微镜、分光光度计或类似的仪器、而不是使用荧光检测器(例如荧光显微镜)进行检测。
在用荧光物质等标记噬菌体核酸的方法中任意使用荧光物质或色素时，实际上可以通过充分地利用亲和力把对核酸(DNA或RNA)具有亲和力的荧光物质等置于所述核酸的立体结构的空间当中，或者另外也可以在其合成的过程中把用荧光物质等标记的核苷酸引入噬菌体核酸中以便通过化学结合来进行标记。
用于检测的噬菌体溶液只要具有能够使所述噬菌体的至少一个粒子在预定时间内与包含在样本液体中的细菌接触的噬菌体浓度就足够了。尽管该水平随着包含在待测定的样本液体(如本文以前所提及的饮用水、休闲场所用水等)中的细菌细胞数目的水平、检测时间等变化，该浓度的水平不能不加选择地测定，但它仍然可以很容易地通过实验测定。举例来说，当在许多情况下要检测包含在饮用水中的大肠杆菌时，最好将该浓度设定在每毫升样本液体(水样)大约有105至1014个粒子的水平、优选为107至1014个粒子的水平、最合适为108至1012个粒子的水平。噬菌体溶液的噬菌体浓度的增加有利于增加多个噬菌体粒子与细菌接触的可能性，这不仅对于正在检测的单个细菌而言增加了色素的染色密度，而且增强了由单个细菌细胞发出的荧光的强度，从而可以进行更为精确的检测。当噬菌体浓度低于105个粒子/ml时，噬菌体与所述细菌接触的可能性会很低，以致于即使所述细菌存在时可能会需要很长的时间来测定、甚至于导致检测失败。另一方面，当噬菌体浓度增加到超过1014个粒子/ml时，样本液体的粘度增加并且背景荧光的强度增强，以致于带来了测量灵敏度下降的问题。因此最好把所述浓度设定在上述范围内。
一般说来，用噬菌体感染的过程(溶菌感染或溶原化)包括3个分开的步骤，即其吸附和连接到宿主细菌上、把噬菌体DNA注入宿主细胞中以及以注入的噬菌体DNA作模板复制噬菌体粒子。
在本发明中使用具有荧光物质标记的核酸等的噬菌体出于下面的理由：具体来说，当噬菌体如上所述特异地吸附到宿主细菌上时，把存在于噬菌体中的荧光物质标记的核酸等与注入细菌细胞中的核酸进行比较人们可推断与其密集地被包裹在噬菌体中的状态相比，本发明中所用的荧光物质标记的核酸等通过在已注入了所述核酸的细菌细胞中解折叠和铺展而发生了形态变化，结果正如例如随后将要描述的在参考实施例1和2的荧光物质的例子中所证实的，发现在检测的荧光强度方面造成了在光学上可以识别的显著性差异。着眼于这一发现，本发明的发明人通过充分地利用这一差别而不必对没有吸附到细菌上的噬菌体粒子进行物理分离的操作，从而完成了本发明，其特征在于在光学上仅仅区别并检测出具有其中注入了噬菌体DNA的细菌。
在本发明中应当注意的另一特征为注意到，吸附在细菌细胞上的噬菌体粒子把噬菌体DNA注入宿主细菌细胞中的过程在许多情况下取决于宿主细菌细胞的能量状态。更具体来说，噬菌体DNA(核酸)并不注入已经丧失了生物活性的宿主细胞中，而是仅仅注入活的细胞(活细胞)中。换言之，由于噬菌体DNA注入活细胞中，因此可以在光学上检测出这些活细胞，而死细胞或片段，尽管其上吸附了噬菌体，但其中没有噬菌体DNA注入，仍可以明确地区分出光学信息。本发明通过充分地利用噬菌体是否存在活性以及注入在光学上可以区别的现象区分出活细菌和死细菌，使用放射性同位素、酶等的常规方法是无法达到的、并且在处理操作的简化以及检测准确度的改进方面本发明是非常有利的。
即使噬菌体非特异地吸附到了细菌上，该噬菌体DNA也不注入该细菌中。因此，本发明的方法在高准确度检测的可能性方面是很突出的，其中仅检测出其中注入了噬菌体DNA的细菌。
而且，在通常条件下在用荧光物质等标记的噬菌体DNA中的基因的转录受到了抑制，基因的活性丧失。这是本发明应当注意的作用之一。更具体来说，本发明中使用的用荧光物质等标记的噬菌体DNA即使注入细菌细胞中，通常也不能复制任何新的噬菌体粒子并且不能形成一组通过破坏宿主细胞用来从细菌细胞中裂解出新形成的噬菌体粒子的酶，从而不会导致发生宿主细胞的溶解，而溶菌作用被认为是感染过程的最后阶段。这就会使得用荧光物质等标记的噬菌体DNA稳定地维持在宿主细胞中，从而带来了处理时间或长或短都会极小地影响到检测准确度的优点。另外要指明的是，当存在着取决于细菌的种类、环境条件、所使用的荧光物质等的种类等的噬菌体核酸发生转录的可能性时，可以进行任意的处理来积极地预防转录和复制。例如，向样本液体中加入DNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂或者将噬菌体基因的一部分变换成无义密码子将足以满足转录和复制能力丧失的要求。
针对前面的理由，根据本发明仅可以检测到给定细菌的活细胞，通过使用具有用荧光物质标记的核酸并对细菌具有特异的吸附能力的噬菌体使所述活细胞染上或者着上荧光。
通过在上面吸附具有荧光物质标记的核酸等的噬菌体并向其中注入所述核酸，能够用光学装置来检测被色素染过色或着过色的细菌。只要可以检测出色素荧光等，其方式等就不进行特别的限制，可以使用的光学装置的实例包括：在色素标记的情况下包括普通的显微镜和分光光度计，在荧光物质标记的情况下包括荧光显微镜、荧光光度计和荧光检测器。另一方面，可以使用通过检测图象的图象解析检出色素点、荧光点等的检测方法、使用荧光光度计检测荧光强度差别的方法、使用流式池检测流动液体中的染色粒子或荧光粒子数目的方法等。
当使用荧光物质作标记时，最简单的方法就是采用具有高灵敏度的荧光检测器。例如，把荧光物质标记的噬菌体溶液和营养盐装入(加入)样本液体中，从而在预定时间之后在鉴别出荧光的强度是否有所增加(即使增加得很少)的基础上可以简单地确定其中是否存在着特异性细菌。另一方面，可以把营养盐和过量的噬菌体溶液加入含有细菌的样本液体中，在预定的时间之后可以将得到的混合物进行离心或膜-过滤来分离细菌-噬菌体以便得到细菌部分，然后测量荧光的强度，从而便可以简单地测量出其中是否存在着细菌。
当使用前面的方法和装置时，例如可以制备出针对每种细菌的用色素或荧光物质标记的特异的噬菌体，然后可以使该噬菌体与细菌接触。在这种情况下，即使不知道该细菌为哪个属的细菌，但仍可以用这种简单的方式进行鉴别，如果是被对大肠杆菌有特异性的噬菌体染色的话就鉴别为大肠杆菌，而如果是被对沙门氏菌有特异性的噬菌体染色的话则鉴别为沙门氏菌。与其中测量了可发酵底物的分解的常规方法(至少需要2天)相比，该方法可以在短时间内(1小时内)进行鉴别实验、这的确是很有利的。
特别需要鉴别细菌的情况包括鉴别诸如医院中的食品中毒或医院感染等致病微生物细菌的情况，以及鉴别用于食品工业等的水等中作为污染物的细菌的情况。更具体来说，可以提到的例如有在需要对细菌进行检测的环境水、环境空气、食品、城市用水、污水、医院(尤其是在诊所中)、精密仪器生产工厂等处检测细菌的情况，这些都是需要避免所述细菌的存在的。要避免的细菌及其特异性噬菌体主要结合的实例包括大肠杆菌与T噬菌体、λ噬菌体等；沙门氏菌与P噬菌体等；假单胞杆菌与P噬菌体等，克雷伯氏菌与斯坦福大学60或92噬菌体；梭菌与70，71或72噬菌体；志贺氏菌与φ80，或斯坦福大学37或D20噬菌体；棒杆菌与C噬菌体；以及微球菌与N噬菌体或ML53-40噬菌体。在这种情况下，通常必须经过浓缩步骤以便检测出痕量的细菌。
而且，本发明还可以有效地用来检测有用的细菌。更具体来说，在使用微生物(细菌)生产食品、药物等领域中，使用其中仅能对活细胞计数的本发明的方法可以验证任何活性细菌的活细胞数目。例如，这可以使所述方法用于在啤酒酿造过程中控制活性酵母的数量、在酸奶生产过程中控制活性乳酸菌的数量，以及用于验证能生产氨基酸等的微生物的活性。另外要指出的是，在许多情况下要检测任何有用的细菌时，通常必须进行以合适的稀释率稀释具有高细菌浓度的溶液的步骤。
对于用噬菌体感染细菌的条件来说，在需氧条件下的温度根据细菌的种类，对嗜热细菌通常设定为0至120℃、而对普通的细菌和噬菌体通常设定为50℃或者更低、以使所述细菌不会失活。在上述范围内，温度越高，感染率也会越高。优选地还要搅拌样本液体以增加细菌和噬菌体接触的效率。
当样本液体为水基样品时，可以直接进行如上的检测。当样本液体为含油的液体样品时，如果其中油的含量低，该样品在用非离子表面活性剂分散后可以进行类似于水基样品的检测，如果油的含量高，通过向其中加入水把细菌萃取到水相中而得到的水相可以作为样本液体进行类似于水基样品的检测。当样品为固体时，把水加入该样品中，然后把样品碾碎并通过离心、过滤或类似的操作去掉固体以得到上清液，所述上清液可以作为样本液体进行类似于水基样品的检测。当样本液体含有色素或荧光物质时，优选在使用生理盐水透析以除去色素或荧光物质之后进行检测。当需要微量过滤器浓缩样本液体时，可以采用浓缩后向同一浓缩罐中加入生理盐水同时用通过液体交换方法得到的包括该浓度的液体来替换所述样本液体的方法。
用光学装置检测到的信息，例如可以根据某种方法可以测量出细菌是否存在及其细胞的数量，所述方法包括把荧光强度超过给定值的情况当作细菌细胞的计数点。根据使用微型电子计算机(MPU)等的图象处理技术可以构造出所用的装置。
本申请第2项所述发明的检测方法的特征在于包括通过截留装置(例如过滤或吸附)截留包含在空气或液体中的细菌，使核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体与所截留的细菌接触，并且用光学检测装置检测注入了所述色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌。第16项所述发明的细菌检测器的特征在于包括用于在膜上截留包含在空气或液体中的细菌的截留装置，用于使包含着核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体的噬菌体溶液与所截留的细菌接触的噬菌体溶液接触装置，和用于检测注入了所述色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌的光学检测装置。
上述截留装置的实例包括活性炭；以及滤膜，例如中空纤维膜、微滤膜、超滤模和反渗透膜。可以使用的吸附装置的实例包括无纺布、纤维过滤材料、离子交换树脂、砂滤材料等，在这些材料上都可以吸附细菌。
