TW514642B - Cyclic peptide analogs of somatostatin - Google Patents

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514642 A7 B7 1 352pif2.doc/008 五、發明說明（I ) 發明背曼 天然生長激素釋放抑制因子（somatostatin)包括 14-胺基酸異構物（亦即soma tost at in-14)與18-胺基酸 異構物（亦即somatostatin_28)，以上是Heiman等人發 表於 Neuroendocrinology，45 ·· 429-436 ( 1987)的資料。 因爲天然生長激素釋放抑制因子的半生期很短，所以有各 種生長激素釋放抑制因子的同類物被發展出來，例如用來 治療肢端肥大症（acromegaly)，如Raynor等人在 Molecular Pharmacol. 43 : 838 ( 1993)所發表。目前已 經有五種生長激素釋放抑制因子之受體（receptor)被淸 楚地區分，如 Hoyer 等人在 Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Phamacol ·，350 : 441 ( 1994 )發表。生長激素釋放抑制 因子會產生許多效應，包括調節賀爾蒙的分泌，例如生長 激素、胰增血糖素（glucagon )、胰島素（insul in )、 澱粉經絡質（amyl m )、以及神經轉移質 (neurotransmitter)的分泌，其所產生的一些效應與其 連結於特定的生長激素釋放抑制因子受體有關，例如生長 激素的抑制是歸因於生長激素釋放抑制因子第二型受體 (somatostatin type-2 receptor ; SSTR-2)，以上是參 考 Raynor 等人在 Molecular Pharmacol. 43 : 838 ( 1993) 所發表，以及 Lloyd 等人在 Am. ；[ .Phs ιοί 268: G102( 1995 ) 所發表文獻，而此時胰島素分泌抑制也歸因於生長激素釋 放抑制因子第五型受體（SSTR-5X摘自於Coy等人在197 : 366-371，1993所發表）。最好是具有一種對負責所欲生 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂---------線^|^" (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 514642 A7 B7 1352pif2.doc/〇〇8 五、發明說明（7/) 物反應的特定生長激素釋放抑制因子之受體具選擇性的 同類物，以負責表現出各別想要的生物反應，因此’減少 會導致不想要的副作用之受體的交互作用。 發明槪鄉 本發明有關於一種胜肽類，其通式如下列： R1 A1-A2-A3-A4-D-Trp-Lys-A7-A8-A9-R3 R2 其中：A1是半胱胺酸（Cys)或Mpa的D-或L-的異 構物； A2是天門冬醯酸（Asn)、麩胺醯酸（Gin )、 脂肪族胺基酸（al iphat ic amino ac id )、芳香 族胺基酸（aromatic amino acid)、或刪除 (deleted); A3是芳香族胺基酸； A4組胺酸（His)或芳香族胺基酸； A7是酥胺酸（Thr)、絲胺酸（Ser)、或脂 肪族胺基酸； A8是芳香族胺基酸； A9是D-或L-的半胱胺酸； R1、R2分別是氫基、C1-C12的烷基（alkyl)、 C7-C20 的苯烷基（phenylalkyl)、C11-C20 的 脂肪族烷基（naphthylalkyl)、C1-C12的羥院 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂--------- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 514642 A7 1 352pif2.doc/008 B7 五、發明說明（A ) 基（hydroxynaphthylalkyl)、C7-C20 的羥苯 院基（hydroxypheny 1 alky 1 )、Cl 1-C20 的經脂 肪族院基（hydroxynaphthy 1 alky 1 )、或 C0E1， 當El是C1-C12的烷基、C7-C20的苯烷基、 C11-C20的脂肪族烷基、C1-C12的羥烷基、C7-C20的羥苯烷基、C11-C20的羥脂肪族烷基；以 及 R3 是胺基（NH2)或 NH_Y-CH2-Z，當 Y 是 CL· C12 烴類（hydroxyalkyl)，而當 Ζ 是-Η，-〇Η， -C〇2H， -C0NH2 ;以及A卜A9殘基的側鏈上有 二硫鍵（disulfide)，或製藥上可容許之鹽類 連結。 在一實施例中，如上述的通式，其中，A3、A8分別是 苯丙胺酸（Phe)、p-X-Phe〔X是鹵素（halogen)、經基 (〇H)、甲氧基（0CH3)、甲基（CH3)、或硝基（N〇2)〕、 o-X-Phe (X是鹵素、羥基、甲氧基、甲基、或硝基）、吡 陡- Ala、色胺酸（Trp)、Θ-Nal、2,4-dichloro-Phe、酉各 胺酸（I ) 〔 Tyr ( I )〕、或F5-Phe，而A4是組胺酸、苯 丙胺酸、p-X-Phe ( X是鹵素、羥基、甲氧基、甲基、或硝 基）、o-X-Phe(X是鹵素、羥基、甲氧基、甲基、或硝基）、 吡啶-Ala、色胺酸、P-Nal、2,4-dichloro-Phe、酪胺酸 (I)、或F5-Phe。A2是天門冬醯酸、麩胺醯酸、丙胺酸、 Ai b、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、N1 e、Nva、Abu、苯丙 胺酸、p-X-Phe(X是鹵素、羥基、甲氧基、甲基、或硝基）、 6 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) ^ --------------------訂---------線^|^* (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 042 1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ____Β7___ 五、發明說明（1 ) 〇-X-Ptie (X是鹵素、羥基、甲氧基、甲基、或硝基）、吡 聢- Ala、色胺酸、/?-Nal、2,4-dichloro-Phe、酪胺酸（I)、 或F5-Phe，而A7是酥胺酸、絲胺酸、丙胺酸、Aib、纈胺 酸、白胺酸、異白胺酸、Nle、Nva、Abu。 