CN111304323A - 一组评估nk/t细胞淋巴瘤发病风险相关的snp标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一组评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险相关的SNP标志物，所述SNP标志物为rs13015714，rs9271588和rs9277378位点。本发明检测者取材方便，只需要外周血而不需要其他组织样本，操作简单通过精简和特异的扩增引物检测SNP，再通过SNP分型评价个体发病风险。采用本发明的分子诊断方法可更加精准确立NK/T细胞淋巴瘤高危人群并指导其采取预防干预措施，在提高适用性的同时增加了灵敏度，从而进一步应用到科研和临床工作中去。

Description

一组评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险相关的SNP标志物及其 应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一组评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险相关的SNP标志物及其应用。

背景技术

NK/T细胞淋巴瘤(Extranodal natural killer/T cell lymphoma，NKTCL)是一种来源于NK细胞或T细胞的较为少见的非霍奇金淋巴瘤。该病在西方白种人群的发病率很低，在亚洲、南美地区相对高发，其中东亚地区的发病率为0.13-0.25/10万人，提示NK/T细胞淋巴瘤发病可能受易感基因影响。大多数NK/T细胞淋巴瘤发生于鼻腔和鼻旁窦，其临床表现为侵袭性强，对化疗不敏感，极易产生耐药，生存期短，预后差，晚期5年生存率不到50％。该肿瘤早期症状和体征不典型导致早期诊断较为困难，因此开发用于NK/T细胞淋巴瘤发病风险评估的分子标记物，有助于鉴定NK/T细胞淋巴瘤高危个体，为其早期预防干预提供遗传学参考依据，从而达到提高患者早诊率，降低死亡率的目标。

遗传多态性是指同一生物群体中有两种或两种以上变异类型或基因型并存的现象，其中单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是最主要的也是最常见的可遗传变异，广泛分布于人类基因组中。已有较多研究证实，存在特定SNP导致不同个体对疾病易感性不同。在病例-对照研究中，组间SNP最小等位基因频率分布差异显著性及优势比(odds ratio，OR)是评估SNP易感性的重要参数，OR越大提示发病风险越高。

目前，NK/T细胞淋巴瘤的发病机制复杂受环境和遗传因素共同作用，单个SNP评估NK/T细胞淋巴瘤的发病风险较低(OR<2)。另外亚洲之外的NK/T细胞淋巴瘤高发地区人群易感性尚未在得到验证。

综上，获得针对亚洲NK/T细胞淋巴瘤高发人群的检测SNP是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一组评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险相关的SNP标志物，所述标志物专门针对亚洲NK/T细胞淋巴瘤高发人群。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一组评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险相关的SNP标志物为rs13015714，rs9271588，rs9277378。

高通量SNP分型芯片(SNP Array)，一次可检出超过100万个标签SNP，基于该芯片分型结果，全基因组关联分析方法(Genome-Wide Association Study，GWAS)，可高效地筛选出疾病的易感SNP。发明人利用全基因组关联分析方法获得一个NK/T细胞淋巴瘤的风险位点：HLA-DPB1区间rs9277378(P＝4.21×10-19，OR＝1.84)。在此基础之上，通过700个NK/T细胞淋巴瘤患者和7752个对照的研究，发现位于染色体2q12.1的rs13015714位点和位于HLA-DRB1区间的rs9271588位点也是NK/T细胞淋巴瘤易感SNP位点。

同时获得上述三个SNP位点的前后10bp序列信息，如下：

rs13015714，CTTTTCCTTT[G/T]GTTAAATAAC

rs9271588，GTTATTAGAA[C/T]AGGGTTGTGG

rs9277378，CCATGTAGCC[A/G]GATAAGTATT

对上述三个易感位点的rs13015714，rs9271588，rs9277378分析发现，当个体的三个位点均携带至少一个风险型等位基因时(rs13015714-G，rs9271588-C，rs9277378-A)，其发病风险较三点均为保护型纯合个体(rs13015714-T，rs9271588-T，rs9277378-G)显著提高(OR>5.76)。