根据本发明，使待处理的水通过滤器进行过滤、例如在水处理装置中静置以便在滤器上截留细菌，然后或者使所述细菌直接与噬菌体溶液接触，或者将其浸入生理盐水或含有营养源的水中、随后用不会破坏所述细菌的超声波剥离细菌以得到上清液，接着向作为样本液体的上清液中加入噬菌体溶液，从而就可以检测和鉴别出待处理的水中的细菌。而且，因为在过滤装置(例如膜)上截留细菌后可以在光学上检测出所述细菌，所以就可能确定地检测出所述细菌。因此，该方法特别适用于迅速性要求较低，而要求高准确度、简单地进行检测的情况。
另外要指出的是，在剥离掉附着在膜上的细菌后把噬菌体溶液加入到液相中的方法可以使得细菌与液相中的噬菌体接触的可能性很高，与附着在膜上的细菌与噬菌体溶液接触相比更优选。
本发明的方法不仅可以如前所述用于检测样本液体(水样)中的细菌，而且可以用于检测空气中飘浮的细菌。例如，可以使其中含有飘浮着的细菌的空气(气体)扩散到(鼓入)水中以便将所述细菌截留在水中，然后可以将其当作样本液体使用。另一方面，实质上可以以与如上所述相同的方式用滤器过滤吸入的空气以便将细菌截留在滤器上，然后或者可以使所述滤器与噬菌体溶液直接接触，或者可以将其浸入生理盐水等中、随后剥离所述细菌以得到上清液、接着再把上清液加入噬菌体溶液中。上述方法例如通过检查空调或其它空气净化装置中的过滤装置可以适当地应用于考察医院、食品厂等具有细菌污染问题的环境空间的状态。
本申请第3项所述发明的检测方法的特征在于包括浓缩所含细菌浓度较低的样本液体中的待检测细菌，把核酸被荧光物质等标记的、以所述细菌为宿主的噬菌体加入所得含有浓缩了所述细菌的液体中，以使其与宿主细菌接触，并且用光学装置检测注入了荧光物质标记的核酸等的细菌。第17项所述发明的检测器的特征在于包括用于浓缩样本液体中的细菌的装置，用于向所得浓缩的样本液体中加入含有核酸被荧光物质等标记的噬菌体的噬菌体溶液的噬菌体溶液进样装置，和用于检测注入了色素标记核酸或荧光物质标记核酸的细菌的光学检测装置。
在前述情况下，例如可以使用膜来进行浓缩，其中只要所述的膜能够抑制作为分析物的细菌通过就可以使用这种膜、而对膜的种类和材料却没有任何特殊的限制。另外要指出的是，当过滤含有分析物的样本液体时，优选使用可以使所述细菌通过、但却抑制截面(SS)大于所述细菌的物质通过的膜进行预过滤。用于上述细菌浓缩方法的装置的具体实例包括这样一种装置，其中例如在一定的时间间隔内自动地取出一定量的流动的样品水溶液的样品并放入带膜的罐中，然后自动地浓缩该样品以得到浓缩的样品水溶液，接着再自动地取出所述样品进行自动的测量。
根据本发明，存在于样品溶液中的浓度稀的细菌在浓缩后可以有效地检测出。
可以根据把液体整体进行浓缩以便浓缩细菌的实施方式或者根据确定所述细菌在液体中的位置从而对其进行部分浓缩的实施方式来对所述细菌进行如上的浓缩。本申请第4项发明的特征在于向液体中加入核酸被荧光物质等标记的噬菌体，在该液体中细菌已通过膜分离或离心进行了浓缩。
其它浓缩细菌的方法包括一种可以如第5项发明所述的在样本液体中的小区域内检出某种待检测细菌而加入吸引剂的方法，以及一种可以如第6项发明所述的使用毛细管加入所述吸引剂的方法。所述吸引剂的实例包括氨基酸(例如丝氨酸和天冬氨酸等)；糖(例如葡萄糖、半乳糖、麦芽糖和核糖等)；以及有机酸(例如柠檬酸和苹果酸等)。除了上述有机物质以外，可以提到的还有氧气、富马酸、硝酸等所有在呼吸链中可以成为电子受体的物质。
通过充分地利用吸引剂来浓缩细菌的方法的具体实例包括下列方法：(1)使用毛细管向测试溶液中加入同时含有吸引剂(例如葡萄糖或丝氨酸等)和核酸被荧光物质等标记的噬菌体的液体，从而所述细菌在毛细管端部附近进行浓缩以便与所述噬菌体接触。(2)使用毛细管向测试溶液中加入吸引剂，用显微镜等验证了在毛细管端部附近细菌的浓缩后，接着用另一只毛细管向其中加入上述噬菌体。(3)向测试溶液中加入上述噬菌体，接着用毛细管向其中加入吸引剂。
本申请第7项发明的特征在于包括稀释含有待检测细菌的浓稠样本液体，向含有所述细菌的稀释了的样本液体中加入核酸被色素或荧光物质标记的、以所述细菌为宿主的噬菌体，以使其与所述宿主细菌接触，以及用光学装置检测注入了色素标记核酸或者荧光物质标记核酸的细菌。任何适宜的稀释剂进样装置都可以用来稀释所述的样本液体。
根据本发明，可以检测或者测量出在浓稠地包含着细菌的溶液中的活细胞的数量。因此，该方法可以用来控制例如在使用了有用细菌的食品生产过程或者类似过程中的细菌的活性。
本申请第8项发明的特征在于包括使核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体与样本液体中的宿主细菌接触，以及按照流式细胞光度术检测注入了色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌。第21项发明的检测器的特征在于包括用于使样本液体连续地通过流式池的液体进样装置，用于向在流式池前的样本液体中添加含有核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体的噬菌体溶液的噬菌体溶液添加装置，以及用于在流式池中检测注入了色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌的光学检测装置。
上述发明可以检测出通过流式池的流动溶液中荧光粒子的数量、也就是细菌数量，从而可以对其连续地进行在线的实时检测。
与前述任一方法发明相比，本申请第9项发明的检测方法的特征在于向宿主细菌中加入营养源、在用噬菌体感染宿主细菌的最初阶段中该营养源对吸附和核酸注入来说是必需的。第23项发明的检测器的特征在于包括用于向样本液体中加入营养源的营养源进样装置，在用噬菌体感染宿主细菌的最初阶段中该营养源对吸附和核酸注入来说是必需的。
当营养盐及类似物(主要是碳源)已经充足地存在于样本液体中时，就不必进行前面的操作了。但在营养盐含量不足的情况下，细菌不进行代谢会造成感染得很少，这往往又会导致噬菌体DNA不注入所述细菌中。通过上述发明可以消除这种情况。
与前述每个发明相比，本申请第11项发明的特征在于包括用色彩不同的分别对应的色素或者用激发波长或荧光波长不同的分别对应的荧光物质标记不同种类的噬菌体核酸，并将所述噬菌体加入含有多种细菌的样本液体中，这些不同种类的噬菌体分别被特异性地吸附在细菌上，由此同时检测多种细菌。
根据本发明的方法，对其中有下列细菌共存的液体或类似的情况来说使用了具有用激发波长或者荧光波长不同的各自相应的荧光物质标记了各自相应核酸并且在例如大肠杆菌、沙门氏菌以及其它细菌上具有相应特异的吸附能力的噬菌体，从而可以同时、集体地进行检测上述细菌的操作。
与前述每个发明相比，本申请第12项的发明的特征在于用同种色素或同种荧光物质标记不同种类的噬菌体核酸，并将所述噬菌体加入含有多个细菌的样本液体中，这些不同种类的噬菌体分别被特异性地吸附在细菌上，由此检测大量细菌的总数。
根据本发明的这种方法，例如可以将细菌作为目标容易地测量出待测的多种细菌是否存在于液体或类似的物质中。
前述发明的方法在检测和鉴别病原菌方面(尤其是在卫生测试或类似情况下)是很有效的。例如，主要造成食物中毒、即食品中毒的致病的肠细菌(其实例包括大肠杆菌、大肠菌群细菌、痢疾杆菌、霍乱杆菌、沙门氏菌、弧菌、肉毒杆菌、韦氏梭菌、葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌)具有用同样或者不同的色素或荧光物质标记的各自相应的核酸，从而使用以所述细菌为宿主的噬菌体可以容易地检测出这些细菌。
前述发明也可以用来检测导致除食物中毒之外的其它传染病的细菌(所述细菌的实例包括结核杆菌、肺炎双球菌、绿脓假单胞菌、军团菌和其它细菌)，并且也可以有效地用于鉴定实验中，收集细菌的菌落并将其悬浮在噬菌体溶液中以便通过其是否着上了荧光来进行鉴别。
与前述每个方法发明相比，本申请权利要求13所述的发明的特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源当作检测到的细菌。另一方面，权利要求14所述发明的特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小至多为预先设定阈值的光源的图象处理方法。而且，权利要求21所述发明的特征在于前述发明的每种装置都装配有作为光学检测装置的图象拾获装置以及用于从由图象拾获装置得到的图象中排除掉荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理装置。
根据上述发明，例如当把荧光物质注入细菌中时的光源大小可以与当所述荧光物质存在于噬菌体中时的光源大小存在显著性差异而区别。因此在预先设定的作为表明大小(例如面积或长度)的指标的阈值(该阈值小于前者但大于后者)的基础上，可以计算出所述细菌是否存在以及细菌的数量。当摄取的图象经过图象处理以排除掉大小等于或小于所述阈值的光源时，仅可以得到发出荧光的细菌的图象，从而可以进行高准确度的检测并且在自动检测方面也非常有效。另外要指出的是，“排除”大小等于或者小于所述阈值的光源的图象处理是指例如把至多达到阈值的光源当作与背景相同。与阈值比较的对象不只局限于光源的大小，并且可以以相同的方式使用光源的荧光强度来进行比较。
本申请第24、25项发明的便携式细菌检测试剂盒的特征在于包括含有能被作为检测对象的细菌同化的碳源的细菌检测助剂，核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体试剂，以及准备向其中加入作为测量对象的样品的反应容器。
例如可以在装有各自的试剂的容器中制备出上述细菌检测助剂和噬菌体试剂。
上述细菌检测助剂至少包括一种可以被所述细菌同化的碳源。可以使用的上述碳源的实例包括糖类、例如包括单糖(如葡萄糖等)、二糖和三糖在内的糖。也可以添加能够改善噬菌体的吸附能力的色氨酸等。根据本发明，由于不需要花费精力来制备原料，因此在实验室以及没有上述检测所需设施的类似的场合中就可以进行高效的工作。而且，可以把上述试剂盒与便携式光学检测装置结合起来。便携式光学装置的实例包括微型显微镜、分光光度计和荧光光度计。
在这种情况下，可以在现场进行室外检测工作，高效地完成工作。
另外要指出的是，本发明不仅局限于前述方法和装置的组成，并且如果需要的话也可以向其中加入其它的成分。例如为了提高噬菌体在细菌上的吸附能力，可以加入色氨酸、镁、钙等二价阳离子作为助剂。
