ES3013744T3

ES3013744T3 - Methods, cells and organisms

Info

Publication number: ES3013744T3
Application number: ES21196419T
Authority: ES
Inventors: Allan Bradley; Hanif Ali; E-Chiang Lee
Original assignee: Kymab Ltd
Current assignee: Kymab Ltd
Priority date: 2013-09-18
Filing date: 2014-09-18
Publication date: 2025-04-15
Anticipated expiration: 2034-09-18
Also published as: EP3418379A2; EP2877571A1; US20150079680A1; EP3842528A1; TW201542816A; CN105637087A; US20170275611A1; US20160207983A1; ES2681622T3; DE202014010413U1; US11920128B2; US20240200054A1; EP3988649B1; ES2844174T3; EP2877571B1; US20160177340A1; EP3418379B1; EP3988649C0; EP3988649A1; EP4610362A2

Abstract

La invención se refiere a un enfoque para introducir una o más inserciones y/o deleciones deseadas de tamaños conocidos en una o más ubicaciones predefinidas de un ácido nucleico (p. ej., en el genoma de una célula u organismo). Se desarrollaron técnicas para realizar esto, ya sea de forma secuencial o insertando un fragmento discreto de ADN de tamaño definido en el genoma con precisión en una ubicación predefinida, o realizando una deleción discreta de un tamaño definido en una ubicación precisa. La técnica se basa en la observación de que las roturas monocatenarias del ADN se reparan preferentemente a través de la vía HDR, lo que reduce la probabilidad de indeles (p. ej., producidas por NHEJ) en la presente invención y, por lo tanto, es más eficiente que las técnicas de la técnica anterior. La invención también proporciona inserciones y/o deleciones secuenciales mediante corte de ADN monocatenario o bicatenario. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos, células y organismos

Los inventores han ideado un enfoque para introducir una o más inserciones y/o eliminaciones deseadas de tamaños conocidos en una o más ubicaciones predefinidas en un ácido nucleico (por ejemplo, en un genoma celular o de organismo). Desarrollaron técnicas para hacerlo de manera secuencial o insertando un fragmento de ADN discreto de tamaño definido en el genoma precisamente en una ubicación predefinida o llevando a cabo una eliminación discreta de un tamaño definido en una ubicación precisa. La técnica se basa en la observación de que las roturas monocatenarias de ADN se reparan preferentemente a través de la vía HDR, y esto reduce las posibilidades de indeles (por ejemplo, producidos por NHEJ) en la presente invención y divulgación, y, por lo tanto, es más eficiente que las técnicas del estado de la técnica.

Los inventores también han ideado nuevas técnicas denominadas recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR) y recombinación dirigida por homología mediada por Cas secuencial (sCHDR).

ANTECEDENTES

Se ha demostrado que ciertas cepas bacterianas y de arqueas contienen sistemas de defensa inmunitaria adaptativos altamente evolucionados, sistemas CRISPR/Cas, que se someten continuamente a reprogramación para dirigir la degradación de secuencias complementarias presentes en el ADN vírico o de plásmido invasor. Segmentos cortos de ADN exógeno, llamados espaciadores, se incorporan al genoma entre repeticiones CRISPR, y sirven como una 'memoria' de exposiciones pasadas. Los espaciadores de CRISPR se usan entonces para reconocer y silenciar elementos genéticos exógenos de una manera análoga a la iARN en organismos eucariotas.

El sistema de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR) que incluye la proteína asociada a CRISPR (Cas) ha sido reconstituidoin vitropor varios grupos de investigación que permiten la escisión de ADN de casi cualquier molde de ADN sin la salvedad de buscar el cortador de enzimas de restricción correcto. El sistema CRISPR/Cas también ofrece una escisión de extremos romos creando un ADNbc o, usando versiones de Cas mutadas, una escisión selectiva específica de cadena única (véase Conget al.,Wanget al.& Maliet al.citado a continuación).

A través de estudiosin vitrousando el sistema CRISPR/Cas deStreptococcus pyogenesde tipo II, se ha demostrado que los únicos componentes necesarios para el ADN diana eficaz mediado por CRISPR/Cas o la modificación del genoma son una nucleasa de Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas9), ARN de CRISPR (ARNcr) y ARNcr transactivador (ARNcrtra). El mecanismo natural de la escisión de ADN mediada por CRISPR/Cas se produce a través de varias etapas. Transcripción de la matriz CRISPR, que contiene pequeños fragmentos (20-30 pares de bases) del ADN encontrado (o diana), en pre-ARNcr, que experimenta la maduración a través de la hibridación con ARNcrtra a través de repeticiones directas de pre-ARNcr. La hibridación del pre-ARNcr y el ARNcrtra, conocido como ARN guía (ARNg o ARNgu), se asocia con la nucleasa Cas que forma un complejo ribonucleoproteico, que media en la conversión del pre-ARNcr en ARNcr maduro. El dúplex de ARNcr:ARNcrtra maduro dirige Cas9 a la diana de ADN que consiste en el protoespaciador y el motivo adyacente al protoespaciador requerido (motivo adyacente al protoespaciador CRISPR/cas; PAM) a través de la formación de heterodúplex entre la región espadadora del ARNcr y el ADN del protoespaciador en el genoma hospedador. La nucleasa Cas9 media en la escisión del ADN diana aguas arriba de PAM para crear una ruptura bicatenaria dentro del protoespaciador o una mella específica de cadena usando nucleasa Cas9 mutada mediante la cual se muta un motivo de escisión específico de cadena de ADN (por ejemplo, la nickasa Cas9 contiene una sustitución D10A) (Conget al.).

Vale la pena señalar que se han aislado diferentes cepas deStreptococcusque usan secuencias de PAM que son diferentes de las usadas por Cas9 deStreptococcus pyogenes.Este último requiere una secuencia PAM de NGG. Se han descrito sistemas de CRISPR/Cas (por ejemplo, la endorribonucleasa Csy4 enPseudomonas aeruginosa(véase Shahet al.)en otras especies procariotas, que reconocen una secuencia PAM diferente (por ejemplo, CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, Ng G, NGGNG). Cabe señalar que Csy4 (también conocido como Cas6f) no tiene homología de secuencia con Cas9, pero la escisión del ADN se produce a través de un mecanismo similar que implica el ensamblaje de un complejo de Cas-proteína-ARNcr que facilita el reconocimiento del ADN diana que conduce a la escisión específica del ADN (Haurwitzet al.).

El sistema CRISPR/Cas de tipo II reconstituidoin vitrose ha adaptado y aplicado en una serie de configuraciones diferentes. Estos incluyen la creación de una alteración génica selectiva en genes individuales o múltiples en células ES y también una alteración génica única o múltiple usando un enfoque de una solo etapa usando rigotos para generar mutaciones bialélicas en ratones. La velocidad, la precisión y la eficiencia a la que este sistema podría aplicarse a la edición del genoma, además de su capacidad de multiplexación, hace que este sistema sea enormemente superior a sus tecnologías de edición del genoma predecesoras, concretamente las nucleasas de dedo de cinc (ZFN), nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN) y meganucleasas de recirculación modificadas (Gajet al.& Perez-Pineraet al.).Estos se han usado con éxito en varios hospedadores eucariotas, pero todos sufren de limitaciones importantes; notablemente mutagénesis inespecífica que conduce a toxicidad relacionada con nucleasas, y también el tiempo y el coste de desarrollar dichas proteínas modificadas. El sistema CRISPR/Cas, por otro lado, es un sistema superior de edición del genoma mediante el cual se pueden introducir mutaciones con relativa facilidad, simplemente diseñando un ARN guiado único complementario a la secuencia del protoespaciador en el ADN diana. La rotura del ADNbc inducida por una endonucleasa, tal como Cas9, se repara posteriormente a través de un mecanismo de unión de extremos no homólogos (NHEJ), mediante el cual la reparación posterior del ADN en la unión del punto de ruptura se une con inserciones o eliminaciones (indeles) diferentes e impredecibles de tamaño variable. Esto es altamente no deseable cuando se requiere una edición precisa del ácido nucleico o genoma. Sin embargo, se puede generar una mutación precisa predefinida usando la reparación dirigida por homología (HDR), por ejemplo, con la inclusión de un oligonucleótido donante o un fragmento de ADN donante. Se ha demostrado que este enfoque con la nucleasa Cas9 genera mutaciones predefinidas precisas, pero la eficiencia a la que esto ocurre en ambos alelos es baja y la mutación se observa en una de las cadenas de la diana de ADNbc (Wanget al.).

Por lo tanto, el sistema CRISPR/CAS tiene algunas limitaciones en su forma actual. Si bien puede ser posible modificar una secuencia deseada en una cadena de ADNbc, la secuencia en la otra cadena a menudo se muta a través de NHEJ no deseables.

S. KONDO et al.: "Highly Improved Gene Targeting by Germline-Specific Cas9 Expression in Drosophila", GENETICS, vol. 195, n.° 3, 3 de septiembre de 2013, divulga una plataforma para el direccionamiento génico sistemático por la endonucleasa guiada por ARN Cas9 enDrosophila.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención es como se expone en las reivindicaciones.

Las realizaciones dirigidas a métodos no están englobadas por la redacción de las reivindicaciones, sino que se consideran útiles para la compresión de la invención.

Una primera configuración, que no forma parte de la presente invención, proporciona:-Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método proporcionar ADNbc que comprende la primera y segunda cadenas y

(a) usar escisión del ácido nucleico para crear extremos de corte en 5' y 3' en la primera cadena;

(b) usar la recombinación homóloga para insertar una secuencia de nucleótidos entre los extremos, produciendo de este modo una primera cadena modificada; produciendo de este modo ADN en donde la primera cadena ha sido modificada por dicha recombinación, pero la segunda cadena no ha sido modificada; y

(c) replicar opcionalmente la primera cadena modificada para producir un ADNbc de progenie, en donde cada cadena del mismo comprende una copia de la secuencia de nucleótidos insertada; y aislar el ADNbc de progenie.

Una segunda configuración, que no forma parte de la presente invención, proporciona:-Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método

(a) usar la escisión del ácido nucleico para crear extremos de corte en 5' y 3' en una única cadena de ácido nucleico;

(b) usar recombinación homóloga para insertar una secuencia de nucleótidos entre los extremos, en donde la secuencia de inserción comprende un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína; y (c) obtener opcionalmente la cadena de ácido nucleico modificada en la etapa (b) o una cadena nucleica de progenie que comprende la secuencia de nucleótidos insertada.

Una tercera configuración, que no forma parte de la presente invención, proporciona:-Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método

(a) usar la escisión del ácido nucleico para crear la primera y segunda roturas en una cadena de ácido nucleico, creando de este modo extremos de corte en 5' y 3' y una secuencia de nucleótidos entre los extremos; (b) usar recombinación homóloga para eliminar la secuencia de nucleótidos; y

(c) obtener opcionalmente la cadena de ácido nucleico modificada en la etapa (b) o una cadena nucleica de progenie que comprende la eliminación.

Una cuarta configuración, que no forma parte de la presente invención, proporciona:-

Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método proporcionar ADNbc que comprende la primera y segunda cadenas y

(a) usar la escisión del ácido nucleico mediada por la endonucleasa Cas para crear un extremo de corte en la primera cadena 3' de un motivo PAM;

(c) usar la escisión del ácido nucleico mediada por la endonucleasa Cas para crear un corte en la segunda cadena en una posición que corresponde a una posición 3' del extremo de corte de la cadena de la parte (a), cuyo corte es 3' del motivo PAM;

(c) proporcionar un primer ARNg que se hibrida con una secuencia 5' con respecto al motivo PAM en la cadena de la parte (a)

(d) proporcionar un segundo ARNg que se hibrida con una secuencia 5' con respecto al motivo PAM en la cadena de la parte (b)

en donde las cadenas del ácido nucleico de la parte (a) y la parte (b) se reparan para producir una eliminación de ácido nucleico entre los cortes.

En aspectos de las configuraciones del presente documento, se proporciona un método de recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR) que comprende llevar a cabo el método de cualquier configuración precedentes una primera vez y llevar a cabo el método de cualquier configuración precedente una segunda vez. De esta manera, la divulgación permite llevar a cabo modificaciones de ácido nucleico en serie, por ejemplo, modificaciones del genoma, que pueden comprender eliminaciones, inserciones o combinaciones de secuencias precisas de estas dos o más veces. Por ejemplo, es posible usar este aspecto para "caminar a lo largo" de ácidos nucleicos (por ejemplo, cromosomas en células) para realizar eliminaciones o inserciones de secuencias de nucleótidos relativamente grandes y precisas. En una realización, se usa una o más endonucleasas Cas (por ejemplo, una Cas9 y/o Cys4) en un método de recombinación dirigida por homología mediada por Cas secuencial (sCHDR).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1A: Inserción precisa de ADN en una ubicación predefinida (KI): el ARNg diseñado contra una ubicación predefinida puede inducir la mella de ADN usando la nickasa Cas9 D10A 5' de la secuencia PAM (mostrada como caja negra sólida). Como alternativa, el ARNg se puede usar junto con la nucleasa natural Cas9 para inducir roturas de ADN bicatenario 5' de la secuencia PAM. La adición de un oligonucleótido donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología alrededor de la región del punto de ruptura que contiene cualquier forma de alteraciones de ADN, incluida la adición de ADN endógeno o exógeno, se puede insertar con precisión en la unión del punto de ruptura donde el ADN se repara a través de HDR.

Figura 1B: Inserción precisa de ADN en una ubicación predefinida (KI):Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 1a . El ARNgu diseñado contra una ubicación predefinida puede inducir la mella de ADN usando la nickasa Cas9 D10A 5' de la secuencia PAM (mostrada como caja negra sólida). Como alternativa, se puede usar ARNgu junto con la nucleasa natural Cas9 para inducir rupturas de ADN bicatenario 5' de la secuencia PAM. La adición de un oligonucleótido donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con brazos de homología (HA) alrededor de la región del punto de ruptura que contiene cualquier forma de alteraciones de ADN, incluida la adición de ADN endógeno o exógeno, se puede insertar con precisión en la unión del punto de ruptura donde el ADN se repara a través de HDR.

Figura 2A: Eliminación precisa del ADN (KO): los ARNg que se dirigen a la región flanqueante de interés pueden inducir dos mellas de ADN usando la nickasa Cas9 D10A en ubicaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadro negro sólido). Como alternativa, los ARNg se pueden usar con nucleasa natural Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de un oligonucleótido donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología a la región 5' de la secuencia PAM 1 y 3' de PAM 2 guiará la reparación del ADN de una manera precisa a través de HDR. La reparación del ADN a través de HDR reducirá el riesgo de formación de indeles en las uniones del punto de ruptura y evitará la reparación del ADN a través de NHEJ y, al hacerlo, eliminará la región flanqueada por la secuencia PAM y llevará a cabo la reparación del ADN de una manera predeterminada y predefinida.

Figura 2B: Eliminación precisa del ADN (KO):Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 2A. Los ARNgu que se dirigen a la región flanqueante de interés pueden inducir dos mellas de ADN usando nickasa Cas9 D10A en ubicaciones predefinidas que contienen las secuencias PAM deseadas (mostradas como recuadro negro sólido). Nota. Las PAM se pueden ubicar en cadenas de ADN opuestas como se supone en el ejemplo representado en la figura donde ambas PAM están en la misma cadena de ADN. Como alternativa, los ARNgu se pueden usar con la nucleasa natural Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de un oligonucleótido donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología a la región 5' de la secuencia PAM 1 y 3' de PAM 2 guiará la reparación del ADN de una manera precisa a través de HDR. La reparación del ADN a través de HDR reducirá el riesgo de formación de indeles en las uniones del punto de ruptura y evitará la reparación del ADN a través de NHEJ y, al hacerlo, eliminará la región flanqueada por la secuencia PAM y llevará a cabo la reparación del ADN de una manera predeterminada y predefinida.

Figura 3A: Eliminación e inserción precisas de ADN (KO ^KI):los ARNgu dirigidos a la región flanqueante de interés pueden inducir dos mellas de ADN usando la nickasa Cas9 D10A en ubicaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadro negro sólido). Como alternativa, los ARNg se pueden usar con nucleasa natural Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de un oligonucleótido donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología a la región 5' de PAM 1 y 3' a PAM 2 con inclusión de ADN endógeno o exógeno adicional guiará la reparación del ADN de manera precisa a través de HDR con la eliminación simultánea de la región flanqueada por DSB o mella y la inserción de ADN de interés.

Figura 3B: Eliminación e inserción precisas de ADN (KO ^ KI):S Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 3A. Los ARNg que se dirigen a la región flanqueante de interés pueden inducir dos mellas de ADN usando la nickasa Cas9 D10A en ubicaciones predefinidas que contienen las secuencias PAM deseadas (mostradas como recuadro negro sólido). Como alternativa, los ARNgu se pueden usar con la nucleasa natural Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de un oligonucleótido donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología a la región 5' de PAM 1 y 3' a PAM 2 con inclusión de ADN endógeno o exógeno adicional guiará la reparación del ADN (inserto de ADN) de manera precisa a través de HDR con la eliminación simultánea de la región flanqueada por DSB o mella y la inserción de ADN de interés. Nota. Una vez más, las PAM se pueden ubicar en cadenas de ADN opuestas como se supone del ejemplo representado en la figura donde ambas PAM están en la misma cadena de ADN

Figura 4A: Reciclaje de PAM para la edición secuencial del genoma (eliminaciones):los ARNg dirigidos a la región flanqueante de interés pueden inducir dos mellas de ADN usando la nickasa Cas9 D10A en ubicaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadro negro sólido). Como alternativa, los ARNg se pueden usar con nucleasa natural Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de un oligonucleótido donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología a la región 5' de PAM 2 y 3' de PAM 3 guiará la reparación del ADN de manera precisa a través de HDR y al hacerlo, eliminará la región entre PAM 2 y PAM3. Esta eliminación conservará PAM 3 y, por lo tanto, actúa como un sitio para llevar a cabo otra ronda de edición del genoma mediada por CRISPR/Cas. Otro sitio PAM (por ejemplo, PAM 1) se puede usar junto con la secuencia PAM 3 para llevar a cabo otra ronda de eliminación como se ha descrito anteriormente. Usando este enfoque de reciclaje de PAM, se pueden realizar muchas rondas de eliminaciones de forma gradual, donde PAM 3 se recicla después de cada ronda. Este enfoque se puede usar también para la adición gradual de ADN endógeno o exógeno.

Figura 4B: Reciclaje de PAM para la edición secuencial del genoma (eliminaciones):Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 4b . Los ARNgu dirigidos a la región flanqueante de interés pueden inducir dos mellas de ADN usando la nickasa Cas9 D10A en ubicaciones predefinidas que contienen las secuencias PAM deseadas. Como alternativa, los ARNgu se pueden usar con la nucleasa natural Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de un oligonucleótido donante o un fragmento de ADN donante (monocatenario o bicatenario) con homología a la región 5' de PAM 1 (caja PAM clara) y 3' de PAM 2 (caja PAM negra) guiará la reparación del ADN de manera precisa a través de HDR y al hacerlo, eliminará la región entre PAM 1 y PAM 2. La secuencia PAM junto con ARNg único se puede incluir en el ADN de intrusión y dirigirse de nuevo al sitio de edición. En esto, la secuencia PAM 1, por ejemplo, puede reciclarse y, por lo tanto, actúa como un sitio para llevar a cabo otra ronda de edición del genoma mediada por CRISPR/Cas. Se puede usar otro sitio PAM (por ejemplo, PAM 3, caja PAM gris) junto con la secuencia PAM 1 reciclada para llevar a cabo otra ronda de edición (es decir, inserción) como se ha descrito anteriormente. Usando este enfoque de reciclaje de PAM, se pueden realizar muchas rondas de edición del genoma de manera gradual, donde PAM 1 se recicla después de cada ronda. Este enfoque se puede usar también para la adición gradual de ADN endógeno o exógeno.

Figura 5A: Inserción de Lox mediada por CRISPR/Cas para facilitar el RMCE: los ARNg dirigidos a la región flanqueante de interés pueden inducir dos mellas de ADN usando la nickasa Cas9 D10A en ubicaciones predefinidas que contienen las secuencias de PAM deseadas (mostradas como recuadro negro sólido). Como alternativa, los ARNg se pueden usar con nucleasa natural Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de dos oligonucleótidos donantes o fragmentos de ADN del donante (monocatenario o bicatenario) con homología a las regiones 5' y 3' de cada secuencia PAM donde el ADN del donante contiene secuencia de reconocimiento de recombinasa (RRS), tal como loxP y Iox5171, guiará la reparación del ADN de una manera precisa a través de HDR con la inclusión de estas RRS. La RRS introducida se puede usar como una plataforma de aterrizaje para insertar cualquier ADN de interés con alta eficiencia y usando con precisión el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE). El sitio PAM 2 retenido se puede reciclar para otra ronda de edición del genoma mediado por CRISPR/Cas para eliminar o insertar ADN de interés. Nota, el ADN de interés insertado podría contener un marcador de selección tal como PGK-Puro flanqueado por PiggyBac LTR para permitir la selección inicial y, tras la integración con éxito en el ADN de interés, el marcador de selección puede eliminarse convenientemente expresando la transposasa hiperPbase.

