CN109321570A - 用于体外抗体类型转换的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于体外抗体类型转换的方法及试剂盒。本发明揭示了一种基于基因编辑技术的抗体转型新方法，称之为CiCS(CRISPR/Cas9 induced antibody Class Switch)系统。本发明的系统可以针对某一类型的抗体生产细胞高效地产生其下游类型的杂交瘤细胞，从而生产出具有特异抗原亲和力的多种类型的单克隆抗体。

Description

用于体外抗体类型转换的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及用于体外抗体类型转换的方法及试剂盒。

背景技术

抗体是适应性免疫过程中至关重要的免疫分子，其不仅在体内起着协助驱除病原保护机体的作用，而且其早已被广泛应用到制药、疾病检测、基础医学和生物学研究等领域中。其中单克隆抗体是杂交瘤细胞产生的具有特异抗原亲和力的抗体，可以实现大规模生产，应用最为广泛。

抗体(Antibody)即免疫球蛋白(Immunoglobulins，Ig)是有颌脊椎动物免疫系统中识别抗原并启动下游免疫反应的重要因子，在适应性免疫中起着重要作用。抗体由两条相同的重链(Heavy Chain，IgH)和两条相同的轻链(Light Chain，IgL)组成，不同的链通过β折叠和保守区域的半胱氨酸形成二硫键结合在一起，最终形成类似于字母“Y”的形状。“Y”型的臂区包括两个可单独与抗原结合的部分，称为Fab区(Antigen Binding Fragment)，Fab区包括轻链和重链N端的一段氨基酸序列极其多样化的结构域，称为可变区(VariableRegion，V区)，以及序列相对恒定的恒定区(Constant Region，C区)的一个结构域。而“Y”的基座部分是一段介导下游免疫反应的结构，称之为Fc区(Crystallizable Fragment)。Fc区由每条重链上的恒定区(Heavy Chain Constant Region，C_H)的2个结构域组成。轻链的恒定区只有一个结构域，且只有两种类型，κ和λ，而重链的恒定区一般有五种类型，μ、δ、γ、ε以及α。一般认为Fc区决定了抗体的类型(Isotype)和亚型(Subclass)，因此与重链恒定区的类型相对应，抗体类型一般分为IgM，IgD，IgG，IgE，IgA，而对于不同的物种具体又分为多种亚型，例如小鼠的IgG又分为IgG3，IgG1，IgG2b，IgG2a/IgG2c等。需要注意的是不同于其他亚型，IgG2a和IgG2c由一对等位基因表达，因此在小鼠体内存在何种亚型取决于其种系，一般C57B/6、SJL背景的小鼠表达IgG2c而NMRI、DBA/2、Balb/c背景的小鼠则表达IgG2a，但二者基因序列是高度相似的。抗体的Fab区通过与抗原结合起到识别作用，而Fc区则通过与Fc受体(Fc Receptor)结合来激活下游效应细胞或免疫中介因子(Immune Mediator)。不同类型的抗体介导的下游免疫反应也不尽相同。IgM是B细胞发育成熟过程中最先表达的抗体类型，其与抗原亲和力较弱，但在免疫调节过程中起到了重要的作用。IgD可能参与了B细胞命运决定，但它在免疫反应中的作用还不清楚。IgG是血清中存在最多的抗体类型，大部分的IgG都可以激活补体反应，最重要的是它们可以直接参与免疫反应，中和毒素和病毒等抗原。IgA在黏膜表面和分泌物例如，唾液、初乳中大量存在，其可能在天然免疫中起着至关重要的作用。除了可以介导下游的免疫反应外，抗体的类型也会影响可变区，类型不同，即使具有相同的可变区，其与抗原的亲和力和特异性也会有所差异。

据推测，人体产生的抗体足以识别5×10¹³种抗原，一般人一生中会产生超过10⁹种不同的抗体。如果每一种抗体都由一个对应的基因表达，那抗体基因的容量将远远超过整个人类基因组的实际容量，而事实上抗体在人和鼠等高等动物中仅由三个基因表达，即两个轻链基因Igκ和Igλ以及一个重链基因Igh。这些有限的基因包含多种元件，以小鼠抗体基因为例，其Igh由大约100个V元件(Variable Element)，10-15个D元件(DiversityElement)，4个J元件(Joining Element)以及8种恒定区基因组成。机体首先通过V(D)J重排(V(D)J Recombination)将不同的V、D、J或V、J元件拼接起来，形成多样的编码抗体可变区的基因区域—V(D)J区，从而形成一个初始的抗体库(Antibody Repertoire)。当机体受到抗原入侵后，成熟的B细胞会发生进一步多样化的过程：可变区的体细胞高频突变(SomaticHypermutation，SHM)和恒定区的抗体类型转换。这两者均由B细胞特异性的胞苷脱氨酶介导。在SHM中，AID靶向重链和轻链的VDJ或VJ外显子，引入点突变，使抗体可变区的结构进一步多样化，通过体内筛选机制获得抗原亲和力更高的抗体。