在另一個實施例中，A9是半胱胺酸，A3、A8分別是 苯丙胺酸、p-X-Phe ( X是鹵素、經基、或甲基）、酪胺酸 (1 )或色胺基，而A4是組胺基、苯丙胺基、p-X-Phe ( X 是鹵素、羥基、或甲基）、酪胺酸（I )、或色胺酸，而 A2是天門冬醯胺、麩胺醯胺、或刪除，而A7是酥胺酸或 絲胺酸。 另一實施例之中，其中A2是天門冬醯胺或刪除，A3 是苯丙胺酸，A4分別是苯丙胺酸、組胺酸、p-X-Phe (X 是鹵素、羥基、或甲基）、酪胺酸（I )、或色胺酸，而 A8是苯丙胺酸、P-X-Phe (X是鹵素、羥基、或甲基）、 酪胺酸（I)、或色胺酸，而Rl、R2各別是氫基，而R3 是胺基。 以下舉例的是用來說明本發明胜肽類的分子式： H2-C〔 Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕-順2 (同類 物I )， H2-C〔 D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕-NH2 (同 類物II )， H2-C [ Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys] -NH2 5 H2-C〔 D-Cys-Phe-Trp-D-Trp麵Lys-Thr-Phe-Cys〕-NH2， H2-C ( Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys] -NH2 ^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） Λ -------------------—訂-------------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) )14642 A7 B7 1 352pif2.doc/008 五、發明說明（t) H2- c〔 D-Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr，Phe _Cys〕-NH2， Eh-c〔 Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys〕-NH2 (同類 物 IV)，

Hi-c [ D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys] -NH2 ^ 類物III) H2-C〔D-Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys〕-NH2， H2-C [Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys] -NH2 j H2-C [ D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys] -NH2 5 H2-C [ Cys-Phe-Tyr ( I ) >D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys ) -NH2 (同類物VIII)， H2-c〔 Cys-Asn-Phe-Phe_D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕-NH2(同 類物V)，

Hi - c [ D-Cy s - Asn -Phe -Phe - D-Trp-Ly s -Thr - Phe -Cy s ]-NH2， H2-C [Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys] -NH2 5 H2-C〔 D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕-NH2， H2- c [ Cy s - Asn -Phe - Hi s - D-Trp-Ly s - Thr - Phe - Cy s ] -NH2 5 H2-C [ D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys )-NH2， H2-C〔 Cys-Asn-Phe，Phe，D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys〕-NH2， H2-C [ D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys ]-， 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 i%42 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五'發明說明（4) H2-C〔Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys〕-NH2， Hi-c 〔 D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys 〕-NH2， H2-C [Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys] -NH2， H2-C 〔 D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys 〕-NH2， H2-C [ Cys -Asn-Phe-Tyr (I) -D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕 _， H2-C C D-Cys-Asn-Phe-Tyr ( I) -D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕 -NHa， H2 - c [ Cys -Asn-Phe-Tyr (I) -D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys ] -NH2， H2-C [ D-Cys-Asn-Phe-Tyr ( I) -D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys〕 -， H2-c〔 Cys-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕-NH2 (同類 物 VI ) ’ H2- c〔 Cy s - Phe - Ty r - D-Trp- Ly s - Thr -Phe - Cy s〕-NH2 (同類 物 VI ) ’ H2-C〔 Cys-Phe-5-Nal-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕-NH2 (同 類物VII) ’ H2-C〔 Cys-Phe-Cpa-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕-順2 (同類 物 IX) ’ H2-c〔 Cys-Phe-Tyr-D-Trp_Lys-Thr-Phe_Cys〕-腿2 (同類 物X) ’ ^紙張尺度適標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------裝--------訂---------^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 514642 A7 1 352pif2.doc/008 β? 