因此，可根据rs13015714，rs9271588，rs9277378的不同基因类型判定是否NK/T细胞淋巴瘤发病风险。

上述三个风险易感位点采用以下方法获得：

1.样本收集：本发明采用病例-对照研究设计，收集NK/T细胞淋巴瘤(NKTCL)患者和无癌对照的外周血标本以及临床资料。

2.基因组DNA准备和基因分型：使用QIAamp DNA Blood Midi kit Cat no.51185对提取基因组DNA。基因组SNP分型采用Illumina OmniZhongHua-8BeadChips、IlluminaOmniExpress-24v1BeadChips芯片，芯片覆盖中国群体中的常见和稀有变异。

3.样本基因分型质量控制：使用PLINK软件对原始基因分型数据分别在SNP层面和样本层面进行分型质量控制。

4.统计分析：全基因组关联分析结果发现SNP rs13015714、rs9271588和rs9277378与NK/T细胞淋巴瘤的发病密切密切相关。同时携带rs13015714-G、rs9271588-C、rs9277378-A的个体，较rs13015714-T、rs9271588-T、rs9277378-A的纯合型个体具有更高的发病风险。

本发明还提供了一组扩增上述三个SNP位点的引物，其引物序列如下：

本发明还制备了评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险的试剂盒，其中包括检测上述三个SNP位点的引物。使用本发明的试剂盒通过PCR反应扩增，对获得的条带单一的PCR产物进行sanger测序，从而获得该片段的序列信息，根据序列信息比对得到待测者的相应的基因型，可分辨杂合子携带者，再根据上述三个位点基因型信息对个体的NK/T细胞淋巴瘤发病风险进行评估，划分风险等级。

本发明还提供了一组与权利要求1所述的评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险相关的SNP标志物强连锁的SNP位点，如本发明说明书表5所示，其中与所述rs13015714强连锁的SNP有192个；与所述rs9271588强连锁的SNP有13个；与所述rs9277378强连锁的SNP有209个。

与rs13015714、rs9271588、rs9277378强连锁的位点，对NK/T细胞淋巴瘤发病风险具有相似的解释作用，可通过检出本发明所举三个位点即可涵盖这些位点的NK/T细胞淋巴瘤发病风险预测作用。

本发明的有益效果：

(1)本发明检测者取材方便，只需要外周血而不需要其他组织样本，操作简单通过精简和特异的扩增引物检测SNP，再通过SNP分型评价个体发病风险。

(2)采用本发明的分子诊断方法可更加精准确立NK/T细胞淋巴瘤高危人群并指导其采取预防干预措施，在提高适用性的同时增加了灵敏度，从而进一步应用到科研和临床工作中去。