CRISPR/Cas9是一种新型高效的基因编辑技术，该技术来源于细菌和古细菌的Ⅱ型适应性免疫系统：CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)系统。Cas9是一种核酸内切酶，目前最常用的Cas9来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，也称为SpCas9。在细菌的Ⅱ型适应性免疫系统中，Cas9会与两段部分互补的RNA结合从而精确靶向并切割目的DNA。其中crRNA(CRISPR RNA)上有一段大约20bp的特异性序列与目的DNA上的一段序列互补，正是通过这段序列Cas9得以被带到特定的位点；而tracrRNA(Trans-Activating CRISPR RNA)则主要起到了连接crRNA和cas9的支架(scaffold)作用。Cas9识别目的DNA序列时具有偏向性，在目的序列的3’端必须有一段PAM(Protospacer-Adjacent Motif)序列才能被cas9识别，SpCas9的PAM序列是5’-NGG-3’。张峰等人通过对Ⅱ型CRISPR系统的改造，获得了可以通过一条单链RNA引导的Cas9系统，并使之得到了广泛应用。该系统仅需人工合成一条约20bp的引导RNA(guide RNA，gRNA)序列的DNA，插入表达质粒，质粒在细胞内表达后，gRNA便会将Cas9带到目的DNA处，在PAM序列前的第三和第四个碱基间切割，造成双链断裂。

目前，要获得具有特异抗原亲和力的不同类型的单克隆抗体主要有两种思路。一是通过直接筛选表达不同类型抗体的杂交瘤细胞，但是这一方法很难做到获得的单克隆抗体的抗原亲和力一致。另一种是对某一类型的杂交瘤细胞进行基因工程改造，但是目前的方法往往效率低下，难以做到定向转换，或是易引入突变，实用价值不高。因此，目前单克隆抗体的类型基本取决于筛选时获得的B细胞的类型，在体外改造B细胞类型十分困难，本领域迫切需要在这一方面实现突破。

发明内容

本发明的目的在于提供用于体外抗体类型转换的方法及试剂盒。

在本发明的第一方面，提供一种抗体类型转换的方法，所述方法包括：将靶向抗体重链恒定区中S区的向导RNA(gRNA)及Cas9酶引入到抗体生产细胞中，从而对抗体生产细胞产生的抗体进行类型转换；其中，所述的向导RNA选自如下核苷酸序列的至少两种：SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:45或其反向互补序列的转录本。

在一个优选例中，所述的抗体类型转换选自：

由IgM向IgG3，IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG3向IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG1向IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG2b向IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG2a/c向IgA的转换。

在另一优选例中，所述抗体类型转换为由IgM向IgG3转换；所述的向导RNA为SEQID NO:3和SEQ ID NO:7；

所述抗体类型转换为由IgM向IgG1转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:20；

所述抗体类型转换为由IgM向IgG2b转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:25；

所述抗体类型转换为由IgM向IgG2a/c转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:3和SEQID NO:34；或

所述抗体类型转换为由IgM向IgA转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:45。

在另一优选例中，所述抗体类型转换为由IgG3向IgG1转换，所述的向导RNA为SEQID NO:7和SEQ ID NO:20；

所述抗体类型转换为由IgG3向IgG2b转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:7和SEQID NO:25；

所述抗体类型转换为由IgG3向IgG2a/c转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:7和SEQID NO:34；或

所述抗体类型转换为由IgG3向IgA转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:45。

在另一优选例中，所述抗体类型转换为由IgG1向IgG2b转换，所述的向导RNA为SEQID NO:20和SEQ ID NO:25；

所述抗体类型转换为由IgG1向IgG2a/c转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:34；或

所述抗体类型转换为由IgG1向IgA转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:45。

在另一优选例中，所述抗体类型转换为由IgG2b向IgG2a/c转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:34；或

所述抗体类型转换为由IgG2b向IgA转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:25和SEQID NO:45。

在另一优选例中，所述抗体类型转换为由IgG2a/c向IgA转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:45。

在另一优选例中，所述的抗体生产细胞是表达抗体的细胞。

在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体；较佳地，所述的抗体生产细胞包括：杂交瘤细胞，B淋巴瘤细胞系，原代B细胞等。

在另一优选例中，所述的方法是非治疗性的方法。

在另一优选例中，所述的方法是以CRISPR/Cas9为基础的方法。

在另一优选例中，所述的向导RNA被包含在载体中，获得gRNA载体；较佳地，gRNA载体通过电转被引入到抗体生产细胞中；更佳地，电转时，gRNA载体用量为5±1μg/5*10⁵个细胞(较佳地，5±0.5μg/5*10⁵个细胞)。

在本发明的另一方面，提供一种用于抗体类型转换的试剂盒，所述试剂盒中含有选自如下核苷酸序列的至少两种向导RNA(gRNA)，或其反向互补序列的转录本：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:45。

在一个优选例中，为了实现更为灵活的抗体转换，所述的试剂盒中包含所有的以下向导RNA：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:34，SEQID NO:45，或其反向互补序列的转录本。