Figura 5B: Inserción de Lox mediada por CRISPR/Cas para facilitar el RMCE:Esta figura muestra una descripción más detallada del mecanismo descrito en la Figura 5A. Los ARNgu que se dirigen a la región flanqueante de interés pueden inducir dos mellas de ADN usando nickasa Cas9 D10A en ubicaciones predefinidas que contienen las secuencias PAM deseadas (mostradas como recuadro negro sólido). Como alternativa, los ARNgu se pueden usar con la nucleasa natural Cas9 para inducir dos DSB que flanquean la región de interés. La adición de dos oligonucleótidos donantes o fragmentos de ADN del donante (monocatenario o bicatenario) con homología a las regiones 5' y 3' de cada secuencia PAM donde el ADN del donante contiene secuencia de reconocimiento de recombinasa (RRS), tal como loxP y Iox5171, guiará la reparación del ADN de una manera precisa a través de HDR con la inclusión de estos RRS. Nota. El direccionamiento de los sitios lox se puede realizar de forma secuencial o como un grupo en un proceso de una sola etapa. La RRS introducida se puede usar como una plataforma de aterrizaje para insertar cualquier ADN de interés con alta eficiencia y usando con precisión el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE). Como se detalla en la Figura 4, la secuencia PAM se puede reciclar para otra ronda de edición del genoma mediada por CRISPR/Cas para eliminar o insertar ADN de interés. Como una opción, el ADN de interés insertado podría contener un marcador de selección tal como PGK-Puro flanqueado por PiggyBac LTR para permitir la selección inicial y, tras la integración con éxito en el ADN de interés, el marcador de selección puede eliminarse convenientemente expresando la transposasa hiperPbase.

Figuras 6A y 6B: Modificación del genoma para producir Cas9 y ARNg cortable por transposón

Figura 6C: Expresión de Cas9 de copia única:Una plataforma de aterrizaje puede dirigirse inicialmente a cualquier locus de elección en células ES de ratón o cualquier otra línea celular eucariota. La plataforma de aterrizaje normalmente contendrá PiggyBac 5' y 3' LTR, marcador de selección tal como neo, por ejemplo, floxado y un promotor gen menos tal como PGK en la configuración general mostrada. El direccionamiento se realiza mediante recombinación homóloga y los clones se seleccionan en G418. La siguiente etapa implicará RMCE para insertar Cas9 unido a través de una secuencia de T2A a Puro-delta-tk con la opción de insertar ARN guía único o múltiple usando los sitios de restricción únicos (RS). La orientación de los sitios lox se ubica de manera que solo una vez que el ADN intruso que contiene la Cas9 se inserta en la plataforma de aterrizaje, el promotor PGK en la plataforma de aterrizaje puede activar la transcripción y, por lo tanto, la expresión de la puromicina y a través de T2A transcribir y expresar la producción de Cas9. Usando este enfoque se puede lograr una única expresión estable de Cas9. Después de 4-6 días de selección en puromicina, el casete floxado de ARN guía y Cas9 completo se puede cortar usando la transposasa PiggyBac (Pbase) y se pueden analizar clones individuales para la edición del genoma resultante del ARN guía introducido. Como una opción, se puede generar una línea celular de banco estable que expresa Cas9 a partir de la cual se pueden generar múltiples líneas celulares modificadas. Para hacer esto, solo se insertará Cas9-T2A-Puro-delta-tk y no ARNg en la etapa de RMCE. Esto producirá una línea celular que expresa Cas9 de copia única general donde su genoma se puede editar transfectando ARNg único o múltiple.

Figura 7: Esquema que representa la posición de ARNg con respecto al gen X, la estructura del vector de direccionamiento y el par de oligonucleótidos usado para genotipar los clones diana resultantes.

Figura 8: Una imagen del gel que muestra los resultados de genotipado después de la ruptura de ADN bicatenario mediada por la nucleasa Cas9 y el posterior direccionamiento de ADN.El genotipado muestra un producto de PCR (880 pb) específico para el brazo de homología diana en 5' usando el par de oligonucleótidos HAP341/HAP334. Los geles a la izquierda muestran datos de genotipado de 96 clones de células ES transfectados con ARNg, nucleasa Cas9 humana y un vector de direccionamiento circular (placa 1) o un vector de direccionamiento lineal (placa 2). Los geles a la derecha muestran 96 clones de células ES transfectados con ARNg y un vector de direccionamiento circular (placa 3) o un vector de direccionamiento lineal (placa 4) pero sin nucleasa Cas9 humana. Se muestra el porcentaje de los clones seleccionados correctamente para cada transfección.

Figura 9: Esquema que muestra la posición de los ARNg en un gen para permitir una eliminación definida de la región entre los dos ARNg.Se usó el par de oligonucleótidos cebador 1 y 2 para detectar clones ES que contenían la eliminación específica de 55 pb.

Figura 10: Un gel de agarosa al 3 % que contiene productos de PCR amplificados a partir de 96 clones ES transfectados con ARNg 1 y 2.Los cebadores 1 y 2 se usaron para amplificar aproximadamente los dos ARNg y cualquier clon que contuviera la eliminación definida se puede ver como un producto de PCR más pequeño, que se resalta por un asterisco.

Figura 11: Genotipado por PCR amplificando los brazos de homología dirigida 5' (gel superior) y 3' (gel inferior) dentro del gen Rosa26 ubicado en el cromosoma 6.Los clones dirigidos correctamente que producen producto de PCR para las uniones 5' y 3' están marcados con un asterisco.

Figura 12: Genotipado para la inserción correcta del casete de ADN Cas9 mediante PCR amplificando el brazo 5' (gel superior) y 3' (gel inferior) del casete de ADN insertado.

Figura 13: Genotipado por PCR amplificando la región alrededor del ARN guía y evaluando el producto de PCR para la presencia de indeles.Se pueden ver indeles más grandes directamente desde el gel, ya que produjeron el producto de PCR más corto que el ADN WT esperado, lo que indica una eliminación significativa. Para el control positivo, se usó ADN genómico de AB2.1 de ratón para dimensionar el producto de PCR WT correspondiente. El control negativo fue un control de agua sin ADN.

Figura 14: Amplificación por PCR de la región que flanquea el ARN guía usando ADN extraído de cachorros después de la inyección de Cas9 de cigoto/ARNm guía para analizar la formación de indeles.El carril 14 muestra una enorme eliminación en ese ratón y los carriles marcados con un asterisco indican que estos ratones contienen indeles más pequeños.

Tabla 3:Se muestran un resumen de los datos de secuenciación de los 8 ratones analizados y los detalles de los indeles detectados. El número se refiere a la frecuencia de ese indel particular identificado en los clones analizados y la descripción de los indeles se muestra entre paréntesis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los inventores abordaron la necesidad de mejorar las técnicas de modificación de ácidos nucleicos. Un ejemplo de una técnica para la modificación de ácidos nucleicos es la aplicación del sistema CRISPR/Cas. Este sistema ha mostrado hasta ahora que es el sistema de edición de genomas más avanzado disponible debido, entre otras cosas, a su amplia aplicación, a la velocidad relativa a la que los genomas pueden editarse para crear mutaciones y a su facilidad de uso. Los inventores, sin embargo, creían que esta tecnología podía ser avanzada para aplicaciones aún más amplias de las que se desprenden del estado de la técnica.

Los inventores se dieron cuenta de que un aspecto importante para lograr esto sería encontrar una manera de mejorar la fidelidad de las modificaciones de ácidos nucleicos más allá de lo contemplado por los métodos CRISPR/Cas conocidos en la técnica

Además, los inventores se dieron cuenta de que hasta la fecha solo se habían notificado modestas modificaciones de ácidos nucleicos. Sería deseable efectuar eliminaciones o inserciones de ADN predefinidas y precisas relativamente grandes usando el sistema CRISPR/Cas.

Los inventores han ideado un enfoque para introducir una o más inserciones y/o eliminaciones deseadas de tamaños conocidos en una o más ubicaciones predefinidas en un ácido nucleico (por ejemplo, en un genoma celular o de organismo). Desarrollaron técnicas para hacerlo de manera secuencial o insertando un fragmento de ADN discreto de tamaño definido en el genoma precisamente en una ubicación predefinida o llevando a cabo una eliminación discreta de un tamaño definido en una ubicación precisa. La técnica se basa en la observación de que las roturas monocatenarias de ADN se reparan preferentemente a través de la vía HDR, y esto reduce las posibilidades de indeles (por ejemplo, producidos por NHEJ) y, por lo tanto, es más eficiente que las técnicas del estado de la técnica.

Con este fin, la divulgación proporciona:-Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método proporcionar ADN bicatenario (ADNbc) que comprende la primera y segunda cadenas y

(a) usar escisión de ácido nucleico para crear extremos de corte en 5' y 3' en la primera cadena; y

(b) usar la recombinación homóloga para insertar una secuencia de nucleótidos entre los extremos, produciendo de este modo una primera cadena modificada; produciendo de este modo ADN en donde la primera cadena ha sido modificada por dicha recombinación, pero la segunda cadena no ha sido modificada.

Opcionalmente, el método comprende además replicar la primera cadena modificada para producir un ADNbc de progenie en donde cada cadena del mismo comprende una copia de la secuencia de nucleótidos de inserto. Opcionalmente, el método comprende (c) aislar el ADNbc de progenie, por ejemplo, mediante la obtención de una célula que contiene dicho ADNbc de progenie. La replicación se puede efectuar, por ejemplo, en una célula. Por ejemplo, las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en una célula y la célula se replica, en donde la maquinaria de la célula replica la primera cadena modificada, por ejemplo, para producir una progenie de ADNbc en la que cada cadena comprende la modificación.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, se aísla la cadena de ADN modificada resultante de la etapa (b).

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el método se lleva a caboin vitro.Por ejemplo, el método se lleva a cabo en una célula o población de célulasin vitro.

Alternativamente, opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el método se lleva a cabo para modificar el genoma de un virus.

Alternativamente, opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el método se lleva a caboin vivoen un organismo. En un ejemplo, el organismo es un organismo no humano. En un ejemplo, es una planta o un animal o un insecto o una bacteria o una levadura. Por ejemplo, el método se pone en práctica en un vertebrado (por ejemplo, un paciente humano o un vertebrado no humano (por ejemplo, un pájaro, por ejemplo, un pollo) o mamífero no humano, tal como un ratón, una rata o un conejo).

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el método es un método de tratamiento cosmético de un ser humano o un método no terapéutico, no quirúrgico, no diagnóstico, por ejemplo, puesto en práctica en un ser humano o un vertebrado o mamífero no humano (por ejemplo, un ratón o una rata).

La divulgación también proporciona:-

Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método

(b) usar recombinación homóloga para insertar una secuencia de nucleótidos entre los extremos, en donde la secuencia de inserción comprende un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína; y

(c) obtener opcionalmente la cadena del ácido nucleico modificada en la etapa (b) o una cadena nucleica de progenie que comprende la secuencia de nucleótidos insertada, por ejemplo, mediante la obtención de una célula que contiene dicha cadena del ácido nucleico de progenie.

En un ejemplo, la cadena de progenie es un producto de la replicación de la cadena producida por la etapa (b). La cadena de progenie se produce, por ejemplo, mediante replicación del ácido nucleico en una célula. Por ejemplo, las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en una célula y la célula se replica, en donde la maquinaria de la célula replica la cadena modificada producida en la etapa (b), por ejemplo, para producir una progenie de ADNbc en la que cada cadena comprende la modificación.

En un ejemplo, la cadena del ácido nucleico único es una cadena de ADN o ARN.

En un ejemplo, el elemento regulador es un promotor o potenciador.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia de nucleótidos insertada es una secuencia de plantas, animales, vertebrados o mamíferos, por ejemplo, una secuencia humana. Por ejemplo, la secuencia codifica una proteína completa, polipéptido, péptido, dominio o una pluralidad (por ejemplo, uno, dos o más) de uno cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia insertada confiere una propiedad de resistencia a una célula que comprende el ácido nucleico modificado producido por el método (por ejemplo, resistencia a herbicidas, vírica o bacteriana). En un ejemplo, la secuencia insertada codifica una interleucina, receptor (por ejemplo, un receptor de superficie celular), factor de crecimiento, hormona, anticuerpo (o dominio variable o sitio de unión del mismo), antagonista, agonista; por ejemplo, una versión humana de cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia insertada es un exón.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia de nucleótidos insertada reemplaza una secuencia ortóloga u homóloga de la cadena (por ejemplo, el inserto es una secuencia humana que reemplaza una secuencia de planta o de ratón). Por ejemplo, el método se lleva a cabo en un ratón o célula de ratón (tal como una célula ES) y el inserto reemplaza una secuencia de ratón ortóloga u homóloga (por ejemplo, una proteína diana biológica de ratón implicada en una enfermedad). Por ejemplo, el método se lleva a cabo (por ejemplo,in vitro)en una célula humana y el inserto reemplaza una secuencia humana ortóloga u homóloga (por ejemplo, una proteína diana biológica humana implicada en una enfermedad, por ejemplo, una forma mutada de una secuencia se reemplaza con una secuencia humana diferente (por ejemplo, natural), que puede ser útil para corregir un defecto génico en la célula. En esta realización, la célula puede ser una célula madre ES o IPS o totipotente o pluripotente humana y puede introducirse posteriormente en un paciente humano en un método de terapia génica para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección médica en el paciente).

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia de nucleótidos insertada tiene al menos 10 nucleótidos de longitud, por ejemplo, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos, o al menos 1,2, 3, 5, 10, 20, 50 o 100 kb de longitud.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia de inserto comprende un sitio de recombinación específico del sitio, por ejemplo, un sitio lox, frt o rox. Por ejemplo, el sitio puede ser un sitio loxP, Iox511 o Iox2272.

La divulgación también proporciona:-

Un método de recombinación de ácido nucleico, comprendiendo el método

(a) usar la escisión del ácido nucleico para crear la primera y segunda roturas en una cadena de ácido nucleico, creando de este modo extremos de corte en 5' y 3' y una secuencia de nucleótidos entre los extremos;

(b) usar recombinación homóloga para eliminar la secuencia de nucleótidos; y

En un ejemplo, la cadena del ácido nucleico único es una cadena de ADN o ARN.

En un ejemplo, la secuencia eliminada comprende un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína. En una realización, el elemento regulador suprimido es un promotor o potenciador.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia de nucleótidos eliminada es una secuencia de plantas, animales, vertebrados o mamíferos, por ejemplo, una secuencia humana. Por ejemplo, la secuencia codifica una proteína completa, polipéptido, péptido, dominio o una pluralidad (por ejemplo, uno, dos o más) de uno cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia eliminada codifica una interleucina, receptor (por ejemplo, un receptor de superficie celular), factor de crecimiento, hormona, anticuerpo (o dominio variable o sitio de unión del mismo), antagonista, agonista; por ejemplo, una versión no humana de cualquiera de estos. En un ejemplo, la secuencia eliminada es un exón.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia de nucleótidos eliminada se reemplaza por una secuencia ortóloga u homóloga de una especie o cepa diferente (por ejemplo, una secuencia humana reemplaza una secuencia de planta, humano o de ratón ortóloga u homóloga). Por ejemplo, el método se lleva a cabo en un ratón o célula de ratón y el inserto reemplaza una secuencia de ratón ortóloga u homóloga (por ejemplo, una proteína diana biológica de ratón implicada en una enfermedad). Por ejemplo, el método se lleva a cabo (por ejemplo,in vitro)en una célula humana y el inserto reemplaza una secuencia humana ortóloga u homóloga (por ejemplo, una proteína diana biológica humana implicada en una enfermedad, por ejemplo, una forma mutada de una secuencia se reemplaza con una secuencia humana diferente (por ejemplo, natural), que puede ser útil para corregir un defecto génico en la célula. En esta realización, la célula puede ser una célula madre ES o IPS o totipotente o pluripotente humana y puede introducirse posteriormente en un paciente humano en un método de terapia génica para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección médica en el paciente).

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la secuencia de nucleótidos eliminada tiene al menos 10 nucleótidos de longitud, por ejemplo, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos, o al menos 1,2, 3, 5, 10, 20, 50 o 100 kb de longitud.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la etapa (c) se realiza aislando una célula que comprende la primera cadena modificada, u obteniendo un vertebrado no humano en el que se ha realizado el método o una progenie del mismo.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el producto del método comprende una cadena de ácidos nucleicos que comprende un motivo PAM 3' de la inserción o eliminación. En un ejemplo, el motivo PAM está dentro de 10, 9, 8, 76, 5, 4 o 3 nucleótidos de la inserción o eliminación. Esto es útil para habilitar inserciones y/o eliminaciones en serie según el método como se explica más adelante.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, el producto del método comprende una cadena de ácidos nucleicos que comprende un motivo PAM 5' de la inserción o eliminación. En un ejemplo, el motivo PAM está dentro de 10, 9, 8, 76, 5, 4 o 3 nucleótidos de la inserción o eliminación. Esto es útil para habilitar inserciones y/o eliminaciones en serie según el método como se explica más adelante.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la etapa (b) se realiza llevando a cabo la recombinación homóloga entre un ácido nucleico entrante que comprende el primer y segundo brazos de homología, en donde los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente a una secuencia que se extiende 5' desde el extremo 5' y una secuencia que se extiende 3' desde el extremo 3'. El experto estará familiarizado con la construcción de vectores y moléculas de ADN para su uso en la recombinación homóloga, incluidas consideraciones tales como el tamaño y la secuencia del brazo de homología y la inclusión de marcadores de selección entre los brazos. Por ejemplo, el ácido nucleico entrante comprende el primer y segundo brazos de homología, y la secuencia de inserto y una secuencia de marcador de selección opcional (por ejemplo, secuencia de neo nucleótidos). Los brazos pueden tener al menos 20, 30, 40, 50, 100 o 150 nucleótidos de longitud, por ejemplo. Cuando se requiere la eliminación, se omite el inserto (aunque una secuencia de marcador de selección opcional puede o no incluirse entre los brazos).

Por lo tanto, en una realización, la etapa (b) se realiza llevando a cabo la recombinación homóloga entre un ácido nucleico entrante que comprende una secuencia de nucleótidos de inserto flanqueada por el primer y segundo brazos de homología, en donde la secuencia de nucleótidos de inserto se inserta entre los extremos 5' y 3'.

En otra realización, el inserto está entre los brazos de homología y no hay secuencia adicional entre los brazos.

En un ejemplo, cada grupo de homología tiene al menos 20, 30, 40, 50, 100 o 150 nucleótidos de longitud.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la etapa (a) se lleva a cabo usando una endonucleasa, por ejemplo, una nickasa. Las nickasas cortan en una única cadena de ADNbc solamente. Por ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa de un sistema CRISPR/Cas, por ejemplo, una endonucleasa Cas9 o Cys4 (por ejemplo, una nickasa Cas9 o Cys4). En un ejemplo, la endonucleasa reconoce una PAM enumerada en la Tabla 1 a continuación, por ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa de Cas que reconoce un PAM seleccionado de CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGGNG GG, NGG, WGG, CWT, CTT y GAA. En un ejemplo, la endonucleasa Cas es una endonucleasa de S.pyogenes,por ejemplo, una endonucleasa Cas9 de S.pyogenes.En un ejemplo, se usa la secuencia de PAM de S.pyogeneso una secuencia PAM LMD-9 deStreptococcus thermophilus.

En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa Cas del grupo 1. En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa Cas del grupo 2. En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa Cas del grupo 3. En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa Cas del grupo 4. En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa Cas del grupo 7. En un ejemplo, la endonucleasa es una endonucleasa Cas del grupo 10.

En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM del grupo 1 de CRISPR/Cas. En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM del grupo 2 de CRISPR/Cas. En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM del grupo 3 de CRISPR/Cas. En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM del grupo 4 de CRISPR/Cas. En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM del grupo 7 de CRISPR/Cas. En un ejemplo, la endonucleasa reconoce un PAM del grupo 10 de CRISPR/Cas.

En un ejemplo, la escisión mediada por Cas se usa en la etapa (a); opcionalmente mediante el reconocimiento de un motivo PAM GG o NGG.

En un ejemplo, el primer y/o segundo brazo de homología comprende un motivo PAM. Esto es útil para habilitar inserciones y/o eliminaciones en serie según el método como se explica más adelante.

Un ejemplo de una nickasa adecuada es la nickasa Cas9 D10A deSpyogenes(véase Conget al.y la sección de Ejemplos a continuación).

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, las etapas (a) y (b) del método se llevan a cabo en una célula, por ejemplo, una célula bacteriana, de levadura, eucariota, célula de planta, animal, mamífero, vertebrado, animal no humano, roedor, rata, ratón, conejo, pez, ave o pollo. Por ejemplo, la célula es una célula deE. colio célula CHO o HEK293 oPicchiaoSaccharomyces.En un ejemplo, la célula es una célula humanain vitro.En una realización, la célula es una célula madre embrionaria (célula ES, por ejemplo, una célula ES humana o no humana, tal como una célula ES de ratón) o una célula madre pluripotente inducida (célula IPS; por ejemplo, una célula IPS humana, de roedor, rata o ratón), o una célula pluripotente o totipotente. Opcionalmente, la célula no es una célula embrionaria, por ejemplo, en donde la célula no es una célula embrionaria humana. Opcionalmente, la célula no es una célula pluripotente o totipotente. En un ejemplo, el método se usa para producir una célula madre humana para terapia humana (por ejemplo, una célula IPS generada a partir de una célula de un paciente para su reintroducción en el paciente después de que el método se haya realizado en la célula), en donde la célula madre comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia génica insertada por el método. Las características de los ejemplos de este párrafo pueden combinarse.

En un ejemplo, el método se lleva a cabo en una célula de mamífero. Por ejemplo, la célula es una célula humanain vitroo una célula de mamífero no humana. Por ejemplo, un cigoto no humano (por ejemplo, roedor, rata o ratón). Por ejemplo, un rigoto no humano unicelular.

En un ejemplo, el método se lleva a cabo en una planta o mamífero no humano, por ejemplo, un roedor, ratón o rata o conejo, o un tejido u órgano del mismo (por ejemplo,in vitro).