附图说明

图1为rs13015714-G/T杂合型(NKTCL风险型)位点sanger测序信号峰图，图中箭头所指出现双峰。

图2为rs9271588-T/T纯合型(NKTCL保护型)位点sanger测序信号峰图。

图3为rs9277378-A/A纯合型(NKTCL风险型)位点sanger测序信号峰图。

图4为rs13015714引物的PCR产物sanger测序所得序列比对信息图。

图5为rs9271588引物的PCR产物sanger测序所得序列比对信息图。

图6为rs9277378引物的PCR产物sanger测序所得序列比对信息图

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细描述。

实施例1

一、提取样本中的DNA：

抽取2ml全血，用试剂盒QIAamp DNA Mini Kit Cat.No.51304抽提DNA，具体步骤如下：

(1)取200ul QIAGEN蛋白酶加入15ml离心管中，加入2ml血样本，震荡混匀；

(2)加入2.4ml AL缓冲液并充分震荡混匀，70℃水浴孵育10分钟；

(3)加入2ml无水乙醇，颠倒混匀；

(4)取一半体积的上述液体加入15ml QIAGEN分离柱中，3000g离心3分钟，弃滤液；

(5)将(3)剩下的液体按照(5)重复；

(6)往分离柱中加入2mlAW1，3000g离心1分钟，弃滤液；

(7)往分离柱中加入2mlAW2，3000g离心1分钟，弃滤液；

(8)分离柱3000g离心1-2分钟，准备新的15ml收集管；

(9)洗脱DNA:向分离柱中加入150ulAE缓冲液，室温静置5分钟，3000g离心1分钟，重复该步骤一次彻底洗脱DNA。

二、基因组SNP分型：

(1)DNA样品扩增

1)实验前准备：预热杂交炉到37℃，让MA1，MA2和MSM室温自然解冻，轻轻颠倒10次使其充分混匀。

2)往MSA1板的每孔加入20ul的MA1和4ul的DNA样品及4ul浓度为0.1N的NaOH。

3)用膜将MSA1板密封，1600转震荡1分钟，280g离心1分钟，室温孵育10分钟。

4)小心打开膜，每孔加入68ul的MA2，再加入75ul的MSM。

5)用膜将MSA1板密封，1600rpm震荡1分钟，280g离心1分钟。

6)将加好试剂的MSA1板放在37℃的杂交炉孵育杂交20-24小时。

(2)将DNA片段化

1)将深孔加热模块预热到37℃，FMS管室温溶解，轻轻颠倒10次。

2)取出MSA1板，280g离心1分钟，每孔加入50ul的FMS。

3)用96孔圆形盖密封MSA1板，1600rpm震荡1分钟，280g离心1分钟，37℃孵育1小时。

(3)DNA沉淀

1)准备工作：热盖到37℃，将PM1室温溶解，轻轻颠倒10次让其充分混匀。

2)揭开MSA1板的盖子，每孔加入100ul的PM1。

3)用盖子密封板，1600rpm震荡分钟，37℃孵育分钟。

4)280g离心1分钟，每孔加入300ul 100％2-丙醇。

5)用新的盖子轻轻将MSA1板子密封，注意不要摇晃板子，直到用盖子将板子完全密封。

6)颠倒至少10次让试剂充分混匀，4℃孵育30分钟。3000g 4℃离心20分钟。

(4)DNA重悬

1)准备工作：预热杂交炉48℃，打开热风机预热。在20-25℃水浴溶解RA1试剂，轻轻混匀直到试剂里面晶体全部溶解。

2)往MSA1板每孔加入46ul RA1。

3)用锡箔纸将MSA1板完全密封，然后放在杂交炉48℃孵育1小时，后1800rpm离心1分钟，280g轻甩离心。

(5)杂交到微珠芯片

1)准备工作：热盖到95℃，准备杂交炉预热到48℃，设置摇晃速度为5。

2)将重悬的MSA1板子放在加热板95℃变性20分钟。

3)往杂交盒的槽子里面加入400ul的PB2，用盖子盖住防止液体蒸发。

4)将杂交盒室温放置实验台，直到芯片加入DNA样品。然后在1小时以内将芯片放进杂交盒。

5)孵育20分钟后，将MSA1板拿出放置室温30分钟冷却，280g离心，去掉锡箔纸盖。

(6)芯片装载

打开包装，将芯片按照条形码插入杂交盒。记录样品编码和芯片位置。装配芯片杂交：将装有芯片的杂交盒放入illumina的杂交盒里面。杂交盒放在48℃的illumina机器杂交炉，开始摇晃，速度为5。

(7)重悬XC4试剂扫描芯片

往XC4瓶子中加入330ml的100％的EtOH，终体积为350ml。摇晃瓶子，保证其充分重悬混匀。XC4试剂室温使用。

(8)洗芯片

将杂交盒从机器上取出，实验台冷却30分钟。将线柄连接到架子上，将洗盘完全浸泡在带有200mlPB1的洗槽。将杂交盒垫从杂交盒中移除。将芯片从杂交盒垫中移出，盖子从芯片上移除。芯片放入洗槽，保证芯片完全覆盖在PB1中。然后拿着架子在水中晃动1分钟。然后再换新的一缸PB1重复洗一遍。

(9)延伸和芯片着色

实验前准备：组装Flow-Through盒，室温溶解RA1，最好25℃水浴溶解，轻轻混匀试剂。然后将其他所需试剂解冻，恢复到室温。确认water circulator reservoir加满水，和打开water circulator将温度设定为44℃。使用温度计确认水温度为44℃。确保将chamberrack的全部气泡排掉，使用illumina的温度计保证温度为44℃±0.5℃。保证温度计是触摸到chamber rack。