在另一优选例中，所述的向导RNA被包含在载体中。

在另一优选例中，所述的载体可以同时表达两个向导RNA；较佳地，所述的载体可以同向表达两个向导RNA，或反向表达两个向导RNA。

在另一优选例中，所述的载体中，含有mU6启动子和hU6启动子。

在另一优选例中，所述的载体是病毒载体，可以稳定整合到目标细胞基因组，并通过药物筛选成功转入gRNA的细胞，以提高将gRNA导入细胞的效率。

在另一优选例中，所述试剂盒中还含有：Cas9mRNA或能够含有Cas9酶编码序列的表达载体。

在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于进行抗体类型转换。

在一个优选例中，所述的用途是非治疗性的方法和用途。

在另一优选例中，所述的抗体类型转换选自：

由IgM向IgG3，IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG3向IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG1向IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG2b向IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG2a/c向IgA的转换。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、小鼠抗体重链基因结构及类型转换机制

A：小鼠抗体重链基因结构示意图。小鼠抗体重链基因包含8个结构相似的恒定区，除Cδ外所有恒定区前都有一个S区和一个非编码的外显子I。

B：AID介导的体内类型转换和CiCS系统介导的类型转换示意图。在体内，AID靶向Sμ区和一个下游的S区，如Sγ1区，形成双链断裂。上下游的末端被连接，中间部分被删除，从而抗体类型被转换为IgG1(左上图)。在体外，本发明人设想使用CRISPR/Cas9在相应的S区制造双链断裂，从而诱发类型转换(右上图)。

图2、在cSuKI细胞系中筛选靶向Sμ区的gRNA

A：流式细胞仪检测cSuKI细胞的表面抗体类型。用Anti-Mouse IgM-APC和Anti-Mouse IgA-FITC抗体对电转Sμ-gRNA质粒后48小时的细胞和未电转的对照(control)细胞染色，然后经流式细胞仪检测。

B：不同Sμ-gRNA引导切割DNA效率比较。对每个Sμ-gRNA重复三次实验，每次统计IgM阴性细胞比例来表征Sμ-gRNA切割效率。

图3、靶向其他S区的gRNA筛选结果

A：Sμ-3和Sγ1-10诱导CH12F3抗体类型转换为IgG1。分别将Sμ-3，Sγ1-gRNA和二者的组合电转转入CH12F3细胞中，72小时后用Anti-IgM APC和Anti-IgG1FITC的抗体染色之后进行流式检测，以未经电转的CH12F3作为对照。

B-F：诱导CH12F3发生特定类型转换的不同gRNA的效率比较。电转72小时后用Anti-Mouse IgM APC抗体和对应的Anti-Mouse FITC抗体对细胞染色，经流式细胞仪检测，重复三次实验，统计IgM阴性且转换类型阳性细胞比例。

G：流式细胞仪检测筛选出的gRNA诱导CH12F3发生类型转换的效率。优化转染条件后，在转染72小时后，用Anti-Mouse IgM APC抗体和对应的Anti-Mouse FITC抗体对细胞染色，并经流式细胞仪分析。

图4、双gRNA慢病毒载体诱导IgM类型杂交瘤细胞发生类型转换

A：双gRNA系统示意图。两gRNA分别通过mU6和hU6启动子起始转录，两gRNA表达结构可同向(+)或反向排列(-)。

B：双gRNA系统诱导IgM杂交瘤细胞转换为IgG1类型。取IgM-IgG1+和IgM-IgG1-慢病毒感染并通过嘌呤霉素筛选的细胞的培液上清做ELISA检测，IgM、IgG1型抗体样品为阳性对照，以3％BSA阴性对照。将发生IgM向IgG1类型转换的细胞混合物稀释后培养和筛选单克隆，取单克隆细胞培液上清进行Anti-IgM和Anti-IgG1的ELISA检测。图中数值为OD400，颜色深浅代表OD400的相对大小，不同颜色代表不同抗体类型，下同。

C：筛选的单克隆类型检测。取筛选出的各类型杂交瘤细胞培液上清做ELISA检测。

图5、ELISA检测IgG1和IgG2b类型杂交瘤细胞中的抗体类型转换

A：在IgG1类型杂交瘤细胞实现抗体类型转换。用相应gRNA慢病毒载体感染的O1-IgG1细胞，经嘌呤霉素筛选约4天后，取细胞培养液上清做ELISA检测是否含有相应的转换类型的抗体。

B：在IgG2b类型杂交瘤细胞实现抗体类型转换。用相应gRNA慢病毒载体感染的O2-IgG2b细胞，经嘌呤霉素筛选约4天后，取细胞培养液上清做ELISA检测是否含有相应的转换类型的抗体。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，揭示了一种基于基因编辑工具CRISPR/Cas9的抗体转型新方法，称之为CiCS(CRISPR/Cas9induced antibody Class Switch)系统。本发明的系统可以针对某一类型的抗体生产细胞(如杂交瘤细胞)快速产生其下游类型的杂交瘤细胞，从而生产出具有特异抗原亲和力的多种类型的单克隆抗体。

如本文所用，所述的“向导RNA(guide RNA，gRNA)”是基于目标基因上的靶位点设计的，其包含的序列足以与核酸内切酶Cas9协同作用，引导发生Cas9介导的靶位点上DNA的双链断裂。

