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TW201542816A - 方法、細胞與生物體 - Google Patents

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TW201542816A
TW201542816A TW103132271A TW103132271A TW201542816A TW 201542816 A TW201542816 A TW 201542816A TW 103132271 A TW103132271 A TW 103132271A TW 103132271 A TW103132271 A TW 103132271A TW 201542816 A TW201542816 A TW 201542816A
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TW
Taiwan
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sequence
cell
human
nucleic acid
dna
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TW103132271A
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Inventor
Allan Bradley
Hanif Ali
E-Chiang Lee
Original Assignee
Kymab Ltd
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Publication date
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Priority claimed from GB201321210A external-priority patent/GB201321210D0/en
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Abstract

本發明係相關於一種引入一或多個已知大小之希望插入及/或刪去，至核酸上之一或多個預定位置(如在細胞或生物體基因體)。發明人已發展出可以依序方式或藉由精準插入預定大小之分離DNA片段至基因體上之預定位置，或於精準位置上進行預定大小之分離刪去。此技術係基於觀察到DNA之單股斷裂傾向於經由HDR路徑修復，本發明可降低indels(如由NHEJ產生)之機會，因此可較先前技術更有效率。本發明亦提供依序插入及/或刪去，使用單股或雙股DNA切割技術。

Description

方法、細胞與生物體
本發明人已設計一種方法，用於將一或多種已知大小之希望插入及/或缺失，引入核酸上一或多個預定位置上(例如，於細胞或生物體基因體中)。他們已發展出可以依序方式或藉由精準插入預定大小之分離DNA片段至基因體上之預定位置，或於精準位置上進行預定大小之分離刪去。此技術係基於觀察到DNA之單股斷裂傾向於經由HDR路徑修復，本發明可降低indels(如由NHEJ產生)之機會，因此可較先前技術更有效率。
本發明人已設計出新穎之技術，名為依序核酸內切酶-媒介之同源引導重組(sEHDR)，以及Cas-媒介之依序同源引導重組(sCHDR)。
發明背景
某些細菌和古細菌菌株已顯示含有高度演進的適應性免疫防禦系統，CRISPR/Cas系統，其持續進行重新編碼，以主導存在於入侵之病毒與質體DNA內之互補序列之直接分解。外來DNA之短片段，稱之為空間子，係引入CRISPR重複之間之基因體，並提供作為過去暴露之'記憶體'。CRISPR空間子之後可用於辨識並關閉外來之基因因子，類 似於真核生物體中之RNAi之方式。
規律成簇間隔短回文重複(CRISPR)系統，包括CRISPR相關(Cas)蛋白質，已由數個研究團隊進行體外重建，可進行幾乎任何DNA模板之DNA切割，而不需尋找正確之限制酶切割者。該CRISPR/Cas系統亦可提供鈍端切割產生dsDNA，或使用經突變之Cas版本，進行選擇性單股-特異性切割(see Cong et al.,Wang et al.& Mali et al.引用如下)。
經由體外研究，使用化膿性鏈球菌(Streptococcu 化膿性鏈球菌(S pyogenes))第II型CRISPR/Cas系統，顯示有效CRISPR/Cas-媒介之標靶DNA或基因體修飾所需之單純成分為Cas核酸酶(如Cas9核酸酶)、CRISPR RNA(crRNA)，以及反式作用crRNA(tracrRNA)。CRISPR/Cas-媒介之DNA切割之野生型機制經由數個步驟發生。含有相遇(或標靶)DNA之小型片段(20-30鹼基對)之CRISPR陣列，轉錄為前-crRNA，其經由與tracrRNA雜合進行成熟化，經由前-crRNA之直接重複。pre-crRNA與tracrRNA，已知為嚮導RNA(gRNA或sgRNA)之雜合，可與Cas核酸酶結合形成核醣核蛋白質複合物，其媒介前-crRNA轉換為成熟crRNA。成熟crRNA：tracrRNA雙合物可引導Cas9至由前空間子與必要前空間子鄰近模體(CRISPR/cas前空間子-鄰近模體；PAM)組成之DNA標靶上，經由之空間子區與宿主基因體上之前空間子DNA間之雜雙合體形成。Cas9核酸酶媒介PAM上游之標靶DNA之切割，以創造前空間子內之雙股切口，或單 股-特異性切口，使用突變之Cas9核酸酶，其中單一DNA股-特異性切割模體係經突變(例如含有D10A取代基之Cas9切口酶)(Cong et al.)。
值得注意的是被分離出之鏈球菌屬(Streptococcus)之不同菌株，使用不同於化膿性鏈球菌(Streptococcu化膿性鏈球菌(S pyogenes))Cas9之PAM序列。後者需要NGG PAM序列。CRISPR/Cas系統(例如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)之Csy4內切酶(請見Shah et al.)已發現於其他原核物種，其可辨識不同PAM序列(如CCN、TCN、TTC、AWG、CC、NNAGNN、NGG、NGGNG)。值得注意的是Csy4(亦知為Cas6f)並無Cas9之同源序列，但DNA切割經由類似機制發生，涉及Cas-蛋白質-crRNA複合物之組合，其可幫助標靶DNA辨識，而引導特異性DNA切割(Haurwitz et al.)。
體外-重建第II型CRISPR/Cas系統，以採用並應用於數種不同設計中。這些設計包括於ES細胞之單一或多重基因中進行選擇性基因破壞，以及使用單一步驟法進行單一或多基因破壞，使用合子產生小鼠之等位基因。除了其多重功能之外，應用此系統進行基因體編輯之速度、準確性與效率，使得此系統大幅優於先前之基因體編輯技術，亦即鋅指核酸酶(ZFNs)、轉錄活化子類似效應子核酸酶(TALENs)，以及經改造之歸巢巨核酸酶(Gaj et al.&Perez-Pinera et al.)。這些已成功使用於各種真核宿主中，但所有皆具有重大限制；值得注意的是，偏離標靶突變會 導致核酸酶-相關之毒性，以及發展此經改造蛋白質所需之時間與費用。另一方面，該CRISPR/Cas系統為較佳之基因體編輯系統，其突變之引入相對容易，可簡單地經由設計互補於標靶DNA前空間子序列之單一嚮導RNA而達成。
由核酸內切酶如Cas9誘發之dsDNA斷裂，之後經非-同源性末端結合機制(NHEJ)修復，其中後續之斷裂點接合之DNA修復，係以不同與不可預期之各種尺寸之插入或刪去(indels)縫合。當需要準確之核酸或基因體編輯時，非常不希望有此現象。然而預定之準確突變可使用同源性引導修復(HDR)達成，如使用包含入提供者寡核苷酸或提供者DNA片段。此使用Cas9核酸酶之方法已顯示可產生準確之經定義突變，但其在二對偶基因上之效率相當低，且在dsDNA標靶其中一股會觀察到突變(Wang et al.)。
因此，該CRISPR/Cas系統在其目前形式中具有某些限制。當其可修飾dsDNA其中一股之希望序列時，另一股之序列通常會經由不希望之NHEJ而產生突變。
發明概要
本發明之第一態樣係提供為：一種核酸重組之方法，該方法包含提供含有第一與第二股之dsDNA以及(a)使用核酸切割，以於第一股產生5’與3’切割端；(b)使用同源重組，以於二端間插入一核苷酸序列，藉此產生經修飾之第一股；藉此產生DNA，其中該第 一股已經該重組所修飾，但第二股尚未經修飾；以及(c)任擇地重複該經修飾之第一股，以產生子代dsDNA，其中每一股包含一插入核苷酸序列複本；並分離該子代dsDNA。
本發明之第二種態樣係提供：一種核酸重組之方法，該方法包含(a)使用核酸切割，以於第一股產生5’與3’切割端；(b)使用同源重組，以於二端間插入一核苷酸序列，其中該插入序列包含一調節要素，或編碼一蛋白質之全部或部分；以及(c)任擇地獲得於步驟(b)中修飾之該核酸股，或包含該插入核苷酸序列之子代核酸股。
本發明之第三種態樣係提供：一種核酸重組之方法，該方法包含(a)使用核酸切割，以於第一股產生5’與3’切割端；(b)使用同源重組，以刪去該核苷酸序列；以及(c)任擇地獲得於步驟(b)中修飾之該核酸股，或包含該刪去之子代核酸股。
本發明之第四種態樣係提供：一種核酸重組之方法，該方法包含提供含有第一與第二股之dsDNA以及(a)使用Cas核酸內切酶-媒介之核酸切割，以於第一股PAM模體之3’端產生一切割端； (b)使用Cas核酸內切酶-媒介之核酸切割，以於第二股之一位置上產生一切割，該位置對應於(a)股之切割端之3’位置，其切割為PAM模體之3’端；(c)提供第一gRNA，其與在(a)部分該股中之PAM模體的5’端之序列雜合；(d)提供第二gRNA，其與在(b)部分該股中之PAM模體的5’端之序列雜合；其中(a)部分與(b)部分的核酸股係經修復，以產生在該等切割之間之核酸刪去。
就本發明之各態樣而言，係提供一種依序核酸內切酶-媒介之同源引導重組(sEHDR)之方法，包含進行前述態樣任一項之方法第一次，並進行前述態樣任一項之方法第二次。在此方法中，本發明可進行一系列核酸修飾，如待進行基因體修飾，其可包含此二次或更多次之準確序列刪去、插入或組合。例如，可使用本發明之此態樣，“步行於”核酸上(如細胞中之染色體)，以產生相對長與準確之核苷酸序列刪去或插入。在一實施例中，一或多種Cas核酸內切酶(如Cas9及/或Cys4)係使用於依序核酸內切酶-媒介之同源引導重組(sEHDR)中。
在另一觀點中，本發明可依據下列各項描述：
1.一種核酸重組之方法，該方法包含提供包含第一與第二股之dsDNAs，以及(a)使用核酸切割，以於第一股產生5’與3’切割端；(b)使用同源重組於二端之間插入一核苷酸序列，藉此 產生經修飾之第一股；藉此產生DNA，其中該第一股經該重組所修飾，但該第二股未經修飾；以及(c)任擇地複製該經修飾之第一股，以產生子代dsDNA，其中每一股包含一該插入核苷酸序列複本；以及分離出該子代dsDNA。
2.一種核酸重組之方法，該方法包含(a)使用核酸切割，以於單一股產生5’與3’切割端；(b)使用同源重組於二端之間插入一核苷酸序列，其中該插入序列包含一調節要素或編碼一蛋白質之全部或部分；以及(c)任擇地獲得步驟(b)中修飾之核酸股，或子代核酸股包含該插入核苷酸序列。
3.如前述任一項之方法，其中該插入序列取代該股之異種同源或同源序列。
4.如前述任一項之方法，其中該插入核苷酸序列為至少10個核苷酸長。
5.如前述任一項之方法，其中該插入核苷酸序列包含一位置特異性重組位置。
6.一種核酸重組之方法，該方法包含(a)使用核酸切割，以於一核酸股上產生第一與第二斷裂，藉此產生5’與3’切割端，以及一位於二端間之核苷酸序列；(b)使用同源重組以刪去該核苷酸序列；以及(c)任擇地獲得經步驟(b)修飾之核酸股，或包含該刪去 之子代核酸股。
7.如前述第6項之方法，其中該刪去序列包含一調節要素或編碼一蛋白質之全部或部分。
8.如前述任一項之方法，其中步驟(c)係經由將包含該經修飾之第一股之細胞分離出，或經由獲得實施本方法之非人類脊椎動物或其子代而達成。
9.如前述任一項之方法，其中該核酸股或第一股為DNA股。
10.如前述任一項之方法，其中該方法之產物包含一核酸股，其包含PAM模體在插入或刪去之3’端。
11.如前述任一項之方法，其中步驟(b)係於包含第一與第二同源臂之進入核酸之間進行同源重組，其中該同源臂實質上分別與自5’端延伸5’端之序列以及自3’端延伸3’端之序列同源。
12.如第11項之方法，其中步驟(b)係於包含側接有第一與第二同源臂之插入核苷酸序列之進入核酸之間，進行同源重組，其中該插入核苷酸序列係於5’與3’端間插入。
13.如第12項之方法，其中該插入如同第3至5項所引用者，且在同源臂之間無其他序列。
14.如第11至13項之方法，其中每一同源臂為至少20個相連核苷酸長度。
15.如第11至14項之方法，其中該第一及/或第二同源臂包含一PAM模體。
16.如前述任一項之方法，其中Cas核酸內切酶-媒介之切割係使用於步驟(a)中，並由辨識GG或NGG PAM模體而進行。
17.如第16項之方法，其中步驟(a)係使用切口酶進行切割。
18.如前述任一項之方法，其中該方法係於一細胞中進行，如真核細胞。
19.如第18項之方法，其中係於哺乳動物細胞中進行。
20.如第18項之方法，其中該細胞為嚙齒類(如小鼠)ES細胞或合子。
21.如前述任一項之方法，其中該方法係於非人類哺乳動物中進行，如小鼠或大鼠或兔子。
22.如前述任一項之方法，其中每一切割位置係側接有PAM模體(如NGG或NGGNG序列，其中N為任一鹼基以及G為鳥糞嘌呤)。
23.如前述任一項之方法，其中該3’端係側接有PAM模體。
24.如前述任一項之方法，其中步驟(a)係於dsDNA之一股上進行切割。
25.如前述任一項之方法，其中步驟(a)係藉由下列方式進行：於細胞中結合核酸股、Cas核酸內切酶、用於標靶核酸內切酶以進行切割之crRNA與tracrRNA(如由一或多gRNAs提供)，以及任擇地一用於與該核酸股進行同源重 組之插入序列。
26.如前述任一項之方法，其中步驟(b)係以與包含第一與第二同源臂之進入核酸進行同源重組而進行，其中該同源臂實質上分別與自5’端延伸5’端之序列以及自3’端延伸3’端之序列同源，其中該第二同源臂包含一PAM序列，使得於該方法之產物中，該第二同源臂與該自3’端延伸3’端之序列之間的同源重組產生包含一PAM模體之序列。
27.一種依序核酸內切酶-媒介之同源引導重組(sEHDR)之方法，包含將前述請求項任一項之方法(如當依據第1項使用切口酶切割dsDNA之一股；或當依據第2或5項使用核酸酶切割dsDNA之二股)進行第一次與第二次，其中該第一次之產物係用於第二次之核酸內切酶-媒介之切割中，其中(i)第一與第二核苷酸序列係分別於第一次與第二次刪去；或(ii)第一核苷酸序列係於第一次刪去，以及第二核苷酸序列係於第二次插入；或(iii)第一核苷酸序列係於第一次插入，以及第二核苷酸序列係於第二次刪去；或(iv)第一與第二核苷酸序列係分別於第一次與第二次插入；任擇地，其中該第二次之核酸股修飾為第一次之核酸股修飾之20或更少個核苷酸內。
28.如第27項之方法，其中該第一次係依據第6項進行，其中該進入核酸在該第一與第二同源臂間不包含序列，其中介於5’端與3’端間之序列係藉由同源重組而刪去；及/或該第二次係依據第6項進行，其中步驟(b)係經由於包 含第一與第二同源臂之進入核酸之間進行同源重組來達成，其中該等同源臂實質上分別與自5’端延伸5’端之序列以及自3’端延伸3’端之序列同源，其中該進入核酸在該第一與第二同源臂間不包含序列，使得介於5’端與3’端間之序列係藉由同源重組而刪去；任擇地，其中該第二臂包含一PAM模體，使得該第二次之產物包含一PAM模體，其用於第1至26項任一項之後續Cas核酸內切酶-媒介之方法中。
29.如第27項之方法，其中該第一次係依據第1或2項進行，其中該進入核酸在該第一與第二同源臂間不包含序列，其中介於5’端與3’端間之序列係藉由同源重組而刪去；及/或該第二次係依據第1或2項進行，其中步驟(b)係於包含第一與第二同源臂之進入核酸之間進行同源重組而進行，其中該同源臂實質上分別與自5’端延伸5’端之序列以及自3’端延伸3’端之序列同源，其中該進入核酸在該第一與第二同源臂間不包含序列，使得介於5’端與3’端間之序列係藉由同源重組而刪去；任擇地，其中該第二臂包含一PAM模體，使得該第二次之產物包含一PAM模體，其用於第1至26項任一項之後續Cas核酸內切酶-媒介之方法中。
30.如第27項之方法，其中該第一與第二次之任一者係依據第28項進行，而另一次係依據第29項進行，其中進行至少一序列刪去及至少一序列插入。
31.如前述任一項之方法，其中步驟(a)係使用Cas核酸內切酶-媒介之切割，以及包含crRNA與tracrRNA之gRNA進行。
32.如第25或31項之方法，其中該crRNA具結構5’-X-Y-3’，其中X為RNA核苷酸序列(任擇地至少5個核苷酸長度)，以及Y為一包含一核苷酸模體之RNA序列，該核苷酸模體與tracrRNA所包含之模體雜合，其中X能夠與自5’端切割端之希望位置延伸5’端之核苷酸序列雜合。
33.如第25、31或32項之方法，其中Y為5’-N1UUUUAN2N3GCUA-3’(SEQ ID NO：3)，其中N1-3之每一者為A、U、C或G，及/或該tracrRNA包含序列(為5’至3’方向)UAGCM1UUAAAAM2(SEQ ID NO：4)，其中M1為空間子核苷酸序列，以及M2為核苷酸。
34.一種產生細胞或轉殖性非人類生物體之方法，該方法包含(a)進行前述請求項任一項之方法，以(i)於第一細胞之基因體中敲除標的核苷酸序列，及/或(ii)敲入一插入核苷酸序列至第一細胞之基因體中，任擇地，其中該插入序列可取代基因體中標的序列之內生性位置之全部或一部份之標的序列；其中該細胞或其子代可發育為非人類生物體或細胞；以及(b)使該細胞或其子代發育為非人類生物體或非人類細胞。
35.如第34項之方法，其中該生物體或細胞與(i)及/或(ii)之修飾物為同型組合。
36.如第34或35項之方法，其中該細胞為ES細胞、iPS細胞、分化全能細胞或多潛能細胞。
37.如第34至36項任一項之方法，其中該細胞為嚙齒類(如小鼠或大鼠)細胞。
38.如第34至37項任一項之方法，其中該標的序列為內生性序列，包含一調節要素之全部或部分，或編碼一蛋白質之全部或部分。
39.如第34至38項任一項之方法，其中該插入序列為合成性序列；或包含編碼一蛋白質之全部或部份之序列，該蛋白質來自除了該第一細胞衍生之物種以外之物種；或包含來自該第一物種之調節要素。
40.如第39項之方法，其中該插入序列編碼人類蛋白質之全部或部分，或人類蛋白質之次單元或區塊。
41.一種細胞或非人類生物體，其基因體包含一修飾，其包含非-內生性核苷酸序列，側接有內生性核苷酸序列，其中該細胞或生物體可由第24至40項任一項之方法獲得，以及其中該非-內生性序列係於3’端側接一Cas PAM模體；其中該細胞並非人體所包含；以及施行(a)至(d)項之一者、多者或全部：(a)該基因體與該修飾為同型組合；或於其中一對偶基因上包含該修飾，而另一對偶基因未經Cas-媒介之同源重組修飾；(b)該非-內生性序列包含一調節要素之全部或部分，或編碼一蛋白質之全部或部分；(c)該非-內生性序列為至少20個核苷酸長度；(d)該非-內生性序列取代該基因體之異種同源或同源 序列。
42.如第41項之細胞或生物體，其中該非-內生性序列為人類序列。
43.如第41或42項之細胞或生物體，其中該PAM模體包含選自於CCN、TCN、TTC、AWG、CC、NNAGNN、NGGNG GG、NGG、WGG、CWT、CTT與GAA之序列。
44.如第41至43項任一項之細胞或生物體，其中有一PAM模體，不多於該非內生性序列之3’端之10個核苷酸(如3個核苷酸)。
45.如第41至44項任一項之細胞或生物體，其中該PAM模體係由鏈球菌屬(Streptococcus)Cas9辨識。
46.如第41至45項任一項之細胞或生物體，其為非-人類脊椎動物細胞或非-人類脊椎動物，其表現一或多個人類抗體重鏈變異區塊(以及任擇地沒有非-人類脊椎動物物種之重鏈變異區塊)。
47.如第41至46項任一項之細胞或生物體，其為非-人類脊椎動物細胞或表現有一或多個人類抗體κ輕鏈變異區塊(以及任擇地無非-人類脊椎動物之κ輕鏈變異區塊)之非-人類脊椎動物。
48.如第41至47項任一項之細胞或生物體，其為非-人類脊椎動物細胞或表現有一或多個人類抗體λ輕鏈變異區塊(以及任擇地無非-人類脊椎動物之λ輕鏈變異區塊)之非-人類脊椎動物。
49.如第46至48項任一項之細胞或生物體，其中 該非-內生性序列係編碼人類Fc受體蛋白質或其次單元或區塊(如人類FcRn或Fcγ受體蛋白、次單元或區塊)。
50.如第41至48項任一項之細胞或生物體，其中該非-內生性序列包含一或多個人類抗體基因段、一抗體變異區，或一抗體恆定區。
51.如第41至50項任一項之細胞或生物體，其中該插入序列為人類序列，其取代或補充一異種同源非-人類序列。
52.一種單株或多株抗體，係藉由使用一抗原來免疫如第41至51項任一項之脊椎動物(如小鼠或大鼠)而製備。
53.一種分離與預定抗原結合之抗體之方法，該方法包含(a)提供如第41至51項任一項之脊椎動物(任擇地為小鼠或大鼠)；(b)以該抗原來免疫該脊椎動物；(c)自該脊椎動物中移出B淋巴球，並篩選出一或多個表現與該抗原結合之抗體之B淋巴球；(d)任擇地使該等經篩選出之B淋巴球或其子代不朽化(immortalizing)，任擇地由其產生融合瘤；以及(e)分離出由該B淋巴球所表現之抗體(如IgG-型抗體)。
54.如第53項之方法，包含自該B淋巴球分離出編碼結合該抗原之抗體之核酸之步驟；任擇地將該抗體之 重鏈恆定區核苷酸序列，與編碼人類或人源化重鏈恆定區之核苷酸序列交換，以及任擇地使該抗體變異區親合力成熟；以及任擇地將該核酸插入至表現載體上與任擇地宿主中。
55.如第53或54項之方法，更包含製造由第53或54項之方法所產生之，抗體之一突變物或衍生物。
56.一種使用如第52項之結合該抗原之經分離的單株或多株抗體或其突變或衍生抗體，製造使用作為藥劑之組成物之用途。
57.一種使用如第52項之與該抗原結合之經分離、單株或多株抗體或其突變或衍生抗體，作為藥物之用途。
58.一種核苷酸序列，其編碼如第52項之抗體，任擇地其中該核苷酸序列為載體之一部分。
59.一種醫藥組成物，包含如第52項之抗體或抗體群，以及一稀釋劑、賦形劑或載體。
60.一種ES細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、非-人類動物或非-人類囊胚細胞，其包含可表現編碼Cas核酸內切酶之基因體整合核苷酸序列。
61.如第60項之細胞、動物或囊胚細胞，其中該核酸內切酶序列可連續地表現。
62.如第60項之細胞、動物或囊胚細胞，其中該核酸內切酶序列可誘導地表現。
63.如第60、61或62項之細胞、動物或囊胚細胞，其中該核酸內切酶序列可以組織特異性或階段特異性方式， 表現於動物或其子代中，或於非-人類動物中，其為該細胞或囊胚細胞之子代。
64.如第63項之細胞、動物或囊胚細胞，其中該細胞為非-人類胚胎細胞，或該動物為非-人類胚胎，其中該核酸內切酶序列可表現或被表現於該細胞或胚胎中。
65.如第64項之細胞、動物或囊胚細胞，其中該核酸內切酶係操作性地連結至一啟動子上，該啟動子選自於由胚胎特異性啟動子(如Nanog啟動子、Pou5f1啟動子或SoxB啟動子)組成之族群。
66.如第60至65項任一項之細胞、動物或囊胚細胞，其中該Cas核酸內切酶位於Rosa 26基因座。
67.如第60至65項任一項之細胞、動物或囊胚細胞，其中該Cas核酸內切酶係操作性連結至Rosa 26啟動子上。
68.如第60至63項任一項之細胞、動物或囊胚細胞，其中該Cas核酸內切酶序列係於5’端與3’端側接有轉位因子(如倒轉piggyBac末端因子)或位置特異性重組位置(如loxP及/或突變lox，如lox2272或lox511；或frt)。
69.如第68項之細胞、動物或囊胚細胞，包含一或多個限制核酸內切酶位置介於Cas核酸內切酶序列與轉位因子之間。
70.如第60至69項任一項之細胞、動物或囊胚細胞，其包含一或多個gRNAs。
71.如第68、69或70項任一項之細胞、動物或囊 胚細胞，其中gRNA(s)於5’端與3’端側接有轉位因子(如倒轉piggyBac末端因子)或位置特異性重組位置(如loxP及/或突變lox，如lox2272或lox511；或frt)。
72.使用如第60至71任一項之細胞、動物或囊胚細胞，於如第1至51項任一項或第73項之方法中。
73.一種核酸重組之方法，該方法包含提供包含第一與第二股之dsDNA以及(a)使用Cas核酸內切酶-媒介之核酸切割，於第一股PAM模體之3’端產生一切割端；(b)使用Cas核酸內切酶-媒介之核酸切割，於第二股之一位置上產生一切割，該位置對應於(a)部分該股之切割端之3’位置，該切割為PAM模體之3’端；(c)提供第一gRNA，其與在(a)部分該股中之PAM模體5’端之序列雜合；(d)提供第二gRNA，其與在(b)部分該股中之PAM模體5’端之序列雜合；其中(a)部分與(b)部分之核酸股係經修復，以產生切割端之間之核酸刪去。
74.如第6項之方法，其中該刪去序列包含一調節要素或編碼一蛋白質之全部或一部份。
75.如第73或74項之方法，其中Cas核酸內切酶-媒介之切割係用於步驟(a)或步驟(b)中，用於辨識GG或NGG PAM模體。
76.如第75項之方法，其中切口酶係用於步驟(a) 及/或步驟(b)中之切割。
77.如第73或74項之方法，其中核酸酶係用於步驟(a)及/或步驟(b)中之切割。
78.如第74至77項任一項之方法，其中該方法係於一細胞中進行，如真核細胞。
79.如第78項之方法，其中該方法係於哺乳動物細胞中進行。
80.如第78項之方法，其中該細胞為嚙齒類(如小鼠)ES細胞或合子。
81.如第74至80項任一項之方法，其中該方法係於非人類哺乳動物中進行，如小鼠或大鼠或兔子。
82.如第74至81項任一項之方法，其中每一切割位置係側接有PAM模體(如NGG或NGGNG序列，其中N為任一鹼基以及G為鳥糞嘌呤)。
83.於第74至82項任一項之方法中使用第一與第二gRNA以標靶核酸之希望部分，定義出待刪去之區域。
圖1A. 於預定位置之精確DNA插入(KI)：針對預定位置之gRNA設計，可誘發DNA切口，使用PAM序列5’端之Cas9 D10A切口酶(顯示為黑色實心方塊中)。此外，gRNA可與Cas9野生-型核酸酶一同使用，以誘發PAM序列5’端之雙股DNA斷裂。加入具斷裂點區同源性之提供者寡核苷酸或提供者DNA片段(單股或雙股)，其含有任一形式之DNA替代，包括加入內生性或外源性DNA，可於斷裂點接 合處準確插入，該處DNA經由HDR修復。
圖1B. 於預定位置之精確DNA插入(KI)：此圖顯示圖1A中針對預定位置之sgRNA設計之更詳細機制說明，可使用PAM序列5’端(顯示為黑色實心方塊)之Cas9 D10A切口酶誘發DNA切口。此外，sgRNA可與Cas9野生-型核酸酶一同使用，以誘發PAM序列5’端之雙股DNA斷裂。加入提供者寡核苷酸或提供者DNA片段(單股或雙股)，具斷裂點區之同源臂(HA)，其含有任一形式之DNA替代，包括加入內生性或外源性DNA，可於斷裂點接合處準確插入，該處DNA經由HDR修復。
圖2A. 精確DNA刪去(KO)：標靶有興趣側接區之gRNAs，可於含有希望PAM序列(顯示為黑色實心方塊)之預定位置，使用Cas9 D10A切口酶誘發二DNA切口。此外，gRNAs可使用Cas9野生-型核酸酶誘發二DSB側接有興趣之區。加入提供者寡核苷酸或提供者DNA片段(單股或雙股)，其與PAM 1之5’區與PAM2序列之3’端同源，可引導DNA經由HDR，以準確方式修復。經由HDR之DNA修復，可降低斷裂點接合處形成indel之風險，並阻止DNA經由將會刪去側接有PAM序列之區域之NHEJ修復，並以預定與預定義之方式進行DNA修復。
圖2B. 精確DNA刪去(KO)：此圖顯示關於圖2A機制之更詳細說明。sgRNAs標靶有興趣之側接區，可於含有希望PAM序列(顯示為黑色實心方塊)之預定位置，使用Cas9 D10A切口酶誘發二DNA切口。請注意，PAMs可位於 圖上指出範例之對向股上，該處二PAMs皆位於同一DNA股上。此外，gRNAs可使用Cas9野生-型核酸酶，誘發二DSB側接有興趣之區域。加入提供者寡核苷酸或提供者DNA片段(單股或雙股)，其與PAM 1之5’區與PAM 2序列之3’端同源，可引導DNA經由HDR，以準確方式修復。經由HDR之DNA修復，可降低斷裂點接合處形成indel之風險，並阻止DNA經由將會刪去側接有PAM序列之區域之NHEJ修復，並以預定與預定義之方式進行DNA修復。
圖3A：準確之DNA刪去與插入(KO→KI)：有興趣之gRNAs標靶側接區，可於含有希望PAM序列(顯示為黑色實心方塊)之預定位置，使用Cas9 D10A切口酶誘發二DNA切口。此外，gRNAs可使用Cas9野生-型核酸酶誘發二DSB側接有興趣之區。加入提供者寡核苷酸或提供者DNA片段(單股或雙股)，其與PAM 1之5’區與PAM 2序列之3’端同源，可引導DNA經由HDR以準確方式修復，伴隨側接有DSB之區域之刪去，或切口，以及插入有興趣之DNA。
圖3B：準確之DNA刪去與插入(KO→KI)：此圖顯示關於圖3A機制之更詳細說明。有興趣之gRNAs標靶側接區，可於含有希望PAM序列(顯示為黑色實心方塊)之預定位置，使用Cas9 D10A切口酶誘發二DNA切口。此外，sgRNAs可使用Cas9野生-型核酸酶，誘發二DSB側接有興趣之區域。加入提供者寡核苷酸或提供者DNA片段(單股或雙股)，其與PAM 1之5’區與PAM 2序列之3’端同源，可引導DNA經由HDR以準確方式修復，伴隨側接有DSB之區域之 刪去，或切口，或插入有興趣之DNA。請注意：同樣地，如同圖中範例所指出的，該PAMs位於對向DNA股上，其中二PAMs係位於相同DNA股上。
