TW201816122A - 診斷子宮頸癌或評估子宮頸癌風險之方法及套組 - Google Patents
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Abstract
提供用於在個體中診斷子宮頸癌或評估發展子宮頸癌之風險之套組，該等套組含有用於偵測至少一種單核苷酸多型性（single nucleotide polymorphism，簡稱SNP）之試劑，例如引子。亦提供用於在個體中診斷子宮頸癌或評估發展子宮頸癌之風險之方法，該方法包含偵測至少一種SNP。
Description
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2016年10月26日申請之美國臨時申請案第62/413,088號之優先權及效益，其全部內容於此併入作為參考。
在背景部分中論述之主題不應僅僅由於其在背景部分中提及而假定為現有技術。類似地，在背景部分中提到之問題及對問題之起因的瞭解不應假定為先前已在先前技術中公認。背景部分中之主題僅表示不同之方法，其本身亦可為發明。
人類乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）測試廣泛用於子宮頸癌篩選。與不具有陰道HIV感染及子宮頸細胞學正常之女性相比，具有陰道HPV感染及子宮頸細胞學正常之女性更可能發展子宮頸癌及/或子宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）。HPV感染之診斷在女性中引起相當大之焦慮，因為子宮頸癌之風險增加。然而，除病毒感染以外，存在與子宮頸癌發展相關之宿主風險因素。
宿主風險因素之鑑別對於評估發展子宮頸癌之風險以及緩解具有陰道HPV感染之女性之焦慮而言具有重要意義。
因此，需要一種經濟而準確之診斷測試，預測子宮頸癌及/或子宮頸上皮內瘤變（CIN）發展之風險，而此需求尚未解決。本發明解決此需求及其他需求。
在一個實施例中，本發明揭示用於在個體中診斷子宮頸癌/CIN或評估發展子宮頸癌/CIN之風險之方法，該等方法包含偵測個體之檢測樣本中選自以下之至少一種單核苷酸多型性的步驟：rs17024091（SEQ ID NO:1）、rs2046542（SEQ ID NO:2）、rs1386286（SEQ ID NO:3）、rs3097662（SEQ ID NO:4）、rs3117221（SEQ ID NO: 5）、rs7759943（SEQ ID NO:6）、rs1333934（SEQ ID NO:7）、rs13347411（SEQ ID NO:8）或rs11651242（SEQ ID NO:9），其中至少一種SNP之存在表示個體中發展或患上子宮頸癌或CIN之風險增加。
在另一實施例中，本發明揭示用於在個體中診斷子宮頸癌/CIN或評估發展子宮頸癌/CIN之風險之方法，該等方法包含偵測個體之檢測樣本中選自以下之至少兩種SNP之步驟：rs8067378（SEQ ID NO: 10）、rs4282438（SEQ ID NO: 11）或rs1386286（SEQ ID NO: 3），其中至少兩種SNP之存在表示個體中發展或患上子宮頸癌或CIN之風險增加。
本發明亦揭示用於在個體中診斷子宮頸癌/CIN或評估發展子宮頸癌/CIN之風險之套組，該等套組包含用於偵測個體之檢測樣本中選自rs17024091、rs2046542、rs1386286、rs3097662、rs3117221、rs7759943、rs1333934、rs13347411或rs11651242之至少一種SNP之試劑。
本發明進一步提供用於在個體中診斷或評估發展子宮頸癌之套組，該等套組包含用於偵測個體之檢測樣本中選自以下SNP之至少兩種SNP之試劑：rs8067378、rs4282438或rs1386286。
在一個實施例中，本文所述之套組進一步包含標記，該標記指示試劑係用於偵測至少一種SNP以診斷或評估發展子宮頸癌/CIN之風險或診斷子宮頸癌/CIN。
本發明亦提供一組用於診斷子宮頸癌/CIN或評估發展子宮頸癌/CIN之風險之SNP，其中SNP選自由以下SNP組成之群：rs17024091、rs2046542、rs1386286、rs3097662、rs3117221、rs7759943、rs1333934、rs13347411、rs11651242、rs8067378與rs4282438之組合、rs8067378與rs1386286之組合、rs4282438與rs1386286之組合以及rs8067378、rs4282438及rs1386286之組合。提供用於在個體中診斷子宮頸癌或評估發展子宮頸癌之風險之方法，該等方法包含偵測來自上述SNP組之至少一種SNP之步驟。亦提供一種用於診斷子宮頸癌或CIN或評估發展子宮頸癌或CIN之風險之微陣列，其中該微陣列包含一組與至少一種以下SNP之多核苷酸雜交之多核苷酸：rs17024091、rs2046542、rs1386286、rs3097662、rs3117221、rs7759943、rs1333934、rs13347411、rs11651242、rs8067378與rs4282438之組合、rs8067378與rs1386286之組合、rs4282438與rs1386286之組合或rs8067378、rs4282438及rs1386286之組合。亦提供一種用於診斷子宮頸癌或CIN或評估發展子宮頸癌或CIN之風險之套組，該套組包含本文所述之微陣列。