如本文所用，所述的抗体类型转换是指由一种抗体亚型向另一种抗体亚型的变化。本发明中，这种转换主要是：由IgM向IgG3，IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或由IgG3向IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或由IgG1向IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或由IgG2b向IgG2a/c，IgA的转换；或由IgG2a/c向IgA的转换。

除非另外说明，本发明中所列举的序列均以5’→3’的方向提供。

抗体类型的多样化依赖于抗体类型转换过程，例如小鼠，其抗体重链基因包含八种恒定区基因，依次是Cμ，Cδ，Cγ3，Cγ1，Cγ2b，Cγ2a/c，Cε，Cα，对应着八种类型的抗体IgM，IgD，IgG3，IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgE，IgA。除了Cδ以外，所有的重链恒定区基因都有类似的结构，在恒定区基因的外显子前有一个S区(Switch Region，S)和一个非编码的外显子(Intervening Exon)，在整个重链恒定区基因的5’和3’端则分别存在着调控其转录的增强子Eμ和Igh 3’RR(图1，A)。S区是一段富含GC和重复序列的片段，每个恒定区基因的S区长度从1kb到高达10kb不等。在抗体类型转换过程中，活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)通过特异地靶向重链S区形成双链断裂，当两个S区都产生双链断裂时，两边断裂的S区通过典型的非同源末端连接或可变末端连接重新连接起来。例如在Cμ前的Sμ区和下游的Cγ1前的Sγ1区同时形成双链断裂时，中间的部分被切除，Cγ1外显子被连接到V(D)J区后，从而被表达的抗体类型也由IgM或IgD转换为IgG1(图1，B，左)。然而这一转换途径在体外操作上存在不够稳定、条件复杂的问题。并且，要提供较多的选择，在各亚型之间尽可能方便地转换，在设计上也存在较大难度。

本发明人基于CRISPR/Cas9的系统，提出了基于基因编辑工具CRISPR/Cas9的抗体转型新方法(CRISPR/Cas9induced antibody Class Switch，CiCS)。同时，本发明提出了适合于进行抗体转型的一系列向导RNA，它们是在经过大量的筛选工作后获得的。

本发明的抗体转型的方法包括：将靶向抗体重链恒定区中S区的向导RNA(gRNA)引入到抗体生产细胞中，从而对抗体生产细胞产生的抗体进行类型转换；其中，所述的向导RNA选自如下核苷酸序列的至少两种：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:45。

本发明的一系列向导RNA，可实现由IgM向IgG3，IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或由IgG3向IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或由IgG1向IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或由IgG2b向IgG2a/c，IgA的转换；或由IgG2a/c向IgA的转换。

适合被改造的一类细胞是抗体生产细胞，其是表达抗体的细胞，所述的抗体例如：单克隆抗体，B细胞表面受体等。作为本发明的优选方式，所述的抗体生产细胞包括：杂交瘤细胞，B淋巴瘤细胞系，原代B细胞等。也存在一些在已有的杂交瘤细胞基础上进行改造后获得的抗体生产细胞，本发明的方法同样也适用于对这些细胞进行改造，获得改型的抗体。

任何能够实现将本发明设计的向导RNA引入到细胞内发挥活性的方法均可被应用于本发明中，例如，可以将上述序列的反向互补序列进行反转录为RNA，然后处理细胞，使之进入到细胞中；或者可将上述的序列插入到构建体或载体(质粒)中，将构建体或载体(质粒)转入细胞中。所述的向导RNA可以是DNA、RNA、上述揭示的序列反向互补序列的转录本。

作为本发明的优选方式，所述的向导RNA被包含在载体中，获得gRNA载体；较佳地，gRNA载体通过电转被引入到抗体生产细胞中；更佳地，电转时，gRNA载体用量为5±1μg/5*10⁵个细胞；较佳地，5±0.5μg/5*10⁵个细胞。

在本发明的优选实施例中，在小鼠B淋巴瘤细胞系CH12F3及基于其改造的细胞系cSuKI中，本发明人验证了利用CRISPR/Cas9技术造成双链断裂，从而诱发抗体类型转换的可行性。同时发现，不同的gRNA诱导类型转换的效率并不一致。因此，本发明人建立了两套筛选系统，先通过cSuKI细胞系筛选出了能高效在Sμ区的造成双链断裂的gRNA——Sμ-3。之后，在CH12F3细胞中通过与Sμ-3组合筛选出了靶向其他S区的5个效率极高的gRNA。经过条件的进一步优化，所筛选出的6个gRNA的组合能够高效的在CH12F3细胞系中诱导抗体类型转换。

进一步地，将筛选出的gRNA应用于杂交瘤细胞中，初步实现了单克隆抗体的类型转换。本发明人设计了高效的双gRNA慢病毒载体，结合嘌呤霉素筛选系统，将不同的gRNA组合转入IgM类型杂交瘤细胞E-IgM并富集转入了病毒的细胞。最终成功使E-IgM发生了抗体类型转换，并筛选出四种其他类型的杂交瘤细胞系。

