TWI783352B - 評估罹患子宮頸癌之風險之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供用於診斷或評估個體發展為子宮頸癌之風險之方法，包含偵測至少一種本文中揭露的單核苷酸多型性(SNP)。同時提供用於診斷或評估個體發展為子宮頸癌風險之套組的用途，該套組包含用於偵測至少一種SNP的試劑，例如引子(primer)。
Description
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年2月4日申請之澳洲臨時申請案第2020900300號之優先權及效益，其全部內容於此併入作為參考。
子宮頸癌是全球女性發病率的第三位，而死亡率則排名女性的第四位。有數種人類乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)類型在子宮頸癌的致癌作用中起到關鍵作用。超過90%的子宮頸癌及其癌前病變可歸因於HPV感染，而持續的HPV感染會發展為子宮頸癌。儘管其特異性隨著早期偵測高級別子宮頸腫瘤中預期的靈敏度增加而降低，但現仍提倡將HPV檢測納入子宮頸癌的篩查。基線HPV陽性/正常細胞學女性中發展為子宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia)2級或以上(CIN2+)的危險比(hazard ratio，HR)為HPV陰性/正常細胞學女性的20~34倍。然而，有研究指出在細胞學上正常的人群中生殖道HPV感染的發生率高達25.6%。而高危型HPV潛伏感染
的識別會導致個別婦女的焦慮。由於缺乏足夠的知識來預測結果，因此除定期隨訪之外，尚無明確適當的管理方法。
多名性伴侶、高危男性伴侶及飲酒等因素與累積的HPV感染增加有關，但不具有持久性。某些宿主因素如年齡較大、激素替代療法、併發其他下生殖道感染等普遍導致免疫反應降低；而HPV基因型、高病毒載量、多種HPV感染、HPV變異等病毒變數也被報導與HPV持久性/清除率降低相關，而在其他縱向隨訪(follow-up)研究中，病毒載量及吸煙則無相關。一些調查子宮頸上皮內瘤變(CIN)和癌症的預測因素的隊列研究得出了相似的結論，而其他研究對清除率/持久性的發現則有所不同。除了高危類型等病毒因素外，確定宿主的遺傳概況對於預測結果而言也是重要的。
因此，需要一種評估罹患子宮頸癌之風險之方法，以預測評估個體罹患子宮頸癌的風險。本發明係用以解決上述及其他需求。
此外，本文所用的術語「子宮頸癌」是包含子宮頸癌及子宮頸上皮內瘤變(CIN)。
根據本發明的一個目的，揭示一種用於在個體中診斷或評估發展子宮頸癌之風險之方法，包含偵測個體之檢測樣本中選自以下之至少一種單核苷酸多型性(SNP)之步驟：rs3097662(SEQ ID NO：1)、rs35979982(SEQ ID NO：2)、rs7763822(SEQ ID NO：3)、rs3128927(SEQ ID NO：4)、rs7759943(SEQ ID NO：5)、rs213194(SEQ ID
NO：6)及rs17835649(SEQ ID NO：7)，其中至少一種SNP之存在表示個體發展或患有子宮頸癌之風險增加。
在一個實施例中，更包含偵測rs3097662、rs35979982、rs7763822、rs3128927、rs7759943、rs213194及rs17835649之步驟。
在一個實施例中，更包含偵測rs4282438(SEQ ID NO：8)之步驟。
在一個實施例中，更包含包含偵測rs3097662、rs35979982、rs7763822、rs3128927、rs7759943、rs213194、rs17835649及rs4282438之步驟。
在一個實施例中，SNP係在血清樣本中偵測。
在一個實施例中，個體患有陰道人類乳頭瘤病毒感染。
根據本發明的另一個目的，揭示一種用於在個體中診斷或評估發展子宮頸癌或子宮頸上皮內瘤變(CIN)的風險及治療子宮頸癌或CIN的方法，包含以下步驟：(a)偵測個體之檢測樣本中選自以下之至少一種單核苷酸多型性(SNP)之步驟：rs3097662、rs35979982、rs7763822、rs3128927、rs7759943、rs213194及rs17835649，其中至少一種SNP之存在表示個體發展或患有子宮頸癌或CIN之風險增加；(b)對患有子宮頸癌或CIN的個體進行一治療以治療子宮頸癌。
在一個實施例中，更包含偵測rs4282438之步驟。
在一個實施例中，該治療為手術、化學治療、放射治療、標把治療、疫苗、抗體或細胞治療。