用於此專利之術語「本發明（invention）」、「本發明（the invention）」、「本發明（this invention）」及「本發明（the present invention）」意欲廣泛地指代此專利及以下專利申請專利範圍之所有主題。含有此等術語之陳述應理解為不限制本文所述之主題或不限制以下專利申請專利範圍之涵義或範疇。此專利涵蓋之本發明之實施例由以下申請專利範圍而非此發明內容界定。本發明內容係本發明之各種態樣之高層次綜述且引入一些在以下實施方式部分中進一步描述之概念。本發明內容並非意欲鑑別所主張之主題之關鍵特徵或基本特徵，亦並非意欲單獨用於確定所主張之主題之範疇。主題應參照整個說明書之恰當部分、任一或所有圖式及各申請專利範圍來理解。
當閱讀附圖及以下實施方式時本發明將變得更清楚。
如本文所用，冠詞「一」係指一個或超過一個（亦即，至少一個）之語法對象。
術語「個體」可指疑似患有子宮頸癌之脊椎動物。個體包括溫血動物，諸如哺乳動物、諸如靈長類動物且更佳人類。非人類之靈長類動物同樣係個體。術語個體包括家養動物，諸如貓、狗等、家畜（例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等）及實驗動物（例如小鼠、兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠等）。在一個實施例中，個體具有陰道人類乳頭瘤病毒（HPV）感染。
本文中之所有數字均可由「約」修飾來理解。如本文所用，除非另外說明，否則術語「約」在提及可量測值時，意謂涵蓋指定值±10%、較佳±5%、更佳±1%且甚至更佳0.1%之變化，因為此類變化適合於同源性百分比。
用於根據本發明之一實施例評估發展子宮頸癌/CIN之風險或診斷子宮頸癌之多種單核苷酸多型性（SNP）包括SEQ ID NO: 1至11之至少一種多核苷酸序列。
表1
美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）資料庫中SNP之GenBank寄存編號指示SNP之序列及位置。所屬領域之技術人員容易使用GenBank寄存編號鑑別SNP之序列及位置。對應於SNP在NCBI中登記之rs號之特定序列可能隨時間推移變化。所屬領域之技術人員明白即使對應rs號改變，該等序列亦在本發明之範疇內。SEQ ID NO: 1至11之核苷酸序列係多態序列。多態序列係包括表示SNP之多態位點之多核苷酸序列。多核苷酸序列可為DNA或RNA。 用於診斷子宮頸癌/CIN或評估發展子宮頸癌/CIN之風險之方法
診斷方法包括自個體之檢測樣本分離DNA，確定DNA多態位點之鹼基序列，且當鹼基序列包括選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 9之至少一種SNP時判定個體患有子宮頸癌/CIN或具有高子宮頸癌/CIN發生率/概率。
在某些實施例中，提供用於在個體中診斷子宮頸癌或CIN或評估發展子宮頸癌或CIN之風險之方法，該等方法包含偵測個體之檢測樣本中選自rs8067378、rs4282438或rs1386286之至少兩種SNP之步驟，其中至少兩種SNP之存在表示個體中子宮頸癌/CIN或發展子宮頸癌或CIN之風險增加。在一例示性實施例中，該方法包含偵測rs8067378下之第一SNP及rs4282438下之第二SNP的步驟。在另一實施例中，該方法包含偵測rs8067378下之第一SNP及rs1386286下之第二SNP的步驟。在另一實施例中，該方法包含偵測rs4282438下之第一SNP及rs1386286下之第二SNP的步驟。在另一實施例中，該方法包含偵測rs4282438下之第一SNP、rs1386286下之第二SNP及rs8067378下之第三SNP的步驟。
本發明部分地基於測試檢測樣本中特定SNP之鑑別。本發明之一些實施例係關於評估個體是否患有子宮頸癌或處於發展子宮頸癌之風險下之方法，該等方法包含鑑別測試檢測樣本中之特定SNP。檢測樣本之非限制性實例包括來自外周血液白血球細胞、血清、細胞、組織或切片檢查之DNA。
在一些實施例中，分子概況分析亦可包括鑑別基因變異體，諸如目標之突變、多型性（例如SNP）、缺失或插入。舉例而言，鑑別基因中之SNP可藉由微陣列分析、實時PCR或定序來確定。本文中所揭示之其他方法亦可用於鑑別一或多個目標之變異體。