将该系统应用到IgG1和IgG2b类型的杂交瘤细胞之后，两种细胞也均发生了向下游类型的抗体类型转换，这充分验证该系统的稳定性和广泛的适用性。至此，本发明人成功建立起了以基因编辑技术CRISPR/Cas9为基础的体外抗体类型转换系统CiCS。该系统可根据需要搭配不同gRNA以诱导表达不同类型抗体的杂交瘤细胞发生抗体类型转换，再通过单克隆筛选，最快两周即可获得表达不同类型的抗体的杂交瘤细胞的单克隆。

因此，本发明的方法可以高效快速地在体外诱导B细胞和杂交瘤细胞发生抗体类型转换，从而生产出具有相同抗体可变区，即相同抗原亲和力的多种类型的抗体。

本发明的一系列向导RNA的组合，提供了很全面的选择，可以使得本领域技术人员方便地实施各种所需的抗体亚型的转换。

抗体转型的试剂盒

本发明还提供了包含有所述至少两种向导RNA(gRNA)的试剂盒。

本发明的试剂盒中，还可包含为了实现CRISPR/Cas9基因编辑所需的其它一些试剂，例如但不限于：Cas9mRNA或能够含有Cas9酶编码序列的表达载体。一些阳性对照、标准品或阴性对照也可被包含于本发明中。

其它常用于进行转基因操作的试剂也可被包含在所述的试剂盒中，以方便本领域技术人员使用。

此外，所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料和方法

试剂

细胞培养基RPMI-1640、DMEM、Opti-MEM、胎牛血清(FBS)、嘌呤霉素购自Gibco公司，质粒提取试剂盒、DNA胶回试剂盒购自天根公司，限制性核酸内切酶BbsⅠ、BsmBI购自NEB公司，T4连接酶购自Promega公司，6转染试剂购自Roche AppliedBiosciences，电转试剂盒Cell Line Nucleofector Kit R购自Lonza公司。蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)购自OXOID公司，氯化钠(NaCl)购自上海沪试分析仪器有限公司，4-硝基苯磷酸盐二钠盐六水合物(pNPP)、聚凝胺(Polybrene)、X-tremeGENE HP购自Sigma-Aldrich公司，ELISA分析96孔板购自Corning公司，20*PBS、Tween20购自上海生工公司，寡聚核苷酸由上海生工公司合成。

抗体

IgM APC购自eBioscience公司，MS IGG3FITC、MS IGG2B FITC购自BD Pharmigen公司，Goat Anti-Mouse IgG2c Human ads-FITC购自Southern Biotech公司。酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体Goat F(ab’)2Anti-Mouse IgM，Human ads-UNLB、Goat Anti-MouseIgG1，Human ads-UNLB、Goat Anti-Mouse IgG3，Human ads-UNLB、Goat Anti-MouseIgG2a，Human ads-UNLB、Goat Anti-Mouse IgG2b，Human ads-UNLB、Goat Anti-MouseIgA-UNLB、Goat Anti-Mouse IgM-AP、Goat Anti-Mouse IgG1，Human ads-AP、Goat Anti-Mouse IgG3，Human ads-AP、Goat Anti-Mouse IgG2a，Human ads-AP、Goat Anti-MouseIgG2b，Human ads-AP、Goat Anti-Mouse IgA-AP均购自Southern Biotech公司。

菌株与质粒

大肠杆菌DH5α、stbl2菌株由本实验室保种。

PX330系列质粒：Addgene plasmid#42230。

PX330质粒上插入gRNA序列，获得重组质粒。

慢病毒包装所需lentiCRISPR系列质粒通过分子克隆的方法在lentiCRIPSRv2(Addgene plasmid#52961)基础上插入mU6启动子，gRNA脚手架序列，以及两个gRNA序列获得。

细胞培养

CH12F3细胞(Honjo；《High frequency class switching of an IgM+B lymphomaclone CH12F3to IgA+cells》)。cSuKI细胞系是在CH12F3细胞系基础上将Sα区替换为核心Sμ区序列获得(获自哈佛大学)。

杂交瘤细胞E-IgM、O1-IgG1、O2-IgG2b获自上海生化细胞所孙兵实验室。它们均使用RPMI-1640培养基加10％FBS，1％200mM的谷氨酰胺，4.2μlβ-Me，1％10000U/ml青霉素，1％10mg/ml链霉素培养。

293T细胞，使用DMEM加10％FBS，1％200mM的谷氨酰胺，4.2μlβ-Me，1％10000U/ml青霉素，1％10mg/ml链霉素培养。

真核表达质粒的转染

真核表达质粒均通过电转转染。使用NEPA21进行电转时，将细胞离心，用PBS洗一遍，用Opti-MEM重悬细胞，使最终每10⁶个细胞和两种gRNA质粒各5μg重悬于100μl Opti-MEM中，在脉冲电压150V，脉冲时间5ms的条件下电转。使用NucleofectorR II细胞核转染仪进行电转时，使用专门的试剂盒Lonza Cell Line Nucleofector Kit R。将细胞培养至密度在10⁶个/ml左右，离心细胞并用PBS洗一遍，之后用试剂盒中提供的试剂Cell LineSolution R和supplement(41：9混合)按照2.2×10⁷个/ml重悬细胞，取90μl细胞悬液和10μl质粒(两种gRNA质粒各5μg)混合，加入试剂盒提供的电转杯中，用K-005程序电转。