根據本發明的又一個目的，揭示一種用於在個體中診斷或評估發展子宮頸癌之風險之套組的用途，該套組包含一試劑，係用以偵測選自以下之至少一種單核苷酸多型性(SNP)：rs3097662、rs35979982、rs7763822、rs3128927、rs7759943、rs213194及rs17835649。
在一個實施例中，該試劑為一引子(primer)。
在一個實施例中，更包含偵測rs4282438之試劑。
用於此專利之術語「本發明(invention)」、「本發明(the invention)」、「本發明(this invention)」及「本發明(the present invention)」意欲廣泛地指代此專利及以下專利申請專利範圍之所有主題。含有此等術語之陳述應理解為不限制本文所述之主題或不限制以下專利申請專利範圍之涵義或範疇。此專利涵蓋之本發明之實施例由以下申請專利範圍而非此發明內容界定。本發明內容係本發明之各種態樣之高層次綜述且引入一些在以下實施方式部分中進一步描述之概念。本發明內容並非意欲鑑別所主張之主題之關鍵特徵或基本特徵，亦並非意欲單獨用於確定所主張之主題之範疇。主題應參照整個說明書之恰當部分、任一或所有圖式及各申請專利範圍來理解。
當閱讀附圖及以下實施方式時本發明將變得更清楚。
下文將參考以下圖式詳細描述本發明之說明性實施例：
第1圖係說明本發明中全基因組關聯研究(GWAS)之發現組、驗證組及預測組之研究設計的流程圖。
第2圖係顯示通過HPV點墨進行HPV基因型分型的例子。其中(A)HPV點墨的示意圖；(B)通過使用SPF1/GP6+共同引子檢測HPV點墨的L1擴增子；在HPV16、HPV18和HPV58上證實了L1擴增子(220bp)；PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，並通過溴化乙錠染色進行分析；表2列出了用於L1分析的引子序列；在HPV點墨中檢測到HPV16；PC：陽性對照，NC：陰性對照。
第3圖係顯示基於7個SNP的高風險(A組)和低風險(B組)HPV組的預測公式的圖表。
如本文所用，冠詞「一」係指一個或超過一個(亦即，至少一個)之語法對象。
術語「個體」可指疑似患有子宮頸癌之脊椎動物。個體包括溫血動物，諸如哺乳動物、諸如靈長類動物且更佳人類。非人類之靈長類動物同樣係個體。術語個體包括家養動物，諸如貓、狗等、家畜(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)及實驗動物(例如小鼠、兔、大鼠、沙鼠、天竺鼠等)。在一個實施例中，個體具有陰道人類乳頭瘤病毒(HPV)感染。
本文中之所有數字均可由「約」修飾來理解。如本文所用，除非另外說明，否則術語「約」在提及可量測值時，意謂涵蓋指定
值±10%、較佳±5%、更佳±1%且甚至更佳0.1%之變化，因為此類變化適合於同源性百分比。
用於根據本發明之一實施例評估發展子宮頸癌/CIN之風險或診斷子宮頸癌之多種單核苷酸多型性(SNP)包括SEQ ID NO：1至8之至少一種多核苷酸序列。
美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)資料庫中SNP之GenBank寄存編號指示SNP之序列及位置。所屬領域之技術人員容易使用GenBank寄存編號鑑別SNP之序列及位置。對應於SNP在NCBI中登記之rs號之特定序列可能隨時間推移變化。所屬領域之技術人員明白即使對應rs號改變，該等序列亦在本發明之範疇內。SEQ ID NO：1至8之核苷酸序列係多態序列。多態序列係包括表示SNP之多態位點之多核苷酸序列。多核苷酸序列可為DNA或RNA。
以下將藉由實例說明本發明之具體實施，不以任何方式將該等實例理解為對本發明之範疇強加限制。相反，可清楚地瞭解，在不脫離本發明精神之情況下，可採用在閱讀本文中之描述之後，所屬領域之技術人員能夠聯想到之各種其他實施例、其修改及等效物。除非另
有說明，否則在以下實例中描述之研究期間，遵循常規程序。下文出於說明之目的，描述一些程序。
本研究使用了系統性的GWAS方法鑑定宿主遺傳變異和HPV類型，以預測台灣人群中進展為CIN2+的風險。首先，我們確定了29種與CIN相關的遺傳變異。然後，我們在第二個獨立的樣本集中驗證了8個變體。在驗證組中，使用高風險預測的7個基因座的SNP面板(rs3097662、rs35979982、rs7763822、rs4282438、rs3128927、rs213194及rs17835649)和低風險預測的7個基因座的SNP面板(rs3097662、rs35979982、rs7763822、rs4282438、rs3128927、rs7759943及rs17835649)，其中具有高風險HPV類型且攜帶SNP