圖4A：用於依序基因體編輯(刪去)之再回收PAM：gRNAs標靶側接有興趣之區域，可於含有希望PAM序列(顯示為黑色實心方塊)之預定位置，使用Cas9 D10A切口酶誘發二DNA切口。此外，gRNAs可使用Cas9野生-型核酸酶誘發二DSB側接有興趣之區域。加入提供者寡核苷酸或提供者DNA片段(單股或雙股)，其與PAM 2之5’區與PAM 3序列之3’端同源，可引導DNA經由HDR以準確方式修復，如此，將會刪去PAM 2與PAM3間之區域。此刪去會保留PAM 3，因此可作為進行另一回合CRISPR/Cas媒介之基因體編輯位置。另一PAM位置(如PAM 1)可用於與PAM 3序列結合，以進行另一回合之刪去，如上所述。使用此PAM再回收法，可進行許多回合之刪去，以逐步刪去方式，其中PAM 3在每一回合後再回收。此方法亦可用於逐步加入內生性或外源性DNA。
圖4B：用於依序基因體編輯(刪去)之再回收PAM：此圖顯示關於圖4B機制之更詳細說明。sgRNAs標靶側接有興趣之區域，可於含有希望PAM序列(顯示為黑色實心方塊)之預定位置，使用Cas9 D10A切口酶，誘發二DNA切口。此外，sgRNAs可使用Cas9野生-型核酸酶誘發二DSB側接有興趣之區域。加入提供者寡核苷酸或提供者DNA片段(單股或雙股)，其與PAM 1(透明PAM塊)之5’區與PAM 2(黑色 PAM塊)序列之3’端同源，可引導DNA經由HDR以準確方式修復，如此，將會刪去PAM 1與PAM 2間之區域。PAM序列與獨特之gRNA可包括於入侵之DNA並標靶回編輯位置。在此情況下，舉例而言，PAM 1序列可經回收，因此可作為進行另一回合之CRISPR/Cas媒介之基因體編輯位置。另一PAM位置(如PAM 3，灰色PAM塊)可用於與PAM 1序列結合，以進行另一回合之編輯，如上所述。使用此PAM再回收法，可以逐步刪去方式，進行許多回合之基因體編輯，其中PAM 1在每一回合後再回收。此方法亦可用於逐步加入內生性或外源性DNA。
圖5A：CRISPR/Cas媒介之Lox插入以加速RMCE：gRNAs標靶側接有興趣之區域，可於含有希望PAM序列(顯示為黑色實心方塊)之預定位置，使用Cas9 D10A切口酶誘發二DNA切口。此外，gRNAs可使用Cas9野生-型核酸酶誘發二DSB側接有興趣之區域。加入提供者寡核苷酸或提供者DNA片段(單股或雙股)，其與每一PAM序列之5’與3’區域同源，其中提供者DNA含有重組酶辨識序列(RRS)，如loxP與lox5171，可引導DNA經由HDR，以準確方式修復，並內含入這些RRS。引入之RRS可使用作為著陸位置(landing pad)，用於插入任一有興趣之DNA，具高度效率，並可準確地使用重組酶媒介片匣交換(RMCE)。留下之PAM 2位置可再回收至另一回合之CRISPR/Cas媒介之基因體編輯，以刪去或插入有興趣之DNA。請注意：插入有興趣之DNA可含有篩選用標記物，如側接有PiggyBac LTR之 PGK-Puro，以進行初始篩選，並成功整合至有興趣之DNA上，該篩選標記物可方便地經由表現hyperPbase轉位酶而移除。
圖5B：CRISPR/Cas媒介之Lox插入以加速RMCE：此圖顯示關於圖5A機制之更詳細說明。sgRNAs標靶側接有興趣之區域，可於含有希望PAM序列(顯示為黑色實心方塊)之預定位置，使用Cas9 D10A切口酶誘發二DNA切口。此外，sgRNAs可使用Cas9野生-型核酸酶誘發二DSB側接有興趣之區域。加入提供者寡核苷酸或提供者DNA片段(單股或雙股)，其與每一PAM序列之5’與3’區域同源，其中提供者DNA含有重組酶辨識序列(RRS)，如loxP與lox5171，可引導DNA經由HDR，以準確方式修復，並內含入這些RRS。引入之RRS可使用作為著陸位置(landing pad)，用於插入任一有興趣之DNA，具高度效率，並可準確地使用重組酶媒介片匣交換(RMCE)。如第4圖所詳述，該PAM序列可回收用於另一回合之CRISPR/Cas媒介基因體編輯，以刪去或插入有興趣之DNA。作為一選擇，插入之有興趣DNA可含有篩選標記物，如如側接有PiggyBac LTR之PGK-Puro，以進行初始篩選，並成功整合至有興趣之DNA上，該篩選標記物可方便地經由表現hyperPbase轉位酶而移除。
圖6A與6B：基因體修飾以產生轉位子-可切割Cas9與gRNA
圖6C：單一複本之Cas9表現：著陸位置(landing pad)一開始可標靶至小鼠ES細胞或任一其他真核細胞株之任一選定基因座上。該著陸位置(landing pad)一般含有PiggyBac 5’與3’LTR、篩選標劑如neo例如floxed與gene less啟動子如PGK，如同圖示。標靶係以同源重組進行，殖株係以G418篩選。下一步驟涉及RMCE，以經由T2A序列插入Cas9連結至Puro-delta-tk，可選擇插入單一或多重嚮導RNA，使用獨特之限制酶位置(RS)。lox位置之方位係定向為僅引入含有Cas9之DNA，其插入至著陸位置(landing pad)，著陸位置(landing pad)上之PGK啟動子可活化轉錄作用，因此啟動嘌呤黴素之表現，經由T2A轉錄，並表現Cas9。使用此方法可達成Cas9單一穩定表現。經嘌呤黴素篩選4-6日後，完整之Cas9與嚮導RNA floxed片匣可使用PiggyBac轉位酶(Pbase)切割，各殖株可分析由導入之嚮導RNA產生之基因體編輯。作為一選項，穩定表現Cas9之細胞株庫可由多重改造之細胞株產生。為此，在RMCE階段僅有Cas9-T2A-Puro-delta-tk插入而無gRNA。此將產生一般單一版本之Cas9表現細胞株，其基因體可藉由轉染單一或多重gRNA編輯。
圖7：圖示相對於基因X之gRNA位置，用於基因分型所得標靶殖株之標靶載體與寡核苷酸對結構。
圖8：顯示Cas9核酸酶媒介之雙股DNA斷裂與後續DNA標靶基因分型結果之膠片影像。該基因分型顯示5’標靶同源臂之PCR產物(880bp)特異性，使用寡核苷酸對HAP341/HAP334。左方膠片顯示經gRNA、人類Cas9核酸酶 與環狀標靶載體(盤1)或直線形標靶載體(盤2)轉染之96 ES細胞殖株之基因分型資料。右方膠片顯示經gRNA與環狀標靶載體(盤3)或直線形標靶載體(盤4)但無人類Cas9核酸酶轉染之96 ES細胞殖株。顯示每一次轉染之正確標靶之殖株百分比。
圖9：圖示可定義二gRNA之間區域之刪去基因上之gRNAs位置。寡核苷酸對引子1與2係用於偵測含有特異性55bp刪去之ES殖株。
圖10：自經gRNA 1與2轉染之96 ES殖株倍增之PCR產物之3%瓊膠凝膠。引子1與2係用於倍增該二gRNA以及含有該定義刪去之殖株，可視為小型PCR產物，其以星號標出。
圖11：藉由倍增標靶位於染色體6上之Rosa26基因內之同源臂之5’端(上方膠片)與3’端(下方膠片)進行PCR基因分型。正確標靶之殖株可產生5’與3’端二端之接合之PCR產物，以星號標示。
圖12：藉由PCR倍增插入DNA片匣之5’端(上方膠片)與3’端(下方膠片)臂，基因分型出正確插入之Cas9 DNA片匣。
圖13：PCR基因分型，藉由倍增嚮導RNA附近區域並評估PCR產物，在indels存在下。可直接由膠片上觀察到大型indels，由於其產生之PCR產物短於預期之WT DNA，顯示有明顯之刪去現象。就陽性控制組而言，小鼠AB2.1之基因體DNA係用於判別相對應WT PCR產物之尺寸。陰性 控制組則為不含DNA之水控制組。
圖14：側接嚮導RNA之區域之PCR倍增反應，使用萃取自小鼠之DNA，之後進行合子Cas9/嚮導mRNA注射，以分析indel資訊。行14顯示該小鼠中之總刪去，以星號標記之行代表這些小鼠含有較小型之indels。
表3：得自8隻經分析小鼠之定序資料摘要，並顯示偵測到之indels詳細資訊。數字代表經分析殖株中辨識出之特定indel，indels之描述顯示於括號中。
較佳實施例之詳細說明
本發明人解決了增進之核酸修飾技術需求。核酸修飾技術之一範例為CRISPR/Cas系統之應用。此系統已被證明是目前最先進的基因體編輯系統，由於其廣泛之應用性，基因體編輯之相對速度，可產生突變以及易用性。然而，本發明人相信此技術之進步，而較目前技術可用於更廣之應用範圍，是顯而易見的。
本發明人體認到要完成此技術之一重要觀點為找出可增進核酸修飾準確度之方法，超越此技術已知之CRISPR/Cas法。
此外，本發明人發現目前僅有適度核酸修飾被報導。希望可使用CRISPR/Cas系統，作用於相對大之預定與精確之DNA刪去或插入。
本發明人已設計一種方法，用於將一或多種已知大小之希望插入及/或缺失，引入核酸上一或多個預定位置 (例如，於細胞或生物體基因體中)。他們已發展出可以依序方式或藉由精準插入預定大小之分離DNA片段至基因體上之預定位置，或於精準位置上進行預定大小之分離刪去。此技術係由於觀察到DNA之單股斷裂傾向於經由HDR路徑修復，本發明可降低indels(如由NHEJ產生)之機會，因此可較先前技術更有效率。
為此，本發明提供：一種核酸重組之方法，該方法包含提供含有第一與第二股之dsDNA以及(a)使用核酸切割，以於第一股產生5’端與3’端切割端；以及(b)使用同源重組，以於二端間插入一核苷酸序列，因而產生經修飾之第一股；因而產生DNA，其中該第一股已經該重組修飾，但第二股尚未經修飾。
任擇地，該方法更包含複製該經修飾之第一股，以產生子代dsDNA，其中每一股包含一插入核苷酸序列複本。任擇地，該方法包含(c)分離子代dsDNA，如藉由獲得含有該子代dsDNA之細胞。複製可於如細胞中進行。例如，步驟(a)與(b)可於細胞中進行，而細胞被複製，其中該細胞機器可複製經修飾之第一股，如產生dsDNA子代，其中每一股皆包含該修飾。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該由步驟(b)產生之經修飾DNA股可經分離。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該方法可於體外進行。例如，該方法係於一細胞 或細胞群之體外方式進行。
此外，任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，可進行該方法以修飾一病毒之基因體。
此外，任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該方法可於一生物體之體內進行。在一範例中，該生物體為非-人類生物體。在一範例中，其為植物或動物或昆蟲或細菌或酵母菌。例如，該方法係於脊椎動物(如人類病患或非-人類脊椎動物(如鳥類如雞)上施行，或非-人類哺乳動物如小鼠、大鼠或兔子)。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該方法為人類之美容治療方法，或非治療性、非手術性、非診斷性方法，如於人類或非-人類脊椎動物或哺乳動物上(如小鼠或大鼠)進行。
本發明亦提供：一種核酸重組之方法，該方法包含(a)使用核酸切割，以於第一股產生5’端與3’端切割端；(b)使用同源重組，以於二端間插入一核苷酸序列，其中該插入序列包含一調節要素，或編碼一蛋白質之全部或部分；以及任擇地獲得於步驟(b)中修飾之該核酸股，或包含該插入核苷酸序列之子代核酸股。
在一範例中，該子代股為步驟(b)產生之複製股產物。該子代股係由如細胞中進行核酸複製而產生。例如， 步驟(a)與(b)係於一細胞中進行，且該細胞係經複製，其中該細胞機器會複製步驟(b)中所產生之經修飾股，如以產生dsDNA子代，其中每一股包含該修飾。
在一範例中，該單核酸股為DNA或RNA股。
在一範例中，該調節要素為啟動子或強化子。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該插入之核苷酸序列為植物、動物、脊椎動物或哺乳動物序列，如人類序列。例如，該序列編碼一完整蛋白質、多胜肽、胜肽、區塊或這些之組合(如一、二或更多)。在一範例中，該插入序列提供本發明製備之包含該經修飾核酸之細胞一些抗性(如除草劑、病毒或細菌抗性)。在一範例中，該插入序列編碼介白素、受器(如細胞表面受器)、生長因子、激素、抗體(或其變異區塊或結合位置)、拮抗劑、協同劑；如這些任一者之人類版本。在一範例中，該插入序列為外顯子。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該插入之核苷酸序列經該股之異種同源或同源序列(如該插入為取代植物、人類或小鼠序列之人類序列)取代。例如，該方法係於小鼠或小鼠細胞中進行(如ES細胞)，且該插入係取代異種同源或同源小鼠序列(如代表一疾病之小鼠生物性標靶蛋白質)。例如，該方法係於人類細胞(體外)中進行，且該插入取代異種同源或同源人類序列(如代表一疾病之人類生物性標靶蛋白質，如以不同(如野生-型)人類序列取代之序列之突變形式，其可用於校正細胞中之基因 缺陷。在此實施例中，該細胞可為人類ES或iPS或分化全能或多潛能幹細胞，之後可以基因療法引入至人類病患中，以治療及/或預防病患之疾病或病症)。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該插入之核苷酸序列為至少10個核苷酸長度，至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800或900個核苷酸，或至少1、2、3、5、10、20、50或100kb長。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該插入序列包含一位置特異性重組位置，如lox、frt或rox位置。例如，該位置可為loxP、lox511或lox2272位置。
本發明亦提供：一種核酸重組之方法，該方法包含(a)使用核酸切割，以於該核酸股產生第一與第二斷裂，因而產生5’端與3’端切割端，以及介於二端之核苷酸序列；(b)使用同源重組，以刪去該核苷酸序列；以及(c)任擇地獲得於步驟(b)中修飾之該核酸股，或包含該刪去之子代核酸股。
在一範例中，該子代股為步驟(b)產生股之複製產物。該子代股係於細胞中由核酸複製而產生。例如，步驟(a)與(b)可於細胞中進行，且該細胞可複製，其中細胞之機器可複製步驟(b)所產生之修飾股，如以產生dsDNA子代， 其中每一股皆包含該修飾。
在一範例中，該單股核酸為DNA或RNA股。
在一範例中，經刪去之序列包含一調節要素或編碼蛋白質之全部或部份。在一實施例中，該經刪去之調節要素為啟動子或強化子。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該經刪去之核苷酸序列為植物、動物、脊椎動物或哺乳動物序列，如人類序列。例如，該序列編碼一完整之蛋白質、多胜肽、胜肽、區塊或這些任一者之組合(如一、二或更多)。在一範例中，該經刪去之序列編碼介白素、受器(如細胞表面受器)、生長因子、激素、抗體(或其變異區塊或結合位置)、拮抗劑、協同劑；如這些任一者之非人類版本。在一範例中，該刪去序列為外顯子。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該刪去之核苷酸序列經該股之異種同源或同源序列(如該插入為取代植物、人類或小鼠序列之人類序列)取代。例如，該方法係於小鼠或小鼠細胞中進行(如ES細胞)，且該刪去係取代異種同源或同源小鼠序列(如代表一疾病之小鼠生物性標靶蛋白質)。例如，該方法係於人類細胞(體外)中進行，且該刪去取代異種同源或同源人類序列(如代表一疾病之人類生物性標靶蛋白質，如以不同(如野生-型)人類序列取代之序列之突變形式，其可用於校正細胞中之基因缺陷。在此實施例中，該細胞可為人類ES或iPS或分化全能或多潛能幹細胞，之後可以基因療法引入至人類病患中， 以治療及/或預防病患之疾病或病症)。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該刪去之核苷酸序列為至少10個核苷酸長度，至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800或900個核苷酸，或至少1、2、3、5、10、20、50或100kb長。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，步驟(c)係以分離包含該經修飾第一股之細胞而進行，或藉由獲得施行本發明之非-人類脊椎動物或其子代而進行。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該插入序列包含一位置特異性重組位置，本發明產物包含一核酸股，其包含插入或刪去之PAM模體3’端。在一範例中，該PAM模體位於該插入或刪去之10、9、8、7、6、5、4或3個核苷酸之內。本方法可用於一系列插入及/或刪去，如以下所說明。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該方法產物包含一核酸股，其包含插入或刪去之PAM模體5’端。在一範例中，該PAM模體位於該插入或刪去之10、9、8、7、6、5、4或3個核苷酸之內。本方法可用於一系列插入及/或刪去，如以下所說明。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，步驟(b)係於包含第一與第二同源臂之進入核酸之間進行同源重組，其中該同源臂實質上分別與來自5’端之 序列延伸5’端，以及來自3’端之序列延伸3’端同源。此技術領域者應熟習同源重組中所使用之建構用載體與DNA分子，包括考量如同源臂大小與序列，以及二臂間之篩選標記。例如，該進入核酸包含第一與第二同源臂，及該插入序列與任擇性篩選標記物序列(如neo核苷酸序列)。該臂可為如至少20、30、40、50、100或150個核苷酸長度。當刪去為必要時，便可省略插入(儘管任擇性篩選標記物序列可包括或不包括於二臂之間)。
因此，在本發明之一實施例中，步驟(b)係於包含側接有第一與第二同源臂之插入核苷酸序列之進入核酸之間，進行同源重組，其中該插入核苷酸序列係於5’與3’端間插入。
在本發明之另一實施例中，該插入係位於同源臂之間，在二臂之間並無其他序列。
在一範例中，每一同源臂為至少20、30、40、50、100或150個核苷酸長。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，步驟(a)係使用核酸內切酶如切口酶進行切割。切口酶僅會切割dsDNA其中一股。例如，該核酸內切酶為CRISPR/Cas系統之核酸內切酶，如Cas9或Cys4核酸內切酶(如Cas9或Cys4切口酶)。在一範例中，該核酸內切酶會辨識下表1所列之PAM，例如，該核酸內切酶為Cas核酸內切酶，其會辨識選自於CCN、TCN、TTC、AWG、CC、NNAGNN、NGGNG GG、NGG、WGG、CWT、CTT與GAA之PAM。在 一範例中，該Cas核酸內切酶為化膿性鏈球菌(S pyogenes)核酸內切酶，如化膿性鏈球菌(S pyogenes)Cas9核酸內切酶。在一範例中，係使用化膿性鏈球菌(S pyogenes)PAM序列或嗜熱性鏈球菌(Streptococcus thermophiles)LMD-9 PAM序列。
在一範例中，該核酸內切酶為第1組Cas核酸內切酶。在一範例中，該核酸內切酶為第2組Cas核酸內切酶。在一範例中，該核酸內切酶為第3組Cas核酸內切酶。在一範例中，該核酸內切酶為第4組Cas核酸內切酶。在一範例中，該核酸內切酶為第7組Cas核酸內切酶。在一範例中，該核酸內切酶為第10組Cas核酸內切酶。
在一範例中，該核酸內切酶辨識CRISPR/Cas第1組PAM。在一範例中，該核酸內切酶辨識CRISPR/Cas第2組PAM。在一範例中，該核酸內切酶辨識CRISPR/Cas第3組PAM。在一範例中，該核酸內切酶辨識CRISPR/Cas第4組PAM。在一範例中，該核酸內切酶辨識CRISPR/Cas第7組PAM。在一範例中，該核酸內切酶辨識CRISPR/Cas第10組PAM。
在一範例中，Cas核酸內切酶-媒介之切割係用於步驟(a)；任擇地經GG或NGG PAM模體辨識。
在一範例中，該第一及/或第二同源臂包含一PAM模體。本方法可用於一系列插入及/或刪去，如以下所說明。
適當之切口酶之一範例為化膿性鏈球菌(S pyogenes)Cas9 D10A切口酶(請見Cong et al.以及下列範例一節)。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，該方法之步驟(a)與(b)係於一細胞中進行，細菌、酵母菌、真核細胞、植物、動物、哺乳動物、脊椎動物、非-人類動物、嚙齒類、大鼠、小鼠、兔子、魚、鳥類或雞細胞。例如，該細胞為大腸桿菌細胞或CHO或HEK293或畢赤酵母菌(Picchia)或酵母菌(Saccharomyces)細胞。在一範例中，該細胞為體內人類細胞。在一實施例中，細胞為胚胎幹細胞(ES細胞，如人類或非-人類ES細胞，如小鼠ES細胞)，或誘發性多潛能幹細胞(iPS細胞；如人類、嚙齒類、大鼠或小鼠iPS細胞)或多潛能或分化全能細胞。任擇地，該細胞非胚胎細胞，如其中該細胞非人類胚胎細胞。任擇地，該細胞非多潛能或分化全能細胞。在一實施例中，該方法係用於產生可用於人類治療之人類幹細胞(如由病患之一細胞產生之iPS細胞，重新引入病患體內，在於該細胞中實施本發明之後)，其中該幹細胞包含以本發明方法插入之一核苷酸序列或基因序列。此段之各範例特徵可組合。
在一範例中，該方法係於哺乳動物細胞中進行。例如，該細胞為體外人類細胞或非-人類哺乳動物細胞。例如，非-人類(如嚙齒類、大鼠或小鼠)合子。例如，單細胞非-人類合子。
在一範例中，該方法係於植物或非-人類哺乳動物中進行，如嚙齒類、小鼠或大鼠或兔子，或其組織或器 官(如體外)中進行。
在一範例中，該3’端或每一切割位置係於3’端側接有PAM模體(如於此揭示之模體，如NGG或NGGNG序列，其中N為任一鹼基，以及G為鳥糞嘌呤)。例如，一或多或所有切割位置係於3’端側接有序列5’-TGGTG-3’。不像dsDNA，該PAM並非ssDNA結合與切割所絕對必須的：單股寡去氧核苷酸，含有具有或不具PAM序列之前空間子(protospacer)，如同dsDNA般地互相結合，並可用於本發明，其中單股DNA經修飾。此外，在Mg2+離子存在下，Cas9會切割結合至crRNA之ssDNA，使用其與PAM無關之HNH活性位置。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，步驟(a)係於dsDNA或ssDNA上之一股進行切割。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，步驟(a)係於細胞與核酸股、Cas核酸內切酶、crRNA與tracrRNA(如由一或多個gRNAs提供)，其標靶為核酸內切酶，以進行切割，以及任擇地用於與核酸股進行同源重組之插入序列之組合中進行。除了插入序列外，可使用含有同源臂但無插入序列之進入序列，如上所述進行刪去。在一範例中，該Cas核酸內切酶係由一核苷酸序列編碼，其已引入該細胞。在一範例中，該gRNA係由一DNA序列編碼，其已引入細胞中。
在一範例中，該方法係於Mg2+存在下進行。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，步驟(b)係以與包含第一與第二同源臂之進入核酸 進行同源重組，其中該同源臂實質上分別與來自5’端之序列延伸5’端以及來自3’端之序列延伸3’端同源，其中該第二同源臂包含一PAM序列，使得該第二同源臂與來自3’端之序列延伸3’端之間進行同源重組，以於該方法之產物中，產生包含PAM模體之序列。舉例而言，該PAM可為於此揭示之任一PAM序列。因此，該方法可產生包含一PAM之經修飾核酸股，該PAM可依據本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例，用於後續之核酸修飾，其中Cas核酸內切酶係用於切割核酸。此可用於進行本發明之依序核酸內切酶-媒介之同源引導重組(sEHDR)，尤其是下述之sCHDR。
依序核酸內切酶-媒介之同源引導重組(sEHDR)
本發明更提供：一種依序核酸內切酶-媒介之同源引導重組(sEHDR)之方法，包含進行前述任一態樣、觀點、範例或實施例之方法第一次與第二次，其中該核酸內切酶-媒介之切割係用於每一步驟(a)；其中該第一次之產物係用於第二次之核酸內切酶-媒介之切割，其中(i)第一與第二核苷酸序列係分別於第一次與第二次刪去；(ii)第一核苷酸序列係於第一次刪去，以及第二核苷酸序列係於第二次插入；(iii)第一核苷酸序列係於第一次插入，以及第二核苷酸序列係於第二次刪去；或(iv)第一與第二核苷酸序列係分別於第一次與第二次插入；任擇地，其中該第二次之核酸股修飾為第一次修飾之核酸股之內20、10、5、4、3、2或1個或更少之核苷酸。
例如，該第一與第二核苷酸序列係經插入，使得 其可在第二次插入後仍相連。此外，該第一與第二刪去為相連序列，其於進行第一次與第二次刪去後被刪除。
在sEHDR之一實施例中，本發明使用Cas核酸內切酶。因此，係提供：一種Cas-媒介之媒介之依序同源引導重組(sCHDR)之方法，包含進行前述請求項任一項之方法第一次與第二次，其中Cas核酸內切酶-媒介之切割係使用於步驟(a)中之每一者；其中第一次之步驟(b)係以與包含第一與第二同源臂之進入核酸進行同源重組，其中該同源臂實質上分別與來自5’端之序列延伸5’端以及來自3’端之序列延伸3’端同源，其中該第二同源臂包含一PAM序列，使得該第二同源臂與來自3’端之序列延伸3’端之間進行同源重組，以於該方法之產物中，產生包含PAM模體之序列；其中該第一次產物之PAM模體係用於第二次之Cas核酸內切酶-媒介之切割，其中(i)第一與第二核苷酸序列係分別於第一次與第二次刪去；(ii)第一核苷酸序列係於第一次刪去，以及第二核苷酸序列係於第二次插入；(iii)第一核苷酸序列係於第一次插入，以及第二核苷酸序列係於第二次刪去；或(iv)第一與第二核苷酸序列係分別於第一次與第二次插入；任擇地，其中該第二次之核酸股修飾為第一次修飾之核酸股之內20、10、5、4、3、2或1個或更少之核苷酸，或直接鄰接於第一次修飾之核酸股。
例如，該第一與第二核苷酸序列係插入，使得其在第二次插入之後仍相連。此外，該第一與第二刪去係以 在進行第一次與第二次刪去之後，刪去一相連序列之方式刪去。
在一實施例中(第一實施例)，該第一次係依據本發明之第三態樣進行，其中該進入核酸在第一與第二同源臂之間不包含序列，其中5’端與3’端之間係以同源重組方式刪去；及/或第二次係依據本發明之第三態樣進行，其中步驟(b)係以包含第一與第二同源臂之進入核酸進行同源重組，其中該同源臂實質上分別與來自5’端之序列延伸5’端以及來自3’端之序列延伸3’端同源，其中該進入核酸不包含該第一與第二同源臂間之序列，其中介於5’端與3’端之序列係藉由同源重組而刪去；任擇地，其中該第二臂包含一PAM模體，使得該第二次之產物包含一PAM模體，可用於本發明任一態樣、觀點、範例或實施例之後續Cas核酸內切酶-媒介之方法。
在一實施例中(第二實施例)，第一次係依據本發明之第一或第二態樣進行，其中該進入核酸在第一與第二同源臂之間包含插入序列，其中5’端與3’端間之插入序列係以同源重組方式插入；及/或第二次係依據本發明之第一或第二態樣進行，其中步驟(b)係以包含第一與第二同源臂之進入核酸進行同源重組，其中該同源臂實質上分別與來自5’端之序列延伸5’端以及來自3’端之序列延伸3’端同源，其中5’端與3’端間之插入序列係以同源重組方式插入；任擇地，其中該第二臂包含一PAM模體，使得該第二次之產物包含一PAM模體，可用於本發明任一態樣、觀點、範例或實施 例之後續Cas核酸內切酶-媒介之方法。
在一範例中，該第一與第二次係於實施例中進行，以及其他次係特別地於第二實施例中進行，其中進行至少一序列刪去與至少一序列插入。
任擇地，在本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例中，步驟(a)係以Cas核酸內切酶-媒介之切割進行，使用Cas核酸內切酶、一或多crRNAs以及tracrRNA進行。例如，該方法係於細胞中進行，crRNA與tracrRNA係引入細胞中作為RNA分子。例如，該方法係於合子中進行(如非-人類合子，如嚙齒類、大鼠或小鼠合子)，以及crRNA與tracrRNA係引入合子中。在另一實施例中，該crRNA與tracrRNA係由細胞或生物體中之DNA編碼，並於細胞或生物體內轉譯(如ES細胞、如非-人類ES細胞、如嚙齒類、大鼠或小鼠ES細胞)，以產生crRNA與tracrRNA。該生物體為如非-人類動物或植物或細菌或酵母菌或昆蟲。在一實施例中，此種tracrRNA係由DNA編碼，但一或多crRNAs係以RNA核酸方式引入細胞或生物體，以進行本發明方法。
此外或另外地，核酸內切酶可以蛋白質或編碼該核酸內切酶之載體形式引入細胞或生物體，以進行本發明方法。在另一範例中，該核酸內切酶經DNA編碼，該DNA基因性整合入細胞或生物體中，且於細胞或生物體中轉錄並轉譯。
在一範例中，本發明方法係於ES細胞中進行(如非-人類ES細胞、如嚙齒類、大鼠或小鼠ES細胞)，其經預 改造，以包含基因性整合之Cas核酸內切酶序列(或帶有此序列之載體包括於該細胞中)。可引入(或編碼)tracrRNA。藉由以引導寡序列引入crRNA，以到達細胞基因體上希望之區域，之後可進行細胞基因體修飾。在一範例中，於此描述之gRNA係引入ES細胞。該基因性整合之可表現Cas核酸內切酶序列，例如，可連續表現或誘發表現。此外或另外地，該序列可以組織特異性方式表現於使用ES細胞而發育之該子代生物體(如嚙齒類)。
包含基因性整合可表現之Cas核酸內切酶序列之初代ES細胞，可經由標準技術產生子代非人類動物，其包含可表現之Cas核酸內切酶序列。因此，本發明提供： 非-人類動物(如脊椎動物、哺乳動物、魚或鳥類)、動物細胞、昆蟲、昆蟲細胞、植物或植物細胞，其包含基因性整合可表現之Cas核酸內切酶核苷酸序列，以及任擇地，編碼tracrRNA之tracrRNA及/或核苷酸序列。該Cas核酸內切酶為如Cas9或Cys4。在一範例中，該動物、昆蟲或植物基因體包含染色體DNA序列，側接有位置特異性重組位置，及/或轉位子片段(如piggyBac轉位子重複因子)，其中該序列編碼核酸內切酶，以及任擇地，一或多gRNAs。如下列範例中所描述的，重組酶-媒介之片匣交換(RMCE)可用於插入此一序列。轉位子片段可用於由基因體上切除序列，一旦該核酸內切酶用於進行重組時。RMCE及/或轉位子-媒介之切除，可於細胞(如ES細胞)中進行，後者係用於衍生子代動物或植物，其包含希望之基因修飾。
本發明亦提供一種衍生或可衍生自此種動物之ES細胞，其中該ES細胞包含基因性整合可表現之Cas核酸內切酶核苷酸序列。在一範例中，該ES細胞為嚙齒類，如小鼠或大鼠ES細胞，或為兔子、狗、豬、貓、牛、非人類的靈長類動物、魚、兩棲類或鳥類ES細胞。