病毒包装与感染

使用X-tremeGENE HP在293T细胞中包装病毒。提前24小时将2×10⁶个293T细胞重悬于6ml无抗DMEM培养基中，铺于10cm细胞培养皿中，在37℃，5％CO₂条件下培养。包装病毒时按每个反应，将1μg慢病毒gRNA质粒和病毒包装质粒psPAX2 750ng和pMD2.G 250ng混合于Opti-MEM至终体积20μl。将6μl X-tremeGENE HP和74μl Opti-MEM混合，室温下静置5分钟。将上述两混合物混匀形成100μl体系，在室温下静置30分钟后均匀滴入培养皿中。12-15小时后将培养基更换为6ml正常DMEM培养基，24小时后，收取培液，通过0.45μm滤膜过滤，保留滤液。感染细胞时，取0.5ml病毒悬液和0.5ml 10⁶个/ml的细胞混合，加入polybrene溶液至其终浓度为8μg/ml，混匀后在1200g，室温下离心90分钟。感染的细胞在24小时后加入终浓度为1.5μg/ml的嘌呤霉素筛选。

流式细胞仪分析

取适量细胞悬液离心，并用FACS缓冲液(PBS加2.5％FBS)洗一遍。用FACS缓冲液按1：200稀释所需抗体，每个样品用100μl稀释后抗体在室温下染色15分钟，然后用FACS缓冲液洗一遍，用合适体积的FACS缓冲液重悬细胞后立即上机检测。

ELISA检测

用0.05M的Na₂CO₃将一抗稀释到2μg/ml，在ELISA分析96孔板上每孔加入50μl一抗，在37℃下孵育3小时，或4℃孵育过夜。倒掉抗体，用3％BSA封闭1小时，倒掉封闭液，用含0.05％Tween20的PBS溶液洗三遍，再用PBS洗三遍。每孔加入待测细胞培养液上清，孵育1小时。按前述方法洗板，用1％BSA按1：1000稀释二抗，每孔加入50μl二抗，孵育1小时。按前述方法洗板，每孔加入50μl pNPP检测液，反应至肉眼可观察到颜色变化后加入等体积2MNaOH。在400nm波长下读取吸光值。

gRNA序列汇总

本发明人对gRNA进行了大量的设计和筛选，经过前期大量筛选后，选择出的一部分gRNA的序列如表1，针对这些gRNA进行进一步筛选。

表1

实施例1、筛选靶向Sμ区的gRNA

为了验证CRIPSR/Cas9系统诱导B细胞发生抗体类型转换的可行性，本发明人首先在一个简化模型中进行试验。cSuKI细胞系是基于B淋巴瘤细胞系CH12F3改造，其恒定区Cα前的Sα区被替换为一段约700bp的Sμ区核心序列cSμ(图2，A)。因此，理论上本发明人只需要向cSuKI细胞中转入靶向Sμ区的gRNA(Sμ-gRNA)便可以同时在Cμ和Cα前形成双链断裂，从而引起抗体基因重组，抗体类型从IgM转换为IgA。本发明人可以通过IgM和IgA的抗体对转入Sμ-gRNA的细胞染色，经流式检测技术FACS(Fluorescence-activated cell sorting)来检测B细胞表面抗体类型，从蛋白水平上确定细胞是否发生抗体类型转换。

本发明人针对Sμ区上的不同靶向位点设计了多个gRNA，分别整合到PX330质粒中，并通过NEPA21进行电转将Sμ-gRNA质粒转入细胞内。经过FACS检测，发现5个Sμ-gRNA(分别简称为：Sμ-1，Sμ-2，Sμ-3，Sμ-4，Sμ-5)可以使cSuKI发生抗体类型转换，但是不同的Sμ-gRNA效率不一(图2，A)。因此，本发明人重复了两次实验，以比较不同gRNA效率的高低。

由于Sμ-gRNA造成的两个双链断裂上下游被正确连接时，会发生抗体类型转换，在FACS检测中显示为IgA阳性IgM阴性；而若Cμ前的双链断裂没有被正确连接到下游，或是发生末端切割(End Resection)，则可能抗体基因可变区被破坏，抗体表达受到影响，在FACS检测中显示为IgM、IgA双阴性。因此，可以认为全部IgM阴性细胞的比例表征了Sμ-gRNA的靶向效率。于是，本发明人对FACS检测结果中的IgM阴性细胞进行了统计，根据统计结果(图2，B)，Sμ-3gRNA呈现显著更高效、更稳定的靶向效果。因此，本发明人选择其用于后续实验。