                 附图的简要描述
图1为示意性地说明本发明实施方式1的装置组成的流程图。
图2为示意性地说明本发明实施方式2的装置组成的流程图。
图3为示意性地说明本发明实施方式3的装置组成的流程图。
图4为示意性地说明本发明实施方式6的装置组成的附图。
图5为说明实施本发明实施方式7的方法的操作概要的附图。
图6为说明当实施本发明实施方式8的方法时的状态的附图。
图7为说明由实施本发明实施方式7的方法造成的状态的附图。
图8为说明当实施本发明实施方式9的方法时的组成概要的附图。
图9(a)为一幅显微镜照片，该照片显示出从核酸被荧光物质标记的噬菌体中以及从通过向细菌中注入被标记的噬菌体核酸而着色的细菌中检测荧光的状态，而图9(b)为在该显微镜照片经图象处理后的图形。
数字的解释1...管路，2，6...反应器，3...检测器，4...浓缩的培养基，5...噬菌体溶液，7...滤器，41，51...泵，52...流量计，60...样本液体，61...用于激发荧光的光源，62...图象拾获管装置，63...图象处理单元，201...水样，202...载玻片，203...载玻片架，204...荧光显微镜的物镜，205...荧光显微镜载物台，206...毛细管，207...反向光程显微镜的物镜。
              实施本发明的方式
以下说明用于实施检测的前述检测方法和检测器。
实施方式1
图1为用于实施本发明方法的一个装置实例的示意流程图。在该附图中，数字1表示从中要检测出细菌的样本液体(下文称作“水样”)所通过的线路，并且该线路在其下游端依次连接到旋管式反应器2上，该反应器用于搅拌包括了其中所加的水样以及噬菌体溶液的液体，然后该反应器再连接到用于检测细菌的荧光检测器3上。另一方面，在反应器2的上游端把管路1分别连接到泵41和泵51上，其中泵41用于加入含有氨基酸、糖、无机盐等的浓缩的培养基4(营养源溶液)，而泵51用于加入含有核酸被荧光物质等(色素或荧光物质)标记的噬菌体的溶液5(在下文中称作“噬菌体溶液”)。
说明使用该实例所述的装置检测所述细菌的步骤。通过各自相应的泵41和51向水管1中连续地加入浓缩的培养基4和噬菌体溶液5，其中所述管路1中通过的是从中要检测出细菌的水样。
在流过管路1的同时把其中加入了上述液体的水样与这两种加入的液体混合，并进入保持在37℃下的旋管式反应器2中，该温度对微生物反应来说是最佳的环境。当水样中存在具有特异性的细菌时，噬菌体就与该特异性细菌反应，从而就把用色素或荧光物质标记的噬菌体核酸(例如噬菌体DNA)注入细菌细胞中。
把从反应器2出来的细菌送入检测器3(例如针对检测色素来说为显微镜或分光光度计，而针对检测荧光来说为荧光检测器)中，以便检测出通过所述噬菌体核酸的注入而用荧光物质等着色或染色的具有特异性的细菌。检测器3的模式可以为对处于静止水样中的着色粒子进行检测的类型(例如显微镜或荧光显微镜)，或者为对流过流式池的着色粒子进行检测的类型。在静态检测和在流动状态下检测的任一种情况中，都可以使用一种类型的检测器，其中使用图象拾获装置(例如CCD照相机等)拍摄下水样的图象，从而获得光电转换信号。
另一方面，可以把用检测器3(为图象拾获装置的形式)检测得到的光电转换信号输入运算装置、例如MPU(在该附图中没有显示)中，在该运算装置中插入了用于确定给定的细菌是否存在、或者定量测定的程序，从而可以检测出所述细菌是是否存在以及细胞的数量。
另外要指出的是，使用如流式细胞计这类用来在流式池中计量出荧光粒子数量的荧光检测器可以设计出一种测量仪器，该仪器能够连续地检测出与生产或处理城市用水、污水、饮用水、软饮料等有关的线路水中的细胞数量。术语“流式细胞计”表示一种在流式细胞光度测定法中所用的测量通过流式池的荧光粒子数量的装置。该装置可以针对每一类荧光强度测量并表示出粒子的数量。
实施方式2
图2为阐明本发明另一个装置实例的组成的流程图。该实例的特点为除了特征性地使用内部装有滤器7的反应器6代替如图1所示的旋管式反应器2以外，其余基本上采用了与实施方式1中相同的组成。因此，其它的构成与前面的实施方式1中是一样的，因此，相同的数字表示相同的构成，对其说明从略。
现在将要描述使用该装置检测细菌的步骤。与实施方式1相同，通过各自相应的泵41和51向水管1中连续地加入前述浓缩的培养基4和噬菌体溶液5，其中所述管路1中通过的是从中要检测出细菌的水样。
使其中加入了浓缩的培养基4和噬菌体溶液5的水样在与这两种加入的液体混合的同时穿过安装在反应器6内部的滤器7，所述的反应器6维持在37℃。所使用的滤器7为一种能够截留细菌、但却可以使噬菌体通过的滤器，例如该滤器孔的大小优选在从0.2μm至0.45μm的范围内。
当水样中存在作为检测对象的细菌时，核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体与管路1中或者滤器7上的细菌接触并发生反应，其中在滤器7上有截留的细菌以便把噬菌体DNA注入所述细菌的细胞中。在过滤了一定量的水样后，卸下该滤器，然后用显微镜或荧光显微镜观察或者用能够测量出荧光强度的其它检测器进行测量，从而可以判断出给定细菌是否存在以及类似的情况。
另外要指出的是，在本例中，在由流式计52测得的噬菌体溶液5的进样速率的基础上，通过前馈控制或反馈控制来控制穿过进样泵51的流速。这是因为优选尽可能地将细菌的检测条件设定为恒定值。针对流速的控制来说，可以适当地选择出使流速恒定的控制方法，以及根据荧光物质的激发能力和荧光-发射能力随时间的变化来增加或减小进样速率的控制方法。
实施方式3
图3为阐明按照本发明装置的另一种例子大概构成的流程图。该例区别于上述实施方式2之处在于不向管路1中加入噬菌体溶液，但是其他构成，实质上是与实施方式2相同的。因此，相同的数字表示相同的构成，省却了对构成的说明。
下面将说明用该装置检测细菌的过程。向水管路1中加入浓培养液4，待检测细菌的水样流过该管路1。在保持为37℃的反应器6中，用滤器7过滤给定量的水样。在本例的方法中，将滤器7上截留的细菌加入培养基进行繁殖。
下一步，经过预定时间后分离滤器7。使滤器7上截留的细菌与噬菌体溶液接触(例如将该滤器浸入噬菌体溶液中)。经过预定时间后，在色素标记的情况下用显微镜观察该滤器，或者在荧光物质标记的情况下用荧光显微镜观察该滤器，以计数染色了的粒子的数量，或者用拾像管装置拾获图象。
按照本例的方法，滤器上截留的细菌在检测前先进行繁殖，这样做在下面的情况中是有效的，即由于给定细菌仅为痕量，为了确认样本液体中细菌的存在抑或不存在，如果不那么做的话就必须使用大量的样本液体作为检测对象。
实施方式4
将用上图3描述的实施方式3中的其上截留有细菌的滤器7浸入含有细菌营养源的液体，同时搅拌或离心液体，以从滤器7上分离细菌。除去滤器7后向剩余液体中加入噬菌体溶液，随后用显微镜或荧光显微镜等检测器进行观察，或者用其他能够测量荧光强度的检测器测量荧光强度。
按照本例，由于细菌是在含有从滤器上除去的细菌的液体相中与噬菌体接触的，在同时进行的搅拌等操作下，细菌与噬菌体接触的机会能够达到很高，因此比起实施方式3来，细菌检测更加确定。
实施方式5
在该例中，说明了这样一种情况，即将用上图3描述的实施方式3中的水管路1用一种气流系统代替，使环境空气吸入和经过该系统，使滤器7截留漂浮在空气中的细菌。不过在这种情况下，省却了浓培养基4和进样泵41。
其上截留了空气中漂浮的细菌的滤器7通过如实施方式3那样直接与噬菌体溶液接触的方式，或者通过如实施方式4那样先从滤器上除去细菌、再使其与噬菌体溶液接触的方式，能够用来检测空气中漂浮的细菌。
实施方式6
如图4所示，本例阐明了这样一种情况，即用不能透过细菌的滤器浓缩样本液体。
更具体来说，例如，采集预定量的要检测特定细菌存在与否的待检测样本液体100，装入密封的压力容器101中，然后将一种压缩气体(例如压缩空气、压缩氮气等等)作用于压力容器101中的样本液体100，将样本液体100通过毛细管102以少量逐渐地转移至下一级压力容器103中，然后通过下一级压力容器103中微量过滤器104滤过水，制得集中含有细菌的浓缩液105。所得液体成为浓缩了细菌的水样。向该含细菌浓缩液105中加入噬菌体溶液，然后对该浓缩液105进行细菌检测，例如使用显微镜或荧光显微镜。另外在图4中，数字106指向压力容器101供应压缩气体的喷嘴，107指液体穿过微量过滤器104的排水系统。
按照本例，可以向通过膜滤法浓缩了细菌的样本液体中加入噬菌体溶液，由此能够使细菌与噬菌体的接触机会概率很高，这是本发明的重要所在。
实施方式7
如图5所示，本例阐明了这样一种情况，用一种吸引剂将细菌浓缩在水样中，以提高检测的灵敏度。
在本例中，将加入了营养盐的水样滴加到载玻片202的下层表面上(见图5(b))，然后夹上载玻片夹203，然后置于显微镜等的载物台205上。在通过显微镜的镜头204进行细菌检测时，将含有吸引剂和噬菌体的溶液经由毛细管206顶端进样到镜头焦点位置，毛细管206从其一侧沿载玻片203延伸，吸引剂例如丝氨酸、天冬氨酸、葡萄糖或半乳糖等。另外要指出的是，可取的做法是可以使水样附着的载玻片表面变得粗糙，如此能够增加水样的附着量。
按照上述过程，细菌集合在含有吸引剂的溶液的注入位置(镜头的焦点位置)，其中与吸引剂一起进样的噬菌体在细菌上被吸收，然后用色素或荧光物质标记的噬菌体DNA被注入到细菌中。于是能够观察到细菌在毛细管顶端附近集合的状态。
另外在本例中，水样201是滴加到载玻片202的下层表面上，这是因为需要观察的是水样的开放状态，而不是按照观察滴加到载玻片上的水样的方法。用盖玻片覆盖水样的状态，由于水样中O2的迅速缺乏，由此提高了细菌被周围空气吸引的趋势，而不是被吸引剂吸引的趋势。另外要指出的是，细菌被吸引剂吸引的速度是非常高的，以致于水样的干燥是不成问题的。
在本例中，如图7(a)所示，噬菌体是与吸引剂一起用单支毛细管206进样的，尽管如此，还可以如图7(b)所示，在用显微镜确认通过吸引剂进样使细菌集合之后，噬菌体溶液用第二支毛细管进样。
实施方式8
图6阐明了这样一种情况，使用反向光程显微镜，吸引剂和噬菌体溶液通过毛细管206进到附着于载玻片202上层表面的水样201中。数字207指的是反向光程显微镜的镜头。