多型性可藉由任何可用方法來偵測，包括擴增、與探針或陣列雜交或其類似方法，參見索夫里諾（B Sobrino）等人, 法醫遺傳學中之SNP：關於SNP分型方法之評述（SNPs in forensic genetics: a review on SNP typing methodologies）, 《國際法醫科學（Forensic Science International）》, 第154卷, 第2-3期, 2005年11月25日, 第181-194頁。在一個特定實施例中，SNP偵測包括擴增多型性、連鎖基因座或與其相關聯之序列（例如側接序列、轉錄序列或其類似序列）及偵測所產生之擴增子。舉例而言，在一個實施例中，擴增包括a）將擴增引子或擴增引子對與自生物體或生物檢測樣本分離之核酸模板混合。引子或引子對可與接近或包括多型性或連鎖基因座之區域互補或部分互補，且能夠藉由聚合酶在核酸模板上起始核酸聚合。引子或引子對在包含聚合酶及模板核酸之DNA聚合反應中延伸，以產生擴增子。在某些態樣中，藉由如下方法或實時PCR分析視情況偵測擴增子，該方法包括使擴增子與陣列雜交，用限制酶消化擴增子。視情況，擴增子可例如藉由雜交完全或部分定序。通常，擴增可包括使用自生物體或生物檢測樣本分離之核酸作為聚合酶鏈式反應（PCR）、逆轉錄酶PCR（RT-PCR）或連接酶鏈式反應（LCR）中之模板進行PCR、RT-PCR或LCR。其他技術可取代擴增，例如使用分支DNA（bDNA）探針。
此等SNP包括與例如以下基因相關之SNP：TMEM178：跨膜蛋白178A；RPL32P9：核糖體蛋白質L32假基因9；RING1：環指蛋白1；VPS52：空泡蛋白分選52；NPAP1P4：核孔相關蛋白1假基因4；MTND2P9：粒線體編碼NADH：泛醌氧化還原酶核心子單元2假基因9；TNFRSF13B：腫瘤壞死因子受體超家族成員13B；IKZF3：IKAROS家族鋅指3；ZPBP2 ；
透明帶結合蛋白2；GSDMB：加斯蛋白（gasdermin）B；ORMDL3：ORM1樣3；LRRC3C：含有3C之富含白胺酸重複序列。相應地，與此等基因有關聯之多型性亦為可能與子宮頸癌多型性相關之較佳SNP。 用於診斷子宮頸癌及/或CIN或評估發展子宮頸癌及/或CIN之風險之套組
本發明亦提供用於診斷子宮頸癌及/或CIN或預測發展子宮頸癌及/或CIN之風險之套組。套組包含用於偵測位於rs17024091、rs2046542、rs1386286、rs3097662、rs3117221、rs7759943、rs1333934、rs13347411或rs11651242之至少一種以下SNP之試劑。
本發明進一步提供用於評估個體中發展子宮頸癌之風險之套組，該等套組包含用於偵測至少兩種以下SNP之試劑：rs8067378、rs4282438及rs1386286。在一例示性實施例中，套組包含用於偵測rs8067378下之第一SNP之第一試劑及用於偵測rs4282438下之第二SNP之第二試劑。在另一實施例中，套組包含用於偵測rs8067378下之第一SNP之第一試劑及用於偵測rs1386286下之第二SNP之第二試劑。在另一實施例中，套組包含用於偵測rs4282438下之第一SNP之第一試劑及用於偵測rs1386286下之第二SNP之第二試劑。在另一實施例中，套組包含用於偵測rsrs4282438下之第一SNP之第一試劑、用於偵測rs1386286下之第二SNP之第二試劑及用於偵測rs8067378下之第三SNP之第三試劑。
在一個實施例中，套組進一步包含使用試劑診斷子宮頸癌或CIN或評估發展子宮頸癌或CIN之風險之說明書。試劑可為所屬領域中已知用於偵測SNP之試劑。
試劑之非限制性實例包括用於分離及擴增DNA之引子組或能夠偵測至少一種SNP之雜交探針。術語「引子」係指聚合酶鏈式反應（PCR）反應中使用之寡核苷酸。適當引子組容易由所屬領域之技術人員，參考根據本發明之一實施例之序列設計。
在一些實施例中，需要使用微陣列。微陣列係能夠平行分析複雜生物化學檢測樣本之核酸、蛋白質、小分子、細胞或其他物質之顯微有序陣列。可使用多種技術，製造微陣列，該等技術包括用細尖之釘印刷至載玻片上、使用預先製備之遮罩進行光刻法、使用動態微鏡裝置進行光刻法、噴墨印刷或微電極陣列上之電化學。
根據本發明之某些實施例的用於診斷子宮頸癌之微陣列包括對偶基因特異性寡核苷酸（allele-specific oligonucleotide，ASO）探針（亦即，與SEQ ID NO:1-11之多核苷酸雜交之多核苷酸）。ASO探針可固定於塗有選自胺基-矽烷、聚-L-離胺酸及醛之活性基團之基板上。且，基板可由矽晶圓、玻璃、石英、金屬或塑膠構成。將多核苷酸固定在基板上之方法可為使用壓電進行微量移液或使用釘狀點樣器之方法。
根據本發明之一實施例用於診斷子宮頸癌/評估發展子宮頸癌之風險之套組包括本文所述之微陣列。
藉由下列實例說明本發明之實施例，不以任何方式將該等實例理解為對本發明之範疇強加限制。相反，可清楚地瞭解，在不脫離本發明精神之情況下，可採用在閱讀本文中之描述之後，所屬領域之技術人員能夠聯想到之各種其他實施例、其修改及等效物。除非另有說明，否則在以下實例中描述之研究期間，遵循常規程序。下文出於說明之目的，描述一些程序。實例 1 ：
全基因組關聯研究（GWAS）
如第1圖中所示，在組織學上診斷具有CIN2+
之507個病例（群組D1）對比920個女性對照（群組C）上，藉由Affymetrix Axiom™全基因組人類陣列進行642,832種單核苷酸多型性（SNP）之全基因組關聯研究（GWAS）作為發現組。
如第1圖中所示之非依賴性驗證組中，驗證來自GWAS之鑑別之75種CIN2+