实施例2、筛选靶向其他S区的gRNA

初步验证CRISPR/Cas9系统介导B细胞抗体类型转换的可行性之后，本发明人尝试利用成对的gRNA诱导未改造的B细胞淋巴瘤细胞系CH12F3进行抗体类型转换。

本发明人将筛选出的Sμ-3和一个靶向Sγ1的gRNA Sγ1-10的PX330质粒共转到CH12F3细胞中，可以看到和Sμ-3或Sγ1-gRNA单转的结果相比，两gRNA共转时明显出现了向IgG1类型的转换(图3，A)。

由于Sμ-gRNA确定，本发明人直接使用IgG1阳性且IgM阴性细胞的比例来表征Sγ1-gRNA的效率。随后，针对每一个S区均设计了多个gRNA，并将Sμ-3和靶向下游S区的gRNA质粒共转到CH12F3中，经FACS检测后统计IgM阴性且转换类型阳性细胞的比例，来比较不同gRNA之间的效率(图3，B)。

经过反复筛选，本发明人得到了能高效靶向S区的6个gRNA：Sμ-3、Sγ3-2、Sγ1-10、Sγ2b-3、Sγ2a/c-3和Sα-6(表2)。

表2

尽管对应的成对gRNA能诱到CH12F3发生定向抗体类型转换，本发明人仍然进一步寻找转换效率提高的方法。将每个反应中每个gRNA质粒用量从2.5μg优化为5μg，并使用电转仪NucleofectorR II和及其专用试剂盒进行电转，从而gRNA诱导类型转换的效率大大提高，最高能达到34％的抗体类型转换效率(图3，C)。

实施例3、在IgM类型杂交瘤细胞中诱导抗体类型转换

验证了CRISPR/Cas9系统诱导B细胞发生抗体类型转换的可行性之后，本发明人进一步将这一系统应用到了杂交瘤细胞中。为了进一步提高该系统的效率，本发明人将gRNA克隆到了慢病毒载体lentiCRISPRv2(双gRNA慢病毒载体)上，并且将两个gRNA组装到同一个载体中(图4，A)。由于不确定两个gRNA以同向排列或反向排列何种表达效率更高，本发明人首先同时构建了Sμ-3(对应于图4，A中gRNA1)和Sγ1-10(对应于图4，A中gRNA2)同向(IgM-IgG1+)和反向(IgM-IgG1-)排列的两种慢病毒质粒载体。在293T细胞中包装病毒后感染了初始表达IgM类型抗体的杂交瘤细胞系E-IgM，然后通过嘌呤霉素筛选感染了病毒的细胞。由于杂交瘤细胞表达的抗体主要为分泌型，因此本发明人采用ELISA方法直接检测细胞培液上清中的抗体类型。

本发明人发现，IgM-IgG1+和IgM-IgG1-两种载体均可以诱导杂交瘤细胞E-IgM发生向IgG1的类型转换(图4，B)，且效率相近。本发明人将发生了类型转换的细胞E-IgM按1个细胞每孔均分至96孔板，培养5天后挑取单克隆，继续培养两天后取上清做Anti-IgM和Anti-IgG1的ELISA来鉴定IgG1型单克隆(图4，B)，最终鉴定出一株IgG1阳性IgM阴性细胞，命名为E-IgG1(通过应用Sμ-3和Sγ1-10获得)。

随后，本发明人又用相同的思路在E-IgM的基础上改造出了IgG2b，IgG2a，IgA类型的杂交瘤细胞系E-IgG2b(通过应用Sμ-3和Sγ2b-3获得)，E-IgG2a(通过应用Sμ-3和Sγ2a/c-3获得)，E-IgA(通过应用Sμ-3和Sα-6获得)。并且，也实现了E-IgM向IgG3类型的转换(通过应用Sμ-3和Sγ3-2获得)，并获得混合细胞系E-IgG3(图4，C)。

实施例4、在IgG1和IgG2b类型杂交瘤细胞中实现抗体类型转换

杂交瘤细胞的类型除IgM外，还包含多种其他下游类型，为了验证本发明人的系统能否使其他类型杂交瘤细胞进一步向下游类型转换，本发明人在IgG1类型的杂交瘤细胞O1-IgG1和IgG2b类型的杂交瘤细胞O2-IgG2b中进行了试验。对于IgG1类型的杂交瘤细胞，本发明人将上述双gRNA反向转录(-))系统(图4A)中的gRNA替换为Sγ1-10和下游的Sγ2b-3、Sγ2a/c-3和Sα-6，然后将这三对gRNA组合通过慢病毒的方式转入细胞内，获得O1-IgG2b、O1-IgG2a和O1-IgA三种类型的混合细胞系。相应的，本发明人将Sγ2b-3分别和下游的Sγ2a/c-3、Sα-6整合到慢病毒载体并感染细胞获得了O2-IgG2a和O2-IgA两种混合细胞系。通过ELISA实验，本发明人在上述五种混合细胞系中均检测到相应类型的抗体(图5，采用反向转录)。这说明O1-IgG1和O2-IgG2b均发生了向下游的抗体类型转换，而且这种转换是与gRNA对应的定向转换。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 用于体外抗体类型转换的方法及试剂盒