五、發明說明（q ) H2-c〔 Cys-Phe_Tyr-D-Trp-Lys_Thr-Phe-D-Cys〕-NH2 (同 類物XI)， H2-C〔 Cys-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Tyr-Cys〕-冊2 (同類 物 XII)， H2-c〔 Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe_Cys〕-NH2 (同類 物 XIII)。 除了 N-末端胺基酸，在揭露中所有胺基酸縮寫（如 Ala、A0表示-NH-CH (R) -C0-之結構，其中R是胺基酸 的側鏈，而R例如是Ala之QL·。而對於N-末端的胺基酸 而言，若其爲半胱胺酸的D-或L-的異構物，上述縮寫表 示=NCH-(CH2SH) -C0-，若其爲Mpa的D-或L-的異構物， 其結構=C- ( -CH2SH) -C0-，而上述的R是胺基酸的側鏈。 而 Nle、Nva、pyridyl-Ala、F5-Phe、2,4-dichloro-/?-Nal 、 Abu、Mpa、Cpa、與Aib分別代表下列α-胺基酸的簡稱： norleucine 、 norvaline 、 β- 口比 D定-alanine 、 pentafluoro-phenyl alanine 、 2,4- d i ch 10 r opheny 1 a 1 an i ne 、 y?-napthy 1 alanine 、 a -aminobutyr i c acid 、mercaptopropionic acid 、p-chloropheny 1 al anine，與 a - ami no i sobu t y r i c ac i d 0 Ty r (I)與碘化酪胺酸（tyrosme)的殘基有關，（例如3-I-Tyr、5-I-Tyr、3,5-I-Tyr)，其中，碘是放射性同位 素，例如，I125、Γ27、或Γ31。脂肪族胺基酸是一種具有一 至二個側鏈的α-胺基酸，其側鏈各別是碳氫鍵，例如是直 鏈或支鏈狀的C1-C6，脂肪族的胺基酸例如包括丙胺酸、 10 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 4- --------------------訂---------線^^----- (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 514642 A7 B7 1352pif2.d〇c/〇〇8 五、發明說明（X ) A^b、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、Nle、Νν&、。而芳 香族胺基也是一種α -胺基酸，而其側鏈包含中性的芳香族 取代物（非酸也非鹼）例如一種取代或非取代的苯基曰脂 肪族、或芳香族六環族群（例如吡啶、或ind〇lyi)，^ 列是芳香族胺基酸的一些例子：苯丙胺酸、p_x_phe (χ是 鹵素（F、a、η、羥基、甲氧基、甲基、或硝基）、〇_χ_ρ= (X是鹵素、羥基、甲氧基、甲基、或硝基）、吡啶_AU、 色胺酸、fNal、2,4-dichloro-Phe、酪胺酸（丨）、或 F5-Phe，胺基酸的殘基有適當的活性，除非特別指定否則 是一 L-異構物，而且上述的通式：hydr〇xyalkyl、 hydrophenylalkyl、與 hydroxynaphthylalkyl，其具有 1-4 hydroxy的取代物，而且C0E1座於-C=0E1的位置。 -C=〇E1 包括 p-hydroxy-phenylpropionyl ( {列女口-C=〇CH2_ CH2-C6H4〇H)，與phenylpropionyl。在此分子式的第四個 位置，具有雙硫鍵介於殘基A1的側鏈之硫醇基（例如Mpa、 D-Mpa、Cys、或D-Cys)與殘基A9的側鏈之硫醇基（例如 Mpa、D-Mpa、Cys、或D-Cys)之間，但並未顯示。這意謂 著本發明的胜肽類可以用其他的形態存在著，例如：H2-c 〔Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕-NH2，其具兩個 雙硫鍵殘基（例如Cys)介於”c”之後的兩個括弧之間。 本發明胜肽類可在生物體上抑制胰島素的分泌（例如 像人類等哺乳動物之病患）。因此，此胜肽可用於治療生 理況，其中可有效的抑制胰島素的釋出，例如用於第二型 糖尿病。再則，在本發明的胜肽類之中含有酪胺酸（I ) 11 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 4· I < --------------------訂·--------線^|^—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 1352pif2.doc/008 五、發明說明（1 ) 殘基，可用於含有生長激素釋放抑制因子受體（例如 SSTR-5)之細胞的顯像。本發明這些胜肽類可以用來活有 機體內（in v1V〇)以偵測含有生長激素釋放抑制因子受 體的細胞（例如癌症細胞）或用於體外試管內（in vhro) 做生長激素釋放抑制因子受體結合試驗的放射性螯合 劑。 本發明的胜肽類可提供製藥上可接受鹽類之形式，與 以下列舉的各種酸所結合之形式皆可，例如有機酸〔醋酸 (acetic acid)、乳酸（lactic acid)、順丁 烯二酸（maleic acid)、檸檬酸（citric acid)、蘋果酸（malic acid)、 抗壞血酸（ascorbic acid)、丁二酸（succinic acid)、 苯甲酸（benzoic acid)、甲基苯磺酸（methanesulfonic acid)、甲苯擴酸（toluenesulfonic acid) 、pamoic ac i d〕、無機酸〔例如鹽酸（hydrochl o r i c ac i d )、硫 酸（sulfuric acid)、磷酸（phosphoric acid)〕、或 聚合酸〔例如丹寧酸（tannic acid )、羧甲基纖維 (carboxymethyl cellulose)、聚乳酸（polylactic)、 聚羧基乙酸（polyglycolic acid)、或乳酸·竣基乙酸的 共聚合物〕。 