本發明亦提供一種分離ES細胞之方法，該方法包含自動物(如非-人類動物如嚙齒類，如大鼠或小鼠)衍生，其中該動物包含基因性整合可表現之Cas核酸內切酶核苷酸序列，如此所述。
在這些觀點之任一者中，取代ES細胞，該細胞可為iPS細胞或分化全能或多潛能細胞。因此，iPS或幹細胞可衍生自人類(如其體細胞)，其經體外改造已包含基因性整合可表現之Cas核酸內切酶核苷酸序列，以及任擇地一或多個編碼tracrRNA或gRNA之DNA序列。因此，本發明亦相關於此方法，並相關於人類iPS或幹細胞，其包含基因性整合可表現之Cas核酸內切酶核苷酸序列，以及任擇地一或多個編碼tracrRNA或gRNA之DNA序列。此細胞可使用於本發明方法中，以進行基因體修飾(如校正基因缺陷，如藉由以希望之序列取代缺陷序列，任擇地具有後續之轉位子-媒介之核酸內切酶-編碼序列切割)。在Cas核酸內切酶序列選擇性切割之後，該iPS細胞或幹細胞可引入提供者人類(或不同人類如其基因上的親戚)，以進行基因療法或預防。在另一範例中，係使用分化全能或多潛能人類細胞，之後發育為人類組織或器官或其部分。此可用於提供人類治療或預防 之材料，或用於產生試驗材料(如用於植入至模型或非-人類動物中)，或用於體外試驗(如作為藥物)。
在一範例中，該方法係使用單股嚮導RNA(gRNA或sgRNA)，其包含crRNA與tracrRNA。該crRNA包含寡核苷酸序列(下述5’-X-Y-3’結構中之“X”)，其係選用於標靶待修飾核酸或基因體之部分。熟習此技術領域者應立即可選擇適當之寡序列。在一範例中，該序列為3至100個核苷酸長，如自3至50、40、30、25、20、15或10個核苷酸長，如或5、10、15或20至100個核苷酸長，如5、10、15或20至50個核苷酸長。
例如，該gRNA為單一核酸，其包含crRNA與tracrRNA二者。gRNA之一範例包含序列5’-[寡]-[UUUUAGAGCUA(S N1UUUUAN2N3GCUA)]-[連接子]-[UAGCAAGUUAAAA(SEQ ID NO：2)]-3’，其中連接子包含複數個(如4或更多，如4、5或6個)核苷酸(如5’-GAAA-3’)。
例如，crRNA具結構5’-X-Y-3’，其中X為RNA核苷酸序列(任擇地，至少5個核苷酸長)，以及Y為crRNA序列，其包含一核苷酸模體，其與含有該tracrRNA之模體雜合，其中X可與5’切割端之希望位置之5’核苷酸序列雜合，如延伸自5’切割端之希望位置之5’延伸端。
在一範例中，Y為5’-N1UUUUAN2N3GCUA-3’(SEQ ID NO：3)，其中N1-3每一者皆為A、U、C或G，及/或tracrRNA包含序列(方向為5’至3’)UAGCM1UUAAAAM2 (SEQ ID NO：4)，其中M1為空間子核苷酸序列，以及M2為核苷酸；如N1-G、N2=G與N3=A。空間子序列為如5、4、3、2或1個RNA核苷酸長(如方向為5’至3’之AAG)。M2為如A、U、C或G(如M2為G)。在一實施例中，係使用嵌合性gRNA，其包含一序列5’-X-Y-Z-3’，其中X與Y係如上述定義，以及Z為tracrRNA，其包含序列(方向為5’至3’)UAGCM1UUAAAAM2(SEQ ID NO：4)，其中M1為空間子核苷酸序列，以及M2為核苷酸。在一範例中，Z包含序列5’-UAGCAAGUUAAAA-3’(SEQ ID NO：2)，如Z為5’-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3’(SEQ ID NO：5)。在一範例中，該gRNA具序列： (SEQ ID NO：6)
當希望使用本發明插入一外源序列至待修飾之核酸時，該外源性序列可以直線形或環狀核酸(如DNA)提供。典型而言，該外源性序列係側接同源臂，其可分別於序列之5’與3’端之該外源性序列待插入處進行同源重組。此技術領域者應熟習選擇用於同源重組之同源臂。
本發明可用於產生基因轉殖生物體之方法中，如此述之任一生物體。例如，該生物體可為非-人類生物體，使用作為試驗模式，以測試醫療藥物或表現外源性蛋白質或其一部份(如於非人類動物試驗生物體中敲入人類蛋白質標靶)。在本發明之另一範例中，本發明已用於敲除生物 體如非-人類生物體之內生性序列(如標靶蛋白質)。此可用於評估敲出之效果(表型)，且因此可評估疾病之潛在藥物標靶或可能相關之蛋白質。在一範例中，該生物體為非-人類動物(如脊椎動物、哺乳動物、鳥類、魚、嚙齒類、小鼠、大鼠或兔子)，其中人類標靶蛋白質已使用本發明敲入。任擇地，本發明已用於敲除生物體之異種同源或同源內生性標靶(如內生性標靶序列已於內生性位置，經異種同源或同源人類標靶序列取代)。在此方法中，可產生測試醫療藥物之試驗模型，其作用於人類標靶。
在一實施例中，該生物體為非-人類脊椎動物，其表現有人類抗體變異區，其基因體包含內生性標靶經異種同源或同源人類序列取代。在一範例中，本發明方法係用於產生抗體-產生脊椎動物或試驗脊椎動物，如WO2013061078所揭示，該份揭示特別包含此種脊椎動物、其組成物、製造與用途，在此併入完整本案以作為參考資料，並提供基準。
在一範例中，係使用該方法敲入(Knock-in)一外源性調節要素。例如，敲入以取代內生性調節要素。
在一觀點中，本發明係提供一種產生細胞或轉殖性非-人類生物體(如此述任一非-人類生物體)之方法，該方法包含：(a)進行本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例，以(i)敲除第一細胞之基因體之標靶核苷酸序列，及/或(ii)敲入第一細胞之基因體之插入核苷酸序列， 任擇地，其中該插入序列取代一完整標靶序列，或基因體之標靶序列之內生性位置之一部分；其中該細胞或其子代可發展為非-人類生物體或細胞；以及(b)將該細胞或子代發展為非人類生物體或非-人類細胞。
在一範例中，該生物體或細胞為修飾(i)及/或(ii)之同型合子。
在一範例中，該細胞為ES細胞(如小鼠ES細胞)、iPS細胞、分化全能細胞或多潛能細胞。在一範例中，該細胞為非-人類脊椎動物細胞或人類體外細胞。在一範例中，該細胞為植物、酵母菌、昆蟲或細菌細胞。
在一範例中，該細胞或生物體為嚙齒類(如小鼠或大鼠)細胞，或兔子、鳥類、魚、雞、非-人類靈長類、猴子、豬、狗、駱駝、鯊魚、綿羊、乳牛或貓之細胞。
在一範例中，該標靶序列為內生性序列，其包含編碼一蛋白質之全部或部分之調節要素之全部或部分。
在一範例中，該插入序列為合成序列；或包含編碼一蛋白質之全部或部分之序列，該蛋白質來自第一細胞所衍生之物種以外之物種；或包含來自該第一物種之調節要素。此可用於與具有新調節要素之基因結合。
在一範例中，該插入序列編碼或人類蛋白質之全部或部分，或人類蛋白質次單元或區塊。例如，該插入序列編碼一細胞膜蛋白質、分泌性蛋白質、細胞內蛋白質、 細胞介質、受器蛋白質(如Fc受器蛋白質，如FcRn或Fcγ受器蛋白質)、人類免疫系統之蛋白質或其區塊(如Ig蛋白質或區塊，如抗體或TCR蛋白質或區塊，或MHC蛋白質)、賀爾蒙或生長因子。
本發明亦提供：一細胞(如經分離或純化之細胞，如體外細胞，或於此揭示之任一細胞)或非-人類生物體(如於此揭示之任一生物體，如小鼠)，其基因體包含一修飾，其包含側接有內生性核苷酸序列之非-內生性核苷酸序列，其中該細胞或生物體可由本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例提供，且其中該非-內生性序列於3’及/或5’側接(如20、10、5、4、3、2或1或更少個核苷酸內，或直接鄰接於)一Cas PAM模體；其中該細胞並非包含於人體中；以及施行(a)至(d)之一、多或全部(如(a)；(b)；(c)；(d)；(a)與(b)；(a)與(c)；(a)與(d)；(b)與(c)；(b)與(d)；(c)與(d)；(a),(b)與(c)；(a),(b)與(d)；(a),(c)與(d)；(b),(c)與(d)或(a),(b),(c)與(d)之全部)。
(a)該基因體為該修飾之同型合子：或於一對偶基因上包含該修飾，而在另一對偶基因上未經Cas-媒介之同源重組修飾；(b)該非-內生性序列包含調節要素之全部或部分或編碼一蛋白質之全部或部分；(c)該非-內生性序列為至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800或900個核苷酸，或至少1、2、3、5、10、 20、50或100kb長；(d)該非-內生性序列取代基因體之一異種同源或同源序列。
該細胞可為人類細胞，或包括於人類組織中，但不為人類之一部分。例如，該細胞為體外人類細胞。
在一範例中，該非-內生性序列為人類序列。
在一範例中，該PAM模體為於此揭示之任一PAM，或包含選自於CCN、TCN、TTC、AWG、CC、NNAGNN、NGGNG GG、NGG、WGG、CWT、CTT與GAA之一序列。例如，該模體為Cas9 PAM模體。例如，該PAM為NGG。在另一範例中，該PAM為GG。
在一範例中，具一不大於10個核苷酸(如3個核苷酸)之3’端PAM模體，及/或非-內生性序列之5’端。
在一範例中，該PAM模體係由鏈球菌屬(Streptococcus)Cas9辨識。
在一範例中，該細胞或生物體為非-人類脊椎動物細胞，或表現一或多個人類抗體重鏈變異區塊(以及任擇地非-人類脊椎動物物種之非重鏈變異區塊)之非-人類脊椎動物。例如，該生物體為抗體-產生脊椎動物或試驗脊椎動物，如WO2013061078所揭示。
在一範例中，該細胞或生物體為非-人類脊椎動物細胞，或表現一或多個人類抗體kappa輕鏈變異區塊(以及任擇地非-人類脊椎動物物種之kappa輕鏈變異區塊)之非-人類脊椎動物。
在一範例中，該細胞或生物體為非-人類脊椎動物細胞，或或表現一或多個人類抗體lambda輕鏈變異區塊(以及任擇地非-人類脊椎動物物種之lambda輕鏈變異區塊)之非-人類脊椎動物。
在一範例中，該非-內生性序列編碼人類Fc受器蛋白質或其次單元或區塊(如人類FcRn或Fcγ受器蛋白質、次單元或區塊)。
在一範例中，該非-內生性序列包含一或多個人類抗體基因片段、抗體變異區或抗體恆定區。
在一範例中，該插入序列為人類序列，其取代或補充異種同源非-人類序列。
本發明亦提供：以抗原使本發明之(或由本發明方法產生之)脊椎動物(如小鼠或大鼠)產生免疫反應，而製備之單株或多株抗體。
本發明亦提供：一種分離可與預定抗原結合之抗體之方法，該方法包含：(a)提供如本發明(或由本發明製造)之脊椎動物(任擇地為小鼠或大鼠)；(b)以該抗原使該脊椎動物產生免疫反應；(c)自該脊椎動物中移出B淋巴球，並篩選出表現有可與該抗原結合之抗體之一或多個B淋巴球；(d)任擇地使該篩選出之B淋巴球或其子代不朽化(immortalizing)，任擇地由其產生融合瘤；以及 (e)分離出該B淋巴球表現之抗體(如IgG-型抗體)。
在一範例中，該方法包含自該B淋巴球分離出編碼與該抗原結合之抗體之核酸；任擇地交換該抗體之重鏈恆定區核苷酸序列，其具有編碼人類或人源化重鏈恆定區之核苷酸序列，以及任擇地使該抗體變異區親合力成熟；以及任擇地插入該核酸至一表現載體上與任擇地一宿主中。
在一範例中，該方法包含製造以該方法製造之抗體之突變物或衍生物。
本發明係提供一種使用與該抗原結合之經分離、單株或多株抗體或其突變或衍生抗體，製造使用作為藥劑之組成物之用途。
本發明係提供一種使用與該抗原結合之經分離、單株或多株抗體或其突變或衍生抗體，作為藥物之用途。
本發明係提供一種治療有需要病患(如人類病患)之方法，包含投以此述之治療有效劑量之經分離、單株或多株抗體，或其突變物或衍生物，其與一抗原結合。
本發明係提供編碼此述抗體之核苷酸序列，任擇地，其中該核苷酸序列為載體之一部分。本發明亦提供包含該核苷酸序列之宿主細胞。
本發明係提供包含該抗體或此述抗體、以及一稀釋劑、賦形劑或載體之醫藥組成物。
本發明係提供一種ES細胞、非-人類動物或非-人類囊胚細胞，包含一可表現之基因整合性核苷酸序列， 其編碼Cas核酸內切酶(如Cas9或Cys4)，以及任擇地基因整合性可表現核苷酸序列，其編碼tracrRNA或gRNA。例如，該ES細胞為此述任一ES細胞類型。
在細胞、動物或囊胚細胞之一範例中，該核酸內切酶序列可持續表現。
在細胞、動物或囊胚細胞之一範例中，該核酸內切酶序列誘導表現。
在細胞、動物或囊胚細胞之一範例中，該核酸內切酶序列可以組織特異性或階段特異性方式，表現於動物或其子代中，或於非-人類動物中，其為該細胞或囊胚細胞之子代。
在一範例中，該細胞、動物或囊胚細胞包含一或多個gRNAs或可表現之核苷酸序列，其編碼一gRNA或複數個可表現之核苷酸序列，每一者編碼一不同之gRNA。
本發明係提供使用本發明之任一態樣、觀點、範例或實施例之細胞、動物或囊胚細胞。
其中一觀點係提供一種由本發明方法製備之抗體，任擇地使用於藥物中，如用於治療及/或預防(如用於治療及/或預防之方法中)一病患如人類之病症或疾病中。
其中一觀點係提供一種編碼本發明抗體之核苷酸序列，任擇地，其中該核苷酸序列為載體之一部分。適當之載體為此技術領域者立即可知，如一般抗體表現載體，其包含核苷酸序列，與一或多個表現控制因子操作性連結。
本發明之一觀點係提供一種醫藥組成物，其包含本發明抗體，以及一稀釋劑、賦形劑或載體，任擇地，其中該組成物係包含於靜脈內(IV)容器中(如IV袋)或與IV注射器相連之容器。
亦提供一種本發明抗體之用途，以製造用於治療及/或預防病患如人類之疾病或病症之藥物。
在另一觀點中，本發明係相關於一種人源化抗體與依據本發明製造之抗體鏈，為嵌合性且為完全人源化形式，以及該抗體於藥物上之用途。本發明亦相關於一種醫藥組成物，包含此抗體與醫藥上可接受之載體或其他賦形劑。
含有人類序列之抗體鏈，如嵌合性人類-非人類抗體鏈，於此視為人源化，由於有人類蛋白質編碼區存在。完全人類抗體可由編碼本發明嵌合性抗體鏈之DNA起始，使用標準技術。
產生單株與多株抗體之方法為技術上已知，且本發明係相關於嵌合性或完全人源化抗體之多株與單株抗體，由抗原刺激本發明之非-人類脊椎動物反應而產生。
在又一觀點中，本發明產生之嵌合性抗體或抗體鏈，可於DNA層級適當地操作，以產生具有抗體類似特性或結構之分子，如人類變異區，來自恆定區不存在之重鏈或輕鏈，如區塊抗體；或人類變異區，具有來自同一或不同物種之重鏈或輕鏈之恆定區；或具有非-天然發生恆定區之人類變異區；或與任一其他融合夥伴結合之人類變異區。 本發明相關於所有此類嵌合性抗體衍生物，其衍生自本發明辨識出之嵌合性抗體。
在又一觀點中，本發明係相關於一種使用本發明之動物，以分析藥物與疫苗效果，使用準-人類抗體資料庫。
本發明相關於一種辨識與驗證藥物或疫苗之方法，該方法包含傳送疫苗或藥物至本發明之哺乳動物中，並監測下列一或多種反應：免疫反應、安全性；以及對疾病之影響。
本發明亦相關於一種套組，包含於此揭示之抗體或抗體衍生物，以及使用此抗體與適當之實驗用試劑，如緩衝液、抗體偵測試劑之說明。
應瞭解到此述之特定實施例僅用於說明而非限制本發明。本發明之主要特徵可應用於各實施例中而不脫離本發明範疇。熟習此技術領域者應可辨識或可確認使用不超過常規研究之數種特定流程之等效物。此等效物落於本發明範疇中，並由申請專利範圍所涵蓋。本說明書提及之所有文獻與專利申請案，可使此技術領域者明白本發明所涉及之技術層級。所有文獻與專利申請案皆在此併入本案以作為參考資料，若每一單獨文獻或專利申請案有特定指出，亦在此併入本案以作為參考資料。在申請專利範圍及/或說明書中使用"一(a)"或"一(an)"，當與術語"包含"結合使用時，可代表"一"，但其亦與"一或多"、"至少一"，以及"一或大於一"意義一致。在申請專利範圍中使用術語"或" 係代表"及/或"，除非明確指出僅代表替代語或替代語是相互排斥的，儘管本分揭示支持該定義僅代表替代語與"及/或"。在本申請案中，術語"約"係用於指出該數值包含用於決定該數值之該裝置、用於決定該數值之方法之固有變數，或該研究對象本身存在之變數。
使用於本說明書與專利申請範圍之中，術語"包含"(以及包含之任一形式，如"包含(comprise)"與"包含(comprises)")、"具有"(以及具有之任一形式如"具有(have)"與"具有(has)")、"包括"(以及包括之任一形式如"包括(includes)"與"包括(include)")或"含有"(以及含有之任一形式如"含有(contains)"與"含有(contain)")為包容性或開放性，並不排除額外的、未列舉的因子或方法步驟。
術語"或其組合"使用於此係指該術語之前之所有列舉項目之排列或組合。例如，"A、B、C或其組合，係包括下列至少一項：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，若該順序在特定內文中相當重要，亦可為BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。延續此範例，該表達包括含有一或多項或術語之重複組合，如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB，以及類似術語。此技術領域者應瞭解到，在任一組合中，該項數或術語數目並無限制，除非另有指出。
本揭示之任一部分可與揭示中之任一其他部分組合，除非內文另有指出。
於此揭示與申請之所有組成物及/或方法，皆可 依據本揭示達成，毋須過多的實驗。儘管本發明之組成物與方法以較佳實施例描述，此技術領域者應瞭解到該組成物及/或方法，以及該方法之步驟或步驟順序，乃可變化，而不脫離本發明概念、精神與範疇。所有此種類似之取代與修飾，為此技術領域者顯而易見的，視為落於本發明之精神、範疇與概念中，如同後附申請專利範圍中所定義者。
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本發明係以下列非限制性範例進行更詳細之描述。
範例 範例1：精確的DNA修飾
(a)使用切口酶修飾HDR
目前已報導Cas9核酸酶可轉換為切口酶，經由將SpCas9之RuvCI區塊之天門冬胺酸取代為丙胺酸(D10A)在(Cong et al.)。值得注意的是，DNA單股斷裂較佳經由HDR路徑修復。Cas9 D10A切口酶，當與成熟crRNA：tracrRNA複合時，可於一精確位置上特異性地誘發DNA產生切口。考慮到這一點，我們提出CRISPR/Cas系統之延伸應用，藉由創造出基因體上特定位置之缺口，使用Cas9 D10A切口酶，之後利用HDR路徑插入單股DNA片段(內生性或外源性)，其含有DNA同源物(一般用於重組工程，50bp已足夠用於有效重組)，側接該切口DNA結合點，以於一精確位置上帶進並插入一特定DNA；類似大小之同源物亦可使用於本範例中(圖1A)。嚮導RNA(gRNA)可單獨依據每個標靶前空間子序列設計或整合進單一CRISPR陣列，其編碼2或多個空間子序列，可產生多重基因體，由單一CRSPR陣列編輯。
(b)精確DNA刪去之範例
為了使用Cas9與gRNA進行精確刪去，且無標靶載體或提供者DNA，我們在一基因中設計二gRNA，其相隔55bp。該二gRNA為於DNA對向股上。如圖9所示。
小鼠ES細胞係經人類Cas9核酸酶與該二gRNAs轉染。轉染程序係如上述進行，但所得殖株未經篩選。經轉染之ES殖株係使用跨越該二gRNA(引子1 & 2)之寡核酸 對進行基因分型(基因分型)，以偵測特異性之55bp刪去(圖10)。
大部分殖株並未顯示具有特異性之55bp刪去，然而，含有該定義刪去之殖株經清楚辨識出。在384個經分析之殖株中，約4%之殖株經發現含有特異性之55bp刪去。請注意：並非所有的基因分型數據皆列出。含有特異性55bp刪去之殖株，係以定序該PCR產物而進一步分析，作為最終確認(數據未顯示)。此外，在觀察到特異性刪去之處，亦觀察到該二對偶基因皆含有該特異性刪去。這些數據確認了，當使用二gRNAs時，便可進行精確與特異性刪去，而不需使用標靶載體。然而，我們可以假設該定義刪去之效率可大幅增進，使用該二gRNA與標靶載體，或含有側接預定刪去區之同源臂之提供者DNA片段之組合物。
(c)DNA刪去之另一方法
在一單獨設定中，編碼複數個空間子序列之二gRNA或單一CRISPR陣列，可設計為側接有興趣之基因或一區，並與Cas9 D10A切口酶結合，二單獨之單股斷裂物便可被誘發。亦即，與單股DNA片段結合，其含有第一DNA缺口片段之5’斷裂點接合之DNA同源物，以及第二DNA缺口片段之3’斷裂點接合之DNA同源物，該二單股DNA缺口間之區域便可精確地被刪去(圖2A)。
(d)DNA取代之另一方法
在另一設定中，二單獨gRNA或多種單一CRISPR陣列可設計為側接一有興趣之基因或一區域，並與Cas9 D10A切口酶結合，便可誘發二單獨之單股斷裂。在此案例中，該加入之單股DNA片段(或雙股DNA)可含有來自已知基因之內生性或外源性序列、調節要素啟動子等之DNA序列。此單股DNA片段(或雙股DNA)可相連，以取代有興趣之DNA區，其側接有DNA缺口，藉由將其瞄準第一缺口之5’區與第二缺口之3’區之DNA同源物(圖3A)。由於CRISPR/Cas系統切割DNA之高效率，上述假設之策略便不需引入任何篩選標記，因此產生精確之無縫基因體編輯，以精確與經定義之方式。作為一選項，篩選標記可經由側接PiggyBac LTR而包含入，以允許直接篩選經正確修飾之殖株。一旦該正確殖株被辨識出，該篩選標記便可經由表現過度活性之piggyBac轉位酶，而方便地移除(Yusa K.,Zhou L.,Li M.A.,Bradley A.,Craig N.L.：A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011,108(4)：1531-1536)。此外，上述方法可應用於ES細胞、哺乳動物細胞、酵母菌細胞、細菌細胞、植物細胞，以及直接於合子中進行，以加快在紀錄時間內改造同源基因體之流程。亦可倍增此系統，以產生同時DNA插入(KI)、刪去(KO)以及依序刪去與插入(KO→KI)等多個步驟。
(e)於預定義位置刪去與插入(KO→KI)DNA之範例
為了呈現希望之DNA區可使用Cas9操作，一種單一嚮導RNA(gRNA)，係於圖7預定之區域(基因X之外顯子1)進行篩選。亦建構標靶載體，其含有約300bp同源臂(5’與3’ HA)，側接有該gRNA。該同源臂可於定義區中進行精確雜合，因而刪去預定刪去之50bp區。該標靶載體亦允許任一有興趣之DNA序列插入。在此概念驗證實驗中，係包含約1.6kb PGK-嘌呤黴素片匣。嚮導RNA(0.5ug)與標靶載體(1ug)及Cas9核酸酶載體(1ug)組合，並轉染ES細胞，之後使用上述流程，以嘌呤黴素篩選出96個殖株。請注意，作為標靶效率測試，我們比較直線形與環狀標靶載體。陰性控制組進行相同實驗但不使用Cas9載體，以比較具有與不具有Cas9表現，進行同源重組之標靶效率。
所有篩選出之殖株皆具嘌呤黴素抗性，且由該四次轉染之每一次中挑選出之96個殖株，係經基因分型，使用寡核酸對HAP341/HAP334。經正確標靶之殖株可產生880bp PCR產物。所得之基因分型數據顯示於圖8。
由此實驗之基因分型數據，可發現Cas9媒介之雙股DNA斷裂可大幅增進標靶載體之同源重組效率達殖株之62%與49%，分別使用環狀或直線形標靶載體，可正確地標靶，與僅使用環狀標靶載體而未使用Cas9之單一標靶殖株相較。由此數據亦可發現該環狀標靶載體可產生些微較佳之標靶效率，與使用直線形載體相較，但通用結果並無法由此單一實驗得知，但環狀及形標靶載體與Cas9以及特異性嚮導RNA合併使用時，可大幅增進標靶效率。此實驗亦呈現使用Cas9產生一定義之DNA斷裂，可用於刪去經定義之DNA區，以及之後可插入任一有興趣之DNA片段。
範例2：回收PAM用於依序插入或刪去
在某些設定中，經由染色體步移編輯基因體是相當有用的。使用上述三個範例之任一者，可以逐步方式進行依序基因體編輯，其中前一回合CRISPR/Cas媒介之基因體編輯中之PAM序列可再利用，以進行多回合基因體編輯，如刪去、插入或同步刪去與插入。依序刪去之範例，其中來自先前基因體編輯步驟之PAM序列係經回收，如圖4A所示。使用PAM回收法，可進行依序插入以及依序同步刪去與插入。
PAM序列經同源重組再引入而回收，並作為同源臂之一部分。該PAM序列可任擇地伴隨有獨特嚮導-RNA序列，而於宿主基因體中產生一新穎位置，用於下一回合之基因體編輯。
範例3：使用CRISPR/Cas系統快速插入Lox位置
在ES細胞中使用一般同源重組法之標靶效率相當低。在另一組中，CRISPR/Cas系統可用於快速且有效率地引入lox位置或其他重組酶辨識序列如Frt於一定義位置，以作為重組酶媒介之片匣交換(RMCE)進行基因體編輯之著陸位置(landing pad)(Qiao J.,Oumard A.,Wegloehner W.,Bode J.：Novel tag-and-exchange(RMCE)strategies generate master cell clones with predictable and stable transgene expression properties.,J.Mol.Biol.,2009, 390(4)：579-594；and Oumard A.,Qiao J.,Jostock T.,Li J.,Bode J.：Recommended Method for Chromosome Exploitation：RMCE-based Cassette-exchange Systems in Animal Cell Biotechnology.,Cytotechnology,2006,50(1-3)：93-108)。一旦lox位置引入基因體中，則倒位、刪去或片匣交換，以於此位置刪去並引入不同大小之DNA片段，便可經由表現Cre重組酶有效率地導入。圖5A係說明經CRISPR/Cas媒介，之後經RMCE之lox插入範例。RMCE步驟可用於倒轉側接有lox位置之區塊，或刪去此區，及同步刪去與插入此區塊有興趣之DNA。此外，該RMCE步驟可用於進行複數次依序RMCE(sRMCE)。
範例4A：
請參照圖6A。內含PGK啟動子-驅動loxP/突變lox-側接neo R基因之piggyBac轉位子，係藉由標準同源重組技術，標靶至ES細胞基因體中。該標靶殖株可經由G418篩選。此提供之後重組酶-媒介之片匣交換(RMCE)之著陸位置。此ES殖株可使用親代細胞進行任何其他修飾。含有loxP/突變lox-側接無啟動子PuroΔTK-T2A-Cas9，及U6聚合酶III啟動子-驅動嚮導RNA(gRNA)基因之片匣，係插入至著陸位置，經由短暫cre表現。gRNA基因可為一或大於一個，其標靶相同或不同基因。經插入之殖株可經嘌呤黴素篩選，並經由接合PCR(junction PCR)確認。在篩選期間，Cas9與來自插入片匣之gRNAs之表現，會導致更有效率之基因標靶或修飾，與短暫表現Cas9與gRNA者相較。經4-6日之刪去之後，整個經修飾片匣係經由短暫表現piggyBac轉位酶(PBase)而切除。最終ES細胞殖株不包含任一Cas9或gRNA序列。具有同源性修飾基因之殖株，係經PCR與序列確認。
本發明之主要特徵為在一定時間內控制Cas9與and gRNA表現，以足夠產生有效之標靶效率。
範例4B：單一複本之Cas9表現
如範例6所描述，進行來自細胞染色體之Cas9之單一與穩定表現，標靶一著陸位置載體至染色體6之Rosa26對偶基因上。DNA同源臂係用於標靶Rosa26之外顯子2與3間之著陸位置載體。使用上述之程序，將著陸位置載體標靶至ES細胞內。經轉染之ES殖株係經G418篩選，並藉由PCR倍增5’與3’同源臂接合點，以基因分型出正確之標靶(圖11)。
標靶著陸位置可產生許多標靶ES殖株。標靶殖株之篩選係用於插入含有Cas9核酸酶經由T2A序列與Puro-delta-tk相連之DNA片匣，經由RMCE插入至標靶著陸位置，其涉及Cre重組酶之表現。位於著陸位置與進入載體之相對應之loxP與102272位置，可確保插入位向正確。由於著陸位置含有geneless PGK啟動子，含有Cas9之進入載體DNA之正確插入，可活化嘌呤黴素之表現，因此殖株為嘌呤黴素篩選陽性。此DNA片匣之非-特異性標靶不會產生嘌呤黴素抗性殖株，由於其在插入DNA片匣中缺乏啟動子驅動無啟動子嘌呤黴素基因之轉錄。初始Cas9載體插入至著陸位置並不含有任何嚮導RNA序列。該抗嘌呤黴素之ES殖株係經PCR進行基因分型，或正確插入Cas9(圖12)。
如同陽性篩選所預測的，大部分殖株經基因分型顯示插入Cas9載體，可經由RMCE正確地標靶，依據PCR 基因分型結果。二正確殖株(KHK1.6 Z2-24-27與KHK1.10Z2-25-4，稱之為陽性Z殖株)，其含有單一複本Cas9整合至Rosa26基因，為單一複本，係用於測試是否Cas9表現足以誘發Cas9媒介之基因體編輯。在該二陽性Z殖株中，某一稱之為Y基因之嚮導RNA，係使用上述流程轉染。在轉染與擴張所得ES殖株之後，36個單獨殖株係由每一次轉染分離出，並開始使用側接有嚮導RNA之寡核苷酸進行PCR而分析(圖13)。
大部分殖株會產生PCR產物，其尺寸相等於陽性控制組PCR產物，其中使用來自小鼠AB2.1 ES細胞之DNA。然而，清楚顯示某些殖株會產生明顯小於陽性控制組之PCR產物，亦即這些殖株含有明顯刪去，經由indel。為了證明此現象，並確認是否其他PCR產物，儘管與陽性控制組大小類似，但不含indels，所有PCR產物皆經Qiagen凝膠萃取套組純化，並經定序分析。定序數據確認這些PCR產物有明顯的刪去，其會產生較陽性控制組短之產物。亦值得注意的是，其他具有類似於陽性控制組之PCR產物尺寸之殖株，含有indels，其包括各種插入與刪去之組合(定序數據未顯示)。在經分析之殖株中，其18%含有indel。這些數據清楚顯示單一複本表現之Cas9可用於進行基因體編輯，且這些殖株可使用作為Cas9宿主細胞，以進行多重基因體編輯。這些ES殖株可用於產生基因轉殖小鼠株，其中可進行單一-步驟基因體編輯，藉由僅直接注射嚮導mRNA至合子中，不需轉錄Cas9 mRNA，以簡化單一-步驟基因體編輯 流程。
範例5(A)：方法學 A：重新建構CRISPR/Cas載體系統(核酸酶)
CRISPR/Cas基因體編輯系統已於體外重新建構，並以小鼠胚胎幹細胞為範例，使用含有人源化化膿性鏈球菌(S.pyogenes)(hSpCsn1)之載體pX330(Cong et al.)。該CRISPR/Cas系統可如Cong et al所述重新建構，使用合成DNA串與DNA裝配。在本範例中，完整的DNA裝配可組成6006bp片段，其含有45bp同源於pBlueScript KS+載體5’端至EcoRV切割位置、人類U6啟動子、二BbsI限制酶位置，用於選殖入空間子序列，其融合至嵌合性嚮導RNA序列、雞β-肌動蛋白啟動子，具有3個FLAG、細胞核定位訊號(NLS)，之後為hSpCsn1序列與另一NLS、bGH polyA、倒轉末端重複序列，以及最終另一45bp同源於pBlueScript KS+3’至EcoRV切割位置。此6006bp之DNA延伸片段係合成為7個單獨DNA片段，其中每一片段皆具與鄰近DNA片段有45bp之重疊，以允許DNA組合。這些片段之DNA序列顯示如下，以進行組裝。
