TW201034657A - Cyclohexene compound - Google Patents

Description

201034657 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種新穎化合物，尤其係關於—種由牛 樟芝萃取物中所分離純化之化合 物及其於抑制腫瘤細胞生長之應用。 【先前技術】 〇 紅樟、紅樟芝、樟菰或樟窟内菰等，為臺灣特有種真菌， 只生長於臺灣山區海拔450〜2〇〇〇公尺間之牛樟樹 (Cm⑽以卜山· Hay )的中空腐朽心材内壁上，因 此是由樹幹内面生長出子實體。牛樟樹目前主要分佈於桃 園、南投等山區’由於牛樟樹是台灣數量極為稀少的保育 類樹種’加上人為的盜伐，使得寄生於其中方能生長之野 生牛樟芝數量更形稀少，且由於其生長相當緩慢，生長期 ❸亦僅在六月至十月之間，因此價格非常昂貴。 牛樟芝之子實體為多年生，無柄，呈木栓質至木質， 其外形多變，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。初時為扁平 型，貼生於木材表面，之後其前緣會略為捲曲翹起，而呈 板塊狀（層纹板狀）或如鐘乳石狀。牛樟芝頂部表面呈褐 色至黑褐色，具不明顯的皺紋，有光澤，邊緣平而鈍，其 腹面則為橘紅色或局部黃色，並有許多細孔。 201034657 此外’牛樟芝具有強烈的黃樟香氣，其曬乾後褪色成 土黃白色’味極苦，民間將其用作解毒、保肝、抗癌之草 藥。牛樟芝如同一般食藥用的蕈菇類，具有許多複雜的成 分’已知的生理活性成分中，包括：多醣體 (polysaccharides ’如：β_萄聚聽）、三萜類化合物 (triterpenoids)、超氧歧化酶（SUper〇xide dismutase，SOD)、 腺苦（adenosine)、蛋白質（含免疫球蛋白）、維生素（如：維 生素B、菸鹼酸）、微量元素（如：鈣、磷及鍺等）、核 〇 酸、凝集素、胺基酸、固醇類、木質素以及血壓穩定物質 (如：antodia acid)等，這些生理活性成分被認為具有抗腫 瘤、增加免疫能力、抗過敏、抑制血小板凝集、抗病毒、 抗細菌、抗高血壓、降血糖、降膽固醇以及保護肝臟等功 能0 牛樟芝眾多成分中以三萜類化合物被研究的最多，三 萜類化合物是由三十個碳元素結合成六角形或五角形天然 化合物之總稱，牛樟芝所具之苦味即主要來自三萜類此成 分。1995年時，Cherng等人發現牛樟芝子實體萃取物中含 有三種新的以麥角甾烧（ergostane )為骨架的三萜類化合 物：antcin A、antcin B 與 antcin C( Cherng，I. H.，and Chiang, H. C. 1995. Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea. J. Nat. Prod. 58:365-371 )。Chen 等人以乙醇 萃取樟芝子實體後發現zhankuic acid A、zhankuic acid B 及zhankuic acid C等三種三萜類化合物（Chen, C· H.，and Yang, S. W. 1995. New steroid acids from Antrodia 4 201034657 cinnamomea, — a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. J. Nat. Prod. 58:1655-1661 )。此外，Chiang 等人於1995年也由子實體萃取物中發現另外三種分別為 倍半萜内醋（sesquiterpene lactone )與兩種雙紛類衍生物 的新三萜類化合物，此即811打〇(^11,4,7-二甲氧基-5-甲基 -1,3-苯並二氧環（4,7-dimethoxy-5-methy_l,3-benzodioxole)與 2,2'，5,5'-四曱氧基-3,4,3'，4'-雙-亞曱二氧基 -6,6’-二曱基聯苯（2,2',5,5'-teramethoxy-3,4,3’,4'-bi-C) methylenedioxy-6,6'- dimethylbiphenyl ) (Chiang, H. C., Wu, D. P., Cherng, I. W., and Ueng, C. H. 1995. A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds from Antrodia Phytochemistry· 39:613-616)。到了 1996 年， Cherng等人以同樣分析方法再度發現四種新的三萜類化合 物：antcin E、antcin F、methyl antcinate G、methyl antcinate H ( Cherng, I. H., Wu, D. P., and Chiang, H. C. 1996. Triteroenoids from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. ❹ 41:263-267);而Yang等人則發現了二種以麥角留烷為骨架 的新化合物zhankuic acid D、zhankuic acid E，和三種以羊 毛甾炫·（lanostane)為骨架的新化合物：15 α -乙酿-去氫 硫色多孔菌酸（15 a -acetyl-dehydrosulphurenic acid)、去 氫齒孔酸（dehydroeburicoic acid )與去水硫色多孔菌酸 (dehydrasulphurenic acid) ( Yang, S. W.，Shen，Y. C., and Chen, C. H. 1996. Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea — a fungus parasitic on Cinnamomum 201034657 m/craw’Az/w· Phytochemistry. 41:1389-1.392 )。雖然由、 諸多之實驗可得知牛樟芝萃取物具有抑癌之功效§騎 Chen ( 1995))，但究為何種有效成分可達到抑制 j处 瘤細 胞效果之研究，目前則仍處於試驗階段，並未有具體之有 效成分發表，故若能將該萃取物進一步純化分析，找出其 真正有效抑癌成分，對於人類癌症之治療實將產生莫大的 助益。 【發明内容】 為明瞭牛樟芝萃取物中究竟是何成分具有抑癌之效 果，本發明由牛樟芝萃取物中分離純化出具式（1)結構式之 新穎化合物；