En un ejemplo, 3' o cada sitio de escisión está flanqueado 3' por el motivo PAM (por ejemplo, un motivo divulgado en el presente documento, tal como la secuencia de n Gg o NGGNG, en donde N es cualquier base y G es una guanina). Por ejemplo, uno o más o todos los sitios de escisión están flanqueados 3' por la secuencia 5'-TGGTG-3'. A diferencia de ADNbc, el PAM no es absolutamente necesaria para la unión y escisión de ADNbc: Un oligodesoxinucleótido monocatenario que contiene un protoespaciador con o sin una secuencia de PAM está unido casi tan bien como el ADNbc y se puede usar en la divulgación en donde se modifica una única cadena de ADN. Además, en presencia de iones Mg2+, Cas9 corta el ADNmc unido al ARNcr usando su sitio activo HNH independientemente de PAM.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la etapa (a) se lleva a cabo mediante escisión en una única cadena de ADNbc o en ADNmc.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la etapa (a) se lleva a cabo combinando en una célula la cadena del ácido nucleico, una endonucleasa Cas, un ARNcr y un ARNcrtra (por ejemplo, proporcionado por uno o más ARNg) para dirigirse a la endonucleasa para llevar a cabo la escisión, y opcionalmente una secuencia de inserto para la recombinación homóloga con la cadena del ácido nucleico. En lugar de una secuencia de inserto, se puede usar una secuencia entrante que contiene brazos de homología, pero sin secuencia de inserto, para efectuar la eliminación como se ha descrito anteriormente. En un ejemplo, la endonucleasa Cas está codificada por una secuencia de nucleótidos que se ha introducido en la célula. En un ejemplo, el ARNg está codificado por una secuencia de ADN que se ha introducido en la célula.

En un ejemplo, el método se lleva a cabo en presencia de Mg2+.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la etapa (b) se realiza llevando a cabo la recombinación homóloga con un ácido nucleico entrante que comprende primer y segundo brazos de homología, en donde los brazos de homología son sustancialmente homólogos respectivamente a una secuencia que se extiende 5' desde el extremo 5' y una secuencia que se extiende 3' desde el extremo 3', en donde el segundo brazo de homología comprende una secuencia de PAM de tal manera que la recombinación homóloga entre el segundo grupo de homología y la secuencia que se extiende 3' desde el extremo 3' produce una secuencia que comprende un motivo PAM en el producto del método. El PAM puede ser cualquier secuencia de PAM divulgada en el presente documento, por ejemplo. Por lo tanto, el método produce una cadena del ácido nucleico modificada que comprende un PAM que se puede usar para una modificación del ácido nucleico posterior según cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, en donde se usa una endonucleasa Cas para cortar el ácido nucleico. Esto es útil, por ejemplo, para realizar la recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR), más particularmente sCHDR descrita a continuación.

Recombinación dirigida por homología secuencial mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR)

La divulgación proporciona además:-

Un método de recombinación dirigida por homología mediada por endonucleasa secuencial (sEHDR) que comprende llevar a cabo el método de cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización precedente una primera y una segunda vez, en donde se usa la escisión mediada por endonucleasa en cada etapa (a); en donde el producto de la primera vez se usa para la escisión mediada por endonucleasa la segunda vez, mediante donde ya sea (i) la primera y segunda secuencias de nucleótidos se eliminan la primera vez y la segunda vez, respectivamente; (ii) una primera secuencia de nucleótidos se elimina la primera vez y una segunda secuencia de nucleótidos se inserta la segunda vez; (iii) una primera secuencia de nucleótidos se inserta la primera vez y una segunda secuencia de nucleótidos se elimina la segunda vez; o (iv) la primera y segunda secuencias de nucleótidos se insertan la primera y segunda veces respectivamente; opcionalmente en donde la modificación de la cadena del ácido nucleico la segunda vez está dentro de 20, 10, 5, 4, 3, 3, 2 o 1 o menos nucleótidos de la modificación de la cadena del ácido nucleico la primera vez o directamente adyacente a la modificación de la cadena del ácido nucleico la primera vez.

Por ejemplo, la primera y segunda secuencias de nucleótidos se insertan de modo que sean contiguas después de la inserción la segunda vez. Como alternativa, la primera y segunda eliminaciones son tales que se ha eliminado una secuencia contigua después de que se hayan realizado la primera y segunda eliminaciones.

En una realización de sEHDR, se usa una endonucleasa Cas. Por lo tanto, se proporciona:-

Un método de recombinación dirigida por homología mediada por Cas secuencial (sCHDR) que comprende llevar a cabo el método de cualquier frase precedente una primera y una segunda vez, en donde se usa escisión mediada por endonucleasa Cas en cada etapa (a); en donde la etapa (b) de la primera vez se lleva a cabo realizando la recombinación homóloga con un ácido nucleico entrante que comprende el primer y segundo brazos de homología, en donde los brazos de homología son sustancialmente homólogos, respectivamente, a una secuencia que se extiende 5' desde el extremo 5' y una secuencia que se extiende 3' desde el extremo 3', en donde el segundo brazo de homología comprende una secuencia de pAm de tal manera que la recombinación homóloga entre el segundo brazo de homología y la secuencia que se extiende 3' desde el extremo 3' produce una secuencia que comprende un motivo PAM en el producto del método; en donde el motivo PAM del producto de la primera vez se usa para la escisión mediada por la endonucleasa Cas la segunda vez, mediante ya sea (i) la primera y segunda secuencias de nucleótidos se eliminan la primera vez y la segunda vez, respectivamente; (ii) una primera secuencia de nucleótidos se elimina la primera vez y una segunda secuencia de nucleótidos se inserta la segunda vez; (iii) una primera secuencia de nucleótidos se inserta la primera vez y una segunda secuencia de nucleótidos se elimina la segunda vez; o (iv) la primera y segunda secuencias de nucleótidos se insertan la primera y segunda veces respectivamente; opcionalmente en donde la modificación de la cadena del ácido nucleico la segunda vez está dentro de 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 o menos nucleótidos de la modificación de la cadena del ácido nucleico la primera vez o directamente adyacentes a la modificación de la cadena del ácido nucleico la primera vez.

En una realización (primera realización), la primera vez se lleva a cabo según la tercera configuración de la divulgación, en donde el ácido nucleico entrante no comprende ninguna secuencia entre el primer y segundo brazos de homología, en donde la secuencia entre los extremos 5' y 3' se elimina mediante recombinación homóloga; y/o la segunda vez se lleva a cabo según la tercera configuración de la divulgación, en donde la etapa (b) se realiza llevando a cabo la recombinación homóloga entre un ácido nucleico entrante que comprende el primer y segundo brazos de homología, en donde los brazos de homología son sustancialmente homólogos, respectivamente, a una secuencia que se extiende 5' desde el extremo 5' y una secuencia que se extiende 3' desde el extremo 3', en donde el ácido nucleico entrante no comprende ninguna secuencia entre los primeros y segundos brazos de homología de tal manera que la secuencia entre los extremos 5' y 3' se elimina mediante recombinación homóloga; opcionalmente en donde el segundo brazo comprende un motivo PAM de tal manera que el producto de la segunda vez comprende un motivo PAM para su uso en un método mediado por la endonucleasa Cas posterior según cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización de la divulgación.

En una realización (segunda realización), la primera vez se lleva a cabo según la primera o segunda configuración de la divulgación, en donde el ácido nucleico entrante comprende la secuencia de inserto entre el primer y segundo brazos de homología, en donde la secuencia de inserto se inserta entre los extremos 5' y 3' mediante recombinación homóloga; y/o la segunda vez se lleva a cabo según la primera o segunda configuración de la divulgación, en donde la etapa (b) se realiza llevando a cabo la recombinación homóloga entre un ácido nucleico entrante que comprende el primer y segundo brazos de homología, en donde los brazos de homología son sustancialmente homólogos, respectivamente, a una secuencia que se extiende 5' desde el extremo 5' y una secuencia que se extiende 3' desde el extremo 3', en donde la secuencia de inserto se inserta entre los extremos 5' y 3' mediante recombinación homóloga; opcionalmente en donde el segundo brazo comprende un motivo PAM de tal manera que el producto de la segunda vez comprende un motivo PAM para su uso en un método mediado por la endonucleasa Cas posterior según cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización de la divulgación.

En un ejemplo, una de dicha primera y segunda veces se lleva a cabo como se especifica en la primera realización y la otra vez se lleva a cabo como se especifica en la segunda realización, en donde se realiza al menos una eliminación de secuencia y al menos una inserción de secuencia.

Opcionalmente, en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, la etapa (a) se lleva a cabo mediante escisión mediada por la endonucleasa Cas usando una endonucleasa de Cas, uno o más ARNcr y un ARNcrtra. Por ejemplo, el método se lleva a cabo en una célula y el ARNcr y el ARNcrtra se introducen en la célula como moléculas de ARN. Por ejemplo, el método se lleva a cabo en un cigoto (por ejemplo, un cigoto no humano, por ejemplo, un cigoto de roedor, rata o ratón) y el ARNcr y el ARNcrtra se inyectan en el cigoto. En otra realización, el ARNcr y el ARNcrtra están codificados por el ADN dentro de una célula u organismo y se transcriben dentro de la célula (por ejemplo, una célula ES, por ejemplo, una célula ES no humana, por ejemplo, una célula ES de roedor, rata o ratón) u organismo para producir el ARNcr y el ARNcrtra. El organismo es, por ejemplo, un animal no humano o planta o una bacteria o levadura o insecto. En una realización, el ARNcrtra está codificado de esta manera por el ADN, pero se introducen uno o más ARNcr como ácido nucleico de ARN en la célula u organismo para efectuar el método.

Adicionalmente o como alternativa a estos ejemplos, la endonucleasa puede introducirse como una proteína o un vector que codifica la endonucleasa puede introducirse en la célula u organismo para efectuar el método. En otro ejemplo, la endonucleasa está codificada por ADN que está genómicamente integrado en la célula u organismo y se transcribe y traduce dentro de la célula u organismo.

En un ejemplo, el método se lleva a cabo en una célula ES (por ejemplo, una célula ES no humana, por ejemplo, una célula ES de roedor, rata o ratón) que se ha modificado previamente para comprender una secuencia de endonucleasa Cas genómicamente integrada expresable (o un vector que lleva esto se ha incluido en la célula). Sería posible introducir (o codificar) un ARNcrtra. Mediante la introducción de un ARNcr con una secuencia de oligonucleótidos guía para dirigirse al área deseada del genoma celular, se pueden llevar a cabo modificaciones en el genoma celular según la divulgación. En un ejemplo, se introduce un ARNg como se describe en el presente documento en la célula ES. La secuencia de endonucleasa Cas expresable genómicamente integrada puede, por ejemplo, expresarse constitutivamente o expresarse induciblemente. Como alternativa o adicionalmente, la secuencia puede ser expresable de una manera específica de tejido en un organismo de la progenie (por ejemplo, un roedor) desarrollado usando la célula ES.

La célula ES inicial que comprende una secuencia de endonucleasa Cas expresable genómicamente integrada se puede usar, mediante técnicas estándar, para producir un animal no humano de la progenie que contiene la secuencia de endonucleasa Cas expresable. Por lo tanto, la invención proporciona:-

una célula animal no humana, que comprende una secuencia de nucleótidos de endonucleasa Cas expresable genómicamente integrada y opcionalmente un ARNcrtra y/o una secuencia de nucleótidos que codifica un ARNcrtra. La endonucleasa Cas es, por ejemplo, Cas9 o Cys4. En un ejemplo, el genoma comprende una secuencia de ADN cromosómico flanqueada por sitios de recombinación específicos del sitio y elementos transposón (por ejemplo, elementos de repetición del transposón piggyBac), en donde la secuencia codifica la endonucleasa y uno o más ARNg. Como se describe en los Ejemplos a continuación, se puede usar el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE) para insertar dicha secuencia. Los elementos transposón se pueden usar para cortar la secuencia del genoma una vez que se ha usado la endonucleasa para realizar la recombinación. La RMCE y/o la escisión mediada por transposón se puede realizar en una célula (por ejemplo, una célula ES) que se usa posteriormente para derivar un animal o planta de progenie que comprende la modificación genómica deseada.

La invención también proporciona una célula ES derivada o derivable de dicho animal, en donde la célula ES comprende una secuencia de nucleótidos endonucleasa Cas expresable genómicamente integrada. En un ejemplo, la célula ES es un roedor, por ejemplo, una célula ES de ratón o rata, o es una célula ES de conejo, perro, cerdo, gato, vaca, primate no humano, pez, anfibio o ave.

Se proporciona un método de aislamiento de una célula ES, comprendiendo el método derivar una célula ES de un animal (por ejemplo, un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, una rata o un ratón), en donde el animal comprende una secuencia de nucleótidos de endonucleasa Cas expresable genómicamente integrada, como se describe en el presente documento.

En cualquiera de estos aspectos, en lugar de una célula ES, la célula puede ser una célula IPS o una célula totipotente o pluripotente. Por lo tanto, una célula iPS o madre puede derivar de (por ejemplo, una célula somática de) un ser humano, modificadoin vitropara comprender una secuencia de nucleótidos de endonucleasa de Cas expresable genómicamente integrada y opcionalmente una o más secuencias de ADN que codifican un ARNcrtra o ARNg. La divulgación, por lo tanto, también se refiere a dicho método y a una célula IPS humana o madre que comprende una secuencia de nucleótidos de endonucleasa Cas expresable genómicamente integrada y opcionalmente una o más secuencias de ADN que codifican un ARNcrtra o ARNg. Esta célula se puede usar en un método de la divulgación para llevar a cabo la modificación del genoma (por ejemplo, para corregir un defecto genético, por ejemplo, mediante el reemplazo de la secuencia defectuosa con una secuencia deseada, opcionalmente con la posterior escisión mediada por transposón de la secuencia que codifica la endonucleasa). Después de la escisión opcional de la secuencia de endonucleasa Cas, la célula iPS o célula madre se puede introducir en el ser humano donante (o en un ser humano diferente, por ejemplo, un pariente genético del mismo) para llevar a cabo terapia genética o profilaxis. Como alternativa, se usa una célula humana totipotente o pluripotente y posteriormente se desarrolla en tejido humano o en un órgano o parte del mismo. Esto es útil para proporcionar material para la terapia humana o la profilaxis o para producir materiales de ensayo (por ejemplo, para la implantación en animales no humanos modelo) o para su uso en pruebasin vitro(por ejemplo, de fármacos).

En un ejemplo, el método usa un ARN guiado único (ARNg o ARNgu) que comprende un ARNcr y un ARNcrtra. El ARNcr comprende una secuencia de oligonucleótidos ("X" en la estructura 5'-X-Y-3' mencionada a continuación) que se elige para dirigirse a una parte deseada del ácido nucleico o genoma que se va a modificar. El experto podrá seleccionar fácilmente la(s) secuencias(s) de oligonucleótidos adecuada(s). En un ejemplo, la secuencia tiene de 3 a 100 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de 3 a 50, 40, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de 5, 10, 15 o 20 a 100 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de 5, 10, 15 o 20 a 50 nucleótidos de longitud.

Por ejemplo, el ARNg es un ácido nucleico único que comprende tanto el ARNcr como el ARNcrtra. Un ejemplo de un ARNg comprende la secuencia 5'-[oligo]-[UUUUAGCUA (S N1UUUAN2N3GCUA)]-[ENLAZADOR]-[UAGCAAGUAAAA (SEQ ID NO:2)]-3', en donde el ENLAZADOR comprende una pluralidad (por ejemplo, 4 o más, por ejemplo, 4, 5 o 6) nucleótidos (por ejemplo, 5'-GAAA-3').

Por ejemplo, el ARNcr tiene la estructura 5'-X-Y-3', en donde X es una secuencia de nucleótidos de ARN (opcionalmente, de al menos 5 nucleótidos de longitud) e Y es una secuencia de ARNcr que comprende un motivo de nucleótido que se hibrida con un motivo comprendido por el ARNcrtra, en donde X es capaz de hibridarse con una secuencia de nucleótidos 5' del sitio deseado del extremo de corte 5', por ejemplo, extendiendo 5' desde el sitio deseado del corte en 5'.

En un ejemplo, Y es 5'-N1 UUUAN2N3GCUA-3' (SEQ ID NO:3), en donde cada uno de N1-3 es una A, U, C o G y/o el ARNcrtra comprende la secuencia (en orientación 5' a 3') UAGCM1UUAAAAM2 (SEQ ID NO:4), en donde M1 es la secuencia de nucleótidos espadadora y M2 es un nucleótido; por ejemplo, N1-G, N2=G y N3=A. La secuencia espaciadora tiene, por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos de ARN de longitud (por ejemplo, AAG en orientación 5’ a 3'). M2 es, por ejemplo, una A, U, C o G (por ejemplo, M2 es una G). En una realización, se usa un ARNg quimérico que comprende una secuencia 5'-X-Y-Z-3', en donde X e Y son como se han definido anteriormente y Z es un ARNcrtra que comprende la secuencia (en orientación 5' a 3') UAGCM1UUAAAAM2 (SEQ ID NO:4), en donde M1 es una secuencia de nucleótidos espaciadora y M2 es un nucleótido. En un ejemplo, Z comprende la secuencia 5'-UAGCAAGUAAAA-3' (SEQ ID NO:2), por ejemplo, Z es 5'- UAGCAAGUAAAUAAGGCUAGUCCG-3' (SEQ ID NO:5). En un ejemplo, el ARNg tiene la secuencia:

5'-GU UU UAGAGCUAGAAAUAGCAAGU UAAAAUMGGCUAGUCCGUUAUCAACU UGAAAAAG UGGCA

CCGAGUCGGUGC-3' (SEQ ID NO:6)

Cuando se desea usar los presentes métodos para insertar una secuencia exógena en el ácido nucleico que se va a modificar, la secuencia exógena se puede proporcionar en ácido nucleico lineal o circular (por ejemplo, ADN). Normalmente, la secuencia exógena está flanqueada por brazos de homología que pueden experimentar recombinación homóloga con las secuencias 5' y 3' respectivamente del sitio donde se va a insertar la secuencia exógena. El experto está familiarizado con la elección de brazos de homología para la recombinación homóloga.

La invención y divulgación se pueden usar en un método de producción de un organismo transgénico, por ejemplo, cualquier organismo citado en el presente documento. Por ejemplo, el organismo puede ser un organismo no humano usado como modelo de ensayo para probar un fármaco farmacéutico o para expresar una proteína exógena o una parte de la misma (por ejemplo, una diana de proteína humana insertada en un organismo de ensayo en animales no humanos). En otro ejemplo, la invención y divulgación se han usado para inactivar una secuencia endógena (por ejemplo, una proteína diana) en un organismo, tal como un organismo no humano. Esto puede ser útil para evaluar el efecto (fenotipo) de la inactivación y, por lo tanto, para evaluar posibles dianas de fármaco o proteínas implicadas en la enfermedad. En un ejemplo, el organismo es un animal no humano (por ejemplo, un vertebrado, mamífero, ave, pez, roedor, ratón, rata o conejo) en el que se ha insertado una proteína diana humana usando la invención o divulgación. Opcionalmente, la invención y divulgación se han usado para inactivar una diana endógena ortóloga u homóloga del organismo (por ejemplo, una secuencia diana endógena se ha reemplazado en la posición endógena por una secuencia diana humana ortóloga u homóloga). De esta manera, se puede producir un modelo de ensayo para probar fármacos farmacéuticos que actúan a través de la diana humana.

En una realización, el organismo es un vertebrado no humano que expresa regiones variables de anticuerpo humano cuyo genoma comprende un reemplazo de una diana endógena con una secuencia humana ortóloga u homóloga. En un ejemplo, el método de la divulgación se usa para producir un vertebrado generador de anticuerpos o un vertebrado de ensayo como se divulga en el documento de patente WO2013061078.

En un ejemplo, un elemento regulador exógeno se inserta usando el método. Por ejemplo, se inserta para reemplazar un elemento regulador endógeno.

En un aspecto, se proporciona un método de producción de una célula o un organismo no humano transgénico (por ejemplo, cualquier organismo no humano citado en el presente documento), comprendiendo el método:

(a) llevar a cabo el método de cualquiera en cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización para (i) inactivar una secuencia de nucleótidos diana en el genoma de una primera célula y/o (ii) insertar una secuencia de nucleótidos de inserto en el genoma de una primera célula, opcionalmente en donde la secuencia de inserto reemplaza una secuencia diana en su totalidad o en parte en la ubicación endógena de la secuencia diana en el genoma; en donde la célula o una progenie de la misma puede convertirse en un organismo o célula no humana; y

(b) desarrollar la célula o progenie en un organismo no humano o una célula no humana.

En un ejemplo, el organismo o célula es homocigótica para la modificación (i) y/o (ii).

En un ejemplo, la célula es una célula ES (tal como una célula ES de ratón), célula IPS, célula totipotente o célula pluripotente. En un ejemplo, la célula es una célula de vertebrado no humano o una célula humanain vitro.En un ejemplo, la célula es una célula de planta, levadura, insecto o bacteriana.

En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de roedor (por ejemplo, una célula de ratón o rata) o una célula de conejo, ave, pez, pollo, primate no humano, mono, cerdo, perro, camélido, tiburón, oveja, vaca o gato.

En un ejemplo, la secuencia diana es una secuencia endógena que comprende todo o parte de un elemento regulador o que codifica toda o parte de una proteína.

En un ejemplo, la secuencia de inserto es una secuencia sintética; o comprende una secuencia que codifica toda o parte de una proteína de una especie distinta de la especie de la que deriva la primera célula; o comprende un elemento regulador de dicha primera especie. Esto es útil para combinar genes con nuevos elementos reguladores.