(10)单碱基延伸

1)当chamber rack温度达到44℃时，快速将flow-through chamber装进ChamberRack。

2)保证每个flow-through chamber放在rack的位置是正确的，以保证rack和chamber之间有足够的热交换。

3)剧烈摇晃XC4瓶子保证试剂充分混匀。

4)在每一个flow-through chamber的孔里面分别加入以下试剂：

a)150ul的RA1，孵育30秒，重复5次。

b)450ul的XC1，孵育10分钟。

c)450ul的XC2，孵育10分钟。

d)200ul的TEM，孵育15分钟。

e)450ul的甲酰胺/1mM的EDTA，孵育1分钟。重复一次。

f)孵育5分钟。

g)将Chamber Rack的温度升至STM管的温度。

h)450ul的XC3，孵育1分钟，重复一次。

5)等待Chamber Rack达到合适的温度。

(11)芯片着色

1)打开scanner，待激光稳定。

2)往flow-through chamber的每孔加入以下试剂：

a)250ulSTM，孵育10分钟。450ulXC3，孵育1分钟，孵育两遍。等待5分钟。重复以上步骤三次。

b)250ulATM，孵育10分钟。450ulXC3，孵育1分钟，孵育两遍。等待5分钟，重复以上步骤三次。

c)立即将flow-through chambers从Chamber Rack拿出，室温水平放在实验台。

(12)洗芯片

1)准备两个盒子，一个标记PB1和标记XC4。同时往标记PB1的盒子添加310ml的PB1.

2)将staining rack浸泡在洗盒里面，然后拆开，取出芯片，将芯片浸泡在PB1里面。

3)慢慢的将staining rack上下移动10次，以将表面的试剂洗掉，然后让其浸泡在PB1里面5分钟。

4)摇晃XC4的试剂瓶，往标记XC4的洗盒加入310ml的XC4。同时将staining rack从PB1转移到XC4。

5)慢慢的将staining rack上下移动10次，将表面的试剂洗掉，然后让其浸泡在XC4里面5分钟。

6)将staining rack放在一个干净的芯片管架上，注意barcode朝上。

7)将管架放在真空干燥器，使用675mmHg(0.9bar)，干燥50-55分钟。

8)用蘸有酒精的吸水纸将芯片背面擦干净，同时将使用完的仪器用相应的试剂清洗干净。

(13)芯片扫描

使用illumina的iScan系统对芯片进行扫描，记录扫描结果存放的位置。然后使用Illumina提供的GenomeStudio进行基因分型。

二、样本基因分型质量控制：

我们使用工具PLINK对样本分型结果进行严格控制，在SNP层面，先移除最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)<1％或者在对照中显著偏离HWE检验(P<10-6)的SNP，接着移除在SNP可读率(call rate)<95％或者是在分型缺失率(missing rate)在病例对照组中存在显著差异的SNP(P<10-5)。在样本层面，我们舍弃总体SNP可读率＜95％的样本，接着舍弃杂合度偏离总体样本的极端值(平均值±3倍标准差之外的样本)，同时移除具有亲缘关系的一级二级亲属对中可读率较低者，最后使用主成分分析(principalcomponent analysis,PCA)方法检测人群分层现象，舍弃离群样本。

三、数据处理与结果分析

本发明通过700个NK/T细胞淋巴瘤患者和7752个对照的研究，检出位于染色体2q12.1的rs13015714(P＝3.36×10^-8，OR＝1.37)和位于HLA-DRB1区间的rs9271588(P＝1.76×10^-13，OR＝1.52)是NK/T细胞淋巴瘤新的易感SNP。

本发明对三个易感位点的rs13015714，rs9271588，rs9277378分析发现，当个体的三个位点均携带至少一个风险型等位基因时(rs13015714-G，rs9271588-C，rs9277378-A)，其发病风险较三点均为保护型纯合个体(rs13015714-T，rs9271588-T，rs9277378-G)显著提高；三个位点均为风险型等基因纯合的个体其发病在三组人群中最高，结果见表1。

表1.利用三个NK/T细胞淋巴瘤风险位点评估个体发病风险等级。

实施例2预测试剂盒的制备方法

(1)用上述方法提取待测者外周血基因组DNA。

(2)利用特异的引物扩增包含rs13015714，rs9271588，rs9277378三个位点的片段，以下是引物信息如表2：

表2：扩增引物

(3)PCR反应体系和条件：

反应体系如下表3：

表3：反应体系

试剂	使用量	终浓度
			5xPCR缓冲液	2μl
dNTP Mixture(2.5mM)	2μl	200uM
			氯化镁	1μl
正向引物	6pmol	0.5uM
			反向引物	6pmol	0.5uM
待测者外周血基因组DNA	100-200ng
			DNA聚合酶	1μl	1U/20μl
去离子水	加至20μl