相關SNP及來自文獻之4種子宮頸癌相關SNP。群組N [n=600]係來自基於群體之子宮頸細胞學及HPV共同測試研究的HPV陰性/正常細胞學女性，而群組D2 [n=306]係具有CIN2+
之女性。
在預測組（第1圖）中，對具有HPV陽性/正常（群組P，n=758）之個體隨訪且充當預測組。藉由邏輯回歸及接受者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析來分析預測效度。結果
群組P之三十二名個體進展至CIN2+（中值追蹤：56.5個月，範圍30.7-119.4）。在驗證組中證實自發現組鑑別的趨勢檢驗p值＜10-4
之七十五種SNP中之十種以及文獻報導之rs8067378，且認可與進展至CIN2+
相關（第2圖及表2）。
表 2
. 自發現組鑑別且在驗證組中證實的與發展CIN2+
或子宮頸癌之風險相關之SNP。
自將HPV類型組合之發現及驗證組產生rs8067378、rs4282438及rs1386286風險預測SNP圖，且在群組P中測試（靈敏度0.844，陰性預測值0.986，ROC 0.725）（表3）。
表 3
. 藉由HPV類型分層之群組P中風險-對偶基因之分佈及觀測到之進展至CIN2+ a
HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68.b
HPV6、11、26、32、37、42、43、44、53、54、55、61、62、67、69、70、71、72、74、81、82、83、84、L1AE5
如第3圖所示，與具有＞1個風險對偶基因之女性相比，攜帶≤1個風險對偶基因之女性具有顯著較低之子宮頸癌進展風險比值（0.21 [0.05-0.86]，p = 0.031）（≤ 1個風險對偶基因之1.7%對比＞1個風險對偶基因之10.7%）。
無
下文將參考以下圖式詳細描述本發明之說明性實施例： 第1圖係說明實例1中全基因組關聯研究（GWAS）之發現組、驗證組及預測組之研究設計的流程圖。 第2圖係曼哈頓圖（Manhattan plot），基於實例1之全基因組關聯研究，說明SNP與2級或更高級別（CIN2+
）子宮頸上皮內瘤變相關。 第3圖係展示不具有或具有一種風險SNP（≤1 SNP）之患者及具有超過一種SNP（＞1 SNP）之患者中子宮頸癌進展之累積發生率的圖。
＜110＞ 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院 (Chang Gung Memorial Hospital, Linkou) ＜120＞ 診斷子宮頸癌或評估子宮頸癌風險之方法及套組 ＜130＞ CGMH-LK-16010-TWI ＜160＞ 11 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 智人 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (26)..(26) ＜223＞ SNP rs17024091; n是c或t ＜400＞ 1 tatgagaaaa tacatacatg gtattnagca ccaatacttg atttcctata t 51 ＜210＞ 2 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 智人 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (26)..(26) ＜223＞ SNP rs2046542; n是a或g ＜400＞ 2 aaaaaagata gtgggttggt cagtgntttc ttacggctgc tctcacagat t 51 ＜210＞ 3 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 智人 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (26)..(26) ＜223＞ SNP rs1386286; n是a或g ＜400＞ 3 aaaaatgtga gcaggatggg aaaatncggc aaatgatggt cacatattct c 51 ＜210＞ 4 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 智人 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (26)..(26) ＜223＞ SNP rs3097662; n是c或t ＜400＞ 4 ctagatcaca tagacaccca ttattncatc cagttgttta ttttccccac c 51 ＜210＞ 5 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 智人 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (26)..