4的女性，其發展為高級別CIN的風險顯著降低。
在驗證組中檢測到三個子宮頸癌的HLA相關SNP，包括位於HLA-DPA1、HLA-DPB1和HLA-DPB2的rs3097662和rs4282438。與先前對中國人群子宮頸癌的研究一致地，我們發現在預測模型中rs4282438賦予了發展為CIN2+的風險。在子宮頸癌的發展中，該基因座與HPV16陽性具有加性相互作用。
SNP rs7759943位於Ring1(無名指蛋白1)和VPS52(空泡蛋白分選52)之間。有研究指出，Ring1的表現上調與多種癌症類型中的侵襲性腫瘤特徵密切相關，且VPS52在胚外組織中作用以支持胚胎外胚層的生長和分化。
評估遺傳效應是否被某些HPV類型修飾。HPV類型和HPV型內序列異質性(HPV intratype sequence heterogeneity)在人群中的分佈存在一定差異。
在這項研究中，風險-SNP面板被證明可用於評估細胞學正常的HPV感染婦女發展為CIN2+的風險。可以在其他種族人群中進一步測試這種SNP+規則(SNP-plus profile)的潛在作用。
實例1：全基因組關聯研究(GWAS)
資格標準和患者招募
本研究得到台灣長庚紀念醫院機構審查委員會的批准。台灣桃園市居民中30歲以上的女性被邀請參加兩項基於人口的研究。每個鄉鎮的受教育人數與其背景人口成正比。參加者的子宮應完整無損，並且沒有浸潤前或浸潤性子宮頸腫瘤的治療史。在簽署了經長庚紀念醫院(CGMH)機構審查委員會批准的知情同意書後，每個參與者都有一份結構化問卷和用於子宮頸抹片檢查(Pap smear)和HPV檢測的子宮頸拭子(cervical swab)。報告子宮頸細胞學結果的命名系統是使用TBS系統(The 2001 Bethesda System)。
參照第1圖，細胞學檢查正常的女性被邀請參加一項縱向隨訪研究(HPV陽性和陰道鏡/活檢陰性，P'組，n=836；N'組，HPV陰性，n=619)；排除未採集血液樣本(n=47)或DNA品質較差(n=34)的女性，N組中的女性人數為600名，作為驗證組(verification set)的對照；而HPV陽性(P組，n=755)的患者接受了隨訪且用作預測測試組(prediction test set)。通過邀請在1991-2014年間接受CIN2/3或原位
腺癌(AIS)的診斷和治療的婦女參加本研究來建立疾病隊列(D1組，n=505；D2組，n=306)。最初是從台灣中央研究院生物醫學研究所獲得了對照女性種群的GWAS數據(n=920)。為了提昇檢定力，通過親緣關係分析過濾後從台灣生物銀行獲得了2315名女性對照，並排除年齡小於30歲或有子宮疾病史的個體，即C組(n=3235)。P組至2013年12月的細胞學和組織學結果是來自台灣健康促進署。
HPV基因分型
如上所述，從細胞學樣本中提取DNA。使用SPF1/GP6+共同引子在38種HPV類型的L1開放閱讀框中擴增約184bp的片段(參照表2)。如果在這項研究中獲得陰性結果，則進行3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)PCR。如前所述進行外部對照GAPDH PCR。通過HPV點墨進行的HPV基因分型(6、11、16、18、26、31、32、33、35、37、39、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、61、62、66、67、68、69、70、71[CP8061]、72、74、81[CP8304]、82[MM4]、83[MM7]、84[MM8]、L1AE5)和類型特異性PCR詳細記載於表2。
Affymetrix AxiomTM全基因組人類陣列
樣本包括2ml EDTA抗凝全血。DNA的提取是根據製造商的規程(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)進行。作為發現組，D1組對比C組藉由Affymetrix AxiomTM全基因組人類陣列進行了對642,832種單核苷酸多態性(SNP)之全基因組基因分型。GWAS數據的質量控製過濾要求盤質量控制(dish quality control，DQC)值>0.82，以作進一步的數據分析。通過親屬關係分析確定患者和對照的一級親屬(父母-後代和全兄弟姐妹配對)，並在進一步分析中將其排除。使用具有默認參數的Affymetrix基因分型控制台4.0調用基因型。
序列分析(用於發現組識別的SNP的探針強度檢查)