En un ejemplo, la secuencia de inserto codifica toda o parte de una proteína humana o una subunidad o dominio de proteína humana. Por ejemplo, la secuencia de inserto codifica una proteína de membrana celular, proteína secretada, proteína intracelular, citocinas, proteína receptora (por ejemplo, proteína receptora de Fc, tal como FcRn o una proteína receptora de FcY), proteína del sistema inmunitario humano o dominio del mismo (por ejemplo, una proteína o dominio de Ig, tal como un anticuerpo o proteína o dominio TCR, o una proteína MHC), una hormona o factor de crecimiento. También se proporciona:-una célula (por ejemplo, una célula aislada o purificada, por ejemplo, una célulain vitroo cualquier célula divulgada en el presente documento) o un organismo no humano (por ejemplo, cualquier organismo divulgado en el presente documento, tal como un ratón) cuyo genoma comprende una modificación que comprende una secuencia de nucleótidos no endógena flanqueada por secuencias de nucleótidos endógenas, en donde la célula u organismo es obtenible mediante el método de cualquier configuración, aspecto, ejemplo o realización, y en donde la secuencia no endógena está flanqueada 3' y/o 5' por (por ejemplo, dentro de 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 o menos nucleótidos de, o directamente adyacentes a) un motivo PAM de Cas; en donde la célula no está comprendida por un ser humano; y se aplica a uno, más o todos de (a) a (d) (por ejemplo, (a); (b); (c); (d); a) y b); a) y c); a) y d); b) y c); b) y d); c) y d); a), b) y c); a), b) y d); (a), (c) y (d); (b), (c) y (d) o todos de (a), (b), (c) y (d)).

(a) el genoma es homocigótico para la modificación; o comprende la modificación en un alelo y no está modificado por recombinación homóloga mediada por CAS en el otro alelo;

(b) la secuencia no endógena comprende todo o parte de un elemento regulador o codifica toda o parte de una proteína;

(c) la secuencia no endógena tiene al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos, o al menos 1,2, 3, 5, 10, 20, 50 o 100 kb de longitud;

(d) la secuencia no endógena reemplaza una secuencia ortóloga u homóloga en el genoma.

La célula, que no forma parte de la invención reivindicada, puede ser una célula humana, o estar incluida en el tejido humano, pero no formar parte de un ser humano. Por ejemplo, la célula es una célula humanain vitro.

En un ejemplo, la secuencia no endógena es una secuencia humana.

En un ejemplo, el motivo PAM es cualquier PAM divulgado en el presente documento o comprende una secuencia seleccionada de CCN, TCN, TTC, AWG, CC, NNAGNN, NGGNG GG, NGG, WGG, CWT, CTT y GAA. Por ejemplo, el motivo es un motivo PAM de Cas9. Por ejemplo, PAM es NGG. En otro ejemplo, PAM es GG.

En un ejemplo, hay un motivo PAM de no más de 10 nucleótidos (por ejemplo, 3 nucleótidos) 3' y/o 5' de la secuencia no endógena.

En un ejemplo, el motivo PAM es reconocido por una Cas9 deStreptococcus.

En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de vertebrado no humano o un vertebrado no humano que expresa uno o más dominios variables de cadena pesada de anticuerpos humanos (y opcionalmente ningún dominio variable de cadena pesada de una especie de vertebrado no humano). Por ejemplo, el organismo es un vertebrado generador de anticuerpos o vertebrado de ensayo divulgado en el documento de patente WO2013061078.

En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de vertebrado no humano o un vertebrado no humano que expresa uno o más dominios variables de cadena ligera kappa de anticuerpos humanos (y opcionalmente ningún dominio variable de cadena ligera kappa de una especie de vertebrado no humano).

En un ejemplo, la célula u organismo es una célula de vertebrado no humano o un vertebrado no humano que expresa uno o más dominios variables de cadena ligera lambda de anticuerpos humanos (y opcionalmente ningún dominio variable de cadena ligera lambda de una especie de vertebrado no humano).

En un ejemplo, la secuencia no endógena codifica una proteína o subunidad o dominio del receptor de Fc humano (por ejemplo, una proteína, subunidad o dominio de FcRn o del receptor de FcY humano).

En un ejemplo, la secuencia no endógena comprende uno o más segmentos génicos de anticuerpo humano, una región variable de anticuerpo o una región constante de anticuerpo.

En un ejemplo, la secuencia de inserto es una secuencia humana que reemplaza o complementa una secuencia no humana ortóloga.

También se proporciona:-un anticuerpo monoclonal o policlonal, que no forma parte de la invención reivindicada, preparado mediante inmunización de un vertebrado (por ejemplo, ratón o rata) de la divulgación (o producido mediante un método de la divulgación) con un antígeno.

La divulgación también proporciona (no forma parte de la invención reivindicada):-un método de aislamiento de un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un vertebrado (opcionalmente un ratón o una rata) de la divulgación (o producido mediante un método de la divulgación);

b) inmunizar dicho vertebrado con dicho antígeno;

(c) eliminar los linfocitos B del vertebrado y seleccionar uno o más linfocitos B que expresan anticuerpos que se unen al antígeno;

(d) inmortalizar opcionalmente dichos linfocitos B seleccionados o progenie de los mismos, opcionalmente produciendo hibridomas a partir de los mismos; y

(e) aislar un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgG) expresado por los linfocitos B.

En un ejemplo, el método comprende la etapa de aislar de dichos linfocitos B ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo que se une a dicho antígeno; opcionalmente intercambiar la secuencia de nucleótidos de la región constante de cadena pesada del anticuerpo con una secuencia de nucleótidos que codifica una región constante de cadena pesada humana o humanizada y opcionalmente madurar por afinidad la región variable de dicho anticuerpo; y opcionalmente insertar dicho ácido nucleico en un vector de expresión y opcionalmente un hospedador.

En un ejemplo, el método comprende hacer un mutante o derivado del anticuerpo producido por el método.

La divulgación proporciona el uso de un anticuerpo aislado, monoclonal o policlonal descrito en el presente documento, o un anticuerpo mutante o derivado del mismo que se une a dicho antígeno, en la fabricación de una composición para su uso como medicamento.

La divulgación proporciona el uso de un anticuerpo aislado, monoclonal o policlonal descrito en el presente documento, o un anticuerpo mutante o derivado del mismo que se une a dicho antígeno para su uso en medicina.

La divulgación proporciona un método de tratamiento de un paciente que lo necesita (por ejemplo, un paciente humano), que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo aislado, monoclonal o policlonal descrito en el presente documento, o un anticuerpo mutante o derivado del mismo que se une a un antígeno. La divulgación proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo descrito en el presente documento, opcionalmente en donde la secuencia de nucleótidos es parte de un vector. La divulgación también proporciona una célula hospedadora que comprende dicha secuencia de nucleótidos.

La divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o anticuerpos descritos en el presente documento y un diluyente, excipiente o portador.

La divulgación proporciona una célula ES, un animal no humano o un blastocisto no humano que comprende una secuencia de nucleótidos genómicamente integrada expresable que codifica una endonucleasa Cas (por ejemplo, una Cas9 o Cys4) y opcionalmente una secuencia de nucleótidos genómicamente integrada expresable que codifica un ARNcrtra o un ARNg. Por ejemplo, la célula ES es cualquier tipo de célula ES descrito en el presente documento.

En un ejemplo de la célula, animal o blastocisto, la secuencia de endonucleasa es constitutivamente expresable.

En un ejemplo de la célula, animal o blastocisto, la secuencia de endonucleasa es induciblemente expresable.

En un ejemplo de la célula, animal o blastocisto, la secuencia de endonucleasa es expresable de una manera específica de tejido en el animal o una progenie del mismo, o en un animal no humano que es una progenie de la célula o blastocisto.

En un ejemplo, la célula, animal o blastocisto comprende uno o más ARNg o una secuencia de nucleótidos expresable que codifica un ARNg o una pluralidad de secuencias de nucleótidos expresables que codifican cada una un ARNg diferente.

La divulgación proporciona el uso de la célula, animal o blastocisto en un método según cualquier configuración, aspecto, realización o ejemplo.

Un aspecto proporciona un anticuerpo producido por el método de la divulgación, opcionalmente para su uso en medicina, por ejemplo, para tratar y/o prevenir (tal como en un método de tratamiento y/o prevención) una afección médica o enfermedad en un paciente, por ejemplo, un ser humano.

Un aspecto proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de la divulgación, opcionalmente en donde la secuencia de nucleótidos es parte de un vector. Los vectores adecuados serán fácilmente evidentes para el experto, por ejemplo, un vector de expresión de anticuerpos convencional que comprende la secuencia de nucleótidos juntos en un enlace operativo con uno o más elementos de control de la expresión.

Un aspecto proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la divulgación y un diluyente, excipiente o portador, opcionalmente en donde la composición está contenida en un recipiente intravenoso (IV) (por ejemplo, y bolsa IV) o un recipiente conectado a una jeringa IV.

Un aspecto proporciona el uso del anticuerpo de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad o afección en un paciente, por ejemplo, un ser humano.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a anticuerpos humanizados y cadenas de anticuerpos producidos según la presente divulgación, tanto en forma quimérica como totalmente humanizada, y al uso de dichos anticuerpos en medicina. La divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo y un portador u otro excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las cadenas de anticuerpos que contienen secuencias humanas, tales como cadenas de anticuerpos humanos-no humanos quiméricas, se consideran humanizadas en el presente documento en virtud de la presencia de la región codificante de proteínas humanas. Se pueden producir anticuerpos completamente humanos a partir de ADN que codifica una cadena de anticuerpo quimérico de la divulgación usando técnicas estándar.

Los métodos para la generación de anticuerpos tanto monoclonales como policlonales son bien conocidos en la técnica, y la presente divulgación se refiere a anticuerpos policlonales y monoclonales de anticuerpos quiméricos o totalmente humanizados producidos en respuesta a la exposición a antígenos en vertebrados no humanos de la presente divulgación.

En un aspecto adicional, los anticuerpos quiméricos o cadenas de anticuerpos generados en la presente divulgación se pueden manipular, adecuadamente al nivel de ADN, para generar moléculas con propiedades o estructura similares a anticuerpos, tal como una región variable humana de una cadena pesada o ligera ausente de una región constante, por ejemplo, un anticuerpo de dominio; o una región variable humana con cualquier región constante de cadena pesada o ligera de la misma especie o diferente; o una región variable humana con una región constante no natural; o región variable humana junto con cualquier otro compañero de fusión. La divulgación se refiere a todos estos derivados de anticuerpos quiméricos derivados de anticuerpos quiméricos identificados según la presente divulgación.

En un aspecto adicional, la divulgación se refiere al uso de animales de la presente divulgación en el análisis de los efectos probables de fármacos y vacunas en el contexto de un repertorio de anticuerpos cuasi humanos.

La divulgación también se refiere a un método para la identificación o validación de un fármaco o vacuna, comprendiendo el método administrar la vacuna o fármaco a un mamífero de la divulgación y monitorizar una o más de: la respuesta inmunitaria, el perfil de seguridad; el efecto sobre la enfermedad.

La divulgación también se refiere a un kit que comprende un anticuerpo o derivado de anticuerpo como se divulga en el presente documento y ya sea instrucciones para el uso de dicho anticuerpo o un reactivo de laboratorio adecuado, tal como un tampón, reactivo de detección de anticuerpos.

El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la descripción descriptiva puede significar "uno", pero también es coherente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o", a menos que se indique explícitamente que se refiere únicamente a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación apoya una definición que se refiere solo a alternativas y "y/o". A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente del error para el dispositivo, el método que se emplea para determinar el valor o la variación que existe entre los sujetos del estudio.

Como se usa en esta memoria descriptiva y reivindicación o reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de comprender, tal como "comprende" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de tener, tal como "tienen" y "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de incluir, tal como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de contención, tal como "contiene" y "contienen") son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos adicionales, no mencionados o etapas del método.

La expresión "o combinaciones de los mismos", como se usa en este documento, se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los términos enumerados que preceden la expresión. Por ejemplo, "A, B, C o combinaciones de los mismos" pretende incluir al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC y, si el orden es importante en un contexto particular, también BA, CA, CB, ACB, CBA, BCA, BAC o CAB. Siguiendo con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más elementos o términos, tales como BB, AAA, AAB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, y así sucesivamente. Los expertos en la materia entenderán que normalmente no hay límite sobre el número de elementos o términos en cualquier combinación, salvo que sea evidente de otro modo a partir del contexto.

Cualquier parte de esta divulgación se puede leer en combinación con cualquier otra parte de la divulgación, a menos que sea evidente de otro modo a partir del contexto.

Todas las composiciones y/o métodos divulgados y reivindicados en el presente documento pueden realizarse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación.

Referencias

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7. Haurwitz RE, Sternberg SH, Doudna JA: Csy4 relies on an unusual catalytic dyad to position and cleave CRISPR RNA. EMBO J 2012, 31 (12):2824-2832.

8. Yusa K, Zhou L, Li MA, Bradley A, Craig NL: A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.

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9. Qiao J, Oumard A, Wegloehner W, Bode J: Novel tag-and-exchange (RMCE) strategies generate master cell clones with predictable and stable transgene expression properties. J Mol Biol 2009, 390(4):579-594.

10. Oumard A, Qiao J, Jostock T, Li J, Bode J: Recommended Method for Chromosome Exploitation: RMCE-based Cassette-exchange Systems in Animal Cell Biotechnology. Cytotechnology 2006, 50(1-3) :93-108.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Modificaciones precisas del ADN

(a) Uso de nickasa para HDR

Se ha informado que la nucleasa Cas9 se puede convertir en una nickasa a través de la sustitución de un aspartato por alanina (D10A) en el dominio RuvCI de SpCas9 (Conget al.).Cabe señalar que las roturas monocatenarias de ADN se reparan preferentemente a través de la vía HDR. La nickasa Cas9 D10A, cuando se encuentra en un complejo con ARNcr:ARNcrtra maduro, puede inducir específicamente la formación de mellas del ADN en una ubicación precisa. Con esto en mente, los presentes inventores proponen extender la aplicación del sistema CRISPR/Cas creando una mella en una ubicación dada en un genoma usando nickasa Cas9 D10A y luego explotando la vía HDR para insertar un fragmento de ADN monocatenario (endógeno o exógeno) que contendrá homología de ADN (normalmente para recombinación, 50 pb es suficiente para una recombinación eficiente) flanqueando la unión de ADN mellada para introducir e insertar un ADN dado en una ubicación de precisión; se usará homología de tamaño similar con el presente ejemplo (Figura 1A). El ARN guía (ARNg) se diseñará individualmente por secuencia protoespaciadora diana o se incorporará en una única matriz de CRISPR que codifica para 2 o más secuencias espaciadoras que permiten la edición del genoma múltiplex a partir de una única matriz de CRISPR.

(b) Ejemplo de eliminación precisa del ADN

Para demostrar una eliminación precisa usando Cas9 en asociación con ARNg y sin un vector de direccionamiento o ADN de donante, los presentes inventores diseñaron dos ARNg dentro de un gen, que estaban separados entre 55 pb. Los dos ARNg estaban en cadenas de ADN opuestas como se muestra en la Figura 9.

Las células ES de ratón se transfectaron con nucleasa Cas9 humana y los dos ARNg. El procedimiento de transfección se llevó a cabo como se detalla anteriormente, pero los clones resultantes no se seleccionaron. Los clones ES transfectados se genotiparon usando un par de oligonucleótidos que abarcaba los dos ARNg (cebador 1 y 2) para detectar una eliminación específica de 55 pb (Figura 10).

La mayoría de los clones no mostraron la eliminación específica de 55 pb, sin embargo, se identificaron claramente clones que contenían la eliminación definida. De los 384 clones analizados, se descubrió que aproximadamente el 4 % de los clones contenía la eliminación específica de 55 pb. Nota: No se muestran todos los datos de genotipado. Los clones que contenían la eliminación específica de 55 pb se analizaron adicionalmente secuenciando los productos de PCR como confirmación final (datos no mostrados). Además, cuando los presentes inventores vieron la eliminación específica, observaron que ambos alelos contenían la eliminación específica. Estos datos confirmaron que cuando se usan dos ARNg, se puede realizar una eliminación precisa y específica sin el requisito de un vector de direccionamiento. Sin embargo, podemos suponer que la eficiencia de la eliminación definida puede mejorarse enormemente usando la combinación de dos ARNg junto con un vector de direccionamiento o un fragmento de ADN donante que contiene brazos de homología que flanquean la región de eliminación deseada.

(c) Metodología alternativa para la eliminación del ADN

En una configuración separada, se pueden diseñar dos ARNg o una única matriz de CRISPR que codifica la secuencia espaciadora múltiple que flanquea un gen o una región de interés y con la asociación de la nickasa Cas9 D10A, se pueden inducir dos roturas monocatenarias separadas. Esto, en asociación con un fragmento de ADN monocatenario que contiene homología de ADN con la unión de punto de ruptura 5' de la primera mella de ADN y homología de ADN con la unión de punto de ruptura 3' de la segunda mella, la región entre los dos mellas de ADN monocatenario puede eliminarse con precisión (Figura 2A).

(d) Metodología alternativa para la sustitución del ADN

En otra configuración, se pueden diseñar dos ARNg separados o una matriz de CRISPR única múltiplex flanqueando un gen o una región de interés y con la asociación de la nickasa Cas9 D10A se pueden inducir dos roturas monocatenarias separadas. En este caso, el fragmento de ADN monocatenario intruso (o ADN bicatenario) puede contener secuencia de ADN de fuente endógena o exógena que contiene una secuencia para un gen conocido, elemento regulador promotor, etc. Este fragmento de ADN monocatenario (o ADN bicatenario) se puede reunir para reemplazar la región de ADN de interés flanqueada por la mella de ADN proveyéndola de homología de ADN de la región 5' de la primera mella y la región 3' de la segunda mella (Figura 3A). Debido a la alta eficiencia del sistema CRISPR/Cas para escindir el ADN, la estrategia propuesta anteriormente no requerirá la introducción de ningún marcador de selección, creando así una edición exacta del genoma sin fisuras de una manera precisa y definida. Como una opción, se puede incluir un marcador de selección flanqueado por LTR de PiggyBac para permitir la selección directa de clones modificados correctamente. Una vez se han identificado los clones correctos, el marcador de selección se puede eliminar convenientemente a través de la expresión de la transposasa hiperactiva piggyBac (Yusa K., Zhou L., Li M.A., Bradley A., Craig N.L.: A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108(4):1531-1536). Además, los enfoques anteriores se pueden aplicar a células ES, células de mamífero, células de levadura, células bacterianas, células de planta, así como realizar directamente en rigotos para acelerar el proceso de ingeniería genómica homocigótica en tiempo récord. También sería posible multiplexar este sistema para generar múltiples inserciones simultáneas de ADN (KI), eliminaciones (KO) y la eliminación e inserción secuenciales (KO ^ KI).

(e) Ejemplo de la eliminación e inserción de ADN en una ubicación predefinida (KO ^ m

Para demostrar que una región de ADN deseada se puede manipular usando Cas9, se seleccionó un ARN guía único (ARNgu) en una región deseada (exón 1 del gen A) Figura 7. También se construyó un vector de direccionamiento, que contenía brazos de homología de aproximadamente 300 pb (HA 5' y 3') flanqueando el ARNg. Los brazos de homología se hibridarán exactamente en la región definida y, por lo tanto, eliminarán una región de 50 pb, que está destinada a la eliminación. El vector de direccionamiento también permite la inserción de cualquier secuencia de ADN de interés. En este experimento preliminar de eficacia, los presentes inventores incluyeron un casete de PGK-puromicina de aproximadamente 1,6 kb. El ARN guía (0,5 ug) junto con el vector de direccionamiento (1 ug) y el vector de nucleasa Cas9 (1 ug) se transfectaron en células ES y se seleccionaron 96 clones después de la selección en puromicina usando el protocolo descrito anteriormente. Nota. Como prueba para la eficiencia de direccionamiento, se comparó el vector de direccionamiento lineal frente al circular. También como control negativo, se hizo el mismo experimento sin el uso de vector Cas9 para comparar la eficiencia de direccionamiento mediante recombinación homóloga con y sin expresión de Cas9.

Todos los clones seleccionados fueron resistentes a puromicina y los 96 clones seleccionados de cada una de las cuatro transfecciones se genotiparon usando el par de oligonucleótidos HAP341/HAP334. Los clones dirigidos correctamente produjeron un producto de PCR de 880 pb. Los datos de genotipado resultantes se muestran en la Figura 8.

A partir de los datos de genotipado de este experimento, se puede ver que la rotura de ADN bicatenario mediada por Cas9 mejora grandemente la eficiencia de recombinación homóloga del vector de direccionamiento, ya que el 62 % y el 49 % de los clones que usaban el vector de direccionamiento circular o lineal, respectivamente, estaban dirigidos correctamente frente a sólo un clon diana usando un vector de direccionamiento circular cuando no se usó Cas9. También se puede ver a partir de estos datos que el vector de direccionamiento circular produjo una eficiencia de direccionamiento ligeramente mejor que cuando se usó un vector lineal, pero no se puede extraer una conclusión general de este experimento único, pero decir que el vector de direccionamiento circular y lineal produjo una eficiencia de direccionamiento enormemente mejorada cuando se asoció con Cas9 y un ARN guía específico. Este experimento también demostró que el uso de Cas9 para crear una rotura de ADN definida se puede usar para eliminar una región de ADN definida y posteriormente insertar cualquier fragmento de ADN de interés

Ejemplo 2: Reciclaje de PAM para inserciones o eliminaciones secuenciales

En ciertas configuraciones puede ser útil editar un genoma mediante paseo cromosómico. Usando cualquiera de los tres ejemplos brevemente expuestos anteriormente, podría ser posible llevar a cabo la edición secuencial del genoma de manera gradual, por lo que la secuencia de PAM usada en una ronda previa de edición del genoma mediada por CRISPR/Cas, puede reusarse para llevar a cabo múltiples rondas de edición del genoma, tales como eliminaciones, inserciones o la eliminación e inserción simultáneas. En la Figura 4A se muestra un ejemplo de eliminación secuencial mediante el cual se recicla la secuencia de PAM de la etapa previa de edición del genoma. Usando el enfoque de reciclaje de PAM, es posible llevar a cabo inserciones secuenciales, así como la eliminación e inserción simultáneas secuenciales.