反应条件表4：

表4：反应条件

(4)电泳：进行DNA电泳质检目的条带(片段大小符合预期，条带单一，亮度适中)。

(5)Sanger测序：对获得的条带单一的PCR产物进行sanger测序。利用上述方向引物进行方向测序，从而获得该片段的序列信息，结合测序结果ab1格式的峰图文件。

(6)测序结果分析：根据序列信息比对得到待测者的相应的基因型，峰图可分辨杂合子携带者。

(7)发病风险评估：根据三个位点基因型信息对个体的NK/T细胞淋巴瘤发病风险进行评估，划分风险等级。

实施例3应用实例

通过上述方法对3例样本进行SNP分型。

以下针对3例样本进行SNP基因分型为例：

一、样本DNA的制备：按照实施例1的方法提取DNA，DNA为浓度45ng/ul，约50ul，260/280＝1.88

二、进行sanger测序，使用的序列与对应的引物为反向互补序列(见表2)。，获得含有三个SNP的测序峰图及基因型信息，结果如图1～3所示：这三个峰图均可清晰辨别所检测SNP的信号，表明对应的引物序列设计合理，PCR产物准确可靠。

三、测序所得序列与参考基因组比对：

利用在线比对数据库(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)，将sanger测序所得序列比对至人参考基因组(GRCh37)。结果如图4-6所示，对比结果表明，PCR所得的产物均位于为预先设计的扩增区间，覆盖所检测的SNP(见表2)。

考虑到上述三个SNP可能存在与之强连锁不平衡的位点。我们利用公共数据库1000Genomes的东亚人群(共504个)，在每个位点的上下游1Mb区间内，计算与该位点呈强连锁不平衡的SNP(r²>0.8)。其中与rs13015714强连锁的SNP有192个；与rs9271588强连锁的SNP有13个；与rs9277378强连锁的SNP有209个，如表5所示。与rs13015714、rs9271588、rs9277378强连锁的位点，可能对NK/T细胞淋巴瘤发病风险具有相似的解释作用，但可通过检出本发明所举三个位点即可涵盖这些位点的NK/T细胞淋巴瘤发病风险预测作用。

表5：与rs13015714、rs9271588、rs9277378强连锁的SNP

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 贝锦新、林国旺、彭柔君、陈杰荣

<120> 一组评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险相关的SNP标志物及其应用

<130> 12.13

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tgaacatttt gcctgtcggc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ctccgcgtct caagtacaca 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gtgcacctac cctcactttc a 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tgctaatgaa gctccccctg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cccccagact cagattccct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tcctctagcc agcaccctta 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> HUMAN

<400> 7

cttttccttt ggttaaataa c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> HUMAN

<400> 8

gttattagaa cagggttgtg g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> HUMAN

<400> 9

ccatgtagcc agataagtat t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> HUMAN

<400> 10

cttttccttt tgttaaataa c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> HUMAN

<400> 11

gttattagaa tagggttgtg g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> HUMAN

<400> 12

ccatgtagcc ggataagtat t 21

Claims (6)

1.一组评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险相关的SNP标志物，其特征在于，所述SNP标志物为rs13015714，rs9271588和rs9277378位点。

2.一种评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险的检测试剂盒，其特征在于，包括检测如权利要求1所述的SNP位点的扩增引物。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO:1～6所示。

4.一种评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险的方法，其特征在于，通过检测如权利要求1所述的SNP标志物，鉴定所述SNP标志物扩增产物的基因类型，当检测结果中包含以下任意一种基因类型则判定为中度风险人群；当包含以下任意两种或两种以上的基因类型则判定为高度风险人群：

rs13015714的基因类型为rs13015714-G时；rs9271588的基因类型为rs9271588-C时；或rs9277378的基因类型为rs9277378-A时。

5.用于评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险的核苷酸序列，其特征在于，包括如SEQ ID NO:7～12所示的核苷酸序列。

6.一组与权利要求1所述的评估NK/T细胞淋巴瘤发病风险相关的SNP标志物强连锁的SNP位点，其特征在于，如本发明说明书表5所示，其中与所述rs13015714强连锁的SNP有192个；与所述rs9271588强连锁的SNP有13个；与所述rs9277378强连锁的SNP有209个。

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