D2組對比N組中證實了GWAS選擇的預測CIN2+的SNP和文獻記載的4種與子宮頸癌相關的SNP。SNP基因分型是由Sequenom MassARRAY平台採用iPLEX黃金化學方法(Sequenom,San Diego,CA)進行的。按照製造指南，使用Assay Designer軟件包(v.4.0)設計特定的PCR引子和延伸引子序列。將1μl基因組DNA樣本(10ng/μl)
以5μl體積進行多路PCR反應，其中包含Taq聚合酶1單位，每種PCR引子混合物500nmol和每種dNTP 2.5mM(Sequenom，PCR附件和酶套組)。熱循環是在94℃下進行4分鐘，然後進行45個循環，分別在94℃下進行20秒、56℃下進行30秒及72℃下進行1分鐘，然後在72℃下進行3分鐘。
未摻入的dNTP使用0.3U的蝦鹼性磷酸酶進行失活。單鹼基延伸反應使用iPLEX酶、終止劑混合物和延伸引子混合物，然後依次在94℃下進行30秒、40個94℃循環進行5秒，5個56℃內循環進行5秒及80℃下進行5秒鐘，然後用iPLEX黃金套件Sequenom在72℃下進行3分鐘。在添加陽離子交換樹脂以從反應中去除殘留的鹽之後，將7nl純化的引子延伸反應加載到SpectroCHIP(Sequenom)的基質墊上。使用MassARRAY Analyzer 4對SpectroCHIP進行分析，並且檢出(calling)是通過使用TYPER 4.0軟件進行聚類分析。
統計分析
在最初的發現階段，對512例經組織學診斷為CIN2+的病例(D1組)進行了基因分型，並與920名來自中央研究院的健康女性對照組及另外使用Affymetrix AxiomTM全基因組人類陣列從台灣生物銀行(C組)獲得的2315名女性對照組進行比較。
對獲得的SNP進行人口分層評估，並通過標準質量控制(QC)程序進行過濾。換言之，如果滿足以下條件，則將SNP從分析中排除：(1)在兩種情況和對照的檢出率均<95%；(2)次要等位基因頻率(MAF)<5%；(3)在對照中檢測到與Hardy-Weinberg平衡(HWE)
的偏離(HWE測試p值<8x10-8)。GWAS共使用了505例病例和3235例對照。
為了鑑定與疾病相關的SNP，藉由使用PLINK軟件v1.07將病例和對照之間的等位基因或基因型頻率由Cochran-Armitage趨勢檢驗、等位基因檢驗和基因型檢驗進行比較，以進行單基因座關聯檢驗。通過邏輯回歸，在假設的三種遺傳模式：加性模型、隱性模型或顯性模型之下，進一步檢查了SNP的等位基因效應。
為了增加候選用於驗證和預測的SNP數量，將上述任何測試p值<5x10-6的寬鬆顯著性水平的SNP保留在考慮範圍中，並在另一具有306例病例和600例控制的獨立隊列中進行驗證。在驗證階段將p值<0.05的SNP納入候選遺傳預測因子庫中。
將發現和驗證樣本的組合用作訓練基礎，以搜索和選擇預測會向CIN2+發展的模型。使用Firth的懲罰對數似然法(Firth’s penalized log-likelihood method)透過十倍交叉驗證評估了“最佳”預測變量。將所選擇的預測因子，亦即形成具有最高靈敏度、特異性、陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)、預測準確性或接收者操作特徵曲線(ROC)的曲線下面積(AUC)的邏輯模型的預測因子在預測/測試隊列(P組)中進行進一步測試。在訓練階段，基於令人滿意的ROC AUC(>.70)、敏感性(>.70)和特異性(>.50)選擇模型進行測試。在測試階段，是根據最高的AUC、敏感性和特異性決定最終模型。
所提出的風險預測SNP面板(risk-predictive SNP panel)隨後用於測量P組全體觀察到的進展率，並基於HPV高危類型(14種高危
類型：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66及68)或低風險類型(6、11、26、32、37、42、43、44、53、54、55、61、62、67、69、70、71、72、74、81、82、83、84、L1AE5)。對於整個P組並按高危或低危HPV類型進行分層，使用Kaplan-Meier方法計算CIN2+的累積發生率(CIR)，並使用Cox回歸分析或log-rank檢驗以分別比較每個分層的風險預測SNP面板。分組臨界值(grouping cutoffs)是透過生存樹使用最小P值來確定。
結果
CIN2/3相關的SNP