La secuencia de PAM se recicló reintroduciéndola mediante recombinación homóloga y como parte del brazo de homología. La secuencia de PAM puede ir opcionalmente acompañada de una secuencia de ARN guía única que crea un sitio novedoso dentro del genoma hospedador para una ronda adicional de edición del genoma.

Ejemplo 3: Rápida inserción de sitios Lox usando el sistema CRISPR/Cas

La eficiencia de direccionamiento usando métodos de recombinación homóloga convencionales en células ES es baja. En una entorno diferente, el sistema CRISPR/Cas se puede usar para introducir rápida y eficientemente sitios lox u otra secuencia de reconocimiento de recombinasa, tal como Frt, en una ubicación definida para actuar como una plataforma de aterrizaje para la edición del genoma usando intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE) (Qiao J., Oumard A., Wegloehner W., Bode J.: Novel tag-and-exchange (RMCE) strategies generate master cell clones with predictable and stable transgene expression properties. J. Mol. Biol., 2009, 390(4):579-594; y OumardA.,Qiao J., Jostock T., Li J., Bode J.: Recommended Method for Chromosome Exploitation: Cassette-exchange Systems in Animal Cell Biotechnology., Cytotechnology, 2006, 50(1-3):93-108). Una vez que los sitios lox se introducen en el genoma, la inversión, la eliminación o el intercambio de casete para eliminar e introducir fragmentos de ADN que varían en tamaño en este sitio se pueden realizar de manera eficiente a través de la expresión de recombinasa Cre. En la Figura 5A se muestra un ejemplo de inserción de lox mediada por CRISPR/Cas seguida de RMCE. La etapa de RMCE se puede usar para invertir la región flanqueada por el sitio lox o para eliminar esta región, así como para eliminar e insertar simultáneamente ADN de interés en esta región. Además, la etapa de RMCE se puede adaptar para llevar a cabo múltiples rondas secuenciales de RMCE (sRMCE).

Ejemplo 4A:

Se hace referencia a la Figura 6A. Un transposón piggyBac que alberga un gen loxP impulsado por el promotorPGK/neoR flanqueado por lox mutante se dirige a un genoma de células ES mediante recombinación homóloga estándar. Los clones diana se pueden seleccionar mediante G418. Esto proporciona una plataforma de aterrizaje para el siguiente intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE). Dicho clon ES se puede usar como células parentales para cualquier modificación adicional. Se inserta un casete que contiene los genes loxP/PuroA TK-T2A-Cas9sin promotor flanqueado por lox mutante y de ARN guía (ARNg) impulsado por el promotor de la polimerasa III U6 en la plataforma de aterrizaje a través de expresión de cre transitoria. Los genes de ARNg pueden ser uno o más de uno que se dirigen al mismo gen o genes diferentes. Los clones insertados se pueden seleccionar con puromicina y confirmar mediante PCR de unión. Durante la selección, la expresión de Cas9 y ARNg del casete insertado da como resultado un direccionamiento o modificación génica más eficiente de lo que la expresión transitoria de Cas9 y ARNg puede lograr. Después de la selección de 4-6 días, todo el casete modificado se corta mediante la expresión transitoria de la transposasapiggyBac (PBase).Los clones de células ES finales no contendrían ninguna secuencia deCas9o ARNg. Los clones con genes modificados homocigóticos se confirmarían mediante PCR y secuencia.

La característica principal de la presente invención es controlar la expresión deCas9y ARNg en cierto tiempo para que sea suficiente para generar tasas de direccionamiento eficientes.

Ejemplo 4B: Expresión de Cas9 de copia única

Como se detalla en el Ejemplo 6, para demostrar la expresión única y estable de Cas9 desde dentro del cromosoma de una célula, los presentes inventores dirigieron un vector de plataforma de aterrizaje a alelo Rosa26 en el cromosoma 6. Se usaron brazos de homología de ADN para dirigirse al vector de la plataforma de aterrizaje entre los exones 2 y 3 de Rosa26. El vector de la plataforma de aterrizaje se dirigió a células ES usando el procedimiento descrito anteriormente. Los clones ES transfectados se seleccionaron en G418 y se genotiparon para el direccionamiento correcto (Figura 11) mediante PCR amplificando las uniones de brazos de homología de 5' y 3'.

El direccionamiento de la plataforma de aterrizaje produjo muchos clones ES dirigidos. Se usó una selección de los clones diana para insertar un casete de ADN que contenía nucleasa Cas9 unida a Puro-delta-tk a través de una secuencia de T2A en la plataforma de aterrizaje diana a través de RMCE, que implicaba la expresión de recombinasa Cre. Los sitios IoxP e Io2272 correspondientes dentro de la plataforma de aterrizaje y el vector entrante garantizaron una orientación correcta de la inserción. Dado que la plataforma de aterrizaje contenía un promotor PGK sin gen, se seleccionaron positivamente en puromicina la inserción correcta del ADN del vector entrante que contenía Cas9, la expresión activada de puromicina y, por lo tanto, los clones. El direccionamiento no específico de este casete de ADN no dará clones resistentes a la puromicina debido a la ausencia de un promotor que impulse la transcripción del gen de puromicina sin promotor en el casete de ADN insertado. El vector Cas9 inicial insertado en la plataforma de aterrizaje no contenía ninguna secuencia de ARN guía. Los clones ES resistentes a la puromicina se genotiparon mediante PCR para la inserción correcta de Cas9 (Figura 12).

Como era de esperar debido a la selección positiva, la mayoría de los clones genotipados para la inserción del vector Cas9 se dirigieron correctamente a través de RMCE en función de los resultados de genotipado por PCR. Se usaron dos de los clones correctos (KHK1.6 Z2-24-27 y KHK1.10Z2-25-4 denominados clones Z positivos) que ahora contienen Cas9 de copia única integrada en el gen Rosa26 como una única copia para probar si la expresión de Cas9 era suficiente para inducir la edición del genoma mediada por Cas9. En los dos clones Z positivos, el ARN guía contra un gen denominado el gen Y se transfectó usando el procedimiento descrito anteriormente. Después de la transfección y expansión de los clones ES resultantes, se aislaron 36 clones individuales de cada transfección y se analizaron inicialmente mediante PCR usando oligonucleótidos que flanqueaban el ARN guía (Figura 13).

La mayoría de los clones produjeron un producto de PCR de tamaño equivalente a la PCR de control positivo donde se usó ADN de células ES AB2.1 de ratón. Sin embargo, se puede ver claramente que algunos clones produjeron un producto de PCR claramente más pequeño que el del control positivo, lo que indica que estos clones contienen una eliminación significativa a través de indel. Para verificar esto y comprobar si el resto de los productos de PCR, aunque de tamaño similar al control positivo, no contenían indeles, todos los productos de PCR se purificaron usando el kit de extracción de gel Qiagen y se analizaron mediante secuenciación. Los datos de secuenciación confirmaron una eliminación significativa para aquellos productos de PCR que produjeron productos más cortos que el control positivo. También destacó, algunos de los otros clones con un tamaño de producto de PCR similar al control positivo contenían indeles, que incluían diversas combinaciones de inserción y eliminación (no se muestran datos de secuenciación). De los clones analizados, el 18 % de ellos contenían un indel. Estos datos demostraron claramente que se puede usar una sola copia de expresión de Cas9 para llevar a cabo la edición del genoma y estos clones se pueden usar ahora como células hospedadoras de Cas9 para llevar a cabo una multitud de edición del genoma. Estos clones ES se están usando ahora para generar líneas transgénicas de ratón mediante las cuales se pueden llevar a cabo una edición del genoma en una sola etapa inyectando únicamente ARNm guía directamente en cigotos sin el requisito de transcribir el ARNm de Cas9 para simplificar el protocolo de edición del genoma en una sola etapa.

Ejemplo 5(A): Metodología:

A: Reconstrucción del sistema vectorial CRISPR/Cas (nucleasa)

El sistema de edición del genoma CRISPR/Cas se ha reconstruidoin vitroy se ha ejemplificado en células madre embrionarias de ratón usando el vector pX330 que contiene S.pyogeneshumanizado (hSpCsn1) (Conget al.).El sistema CRISPR/Cas se puede reconstruir como se describe en Conget al.usando cadenas de ADN sintéticas y ensamblaje de ADN. En el presente ejemplo, todo el ensamblaje de ADN constituiría un fragmento de 6006 pb que contenía homología de 45 pb con el vector pBlueScript kS+ 5' con respecto al sitio de corte de EcoRV, promotor U6 humano, dos sitios de restricción de BbsI para la clonación en la secuencia espaciadora que se fusiona con una secuencia de ARN guiada quimérica, promotor de beta-actina de pollo con 3 FLAG, señal de localización nuclear (NLS) seguida de hSpCsn1 y otra secuencia NLS, poliA de bGH, secuencia de repetición terminal invertida y finalmente otra homología de 45 pb con pBlueScript KS+ 3' con respecto al sitio de corte de EcoRV. Este tramo de ADN de 6006 pb se sintetizará como 7 fragmentos de ADN individuales donde cada fragmento tendrá un solapamiento de 45 pb con el fragmento de ADN adyacente para permitir el ensamblaje de ADN. La secuencia de ADN de estos fragmentos se muestra a continuación en el orden de ensamblaje.

Fragmento 1A (1340 pb)

GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCT

TCAT ATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAG AGATAATTGG AATTAATTTG ACTGTAAACACAAAG A

TATTAGTACAAAATACGTG ACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTT

TAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGA

AAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTA

GTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCI l i l i IGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT

AAAATAAGGCTAGTCCGI I I I IAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGGTACCCGTTA

CATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAAC

GCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACAT

CAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTGTG

CCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCAT

GGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCrTCACrCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTAT TTATTTA l i l i l í AATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGG

GGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGC

GCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCG

GCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGC

CCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTA

ATTAGCTGAGCAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGG

AGCACCTGCCTGAAATCACI I I I I I ICAGGTTGGACCGGTGCCACCATGGACTATAAGGACCACGACGGA

GACTACAAGGATCATGATATT (SEQ ID NO:7)

Fragmento 2 (852 pb)

ATGGACTATAAGGACCACGACGG AGACTACAAGGATCATGATATTGATTAC AAAG ACG ATGACGATAAG A TGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCG GCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGA AATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCG ACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGA ACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACA GACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCG TGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCA CCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCC TGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCT ACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCA GACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGT TCGGAAACCTGATTGCCCTGAGC (SEQ ID NO:8)

Fragmento 3 (920 pb) GGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGAAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAG AGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGAC AACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCC ATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCA AGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGA AGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCC AGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGA AGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCC ACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGG AAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCA GATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACA AGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGG TGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGT GACCGAGGGAATGAGAAAGCC (SEQ ID NO:9)

Fragmento 4 (920 pb)

CGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAA AAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTA CTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTG GGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACA TTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAA CCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCA GGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGA AGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGA CATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAG CCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCG GCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAA CAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACA CCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATAT GTACGTGGACCAGGAACTGG (SEQ ID NO: 10)

Fragmento 5 (920 pb)

ACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACG ATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAA GCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACT GGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAG GCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAA AGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGG AAGTGAAAGTGATCACCCrGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGT GCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATC AAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATG ATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACT TTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCG AAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCC AAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGA GGAACAGCGATAAGCTGATC (SEQ ID NO: 11)

Fragmento 6 (789 pb)

AGCAAAGAGTCTATCCTGCCCMGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCT

AAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAG

GGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTC

GAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGC

TGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGC

AGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAA

GCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGA

CGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGT

GCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTT

ACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACA

CCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGA

TCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGAC (SEQ ID NO: 12)

Fragmento 7 (535 pb)

GGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAG

GCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGTAAGAATTCCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAG

TTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTC

CTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGG

GTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGAGAATAGCAGGCATGCTGGGGAGCGGCCGCAGG

AACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAA

AGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAG

GGGCGCCTATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCC (SEQ ID NO: 13)

Para reconstruir el sistema CRISPR/Cas descrito en Conget al.,se ensamblarán los fragmentos de ADN anteriores además del vector pBlueScript KS+ linealizado con EcoRV usando el kit de ensamblaje Gibson (n.° de cat. de NEB E5510S). Como enfoque alternativo, el fragmento de 6006 pb se puede ensamblar mediante PCR de ensamblaje mezclando la relación molar de los fragmentos de ADN individuales juntos y usando la mezcla de ADN como molde de PCR. A continuación, el producto de PCR ensamblado se puede clonar directamente en un vector pBlueScript o un sistema de vector de clonación estándar, tal como un kit de clonación TOPO TA (Invitrogen).

B: Reconstrucción del sistema de vectores CRISPR/Cas (nickasa D10A)

La versión de nickasa D10A del sistema CRISPR/Cas se puede reconstruir convenientemente ensamblando los fragmentos anteriores donde el fragmento 2 se reemplaza por el fragmento 2A que contiene la sustitución D10A (véase la secuencia a continuación).

Fragmento 2A (852 pb)

ATGGACTATAAGGACCACGACGG AGACTACAAGGATCATGATATTGATTAC AMG ACG ATGACGATAAG A TGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCG GCCTGgccATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGA AATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCG ACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGA ACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACA GACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCG TGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCA CCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCC TGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCT ACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCA GACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGT TCGGAAACCTGATTGCCCTGAGC (SEQ ID NO: 14)

El aspartato sustituido por alanina se resalta en negrita y subrayado.

C: Clonación de secuencia (espaciadora) diana

La secuencia espaciadora diana se puede clonar en el sistema vectorial CRISPR/Cas anterior a través de los sitios de restricción de BbsI ubicados aguas arriba de la secuencia de ARN guiado quimérico. La secuencia espaciadora se puede ordenar como pares de oligonucleótidos e hibridar junto con nucleótidos protuberantes como se muestra a continuación para permitir la clonación directa en un vector CRISPR/Cas linealizado con BbsI usando protocolos de biología molecular estándar.

Secuencia de un par de oligonucleótidos de ejemplo con secuencia espaciadora:

5'- CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3' (SEQ ID NO: 15)

3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5' (SEQ ID NO: 16)

Se requiere que la secuencia de nucleótidos protuberantes de 4 pb subrayada se incluya en los oligonucleótidos espaciadores para facilitar la clonación en el sitio de restricción de BbsI en el vector CRISPR/Cas. Usando este enfoque, cualquier secuencia espaciadora puede clonarse convenientemente en el vector CRISPR/Cas.

D: Reconstrucción del sistema CRISPR/Cas para la generación en una sola etapa de animales transgénicos

Con el fin de reconstituir un sistema CRISPR/Cas para la generación en una sola etapa de animal transgénico como se describe en Wanget al.(Wang H., Yang H., Shivalila C.S., Dawlaty M.M., Cheng A.W., Zhang F., Jaenisch R.: Generación en una sola etapa de ratones que llevan mutaciones en múltiples genes mediante ingeniería genómica mediada por CRISPR/Cas., Cell, 2013, 153(4):910-918) donde se usa inyección directa de embriones, el sistema vectorial CRISPR/Cas detallado anteriormente necesita modificarse para incorporar un promotor de polimerasa T7 a la secuencia codificante de Cas9. Además, el ARNg debe eliminarse y sintetizarse por separado hibridando oligonucleótidos o producirse sintéticamente (véase a continuación un ejemplo de secuencia espaciadora T7 fusionada con una secuencia de ARN guiada quimérica - ARNg de T7). Nota, idealmente la secuencia espaciadora se diseñará en una región única de un cromosoma dado para minimizar el efecto inespecífico y también la respectiva secuencia genómica del protoespaciador debe tener un PAM en el extremo 3'.

Secuencia de ARNg de T7 de ejemploTTAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT AAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC l i l i l í (SEQ ID NO: 17)

Los 20 pb subrayados de N representan la secuencia espaciadora para un ADN diana dado.

Para reconstruir el sistema CRISPR/Cas de una sola etapa, los fragmentos de ADN detallados anteriormente (fragmentos 2, 3, 4, 5, 6 y 7) se pueden ensamblar juntos donde el fragmento 1A (que contiene 45 pb de homología con el vector pBlueScript KS+ 5' con respecto al sitio de restricción de EcoRV, promotor de U6 humano, sitios de restricción de BbsI, secuencia de ARN guiado quimérico y promotor de b-actina de pollo) se reemplaza con el fragmento 1, que contiene solo la homología de 45 pb con el vector pBlueScript KS+ y la secuencia de ADN para el promotor de polimerasa T7 con la homología de 45 pb con el fragmento 2. Esto creará la versión nucleasa del sistema CRISPR/Cas para la generación en una sola etapa de animales transgénicos. Para crear la versión de nickasa, el fragmento 2 se puede reemplazar con el fragmento 2A como se detalla anteriormente y a continuación los fragmentos 1, 2A, 3, 4, 5, 6 y 7 se pueden ensamblar juntos ya sea mediante el ensamblaje de Gibson o mediante PCR de ensamblaje.

Fragmento 1 (111 pb)

GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCG ATAAGCTTGATAATACG ACTC ACTATAGGGAGAAT

GGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGATATT (SEQ ID NO: 18)

E Preparación de fragmentos de oligonucleótido/ADN para la reparación mediada por HDR

Los oligonucleótidos de ADN que varían a partir de 15 pb en adelante en exceso de >125 pb se sintetizarán a través del Servicio de Síntesis de Oligonucleótidos Personalizado de Sigma. Los oligonucleótidos pueden contener cualquier secuencia, tal como una mutación definida, sitios de restricción introducidos o una secuencia de interés que incluye secuencia de reconocimiento de recombinación tal como loxP o derivados de la misma, Frt y derivados de la misma o PiggyBac LTR o cualquier otro elemento transposón o elementos reguladores, incluidos potenciadores, secuencia promotora, gen indicador, mercadores de selección y etiquetas. El diseño de oligonucleótidos incorporará homología de ADN a la región donde Cas9 media en la ruptura de ADN bicatenario o mella de ADN. El tamaño de la homología variará a partir de unos pocos pares de bases (2-5 pb) en adelante y en exceso de 80 pb. Se prepararán fragmentos de ADN más grandes (>100 pb que varían hasta varias kilobases) ya sea sintéticamente (GeneArt) o mediante PCR. El fragmento de ADN se sintetizará con o sin NLS flanqueadas o solo con una única NLS y con o sin un promotor (por ejemplo, promotor de polimerasa T7). El ADN se puede preparar como un fragmento de ADN monocatenario usando el método de secuencia de ADN diana biotinilado de captura (Invitrogen: Dynabeads M-270 Streptavidin ) o cualquier otra metodología estándar y establecida de preparación de ADN monocatenario. El ADN monocatenario se puede preparar para la microinyección mediante IVT como se ha descrito anteriormente y el ARNm coinyectado con ARNm y ARNg de Cas9. El fragmento de ADN también se puede coinyectar como un fragmento de ADN bicatenario. El fragmento de ADN estará flanqueado por homología de ADN al sitio donde Cas9 media la ruptura de ADN bicatenario o mella de ADN. La homología de ADN puede variar desde unos pocos pares de bases (2-5 pb) y hasta o en exceso de varias kilobases. El fragmento de ADN se puede usar para introducir cualquier ADN endógeno o exógeno.

La reparación mediada por HDR también se puede realizar en células ES después de la escisión del ADN mediada por CRISPR/Cas. El oligonucleótido donante o fragmento de ADN mencionado anteriormente se puede cotransfectar en células ES junto con el vector de expresión CRISPR/Cas.

F: Producción de ARNm y ARNg de Cas9

El vector que contiene el promotor de polimerasa T7 con la región codificante de Cas9 humanizado se amplificará por PCR usando oligonucleótidos Cas9-F y Cas9-R. El producto de PCR T7-Cas9 se puede extraer en gel y purificar el ADN usando el kit de extracción en gel Qiagen. El ADN de T7-Cas9 purificado se usará para la transcripciónin vitro(TIV) usando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra (n.° de cat. de Life Technologies AM1345). El vector que contiene ARNg de T7 se puede amplificar por PCR usando oligonucleótidos ARNg-F y ARNg-R y, una vez más, se purifican los productos de PCR en gel. La IVT del ARNg de T7 se llevará a cabo usando el kit MEGAshortscript T7 (n.° de cat. de Life Technologies AM1354) y el ARNg se purifica usando el kit MEGAclear (n.° de cat. de Life Technologies AM1908) y se eluye en agua libre de RNasa.

Ejemplo 5B: Generación de una etapa de animales transgénicos

A: Procedimiento de transfección de células ES

Se usarán células madre embrionarias de ratón AB2.1 y derivados de esta línea para transfectar Cas9 con codones optimizados de mamífero y ARNgu a partir de un único vector de expresión o de vectores separados si se desea. Las células ES AB2.1 se cultivarán en una capa alimentadora de PSNL76/7/4 MEF en M-15: KnockOut DMEM (Gibco, sin piruvato, alta glucosa, 15 % de FBS, 1xGPS, 1xBME) con técnicas de cultivo de células ES estándar. La transfección del vector de expresión de CRISPR/Cas junto con la adición opcional de un oligonucleótido donante o fragmento de ADN se realizará mediante electroporación usando el protocolo Amaxa 4D-Nucleofector® (Lonza). Un plásmido que expresa PGK-Puro también se cotransfectará opcionalmente para promover la eficiencia de transfección.