片段1A(1340bp)
(SEQ ID NO：7)
片段2(852bp)
(SEQ ID NO：8)
片段3(920bp)
(SEQ ID NO：9)
片段4(920bp)
(SEQ ID NO：10)
片段5(920bp)
(SEQ ID NO：11)
片段6(789bp)
(SEQ ID NO：12)
片段7(535bp)
(SEQ ID NO：13)
為了建構Cong et al描述之CRISPR/Cas系統，除了EcoRV直線化pBlueScript KS+載體之外，上述DNA片段將使用Gibson組裝套組(NEB Cat No.E5510S)組裝。在另一方法中，該6006bp片段可藉由組裝式PCR組裝，藉由混合各DNA片段之莫耳比例，並使用DNA混合物作為PCR模板。組裝之PCR產物之後可直接選殖至pBlueScript載體或標準選殖載體系統，如TOPOTA選殖套組(Invitrogen)。
B：重新建構CRISPR/Cas載體系統(D10A切口酶)
CRISPR/Cas系統之D10A切口酶版本，可方便地以組裝上述片段而重建，其中片段2係以含有D10A取代之片段2A取代(請見下序列)。
片段2A(852bp)
(SEQ ID NO：14)天門冬胺酸取代為丙胺酸係以粗體與下標作標記。
C：標靶(空間子)序列選殖
該標靶空間子序列可選殖至上述CRISPR/Cas載體系統，經由BbsI限制酶位置，其位於嵌合性嚮導RNA序列上游。該空間子序列可排列為寡核苷酸對，並黏合為具有突出端，如下所示，以允許直接選殖至BbsI直線化CRISPR/Cas載體上，使用標準分子生物學流程。
具有空間子序列之寡核苷酸對範例序列為：5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO：15)
3’-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’(SEQ ID NO：16)
該下標之4bp突出序列必須包含於空間子寡核苷酸中，以幫助選殖至CRISPR/Cas載體中之BbsI限制酶位置上。使用此方法，任一空間子序列可方便地選殖至CRISPR/Cas載體上。
D：用於單-步驟產生基因轉殖動物之重建CRISPR/Cas系統
為了重建CRISPR/Cas系統，用於單-步驟產生基因轉殖動物，如Wang et al.所述(Wang H.,Yang H.,Shivalila C.S.,Dawlaty M.M.,Cheng A.W.,Zhang F.,Jaenisch R.：One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.,Cell,2013,153(4)：910-918)，其中使用直接胚胎注射，上述之CRISPR/Cas載體系統需要經修飾，以加入T7聚合酶啟動子至Cas9編碼序列中。此外，該gRNA需要被移除，並單獨合成，藉由黏合寡核苷酸或合成製造(請見下列範例T7-融合至嵌合性嚮導RNA序列-T7-gRNA之空間子序列)。請注意，理想中該空間子序列可設計於一特定染色體之獨特區塊中，以使偏離目標效應最小化，以及各基因體序列需要於3’-端具有PAM。
範例T7-gRNA序列
(SEQ ID NO：17)N端下標之20bp為特定標靶DNA之空間子序列。
為了重建該單-步驟CRISPR/Cas系統，上述之DNA片段(片段2、3、4、5、6 & 7)可組裝在一起，其中片段1A(含有45bp同源於pBlueScript KS+載體5’至EcoRV限制酶位置、人類U6啟動子、BbsI限制酶位置、嵌合性嚮導RNA序列與雞b-肌動蛋白啟動子)係以片段1取代，其中僅含有45bp同源於pBlueScript KS+載體與T7聚合酶啟動子之DNA序列，其具有片段2之45bp同源物。此會產生CRISPR/Cas系統之核酸酶版本，用於單-步驟產生之基因轉殖動物。為了產生切口酶版本，片段2可置換為片段2A，如上所述，之後片段1、2A、3、4、5、6與7可組裝在一起，不論是使用Gibson組裝或組裝式PCR。
片段1(111bp)
(SEQ ID NO：18)
E：製備用於HDR-媒介之修復之寡核苷酸/DNA片段
範圍為15bp至超過>125bp之DNA寡核苷酸，係經由Sigma客戶寡核苷酸合成服務處合成。寡核苷酸可含有任一序列如經定義之突變、引入限制酶位置，或有興趣之序列，包括重組辨識序列，如loxP或其衍生物、Frt或其衍 生物，或PiggyBac LTR或任一其他轉位子片段，或調節要素，包括強化子、啟動子序列、報導子基因、篩選標記與標籤。該寡核苷酸之設計將加入DNA同源物至其中Cas9媒介雙股DNA斷裂物或DNA缺口之區域。該同源物之尺寸範圍自數個鹼基對(2-5bp)以上，並超過80bp。較大之DNA片段(>100bp，範圍向上至數千個鹼基)可以合成(GeneArt)或PCR方式製備。該DNA片段可合成為具有或不具側接之NLS，或僅具有單一NLS，以及具有或不具啟動子(如T7聚合酶啟動子)。該DNA可製備為單股DNA片段，使用捕捉生物素化標靶DNA序列法(Invitrogen：Dynabeads M-270 Streptavidin)，或任一其他標準與已建立之單股DNA製備方法學。該單股DNA可製備用於IVT微注射，如上所述，以及與Cas9 mRNA與gRNA共注射之mRNA。該DNA片段亦可以雙股DNA片段形式共注射。該DNA片段可側接有DNA同源物，同源於Cas9媒介雙股DNA斷裂物或DNA缺口處。該DNA同源物範圍為數個鹼基對(2-5bp)，至多或大於數千個鹼基。該DNA片段可用於引入內生性或外源性DNA。
HDR-媒介之修復亦可於ES細胞中進行，在CRISPR/Cas-媒介之DNA切割之後。上述供應者寡核苷酸或DNA片段可與CRISPR/Cas表現載體共轉染至ES細胞中。
F：製備Cas9 mRNA與gRNA
含有T7聚合酶啟動子，其具有人源化Cas9之編碼區，之載體，係使用寡核苷酸Cas9-F與Cas9-R進行PCR倍增反應。該T7-Cas9 PCR產物可經凝膠萃取，並使用Qiagen凝 膠萃取套組進行DNA純化。經純化之T7-Cas9 DNA可用於體外轉錄作用(IVT)，使用mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra套組(Life Technologies Cat No.AM1345)。含有T7-gRNA之載體可經PCR倍增，使用寡核苷酸gRNA-F與gRNA-R，並再次進行PCR產物凝膠純化。T7-gRNA之IVT可使用MEGAshortscript T7套組(Life Technologies Cat No.AM1354)進行，gRNA使用MEGAclear套組(Life Technologies Cat No.AM1908)純化，並使用無RNase之水純化。
Cas9-F：TTAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO：19)
Cas9-R：GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC(SEQ ID NO：20)
gRNA-F：TTAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO：21)
gRNA-R：AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ ID NO：22)
範例5B：單一步驟產生基因轉殖動物 A：ES細胞轉染過程
小鼠胚胎幹細胞AB2.1與此細胞株之衍生物，係用於轉染哺乳動物密碼子最佳化之Cas9，以及來自單一表現載體或來自單獨載體之sgRNA，若希望的話。AB2.1 ES細胞可於M-15之PSNL76/7/4 MEF給料層上培養：Knockout DMEM(Gibco，無丙酮酸鹽，高葡萄糖，15% FBS，1xGPS，1xBME)，使用標準ES細胞培養技術。CRISPR/Cas表現載體之轉染與提供者寡核苷酸或DNA片段之選擇性添加，藉由電破法完成，使用Amaxa 4D-Nucleofector® Protocol(Lonza)。表現PGK-Puro之質體亦可任擇地共轉染， 以啟動轉染效率。
在一方法中，經轉染後，該ES細胞將植回給料盤，並於轉染後72小時加入嘌呤黴素(2μg/ml)7日，之後挑選殖株，並經PCR進行基因分型。陽性殖株可進一步培養，並於給料層擴張，必須之篩選標記將使用PiggyBac轉位子系統切除。此藉由電破ES細胞而進行，使用含有HyPbase之質體，並使用Amaxa 4D-Nucleofector® Protocol(Lonza)。該ES細胞將植回給料盤。ES細胞在轉染後分代2-3日，再過2-3日該ES細胞以不同細胞密度分盤(1：10、1：20、1：100與1：300)，分盤後24小時進行FIAU(2μg/ml)篩選。於篩選培養基上7-10天後，殖株經挑選，並進行PCR基因分型。陽性殖株可進一步培養，並於給料層上擴張，並以微注射法送入合子(囊胚細胞)中。
在另一方法中，轉染8小時前，ES細胞係以0.5x106細胞密度植入，使用無抗生素M-15 Knockout DMEM(Gibco,no pyruvate,high glucose,15% FBS,1xL-Glutamine,1xBME)，植入至6w給料盤上。短暫轉染係使用Lipofectamine® LTX試劑進行，以及LUSTM試劑(InvitrogenTM)，使用標準流程。在培養時間之後，轉染試劑係轉移至給料盤(培養於無抗生素培養液中)，轉染後，這些培養盤上之培養液(M-15)不更換至少24小時。ES細胞轉染後48小時，經胰蛋白酶處理為單細胞懸浮物，並進行細胞計數，細胞以不同細胞密度分盤，每10cm給料盤為100-5000個細胞。重新植入24小時後，進行2μg/ml Puro(嘌 呤黴素二氯化氫，來自黑鏈黴菌(Streptomyces albonige)粉末，P8833 Sigma)篩選細胞4天，之後該細胞再次培養於M-15中。在轉染後10-13天進行殖株挑選。
方法5C：小鼠合子之微注射-方法1 材料與試劑：
˙M2(Sigma M7167)
˙Embryo Max KSOM(特殊培養基MR-020P-F)
˙玻尿酸酶(Sigma H4272)
˙礦物油(Sigma,M-8410)
可能之提供者殖株：
˙S3F/S3F；KF3/KF3
˙S3F/S3F；K4/K4
˙S7F/S7F
˙K5F/K5F
合子之製備與微注射：
流程係描述於：A.Nagy Et al.Manipulating the Mouse Embryo 3rd Edition.Chapter 7,Protocols 7-1,7-6,7-10,7-11.Cold Spring Harbor Laboratory Press。
摘要為：
1.合子係收穫自E0.5dpc(交配後天數)過量排卵之雌性小鼠。
2.合子與玻尿酸酶一同培養以分散堆積之細胞。
3.合子經收集並轉移至數滴M2培養液中，以潤洗玻尿酸酶溶液與殘餘物。合子置於KSOM培養液中，並於37℃，5% CO2中培養至需要使用時。
4.合子品質係經評估，具正常型態之合子係經挑選出用於注射，這些合子置於KSOM培養基中，並於37℃,5% CO2培養至需要用時。
微注射設定：
注射流程係於Nikon Eclipse Ti倒立顯微鏡下進行，使用Eppendorf顯微操作器，以及Eppendorf顯微注射(femtojet injection)系統。載玻片係加入一大滴~200微升M2至中心而製備。
微注射：
置入適當數目之合子至載玻片上。檢驗合子並篩選出僅具有正常型態者(2個獨特之原核(pronuclei)清晰可見)。維持住最接近注射用微吸管之具有雄性原核之合子，小心地將注射用微吸管推進原核之透明帶中，施加注射壓力，原核可見膨脹，快速移出注射用微吸管。注射過之合子取下，同時注射其餘合子。
在注射程序結束時，所有存活之經注射合子可置於製備好之培養盤中，其含有數滴KSOM並靜置直至可手術植入。在手術植入至假懷孕雌性動物之前，將這些合子培養2-3小時。子代將於21天後出生。
方法5C：小鼠合子之微注射-方法2 材料與試劑
˙PMSG
˙hCG
˙M2(Sigma M7167)
˙胚胎Max KSOM(特殊培養基MR-020P-F)
˙礦物油(Sigma,M-8410)
˙玻尿酸酶(Sigma H 4272)
˙35mm Falcon培養皿(Fisher 08-757-100A)
˙尖銳剪刀
˙尖銳鑷子
卵之製備：
1.第0日：將PMSG(5 I.U.)I.P.注射至雌性動物中。
2.第2日：將hCG(5 I.U.)I.P.注射至雌性動物中48小時。使該雌性動物與研究用雄性動物交配。
3.第3日：檢查交配栓，以CO2窒息法犧牲具交配栓之雌小鼠或頸椎脫臼法，於0.5dpc，於8.00am。
4.解剖打開腹部，找到卵巢和脂肪墊，解剖出輸卵管，留下卵巢和脂肪，修整的子宮角至~1厘米，置入含室溫M2之35mm培養皿中。
5.一次將一個卵巢置入含有玻尿酸酶溶液之室溫M2(~0.3mg/ml)培養皿中。經由20倍或40倍放大倍率之立體顯微鏡檢視。
6.使用一對鑷子抓住輸卵管，並將其保持在培養皿底部。使用第二對鑷子或利用26g針頭撕裂靠近合子所在之輸卵管(壺腹)，釋放卵丘細胞窩。
7.合子應留在玻尿酸酶中僅幾分鐘，超過該時間合子將受損。如果有必要，將其抽吸上下數次，以幫助合子由卵丘細胞釋放。
8.用口微吸管挑起合子，並將它們轉移到M2新鮮培養皿中，之後經數滴M2轉移，沖洗掉玻尿酸酶、卵丘細胞與雜物。將合子分類，移除任何明顯不好的(片段化、畸形、未受精)，並將好的(二極體應清晰可見，以及任何具有極體者)平衡於數滴KSOM+AA中，於37℃與5% CO2下培養至需要時。每滴置入約50個卵。
原核微注射
1.微注射設定：注射流程係於Nikon Eclipse Ti倒立式顯微鏡上進行，使用Eppendorf顯微操作器。製備60mm培養皿以置入該經注射之合子。抽吸4-6次40μl之KSOM+AA滴液，滴蓋上油，並置於5% CO2培養箱中達平衡。製備凹玻片，藉由於凹陷中央滴上一大滴(~200μl)M2培養液，於玻片左方加入一小滴培養液，用於維持用微吸管。
2.微注射：確認加壓注射器開啟，並準備好使用。將適當數目之合子置於玻片上，在20-30分鐘內勿加入超過可注射之更多合子。將維持用微吸管置入玻片左方之M2滴液中；藉由毛細作用吸滿，一旦充滿至大約操作器肩部處。仔細檢驗合子，確認該二原核為肉眼可見且型態良好，丟棄外觀不正常者。檢查 注射針頭是否開啟，於同一對焦平面上將針頭接近但不觸碰合子。使用加壓系統施加壓力，若合子移動則針頭為開啟的，若非如此針頭便為關閉的。在此案例中，使用"清楚"特徵者施加壓力，若尖頭尚未開啟，人工折斷該尖頭。仔細"敲"維持用微吸管的尖頭，重複上述測試，確認尖頭不會太大，若發生此現象則替換針頭，並再次起始。將維持用微吸管的尖頭置於合子旁，並將其吸至微吸管末端，藉由施加負壓。顯微鏡對焦定位原核，合子應以此方式定位，使得合子可進行注射而不會破壞原核，較佳在透明帶與卵膜間有縫隙。將注射針頭之尖頭置於透明帶之同一對焦平面上。將注射用微吸管置於透明帶之y軸位置上，調整針頭高度，使得該尖頭呈現完全尖銳，而不改變焦距。此可確保針頭正確標靶至合子。將注射用微吸管推入透明帶中，通過細胞質朝向合子背側。針頭將通過卵膜產生"泡泡"，此需要被戳破，將觀察到彈回，於該點快速移出針頭，將觀察到細胞質流動，代表RNA由針頭流出。移出注射微吸管之後，細胞質顆粒由卵母細胞流出，為合子不久後將裂解之清楚徵兆。在此情況下，或若細胞核/細胞質成分黏至注射用微吸管上時，該卵母細胞便應在注射後丟棄。若該合子仍完整且經成功注射，將此卵歸入良好組別。挑選新的合子進行注射。可使用相同之注射微吸管，只要其持續成功 注射。若有以下情況，換成新的注射微吸管：(a)無法觀察到任何細胞質變形；(b)合子一個接一個裂解；(c)微吸管尖頭變成"髒的"，或細胞核成分黏至微吸管上。一旦所有合子經注射，將其移出並置於平衡之KSOM+AA中，並將其置於37℃培養箱中至隔日。僅移出在注射後可存活之合子，並培養至2細胞階段。留下裂解之合子，以及未發育之合子。
3.計數注射總數，並計數每位接受者轉移之數目。
結果
為了呈現單一步驟產生基因轉殖小鼠之效率，我們使用T7-Cas9核酸酶載體產生mRNA，經由上述體內轉錄方式。來自嚮導RNA之mRNA亦使用上述之體外轉錄產生。在注射mRNA混合物至細胞質之前，卵母細胞係製備自雌性小鼠，使用上述流程。含有100ng/ul Cas9核酸酶mRNA與50ng/ul引導mRNA之mRNA混合物，係微注射入細胞質中，如上所述。該微注射係於單一細胞階段完成。注射後存活之合子係培養至2細胞階段，之後轉移至接受者小鼠中。
總結之，107個合子經注射，其中49個存活，並進入2細胞階段。之後這些合子轉移至二接受者雌性小鼠體內。此產生2窩19隻子代。第1窩產生3隻雄鼠與6隻雌鼠。第2窩產生4之雄鼠與6隻雌鼠。子代於出生後3週進行剪耳並萃取DNA。PCR使用側接有gRNA之寡核苷酸進行，以偵測可能之indels(圖14)。
進行嚮導RNA之PCR倍增反應，並於瓊膠膠片上 分離出PCR產物，指出至少一小鼠含有一大indel，為刪去形式，其中其他小鼠呈現具有較小之indels，由膠片上之PCR產物尖銳度判斷。如同初始粗略分析，所有PCR產物係進行定序，並以星號標記(總共7隻小鼠，圖14)，產生混合gRNA之序列，進一步確認了其含有indels。為了確認此結果，此7隻小鼠之PCR產物與另一為產生混合序列之小鼠之PCR產物(第19行之PCR產物，圖14)，分別選殖至一般選殖用載體上。就每一選殖株而言，挑選出28個殖株並進行定序分析。定序結果確認了所有7隻小鼠皆含有indels，且未含有任何混合序列之小鼠不含有indels。定序數據摘錄於表3。
定序結果確認所有經分析的小鼠皆含有indels。亦指出使用本發明之合子注射流程，以及用於製備Cas9與嚮導RNA之mRNA，Cas9在早期工作更有效率，且直至細胞開始分裂超過2個細胞階段，所有小鼠皆經分析，不超過3種indels被辨識出。含有indels之7隻小鼠中，其中3隻不具有可偵測之WT序列。未顯示混合序列之雌性小鼠(KMKY6.1j)，其初始定序分析的確顯示不含有任何indels，因此其可驗證我們的PCR產物之初始定序結果。
顯示無WT序列之雄性小鼠(KMKY5.1c)係使用作為二雌性小鼠(KMKY5.1e & KMKY6.1e)，其顯示無WT序列之交配夥伴。該二次交配得到14隻子代，全部來自第一窩。進行類似之定序分析後，其中來自嚮導RNA區域之PCR產物經倍增，分別選殖，之後數個殖株分析indels之存 在。就每一小鼠而言，24個殖株經定序分析。所有14隻子代之定序結果確認僅有二indel序列，反映出有二對偶基因由親代雄鼠與雌鼠產生。此數據清楚顯示我們的單-步驟基因體編輯流程，在早期且不超過2細胞階段非常有效率，因此可防止複雜的嵌合indel資訊。使用我們建立的流程，我們可於合子中進行經定義之刪去，或進行經定義之刪去之後插入，以於記錄時間內加速產生基因轉殖小鼠至純合性之過程。
範例6： ES細胞中之單一複本Cas9表現
請參考圖6B。
1.具有下列特徵之PiggyBac轉位子片段組成之著陸位置，標靶至小鼠ES細胞(如129-衍生之ES細胞，如AB2.1 ES細胞；Baylor College of Medicine,Texas,USA)並以G418篩選。PiggyBac轉位子片段將含有新黴素抗性基因，側接有loxP與lox2272。亦具有geneless PGK啟動子。在此範例中，著陸位置可標靶至染色體6上之Rosa26基因之醫源(introgenic)區，但亦可標靶至別處。標靶Rosa26基因上之此著陸位置，可提供一普及之ES細胞株，可準確插入任一希望之DNA片段，包括含有Cas9、突變Cas9或任一含有此DNA片段之基因，經由具高效率之RMCE。標靶Rosa26是有幫助的，一旦標靶建構物以單一複本插入時(與別處之隨機插入不同)，不會產生不希望之表型影響。
請注意。此著陸位置可插入至任一染色體之任一基因上，或事實上至任一真核或哺乳動物細胞株中，如人類、昆蟲、植物、酵母菌、小鼠、大鼠、兔子、嚙齒類、豬、狗、貓、魚、雞或鳥類細胞株，之後產生相對應表現有Cas9之基因轉殖生物體。
Rosa 26基因座
於小鼠胚胎幹細胞中之轉殖基因之普遍表現，可藉由將基因標靶至ROSA26基因座(亦已知為：基因捕捉ROSA 26或Gt(ROSA)26)，藉由同源重組(下列參考文獻(a)與(b))而達成。小鼠C57BL/6J Rosa26基因之基因座標，發表於Ensemble release 73-September 2013為：染色體6：113,067,428-113,077,333；反向股。
Rosa26基因座亦可使用作為接受者位置，以敲入一轉殖基因。在範例中，吾人使用Rosa26基因座敲入著陸位置載體，藉由同源重組標靶至醫源(intronic)區，其位於小鼠品系129-衍生胚胎幹細胞之外顯子2與3之間，使用約3.1kb同源臂。該同源臂藉由重組改造由小鼠品系129產生之BAC殖株而回收。用於標靶之Rosa26同源臂序列係提供如下。
Rosa26之5’同源臂序列
(SEQ ID NO：23)
Rosa26之3’同源臂序列
(SEQ ID NO：24)
參考文獻：
a) Pablo Perez-Pinera, David G. Ousterout, Matthew T. Brown and Charles A. Gersbach (2012) Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases. Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 8 3741-3752
b) Peter Hohenstein, Joan Slight, Derya Deniz Ozdemir, Sally F Burn, Rachel Berry and Nicholas D Hastie (2008) High-efficiency Rosa26 knock-in vector construction for Cre-regulated overexpression and RNAi. PathoGenetics 2008, 1:3
2.重組酶媒介之片匣交換(RMCE)-能力載體，其含有一無啟動子嘌呤黴素-delta-tk，具有C-端T2A之框內融合，之後接著Cas9或突變Cas9核苷酸序列，以及一系列之獨特限制酶位置，側接有loxP與lox2272，可允許此載體直接標靶至著陸位置，藉由Cre-媒介之RMCE。如同一般所知，T2A在轉譯期間可允許核糖體跳躍。T2A之編碼序列插入二基因間，會導致二種產物(一基因，一轉錄物，但表現二種蛋白質，在此案例中為Cas9與篩選標記物)。含有正確插入之DNA片段之ES殖株，可直接以嘌呤黴素篩選。此方法亦可較佳地確保Cas9之單一複本表現，假設為隨機插入或暫時表現法。RMCE之插入可使載體進入希望之基因座，其含有著陸位置，可直接選用作為著陸位置中之PGK啟動子，驅動無啟動子Puro-Delta-Tk與Cas9之轉錄。由於Puro-delta-Tk位於與Cas9相同之轉錄單元上，經嘌呤黴素挑選之ES殖株可確保Cas9之表現。
3.上述策略允許三種單獨方法表現sgRNA，其設計用於破壞(經由indel形成、刪去或刪去後插入而突變)有興趣之基因。
a.上述含有Cas9之ES細胞株可用於基因產生轉殖小鼠，不論是組成性表現Cas9或經修飾以誘發Cas9表現或組織特異性Cas9表現，例如於胚胎階段使用 Nanog-、Pou5f1-或SoxB啟動子-特異性Cas9表現而表現Cas9。此表現有Cas9之衍生小鼠株可用於以流暢方式進行基因體編輯，其中體外轉錄之sgRNA可容易地注射入由此轉殖小鼠得到之胚胎中。此可強化產生具有希望之同型合子基因型之小鼠株之效率，因此大幅降低需要之動物數目。
b.sgRNA可直接轉染至表現有Cas9之ES細胞中，因此可避免選殖至RMCE能力載體之單一或多重sgRNA之需求。此方法可允許多重sgRNA同時非常快速地插入至ES細胞中。
c.多重sgRNA可直接選殖至RMCE能力載體之多重選殖位置上(意即使用複數個不同之限制性核酸內切酶位置)，以允許嚮導-RNA之單一複本表現。此方法可用於限制偏離標靶效應，特別是相關於在基因體內具有高序列同源性之基因。
4.表現Cas9與sgRNA之ES細胞，可直接於含有嘌呤黴素之培養基上篩選。以嘌呤黴素篩選4-6天可允許希望之位置突變或破壞，且操作各單獨殖株之ES細胞之優點為可經PCR分析，之後定序希望之突變。只有經正確突變之ES細胞株可經加工，之後引入插入DNA因子，經由插入至著陸位置，之後RMCE載體之插入可完全移除，使ES細胞缺乏改變，而非預定由Cas9與sgRNA所誘發之突變。此可經由短暫表現PBase轉位子，之後經FIAU篩選而達成。移除組成性表現之Cas9，其僅具有在sgRNA存在下，誘發 突變所需之最小長度，可降低或消除Cas9誘發不希望突變之機率。
5.含有希望突變之ES殖株可注射入囊胚細胞，以產生基因轉殖小鼠。
表1：各CRISPR類型之重複與引導序列中之PAM保留(再製於Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system F.J.M.Mojica,C.Díez-Villaseñor,J.García-Martínez,C.Almendros Microbiology(2009),155,733-740)
表1中之各序列SEQ ID NOs如下表設定。
表2：CRISPR-相關核酸內切酶
[基因ID編號係指NCBI基因資料庫中之基因，於2013年9月；所有序列資訊相關於下列基因ID之資訊皆於此併入作為參考資料，因應本發明可能之需要]
1.Plav_0099
CRISPR-相關核酸內切酶Csn1家族蛋白質[食清潔劑細小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)DS-1]
其他別名：Plav_0099
基因環境：染色體
註解：NC_009719.1(105795..108908，互補)
ID：5454634
SEQ ID NO：62
2.FTN_0757
膜蛋白[新兒手法蘭西斯氏菌(Francisella novicida)U112]
其他別名：FTN_0757
基因環境：染色體
註解：NC_008601.1(810052..814941)
ID：4548251
SEQ ID NO：63
3.Cj1523c
CRISPR-相關蛋白質[彎曲桿菌空腸亞種(Campylobacter jejuni subsp.Jejuni)NCTC 11168=ATCC 700819]
其他別名：Cj1523c
基因環境：染色體
註解：NC_002163.1(1456880..1459834，互補)
ID：905809
SEQ ID NO：64
4.mcrA
限制性核酸內切酶[長雙叉乳酸桿菌(Bifidobacterium longum)DJO10A]
其他別名：BLD_1902
基因環境：染色體
註解：NC_010816.1(2257993..2261556)
ID：6362834
SEQ ID NO：65
5.MGA_0519
Csn1家族CRISPR-相關蛋白質[雞敗血黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)str.R(低)]
其他別名：MGA_0519
基因環境：染色體
註解：NC_004829.2(919248..923060)
ID：1089911
SEQ ID NO：66
6.Emin_0243
CRISPR-相關核酸內切酶Csn1家族蛋白質[Elusimicrobium minutum Pei191]
其他別名：Emin_0243
基因環境：染色體
註解：NC_010644.1(261119..264706)
ID：6263045
SEQ ID NO：67
7.FTW_1427
CRISPR-相關大型蛋白質[土倫病法蘭西斯氏菌(Francisella tularensis subsp.tularensis)WY96-3418]
其他別名：FTW_1427
基因環境：染色體
註解：NC_009257.1(1332426..1335803，互補)
ID：4958852
SEQ ID NO：68
8.SMA_1444
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[馬其頓鏈球菌(Streptococcus macedonicus)ACA-DC 198]
其他別名：SMA_1444
註解：NC_016749.1(1418337..1421729，互補)
ID：11601419
SEQ ID NO：69
9.SSUST3_1318
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[豬鏈球菌(Streptococcus suis)ST3]
其他別名：SSUST3_1318
基因環境：染色體
註解：NC_015433.1(1323872..1327240，互補)
ID：10491484
SEQ ID NO：70
10.cas5
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[沒食子酸鏈球菌(Streptococcus gallolyticus)UCN34]
其他別名：GALLO_1439
基因環境：染色體
註解：NC_013798.1(1511433..1514825，互補)
ID：8776949
SEQ ID NO：71
11.GALLO_1446
CRISPR-相關蛋白質[沒食子酸鏈球菌(Streptococcus gallolyticus)UCN34]
其他別名：GALLO_1446
基因環境：染色體
註解：NC_013798.1(1518984..1523110，互補)