由于这种情况是一种将水样附着于载玻片202上层表面的方法，其有利之处在于能够附着相对大量的水样。
实施方式9
本例阐明了这样一种情况，例如如图1至3所示，穿过管路1的水样(样本液体)是一种通过以几十至几千范围内的预定稀释比例稀释含有细菌的稠溶液而制得的水样，如此便大体上能够适用如上述实施方式所述相同的细菌检测过程。
按照本例，有用的微生物的活性状态能够在生产设备等中控制，例如，通过产生微生物(细菌)的大部分代谢活性得到给定产品。
实施方式10
本例阐明了这样一种情况，例如通过与图1相同的处理方式得到的样本液体60用来自一种光源的光照射，例如图8所示，该光源是荧光物质激发光源61的形式，此时，具有由噬菌体注入的荧光物质标记核酸的细菌所发射的荧光用一种拾像管装置62拾获图象，该拾像管的安装方式例如是使其具有荧光显微镜的功能，以得到所拾获图象的信息，然后用一种图象处理单元(一般为计算机)63对图象进行预定的处理，以机械化和自动化检测用荧光物质染色的细菌。
另外要指出的是，本例的方法并不限于上述涉及荧光检测的检测方法，也可以按照具有不同标记物质和/或检测方法的步骤进行，下面将提到一些例子。
(1)用CCD照相机等拾获的图象以预定的图形分辨率在x和y方向上解析，以用荧光点与背景的区别检测像素(图象元素)，并对每个荧光点像素的亮度进行分级，例如按照一般用于阶度分析方法的0至255阶度分级，将其与预定亮度阈值比较，由此将超过阈值的光源认定为细菌。在这种情况下，将超过阈值的连续光源像素判定为单个细菌细胞。
(2)用CCD照相机等拾获的图象以预定的图形分辨率在x和y方向上解析，以用荧光点与背景的区别检测像素(图象元素)，并计算每个作为荧光点检测到的像素在x或y方向上的连续长度或面积，将计算结果与细菌检测的预定长度或面积阈值比较。
(3)用CCD照相机等拾获的给定色调的光谱图象以预定的图形分辨率在x和y方向上解析，以用荧光点与背景的区别检测像素(图象元素)，并计算每个作为色素检测点检测到的像素在x或y方向上的连续长度或面积，将计算结果与细菌检测的预定长度或面积阈值比较。
(4)以这样一种方式进行图象处理，在上述(1)至(3)中荧光检测点或色素检测点中超过阈值的像素作为检测点，并将取消至多阈值的像素看作背景(将该水准赋予背景)。
另外要指出的是，图8的例子仅仅阐明了构成光学检测装置的荧光物质激发光源61和拾像管设备62，尽管如此，根据需要当然还可以安装其他镜头系统、滤光镜等等。而且，上述图象处理等能够用一种已知的计算机或一种图象处理技术进行。
                          实施例
参考实施例1
进行如下试验，目的在于确认噬菌体核酸从噬菌体粒子释放后扩散的状态下，荧光的强度增加了，与之相对的状态是噬菌体核酸被包裹在噬菌体粒子中，试验使用大肠杆菌特异的噬菌体T4，该噬菌体核酸被荧光物质标记，并且是在下面的噬菌体制备实施例(1-1)中制备的。
具体来说，测量每个样本I和样本II的荧光强度，样本I是浓度为3×108/ml的噬菌体溶液(核酸被荧光物质标记的噬菌体溶液)，样本II是经表面活性剂和碱处理而被破坏的噬菌体粒子溶液。
结果，样本I溶液的荧光强度为24.4，样本II溶液的荧光强度为52.3。因此可以理解的是，通过扩散，荧光物质标记的噬菌体核酸在荧光强度上至少增加了两倍。
参考实施例2
将大肠杆菌悬浮在每份生理盐水和营养基中，所得浓度为108/ml。另一方面，单独将假单胞菌属悬浮在营养基中，所得浓度相同。
随后，向每份所得制剂中加入与参考实施例1所用相同的核酸被荧光物质标记的大肠杆菌特异的噬菌体T4，所得浓度为3×109/ml。所得混合物在37℃下保持10分钟，随后测量其荧光强度。
结果发现，悬浮在生理盐水中的大肠杆菌样本的荧光强度为25.2，悬浮在营养基中的大肠杆菌样本的荧光强度为119.7，悬浮在营养基中的假单胞菌属样本的荧光强度为28.7。
从上述结果可以看到，在悬浮在生理盐水中的大肠杆菌样本中，尽管在大肠杆菌上吸收了噬菌体，噬菌体核酸也没有被注入到大肠杆菌中，其原因为对大肠杆菌的营养不足(可代谢能量不足)，由此认为，荧光强度没有增加，实质上与参考实施例1中的荧光强度值相等。
另一方面，在悬浮在营养基中的大肠杆菌样本中，出现了噬菌体被吸附-噬菌体核酸被注入到大肠杆菌中(释放-扩散)，由此认为，荧光强度显著增加。
相形之下，在悬浮在营养基中的假单胞菌属样本中可以看到，因为既没有出现假单胞菌属上大肠杆菌特异的噬菌体T4的吸附，也没有出现噬菌体核酸的释放，所以认为荧光强度没有显著增加。
从上述结果可以看到，对噬菌体特异的细菌的存在或不存在能够简单地和肯定地判断出来，方法是在给定营养来源的存在下，使核酸被荧光物质标记的细菌特异的噬菌体与具有代谢活性的细菌接触，随后测量荧光强度。
还可以看到，给定细菌能被定量测定，方法是用校正曲线初步确认荧光强度与细胞数之间的关系。
(1)实施例1：用噬菌体T4检测大肠杆菌
(1-1)核酸被荧光物质标记的噬菌体的制备
在37℃下，将大肠杆菌菌株B在肉汤培养基(每升含有10g细菌用胰蛋白胨、5g酵母提取液和5g氯化钠)中进行需氧培养，然后在对数生长中期加入购自IFO(发酵机构，大阪)的噬菌体T4(No.20004)，使噬菌体繁殖。用于繁殖培养噬菌体的培养基没有特别限制，只要是富含营养的培养基即可。
为了制备DNA被荧光物质标记的噬菌体粒子，向培养基中加入噬菌体，同时，向每升培养基中加入1mg盐酸4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)作为荧光物质。另外要指出的是，荧光物质没有特别限制，只要是对噬菌体DNA具有亲和力的物质即可。
继续在37℃下进行需氧培养，直到在大肠杆菌细胞中繁殖的噬菌体通过溶菌作用破裂进入培养基。其后，将含有噬菌体的培养基进行低速离心分离(3000rpm，10分钟)，除去细胞残渣。加入氯化钠并使其溶解，所得浓度为1M，进一步加入聚乙二醇并使其溶解，所得浓度为10％。将所得混合物在4℃下保持一夜，然后通过离心分离作用(15000rpm，20分钟)回收所得凝集产物。将该沉淀悬浮在少量含有5mM硫酸镁的20mM盐酸-Tris缓冲液中。将所得混悬液与等量氯仿混合，剧烈搅拌30秒钟，然后进行离心分离，分离为氯仿层和水层。收集含有噬菌体的水层，在30000rpm下离心分离30分钟，以回收噬菌体。将所得沉淀悬浮在少量的5mM硫酸镁/20mM Tris-盐酸缓冲液中。
将该混悬液置于氯化铯密度为57％、46％和33％的不连续密度梯度，用水平转子在30000rpm、4℃下离心分离3小时。收集所形成的噬菌体带，透析除去氯化铯，由此得到精制了的荧光物质标记的噬菌体制剂。所得噬菌体的精制制剂浓度为1012个粒子/ml。
(1-2)大肠杆菌的检测
向1ml含有培养的大肠杆菌的溶液(大肠杆菌浓度：108个细胞/ml)中加入2μl上述荧光物质标记的噬菌体的精制制剂，然后用荧光显微镜观察，确认荧光物质染色的大肠杆菌细胞。另外要指出的是，图9(a)表示加入了噬菌体的大肠杆菌溶液的荧光图象的显微镜照片，用BH2-RFL落射荧光显微镜(由奥林巴斯光学有限公司制造)拾获该图象，图9(b)表示取消预定阈值以下的荧光点的图象处理结果，处理方法是计算该图象中荧光点在x或y方向上的连续长度。
相形之下，其他细菌菌株的细胞即使与上述荧光物质标记的噬菌体的精制制剂混合，也不被荧光染色。从上述结果可以确认，噬菌体对宿主的识别是严格的。
另一方面，若大肠杆菌用氯进行过灭菌处理，然后与上述荧光物质标记的噬菌体制剂混合，则没有观察到荧光。从该结果可以确认，灭绝的大肠杆菌(死亡的大肠杆菌)不被荧光染色，以及噬菌体DNA仅被注入到有活力的细胞中。
从上述结果可以确认，按照本发明的方法，用核酸被荧光物质标记的大肠杆菌特异的噬菌体仅能特异性地检测具有生物活性的大肠杆菌细胞。
(2)实施例2：用流式细胞计数器测量大肠杆菌的细胞数
将实施例1(1-1)中得到的荧光物质标记的噬菌体T4用20mMTris-盐酸(Tris-HCl)和5mM MgSO4的pH为7.5的溶液稀释，所得浓度为1010个粒子/ml，然后用流式细胞光度测定法，用流式细胞计数器(BRYTE HS，由Biorad公司制造)测量，几乎检测不到荧光粒子。
相形之下，除了向含有相等数量噬菌体粒子的噬菌体溶液中加入作为噬菌体宿主的大肠杆菌以外，若在大体上相同的条件下用上述流式细胞计数器进行测量试验，则在高荧光强度区检测到了很多荧光粒子。
从两次未加入任何不同于噬菌体粒子的荧光物质的测量试验结果可以显而易见，通过噬菌体DNA借助于噬菌体注入大肠杆菌中，高荧光强度中的粒子是来自于大肠杆菌被染色的荧光，该粒子是在新加入大肠杆菌时出现的。
另外要指出的是，用上述装置从不合有加入其中的大肠杆菌的噬菌体溶液中没有检测到荧光的原因据信是荧光强度低于使用上述装置的检测限度，这是由于具有噬菌体DNA的噬菌体粒子极纯，或者由于存在于噬菌体中的噬菌体DNA的形态学使然，纵然真实的原因并不一定是显而易见的。因此，可以使用一种系统的光学装置和信息处理装置，该系统不仅能够检测噬菌体以及细菌中荧光物质标记的DNA，而且也能够通过两种情况之间荧光强度的差异来区别其间的差异，尽管它取决于所用光学检测器的种类。
进一步为了确认上述借助于噬菌体DNA的基于荧光的大肠杆菌检测，将大肠杆菌直接由荧光物质赋予荧光，而不用噬菌体，来测量荧光强度。另外要指出的是，对直接染色的大肠杆菌荧光来说，向培养的大肠杆菌中加入1μg/ml DPAI，以对大肠杆菌DNA染色。
结果，检测到大体上相等数量的粒子，说明荧光强度与借助于噬菌体给出的荧光强度相等。
如上所述，按照本发明的方法，可能检测到大体上等于常规方法的荧光水平，在常规方法中，大肠杆菌是直接用荧光物质标记的。而且，按照本发明，借助于噬菌体对细菌荧光染色能够产生一个优点，即只有严格选择的特异性细菌能够被特异性地染色，而不象用荧光物质直接对细菌染色的方法，由此能够显著增加细菌的可定量测定性。
(3)实施例3：用噬菌体T4选择性检测大肠杆菌
在本实施例中，对是否能够借助于噬菌体T4鉴别从环境分离的肠杆菌进行了试验。
将大阪府污水作为水样，涂在脱氧胆酸琼脂培养基上(荣研化学有限公司)。在该琼脂培养基中，大肠杆菌和其他包括在大肠菌群中的细菌构成红色菌落，由此它们能够与其他一般的细菌区别开来。