En un método, después de la transfección, las células ES se colocarán de nuevo en placas alimentadoras y se añadirá puromicina (2 pg/ml) 72 horas después de la transfección durante 7 días después de los cuales las colonias se recogerán y genotiparán mediante PCR. Las colonias positivas se cultivarán y expandirán adicionalmente en la capa alimentadora y los marcadores de selección cuando sea necesario se cortarán usando un sistema de transposon PiggyBac. Esto se hará mediante electroporación de células ES con un plásmido que contiene HyPbase usando el protocolo Amaxa 4D-Nucleofector® (Lonza). La célula ES se colocará de nuevo en placas alimentadoras. Las células ES se someterán a pases 2-3 días después de la transfección y después de 2-3 días adicionales, las células ES se sembrarán en placas en diferentes densidades de células (1: 10, 1:20, 1:100 y 1:300) y la selección de FIAU (2 pg/ml) se añadirá 24 horas después de la resiembra. Las colonias se recogerán y analizarán mediante genotipado por PCR después de 7-10 días en medios de selección. Los clones positivos se cultivarán y expandirán adicionalmente en la capa alimentadora y se enviarán para microinyección de cigotos (blastocistos).

En un método alternativo, 8 horas antes de la transfección, las células ES se siembran a una densidad de 0,5x106 células usando M-15 KnockOut DMEM libre de antibióticos (Gibco, sin piruvato, alta glucosa, 15 % de FBS, 1xL-glutamina, 1xBME) en placas alimentadoras 6w. La transfección transitoria se realiza usando el reactivo Lipofectamine® LTX con el reactivo LUS™ (Invitrogen™) mediante protocolo estándar. Después del tiempo de incubación, los reactivos de transfección se transfieran a placas alimentadoras (cultivadas en medios libres de antibióticos), el medio (M-15) no se cambiará en estas placas durante al menos 24 horas después de la transfección.

48 horas después de la transfección, las células ES se tripsinizan en una única suspensión celular y se lleva a cabo un recuento celular y las células se siembran en placa en diferentes densidades celulares que varían de 100-5000 células por placa alimentadora de 10 cm. 24 horas después de la resiembra, la selección con Puro a 2 pg/ml (diclorhidrato de Puromicina de polvo deStreptomyces alboniger,Sigma P8833) se aplica a las células durante 4 días, después de lo cual las células se cultivan de nuevo en M-15. Las colonias se recogen 10-13 días después de la transfección.

Método 5C: Microinyección de cigotos de ratón - Método 1

Materiales y reactivos:

• M2 (Sigma M7167)

• Embryo Max KSOM (medio especializado MR-020P-F)

• Hialuronidasa (Sigma H4272)

• Aceite mineral (Sigma, M-8410)

Posibles cepas donantes:

• S3F/S3F; KF3/KF3

• S3F/S3F; K4/K4

• S7F/S7F

• K5F/K5F

Preparación de cigotos y microinyección:

El protocolo es como se describe en: A. Nagy et al. Manipulating the Mouse Embryo 3.a edición. Capítulo 7, Protocolos 7-1,7-6, 7-10, 7-11. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

En resumen:

1. Los cigotos se obtienen de ratones hembra superovulados E0,5 dpc (día después del coito).

2. Los cigotos se incuban en hialuronidasa para dispersar las células del cúmulo.

3. Los cigotos se recogen y se transfieren a varias gotas de medio M2 para enjuagar la disolución de hialuronidasa y los desechos. Los cigotos se colocan en medio KSOM y se incuban a 37 °C, 5 % de CO2 hasta que sea necesario.

4. Se evalúa la calidad del cigoto y se seleccionan para inyección rigotos con morfología normal, estos se colocan en medio KSOM y se incuban a 37 °C, 5 % de CO2 hasta que sea necesario.

Configuración de microinyección:

Los procedimientos de inyección se realizan en un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti con micromanipuladores Eppendorf y un sistema de inyección Eppendorf femtojet. Se prepara un portaobjetos añadiendo una gota grande ~200 microlitros de M2 en el centro.

Microinyección:

Colocar un número adecuados de cigotos en el portaobjetos. Examinar los rigotos y seleccionar sólo aquellos con morfología normal (son visibles 2 pronúcleos distintos). Mientras se sujeta un cigoto con un pronúcleo macho lo más cercano a la pipeta de inyección, empujar cuidadosamente la pipeta de inyección a través de la zona pelúcida en el pronúcleo, aplicar presión de inyección, el pronúcleo debe hincharse visiblemente, retirar la pipeta de inyección rápidamente. El cigoto inyectado se puede colocar mientras se inyecta el resto.

Al final de la sesión de inyección, todos los cigotos inyectados viables deben colocarse en placas preparadas que contengan gotas de KSOM e incubarse hasta que estén listos para implantarse quirúrgicamente. Se incuban durante 2-3 horas antes de implantarse quirúrgicamente en hembras pseudopreñadas. Los cachorros nacerán 21 días después.

Método 5C: Microiniciación de cigotos de ratón - Método 2

Materiales y reactivos

• PMSG

• HCG

• M2 (Sigma M7167)

• Embryo Max KSOM (medio especializado MR-020P-F)

• Aceite mineral (Sigma, M-8410)

• Hiluronidasa (Sigma H 4272)

• Placas de Petri Falcon de 35 mm (Fisher 08-757-100A)

• Tijeras afiladas

• Pinzas para relojero afiladas

Preparación de ovocitos:

1. Día 0: Inyectar PMSG (5 UI) a las hembras mediante inyección i.p.

2. Día 2: Inyectar hCG (5 UI) a las hembras 48 horas después mediante inyección i.p. Emparejar las hembras con machos sementales.

3. Día 3: Revisar los tapones, sacrificar las ratonas copuladas por asfixia con CO2 o luxación cervical a 0,5 dpc a las 8.00 AM.

4. Diseccionar el abdomen, localizar el ovario y el cuerpo adiposo, diseccionar el oviducto dejando el ovario y la grasa, recortar la trompa uterina a ~1 cm, colocar en una placa de Petri de 35 mm que contenga M2 a temperatura ambiente.

5. Colocar un ovario cada vez en una placa que contiene disolución de hialuronidasa en M2 (~0,3 mg/ml) a temperatura ambiente. Ver a través de un estereoscopio a un aumento de 20x o 40x.

6. Usar un par de pinzas para agarrar el oviducto y mantenerlo en el fondo de la placa. Usar el segundo par de pinzas o una aguja de 26 g para desgarrar el oviducto cerca de donde se encuentran los cigotos (la ampolla), liberando la aglomeración de las células del cúmulo.

7. Los rigotos deben dejarse en la hialuronidasa solo durante unos minutos, después de lo cual los rigotos pueden dañarse. Si es necesario, pipetearlos arriba y abajo unas cuantas veces para ayudar a la liberación de los rigotos de las células del cúmulo.

8. Usar una pipeta bucal para recoger los rigotos y transferirlos a una placa nueva de M2, luego transferirlos a través de varias gotas de M2 para enjuagar la hialuronidasa, las células del cúmulo y los desechos. Clasificar los cigotos eliminando los que son obviamente malos (fragmentados, deformes, no fecundados) y colocar los buenos (dos cuerpos polares deben ser visibles y cualquiera con cuerpos polares) en gotas equilibradas de KSOM+ AA a 37 °C y 5 % de CO2, mantenerlos incubados hasta que sea necesario. Colocar aproximadamente 50 huevos por gota.

Microinyección pronuclear

1.Configuración de la microinyección:Los procedimientos de inyección se realizan en un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti con micromanipuladores de Eppendorf. Preparar una placa de Petri de 60 mm para colocar los rigotos inyectados. Pipetear cuatro - seis gotas de 40 pl de KSOM+AA, cubrir con aceite y colocar en una incubadora con 5 % de CO2 para equilibrar. Preparar una cavidad deslizante haciendo una gran (~200 pl) gota de medio M2 en el centro del pocillo, añadir una pequeña gota de medio en el lado izquierdo del tobogán, para la pipeta de retención.

2.Microinyección:Asegurarse de que el inyector presurizado se haya encendido y esté listo para uso. Colocar un número adecuado de cigotos en el portaobjetos, no añadir más cigotos de los que se pueden inyectar en 20-30 minutos. Colocar la pipeta de retención en la gota de M2 a la izquierda del portaobjetos; se llenará usando acción capilar, una vez llenada aproximadamente hasta el hombro unirla al manipulador. Examinar cuidadosamente los rigotos, asegurándose de que dos pronúcleos sean visibles y la morfología sea buena, desechar cualquiera que parezca anormal. Para probar si la aguja de inyección está abierta, colocar la punta cerca de un cigoto, pero sin tocarlo, en el mismo plano focal. Aplicar presión usando el sistema presurizado, si el cigoto mueve la aguja está abierta, si no lo hace, la aguja está cerrada. En este caso, aplicar presión usando la función "Despejar", si la punta aún no está abierta romper manualmente la punta. "Golpear" cuidadosamente la punta de la pipeta de retención y repetir la prueba anterior, asegurándose de que la punta no se vuelva demasiado grande, si esto sucede, reemplazar la aguja y comenzar de nuevo. Colocar la punta de la pipeta de retención junto a un cigoto y succionarlo en el extremo de la pipeta aplicando presión negativa. Enfocar el microscopio para localizar los pronúcleos, el cigoto debe colocarse de tal manera que permita la inyección en el cigoto sin golpear los pronúcleos, preferiblemente con un espacio entre la zona pelúcida y el oolema. Llevar la punta de la aguja de inyección en el mismo plano focal que la zona pelúcida. Llevar la pipeta de inyección a la misma posición del eje y que la zona pelúcida, ajustar la altura de la aguja para que la punta parezca completamente nítida, sin cambiar el enfoque. Esto garantiza que la aguja se dirija al cigoto exactamente. Empujar la pipeta de inyección a través de la zona pelúcida, a través del citoplasma hacia la parte posterior del rigoto. La aguja creará una "burbuja" a través del oolema, ésta debe romperse, se verá que se rompe en el momento en el que se retire la aguja rápidamente, se verá el citoplasma moviéndose para indicar que el ARN está fluyendo de la aguja. Los gránulos citoplasmáticos que salen de los ovocitos después de la eliminación de la pipeta de inyección es una señal clara de que el cigoto se lisará pronto. En este caso, o si componentes nucleares/citoplasmáticos se adhieren a la pipeta de inyección, los ovocitos deben desecharse después de la inyección. Si el cigoto parece estar intacto y se ha inyectado con éxito, clasificarlo en un buen grupo. Elegir un nuevo cigoto para inyección. Se puede usar la misma pipeta de inyección siempre que continúe inyectando con éxito. Cambiar a una nueva pipeta de inyección si (a) no puede ver ninguna distorsión citoplasmática (b) los cigotos están lisando uno tras otro; (c) la punta de la pipeta se vuelve visiblemente "sucia" o el contenido nuclear se adhiere a la pipeta. Una vez que se hayan inyectado todos los rigotos, retirarlos y colocarlos en KSOM AA equilibrado y colocarlos en la incubadora a 37 °C durante la noche. Solo transferir aquellos rigotos que han sobrevivido a la inyección y se han cultivado a la etapa de 2 células. Abandonar los lisados, y los cigotos que no se hayan desarrollado.

3. Contar el número total inyectado y registrar los números transferidos por receptor

Resultados

Para demostrar la eficiencia de la generación en una sola etapa de ratones transgénicos, los presentes inventores usaron su vector de nucleasa T7-Cas9 para generar ARNm a través de la transcripciónin vitrodetallada anteriormente. También se produjo ARNm del ARN guía usando la transcripciónin vitrodescrita anteriormente. Antes de inyectar la mezcla de ARNm en el citoplasma, se prepararon ovocitos de ratonas usando el protocolo detallado anteriormente. Se inyectó una mezcla de ARNm que contenía 100 ng/ul de ARNm de nucleasa Cas9 y 50 ng/ul de ARNm guía mediante microinyección en el citoplasma como se detalla anteriormente. La microinyección se realiza en la etapa unicelular. Los cigotos que sobrevivieron a la inyección se cultivaron a una etapa de 2 células, que luego se transfirieron a ratones receptores.

En total, se inyectaron 107 cigotos de los cuales 49 sobrevivieron y pasaron a la etapa de 2 células. A continuación, estos se transfirieron a dos ratonas receptoras. Esto dio como resultado 19 crías de 2 camadas. La camada 1 produjo 3 machos y 6 hembras. La camada 2 produjo 4 machos y 6 hembras. Se perforaron las orejas de las crías 3 semanas después del nacimiento y se extrajo ADN. La PCR se llevó a cabo usando oligonucleótidos que flanqueaban el ARNg para detectar posibles indeles (Figura 14).

La amplificación por PCR alrededor del ARN guía y la separación de los productos de PCR en un gel de agarosa resaltó que al menos un ratón contenía un indel grande en forma de una eliminación, mientras que otros ratones parecían tener indeles más pequeños a juzgar por la nitidez del producto de PCR en el gel. Como análisis inicial en bruto, todos los productos de PCR se enviaron para secuenciación y los marcados con un asterisco (7 ratones en total, Figura 14) produjeron secuencias de mezcla alrededor del ARNg confirmando además que contenían indeles. Para confirmar esto, los productos de PCR de estos 7 ratones junto con el producto de PCR de otro ratón que no produjo una secuencia de mezcla (producto de PCR de carril 19, Figura 14) se clonaron individualmente en un vector de clonación general. De cada clonación individual, se seleccionaron 28 clones y se analizaron mediante secuenciación. La secuenciación confirmó que los 7 ratones contenían indeles y los ratones que no contenían ninguna secuencia de mezcla no contenían indeles. Los datos de secuenciación se resumen en la Tabla 3.

Los datos de secuenciación confirmaron que todos los ratones analizados contenían indeles. También sugiere que usando el protocolo de inyección de cigotos de los presentes inventores detallado anteriormente y el método de preparación de ARNm para Cas9 y ARN guía, Cas9 funciona eficientemente en una etapa temprana y hasta el punto en que las células comienzan a dividirse más allá de la etapa de 2 células a juzgar por el hecho de que en todos los ratones analizados, no se identificaron más de 3 tipos de indeles. De los 7 ratones que contenían indeles, 3 de ellos no tenían una secuencia WT detectable. El ratón hembra (KMKY6.1j) que no mostró la secuencia de mezcla del análisis de secuenciación inicial de hecho no contenía ningún indel, por lo que valida nuestro análisis de secuenciación inicial de los productos de PCR.

El ratón macho (KMKY5.1c) que no mostró secuencia WT se usó como compañero de apareamiento para las dos ratonas (KMKY5.1e y KMKY6.1e) que tampoco mostraron secuencia WT. Las crías resultantes de los dos apareamientos produjeron 14 crías en total a partir de la primera camada. Después de un análisis de secuenciación similar mediante el cual se clonaron los productos de PCR amplificados de la región alrededor del ARN guía, se analizaron clones individuales y varios clones para la presencia de indeles. Para cada ratón, se analizaron 24 clones mediante secuenciación. Los datos de secuenciación de las 14 crías confirmaron solo dos secuencias de indeles que reflejaban los dos alelos que surgieron del ratón y ratona progenitores. Estos datos demuestran inequívocamente que nuestro protocolo de edición de genomas en una sola etapa funciona de manera muy eficiente en una etapa temprana y no más allá de la etapa de 2 células, evitando así la formación de indeles mosaico complejos. Usando nuestro protocolo establecido, podemos llevar a cabo eliminaciones definidas directamente en rigotos o llevar a cabo eliminaciones definidas seguidas de inserción para acelerar el proceso de generación de ratones transgénicos a homocigosidad en tiempo récord.

Ejemplo 6:

Expresión de Cas9 de copia única en células ES

Se hace referencia a la Figura 6B.

1. Una plataforma de aterrizaje que consiste en un elemento transposón de PiggyBac con las siguientes características se dirigirá a células ES de ratón (por ejemplo, células ES derivadas de 129, tales como células ES AB2.1; Baylor College of Medicine, Texas, EE. UU.) y se seleccionará en G418. El elemento transposón PiggyBac contendrá un gen de resistencia a neomicina flanqueado por IoxP y Iox2272. También tendrá un promotor PGK sin gen. En este ejemplo, la plataforma de aterrizaje se dirigirá a la región introgénica del gen Rosa26 ubicada en el cromosoma 6, pero podría dirigirse a otra parte. El direccionamiento de esta plataforma de aterrizaje en el gen Rosa26 proporcionará una línea celular ES universal para insertar con precisión cualquier fragmento de ADN deseado, incluidos fragmentos de ADN que contienen Cas9, Cas9 mutante o cualquier otro gen de interés a través de RMCE con alta eficiencia. El direccionamiento de Rosa26 es beneficioso, ya que la construcción dirigida se insertará como una copia única (a diferencia de la integración aleatoria en otros lugares) y es poco probable que produzca un efecto fenotípico no deseado.

Nota. Esta almohadilla de aterrizaje se puede insertar en cualquier gen en cualquier cromosoma o de hecho en cualquier línea celular eucariota o de mamífero, por ejemplo, una línea celular humana, de insecto, planta, levadura, ratón, rata, conejo, roedor, cerdo, perro, gato, pescado, pollo o ave, seguida de la generación del organismo transgénico respectivo que expresa Cas9.

Locus de Rosa 26

La expresión ubicua del transgén en la célula madre embrionaria de ratón se puede lograr dirigiéndose al gen al locus ROSA26 (también conocido como: trampa génica ROSA 26 o GT(ROSA)26) mediante recombinación homóloga (Ref.

(A) y (b) a continuación). Las coordenadas genómicas para el gen C57BL/6J Rosa26 de ratón se basaron en la edición 73 de Ensemble 73 - septiembre de 2013 son: Cromosoma 6: 113,067,428 - 113,077,333; cadena inversa.

El locus de Rosa26 también se puede usar como una ubicación receptora para insertar un transgén. En nuestro ejemplo hemos usado el locus Rosa26 para insertar el vector de la plataforma de aterrizaje dirigiéndose a través de recombinación homóloga hacia la región intrónica ubicada entre los exones 2 y 3 de células madre embrionarias derivadas de la cepa 129 de ratón usando brazos de homología de aproximadamente 3,1 kb. Los brazos de homología se recuperaron recombinando a partir de un clon de BAC generado a partir de la cepa 129 de ratón. La secuencia de los brazos de homología Rosa26 usados para el direccionamiento se proporciona a continuación.