ID：8776185
SEQ ID NO：72
12.csn1
CRISPR-相關核酸內切酶Csn1[齒雙歧桿菌(Bifidobacterium dentium)Bd1]
其他別名：BDP_1254
基因環境：染色體
註解：NC_013714.1(1400576..1403992，互補)
ID：8692053
SEQ ID NO：73
13.NMO_0348
假設CRISPR-相關蛋白質[腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)alpha14]
其他別名：NMO_0348
基因環境：染色體
註解：NC_013016.1(369547..372795，互補)
ID：8221228
SEQ ID NO：74
14.csn1
CRISPR-相關蛋白質Csn1[馬鏈球菌獸瘟亞種(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)MGCS10565]
其他別名：Sez_1330
基因環境：染色體
註解：NC_011134.1(1369339..1373385，互補)
ID：6762114
SEQ ID NO：75
15.csn1
CRISPR-相關核酸內切酶Csn1家族蛋白質[格登鏈球菌(Streptococcus gordonii str.Challis substr.)CH1]
其他別名：SGO_1381
基因環境：染色體
註解：NC_009785.1(1426750..1430160，互補)
ID：5599802
SEQ ID NO：76
16.M28_Spy0748
細胞質蛋白質[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS6180]
其他別名：M28_Spy0748
基因環境：染色體
註解：NC_007296.1(771231..775337)
ID：3573516
SEQ ID NO：77
17.SGGBAA2069_c14690
CRISPR-相關蛋白質[鳥禽類鏈球菌屬(Streptococcus gallolyticus subsp.Gallolyticus)ATCC BAA-2069]
其他別名：SGGBAA2069_c14690
基因環境：染色體
註解：NC_015215.1(1520905..1525017，互補)
ID：10295470
SEQ ID NO：78
18.SAR116_2544
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[Candidatus Puniceispirillum marinum IMCC1322]
其他別名：SAR116_2544
基因環境：染色體
註解：NC_014010.1(2748992..2752099)
ID：8962895
SEQ ID NO：79
19.TDE0327
CRISPR-相關Cas5e[牙密螺旋體(Treponema denticola)ATCC 35405]
其他別名：TDE0327
基因環境：染色體
註解：NC_002967.9(361021..365208)
ID：2741543
SEQ ID NO：80
20.csn1
CRISPR-相關蛋白質[巴斯德鏈球菌(Streptococcus pasteurianus)ATCC 43144]
其他別名：SGPB_1342
基因環境：染色體
註解：NC_015600.1(1400035..1403427，互補)
ID：10753339
SEQ ID NO：81
21.cas9
CRISPR-相關蛋白質[潰瘍棒桿菌(Corynebacterium ulcerans)BR-AD22]
其他別名：CULC22_00031
基因環境：染色體
註解：NC_015683.1(30419..33112，互補)
ID：10842578
SEQ ID NO：82
22.MGAS2096_Spy0843
假設細胞質蛋白質[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS2096]
其他別名：MGAS2096_Spy0843
基因環境：染色體
註解：NC_008023.1(813084..817190)
ID：4066021
SEQ ID NO：83
23.MGAS9429_Spy0885
細胞質蛋白質[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS9429]
其他別名：MGAS9429_Spy0885
基因環境：染色體
註解：NC_008021.1(852508..856614)
ID：4061575
SEQ ID NO：84
24.AZL_009000
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[固氮螺菌屬(Azospirillum sp.)B510]
其他別名：AZL_009000
基因環境：染色體
註解：NC_013854.1(1019522..1023028，互補)
ID：8789261
SEQ ID NO：85
25.EUBREC_1713
含有RuvC-類似核酸酶與HNH-核酸酶區塊[直腸真桿菌(Eubacterium rectale)ATCC 33656]
其他別名：EUBREC_1713
其他名稱：CRISPR-系統相關蛋白質
基因環境：染色體
註解：NC_012781.1(1591112..1594456)
ID：7963668
SEQ ID NO：86
26.Alide2_0194
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[厚壁菌(Alicycliphilus denitrificans)K601]
其他別名：Alide2_0194
基因環境：染色體
註解：NC_015422.1(218107..221196)
ID：10481210
SEQ ID NO：87
27.Alide_0205
crispr-相關蛋白質，csn1家族[厚壁菌(Alicycliphilus denitrificans)BC]
其他別名：Alide_0205
基因環境：染色體
註解：NC_014910.1(228371..231460)
ID：10102228
SEQ ID NO：88
28.STER_1477
CRISPR-系統-類似蛋白質[嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)LMD-9]
其他別名：STER_1477
基因環境：染色體
註解：NC_008532.1(1379975..1384141，互補)
ID：4437923
SEQ ID NO：89
29.STER_0709
CRISPR-系統-類似蛋白質[嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)LMD-9]
其他別名：STER_0709
基因環境：染色體
註解：NC_008532.1(643235..646600)
ID：4437391
SEQ ID NO：90
30.cas9
CRISPR-相關蛋白質[白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)241]
其他別名：CD241_2102
基因環境：染色體
註解：NC_016782.1(2245769..2248399)
ID：11674395
SEQ ID NO：91
31.cas3
CRISPR-相關核酸內切酶[白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)241]
其他別名：CD241_0034
基因環境：染色體
註解：NC_016782.1(35063..38317)
ID：11672999
SEQ ID NO：92
32.Corgl_1738
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[球團科里氏桿菌(Coriobacterium glomerans)PW2]
其他別名：Corgl_1738
基因環境：染色體
註解：NC_015389.1(2036091..2040245)
ID：10439994
SEQ ID NO：93
33.Fluta_3147
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[Fluviicola taffensis DSM 16823]
其他別名：Fluta_3147
基因環境：染色體
註解：NC_015321.1(3610221..3614597，互補)
ID：10398516
SEQ ID NO：94
34.Acav_0267
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[西瓜果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.Avenae)ATCC 19860]
其他別名：Acav_0267
基因環境：染色體
註解：NC_015138.1(295839..298976)
ID：10305168
SEQ ID NO：95
35.NAL212_2952
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[亞硝化單胞菌(Nitrosomonas sp.)AL212]
其他別名：NAL212_2952
基因環境：染色體
註解：NC_015222.1(2941806..2944940，互補)
ID：10299493
SEQ ID NO：96
36.SpiBuddy_2181
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[Sphaerochaeta globosa str.Buddy]
其他別名：SpiBuddy_2181
基因環境：染色體
註解：NC_015152.1(2367952..2371491，互補)
ID：10292274
SEQ ID NO：97
37.Tmz1t_2411
HNH核酸內切酶[陶厄氏菌(Thauera sp.)MZ1T]
其他別名：Tmz1t_2411
基因環境：質體pTha01
註解：NC_011667.1(75253..76200，互補)
ID：7094333
SEQ ID NO：98
38.Gdia_0342
Csn1家族CRISPR-相關蛋白質[重氮營養葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)PA15]
其他別名：Gdia_0342
基因環境：染色體
註解：NC_011365.1(382737..385748)
ID：6973736
SEQ ID NO：99
39.JJD26997_1875
CRISPR-相關Cas5e家族蛋白質[彎曲桿菌(Campylobacter jejuni subsp.doylei)269.97]
其他別名：JJD26997_1875
基因環境：染色體
註解：NC_009707.1(1656109..1659063，互補)
ID：5389688
SEQ ID NO：100
40.Asuc_0376
CRISPR-相關核酸內切酶Csn1家族蛋白質[產琥珀酸放線桿菌(actinobacillus succinogenes)130Z]
其他別名：Asuc_0376
基因環境：染色體
註解：NC_009655.1(431928..435116)
ID：5348478
SEQ ID NO：101
41.Veis_1230
CRISPR-相關核酸內切酶Csn1家族蛋白質[Verminephrobacter eiseniae EF01-2]
其他別名：Veis_1230
基因環境：染色體
註解：NC_008786.1(1365979..1369185)
ID：4695198
SEQ ID NO：102
42.MGAS10270_Spy0886
假設細胞質蛋白質[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS10270]
其他別名：MGAS10270_Spy0886
基因環境：染色體
註解：NC_008022.1(844446..848552)
ID：4063984
SEQ ID NO：103
43.gbs0911
假設蛋白質[無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)NEM316]
其他別名：gbs0911
基因環境：染色體
註解：NC_004368.1(945801..949946)
ID：1029893
SEQ ID NO：104
44.NMA0631
假設蛋白質[腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)Z2491]
其他別名：NMA0631
基因環境：染色體
註解：NC_003116.1(610868..614116，互補)
ID：906626
SEQ ID NO：105
45.Ccan_14650
假設蛋白質[二氧化碳嗜纖維菌(Capnocytophaga canimorsus)Cc5]
其他別名：Ccan_14650
基因環境：染色體
註解：NC_015846.1(1579873..1584165，互補)
ID：10980451
SEQ ID NO：106
46.lpp0160
假設蛋白質[嗜肺性退伍軍人桿菌(Legionella pneumophila str.Paris)]
其他別名：lpp0160
基因環境：染色體
註解：NC_006368.1(183831..187949)
ID：3118625
SEQ ID NO：107
47.Cbei_2080
假設蛋白質[拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB 8052]
其他別名：Cbei_2080
基因環境：染色體
註解：NC_009617.1(2422056..2423096)
ID：5296367
SEQ ID NO：108
48.MMOB0330
假設蛋白質[移動黴漿菌(Mycoplasma mobile)163K]
其他別名：MMOB0330
基因環境：染色體
註解：NC_006908.1(45652..49362，互補)
ID：2807677
SEQ ID NO：109
49.MGF_5203
Csn1家族CRISPR-相關蛋白質[雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum str.F)]
其他別名：MGF_5203
基因環境：染色體
註解：NC_017503.1(888602..892411)
ID：12397088
SEQ ID NO：110
50.MGAH_0519
Csn1家族CRISPR-相關蛋白質[雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum str.R(high))]
其他別名：MGAH_0519
基因環境：染色體
註解：NC_017502.1(918476..922288)
ID：12395725
SEQ ID NO：111
51.Smon_1063
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis DSM 12112)]
其他別名：Smon_1063
基因環境：染色體
註解：NC_013515.1(1159048..1162827，互補)
ID：8600791
SEQ ID NO：112
52.Spy49_0823
假設蛋白質[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)NZ131]
其他別名：Spy49_0823
基因環境：染色體
註解：NC_011375.1(821210..825316)
ID：6985827
SEQ ID NO：113
53.C8J_1425
假設蛋白質[空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni subsp.Jejuni)81116]
其他別名：C8J_1425
基因環境：染色體
註解：NC_009839.1(1442672..1445626，互補)
ID：5618449
SEQ ID NO：114
54.FTF0584
假設蛋白質[土倫病法蘭西斯氏菌(Francisella tularensis subsp.Tularensis)FSC198]
其他別名：FTF0584
基因環境：染色體
註解：NC_008245.1(601115..604486)
ID：4200457
SEQ ID NO：115
55.FTT_0584
假設蛋白質[土倫病法蘭西斯氏菌(Francisella tularensis subsp.Tularensis)SCHU S4]
其他別名：FTT_0584
基因環境：染色體
註解：NC_006570.2(601162..604533)
ID：3191177
SEQ ID NO：116
56.csn1
CRISPR-相關蛋白質[停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis)RE378]
其他別名：GGS_1116
註解：NC_018712.1(1169559..1173674，互補)
ID：13799322
SEQ ID NO：117
57.SMUGS5_06270
CRISPR-相關蛋白質csn1[轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)GS-5]
其他別名：SMUGS5_06270
基因環境：染色體
註解：NC_018089.1(1320641..1324678，互補)
ID：13299050
SEQ ID NO：118
58.Y1U_C1412
Csn1[嗜熱鏈球菌屬(Streptococcus thermophilus)MN-ZLW-002]
其他別名：Y1U_C1412
基因環境：染色體
註解：NC_017927.1(1376653..1380819，互補)
ID：12977193
SEQ ID NO：119
59.Y1U_C0633
CRISPR-系統-類似蛋白質[嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)MN-ZLW-002]
其他別名：Y1U_C0633
基因環境：染色體
註解：NC_017927.1(624274..627639)
ID：12975630
SEQ ID NO：120
60.SALIVA_0715
CRISPR-相關核酸內切酶，Csn1家族[唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)JIM8777]
其他別名：SALIVA_0715
註解：NC_017595.1(708034..711417)
ID：12910728
SEQ ID NO：121
61.csn1
CRISPR-相關蛋白質csn1[轉糖鏈球菌屬(Streptococcus mutans)LJ23]
其他別名：SMULJ23_0701
註解：NC_017768.1(751695..755732)
ID：12898085
SEQ ID NO：122
62.RIA_1455
CRISPR-相關蛋白質，SAG0894[疫理莫氏桿菌(Riemerella anatipestifer)RA-GD]
其他別名：RIA_1455
基因環境：染色體
註解：NC_017569.1(1443996..1448198)
ID：12613647
SEQ ID NO：123
63.STND_0658
CRISPR-相關核酸內切酶，Csn1家族[嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)ND03]
其他別名：STND_0658
基因環境：染色體
註解：NC_017563.1(633621..636986)
ID：12590813
SEQ ID NO：124
64.RA0C_1034
假定BCR[鴨疫黎氏桿菌(Riemerella anatipestifer)ATCC 11845=DSM 15868]
其他別名：RA0C_1034
基因環境：染色體
註解：NC_017045.1(1023494..1026931，互補)
ID：11996006
SEQ ID NO：125
65.Sinf_1255
CRISPR-相關蛋白質，SAG0894家族[嬰兒鏈球菌(Streptococcus infantarius subsp.Infantarius)CJ18]
其他別名：Sinf_1255
基因環境：染色體
註解：NC_016826.1(1276484..1280611，互補)
ID：11877786
SEQ ID NO：126
66.Nitsa_1472
CRISPR-相關蛋白質，csn1家族[Nitratifractor salsuginis DSM 16511]
其他別名：Nitsa_1472
基因環境：染色體
註解：NC_014935.1(1477331..1480729)
ID：10148263
SEQ ID NO：127
67.NLA_17660
假設蛋白質[乳糖奈瑟氏球菌(Neisseria lactamica)020-06]
其他別名：NLA_17660
基因環境：染色體
註解：NC_014752.1(1890078..1893326)
ID：10006697
SEQ ID NO：128
68.SmuNN2025_0694
假設蛋白質[轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)NN2025]
其他別名：SmuNN2025_0694
基因環境：染色體
註解：NC_013928.1(737258..741295)
ID：8834629
SEQ ID NO：129
69.SDEG_1231
假設蛋白質[停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae subsp.Equisimilis)GGS_124]
其他別名：SDEG_1231
染色體：1
註解：染色體1NC_012891.1(1176755..1180870，互補)
ID：8111553
SEQ ID NO：130
70.NMCC_0397
假設蛋白質[腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)053442]
其他別名：NMCC_0397
基因環境：染色體
註解：NC_010120.1(402733..405981，互補)
ID：5796426
SEQ ID NO：131
71.SAK_1017
假設蛋白質[無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)A909]
其他別名：SAK_1
基因環境：染色體
註解：NC_007432.1(980303..984415)
ID：3686185
SEQ ID NO：132
72.M5005_Spy_0769
假設蛋白質[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS5005]
其他別名：M5005_Spy_0769
基因環境：染色體
註解：NC_007297.1(773340..777446)
ID：3572134
SEQ ID NO：133
73.MS53_0582
假設蛋白質[滑膜黴漿菌(Mycoplasma synoviae)53]
其他別名：MS53_0582
基因環境：染色體
註解：NC_007294.1(684155..688099)
ID：3564051
SEQ ID NO：134
74.DIP0036
假設蛋白質[白喉桿菌(Corynebacterium diphtheria)NCTC 13129]
其他別名：DIP0036
基因環境：染色體
註解：NC_002935.2(34478..37732)
ID：2650188
SEQ ID NO：135
75.WS1613
假設蛋白質[產琥珀酸沃氏菌(Wolinella succinogenes)DSM 1740]
其他別名：WS1613
基因環境：染色體
註解：NC_005090.1(1525628..1529857)
ID：2553552
SEQ ID NO：136
76.PM1127
假設蛋白質[多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida subsp.multocida str.)Pm70]
其他別名：PM1127
基因環境：染色體
註解：NC_002663.1(1324015..1327185，互補)
ID：1244474
SEQ ID NO：137
77.SPs1176
假設蛋白質[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)SSI-1]
其他別名：SPs1176
基因環境：染色體
註解：NC_004606.1(1149610..1153716，互補)
ID：1065374
SEQ ID NO：138
78.SMU_1405c
假設蛋白質[轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)UA159]
其他別名：SMU_1405c，SMU.1405c
基因環境：染色體
註解：NC_004350.2(1330942..1334979，互補)
ID：1028661
SEQ ID NO：139
79.lin2744
假設蛋白質[無毒李斯特菌(Listeria innocua)Clip11262]
其他別名：lin2744
基因環境：染色體
註解：NC_003212.1(2770707..2774711，互補)
ID：1131597
SEQ ID NO：140
80.csn1B
CRISPR-相關蛋白質[鳥禽類鏈球菌(Streptococcus gallolyticus subsp.gallolyticus)ATCC 43143]
其他別名：SGGB_1441
註解：NC_017576.1(1489111..1493226，互補)
ID：12630646
SEQ ID NO：141
81.csn1A
CRISPR-相關蛋白質[鳥禽類鏈球菌(Streptococcus gallolyticus subsp.gallolyticus)ATCC 43143]
其他別名：SGGB_1431
註解：NC_017576.1(1480439..1483831，互補)
ID：12630636
SEQ ID NO：142
82.cas9
CRISPR-相關蛋白質[潰瘍棒桿菌(Corynebacterium ulcerans)809]
其他別名：CULC809_00033
基因環境：染色體
註解：NC_017317.1(30370..33063，互補)
ID：12286148
SEQ ID NO：143
83.GDI_2123
假設蛋白質[葡糖酸醋酸桿菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)PAl 5]
其他別名：GDI_2123
基因環境：染色體
註解：NC_010125.1(2177083..2180235)
ID：5792482
SEQ ID NO：144
84.Nham_4054
假設蛋白質[硝化菌(Nitrobacter hamburgensis)X14]
其他別名：Nham_4054
基因環境：質體1
註解：NC_007959.1(13284..16784，互補)
ID：4025380
SEQ ID NO：145
85.str0657
假設蛋白質[嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophiles)CNRZ1066]
其他別名：str0657
基因環境：染色體
註解：NC_006449.1(619189..622575)
ID：3165636
SEQ ID NO：146
86.stu0657
假設蛋白質[嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophiles)LMG 18311]
其他別名：stu0657
基因環境：染色體
註解：NC_006448.1(624007..627375)
ID：3165000
SEQ ID NO：147
87.SpyM3_0677
假設蛋白質[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS315]
其他別名：SpyM3_0677
基因環境：染色體
註解：NC_004070.1(743040..747146)
ID：1008991
SEQ ID NO：148
88.HFMG06CAA_5227
Csn1家族CRISPR-相關蛋白質[雞敗血黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)CA06_2006.052-5-2P]
其他別名：HFMG06CAA_5227
基因環境：染色體
註解：NC_018412.1(895338..899147)
ID：13464859
SEQ ID NO：149
89.HFMG01WIA_5025
Csn1家族CRISPR-相關蛋白質[雞敗血黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)WI01_2001.043-13-2P]
其他別名：HFMG01WIA_5025
基因環境：染色體
註解：NC_018410.1(857648..861457)
ID：13463863
SEQ ID NO：150
90.HFMG01NYA_5169
Csn1家族CRISPR-相關蛋白質[雞敗血黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)NY01_2001.047-5-1P]
其他別名：HFMG01NYA_5169
基因環境：染色體
註解：NC_018409.1(883511..887185)
ID：13462600