在污水直接涂在琼脂板上而形成的菌落中，从认为含有大肠杆菌或任何大肠杆菌群的红色菌落中拾获50个菌落，就荧光的表现借助于DAPI标记的噬菌体T4进行检查，并就β-葡萄糖醛酸酶活性进行检查。β-葡萄糖醛酸酶是一种大肠杆菌特异的酶。根据该酶的存在或不存在，能够从大肠菌群中分辨出大肠杆菌(城市用水试验方法；特异酶-酶解物培养基方法)。
同时进一步按照1号生物试验法规(荣研化学有限公司)鉴别菌种。结果如下表1所示。表1说明了大肠杆菌和据信包括在大肠菌群中的细菌的鉴别结果。表1：从污水中分离的细菌(形成红色菌落的细菌)试验
    No.     生物试验法规Code     菌种 β-葡萄糖醛酸酶 荧光物质标记的噬菌体
    1     0611517     -     +
    2     0241407     E.coli     -     ±
    3     0651517     -     +
    4     0211517     E.coli     -     +
    5     0201537     E.coli*     -     +
    6     0241407     E.coli     -     ±
    7     0211517     E.coli     -     +
    8     0201507     E.co1i     -     +
    9     0201507     E.coli*；Shigella sp.     -     +
    10     0251527     -     +
    11     0251407     -     +
    12     0201537     E.coli*     -     +
    13     0611517     E.coli*     -     +
    14     0001517     Serratia p.     -     +
    15     1241407     E.coli     -     +
    16     0211517     E.coli     -     +
    17     0241407     E.coli     -     +
    18     0211517     E.coli     -     +
    19     0201517     E.coli*；Shigella sp.     -     +
    20     0201517     E.coli*；Shigella sp.     -     +
    21     6135535     Citrobacter     -     -
    22     4117377     -     -
    23     0101507     Enterobacter**；Serratia*     -     +
    24     0241417     E.coli     -     +
    25     0241407     E.coli     -     +
    26     0201517     E.coli*；Shigella sp.     -     +
    27     0201517     E.coli*；Shigella sp.     -     ±
    28     0201407     E.coli     -     +
    29     0251517     -     +
    30     0201517     E.coli*；Shigella sp.     -     +
    31     0347777     Klebsiella ox.     -     +
    32     0757777     -     -
    33     2261535     E.coli***     +     +
    34     0201517     E.coli*；Shigella sp.     -     ±
    35     0201517     E.coli*     -     ±
    36     2271535     E.coli*     +     ±
    37     0201407     E.coli     -     +
    38     0201407     E.coli     -     -
    39     2261537     E.coli***     +     +
    40     2271535     E.coli     +     -
    41     6105577     Citrobacter     -     +
    42     2261537     E.coli***     +     +
    43     2107777     K1ebsiella     -     -
    44     2201735     Enterobacter     +     -
    45     2261537     E.coli***     +     +
    46     2271535     E.coli*     +     +
    47     4101577     Citrobacter     -     +
    48     0241417     E.coli     -     ±
    49     0271535     E.coli     -     -
    50     0347777     Klebsiella     -     ±
另外在表1中，“+”表示出现活性反应(阳性)，“-”表示没有出现任何活性反应(阴性)。另一方面，“菌种”栏中的空白指没有发现对应于生物试验的细菌。菌种名称后的星号“*”用来表示符合率，至少10％的菌种符合率用***表示，至少1％的符合率用**表示，至少0.2％的符合率用*表示，符合率小于0.2％者没有这样的符号。
上述表1中的结果说明，使用任何β-葡萄糖醛酸酶活性反应的方法与生物试验之间的符合率为16％，而本发明方法与生物试验之间的符合率为94％。
这一点确认，本发明方法的定量测定水平显著高于常规方法。
(4)实施例4：吸引剂作用下的细菌浓缩
制备了含有培养的大肠杆菌的0.1ml水样(大肠杆菌浓度：108个细胞/ml)，如实施例2制备了核酸被荧光物质标记的噬菌体T4的精制制剂，还制备了含有1mM丝氨酸作为吸引剂的吸引剂溶液。按照实施方式7，将水样附着于载玻片的下层表面，然后将载玻片置于荧光显微镜中。将噬菌体T4的精制制剂和吸引剂溶液经由一支或几支毛细管注入到水样中(用喷灯加热玻璃管并拉长之，形成毛细管)，用荧光显微镜观察水样。
观察结果如图7所示。图7(a)表示在这样一种情况下的结果，其中在彼此混合后，噬菌体T4的精制制剂和吸引剂溶液经由一支毛细管被注入到水样中，图7(b)表示在这样一种情况下的结果，其中在彼此混合后，噬菌体T4的精制制剂和吸引剂溶液经由单独的毛细管被注入到水样中。从这些结果可以理解的是，细菌聚集在毛细管顶端附近，由此可以确认，高灵敏度的检测是可能的。
(5)实施例5：在不同波长下，用被2种荧光物质标记的2种噬菌体同时检测2种细菌
(5-1)核酸被荧光物质标记的噬菌体的制备
除了用吖啶橙代替DAPI作为一种荧光物质，按照大体上与上述实施例1(1-1)噬菌体制备过程相同的过程，制备吖啶橙标记的大肠杆菌特异的噬菌体T4。另一方面，除了用购自IFO的沙门氏菌特异的噬菌体P22(No.20023)作为噬菌体，按照大体上与上述实施例1(1-1)噬菌体制备过程相同的过程，制备DAPI标记的沙门氏菌特异的噬菌体P22。
上述吖啶橙标记的大肠杆菌特异的噬菌体T4用荧光显微镜在492nm激发波长下观察，为黄绿色荧光粒子，而上述DAPI标记的沙门氏菌特异的噬菌体P22在345nm激发波长下观察，为蓝色荧光粒子。而且，在这些噬菌体彼此混合后进行观察时，由于各自的荧光物质彼此之间的激发波长和荧光波长不同，各自的观察结果互相不干扰。
(5-2)大肠杆菌和沙门氏菌的检测
将培养的大肠杆菌浓度为109个细胞/ml的营养肉汤与等量的培养的沙门氏菌浓度为109个细胞/ml的营养肉汤混合，制备试验液体，向其中加入吖啶橙标记的大肠杆菌特异的噬菌体T4和DAPI标记的沙门氏菌特异的噬菌体P22，所得浓度分别为1010个粒子/ml。将所得混合物在37℃下保持10分钟，然后用荧光显微镜观察，以在492nm激发波长下确认用吖啶橙标记的噬菌体T4染色的大肠杆菌，在345nm激发波长下确认用DAPI标记的噬菌体P22染色的沙门氏菌，随后计数在10个视野中每种细菌的数量。在492nm激发波长下，识别出来的大肠杆菌细胞数为20、15、27、22、28、42、30、18、22和22，平均为24.6。另一方面，在345nm激发波长下，识别出来的沙门氏菌细胞数为19、33、27、35、38、14、48、25、18和22，平均为27.9。于是，所观察到的细胞数与以1∶1细胞数比例混合制得的原始供试液中的比例符合良好。
从上述结果可以确认，2种(或以上)噬菌体菌株与各自2种(或以上)不同波长(激发波长或荧光波长)的荧光物质能够同时检测2种(或多种)给定细菌。
(6)实施例6：用2种噬菌体测量2种细菌总数，这2种噬菌体用相同荧光物质染色
(6-1)核酸被荧光物质标记的噬菌体的制备
用DAPI标记大肠杆菌特异的噬菌体T4，并如实施例1(1-1)制备，用DAPI标记上述沙门氏菌特异的噬菌体P22，并如实施例5(5-1)制备，使用这二者作为各自核酸被荧光物质标记的噬菌体。
(6-2)大肠杆菌和沙门氏菌的检测
将具有108个细胞/ml浓度的培养的大肠杆菌的营养肉汤与等量具有108个细胞/ml浓度的培养的沙门氏菌的营养肉汤混合，制备供试液，向其中加入荧光物质标记的噬菌体T4和噬菌体P22，所得浓度分别为1010个粒子/ml。所得混合物在37℃下保持10分钟，然后用流动式细胞计数器测量细胞数。荧光粒子数的测量值为8×107/ml。