本發明胜肽類之治療有效劑量與在製藥上可接受之載 劑物質〔例如碳酸鎂（magnes ium carbonate )、乳糖 (lactose)、或可以和具療效之化合物形成微胞之磷脂 (phosphol ipid)〕共同形成一醫藥組合物（例如一藥九、 錠劑、膠囊、液體）以供需要此胜肽類的患者服用（口服、 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------A__w^--------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 514642 A7 1 3 5 2pif2 . doc/008 β7 五、發明說明（（"） 靜脈注射、經皮、經肺、經陰道、皮下、經鼻、離子滲透、 或呼吸道）。上述的藥九、錠劑、膠囊可以用一層具有防 止胃酸、腸酵素反應的物質加以包覆，使其停留在胃中不 致消化而達到小腸。上述具療效的物質也可以製成生物可 降解或生物不可降解之緩釋型之處方而經由皮下或肌肉 使用，例如美國專利編號第3773919、4767628或PCT專 利編號No. W0 94/00148，持續地使用則病患也會得到如使 用皮下注射或外用生理幫浦（例如INFUSAIDTM pump) — 樣的具療效的成份，因此，可在病患就寢之前服用該胜肽 類。 使用本發明的胜肽類以治療上述的疾病或生理失調 的劑量，是視服用的方式而不同，也必須考慮年齡、體重、 治療對象病情等因素而施予，但最終的劑量是由醫生或獸 醫來決定的。此處提供一些醫生或獸醫決定的胜肽類劑量 意即具療效的劑量以供參考。 再則，如本發明所預期的結果，本發明的胜肽類，包 含於上述的通式之中，並且可以用於治療抑制胰島素分泌 的相關疾病與生理失調，例如第二型之糖尿病，也可以用 於檢定生長激素釋放抑制因子受體之試驗，例如放射性顯 影。 本發明其他的特色與優點可以從申請專利範圍的詳 述而顯而見。 本瘦明的詳細說明 本發明之生長激素釋放抑制因子類似物質的合成與使 13 本紙張尺度it用中國國家標準（CNS)A4規格（21G X 297公釐） -- --------訂---------線 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 514642 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 1 352pif2.doc/008 gy 五、發明說明（（\ ) 用方法，可以用習知的技術方法而輕易完成，除非有特別 指定，否則所有的專有或科技名詞都應屬於一般習知的技 術所使用的，而且，此處所提及之所有的公開發表、專利 申請案、專利與其他的參考文獻皆納入參考。 相信熟悉此技藝者都能依此描述使用本發明至最大的 延伸。以下所舉的實施例中，只是一特定的例子，其並不 限定其他揭露的部份。 素釋放抑制因子的合成： 關於短鏈胜肽類的合成在胜肽技術中已廣泛硏究。可 參照Stewart等人在所發表的，，固相胜肽類合成，，（pierce Chem1Calco.，2ded.1984)，下列是同類物1(同類物I) 的合成。本發明其他胜肽類製備可經由熟於此項技藝人士 以同方法完成。 將l.lg，0.5mm〇U的卞基羧胺聚苯乙烯樹脂 (benzylhydryamine-polystyrene resin)含氯離子的形 式置於Advanced ChemTech ACT 200的胜肽類合成反應器 之中’然後依序經過下列試劑/溶劑的沖洗：（a)二氯甲 fet; ( methylene chloride ) ( b ) 33% 三氟醋酸 (trifiu〇r〇acetic acid)溶於二氯甲院的溶液，（在1 分鐘與25分鐘各一次）（c)二氯甲烷（d)乙醇（ethanol) (e)=氯甲院（f) 10%的三乙胺（triethyl amine)溶於 氯仿（chloroform)的溶液。 進行中和步驟，將上述樹脂置於各含1.5mmoleBoc-S_4_methylbenzyl-Cys 與二異丙基碳二醯胺 --------------------訂--------^線 (請先閱讀背面之江意事項再填寫本頁) 本紙張尺錢巾目國準（CNS)A4規格（21G X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 514642 A7 1352pif2.doc/008 07 五、發明說明（ll/) (di 1 sopropy 1 carbodi imide )而溶於二氯甲院的溶液中 攪拌一小時，然後依序以上述（a)至（f)的試劑/溶劑 循環淸洗。下列的胺基酸（1.5mmole)可以用同樣的方式 成功地被偶合（couple ) : Boc-Phe、Boc-0-benzyl - Thr、 Boc-N-benzyloxycarbonyl-Lys 、 Boc-D-Trp ， Boc-Phe 、 Boc-Phe、Boc-S-methylbenzyl-Cys。經過淸洗與乾燥之 後，所得到的中和樹脂約1.6g。 接著，取樹脂（1 .6g，0.5mmole)加入5ml的茴香醚 (ani sole )、100g 的二醯代蘇糖醇（dithiothreitol)、 以及35ml的氫氟酸（HF)，然後在0°C之下混合攪拌45 分鐘，過量的氫氟酸會在乾燥的氮蒸氣之下快速地被去除 蒸除，所剩餘的胜肽類會沈澱，然後，再以乙醚來淸洗以 得到粗製胜肽類（crude peptide)。其次，將該粗製胜 肽類溶於500ml已加入I2/MeOH的濃溶液而變至永久棕色 的90%醋酸之中。並加入抗壞血酸（ascorbic acid)以去 除過量碘，然後將此溶液蒸發至小量體積以供SEPHADEX G-25的分離柱（column)分離，而使用50%的醋酸沖提， 利用紫外光（UV)吸收光譜儀取出含主成份的部份。接著， 利用薄層層析法（thin layer chromatography ; TLC)來 蒸發成小體積。然後，利用高性能液相層析法（high performance liquid chromatography ； HPLC )，以 VYDACTM 含有 octadecylsilane 砂土（ silica)而尺寸爲 1.5x70cm 的分離柱，使用線性梯度沖提液當作移動相，沖提液混合 比例A : B是80 : 20至40 : 60之間，其中當A是〇. 