通過邀請在1991年至2014年間接受過CIN2/3或原位腺癌(AIS)的診斷和治療的女性來建立疾病隊列。共有507名平均年齡為44.9歲的CIN2/3女性接受了檢查(D1組)。從中央研究院生物醫學研究所獲得了總計920名平均年齡為45.5歲的健康女性捐贈者作為最初GWAS的正常對照。在QC過濾之後，關聯測試中總共保留了重疊的577010個SNP。在GWAS中，使用Affymetrix AxiomTM全基因組人類陣列及臺灣人體生物資料庫(參照第1圖)。經過QC程序後，在GWAS中分析了505例經組織學診斷為CIN2+的病例(D1組)和3235例對照(C組)。在最初的GWAS中確定了29個SNP，且趨勢檢驗p值<5x10-6。
在1991年至2014年之間，共對306名從CIN2/3或原位腺癌(AIS)抽取的婦女進行了調查(D2組)。對從TBS系統抽取的總共600例基線和細胞學檢查正常的HPV陰性對照婦女(N組)進行了研究。對預測樣本組的8個SNP，包含染色體6上的rs3097662、rs35979982、
rs7763822、rs4282438、rs3128927、rs7759943、rs213194及19號染色體上的rs17835649進行了Sequenom MassARRAY分析，在驗證隊列(D2組[n=306]與N組[n=600])中具有關聯檢驗p值<0.05(如下表3)。第3圖顯示了在CIN2+和正常對照人群中進行GWAS篩查的趨勢測試p值的曼哈頓圖。然後將8個SNP用於模型訓練和測試以預測CIN2+的發展。
表3：選自發現組並在驗證組中驗證與台灣女性進展為CIN2+相關的SNP
HPV相關的SNP
共有755名基線細胞學檢查正常且HPV陽性的女性接受了隨訪，並被用作預測組(P組)。在預測隊列中，P組中的33個個體(4.4%)發展為CIN2+(中位隨訪時間：23.7個月，範圍4.0-122.1)。在基線和CIN2+診斷的HPV分型總結於下表4。
在從驗證組中訓練了8個CIN2+相關SNP的所有組合並且在P組中進行了測試之後，構建了HPV風險分層模型(HPV risk-stratified modeling)。由rs3097662、rs35979982、rs7763822、rs4282438、rs3128927、rs213194及rs17835649組成的高風險預測SNP面板(靈敏度0.72，特異性0.651，曲線下面積0.703)，以及由rs3097662、rs35979982、rs7763822、rs4282438、rs3128927、rs7759943及rs17835649組成的低風險預測SNP面板(靈敏度0.75，特異性0.884，曲線下面積0.701)已被鑑定，且在風險等位基因的影響被認為是可累加時，於P組中獲得最佳表現。
將生存分析/比較用於評估兩個高風險(hr)及低風險(lr)面板/預測公式的性能。在具有hrHPV的P組中，攜帶<4個風險等位基因的組比具有
4個風險等位基因的組發展為CIN2+的風險顯著降低
(log-rank p=0.007，第3圖(A))，而在lrHPV的P組中具有
0.095的預測概率者在3年時累積的進展風險為10%(第3圖(B))。
<110> 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院，長庚大學(Chang Gung Memorial Hospital,Linkou,Chang Gung University)
<120> 評估罹患子宮頸癌之風險之方法
<130> CGMH-LK-20001-TWI
<150> AU2020900300
<151> 2020-02-04
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<400> 8
Claims (5)
- 一種用於在個體中評估發展子宮頸癌之風險之方法，包含偵測該個體之檢測樣本中以下所述單核苷酸多型性(SNP)之步驟：rs3128927、rs7763822、rs213194、rs4282438、rs35979982、rs3097662及rs17835649，其中該等SNP之存在表示該個體發展或患有子宮頸癌之風險增加。
- 如請求項1所述之方法，其中該等SNP係在血清樣本中偵測。
- 如請求項1所述之方法，其中該個體患有陰道人類乳頭瘤病毒感染。
- 一種偵測單核苷酸多型性(SNP)的試劑之用途，其係用於製備在個體中評估發展子宮頸癌風險之套組，其中該單核苷酸多型性(SNP)包含：rs3128927、rs7763822、rs213194、rs7759943、rs35979982、rs3097662、rs4282438及rs17835649。
- 如請求項4所述之用途，其中該試劑為一引子(primer)。
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