SEQ ID NO：151
91.HFMG96NC SEQ ID NO：127
A_5295
Csn1家族CRISPR-相關蛋白質[雞敗血黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)NC96_1596-4-2P]
其他別名：HFMG96NCA_5295
基因環境：染色體
註解：NC_018408.1(904664..908473)
ID：13462279
SEQ ID NO：152
92.HFMG95NCA_5107
Csn1家族CRISPR-相關蛋白質[雞敗血黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)NC95_13295-2-2P]
其他別名：HFMG95NCA_5107
基因環境：染色體
註解：NC_018407.1(871783..875592)
ID：13461469
SEQ ID NO：153
93.MGAS10750_Spy0921
假設蛋白質[化膿性鏈球菌屬(Streptococcus pyogenes)MGAS10750]
其他別名：MGAS10750_Spy0921
基因環境：染色體
註解：NC_008024.1(875719..879834)
ID：4066656
SEQ ID NO：154
94.XAC3262
假設蛋白質[斑點病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)str.306]
其他別名：XAC3262
基因環境：染色體
註解：NC_003919.1(3842310..3842765)
ID：1157333
SEQ ID NO：155
95.SSUST1_1305
CRISPR-系統-like蛋白質[豬鏈球菌(Streptococcus suis)ST1]
其他別名：SSUST1_1305
基因環境：染色體
註解：NC_017950.1(1293105..1297250，互補)
ID：13017849
SEQ ID NO：156
96.SSUD9_1467
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[豬鏈球菌(Streptococcus suis)D9]
其他別名：SSUD9_1467
基因環境：染色體
註解：NC_017620.1(1456318..1459686，互補)
ID：12718289
SEQ ID NO：157
97.BBta_3952
假設蛋白質[短根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)BTAi1]
其他別名：BBta_3952
基因環境：染色體
註解：NC_009485.1(4149455..4152649，互補)
ID：5151538
SEQ ID NO：158
98.CIY_03670
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)16/4]
其他別名：CIY_03670
註解：NC_021031.1(309663..311960，互補)
ID：15213189
SEQ ID NO：159
99.A11Q_912
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[蛭弧菌(Bdellovibrio exovorus)JSS]
其他別名：A11Q_912
基因環境：染色體
註解：NC_020813.1(904781..907864，互補)
ID：14861475
SEQ ID NO：160
100.MCYN0850
Csn1家族CRISPR-相關蛋白質[犬黴漿菌(Mycoplasma cynos)C142]
其他別名：MCYN_0850
註解：NC_019949.1(951497..955216，互補)
ID：14356531
SEQ ID NO：161
101.SaSA20_0769
CRISPR-相關蛋白質[無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)SA20-06]
其他別名：SaSA20_0769
基因環境：染色體
註解：NC_019048.1(803597..807709)
ID：13908026
SEQ ID NO：162
102.csn1
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)A20]
其他別名：A20_0810
基因環境：染色體
註解：NC_018936.1(772038..776144)
ID：13864445
SEQ ID NO：163
103.P700755_000291
CRISPR-相關蛋白質Cas9/Csn1，亞型II[扭曲冷彎曲菌(Psychroflexus torquis)ATCC 700755]
其他別名：P700755_000291
基因環境：染色體
註解：NC_018721.1(312899..317428)
ID：13804571
SEQ ID NO：164
104.A911_07335
CRISPR-相關蛋白質[空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni subsp.jejuni)PT14]
其他別名：A911_07335
基因環境：染色體
註解：NC_018709.2(1450217..1453180，互補)
ID：13791138
SEQ ID NO：165
105.ASU2_02495
CRISPR-相關核酸內切酶Csn1家族蛋白質[豬放線桿菌(actinobacillus suis)H91-0380]
其他別名：ASU2_02495
基因環境：染色體
註解：NC_018690.1(552318..555482)
ID：13751600
SEQ ID NO：166
106.csn1
CRISPR-相關蛋白質[單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)SLCC2540]
其他別名：LMOSLCC2540_2635
註解：NC_018586.1(2700744..2704748，互補)
ID：13647248
SEQ ID NO：167
107.csn1
CRISPR-相關蛋白質[單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)SLCC5850]
其他別名：LMOSLCC5850_2605
註解：NC_018592.1(2646023..2650027，互補)
ID：13626042
SEQ ID NO：168
108.csn1
CRISPR-相關蛋白質[單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes serotype 7)str.SLCC2482]
其他別名：LMOSLCC2482_2606
註解：NC_018591.1(2665393..2669397，互補)
ID：13605045
SEQ ID NO：169
109.csn1
CRISPR-相關蛋白質[單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)SLCC2755]
其他別名：LMOSLCC2755_2607
註解：NC_018587.1(2694850..2698854，互補)
ID：13599053
SEQ ID NO：170
110.BN148_1523c
CRISPR-相關蛋白質[空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni subsp.jejuni)NCTC 11168-BN148]
其他別名：BN148_1523c
註解：NC_018521.1(1456880..1459834，互補)
ID：13530688
SEQ ID NO：171
111.Belba_3201
CRISPR-相關蛋白質Cas9/Csn1，亞型II/NMEMI[Belliella baltica DSM 15883]
其他別名：Belba_3201
基因環境：染色體
註解：NC_018010.1(3445311..3449369，互補)
ID：13056967
SEQ ID NO：172
112.FN3523_1121
膜蛋白質[法蘭西斯氏菌(Francisella cf.novicida)3523]
其他別名：FN3523_1121
基因環境：染色體
註解：NC_017449.1(1129528..1134468，互補)
ID：12924881
SEQ ID NO：173
113.cas9
CRISPR-相關蛋白質Cas9/Csn1，亞型II/NMEMI[中間普氏菌(Prevotella intermedia)17]
其他別名：PIN17_A0201
染色體：II
註解：染色體IINC_017861.1(240722..244864)
ID：12849954
SEQ ID NO：174
114.csn1
CRISPR-相關蛋白質，Csn1家族[嗜熱鏈球菌屬(Streptococcus thermophilus)JIM 8232]
其他別名：STH8232_0853
註解：NC_017581.1(706443..709808)
ID：12637306
SEQ ID NO：175
115.LMOG_01918
CRISPR-相關蛋白質[單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)J0161]
其他別名：LMOG_01918
基因環境：染色體
註解：NC_017545.1(2735374..2739378，互補)
ID：12557915
SEQ ID NO：176
116.LMRG_02138
CRISPR-相關蛋白質[單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)10403S]
其他別名：LMRG_02138
基因環境：染色體
註解：NC_017544.1(2641981..2645985，互補)
ID：12554876
SEQ ID NO：177
117.CJSA_1443
putative CRISPR-相關蛋白質[Campylobacter jejuni subsp.jejuni IA3902]
其他別名：CJSA_1443
基因環境：染色體
註解：NC_017279.1(1454273..1457227，互補)
ID：12250720
SEQ ID NO：178
118.csn1
CRISPR-相關蛋白質Csn1[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS1882]
其他別名：MGAS1882_0792
基因環境：染色體
註解：NC_017053.1(775696..779799)
ID：12014080
SEQ ID NO：179
119.csn1
CRISPR-相關蛋白質Csn1[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)MGAS15252]
其他別名：MGAS15252_0796
基因環境：染色體
註解：NC_017040.1(778271..782374)
ID：11991096
SEQ ID NO：180
120.cas3
CRISPR-相關核酸內切酶[白喉桿菌(Corynebacterium diphtheria)HC02]
其他別名：CDHC02_0036
基因環境：染色體
註解：NC_016802.1(37125..40379)
ID：11739116
SEQ ID NO：181
121.cas3
CRISPR-相關核酸內切酶[白喉桿菌(Corynebacterium diphtheria)C7(beta)]
其他別名：CDC7B_0035
基因環境：染色體
註解：NC_016801.1(36309..39563)
ID：11737358
SEQ ID NO：182
122.cas3
CRISPR-相關核酸內切酶[白喉桿菌(Corynebacterium diphtheria)BH8]
其他別名：CDBH8_0038
基因環境：染色體
註解：NC_016800.1(37261..40515)
ID：11735325
SEQ ID NO：183
123.cas3
CRISPR-相關核酸內切酶[白喉桿菌(Corynebacterium diphtheria)31A]
其他別名：CD31A_0036
基因環境：染色體
註解：NC_016799.1(34597..37851)
ID：11731168
SEQ ID NO：184
124.cas3
CRISPR-相關核酸內切酶[白喉桿菌(Corynebacterium diphtheria)VA01]
其他別名：CDVA01_0033
基因環境：染色體
註解：NC_016790.1(34795..38049)
ID：11717708
SEQ ID NO：185
125.cas3
CRISPR-相關核酸內切酶[白喉桿菌(Corynebacterium diphtheria)HC01]
其他別名：CDHC01_0034
基因環境：染色體
註解：NC_016786.1(35060..38314)
ID：11708318
SEQ ID NO：186
126.cas9
CRISPR-相關蛋白質[白喉桿菌(Corynebacterium diphtheria)HC01]
其他別名：CDHC01_2103
基因環境：染色體
註解：NC_016786.1(2246368..2248998)
ID：11708126
SEQ ID NO：187
127.PARA_18570
假設蛋白質[副流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae)T3T1]
其他別名：PARA_18570
基因環境：染色體
註解：NC_015964.1(1913335..1916493)
ID：11115627
SEQ ID NO：188
128.HDN1F_34120
假設蛋白質[迦瑪變形菌(gamma proteobacterium)HdN1]
其他別名：HDN1F_34120
基因環境：染色體
註解：NC_014366.1(4143336..4146413，互補)
ID：9702142
SEQ ID NO：189
129.SPy_1046
假設蛋白質[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)M1 GAS]
其他別名：SPy_1046
基因環境：染色體
註解：NC_002737.1(854757..858863)
ID：901176
SEQ ID NO：190
130.GBS222_0765
假設蛋白質[無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)]
其他別名：GBS222_0765
註解：NC_021195.1(810875..814987)
ID：15484689
SEQ ID NO：191
131.NE061598_03330
假設蛋白質[土倫病法蘭西斯氏菌(Francisella tularensis subsp.Tularensis)NE061598]
其他別名：NE061598_03330
基因環境：染色體
註解：NC_017453.1(601219..604590)
ID：12437259
SEQ ID NO：192
132.NMV_1993
假設蛋白質[腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)8013]
其他別名：NMV_1993
註解：NC_017501.1(1917073..1920321)
ID：12393700
SEQ ID NO：193
133.csn1
假設蛋白質[空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni subsp.jejuni)M1]
其他別名：CJM1_1467
基因環境：染色體
註解：NC_017280.1(1433667..1436252，互補)
ID：12249021
SEQ ID NO：194
134.FTU_0629
假設蛋白質[土倫病法蘭西斯氏菌(Francisella tularensis subsp.tularensis)TIGB03]
其他別名：FTU_0629
基因環境：染色體
註解：NC_016933.1(677092..680463)
ID：11890131
SEQ ID NO：195
135.NMAA_0315
假設蛋白質[腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)WUE 2594]
其他別名：NMAA_0315
註解：NC_017512.1(377010..380258，互補)
ID：12407849
SEQ ID NO：196
136.WS1445
假設蛋白質[產琥珀酸沃氏菌(Wolinella succinogenes)DSM 1740]
其他別名：WS1445
基因環境：染色體
註解：NC_005090.1(1388202..1391381，互補)
ID：2554690
SEQ ID NO：197
137.THITE_2123823
假設蛋白質[土生梭孢黴菌(Thielavia terrestris)NRRL 8126]
其他別名：THITE_2123823
染色體：6
註解：染色體6NC_016462.1(1725696..1725928)
ID：11523019
SEQ ID NO：198
138.XAC29_16635
假設蛋白質[斑點病菌(Xanthomonas axonopodis)Xac29-1]
其他別名：XAC29_16635
基因環境：染色體
註解：NC_020800.1(3849847..3850302)
ID：14853997
SEQ ID NO：199
139.M1GAS476_0830
假設蛋白質[化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)M1 476]
其他別名：M1GAS476_0830
染色體：1
註解：NC_020540.1(792119..796225)
ID：14819166
SEQ ID NO：200
140.Piso0_000203
Piso0_000203[Millerozyma farinosa CBS 7064]
其他別名：GNLVRS01_PISO0A04202g
其他名稱：假設蛋白質
染色體：A
註解：NC_020226.1(343553..343774，互補)
ID：14528449
SEQ ID NO：201
141.G148_0828
假設蛋白質[鴨疫黎氏桿菌(Riemerella anatipestifer)RA-CH-2]
其他別名：G148_0828
基因環境：染色體
註解：NC_020125.1(865673..869875)
ID：14447195
SEQ ID NO：202
142.csn1
假設蛋白質[停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae subsp.
equisimilis)AC-2713]
其他別名：SDSE_1207
註解：NC_019042.1(1134173..1138288，互補)
ID：13901498
SEQ ID NO：203
143.A964_0899
假設蛋白質[無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)GD201008-001]
其他別名：A964_0899
基因環境：染色體
註解：NC_018646.1(935164..939276)
ID：13681619
SEQ ID NO：204
144.FNFX1_0762
假設蛋白質[新兒手法蘭西斯氏菌(Francisella cf.novicida)Fx1]
其他別名：FNFX1_0762
基因環境：染色體
註解：NC_017450.1(781484..786373)
ID：12435564
SEQ ID NO：205
145.FTV_0545
假設蛋白質[土倫病法蘭西斯氏菌(Francisella tularensis subsp.tularensis)TI0902]
其他別名：FTV_0545
基因環境：染色體
註解：NC_016937.1(601185..604556)
ID：11880693
SEQ ID NO：206
146.FTL_1327
假設蛋白質[土倫病法蘭西斯氏菌(Francisella tularensis subsp.holarctica)LVS]
其他別名：FTL_1327
基因環境：染色體
註解：NC_007880.1(1262508..1263689，互補)
ID：3952607
SEQ ID NO：207
147.FTL_1326
假設蛋白質[土倫病法蘭西斯氏菌(Francisella tularensis subsp.holarctica)LVS]
其他別名：FTL_1326
基因環境：染色體
註解：NC_007880.1(1261927..1262403，互補)
ID：3952606
SEQ ID NO：208
<110> 凱美寶有限公司
<120> 方法、細胞與生物體
<130> K000016-1 PCT
<140>
<141>
<160> 208
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在連結子序列前之gRNA部分之範例
<400> 1
<210> 2
<211> 13
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 在連結子序列後之gRNA部分之範例
<400> 2
<210> 3
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA(crRNA)之範例部分
<220>
<221> 其他重要生物功能區
<222> 1,7,8
<223> n=A,U,C或G
<400> 3
<210> 4
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tracrRNA之範例，其包含一gRNA之一部分
<220>
<221> 其他重要生物功能區
<222> 5
<223> n=間隔序列
<220>
<221> 其他重要生物功能區
<222> 12
<223> n=A,U,C或G
<400> 4
<210> 5
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> tracrRNA之一範例
<400> 5
<210> 6
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA之一範例
<400> 6
<210> 7
<211> 1340
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段1A(1340bp)
<400> 7
<210> 8
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段2(852bp)
<400> 8
<210> 9
<211> 920
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段3(920bp)
<400> 9
<210> 10
<211> 920
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段4(920bp)
<400> 10
<210> 11
<211> 920
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段5(920bp)
<400> 11
<210> 12
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段6(789bp)
<400> 12
<210> 13
<211> 535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段7(535bp)
<400> 13
<210> 14
<211> 852
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段2A(852bp)
<400> 14
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸之一範例
<220>
<221> 其他重要生物功能區
<222> 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24
<223> n=A,T,C或G
<400> 15
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸之一範例
<220>
<221> 其他重要生物功能區
<222> 5,6,7,8,9,10,11，12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23
<223> n=A,T,C或G
<400> 16
<210> 17
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7-gRNA序列之範例
<220>
<221> 其他重要生物功能區
<222> 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40
<223> n=A,T,C或G
<400> 17
<210> 18
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 片段1(111bp)
<400> 18
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子Cas9-F
<400> 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於PCR倍增反應之引子Cas9-R
<400> 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子CgRNA-F
<400> 21
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子CgRNA-R
<400> 22
<210> 23
<211> 3108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rosa26之5端同源臂序列
<400> 23
<210> 24
<211> 3102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rosa26之3-端同源臂序列
<400> 24
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Mth與PaM NGG之CRISPR共有序列
<400> 25
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Lmo與PaM WGG之CRISPR共有序列
<400> 26
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Eco與PaM CWT之CRISPR共有序列
<400> 27
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Pae與PaM CTT之CRISPR共有序列
<400> 28
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Spy與PaM GAA之CRISPR共有序列
<400> 29
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Xan與PaM WGG之CRISPR共有序列
<400> 30
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體She與PaM GG之CRISPR共有序列
<400> 31
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Pae與PaM GG之CRISPR共有序列
<400> 32
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Ype與PaM GG之CRISPR共有序列
<400> 33
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Sso與PaM NGG之CRISPR共有序列
<400> 34
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Mse與PaM NGG之CRISPR共有序列
<400> 35
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Str與PaM NGG之CRISPR共有序列
<400> 36
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 基因體Lis與PaM NGG之CRISPR共有序列
<400> 37
<210> 38
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 38
<210> 39
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 39
<210> 40
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 40
<210> 41
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 41