相形之下，若用流式细胞计数器以相同方式测量通过将含有大肠杆菌的培养基与等量不含沙门氏菌的培养基混合而制得的液体中的细胞数，则荧光粒子数的测量值为3×107/ml。另一方面，若用流动式细胞计数器以相同方式测量通过将含有沙门氏菌的培养基与等量不合大肠杆菌的培养基混合而制得的液体中的细胞数，则荧光粒子数的测量值为3×107/ml。这些数值大约是含有上述两种细菌的供试液的细胞数测量值的一半，因此符合度良好。
从这些结果可以理解的是，通过用相同色素标记2种或多种噬菌体，是能够测定2种或多种给定细菌的细胞总数的。
(7)实施例7：所加入的噬菌体浓度对检测结果的影响
为了确认所加入的噬菌体浓度的改变对待检测细菌的细胞数和作出检测所需的时间是否有影响，进行下述试验。
(7-1)制备L肉汤中106个细胞/ml的大肠杆菌。向该含有培养的大肠杆菌的溶液中加入实施例1(1-1)中得到的荧光物质标记的噬菌体T4，所得噬菌体浓度为104个粒子/ml、108个粒子/ml、109个粒子/ml和1010个粒子/ml。
(7-2)在37℃下恒温，在给定间隔按给定量(60μl)的每种样本取样，用流式细胞计数器测定大肠杆菌。
在分别具有1010个粒子/ml和109个粒子/ml噬菌体浓度的样本恒温后15分钟计数明显的荧光粒子，二者的测量值均为106个细胞/ml，这与原始制备的培养的大肠杆菌浓度符合良好。在这些样本中，即使延长恒温时间，也认为测量值没有更大的改变。
在噬菌体浓度为108个粒子/ml的样本中，恒温后15分钟的明显荧光粒子数的测量值为105个粒子/ml。该测量值仅仅约占实际细胞数值的10％。不过在该样本中，当在恒温后30分钟测量时，所计数的粒子数约为106个粒子/ml。
至于噬菌体浓度为104个粒子/ml的样本，不仅在恒温后15分钟，而且在恒温后30分钟，都不能确认明显的荧光粒子。即使进一步延长恒温时间，也不能确认明显的荧光粒子。
上述结果说明，若加入到样本中的噬菌体浓度较低，则检测所需的时间较长，且检测不到的细菌数增加。
                      工业实用性
按照本发明，利用噬菌体特异性地识别宿主细菌，将DNA只注入具有生物活性的宿主细菌(活细胞)的性质，只要将具有以核酸被色素或荧光物质标记形式的噬菌体DNA的噬菌体与特定细菌接触，就能够对细菌染色或着色，并且染色或着色的细菌根据荧光能够用分光光度法分析或检测，可以从光学上把具有噬菌体DNA的噬菌体和细菌显著地区别开来，因此能够获得下列优点，任何用物理方法分离染色或着色的细菌与噬菌体的操作都是不必要的，由此通过快速而简单的操作，只有特定细菌的活细胞能够被检测和识别出来，从而达到能够检测痕量细菌的效果，而痕量细菌，例如在环境水、环境空气、食品、城市用水、精密仪器工厂和食品生产及加工厂污水、医院中的使用水、或空气中其存在是应当避免的。
进一步按照本申请第2和16项的发明，在膜上截留并注入细菌中的噬菌体DNA被荧光物质与之进行的结合作用(标记)抑制了基因的转录，因此不产生噬菌体粒子复制和溶菌的酶群，由此能够保持细菌是被染色的荧光这样一种状态稳定，以达到能够进行高准确度的检测效果，同时不受处理时间的影响。
按照本申请第3至6和17至19项的发明，由于对细菌进行浓缩检测，能够确实现为高准确度的检测。
按照本申请第7和20项的发明，能够达到这样一种效果，它们可在食品生产工厂和药品工厂用于控制有用细菌的活性。
按照本申请第8和21项的发明，能够达到这样一种效果，能够实时连续检测细菌或鉴定其细胞数在流经流式池的水样中的存在或不存在。
按照本申请第9和23项的发明，如果必要的话，加入营养盐，能够保持细菌处于一种代谢中的状态，确保向该细菌中注入荧光物质标记的噬菌体DNA。
按照本申请第10项的发明，能够提高噬菌体与细菌接触的可能性，以增加色素对单个待检测细菌的染色密度或从该单个细菌发射的荧光强度，由此能够达到可能进行高准确度检测的效果。
按照本申请第11项的发明，将含有多种细菌的样本液体与对各自细菌特异的噬菌体混合，不同种类的噬菌体分别被特异性吸收在各自细菌上，所述噬菌体各自的核酸被激发波长或荧光波长不同的各自的荧光物质标记，由此，按照每种激发波长或荧光波长能够独立地检测多种不同的细菌，从而能够同时进行检测多种不同细菌的操作。
按照本申请第12项的发明，由于分别可被特异性吸收在多种不同细菌上的噬菌体是用相同的荧光物质进行标记的，因此，能够容易地检查例如待检查的细菌是否存在于作为检查对象的液体中。
按照本申请第13、14和22项的发明，根据所拾获的图象，按照预定的阈值，能够把细菌明显与噬菌体区别开来。因此，利用图象处理技术，能够将它们应用于自动检测中。
按照本申请第24和25项的发明，在户外检测工作的情况下，能够有效地进行就地检测。
按照本申请能够产生上述作用的发明，能够显著改进城市用水、污水、环境水和食品的检测。

Claims (55)

1.一种细菌的检测方法，其特征在于包括使核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体与宿主细菌接触，并且用光学检测装置检测注入了色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌，所述光学检测装置普通的显微镜、分光光度计、荧光显微镜、荧光光度计、荧光检测器，和/或可以通过检测图象的图象解析检出色素点、荧光点的检测装置、使用荧光光度计检测荧光强度差别的装置、使用流式池检测流动液体中的染色粒子或荧光粒子数目的装置。
2.一种细菌的检测方法，其特征在于包括通过截留装置截留包含在空气或液体中的细菌，使核酸被色素或荧光物质标记的、以所述细菌为宿主的噬菌体与所截留的细菌接触，并且用光学检测装置检测注入了所述色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌，所述光学检测装置如权利要求1定义，所述截留装置为通过过滤或吸附截留包含在空气或液体中细菌的装置。
3.一种细菌的检测方法，其特征在于包括浓缩所含细菌浓度较低的样本液体中的待检测细菌，把核酸被色素或荧光物质标记的、以所述细菌为宿主的噬菌体装入所得含有浓缩了所述细菌的液体中，以使其与宿主细菌接触，并且用光学装置检测注入了色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌，所述用于检测的光学装置同权利要求1中定义。
4.如权利要求3记载的细菌检测方法，其特征在于所述细菌通过膜分离或离心分离的方法浓缩。
5.如权利要求3记载的细菌检测方法，其特征在于按照一种方法浓缩所述细菌，该方法包括在所述样本液体有限的小区域内将一种吸引剂给予待检测的给定细菌。
6.如权利要求5记载的细菌检测方法，其特征在于吸引剂是通过毛细管进样的。
7.一种细菌的检测方法，其特征在于包括稀释含有待检测细菌的浓稠样本液体，向含有所述细菌的稀释了的样本液体中加入核酸被色素或荧光物质标记的、以所述细菌为宿主的噬菌体，以使其与所述宿主细菌接触，以及用光学装置检测注入了色素标记核酸或者荧光物质标记核酸的细菌，所述用于检测的光学装置同权利要求1中定义。
8.一种细菌的检测方法，其特征在于包括使核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体与样本液体中的宿主细菌接触，以及按照流式细胞光度术检测注入了色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌。
9.如任一项权利要求1-8记载的细菌检测方法，其特征在于向宿主细菌中加入营养源、在用噬菌体感染宿主细菌的最初阶段中该营养源对吸附和核酸注入来说是必需的。
10.如任一项权利要求1-8记载的细菌检测方法，其特征在于在含有所述细菌的所述样本液体中，荧光物质标记的噬菌体浓度为105至1014个粒子/ml。
11.如权利要求9记载的细菌检测方法，其特征在于在含有所述细菌的所述样本液体中，荧光物质标记的噬菌体浓度为105至1014个粒子/ml。
12.如任一项权利要求1-8记载的细菌检测方法，其特征在于用色彩不同的分别对应的色素或者用激发波长或荧光波长不同的分别对应的荧光物质标记不同种类的噬菌体核酸，并将所述噬菌体加入含有多种细菌的样本液体中，其中这些不同种类的噬菌体分别被特异性地吸附在细菌上，由此同时检测多种细菌。
13.如权利要求9记载的细菌检测方法，其特征在于用色彩不同的分别对应的色素或者用激发波长或荧光波长不同的分别对应的荧光物质标记不同种类的噬菌体核酸，并将所述噬菌体加入含有多种细菌的样本液体中，其中这些不同种类的噬菌体分别被特异性地吸附在细菌上，由此同时检测多种细菌。
14.如权利要求10记载的细菌检测方法，其特征在于用色彩不同的分别对应的色素或者用激发波长或荧光波长不同的分别对应的荧光物质标记不同种类的噬菌体核酸，并将所述噬菌体加入含有多种细菌的样本液体中，其中这些不同种类的噬菌体分别被特异性地吸附在细菌上，由此同时检测多种细菌。
15.如权利要求11记载的细菌检测方法，其特征在于用色彩不同的分别对应的色素或者用激发波长或荧光波长不同的分别对应的荧光物质标记不同种类的噬菌体核酸，并将所述噬菌体加入含有多种细菌的样本液体中，其中这些不同种类的噬菌体分别被特异性地吸附在细菌上，由此同时检测多种细菌。
16.如任一项权利要求1-8记载的细菌检测方法，其特征在于用同种色素或同种荧光物质标记不同种类的噬菌体核酸，并将所述噬菌体加入含有多种细菌的样本液体中，其中这些不同种类的噬菌体分别被特异性地吸附在细菌上，由此检测多种细菌的总细胞数。
17.如权利要求9记载的细菌检测方法，其特征在于用同种色素或同种荧光物质标记不同种类的噬菌体核酸，并将所述噬菌体加入含有多种细菌的样本液体中，其中这些不同种类的噬菌体分别被特异性地吸附在细菌上，由此检测多种细菌的总细胞数。
18.如权利要求10记载的细菌检测方法，其特征在于用同种色素或同种荧光物质标记不同种类的噬菌体核酸，并将所述噬菌体加入含有多种细菌的样本液体中，其中这些不同种类的噬菌体分别被特异性地吸附在细菌上，由此检测多种细菌的总细胞数。
19.如权利要求11记载的细菌检测方法，其特征在于用同种色素或同种荧光物质标记不同种类的噬菌体核酸，并将所述噬菌体加入含有多种细菌的样本液体中，其中这些不同种类的噬菌体分别被特异性地吸附在细菌上，由此检测多种细菌的总细胞数。