其中’ X係氧（〇 )或硫（S ) ’ γ係氧或硫；Ri係氫 基（H)、曱基（ch3)或(CH2)m-CH3，R2係氫基、甲基或 (CH2)m-CH3 ’ R3 係氫基、曱基或(CH2)m_CH3，m=1〜12 ; n= 1 〜12。 如式（1)結構式之化合物中，較佳者為如下所示式（2) 之化合物： 6 (2) 201034657

式（2)之化合物，其化學名為4-輕基-2,3-二曱氧美6 甲基-5 (3,7，n_三曱基·2,6，10_十二碳三烯）-2_環己 (4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,l 1-trimethyl-dod

eca-2,6，UMrienyl)-cycl〇hex-2-en〇ne)，分子式為（：2出38〇4， 外觀為淡黃色粉末狀，分子量為390。 本發明中式（1 )、式（2)之化合物係分離純化自牛樟芝水 萃取物或有機溶劑萃取物，有機溶劑可包括醇類（例如甲 醇、乙醇或丙醇）、酯類（例如乙酸乙醋）、院類（例如 己烷.）或_烷（例如氯曱烷、氯乙烷），但並不以此為限， 其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。 藉由前述化合物’本發明係將其應用於抑制腫瘤細胞 〇 ^長上，使能進一步應用於治療癌症之醫藥組成份中，增 益癌症之治療效果。本發明化合物得應用之範圍包括對^ 乳癌腫瘤細胞、肝癌腫瘤細胞與攝護腺癌腫瘤細胞等細胞 之生長產生抑制效果，使該等腫瘤細胞無法迅速生長，進 而抑制腫瘤之增生，延緩腫瘤之惡化，因此，可進一步利 用於乳癌、肝癌與攝護腺癌等癌症之治療。 …另一方Φ ’本發明中亦可將式⑴或/與式(2)之化合物 利用於治療乳癌、肝癌與攝護腺癌等醫餘成物之成分 7 201034657 中藉以抑制该等腫瘤細胞的生長。前述醫藥組成物除包 括有效劑量之式（1)或/與式(2)之化合物外，尚吁包括藥學 ^可接受的载體。載體可為賦形劑（如水）、填充劑（如 薦糖或灰叔）、黏合劑（如纖維素衍生物）、稀釋劑、崩 2劑、吸收促進劑或甜味劑，但並未僅限於此。本發明醫 藥組成物可依-般習知藥學之製備方法生產製造，將式⑴ 或/與式⑺有效成分劑量與一種以上之載體相混合，製備出 所需之劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊或其 ❹他液體製劑，但未以此為限。 此外，由於本發明中之化合物同時具有抗氧化活性，因此亦 可將之添加於保健食品、飲食品、醫藥品、化妝品當中，藉由 其抗氧化能力達到預防心血管疾病或避免細胞突變等效用，使 助益於施用人體之健康。 以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉 的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何 〇 熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍内，當可做些許更 動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界 定者為準。 【實施方式】 首先取牛棒之（d扣rocZ/β 叫^^如“）菌絲體、子實 體或一者之混合物’利用習知萃取方式，以水或有機溶劑 進行萃取，藉以取得牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物。 其中’有機溶劑可包括醇類（例如曱醇、乙醇或两醇）、 8 201034657 酯類（例如乙酸乙酯）、烷類（例如己烷）或由烧（例如 氯甲烷、氯乙烷），但並不以此為限。其中較佳者為醇類， 更佳者為乙醇。 、 經萃取過後之牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物，可 進一步藉由高效液相層析加以分離純化，之後再對每—分 液（fraction)進行抑癌效果的測試。