<210> 42
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 42
<210> 43
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 43
<210> 44
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 44
<210> 45
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 45
<210> 46
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 46
<210> 47
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 47
<210> 48
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 48
<210> 49
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 49
<210> 50
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 50
<210> 51
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 51
<210> 52
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 52
<210> 53
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 53
<210> 54
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 54
<210> 55
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 55
<210> 56
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 56
<210> 57
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 57
<210> 58
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 58
<210> 59
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 59
<210> 60
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 60
<210> 61
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引導序列
<400> 61
<210> 62
<211> 1037
<212> PRT
<213> 食清潔劑細小細菌(Parvibaculum lavamentivorans)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_001411379
<309> 2013-06-10
<400> 62
<210> 63
<211> 1629
<212> PRT
<213> 新兒手法蘭西斯菌(Francisella novicida)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_898402
<309> 2013-06-27
<400> 63
<210> 64
<211> 984
<212> PRT
<213> 空腸彎曲桿菌亞種(空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni))
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_002344900
<309> 2014-07-11
<400> 64
<210> 65
<211> 1187
<212> PRT
<213> 長雙叉乳酸桿菌(Bifidobacterium longum)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_001955845
<309> 2013-08-26
<400> 65
<210> 66
<211> 1270
<212> PRT
<213> 雞敗血性黴漿菌(雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum))
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> NP_853456
<309> 2013-06-27
<400> 66
<210> 67
<211> 1195
<212> PRT
<213> Elusimicrobium minutum
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_001875142
<309> 2013-06-10
<400> 67
<210> 68
<211> 1125
<212> PRT
<213> 土倫病法蘭西斯氏菌(土倫病法蘭西斯氏症(Francisella tularensis))
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_001122287
<309> 2013-06-10
<400> 68
<210> 69
<211> 1130
<212> PRT
<213> 馬其頓鏈球菌(Streptococcus macedonicus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005095062
<309> 2013-06-11
<400> 69
<210> 70
<211> 1122
<212> PRT
<213> 豬鏈球菌(Streptococcus suis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004401929
<309> 2013-07-06
<400> 70
<210> 71
<211> 1130
<212> PRT
<213> 沒食子酸鏈球菌(Streptococcus gallolyticus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-06-10
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<211> 1371
<212> PRT
<213> 沒食子酸鏈球菌(Streptococcus gallolyticus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_003430861
<309> 2013-06-10
<400> 72
<210> 73
<211> 1138
<212> PRT
<213> 齒雙歧桿菌(Bifidobacterium dentium)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<400> 73
<210> 74
<211> 1082
<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌(腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis))
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-06-10
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<210> 75
<211> 1348
<212> PRT
<213> 馬鏈球菌(Streptococcus equi)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-06-27
<400> 75
<210> 76
<211> 1136
<212> PRT
<213> 格登鏈球菌(Streptococcus gordonii)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_001450662
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<400> 76
<210> 77
<211> 1368
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<400> 77
<210> 78
<211> 1370
<212> PRT
<213> 沒食子酸鏈球菌(Streptococcus gallolyticus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-07-06
<400> 78
<210> 79
<211> 1035
<212> PRT
<213> Candidatus Puniceispirillum marinum
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_003552871
<309> 2013-06-10
<400> 79
<210> 80
<211> 1395
<212> PRT
<213> 牙密螺旋體(Treponema denticola)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> NP_970941
<309> 2013-06-10
<400> 80
<210> 81
<211> 1130
<212> PRT
<213> 巴斯德鏈球菌(Streptococcus pasteurianus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004559470
<309> 2013-07-06
<400> 81
<210> 82
<211> 897
<212> PRT
<213> 潰瘍棒桿菌(Corynebacterium ulcerans)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004628671
<309> 2013-07-06
<400> 82
<210> 83
<211> 1368
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-08-28
<400> 83
<210> 84
<211> 1368
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_596617
<309> 2013-08-28
<400> 84
<210> 85
<211> 1168
<212> PRT
<213> 固氮螺菌屬(Azospirillum sp.)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_003448082
<309> 2013-06-10
<400> 85
<210> 86
<211> 1114
<212> PRT
<213> 直腸真桿菌(Eubacterium rectale)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_002937591
<309> 2013-06-27
<400> 86
<210> 87
<211> 1029
<212> PRT
<213> 厚壁菌(Alicycliphilus denitrificans)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004386148
<309> 2013-07-06
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<211> 1029
<212> PRT
<213> 厚壁菌(Alicycliphilus denitrificans)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004124877
<309> 2013-07-06
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<211> 1388
<212> PRT
<213> 嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-08-27
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<211> 1121
<212> PRT
<213> 嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_820161
<309> 2013-08-27
<400> 90
<210> 91
<211> 876
<212> PRT
<213> 白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005126356
<309> 2013-06-11
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<210> 92
<211> 1084
<212> PRT
<213> 白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005124303
<309> 2013-06-11
<400> 92
<210> 93
<211> 1384
<212> PRT
<213> 球團科里氏桿菌(Coriobacterium glomerans)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004373648
<309> 2013-07-06
<400> 93
<210> 94
<211> 1458
<212> PRT
<213> Fluviicola taffensis
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004345959
<309> 2013-07-06
<400> 94
<210> 95
<211> 1045
<212> PRT
<213> 西瓜果斑病菌(Acidovorax avenae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004232757
<309> 2013-07-06
<400> 95
<210> 96
<211> 1044
<212> PRT
<213> 亞硝化單胞菌(Nitrosomonas sp.)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004295898
<309> 2013-07-06
<400> 96
<210> 97
<211> 1179
<212> PRT
<213> Sphaerochaeta globosa
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004248194
<309> 2013-07-06
<400> 97
<210> 98
<211> 315
<212> PRT
<213> 陶厄氏菌(Thauera sp.)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_002364238
<309> 2013-06-07
<400> 98
<210> 99
<211> 1003
<212> PRT
<213> 重氮營養葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_002274753
<309> 2013-06-10
<400> 99
<210> 100
<211> 984
<212> PRT
<213> 空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_001398821
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<400> 100
<210> 101
<211> 1062
<212> PRT
<213> 產琥珀酸放線桿菌(actinobacillus succinogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_001343689
<309> 2013-06-10
<400> 101
<210> 102
<211> 1068
<212> PRT
<213> Verminephrobacter eiseniae
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_996018
<309> 2013-06-10
<400> 102
<210> 103
<211> 1368
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_598495
<309> 2013-09-06
<400> 103
<210> 104
<211> 1377
<212> PRT
<213> 無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> NP_735360
<309> 2013-06-27
<400> 104
<210> 105
<211> 1082
<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_002342100
<309> 2013-06-10
<400> 105
<210> 106
<211> 1430
<212> PRT
<213> 二氧化碳嗜纖維菌(Capnocytophaga canimorsus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004740688
<309> 2013-06-11
<400> 106
<210> 107
<211> 1372
<212> PRT
<213> 嗜肺性退伍軍人桿菌(Legionella pneumophila)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_122507
<309> 2013-06-10
<400> 107
<210> 108
<211> 346
<212> PRT
<213> 拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_001309203
<309> 2013-06-10
<400> 108
<210> 109
<211> 1236
<212> PRT
<213> 移動黴漿菌(Mycoplasma mobile)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_015730
<309> 2013-06-10
<400> 109
<210> 110
<211> 1269
<212> PRT
<213> 雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005880991
<309> 2013-06-11
<400> 110
<210> 111
<211> 1270
<212> PRT
<213> 雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005880236
<309> 2013-06-11
<400> 111
<210> 112
<211> 1259
<212> PRT
<213> 念珠狀鏈桿菌(Streptobacillus moniliformis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_003306403
<309> 2013-06-10
<400> 112
<210> 113
<211> 1368
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_002285828
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<210> 114
<211> 984
<212> PRT
<213> 空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_001483000
<309> 2013-06-10
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<211> 1123
<212> PRT
<213> 土倫病法蘭西斯氏菌(土倫病法蘭西斯氏症(Francisella tularensis))
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_666740
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<212> PRT
<213> 土倫病法蘭西斯氏菌(土倫病法蘭西斯氏症(Francisella tularensis))
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_169608
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<210> 117
<211> 1371
<212> PRT
<213> 停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_006859751
<309> 2013-08-27
<400> 117
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<211> 1345
<212> PRT
<213> 轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_006490549
<309> 2013-06-11
<400> 118
<210> 119
<211> 1388
<212> PRT
<213> 嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_006340526
<309> 2013-06-11
<400> 119
<210> 120
<211> 1121
<212> PRT
<213> 嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_006339747
<309> 2013-06-11
<400> 120
<210> 121
<211> 1127
<212> PRT
<213> 唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_006069875
<309> 2013-06-11
<400> 121
<210> 122
<211> 1345
<212> PRT
<213> 轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_006250978
<309> 2013-06-11
<400> 122
<210> 123
<211> 1400
<212> PRT
<213> 疫理莫氏桿菌(Riemerella anatipestifer)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_006017889
<309> 2013-06-11
<400> 123
<210> 124
<211> 1121
<212> PRT
<213> 嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_006002222
<309> 2013-06-11
<400> 124
<210> 125
<211> 1145
<212> PRT
<213> 疫理莫氏桿菌(Riemerella anatipestifer)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005394506
<309> 2013-07-06
<400> 125
<210> 126
<211> 1375
<212> PRT
<213> 嬰兒鏈球菌(Streptococcus infantarius
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005204039
<309> 2013-06-11
<400> 126
<210> 127
<211> 1132
<212> PRT
<213> Nitratifractor salsuginis
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004168469
<309> 2013-07-06
<400> 127
<210> 128
<211> 1082
<212> PRT
<213> 乳糖奈瑟氏球菌(Neisseria lactamica)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004049328
<309> 2013-07-06
<400> 128
<210> 129
<211> 1345
<212> PRT
<213> 轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_003484612
<309> 2013-08-27
<400> 129
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<211> 1371
<212> PRT
<213> 停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_002996940
<309> 2013-06-27
<400> 130
<210> 131
<211> 1082
<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_001598557
<309> 2013-06-10
<400> 131
<210> 132
<211> 1370
<212> PRT
<213> 無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_329639
<309> 2013-06-10
<400> 132
<210> 133
<211> 1368
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_282132
<309> 2013-08-28
<400> 133
<210> 134
<211> 1314
<212> PRT
<213> 滑膜黴漿菌(Mycoplasma synoviae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_278700
<309> 2013-06-10
<400> 134
<210> 135
<211> 1084
<212> PRT
<213> 白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> NP_938445
<309> 2013-06-10
<400> 135
<210> 136
<211> 1409
<212> PRT
<213> 產琥珀酸沃氏菌(Wolinella succinogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> NP_907747
<309> 2013-05-23
<400> 136
<210> 137
<211> 1056
<212> PRT
<213> 多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> NP_246064
<309> 2013-06-27
<400> 137
<210> 138
<211> 1368
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> NP_802438
<309> 2013-06-10
<400> 138
<210> 139
<211> 1345
<212> PRT
<213> 轉糖鏈球菌(Streptococcus mutans)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> NP_721764
<309> 2013-06-27
<400> 139
<210> 140
<211> 1334
<212> PRT
<213> 無毒李斯特菌(Listeria innocua)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> NP_472073
<309> 2013-06-27
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<210> 141
<211> 1371