Secuencia del brazo de homología en 5' de Rosa26

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Secuencia del brazo de homología en 3' de Rosa26

CTTGGTAAATCTTTGTCCTGAGTAAGCAGTACAGTGTACAGTTTACATTTTCATTTAAAGATACATTAGCT CCCTCTACCCCCTAAGACTGACAGGCACTTTGGGGGTGGGGAGGGCTTTGGAAAATAACGCTTCCATAC ACTAAAAGAGAAATTTCTTTAATTAGGCTTGTTGGTTCCATACATCTACTGGTGTTTCTACTACTTAGTAA TATTATAATAGTCACACAAGCATCTTTGCTCTGTTTAGGTTGTATATTTATTTTAAGGCAGATGATAAAAC TGTAGATCTTAAGGGATGCTTCTGCTTCTGAGATGATACAAAGAATTTAGACCATAAAACAGTAGGTTGC ACAAGCAATAGAATATGGCCTAAAGTGTTCTGACACTTAGAAGCCAAGCAGTGTAGGCTTCTTAAGAAAT ACCATTACAATCACCTTGCTAGAAATCAAGCATTCTGGAGTGGTCAAGCAGTGTAACCTGTACTGTAAGT TACTTTTCTGCTAI I I I ICTCCCAAAGCAAGTTCTTTATGCTGATATTTCCAGTGTTAGGAACTACAAATA TTAATAAGTTGTCTTCACTCTTTTCTTTACCAAGGAGGGTCTCTTCCTTCATCTTGATCTGAAGGATGAAC AAAGGCTTGAGCAGTGCGCTTTAGAAGATAAACTGCAGCATGAAGGCCCCCGATGTTCACCCAGACTACA

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TACCAGTCTGATTCTAAAACAACCTAAAATCTTCCCACTTAAATGCTATGGGTGGTGGGTTGGAAAGTTG

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CAAACAGGGAGGTGAGTGATTTAACTCrCGTGTATAGTACCTTGGTAAAACAI MCI IGTCCTGAGTAAG

CAGTACAGCTCTGCCTGTCCCTGGTCTACAGACACGGCTCATTTCCCGAAGGCAAGCTGGATAGAGATTC

CAATTTCTCTTCTTGGATCCCATCCTATAAAAGAAGGTCAAGTTTAATCTATTGCAAAAGGTAAATAGGTA

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ACI I I I I I I I IAAACAACTGCAACTTAGCTTATTGAAGACAAACCACGAGTAGAAATCTGTCCAAGAAGCA

AGTGCTTCTCAGCCTACAATGTGGAATAGGACCATGTAATGGTACAGTGAGTGAAATGAATTATGGCATG

l i l i ICTGACTGAGAAGACAGTACAATAAAAGGTAAACTCATGGTATTTATTTAAAAAGAATCCAATTTCT

ACCI I I I ICCAAATGGCATATCTGTTACAATAATATCCACAGAAGCAGTTCTCAGTGGGAGGTTGCAGAT

ATCCCACTGAACAGCATCAATGGGCAAACCCCAGGTTGI I I I ICTGTGGAGACAAAGGTAAGATATTTCA

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CTTGATCCTCAGGGACCATGTGGTACAAGGAGAGACCTAAATCCTTCAGTTGGACTTCAATCTTCTACCC

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ACTGGTTTTCAAAGGATGTATGGTTAAGAAAATACCAGGGAAAATGAGCTTACATGTAAAAAAGTGTCTA

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GGAAGAAGAGACCCAACTCTCACTAGTTATCCTCTGACTTCCACACCATGACACAGCTCCATGGCACTCT

CAGGCCCCCACACATATACAGATATAAACAGAAACCTAATCCACCAGCCTTCAGAAGCAAAGCAATTGGA

GGATTTAAACAGGCCATGGCTACTAATAGAGATAACTGGTAGTTTAAAAGTTATGGTAATGACTTTCATG

CTTCTTTCAACTCATATTGTTCTAAATAATTAATTTGGTnTTCAAGGCAGGGTTTCTCTGTGTAGTTCTG

GCTGTCCTGGAACTCACTCTGTAGACCAGGCTGGCCTTGAACTCAGATCCATCTGCCTCTGGAATAAGGG

CACGTGCGTGCC l i l i CTAC ATAACAAAACCTATACTATAACAAAACCTATACC ATACT GTACCGTTTT GG

GAAAAGACAAAAAATAATGAACAAAAAAGGAGAAATAACATTCCAATAAAGTATGGAAATGGTAGTTAAA

TTAATTACAAATGTTTTTCAGTAAATTAGATGTGACTTCTCATACTGTTCATTTGGCTATAATGATACCAC

AAAGCACTGGGGGTGAATAATAATTCCAAGTCAGTAGGGAGAGAGACTTGAAAAGATGCAATGCAATCA

TTG AAGTTAAACTTACCCATCTTTAATCTGGCTCTTAGTCAATAGAG ATGAGATGTTATTTGCTGCTCTG

TTCACTGCCAGTGGGTTATTGTCCCCAGCAATATGGTAACAGTGAGACCACTCAGTAGCCCCCTATGAGA

CAGGAGTGTTGGTTAAACATGCCACAAGAGAAAAGGGAAAAGTCACTATGGCCAACTCTCAGTAACATG

GCAATCCGTGCCATTCATTTCCTTGCCAGAAATGTCTTCCCTGTTCTTCTGCCTACTGAACTTTCACCCAC

TAGAAATGTGGCTCCAATGTCATCCACTATGACATCAATGTCAGCGCTAGAAGCACTTTGCACACCTCTG

TTGCTGACTTAG (SEQ ID NO:24)

Referencia:

a) Pablo Perez-Pinera, David G. Ousterout, Matthew T. Brown y Charles A. Gersbach (2012) Gene targeting to the ROSA26 locus directed by engineered zinc finger nucleases. Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, N.° 8 3741-3752

b) Peter Hohenstein, Joan Slight, Der-ya Deniz Ozdemir, Sally F Burn, Rachel Berry y Nicholas D Hastie (2008) High-efficiency Rosa26 knock-in vector construction for Cre-regulated overexpression and RNAi. PathoGenetics 2008, 1:3

2. Un vector habilitado para el intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE) que contiene una puromicina-delta-tk sin promotor con fusión en el marco de T2A en el extremo carboxi seguido de la secuencia de nucleótidos de Cas9 o Cas9 mutante y una serie de sitios de restricción únicos flanqueados por IoxP y Iox2272 permitirá el direccionamiento directo de este vector a la plataforma de aterrizaje por RMCE mediado por Cre. Como es sabido, T2A permite el salto ribosómico durante la traducción. La inserción de la secuencia codificante de T2A entre dos genes da como resultado dos productos (un gen, un transcrito pero dos proteínas expresadas, en este caso el Cas9 y el marcador de selección). Los clones ES que contienen el fragmento de ADN insertado correctamente se pueden seleccionar directamente en puromicina. Este enfoque también garantiza ventajosamente la expresión de una sola copia de Cas9 como se supone para una integración aleatoria o un enfoque de expresión transitoria. La inserción del vector habilitado para RMCE en el locus deseado que contiene la plataforma de aterrizaje se puede seleccionar directamente ya que el promotor PGK en la plataforma de aterrizaje impulsará la transcripción de Puro-Delta-Tk y Cas9 sin promotor. Dado que Puro-delta-TK está en la misma unidad transcripcional que Cas9, los clones Es seleccionados en puromicina garantizarán la expresión de Cas9.

3. La estrategia anterior permite tres enfoques separados para expresar el ARNgu diseñado para alterar (mutación a través de formación, eliminación de indeles o eliminación seguida de inserción) el gen de interés.

a. La línea celular ES anterior que contiene Cas9 se puede usar para generar ratones transgénicos con Cas9 expresado constitutivamente o modificado para la expresión de Cas9 inducible o, de hecho, la expresión de Cas9 específica de tejido, por ejemplo, la expresión de Cas9 en una etapa embrionaria usando la expresión de Cas9 específica del promotor Nanog, Pou5f1 o SoxB. Dicha línea de ratón derivada que expresa Cas9 se puede usar para la edición del genoma de una manera aerodinámica, por lo que el ARNgu transcritoin vitrose puede inyectar fácilmente en embriones obtenidos de dichos ratones transgénicos. Esto mejorará la eficiencia de generación de líneas de ratón con el genotipo homocigótico deseado y, por lo tanto, reducirá drásticamente el número de animales necesarios.

b. el ARNgu se puede transfectar directamente en las células ES que expresan Cas9 y, por lo tanto, evita el requisito de clonación en el ARNgu único o múltiple habilitado para RMCE. Este enfoque permitirá insertar múltiples ARNgu en las células ES simultáneamente muy rápidamente.

c. Se pueden clonar múltiples ARNgu directamente en el sitio de clonación múltiple del vector habilitado con RMCE (es decir, usando una pluralidad de diferentes sitios de endonucleasa de restricción) para permitir la expresión de una sola copia del ARN guía. Este enfoque puede ser útil para limitar los efectos fuera de la diana particularmente relevantes para aquellos genes con alta homología de secuencia dentro del genoma.

4. Las células ES que expresan Cas9 y ARNgu se pueden seleccionar directamente en el medio que contiene puromicina. La selección en puromicina durante 4-6 días permitirá que la ubicación deseada se mute o interrumpa y la ventaja de manipular células ES es que los clones individuales se pueden analizar mediante PCR seguida de secuenciación para la mutación deseada. Solo los clones de células ES mutados correctamente se pueden procesar adicionalmente por lo que el elemento de ADN insertado introducido a través de la inserción de la plataforma de aterrizaje y la posterior inserción del vector RMCE se pueden eliminar completamente dejando la célula ES desprovista de cualquier alteración distinta de la mutación deseada inducida por la acción de Cas9 y el ARNgu. Esto se puede hacer expresando transitoriamente el transposón PBase seguido de selección en FIAU. La eliminación de la Cas9 expresada constitutivamente con solo la duración mínima de tiempo necesaria para inducir la mutación en presencia de ARNgu reducirá o eliminará la posibilidad de que Cas9 induzca mutaciones no deseadas.

5. Los clones que contienen la mutación deseada se pueden inyectar en blastocisto para generar ratones transgénicos.

Tabla 1: Conservación de PAM en repeticiones y conductores para diversos tipos de CRISPR(reproducido de Short motíf sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system F. J. M. Mojica, C. Díez-Vlllasñor, J. García-Martínez, C. Almendros Microbiology (2009), 155, 733-740}

“Los genomas se abrevian según las denominaciones de la especie o género que lleva las matrices de

CRIPS correspondientes: Mth,M. thermautotrophicus;Lino,L. monocytogems; Eco,E. coli',Pae,P.

(¡eruginosa;Spy,S. pyogenes;Xan,Xanthomonas

spp.; She,Shewanellaspp.; Ype, Ypestis;Sso, S.solfatarícus; Mse,M. sedula; Str,Streptococcusspp.; Lis,Listeríaspp. f SSe subrayan las secuencias que coinciden con PAM. 4 Secuencias conductoras proximales de matriz CRISPR representativas. Están subrayados los nucleótidos que coinciden con PAM.

Las SEQ ID NO para las secuencias de la Tabla 1 se exponen en la siguiente tabla.

[Los números de ID de genes se refieren a genes en la base de datos de genes del NCBI a septiembre de 2013; toda la información de secuencias relacionada con los ID de genes a continuación se incorpora en el presente documento como referencia para su posible uso en la presente invención]

1.Plav_0099

Proteína de la familia Csn1 de la endonucleasa asociada a CRISPR [Parvibaculum lavamentivorans DS-1] Otros alias: Plav_0099

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_009719.1 (105795..108908, complemento)

ID :5454634

SEQ ID NO: 62

2.FTN_0757

Proteína de membrana [Francisella novicida U112]

Otros alias: FTN_0757

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_008601.1 (810052..814941)

ID: 4548251

SEQ ID NO: 63

3.Cj1523c

Proteína asociada a CRISPR [Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168 = ATCC 700819] Otros alias: Cj1523c

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_002163.1 (1456880..1459834, complemento)

ID: 905809

SEQ ID NO: 64

4.mcrA

Endonucleasa de restricción [Bifidobacterium longum DJO10A]

Otros alias: BLD_1902

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_010816.1 (2257993..2261556)

ID: 6362834

SEQ ID NO: 65

5.MGA_0519

Proteína asociada a CRISPR de la familia Csn1 [Mycoplasma gallisepticum str. R(bajo)] Otros alias: MGA_0519

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_004829.2 (919248..923060)

ID :1089911

SEQ ID NO: 66

6.Emin_0243

Proteína de la familia Csn1 de la endonucleasa asociada a CRISPR [Elusimicrobium minutum Pei191] Otros alias: Emin_0243

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_010644.1 (261119..264706)

ID: 6263045

SEQ ID NO: 67

7.FTW_1427

Proteína grande asociada a CRISPR [Francisella tularensis subsp. tularensis WY96-3418] Otros alias: FTW_1427

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_009257.1 (1332426..1335803, complemento)

ID: 4958852

SEQ ID NO: 68

8.SMA 1444

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Streptococcus macedonicus ACA-DC 198] Otros alias: SMA_1444

Comentario: NC_016749.1 (1418337..1421729, complemento)

ID :11601419

SEQ ID NO: 69

9.SSUST3_1318

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Streptococcus suis ST3]

Otros alias: SSUST3_1318

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_015433.1 (1323872..1327240, complemento)

ID :10491484

SEQ ID NO: 70

10.cas5

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Streptococcus gallolyticus UCN34]

Otros alias: GALLO_1439

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_013798.1 (1511433..1514825, complemento)

ID: 8776949

SEQ ID NO: 71

11.GALLO_1446

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus gallolyticus UCN34]

Otros alias: GALLO_1446

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_013798.1 (1518984..1523110, complemento)

ID :8776185

SEQ ID NO: 72

12.csn1

Endonucleasa Csn1 asociada a CRISPR [Bifidobacterium dentium BD1]

Otros alias: BDP_1254

Contexto genómico: Cromosoma

C o m e n ta rio : N C _013714.1 (1400576..1403992 , co m p le m e n to )

ID: 8692053

SEQ ID NO: 73

13.NMO_0348

Supuesta proteína asociada a CRISPR [Neisseria meningitidis alfa 14]

Otros alias: NMO_0348

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_013016.1 (369547..372795, complemento)

ID :8221228

SEQ ID NO: 74

14.csnl

Proteína Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus equi subsp. zooepidemicus MGCS10565] Otros alias: Sez_1330

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_011134.1 (1369339..1373385, complemento)

ID :6762114

SEQ ID NO: 75

15.csnl

Proteína de la familia Csn1 de la endonucleasa asociada a CRISPR [Streptococcus gordonii str. Challis substr. CH1]

Otros alias: SGO_1381

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_009785.1 (1426750..1430160, complemento)

ID: 5599802

SEQ ID NO: 76

16.M28_Spy0748

Proteína citoplasmática [Streptococcus pyogenes MGAS6180]

Otros alias: M28_spy0748

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_007296.1 (771231..775337)

ID :3573516

SEQ ID NO: 77

17.SG G BAA2069_c14690

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus ATCC BAA-2069] Otros alias: SGGBAA2069_c14690

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_015215.1 (1520905..1525017, complemento)

ID :10295470

SEQ ID NO: 78

18.SAR116_2544

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Candidatus Puniceispirillum marinum IMCC1322] Otros alias: SAR116_2544

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_014010.1 (2748992..2752099)

ID: 8962895

SEQ ID NO: 79

19.19.TDE0327

Cas5e asociada a CRISPR [Treponema denticola ATCC 35405]

Otros alias: TDE0327

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_002967.9 (361021..365208)

ID :2741543

SEQ ID NO: 80

20.csn1

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus pasteurianus ATCC 43144]

Otros alias: SGPB_1342

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_015600.1 (1400035..1403427, complemento)

ID :10753339

SEQ ID NO: 81

21.cas9

Proteína asociada a CRISPR [Corynebacterium ulcerans BR-AD22]

Otros alias: CULC22_00031

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_015683.1 (30419..33112, complemento)

ID :10842578

SEQ ID NO: 82

22.MGAS2096_Spy0843

S u p u e s ta p ro te ín a c ito p la s m á tic a [S tre p to co ccu s p yo g e n e s M G A S 2096 ]

Otros alias: MGAS2096_Spy0843

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_008023.1 (813084..817190)

ID :4066021

SEQ ID NO: 83

23.MGAS9429_Spy0885

Proteína citoplasmática [Streptococcus pyogenes MGAS9429]

Otros alias: MGAS9429_Spy0885

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_008021.1 (852508..856614)

ID :4061575

SEQ ID NO: 84

24.AZL_009000

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Azospirillum sp. B510]

Otros alias: AZL_009000

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_013854.1 (1019522..1023028, complemento)

ID: 8789261

SEQ ID NO: 85

25.EUBREC_1713

Contiene dominios de nucleasa similares a RuvC y de HNH-nucleasa [Eubacterium rectale ATCC 33656] Otros alias: EUBREC_1713

Otras denominaciones: Proteína relacionada con el sistema CRISPR

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_012781.1 (1591112..1594456)

ID: 7963668

SEQ ID NO: 86

26.Alide2_0194

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Alicycliphilus denitrificans K601] Otros alias: Alide2_0194

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_015422.1 (218107..221196)

ID :10481210

SEQ ID NO: 87

27.Alide_0205

Proteína asociada a crispr, familia csn1 [Alicycliphilus denitrificans BC] Otros alias: Alide_0205 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_014910.1 (228371..231460)

ID :10102228

SEQ ID NO: 88

28.STER_1477

Proteína similar al sistema CRISPR [Streptococcus thermophilus LMD-9] Otros alias: STER_1477

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_008532.1 (1379975..1384141, complemento) ID: 4437923

SEQ ID NO: 89

29.STER_0709

Proteína similar al sistema CRISPR [Streptococcus thermophilus LMD-9] Otros alias: STER_0709

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_008532.1 (643235..646600)

ID: 4437391

SEQ ID NO: 90

30.cas9

Proteína asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae 241] Otros alias: CD241_2102

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016782.1 (2245769..2248399)

ID :11674395

SEQ ID NO: 91

31.cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae 241] Otros alias: CD241_0034

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016782.1 (35063..38317)

ID :11672999

SEQ ID NO: 92

32.Corgl_1738

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Coriobacterium glomerans PW2] Otros alias: Corgl_1738

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_015389.1 (2036091..2040245)

ID :10439994

SEQ ID NO: 93

33.Fluta_3147

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Fluviicola taffensis DSM 16823]

Otros alias: Fluta_3147

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_015321.1 (3610221..3614597, complemento)

ID :10398516

SEQ ID NO: 94

34.Acav_0267

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Acidovorax avenae subsp. avenae ATCC 19860] Otros alias: Acav_0267

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_015138.1 (295839..298976)

ID :10305168

SEQ ID NO: 95

35.NAL212_2952

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Nitrosomonas sp. AL212]

Otros alias: NAL212_2952

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_015222.1 (2941806..2944940, complemento)

ID :10299493

SEQ ID NO: 96

36.SpiBuddy_2181

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Sphaerochaeta globosa str. Buddy]

Otros alias: SpiBuddy_2181

Contexto genómico: Cromosoma

C o m e n ta rio : N C _015152.1 (2367952..2371491 , co m p le m e n to )

I D : 10292274

S E Q ID NO : 97

37.Tmz1t_2411

Endonucleasa HNH [Thauera sp. MZ1T]

Otros alias: Tmz1t_2411

Contexto genómico: Plásmido pTha01

Comentario: NC_011667.1 (75253..76200, complemento)

ID: 7094333

SEQ ID NO: 98

38.Gdia_0342

Proteína asociada a CRISPR de la familia Csn1 [Gluconacetobacter diazotrophicus PAI 5] Otros alias: Gdia_0342

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_011365.1 (382737..385748)

ID: 6973736

SEQ ID NO: 99

39.JJD26997_1875

Proteína de la familia Cas5e asociada a CRISPR [Campylobacter jejuni subsp. doylei 269.97] Otros alias: JJD26997_1875

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_009707.1 (1656109..1659063, complemento)

ID: 5389688

SEQ ID NO: 100

40.Asuc_0376

Proteína de la familia Csn1 de la endonucleasa asociada a CRISPR [Actinobacillus succinogenes 130Z] Otros alias: Asuc_0376

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_009655.1 (431928..435116)

ID: 5348478

SEQ ID NO: 101

41.Veis_1230

Proteína de la familia Csn1 de la endonucleasa asociada a CRISPR [Verminephrobacter eiseniae EF01-2] Otros alias: Veis_1230

Contexto genómico: Cromosoma

C o m e n ta rio : N C _008786.1 (1365979..1369185 )

I D : 4695198

S E Q ID NO : 102

42.MGAS10270_Spy0886

Supuesta proteína citoplasmática [Streptococcus pyogenes MGAS10270] Otros alias: MGAS10270_Spy0886

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_008022.1 (844446..848552)

ID :4063984

SEQ ID NO: 103

43.gbs0911

Proteína hipotética [Streptococcus agalactiae NEM316]

Otros alias: gbs0911

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_004368.1 (945801..949946)

ID :1029893

SEQ ID NO: 104

44.NMA0631

Proteína hipotética [Neisseria meningitidis Z2491]

Otros alias: NMA0631

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_003116.1 (610868..614116, complemento) ID: 906626 SEQ ID NO: 105

45.Ccan_14650

Proteína hipotética [Capnocytophaga canimorsus Cc5] Otros alias: Ccan_14650 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_015846.1 (1579873..1584165, complemento) ID: 10980451 SEQ ID NO: 106

46.Ipp0160

Proteína hipotética [Legionella pneumophila str. Paris] Otros alias: lpp0160 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_006368.1 (183831..187949)

ID :3118625

SEQ ID NO: 107

47.Cbei 2080

Proteína hipotética [Clostridium beijerinckii NCIMB 8052] Otros alias: Cbei_2080 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_009617.1 (2422056..2423096)

ID: 5296367

SEQ ID NO: 108

48.MMOB0330

Proteína hipotética [Mycoplasma mobile 163K]

Otros alias: MMOB0330

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_006908.1 (45652..49362, complemento)

ID: 2807677

SEQ ID NO: 109

49.MGF_5203

Proteína asociada a CRISPR de la familia Csn1 [Mycoplasma gallisepticum str. F]

Otros alias: MGF_5203

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017503.1 (888602..892411)

ID :12397088

SEQ ID NO: 110

50.MGAH_0519

Proteína asociada a CRISPR de la familia Csn1 [Mycoplasma gallisepticum str. R(alta)] Otros alias: MGAH_0519

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017502.1 (918476..922288)

ID :12395725

SEQ ID NO: 111

51.Smon_1063

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Streptobacillus moniliformis DSM 12112] Otros alias: Smon_1063

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_013515.1 (1159048..1162827, complemento)

ID: 8600791

SEQ ID NO: 112

52.Spy49_0823

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes NZ131]

Otros alias: Spy49_0823

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_011375.1 (821210..825316)

ID: 6985827

SEQ ID NO: 113

53.C8J_1425

Proteína hipotética [Campylobacter jejuni subsp. jejuni 81116]

Otros alias: C8J_1425

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_009839.1 (1442672..1445626, complemento)

ID :5618449

SEQ ID NO: 114

54.FTF0584

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. tularensis FSC198]

Otros alias: FTF0584

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_008245.1 (601115..604486)

ID: 4200457

SEQ ID NO: 115

55.FTT_0584

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. tularensis SCHU S4]

Otros alias: FTT_0584

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_006570.2 (601162..604533)

ID: 3191177

SEQ ID NO: 116

56.csnl

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis RE378] Otros alias: GGS_1116

C o m e n ta rio : N C _018712.1 (1169559..1173674 , co m p le m e n to )

ID :13799322

SEQ ID NO: 117

57.SMUGS5_06270

Proteína csnl asociada a CRISPR [Streptococcus mutans GS-5]

Otros alias: SMUGS5_06270

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018089.1 (1320641..1324678, complemento)

ID :13299050

SEQ ID NO: 118

58.Y1U_C1412

Csn1 [Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002]

Otros alias: Y1U_C1412

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017927.1 (1376653..1380819, complemento)

ID :12977193

SEQ ID NO: 119

59.Y1U_C0633

Proteína similar al sistema CRISPR [Streptococcus thermophilus MN-ZLW-002]

Otros alias: Y1U_C0633

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017927.1 (624274..627639)