1%三 15 本紙張尺度適用^國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 細 " --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 丄 4642 1 3 5 2pif2 . doc/008 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明奶） 氟醋酸（trifluoroacetic acid; TFA)水溶液，B 是 79.9% 氰化甲烷（acetonitrile)、20%水、與〇. 1%的TFA的混 合液。分量利用薄層層析法（TLC)、與液相層析法（HPLC) 測試並收集得到純度更高的溶液，然後將上述溶液以水重 複凍乾（lyophilization)，而得到95mg的白色蓬鬆粉 末即產物。 由HPLC與TLC方法得到之產物均質化。而由酸水解酵 素（acid hydrolysate)與基質輔助雷射脫附質譜儀 C MALDIMS)之胺基酸試驗來確認其結構是環式八胜肽類 (cylic octapeptide)(其分子量計算値是1077,偵測 値是10 8 0 )。 以下是同類物V的合成反應。將0.7g，0.25mmole氯 離子的形式之苯甲基氫化胺-苯乙烯樹脂（Advanced ChemTech，Inc.)置於 Advanced ChemTech ACT 200 的胜 肽合成反應器之中，然後程式化輸送下列試劑/溶劑的沖 洗·（a) 一氯甲院（二氯甲院）（b)33%trifluoroacetic acid溶於二氯甲烷的溶液，（在1分鐘與25分鐘各一次） (c)二氯甲烷（d)乙醇（ethanol) (e)二氯甲烷（〇 10%的二乙胺（triethylamine)溶於氯仿（chloroform) 的溶液。 進行中和步驟，將上述樹脂置於各含1.5〇1〇1〇168〇(：-S_4_methylbenzyl-Cys 與 diisopropylcarbodiimide 的溶 於二氯甲烷溶液中攪拌一小時，然後依序以上述（a)至 (f )的試劑/溶劑循環淸洗，下列的胺基酸（1.5mmole) 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -— IT---------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 514642 A7 1 352pif2.doc/008 β7 五、發明說明（^) 可以用同樣的方式成功地被偶合（couple) : Boc-Phe、 Boc-0-benzyl-Thr 、 Boc-N-benzyloxycarbonyl-Lys 、 Boc-D-Trp ， Boc-Phe 、 Boc-Phe 、 Boc-S-methylbenzyl-

Cys。經過淸洗與乾燥之後，所得到的中和樹脂約1 .2g。 接著，同樣如上述將胜肽類樹脂以氫氟酸切開結構，再以 碘進行環化作用，再如上述以分離柱純化，可得21mg九 環胜肽，其以HPLC與TLC均質化。同樣以酸水解酵素與 基質輔助雷射脫附質譜儀（MALDIMS)之胺基酸試驗來確 認其組成（其分子量計算値是1192，偵測値是1192)。 上述在酪胺酸的殘基上合成碘化生長激素釋放抑制 因子同類物的方法〔例如氯胺_T( chloramine-T)的方法〕 是一種習知常用的技藝（例如參照Czerruck等人在J. Biol .Chem. 258 : 5525 ( 1993 )所發表的文獻以及歐洲專 利 No.389,180 B1 的內容）。 生長激素釋放抑制因子受體結合分析(Somatos t in Receptor Binding Assay) (1 )人類SSTR-2的結合分析 將取自於美國菌種中心（ATCC)，之ATCC No· CCL61 (Rockville，MD)中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary ; CH0-K1)轉植人類的SSTR-2 cDNA，上述方法記 載於 Yamada 等人在 Pi*oc. Natl · Acad. Sci . USA，89 : 251 -255 ( 1992 )所發表的內容，或是一般的分子生物標 準技術，例如Patel 等人在 Biochem. Biophy. Res. Commun. 198:605( 1994 )所發表的內容。接著，將已轉植人類SSTR-2 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -衣--------訂---------· 514642 1 352pif2.doc/008 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（（t) 的CH0-K1細胞加入20ml的冰冷50mM Tris-HCl緩衝溶液 (Buffer A) ’ 然後’以 P〇LYTRONtm 均質機（Brinkmann Instrument，Westbury，NY)，調整 setting 6，攪拌 15 秒鐘，以形成均質化的粗製細胞膜。其次，將上述樣品以 Buffer A稀釋至最終體積40ml。然後，進行離心程序， 將樣品置於0 - 4 C的離心機（DuPon t，New t on，CT )中， 39000g的速度下離心10分鐘，接著，將上淸液輕輕倒出， 並丟棄。然後，將離心所殘餘的部份加上Buffer A重複 如上述均質、稀釋、與離心步驟，最後殘餘的部份，與l〇Mm 的Tris HC1緩衝溶液混合，並存於冰冷的環境，以供受 體結合試驗。 將上述經處理的細胞水溶液加入適量含有〇 . 〇 5nM [125I-Typ] (MK-678) 200OCi/mmol ； c [N-meyhyl-Ala- Tyr ( I125) -D-Trp-Lys-Val-Phe〕50Mm 的 HEPES 緩衝溶液 (ρΗ7·4)，而配製成各種不同濃度的溶液，（例如l〇_]1 至1〇-6Μ)，並加入10mg/ml的牛血淸蛋白（bovine serum albumin ，fraction V，Sigma Chemical Co.,St. Louis M〇），氯化鎂（MgClO (5mM)、Trasylol( 200KIU/ml)、 bacitracin(0.02mg/ml)、以及 phenylmethyl-sulphonyl fluoride (0.02mg/ml)，然後取 0.3ml 置於 25°C下，培 養90分鐘。然後，利用已預浸0.3%polyethy lenimine溶 液30分鐘的GF/C濾紙配合過濾器（Brandel， Gaithersburg，MD)快速過爐以終止培養，並且每一個試 管在過濾後，隨即以冰冷的Buffer A淸洗三次。指定的 18 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---- tr---------. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 514642 A7 B7 1 352pif2.doc/008 五、發明說明（（G) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 結合量（spec i f i c binding )被定義成：總〔Hyp] (MK-678 )結合量減掉存在於200nM生長激素釋放抑制因 子-14的結合量。 接著，重複上述步驟進行下列胜肽類實M : Somatostatin-14、Somatostatin-28、同類物 I、问乂頁物 II、同類物III、同類物IV與同類物V’同類物ί至v 的結構如上所述，而上述各胜肽類的Κι値由下列的公式 計算而得：