(26) ＜223＞ SNP rs3117221; n是a或g ＜400＞ 5 aatcctctag accctaaact cagtgnggga ccctcaccat ccgtgtgcgg c 51 ＜210＞ 6 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 智人 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (26)..(26) ＜223＞ SNP rs7759943; n是a或g ＜400＞ 6 ttgttcttat aatgggatac tatacngcag ttaaatgaat tatagacata t 51 ＜210＞ 7 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 智人 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (26)..(26) ＜223＞ SNP rs1333934; n是g或t ＜400＞ 7 ttcaatcagg aaactttctg tagganattg accttggtct gtaaaggaaa g 51 ＜210＞ 8 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 智人 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (26)..(26) ＜223＞ SNP rs13347411; n是a或g ＜400＞ 8 tatattgtta ctttataaca gtttcngatg cagcaaggca atattatctc t 51 ＜210＞ 9 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 智人 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (26)..(26) ＜223＞ SNP rs11651242; n是a, g或t ＜400＞ 9 gtcactcagc ctctctgagt tccccncaat aagtattcat gaaggactta c 51 ＜210＞ 10 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 智人 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (26)..(26) ＜223＞ SNP rs8067378; n是a或g ＜400＞ 10 aaaaaatatt tgtaacgtta taaatnggga aaaacgttta tatcactgcc a 51 ＜210＞ 11 ＜211＞ 51 ＜212＞ DNA ＜213＞ 智人 ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (26)..(26) ＜223＞ SNP rs4282438; n是g或t ＜400＞ 11 acaggttaag tatccatact ccaagnaaat ttggagagca tttcccagag a 51
Claims (8)
- 一種用於在個體中診斷子宮頸癌或評估發展子宮頸癌之風險之方法，該方法包含偵測該個體中選自以下之至少一種單核苷酸多型性（SNP）之步驟：rs17024091、rs2046542、rs1386286、rs3097662、rs3117221、rs7759943、rs1333934、rs13347411、rs11651242、rs8067378與rs4282438之組合、rs8067378與rs1386286之組合、rs4282438與rs1386286之組合或rs8067378、rs4282438及rs1386286之組合，其中該等SNP中至少一種SNP之存在表示該個體發展子宮頸癌之風險增加。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中在血清檢測樣本中偵測該SNP。
- 如申請專利範圍第1項之方法，其中該個體具有陰道人類乳頭瘤病毒感染。
- 一種用於診斷子宮頸癌或評估發展子宮頸癌之風險之套組，該套組包含： 用於偵測個體之檢測樣本中選自以下之至少一種單核苷酸多型性（SNP）之試劑：rs17024091、rs2046542、rs1386286、rs3097662、rs3117221、rs7759943、rs1333934、rs13347411、rs11651242、rs8067378與rs4282438之組合、rs8067378與rs1386286之組合、rs4282438與rs1386286之組合或rs8067378、rs4282438及rs1386286之組合。
- 如申請專利範圍第4項之套組，其中該檢測樣本係來自血液白血球細胞之DNA。
- 如申請專利範圍第4項之套組，其中該試劑係引子。
- 如申請專利範圍第4項之套組，其中該試劑係對偶基因特異性寡核苷酸（ASO）探針。
- 如申請專利範圍第4項之套組，其進一步包含標記，該標記指示該試劑用於偵測子宮頸癌之風險。
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