20.如任一项权利要求1-8记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
21.如权利要求9记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
22.如权利要求10记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
23.如权利要求11记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
24.如权利要求12记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
25.如权利要求13记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
26.如权利要求14记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
27.如权利要求15记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
28.如权利要求16记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
29.如权利要求17记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
30.如权利要求18记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
31.如权利要求19记载的细菌检测方法，其特征在于包括从其中注入了荧光物质标记的核酸的细菌中测量荧光强度或荧光光源的大小，并把测得的值与预先设定的阈值进行比较，由此把超过阈值的每个光源作为检测到的细菌。
32.如任一项权利要求1-8记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
33.如权利要求9记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
34.如权利要求10记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
35.如权利要求11记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
36.如权利要求12记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
37.如权利要求13记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
38.如权利要求14记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
39.如权利要求15记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
40.如权利要求16记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
41.如权利要求17记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
42.如权利要求18记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
43.如权利要求19记载的细菌检测方法，其特征在于在对用光学检测装置测量到的荧光强度或光源大小进行图象处理后，从图象中检测细菌是否存在或细胞的数量，其中根据的是排除了荧光强度或光源大小为预先设定阈值以下的光源的图象处理方法。
44.用于权利要求1-43的方法中的细菌检测器，其特征在于包括用于向样本液体中加入含有噬菌体的溶液的装置，和用于检测注入了色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌的光学检测装置，该噬菌体的核酸被色素或荧光物质标记，并且对作为检测对象的细菌具有特异的吸附能力。
45.用于权利要求1-43的方法中的细菌检测器，其特征在于包括用于在膜上截留包含在空气或液体中的细菌的截留装置，用于使包含着核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体的噬菌体溶液与所截留的细菌接触的噬菌体溶液接触装置，和用于检测注入了所述色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌的光学检测装置。
46.用于权利要求1-43的方法中的细菌检测器，其特征在于包括用于浓缩样本液体中的细菌的装置，用于向所得的浓缩样本液体中加入含有核酸被荧光物质等标记的噬菌体的噬菌体溶液的噬菌体溶液进样装置，和用于检测注入了色素标记核酸或荧光物质标记核酸的细菌的光学检测装置。
47.如权利要求46记载的细菌检测器，其特征在于所述浓缩装置是一种膜分离单元或离心分离装置。
48.如权利要求46记载的细菌检测器，其特征在于所述浓缩装置是一种将细菌吸引剂进样到样本液体中有限的小区域中的装置。
49.一种细菌检测器，其特征在于包括用于稀释含有细菌的浓稠样本液体的装置，用于将含有核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体的噬菌体溶液进样到稀释了的样本液体中的装置，以及用于检测注入了色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌的装置。
50.一种细菌检测器，其特征在于包括用于使样本液体连续地通过流式池的液体进样装置，用于向在流式池上游的样本液体中添加含有核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体的噬菌体溶液的噬菌体溶液添加装置，以及用于在所述流式池中检测注入了色素标记的核酸或荧光物质标记的核酸的细菌的光学检测装置。
51.如任一项权利要求44至50记载的细菌检测器，其特征在于包括图象拾获装置作为所述的光学检测装置，和图象处理装置，用于从由所述图象拾获装置得到的拾获图象中排除荧光强度为预定阈值以下的光源或光源大小。
52.如任一项权利要求44至50记载的细菌检测器，其特征在于包括用于向样本液体中加入营养源的营养源进样装置，在用噬菌体感染宿主细菌的最初阶段中该营养源对吸附和核酸注入来说是必需的。
53.如权利要求51记载的细菌检测器，其特征在于包括用于向样本液体中加入营养源的营养源进样装置，在用噬菌体感染宿主细菌的最初阶段中该营养源对吸附和核酸注入来说是必需的。
54.用于权利要求1～43的方法中的便携式细菌检测试剂盒，其特征在于包括含有能被作为检测对象的细菌同化的碳源的细菌检测助剂，核酸被色素或荧光物质标记的噬菌体试剂，以及准备向其中加入作为测量对象的样品的反应容器。
55.如权利要求54记载的便携式细菌检测试剂盒，其特征在于所述细菌检测助剂含有促进噬菌体在所述细菌上的吸附的吸附助剂。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108474792A (zh) * 2015-11-20 2018-08-31 辛纳米拉股份公司 用于检测细菌的方法和设备

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH1132761A (ja) * 1997-07-17 1999-02-09 Japan Organo Co Ltd 変異原性試験方法
JP4448223B2 (ja) * 1999-01-28 2010-04-07 日華化学株式会社 細菌の検出方法および検出装置
DE60014987T2 (de) 1999-02-22 2005-11-10 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma Verfahren zum Nachweis von Bakterien
US7023622B2 (en) * 2002-08-06 2006-04-04 Dmetrix, Inc. Miniature microscope objective lens
US7113651B2 (en) * 2002-11-20 2006-09-26 Dmetrix, Inc. Multi-spectral miniature microscope array
US8206946B2 (en) * 2003-03-24 2012-06-26 Mary Beth Tabacco Fluorescent virus probes for identification of bacteria
WO2008157384A2 (en) * 2007-06-15 2008-12-24 Microphage Incorporated Method of detection of microorganisms with enhanced bacteriophage amplification
JP3929057B2 (ja) 2004-03-31 2007-06-13 キヤノン株式会社 発光強度解析方法及び装置
DE102005052752A1 (de) * 2005-11-04 2007-05-10 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
JP4745326B2 (ja) * 2005-01-31 2011-08-10 野村マイクロ・サイエンス株式会社 超純水中の微粒子数測定方法、微粒子数測定用ろ過装置、その製造方法及びその装置に用いる中空糸膜ユニット
US20090068638A1 (en) * 2005-03-17 2009-03-12 Biophage Inc. Phage-based method for the detection of bacteria