Ki = IC5。/〔 1+ ( LC/LEC)〕其中 IG。：抑制50%的放射性配位體〔125I-Typ〕（MK-678 ) (〇·05ηΜ)特定結合，所需的胜肽類濃度。 LC :放射性配位體〔125I-Typ〕（ MK-678 )的濃度 (〇_〇5nM) 〇 LEC:放射性電位體的平衡解離常數（〇·155ηΜ) ° 由上式所計算而得的各種胜肽類之Μ値，請參照表I (SSTR-2)所示。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將取自於美國菌種中心（ATCC)，之ATCC No. CCL61 (Rockville，MD)中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary ; CH0-K1)轉植人類的SSTR-5 cDNA，上述方法記 載於 Yamada 等人在 Proc. Natl. Acad . Sc i . USA，89 : 251 -255 ( 1992 )所發表的內容。或是一般的分子生物標 準技術，例如 Pate 1 等人在 Biochem· BioDhv · Res · Commun . 198:605( 1994)所發表的內容。接著，將已轉植人類SSTR-5 1 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 514642 A7 B7 1 352pif2.doc/008 五、發明說明（0) 的CHO-K1細胞加入20ml的冰冷50mM Tris-HCl緩衝溶液 (Buffer A)，然後，以 POLYTRONtm 均質機（Brinkmann Instrument，Westbury，NY)，調整 setting 6，攪拌 15 秒鐘，以形成均質化的粗製細胞膜。其次，將上述樣品以 Buffer A稀釋至最終體積40ml。然後，進行離心程序， 將樣品置於0-4 C的離心機（DuPont，Newton，CT)中， 39000g的速度下離心10分鐘，接著，將上淸液輕輕倒出， 並丟棄。然後，將離心所殘餘的部份加上Buffer A重複 如上述均質、稀釋、與離心步驟，最後殘餘的部份，與10Mm 的Tris HC1緩衝溶液混合，並存於冰冷的環境，以供受 體結合試驗。 將上述經處理的細胞水溶液加入適量含有0.05nM [125I-TyrM] somatotatin-14 ( 2000Ci / mmol ? Amer shan Corp.，Alington Heights，IL) 50Mm 的 HEPES 緩衝溶液 (pH7.4)，而配製成各種不同濃度的胜肽類溶液，（例 如 10·11 至 10_6M)，10mg/ml 的牛血淸蛋白（bovine serum albumin，fraction V，Sigma Chemical Co.,S t . Louis M〇），氯化鎂（5mM)，Trasylol( 200KIU/ml)，bacitracin (0.02mg/ml )以及 phenylmethyl-sulphonyl fluoride (0.02mg/ml )，然後取0.3ml置於30°C下，培養90分鐘。 然後，利用已預浸〇.3%polyethylenimine溶液30分鐘的 GF/C 濾紙配合過濾器（Brandel，Gaithersburg，MD)快 速過濾以終止培養，並且每一個試管在過濾後，隨即以冰 冷的5m 1 Bu f fe r A淸洗二次。指定的結合量（）被疋義 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 514642 A7 B7 1 3 5 2pif2 . doc/008 五、發明說明（) 成：總〔125I - Ty r11〕somas t os t a t i η 14結合量減掉存在於 1〇〇0ηΜ生長激素釋放抑制因子受體第五類螯合劑61皿-23052 ( H2-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2) 的結合量。抑制常數K i値由下列的公式計算而得：K i = IC5。/ 〔1+ (LC/LEC)。其中，IC5〇是抑制50%的放射性螯合劑 〔1251-Tyr11〕somatostatin-14 (0_05nM)特定結合，所需 的胜肽類濃度；LC是放射性螯合劑的濃度（0.05nM) ; LEC 則是放射性螯合劑的平衡解離常數（〇.16nM)。由上式所 計算而得的各種胜肽類之解離常數Κι，請參照表I (SSTR-5)所示。 同時，表I也標示人類各別的SSTR-2，SSTR-5之抑制 常數Ki比率，在本發明之中的胜肽類，例如同類物I-V， 其所得的比率比預期的大，因此，SSTR-5的選擇性大於 SSTR-2 。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 514642 A7 R7 1 352pif2.doc/008 五、發明說明（（I )