ID :12975630

SEQ ID NO: 120

60.SALIVA_0715

Endonucleasa asociada a CRISPR, familia Csn1 [Streptococcus salivarius JIM8777] Otros alias: SALIVA_0715

Comentario: NC_017595.1 (708034..711417)

ID :12910728

SEQ ID NO: 121

61.csn1

Proteína csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus mutans LJ23]

Otros alias: SMULJ23_0701

Comentario: NC_017768.1 (751695..755732)

ID :12898085

SEQ ID NO: 122

62.RIA 1455

Proteína asociada a CRISPR, SAG0894 [Riemerella anatipestifer RA-GD]

Otros alias: RIA_1455

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017569.1 (1443996..1448198)

ID :12613647

SEQ ID NO: 123

63.STND_0658

Endonucleasa asociada a CRISPR, familia Csn1 [Streptococcus thermophilus ND03] Otros alias: STND_0658

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017563.1 (633621..636986)

ID :12590813

SEQ ID NO: 124

64.RA0C_1034

Supuesta BCR [Riemerella anatipestifer ATCC 11845 = DSM 15868]

Otros alias: RA0C_1034

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017045.1 (1023494..1026931, complemento)

ID :11996006

SEQ ID NO: 125

65.Sinf_1255

Proteína asociada a CRISPR, familia SAG0894 [Streptococcus infantarius subsp. infantarius CJ18] Otros alias: Sinf_1255

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016826.1 (1276484..1280611, complemento)

ID :11877786

SEQ ID NO: 126

66.Nitsa_1472

Proteína asociada a CRISPR, familia csn1 [Nitratifractor salsuginis DSM 16511]

Otros alias: Nitsa_1472

Contexto genómico: Cromosoma

C o m e n ta rio : N C _014935.1 (1477331..1480729 )

I D : 10148263

S E Q ID NO : 127

67.NLA_17660

Proteína hipotética [Neisseria lactamica 020-06]

Otros alias: NLA_17660

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_014752.1 (1890078..1893326)

ID :10006697

SEQ ID NO: 128

68.SmuNN2025_0694

Proteína hipotética [Streptococcus mutans NN2025]

Otros alias: SmuNN2025_0694

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_013928.1 (737258..741295)

ID: 8834629

SEQ ID NO: 129

69.SDEG_1231

Proteína hipotética [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis GGS_124] Otros alias: SDEG_1231

Cromosoma: 1

Comentario: Cromosoma 1NC_012891.1 (1176755..1180870, complemento) ID: 8111553 SEQ ID NO: 130

70.NMCC_0397

Proteína hipotética [Neisseria meningitidis 053442]

Otros alias: NMCC_0397

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_010120.1 (402733..405981, complemento)

ID: 5796426

SEQ ID NO: 131

71.SAK_1017

Proteína hipotética [Streptococcus agalactiae A909]

Otros alias: SAK_1

Contexto genómico: Cromosoma

C o m e n ta rio : N C _007432.1 (980303..984415 )

I D : 3686185

S E Q ID NO : 132

72.M5005_Spy_0769

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes MGAS5005]

Otros alias: M5005_Spy_0769

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_007297.1 (773340..777446)

ID :3572134

SEQ ID NO: 133

73.MS53_0582

Proteína hipotética [Mycoplasma synoviae 53]

Otros alias: MS53_0582

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_007294.1 (684155..688099)

ID: 3564051

SEQ ID NO: 134

74.DIP0036

Proteína hipotética [Corynebacterium diphtheriae NCTC 13129] Otros alias: DIP0036 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_002935.2 (34478..37732)

ID :2650188

SEQ ID NO: 135

75.WS1613

Proteína hipotética [Wolinella succinogenes DSM 1740]

Otros alias: WS1613

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_005090.1 (1525628..1529857)

ID: 2553552

SEQ ID NO: 136

76.PM1127

Proteína hipotética [Pasteurella multocida subsp. multocida str. Pm70] Otros alias: PM1127 Contexto genómico: Cromosoma

C o m e n ta rio : N C _002663.1 (1324015..1327185 , co m p le m e n to )

I D : 1244474

S E Q ID NO : 137

77.SPs1176

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes SSI-1]

Otros alias: SPs1176

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_004606.1 (1149610..1153716, complemento)

ID :1065374

SEQ ID NO: 138

78.SMU_1405c

Proteína hipotética [Streptococcus mutans UA159]

Otros alias: SMU_1405c, SMU.1405c

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_004350.2 (1330942..1334979, complemento)

ID :1028661

SEQ ID NO: 139

79.lin2744

Proteína hipotética [Listeria innocua Clip11262]

Otros alias: lin2744

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_003212.1 (2770707..2774711, complemento)

ID :1131597

SEQ ID NO: 140

80.csnIB

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus ATCC 43143] Otros alias: SGGB_1441

Comentario: NC_017576.1 (1489111..1493226, complemento)

ID :12630646

SEQ ID NO: 141

81.csnIA

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus gallolyticus subsp. gallolyticus ATCC 43143] Otros alias: SGGB_1431

C o m e n ta rio : N C _017576.1 (1480439..1483831 , co m p le m e n to )

ID :12630636

SEQ ID NO: 142

82.cas9

Proteína asociada a CRISPR [Corynebacterium ulcerans 809] Otros alias: CULC809_00033

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017317.1 (30370..33063, complemento)

ID :12286148

SEQ ID NO: 143

83.GDI_2123

Proteína hipotética [Gluconacetobacter diazotrophicus PAL 5] Otros alias: GDI_2123

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_010125.1 (2177083..2180235)

ID: 5792482

SEQ ID NO: 144

84.Nham_4054

Proteína hipotética [Nitrobacter hamburgensis X14]

Otros alias: Nham_4054

Contexto genómico: Plásmido 1

Comentario: NC_007959.1 (13284..16784, complemento)

ID: 4025380

SEQ ID NO: 145

85.str0657

Proteína hipotética [Streptococcus thermophilus CNRZ1066] Otros alias: str0657

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_006449.1 (619189..622575)

ID :3165636

SEQ ID NO: 146

86.stu0657

Proteína hipotética [Streptococcus thermophilus LMG 18311] Otros alias: stu0657

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_006448.1 (624007..627375)

I D : 3165000

S E Q ID NO : 147

87.SpyM3_0677

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes MGAS315]

Otros alias: SpyM3_0677

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_004070.1 (743040..747146)

ID :1008991

SEQ ID NO: 148

88.HFMG06CAA_5227

Proteína asociada a CRISPR de la familia Csn1 [Mycoplasma gallisepticum CA06_2006.052-5-2P] Otros alias: HFMG06CAA_5227

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018412.1 (895338..899147)

ID :13464859

SEQ ID NO: 149

89.HFMG01WIA_5025

Proteína asociada a CRISPR de la familia Csn1 [Mycoplasma gallisepticum WI01_2001.043-13-2P] Otros alias: HFMG01WIA_5025

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018410.1 (857648..861457)

ID :13463863

SEQ ID NO: 150

90.HFMG01 NYA_5169

Proteína asociada a CRISPR de la familia Csn1 [Mycoplasma gallisepticum NY01_2001.047-5-1P] Otros alias: HFMG01NYA_5169

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018409.1 (883511..887185)

ID :13462600

SEQ ID NO: 151

91.HFMG96NCSEQ ID NO: 127

A_5295

P ro te ín a a so c ia d a a C R IS P R de la fa m ilia Csn1 [M yco p la sm a g a llise p ticu m N C 96 _ 1596 -4 -2 P ] O tros a lias : H F M G 96 N C A _ 5295

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018408.1 (904664..908473)

ID :13462279

SEQ ID NO: 152

92.HFMG95NCA_5107

Proteína asociada a CRISPR de la familia Csn1 [Mycoplasma gallisepticum NC95_13295-2-2P] Otros alias: HFMG95NCA_5107

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018407.1 (871783..875592)

ID :13461469

SEQ ID NO: 153

93.MGAS10750_Spy0921

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes MGAS10750]

Otros alias: MGAS10750_Spy0921

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_008024.1 (875719..879834)

ID: 4066656

SEQ ID NO: 154

94.XAC3262

Proteína hipotética [Xanthomonas axonopodis pv. citri str. 306]

Otros alias: XAC3262

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_003919.1 (3842310..3842765)

ID :1157333

SEQ ID NO: 155

95.SSUST1_1305

Proteína similar al sistema CRISPR [Streptococcus suis ST1]

Otros alias: SSUST1_1305

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017950.1 (1293105..1297250, complemento)

ID :13017849

SEQ ID NO: 156

96.SSUD9_1467

P ro te ín a a so c ia d a a C R IS P R , fa m ilia Csn1 [S tre p to co ccu s su is D9] O tro s a lias : S S U D 9 _ 1467 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017620.1 (1456318..1459686, complemento)

ID :12718289

SEQ ID NO: 157

97.BBta_3952

Proteína hipotética [Bradyrhizobium sp. BTAi1]

Otros alias: BBta_3952

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_009485.1 (4149455..4152649, complemento)

ID :5151538

SEQ ID NO: 158

98.CIY_03670

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Butyrivibrio fibrisolvens 16/4] Otros alias: CIY_03670 Comentario: NC_021031.1 (309663..311960, complemento)

ID :15213189

SEQ ID NO: 159

99.A11Q_912

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Bdellovibrio exovorus JSS] Otros alias: A11Q_912 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_020813.1 (904781..907864, complemento)

ID :14861475

SEQ ID NO: 160

100.MCYN0850

Proteína asociada a CRISPR de la familia Csn1 [Mycoplasma cynos C142]

Otros alias: MCYN_0850

Comentario: NC_019949.1 (951497..955216, complemento)

ID :14356531

SEQ ID NO: 161

101.SaSA20_0769

Proteína asociada a CRISPR [Streptococcus agalactiae SA20-06]

Otros alias: SaSA20_0769

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_019048.1 (803597..807709)

I D : 13908026

S E Q ID NO : 162

102.csnl

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Streptococcus pyogenes A20]

Otros alias: A20_0810

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018936.1 (772038..776144)

ID :13864445

SEQ ID NO: 163

103.P700755_000291

Proteína Cas9/Csn1 asociada a CRISPR, subtipo II [Psychroflexus torquis ATCC 700755] Otros alias: P700755_000291

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018721.1 (312899..317428)

ID :13804571

SEQ ID NO: 164

104.A911_07335

Proteína asociada a CRISPR [Campylobacter jejuni subsp. jejuni PT14]

Otros alias: A911_07335

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018709.2 (1450217..1453180, complemento)

ID :13791138

SEQ ID NO: 165

105.ASU2_02495

Proteína de la familia Csn1 de la endonucleasa asociada a CRISPR [Actinobacillus suis H91 -0380] Otros alias: ASU2_02495

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018690.1 (552318..555482)

ID :13751600

SEQ ID NO: 166

106.csn1

Proteína asociada a CRISPR [Listeria monocytogenes SLCC2540]

Otros alias: LMOSLCC2540_2635

C o m e n ta rio : N C _018586.1 (2700744..2704748 , co m p le m e n to )

I D : 13647248

S E Q ID NO : 167

107.csnl

Proteína asociada a CRISPR [Listeria monocytogenes SLCC5850]

Otros alias: LMOSLCC5850_2605

Comentario: NC_018592.1 (2646023..2650027, complemento)

ID :13626042

SEQ ID NO: 168

108.csnl

Proteína asociada a CRISPR [Listeria monocytogenes serotipo 7 str. SLCC2482] Otros alias: LMOSLCC2482_2606

Comentario: NC_018591.1 (2665393..2669397, complemento)

ID :13605045

SEQ ID NO: 169

109.csnl

Proteína asociada a CRISPR [Listeria monocytogenes SLCC2755]

Otros alias: LMOSLCC2755_2607

Comentario: NC_018587.1 (2694850..2698854, complemento)

ID :13599053

SEQ ID NO: 170

110.BN148_1523c

Proteína asociada a CRISPR [Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168-BN148] Otros alias: BN148_1523c

Comentario: NC_018521.1 (1456880..1459834, complemento)

ID :13530688

SEQ ID NO: 171

111.Belba_3201

Proteína asociada a CRISPR Cas9/Csn1, subtipo II/NMEMI [Belliella baltica DSM 15883] Otros alias: Belba_3201

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018010.1 (3445311..3449369, complemento)

ID :13056967

SEQ ID NO: 172

112.FN3523_1121

Proteína de membrana [Francisella cf. novicida 3523]

Otros alias: FN3523_1121

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017449.1 (1129528..1134468, complemento)

ID :12924881

SEQ ID NO: 173

113. cas9

Proteína Cas9/Csn1 asociada a CRISPR, subtipo II/NMEMI [Prevotella intermedia 17] Otros alias: PIN17 A0201

Cromosoma: II

Comentario: Cromosoma IINC_017861.1 (240722..244864)

ID :12849954

SEQ ID NO: 174

114. csn l

Proteína asociada a CRISPR, familia Csn1 [Streptococcus thermophilus JIM 8232] Otros alias: STH8232_0853

Comentario: NC_017581.1 (706443..709808)

ID :12637306

SEQ ID NO: 175

115. LMOG _01918

Proteína asociada a CRISPR [Listeria monocytogenes J0161]

Otros alias: LMOG_01918

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017545.1 (2735374..2739378, complemento)

ID :12557915

SEQ ID NO: 176

116. LMRG 02138

Proteína asociada a CRISPR [Listeria monocytogenes 10403S]

Otros alias: LMRG_02138

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017544.1 (2641981..2645985, complemento)

ID :12554876

SEQ ID NO: 177

117. CJSA 1443

Proteína asociada a CRISPR putativa [Campylobacter jejuni subsp. jejuni IA3902] Otros alias: CJSA_1443

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017279.1 (1454273..1457227, complemento)

ID :12250720

SEQ ID NO: 178

118.csnl

Proteína Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus pyogenes MGAS1882]

Otros alias: MGAS1882_0792

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017053.1 (775696..779799)

ID :12014080

SEQ ID NO: 179

119.csnl

Proteína Csn1 asociada a CRISPR [Streptococcus pyogenes MGAS15252] Otros alias: MGAS15252_0796

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017040.1 (778271..782374)

ID :11991096

SEQ ID NO: 180

120.cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae HC02] Otros alias: CDHC02_0036 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016802.1 (37125..40379)

ID: 11739116

SEQ ID NO: 181

121.cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae C7 (beta)] Otros alias: CDC7B_0035

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016801.1 (36309..39563)

ID :11737358

SEQ ID NO: 182

122.cas3

E n d o n u c le a sa a so c ia d a a C R IS P R [C o ryn e b a c te riu m d ip h th e ria e B H 8] O tro s a lias : C D B H 8 _ 0038 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016800.1 (37261..40515)

ID :11735325

SEQ ID NO: 183

123.cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae 31A] Otros alias: CD31A_0036 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016799.1 (34597..37851)

ID: 11731168

SEQ ID NO: 184

124.cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae VA01] Otros alias: CDVA01_0033 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016790.1 (34795..38049)

ID :11717708

SEQ ID NO: 185

125.cas3

Endonucleasa asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae HC01] Otros alias: CDHC01_0034 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016786.1 (35060..38314)

ID :11708318

SEQ ID NO: 186

126.cas9

Proteína asociada a CRISPR [Corynebacterium diphtheriae HC01] Otros alias: CDHC01_2103 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016786.1 (2246368..2248998)

ID :11708126

SEQ ID NO: 187

127.PARA_18570

Proteína hipotética [Haemophilus parainfluenzae T3T1]

Otros alias: PARA_18570

Contexto genómico: Cromosoma

C o m e n ta rio : N C _015964.1 (1913335..1916493 )

ID: 11115627

S E Q ID NO : 188

128.HDN1 F_34120

Proteína hipotética [proteobacteria gamma HdN1]

Otros alias: HDN1F_34120

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_014366.1 (4143336..4146413, complemento)

ID :9702142

SEQ ID NO: 189

129.SPy_1046

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes M1 GAS]

Otros alias: SPy_1046

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_002737.1 (854757..858863)

ID: 901176

SEQ ID NO: 190

130.GBS222_0765

Proteína hipotética [Streptococcus agalactiae]

Otros alias: GBS222_0765

Comentario: NC_021195.1 (810875..814987)

ID :15484689

SEQ ID NO: 191

131.NE061598_03330

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. tularensis NE061598] Otros alias: NE061598_03330

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017453.1 (601219..604590)

ID :12437259

SEQ ID NO: 192

132.NMV_1993

Proteína hipotética [Neisseria meningitidis 8013]

Otros alias: NMV_1993

C o m e n ta rio : N C _017501.1 (1917073..1920321 )

I D : 12393700

S E Q ID NO : 193

133. csn l

Proteína hipotética [Campylobacter jejuni subsp. jejuni M1]

Otros alias: CJM1_1467

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017280.1 (1433667..1436252, complemento)

ID :12249021

SEQ ID NO: 194

134. FTU_0629

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. tularensis TIGB03] Otros alias: FTU_0629 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016933.1 (677092..680463)

ID :11890131

SEQ ID NO: 195

135. NMAA_0315

Proteína hipotética [Neisseria meningitidis WUE 2594]

Otros alias: NMAA_0315

Comentario: NC_017512.1 (377010..380258, complemento)

ID :12407849

SEQ ID NO: 196

136. WS1445

Proteína hipotética [Wolinella succinogenes DSM 1740]

Otros alias: WS1445

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_005090.1 (1388202..1391381, complemento)

ID: 2554690

SEQ ID NO: 197

137. THITE_2123823

Proteína hipotética [Thielavia terrestris NRRL 8126]

Otros alias: THITE_2123823

Cromosoma: 6

C o m e n ta rio : C ro m o s o m a 6N C _016462.1 (1725696..1725928 )

I D : 11523019

S E Q ID NO : 198

138. XAC29_16635

Proteína hipotética [Xanthomonas axonopodis Xac29-1]

Otros alias: XAC29_16635

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_020800.1 (3849847..3850302)

ID :14853997

SEQ ID NO: 199

139. M1GAS476_0830

Proteína hipotética [Streptococcus pyogenes M1 476]

Otros alias: M1GAS476_0830

Cromosoma: 1

Comentario: NC_020540.1 (792119..796225)

ID :14819166

SEQ ID NO: 200

140. Piso0_000203

Piso0_000203[Millerozyma farinosa CBS 7064]

Otros alias: GNLVRS01_PISO0A04202g

Otras denominaciones: Proteína hipotética

Cromosoma: A

Comentario: NC_020226.1 (343553..343774, complemento)

ID :14528449

SEQ ID NO: 201

141. G148_0828

Proteína hipotética [Riemerella anatipestifer RA-CH-2]

Otros alias: G148_0828

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_020125.1 (865673..869875)

ID :14447195

SEQ ID NO: 202

142. csn1

Proteína hipotética [Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis AC-2713] Otros alias: SDSE 1207

Comentario: NC_019042.1 (1134173..1138288, complemento)

ID :13901498

SEQ ID NO: 203

143. A964_0899

Proteína hipotética [Streptococcus agalactiae GD201008-001] Otros alias: A964_0899 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_018646.1 (935164..939276)

ID :13681619

SEQ ID NO: 204

144. FNFX1_0762

Proteína hipotética [Francisella cf. novicida Fx1]

Otros alias: FNFX1_0762

Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_017450.1 (781484..786373)

ID :12435564

SEQ ID NO: 205

145. FTV_0545

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. tularensis TI0902] Otros alias: FTV_0545 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_016937.1 (601185..604556)

ID :11880693

SEQ ID NO: 206

146. FTL_1327

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. holarctica LVS] Otros alias: FTL_1327 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_007880.1 (1262508..1263689, complemento)

ID: 3952607

SEQ ID NO: 207

147. FTL_1326

Proteína hipotética [Francisella tularensis subsp. holarctica LVS] Otros alias: FTL_1326 Contexto genómico: Cromosoma

Comentario: NC_007880.1 (1261927..1262403, complemento) ID: 3952606 SEQ ID NO: 208

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula ES no humana o una célula de mamífero no humano que comprende una secuencia de ADN cromosómico flanqueada por sitios de recombinación específicos del sitio y elementos transposón, en donde la secuencia codifica una endonucleasa Cas y uno o más ARNg y los elementos de transposón se pueden usar para cortar la secuencia del genoma.

2. La célula ES no humana o célula de mamífero no humano según la reivindicación 1, en donde la secuencia que codifica la endonucleasa Cas y uno o más ARNg se introdujo mediante RMCE.

3. La célula ES no humana o célula de mamífero no humano según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde cada uno del uno o más ARNg comprende un ARNcrtra y un ARN de CRISPR.

4. La célula de cualquier reivindicación precedente, en donde la secuencia de endonucleasa es constitutivamente expresable o es induciblemente expresable.

5. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la secuencia de endonucleasa es induciblemente expresable y en donde la endonucleasa Cas está en un locus Rosa 26 y está opcionalmente unida operativamente a un promotor de Rosa 26.

6. La célula de cualquier reivindicación precedente, en donde la secuencia de ADN cromosómico está flanqueada 5' y 3' por elementos de transposón que son elementos terminales de piggyBac invertidos.

7. La célula de cualquier reivindicación precedente, en donde la secuencia de ADN cromosómico está flanqueada 5' y 3' por sitios de recombinación específicos de sitio seleccionados de frt, loxP y un lox mutante, por ejemplo, lox2272 o lox511.

8. La célula de la reivindicación 7, que comprende uno o más sitios de endonucleasa de restricción entre la secuencia de endonucleasa Cas y un elemento transposón.

9. La célula de cualquier reivindicación precedente, en donde la endonucleasa Cas es Cas9.

10. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la célula es una célula de roedor.