CN1840688B (zh) * 2005-03-29 2010-12-08 中国科学院电工研究所 一种细菌活性比较仪
JP2009085898A (ja) * 2007-10-03 2009-04-23 Hitachi Ltd 生物検査装置
JP5024556B2 (ja) * 2008-09-22 2012-09-12 株式会社日立プラントテクノロジー 有機ハロゲン化合物の簡易測定方法及び装置
EP2620762B1 (en) * 2010-09-21 2017-02-01 Olympus Corporation Optical analysis method using the detection of a single light-emitting particle
CN102094062A (zh) * 2010-11-19 2011-06-15 聚光科技(杭州)股份有限公司 一种细菌检测方法及装置
CN102175632A (zh) * 2010-12-31 2011-09-07 聚光科技(杭州)股份有限公司 一种细菌检测方法及装置
BR112013018656B1 (pt) * 2011-01-21 2021-03-02 Labrador Diagnostics Llc método para detectar a presença ou concentração de um analito numa amostra de fluido contido num recipiente, e, método de medição da concentração de analito numa amostra de fluido
EP2706346A4 (en) * 2011-04-13 2014-11-19 Olympus Corp PHOTO-ANALYSIS DEVICE USING SINGLE-LIGHT EMITTING PARTICLE DETECTION, METHOD FOR PHOTO-ANALYSIS, AND COMPUTER PROGRAM FOR PHOTO-ANALYSIS
EP2617833A1 (en) * 2012-01-18 2013-07-24 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) A method for specifically detecting living bacteria
BR112014020512B1 (pt) * 2012-02-21 2022-07-12 Laboratory Corporation Of America Holdings Métodos e sistemas para a detecção de microorganismos
US10519483B2 (en) 2012-02-21 2019-12-31 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods and systems for rapid detection of microorganisms using infectious agents
CN103293138B (zh) * 2013-06-21 2015-08-26 北京大学 一种快速表征剩余污泥碱性厌氧发酵过程与产物的方法
WO2017023721A1 (en) * 2015-07-31 2017-02-09 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Detection of bacteria using bacteriophage
CN108431602B (zh) * 2015-08-17 2022-04-08 瑞士菌分析股份公司 细菌快速试验
US20230227768A1 (en) * 2016-04-25 2023-07-20 Renascent Diagnostics, Llc Method and systems for increasing the capacity of flow cytometter bacteria detection and antibiotic susceptibility testing systems
GB2551121B (en) * 2016-06-02 2021-01-06 Fungialert Ltd In situ detection of pathogens
CN106995804A (zh) * 2017-03-20 2017-08-01 海南大学 一种乙酰胆碱酯酶标记的工程化噬菌体快速检测微生物
CN108344613A (zh) * 2018-02-05 2018-07-31 江苏诺鬲生物科技有限公司 一种标记白带及宫颈脱落细胞病原菌的荧光染色试剂
EP3957740A4 (en) * 2019-04-18 2023-08-23 Shenzhen Aier Biotechnology Co., Ltd. Method for measuring bacterial inhibition of antibacterial drug, and bacterial counting device and method thereof
CA3147173A1 (en) 2019-08-26 2021-03-04 Stephen Erickson Devices and methods for detecting microorganisms using recombinant reproduction-deficient indicator bacteriophage
CN110656038B (zh) * 2019-10-12 2022-09-13 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种高通量筛选人畜共患病原菌噬菌体检测板及其应用
CN112080475B (zh) * 2020-07-30 2022-02-11 扬州大学 一种副溶血性弧菌噬菌体及其在检测副溶血性弧菌大流行株活细胞含量中的应用
TWI788849B (zh) * 2021-05-17 2023-01-01 張勝致 反應器模組及具有該反應器模組的生物力學測試系統
CN113358621B (zh) * 2021-06-10 2022-11-18 深圳市核子基因科技有限公司 一种同轴光纤荧光基因检测装置及其检测方法
CN116596925B (zh) * 2023-07-17 2023-09-19 广州盛安医学检验有限公司 一种基于荧光扫描影像技术的妇科阴道菌群估算系统

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988004326A1 (en) * 1986-12-01 1988-06-16 Mcdonnell Douglas Corporation Method of identifying unknown organisms

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61501489A (ja) * 1984-03-19 1986-07-24 ユニバ−シテイ　オブ　イリノイ 認識及び同定剤としてのバクテリオファ−ジ
CA1277931C (en) * 1984-06-05 1990-12-18 Shimon Ulitzur Detection and/or identification of microorganisms in a test sample usingbioluminescence or other exogenous genetically-introduced marker
WO1988007584A1 (en) * 1987-03-23 1988-10-06 New Horizons Diagnostics Corporation Method and apparatus for detection and quantification of bacteria
WO1993017129A1 (en) * 1992-02-28 1993-09-02 Judkins Paul W Method and diagnostic kit for determination of bacteria
FR2719602B1 (fr) * 1994-05-05 1996-07-26 Biocom Sa Procédé et installation pour la numérisation de cellules et micro-organismes, notamment des produits alimentaires ou des fluides biologiques.
JP3615810B2 (ja) * 1994-12-05 2005-02-02 東北電子産業株式会社 細菌の検出方法及び検出装置

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988004326A1 (en) * 1986-12-01 1988-06-16 Mcdonnell Douglas Corporation Method of identifying unknown organisms

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108474792A (zh) * 2015-11-20 2018-08-31 辛纳米拉股份公司 用于检测细菌的方法和设备
CN108474792B (zh) * 2015-11-20 2021-02-02 辛纳米拉股份公司 用于检测细菌的方法和设备

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Publication number Publication date
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