表I 成 份 SSTR-2 SSTR-5 SSTR-2/ SSTR-5 Somatostatin- 14 0.187 0.883 0.212 Somatostatin- 28 0.242 0.383 0.632 同類物I 15. 1 0.376 40.2 同類物11 13.0 2.63 4.94 同類物III 14.7 1.21 12.1 同類物IV 19.3 0.928 20.8 同類物V 129 2.43 53.1 同類物VI 6.19 0.34 18.2 同類物VII 8.07 4.125 1.94 同類物VIII 4.78 0.27 17.7 同類物IX 6.205 4.77 1.30 同類物X 15.0 0.744 20.1 同類物XI 34.83 28.04 1.24 同類物XII 59.20 5.78 10.2 同類物XIII 32.32 2.01 16.1 雖然本發明已以一較佳實施例揭露如上，然其並非用 以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精 神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 4^^--------訂---------線^^- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 514642 A7 B7 1 352pif2.doc/008 五、發明說明（#) 護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者爲準 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----- 訂---------線* 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1. 514642 1 352pif2.doc/008 六、申請專利範圍 A8 HB8-* C8

   1. 一種具有下列分子式之胜肽類： Ri Ai -A2-A3-A4-D-Trp-Lys -A7-A8-A9-R3 R2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其中I是半胱胺酸或Mpa的D-或L-的異構物； A2是天門冬醯酸、麩胺醯酸、脂肪族胺基酸、 苯丙胺酸（Phe)、色胺酸（Trp)、酪胺酸（Tyr)、 酪胺酸（I ) (Tyr-(I))、/3 -Nal、5 -Nal、或刪 除； A3是苯丙胺酸（Phe)、色胺酸（Τι*ρ)、酪胺酸 酪胺酸（Ί ) (Tyr · (I))、/? -Nal 或 5 -Nal ; A4是組胺酸或苯丙胺酸（Phe)、色胺酸（Trp)、 酪胺酸（Ty〇、酪胺酸（I) (Tyi-(I))、/5 -Nal 或 δ -Nal ; A7是断胺酸、絲胺酸、或脂肪族胺基酸； A8是苯丙胺酸（Phe)、色胺酸（Trp)、酪胺酸 (Ty〇、酪胺酸（I) (Tyr-(I))、/3 -Nal 或 δ -Nal ; A9是D-或L-的半胱胺酸； Rl、R2分別是氣基，以及 R3是胺基（NH2)。 2.如申請專利範圍第1項所述之胜1 別是苯丙胺酸（Phe)、p-X-Phe(X是 基、甲基、或硝基）、o-X-Phe(X是歯素 甲基、或硝基）、吼陡-A1 a、色胺酸 (Tyr)

   其中A3、As分 羥基、甲氧 •甲氧基、 户-Nal、2,4- dichloro-Phe、酪胺酸（I)、或iVPhe，而A4是組胺酸、 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 514642 A8 1 ， B8 C8 1 3 5 2pif2 . doc/OO8 D8 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 苯丙胺酸、p-X-Phe (X是鹵素、羥基、甲氧基、甲基、或 硝基）、〇-X-Phe (X是鹵素、經基、甲氧基、甲基、或硝 基）、吼陡-A1 a、色肢酸、p_Nal、2,4-dichloro-Phe、 酪胺酸（I)、或F5-Phe。 3·如申請專利範圍第2項所述之胜肽類，其中a2是被 刪除的，而Αν是酥胺酸、絲胺酸、丙胺酸、A1 b、纈胺酸、 白胺酸、異白胺酸、Nle、Nva、或Abu ◦ 4·如申請專利範圍第3項所述之胜肽類，其中A9是半 月光胺酸。 5·如申請專利範圍第4項所述之胜肽類，其中a3、A8 分別是苯丙胺酸（Phe)、p-X-Phe (X是鹵素、羥基、或 甲基）、酪胺酸（I)、或色胺酸，而A4是組胺酸、苯丙 胺酸、P-X-Phe ( X是鹵素、羥基、或甲基）、酪胺酸（I )、 或色胺酸。 6·如申請專利範圍第5項所述之胜肽類，其中A7是酥 胺酸或絲胺酸。 s 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 7. 如申請專利範圍第6項所述之胜肽類，其中A3苯丙 胺酸、p-X-Phe(X是鹵素、羥基、甲氧基、甲基、或硝基）、 組胺酸、酪胺酸（I)、或色胺酸，而A8是苯丙胺酸、p-X-Phe (X是鹵素、羥基、甲氧基、甲基、或硝基）。 8. 如申請專利範圍第6項所述之胜肽類，其中A3是苯 丙胺酸，而A4是苯丙胺酸、酪胺酸、酪胺酸（I)、或色 胺酸，而A8是苯丙胺酸。 9. 如申請專利範圍第8項所述之胜肽類，其分子式如 25 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 514642 A8 ' ， B8 1352pif2.doc/008 惡 六、申請專利範圍 下： H2-C C Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys] -NH2 ? H2-C C D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys ] -NH2 9 H2-C [Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys] -NH2 ? H2-C〔 Cys-Phe-Phe_D_Trp_Lys-Ser-Phe，Cys〕-NH2， H2-C CCys-Phe-Tyr ( I ) -D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys] -NH2 ? 10. 如申請專利範圍第7項所述之胜肽類，其分子式 如下： H2-c〔 Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕-冊2， H2-C [ D-Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys] -NH2 ? H2-c [ Cys-Phe-Hi s-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys] -NH2 5 H2-c [ D-Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys ] -NH2 5 H2-C〔 D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys〕-NH2， H2-C [D-Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys] -NH2 ? H2-C [Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys] -NH2 ? H2-C [D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys] -NH2 j H2-c[ D-Cys-Phe-Tyr( I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys ] -NH25 H2-C [ Cys-Phe-Tyr ( I) -D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys] -NH2 5 或 H2_c 〔D_Cys，Phe_Tyr (I) _D_Trp-Lys-Ser-Phe，Cys〕 -NH2。 