<212> PRT
<213> 沒食子酸鏈球菌(Streptococcus gallolyticus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 142
<211> 1130
<212> PRT
<213> 沒食子酸鏈球菌(Streptococcus gallolyticus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 143
<211> 897
<212> PRT
<213> 潰瘍棒桿菌(Corynebacterium ulcerans)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 144
<211> 1050
<212> PRT
<213> 重氮營養葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 145
<211> 1166
<212> PRT
<213> 硝化菌(Nitrobacter hamburgensis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 146
<211> 1128
<212> PRT
<213> 嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<211> 1122
<212> PRT
<213> 嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 148
<211> 1368
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-06-10
<400> 148
<210> 149
<211> 1269
<212> PRT
<213> 雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 150
<211> 1269
<212> PRT
<213> 雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_006584600
<309> 2013-06-11
<400> 150
<210> 151
<211> 1224
<212> PRT
<213> 雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_006583854
<309> 2013-06-11
<400> 151
<210> 152
<211> 1269
<212> PRT
<213> 雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-06-11
<400> 152
<210> 153
<211> 1269
<212> PRT
<213> 雞敗血性黴漿菌(Mycoplasma gallisepticum)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-06-11
<400> 153
<210> 154
<211> 1371
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_602415
<309> 2013-08-28
<400> 154
<210> 155
<211> 151
<212> PRT
<213> 斑點病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> NP_643570
<309> 2013-06-10
<400> 155
<210> 156
<211> 1381
<212> PRT
<213> 豬鏈球菌(Streptococcus suis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-06-11
<400> 156
<210> 157
<211> 1122
<212> PRT
<213> 豬鏈球菌(Streptococcus suis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<400> 157
<210> 158
<211> 1064
<212> PRT
<213> 短根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<400> 158
<210> 159
<211> 765
<212> PRT
<213> 溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<400> 159
<210> 160
<211> 1027
<212> PRT
<213> 蛭弧菌(Bdellovibrio exovorus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-06-11
<400> 160
<210> 161
<211> 1239
<212> PRT
<213> 犬黴漿菌(Mycoplasma cynos)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<400> 161
<210> 162
<211> 1370
<212> PRT
<213> 無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-06-11
<400> 162
<210> 163
<211> 1368
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_006932845
<309> 2013-06-11
<400> 163
<210> 164
<211> 1509
<212> PRT
<213> 扭曲冷彎曲菌(Psychroflexus torquis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-06-11
<400> 164
<210> 165
<211> 987
<212> PRT
<213> 空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<400> 165
<210> 166
<211> 1054
<212> PRT
<213> 豬放線桿菌(actinobacillus suis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 167
<211> 1334
<212> PRT
<213> 單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 168
<211> 1334
<212> PRT
<213> 單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 169
<211> 1334
<212> PRT
<213> 單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)血清型7
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<211> 1334
<212> PRT
<213> 單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 171
<211> 984
<212> PRT
<213> 空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 172
<211> 1352
<212> PRT
<213> Belliella baltica
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 173
<211> 1646
<212> PRT
<213> 新兒手法蘭西斯氏菌(Francisella novicida)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<211> 1380
<212> PRT
<213> 中間普氏菌(Prevotella intermedia)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<212> PRT
<213> 嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<211> 1334
<212> PRT
<213> 單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 177
<211> 1334
<212> PRT
<213> 單細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<211> 984
<212> PRT
<213> 空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
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<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<212> PRT
<213> 白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<212> PRT
<213> 白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<212> PRT
<213> 白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<212> PRT
<213> 白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 185
<211> 1084
<212> PRT
<213> 白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<309> 2013-06-11
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<211> 1084
<212> PRT
<213> 白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005134835
<309> 2013-08-28
<400> 186
<210> 187
<211> 876
<212> PRT
<213> 白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005136892
<309> 2013-08-28
<400> 187
<210> 188
<211> 1052
<212> PRT
<213> 副流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_004823543
<309> 2013-06-11
<400> 188
<210> 189
<211> 1025
<212> PRT
<213> 迦瑪變形菌(gamma proteobacterium)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_003812627
<309> 2013-06-10
<400> 189
<210> 190
<211> 1368
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> NP_269215
<309> 2013-06-27
<400> 190
<210> 191
<211> 1370
<212> PRT
<213> 無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_007968536
<309> 2013-06-11
<400> 191
<210> 192
<211> 1123
<212> PRT
<213> 土倫病法蘭西斯氏菌(土倫病法蘭西斯氏症(Francisella tularensis)subsp.tularensis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005830750
<309> 2013-06-11
<400> 192
<210> 193
<211> 1082
<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005879219
<309> 2013-06-11
<400> 193
<210> 194
<211> 861
<212> PRT
<213> 空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005658406
<309> 2013-06-11
<400> 194
<210> 195
<211> 1123
<212> PRT
<213> 土倫病法蘭西斯氏症(Francisella tularensis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005305300
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<400> 195
<210> 196
<211> 1082
<212> PRT
<213> 腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005891308
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<400> 196
<210> 197
<211> 1082
<212> PRT
<213> 產琥珀酸沃氏菌(Wolinella succinogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> YP_005891308
<309> 2013-06-11
<400> 197
<210> 198
<211> 58
<212> PRT
<213> 土生梭孢黴菌(Thielavia terrestris)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> XP_003657788
<309> 2012-01-04
<400> 198
<210> 199
<211> 151
<212> PRT
<213> 斑點病菌(Xanthomonas axonopodis pv.citri)Xac29-1
<308> YP_007637705
<309> 2013-08-28
<400> 199
<210> 200
<211> 1368
<212> PRT
<213> 化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
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<210> 201
<211> 73
<212> PRT
<213> Millerozyma farinosa
<220>
<223> CRISPR-相關核酸內切酶
<308> XP_004204917
<309> 2013-02-06
<400> 201
<210> 202
<211> 1400
<212> PRT
<213> 疫理莫氏桿菌(Riemerella anatipestifer)
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<400> 208

Claims (70)

  1. 一種核酸重組之方法，該方法包含(a)使用Cas核酸內切酶-媒介之核酸切割，以於一核酸股上產生第一與第二斷裂，藉此產生5’與3’切割端，以及一在該等端間之核苷酸序列；(b)使用同源重組以刪去該核苷酸序列；以及(c)任擇地獲得於步驟(b)中所修飾之核酸股，或包含該刪去之子代核酸股。
  2. 如請求項1之方法，其中該刪去之序列包含一調節要素或編碼一蛋白質之全部或一部份。
  3. 如請求項2之方法，其中該刪去之序列包含一蛋白質次單元或區塊。
  4. 如請求項1至3任一項之方法，其中該步驟(b)之刪去係至少20個核苷酸長度。
  5. 如請求項1之方法，更包含於(a)之該等切割端之間插入一核苷酸序列之步驟。
  6. 如請求項5之方法，其中該插入之核苷酸序列包含一PAM模體。
  7. 如請求項5或6之方法，其中該插入序列為至少10個核苷酸長度。
  8. 如請求項5至7任一項之方法，其中重組酶辨識序列係用於插入該核苷酸序列，如loxP及/或突變lox，如lox2272或lox511；或frt。
  9. 如請求項5至7任一項之方法，其中同源重組係用於插入該插入核苷酸序列。
  10. 如請求項5至9任一項之方法，其中該方法係於一細胞中進行，且該插入序列取代該細胞中之異種同源(orthologous)或同種同源(homologous)序列。
  11. 如前述請求項任一項之方法，其中步驟(c)係經由將包含該經修飾之第一股之細胞分離出，或經由獲得實施本方法之非人類脊椎動物或其子代而達成。
  12. 如前述請求項任一項之方法，其中該核酸股或該第一股為DNA股。
  13. 如前述請求項任一項之方法，其中該方法之產物包含一核酸股，其包含一PAM模體在該插入或刪去之3’端。
  14. 如請求項13之方法，其中該PAM模體不多於該刪去之3’端的10個核苷酸。
  15. 如前述請求項任一項之方法，其中步驟(b)係藉由於包含第一與第二同源臂之進入核酸之間進行同源重組來達成，其中該等同源臂實質上分別與一自5’端延伸5’端之序列以及一自3’端延伸3’端之序列同源。
  16. 如請求項15之方法，其中步驟(b)係藉由於包含側接有第一與第二同源臂之插入核苷酸序列之進入核酸之間，進行同源重組來達成，其中該插入核苷酸序列係於5’與3’端間插入。
  17. 如請求項15或請求項16之方法，其中每一同源臂為至少20個連續的核苷酸長度。
  18. 如請求項15至17任一項之方法，其中該第一及/或第二同源臂包含一重組酶辨識序列，如PAM模體。
  19. 如前述請求項任一項之方法，其中該Cas核酸內切酶-媒介之切割係使用於步驟(a)中，並經由辨識GG或NGG PAM模體來進行。
  20. 如請求項19之方法，其中一切口酶被用於步驟(a)中進行切割，以及任擇地，其中該切口酶為Cas切口酶。
  21. 如前述請求項任一項之方法，其中該方法係於一細胞中進行，如真核細胞。
  22. 如請求項21之方法，其中該方法係於哺乳動物細胞中進行，如嚙齒類或小鼠細胞，如嚙齒類(如小鼠)ES細胞或合子。
  23. 如前述請求項任一項之方法，其中該方法係於非人類哺乳動物中進行，如小鼠或大鼠或兔子。
  24. 如前述請求項任一項之方法，其中每一切割位置係側接有PAM模體(如NGG或NGGNG序列，其中N為任一鹼基以及G為鳥糞嘌呤)。
  25. 如前述請求項任一項之方法，其中該3’端係側接有PAM模體。
  26. 如前述請求項任一項之方法，其中步驟(a)係藉由於dsDNA之一股上進行切割來達成。
  27. 如前述請求項任一項之方法，其中步驟(a)係藉由下列方式進行：於細胞中結合核酸股、Cas核酸內切酶、用於標靶核酸內切酶以進行切割之crRNA與tracrRNA(如由 一或多gRNAs提供)，以及任擇地一用於與該核酸股進行同源重組之插入序列。
  28. 如前述請求項任一項之方法，其中步驟(b)係經由與包含第一與第二同源臂之進入核酸進行同源重組來進行，其中該同源臂實質上分別與一自5’端延伸5’端之序列以及一自3’端延伸3’端之序列同源，其中該第二同源臂包含一PAM序列，使得於該方法之產物中，該第二同源臂與該自3’端延伸3’端的序列之間的同源重組產生一包含PAM模體之序列。
  29. 一種依序核酸內切酶-媒介之同源引導重組(sEHDR)之方法，包含將前述請求項任一項之方法進行第一次與第二次，其中該第一次之產物係用於第二次之核酸內切酶-媒介之切割中，藉此(i)第一與第二核苷酸序列係分別於第一次與第二次刪去；或(ii)第一核苷酸序列係於第一次刪去，以及第二核苷酸序列係於第二次插入；或(iii)第一核苷酸序列係於第一次插入，以及第二核苷酸序列係於第二次刪去；或(iv)第一與第二核苷酸序列係分別於第一次與第二次插入；任擇地，其中該第二次之核酸股修飾是第一次之核酸股修飾之20或更少個核苷酸內。
  30. 如請求項29之方法，其中該第一次係依據請求項1進行，其中該進入核酸在該第一與第二同源臂間不包含序列，其中介於5’端與3’端間之序列係藉由同源重組而刪去；及/或該第二次係依據請求項1進行，其中步驟(b)係經由 於包含第一與第二同源臂之進入核酸之間進行同源重組來達成，其中該等同源臂實質上分別與自5’端延伸5’端之序列以及自3’端延伸3’端之序列同源，其中該進入核酸在該第一與第二同源臂間不包含序列，使得介於5’端與3’端間之序列係藉由同源重組而刪去；任擇地，其中該第二臂包含一PAM模體，使得該第二次之產物包含一PAM模體，其用於請求項1至28任一項之後續Cas核酸內切酶-媒介之方法中。
  31. 如前述請求項任一項之方法，其中步驟(a)係使用Cas核酸內切酶-媒介之切割，以及一包含crRNA與tracrRNA之gRNA來進行。
  32. 如請求項27或31之方法，其中該crRNA具結構5’-X-Y-3’，其中X為RNA核苷酸序列(任擇地至少5個核苷酸長度)，以及Y為一包含一核苷酸模體之RNA序列，該核苷酸模體與tracrRNA所包含之模體雜合，其中X能夠與一自5’切割端之希望位置延伸5’端之核苷酸序列雜合。
  33. 如請求項27、31或32之方法，其中Y為5’-N1UUUUAN2N3GCUA-3’，其中N1-3之每一者為A、U、C或G，及/或該tracrRNA包含序列(呈5’至3’方向)UAGCM1UUAAAAM2，其中M1為間隔核苷酸序列，以及M2為核苷酸。
  34. 一種核酸重組之方法，該方法包含提供含有第一與第二股之dsDNA，以及(a)使用Cas核酸內切酶-媒介之核酸切割，於第一股 PAM模體之3’端產生一切割端；(b)使用Cas核酸內切酶-媒介之核酸切割，於第二股的一位置上產生一切割，該位置對應於(a)部分中該股之切割端之3’位置，該切割為PAM模體之3’端；(c)提供第一gRNA，其與在(a)部分該股中之PAM模體的5’端之序列雜合；(d)提供第二gRNA，其與在(b)部分該股中之PAM模體的5’端之序列雜合；其中(a)部分與與(b)部分的核酸股係經修復，以產生在該等切割之間的核酸刪去。
  35. 一種生產細胞或轉殖性非人類生物體之方法，該方法包含：(a)進行前述請求項任一項之方法，以(i)於第一細胞之基因體中敲除(knock out)標的核苷酸序列，及/或(ii)敲入(knock in)一插入核苷酸序列至第一細胞之基因體中，任擇地，其中該插入序列取代基因體中標的序列之內生性位置之全部或一部份之標的序列；其中該細胞或其子代可發育為非人類生物體或細胞；以及(b)令該細胞或其子代發育為非人類生物體或非人類細胞。
  36. 如請求項35之方法，其中該生物體或細胞與(i)及/或(ii)之修飾物為同型組合。
  37. 如請求項35或36之方法，其中該細胞為ES細胞、iPS細 胞、分化全能細胞或多潛能細胞，任擇地為嚙齒類(如小鼠或大鼠)細胞。
  38. 如請求項35至37任一項之方法，其中該標的序列為內生性序列，其包含一調節要素之全部或部分，或編碼一蛋白質之全部或部分。
  39. 如請求項35至38任一項之方法，其中該插入序列為合成性序列；或包含編碼一蛋白質之全部或部份之序列，該蛋白質來自除了該第一細胞衍生之物種以外之物種；或包含來自該第一物種之調節要素。
  40. 如請求項39之方法，其中該插入序列編碼人類蛋白質之全部或部分，或人類蛋白質之次單元或區塊。
  41. 一種細胞或非人類生物體，其基因體包含一修飾，該修飾包含非-內生性核苷酸序列，側接有內生性核苷酸序列，其中該細胞或生物體可由請求項26至40任一項之方法獲得，以及其中該非-內生性序列係於3’端側接一Cas PAM模體；其中該細胞並非人類所包含；以及施行(a)至(d)項之一者、多者或全部：(a)該基因體與該修飾為同型組合；或於其中一對偶基因上包含該修飾，而另一對偶基因未經Cas-媒介之同源重組修飾；(b)該非-內生性序列包含一調節要素之全部或部分，或編碼一蛋白質之全部或部分；(c)該非-內生性序列為至少20個核苷酸長度；(d)該非-內生性序列取代該基因體之異種同源或同源 序列。
  42. 如請求項41之細胞或生物體，其中該非-內生性序列為人類序列。
  43. 如請求項41或42之細胞或生物體，其中該PAM模體包含選自於CCN、TCN、TTC、AWG、CC、NNAGNN、NGGNG GG、NGG、WGG、CWT、CTT與GAA之序列。
  44. 如請求項41至43任一項之細胞或生物體，其中有一PAM模體，不多於該非內生性序列之3’端之10個核苷酸(如3個核苷酸)。
  45. 如請求項41至44任一項之細胞或生物體，其中該PAM模體係由鏈球菌屬(Streptococcus)Cas9辨識。
  46. 如請求項41至45任一項之細胞或生物體，其為非-人類脊椎動物細胞或非-人類脊椎動物，其表現一或多個人類抗體重鏈變異區塊(以及任擇地沒有非-人類脊椎動物物種之重鏈變異區塊)。
  47. 如請求項41至46任一項之細胞或生物體，其為非-人類脊椎動物細胞或非-人類脊椎動物，其表現一或多個人類抗體κ輕鏈變異區塊(以及任擇地沒有非-人類脊椎動物之κ輕鏈變異區塊)，或表現一或多個人類抗體λ輕鏈變異區塊(以及任擇地沒有非-人類脊椎動物之κ輕鏈變異區塊)。
  48. 如請求項46或47任一項之細胞或生物體，其中該非-內生性序列係編碼人類Fc受體蛋白質或其次單元或區塊(如人類FcRn或Fc γ受體蛋白、次單元或區塊)。
  49. 如請求項41至48任一項之細胞或生物體，其中該非-內生性序列包含一或多個人類抗體基因段、一抗體變異區，或一抗體恆定區。
  50. 如請求項41至49任一項之細胞或生物體，其中該插入序列為人類序列，其取代或補充一異種同源非-人類序列。
  51. 一種單株或多株抗體，係藉由使用一抗原來免疫如請求項41至50任一項之脊椎動物(如小鼠或大鼠)而製備。
  52. 一種分離與預定抗原結合之抗體之方法，該方法包含：(a)提供如請求項41至51任一項之脊椎動物(任擇地為小鼠或大鼠)；(b)以該抗原來免疫該脊椎動物；(c)自該脊椎動物中移出B淋巴球，並篩選出一或多個表現與該抗原結合之抗體之B淋巴球；(d)任擇地使該等經篩選出之B淋巴球或其子代不朽化(immortalizing)，任擇地由其產生融合瘤；以及(e)分離出由該B淋巴球所表現之抗體(如IgG-型抗體)。
  53. 如請求項52之方法，其包含下列步驟：自該等B淋巴球分離出編碼結合該抗原之抗體之核酸；任擇地將該抗體之重鏈恆定區核苷酸序列，與編碼人類或人源化重鏈恆定區之核苷酸序列交換，以及任擇地使該抗體變異區親合力成熟；以及任擇地將該核酸插入至表現載體上與任擇地宿主中。
  54. 如請求項52或53之方法，更包含製造由請求項52或53 之方法所產生之抗體之一突變物或衍生物。
  55. 一種結合該抗原之如請求項51之經分離的單株或多株抗體或其突變或衍生抗體之用途，係製造用來作為藥劑之組成物。
  56. 一種結合該抗原之如請求項51之經分離的單株或多株抗體或其突變或衍生抗體用於作為藥物之用途。
  57. 一種核苷酸序列，其編碼如請求項51之抗體，任擇地其中該核苷酸序列為載體之一部分。
  58. 一種醫藥組成物，包含如請求項51之抗體或抗體群，以及一稀釋劑、賦形劑或載體。
  59. 一種ES細胞、真核細胞、哺乳動物細胞、非-人類動物或非-人類囊胚細胞，其包含可表現編碼Cas核酸內切酶之基因體整合核苷酸序列。
  60. 如請求項59之細胞、動物或囊胚細胞，其中該核酸內切酶序列可連續地表現。
  61. 如請求項59之細胞、動物或囊胚細胞，其中該核酸內切酶序列可誘導地表現。
  62. 如請求項59、60或61之細胞、動物或囊胚細胞，其中該核酸內切酶序列可以組織特異性或階段特異性方式，表現於動物或其子代中，或於非-人類動物中，其為該細胞或囊胚細胞之子代。
  63. 如請求項62之細胞或動物，其中該細胞為非-人類胚胎細胞，或該動物為非-人類胚胎，其中該核酸內切酶序列可表現或被表現於該細胞或胚胎中。
  64. 如請求項63之細胞或動物，其中該核酸內切酶係操作性地連結至一啟動子上，該啟動子選自於由胚胎特異性啟動子(如Nanog啟動子、Pou5f1啟動子或SoxB啟動子)組成之族群。
  65. 如請求項61至64任一項之細胞、動物或囊胚細胞，其中該Cas核酸內切酶位於Rosa 26基因座，且任擇地操作性連結至Rosa 26啟動子上。
  66. 如請求項59至62任一項之細胞、動物或囊胚細胞，其中該Cas核酸內切酶序列係於5’端與3’端側接有轉位因子(如倒轉piggyBac末端因子)或位置特異性重組位置(如loxP及/或突變lox，如lox2272或lox511；或frt)。
  67. 如請求項66之細胞、動物或囊胚細胞，包含一或多個限制核酸內切酶位置，介於Cas核酸內切酶序列與轉位因子之間。
  68. 如請求項59至67任一項之細胞、動物或囊胚細胞，其包含一或多個gRNAs。
  69. 如請求項66、67或68之細胞、動物或囊胚細胞，其中gRNA(s)於5’端與3’端側接有轉位因子(如倒轉piggyBac末端因子)或位置特異性重組位置(如loxP及/或突變lox，如lox2272或lox511；或frt)。
  70. 一種如請求項59至69任一項之細胞、動物或囊胚細胞之用途，係於如請求項1至50任一項之方法中。
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