<130> 174041

<160> 52

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 1

ggtgagctga gctgagctg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 2

gctggggtga gctgagctg 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 3

ggtgagctgg gctgagctg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 4

tctgagctga gatgagctg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 5

gctgagctgg gctgagctg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 6

gaccaggctg ggcagctct 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 7

agcagctaca ggtgagctg 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 8

ggcagctctg ggggagctg 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 9

gggatgtggg gaccaggct 19

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 10

gctctggggg agctagggt 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 11

cccaggcaga gcagctcca 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 12

gctccagggc agccaggac 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 13

gccaggacag gtggaaatg 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 14

acccaggcag agcagctat 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 15

ccaggcagag cagctccag 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 16

ccaggcagag cagctacag 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 17

ataggggagc caggacagg 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 18

cttagggagc caggacagg 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 19

ccagggcagc caggacagg 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 20

ggtggaagtg tggtgaccc 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 21

cccaggcaga gaagctcca 19

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 22

acccaggcag agaagctcc 19

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 23

agcagctgtg gggaagctg 19

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 24

gaagatggta ggaatgtgg 19

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 25

aacagctagg agggagctg 19

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 26

aggagggagc tggggcagg 19

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 27

gctaggaggg agctggggc 19

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 28

ggggatggta ggaatatga 19

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 29

ggggcagggg gaagtgtga 19

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 30

agctgtgggg gagctgggg 19

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

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tgtgggggag ctggggagg 19

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 32

aaggcagtag agctgtagg 19

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 33

aggcagtaca gctctgagt 19

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 34

ggaccaggca gtacagctg 19

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 35

gaccaggcag tacagctgt 19

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 36

ggcagtacag ctgtggatg 19

<210> 37

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 37

gaccaggcag tacagctat 19

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 38

gaccaggcag tacagctct 19

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 39

aggcagtaca gctctgggt 19

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 40

ggctggaata ggctgggct 19

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 41

gagctgagct ggaatgagc 19

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 42

gggctgggct ggtgcgagc 19

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 43

ggatgggatg ggatgggat 19

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 44

aggctggaat aggctgggc 19

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 45

agctaggctg gaataggct 19

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 46

ataggctggg ctgggctgg 19

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

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gtgtgagcta ggttaggct 19

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 48

agctggaatg agatggaat 19

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<212> DNA

<213> sgRNA序列

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ggctggtgtg agctgggct 19

<210> 50

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<213> sgRNA序列

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gggatgggat gggatggga 19

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<213> sgRNA序列

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ggatggaata ggctgggct 19

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<211> 19

<212> DNA

<213> sgRNA序列

<400> 52

gactaggctg agttagtct 19

Claims (15)

1.一种抗体类型转换的方法，其特征在于，所述方法包括：将靶向抗体重链恒定区中S区的向导RNA及Cas9酶引入到抗体生产细胞中，从而对抗体生产细胞产生的抗体进行类型转换；

其中，所述的向导RNA选自如下核苷酸序列的至少两种：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:45或其反向互补序列的转录本。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗体类型转换选自：

由IgM向IgG3，IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG3向IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG1向IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG2b向IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG2a/c向IgA的转换。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗体类型转换为由IgM向IgG3转换；所述的向导RNA为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7；

所述抗体类型转换为由IgM向IgG1转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:20；

所述抗体类型转换为由IgM向IgG2b转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:25；

所述抗体类型转换为由IgM向IgG2a/c转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:34；或

所述抗体类型转换为由IgM向IgA转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:45。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗体类型转换为由IgG3向IgG1转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:20；

所述抗体类型转换为由IgG3向IgG2b转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:25；

所述抗体类型转换为由IgG3向IgG2a/c转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:34；或

所述抗体类型转换为由IgG3向IgA转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:45。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗体类型转换为由IgG1向IgG2b转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:25；

所述抗体类型转换为由IgG1向IgG2a/c转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:34；或

所述抗体类型转换为由IgG1向IgA转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:45。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗体类型转换为由IgG2b向IgG2a/c转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:34；或

所述抗体类型转换为由IgG2b向IgA转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:45。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗体类型转换为由IgG2a/c向IgA转换，所述的向导RNA为SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:45。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗体生产细胞是表达抗体的细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的抗体是单克隆抗体；较佳地，所述的抗体生产细胞包括：杂交瘤细胞，B淋巴瘤细胞系，原代B细胞等。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的向导RNA被包含在载体中，获得gRNA载体；较佳地，gRNA载体通过电转被引入到抗体生产细胞中；更佳地，电转时，gRNA载体用量为5±1μg/5*10⁵个细胞。

11.一种用于抗体类型转换的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有选自如下核苷酸序列的至少两种向导RNA，或其反向互补序列的转录本：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:45。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的向导RNA被包含在载体中。

13.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有：Cas9mRNA或能够含有Cas9酶编码序列的表达载体。

14.权利要求11～13任一所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于进行抗体类型转换。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述的抗体类型转换选自：

由IgM向IgG3，IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG3向IgG1，IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG1向IgG2b，IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG2b向IgG2a/c，IgA的转换；或

由IgG2a/c向IgA的转换。