11. 如申請專利範圍第2項所述之胜肽類，其中八2是 天門冬醯酸、麩胺醯酸、丙胺酸、Aib、纈胺酸、白胺酸、 異白胺酸、N1 e、Nva、Abu、苯丙胺酸、p-X-Phe ( X是鹵 素、羥基、甲氧基、甲基、或硝基）、〇-X-Phe(X是鹵素、 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 514642 A8 * · B8 1 352pif2.doc/008 毯 六、申請專利範圍 羥基、甲氧基、甲基、或硝基）、吡啶-Ala、色胺酸、A-Nal、 2,4-二氯-?1^、酪胺酸（1)、或？5-?1^，而八7是酥胺酸、 絲胺酸、丙胺酸、A i b、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、N1 e、 Nva 、 Abu 〇 12. 如申請專利範圍第11項所述之胜肽類，其中A9是 半胱胺酸。 13. 如申請專利範圍第12項所述之胜肽類，其中A3、 A8分別是苯丙胺酸、p-X-Phe(X是鹵素、羥基、或甲基）、 酪胺酸（I)或色胺基，而A4是組胺基、苯丙胺基、p-X-Phe (X是鹵素、羥基、或甲基）、酪胺酸（I)、或色胺酸。 14. 如申請專利範圍第Π項所述之胜肽類，其中八2是 天門冬醯胺或麩胺醯胺，而A7是酥胺酸或絲胺酸。 15. 如申請專利範圍第14項所述之胜肽類，其中A3是 苯丙胺酸，A4是苯丙胺酸、p-X-Phe (X是鹵素、經基、甲 氧基、甲基、或硝基）、組胺基、酪胺酸（I)、或色胺 基，而As是苯丙胺酸、或p-X-Phe (X是鹵素、羥基、甲 氧基、甲基、或硝基）。 16. 如申請專利範圍第15項所述之胜肽類，其中A3是 苯丙胺酸，而A4是苯丙胺酸、酪胺酸、酪胺酸（I )、或 色胺酸，而A8是苯丙胺酸。 17. 如申請專利範圍第16項所述之胜肽類，其分子式 如下： H2-C [ Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys ] -NH2 18. 如申請專利範圍第15項所述之胜肽類，其分子式 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 514642 A8 B8 C8 D8 l352pif2d〇C//〇〇8 六、申請專利範圍 如下： . c C D-Cy s - Asn -Phe - Phe - D-Trp- Ly s -Thr - Phe -Cy s ]-NH2 ’ H2-c C Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys) -NH2 5 H”c 〔 D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys 〕- NH2 ’ H2- c [ Cys-Asn-Phe-Hi s-D-Trp-Lys-Thr - Phe -Cys] -NH2 5 H2-C C D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys ]- NH2 ’ H2-C C Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys] -NH2 5 H2-c i D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys ]- Ha-c [ Cy s- Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys- Ser-Phe-Cys] -NH2 5 H2-c〔 D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys〕- NH2 ? H2-c〔Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys〕-NH2， H2-C 〔 D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys 〕- NH2 i H2-C [ Cys -Asn-Phe-Tyr (I) -D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕 -NH2 ’ H2-c [ D-Cys-Asn-Phe-Tyr ( I) -D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕 -NH2 ’ Y[2^c ( Cy s - Asn-Phe-Ty r (I) -D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys ] - NH2，或 . 28 t紙張尺度適家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐） # / ---------------------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 514642 A8 B8 1352pif2.doc/008 六、申請專利範圍 H2-c [ D-Cys-Asn-Phe-Tyr ( I ) -D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys] -NH2。 19.如申請專利範圍第1項所述之胜肽類，其分子式 如下： H2-C〔 Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys〕-NH2 〇 --- 丨丨！ I I —丨 I I I —訂丨 ------I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）