最後，則針對具抑癌 效果之分液進行成分分析，將可能產生抑癌效果的成分再 ❹分別進一步做不同癌症腫瘤細胞之抑制效果測試。最終即 务現本發明中如式（1)/式（2)之化合物係具有抑制不同癌症 腫瘤細胞生長之效果，且該化合物經與習知文獻比對，並 未曾發現於牛樟芝中’因此係一新穎之化合物。 為方便說明本發明，以下將以式（2)之4-羥基-2,3-二甲 氧基-6-甲基·5 ( 3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯）環己 烯酮化合物進行說明。此外，為證實4_羥基_2,3_二甲氧基 -6-甲基-5 (3,7，11-三甲基·2,6，1〇-十二碳三烯）_2_環己烯酮 €)化合物對腫瘤細胞生之抑制效果，本發明中係以ΜΤΤ分析 法’根據美國國家癌症研究所（National Cancer Institute， NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，對包括乳癌、肝癌與攝護腺 癌等腫瘤細胞進行細胞存活率之測試。由該些測試證實， 4-羥基-2,3-二甲氧基曱基_5 ( 3,7,11-三曱基-2,6,10-十二 石反二稀）-2-環己烯酮對於乳癌腫瘤細胞（包括mcF-7與 MDA_MB-231)、肝癌腫瘤細胞（包括Hep3B與HepG2) 與攝護腺癌腫瘤細胞（包括LNCaP與DU-145)等皆可降 201034657 低其存活率，相對之下並可同時降低生長半抑制率所需濃 度（即IC50值），因此得藉由4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基 -5 (3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯酮，應用 於包括乳癌、肝癌與攝護腺癌等腫瘤細胞之生長抑制上， 而進一步可利用於乳癌、肝癌與攝護腺癌等癌症之治療。 茲對前述實施方式詳盡說明如下： 實施例1 : 0 4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三曱基-2,6，10-十二 碳三烯）-2-環己烯酮的分離 將100克左右之牛樟芝菌絲體、子實體或二者之混合 物，置入三角錐形瓶中，加入適當比例的水與醇類 (70%〜100%醇類水溶液），於20〜25°C下攪拌萃取至少1 小時以上，之後以濾紙及0_45 μιη濾膜過濾，收集萃取液。 將前述收集之牛樟芝萃取液，利用高效能液相層析儀 Ο (High Performance Liquid chromatography)’ 以 RP18 的層析 管（column)進行分析，並以曱醇(A)及0.1%〜0.5%醋酸水溶 液(B)做為移動相（mobile phase)(其溶液比例係：0〜10分 鐘，B比例為95%〜20% ; 10〜20分鐘，B比例為20%〜10% ; 20〜35分鐘，B比例為10%〜10%; 35〜40分鐘，B比例為 10%〜95%)，在每分鐘1 ml之速度下沖提，同時以紫外-可見光全波長偵測器分析。 201034657 將25分鐘至30分鐘之沖提液收集濃縮即可得淡黃色 粉末狀之固體產物，此即4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯酮。經分 析，其分子式為C24H38〇4，分子量390，溶點（m.p.)為 48°C〜52°C。核磁共振（NMR )分析值則如下所示： 1H-NMR(CDCl3)5(ppm) ： 1.51 > 1.67 ' 1.71 ' 1.75 ' 1.94 ' 2.03、2.07、2.22、2·25、3.68、4.05、5.07 與 5.14。 13C-NMR(CDCl3)5(ppm) ： 12.31 ' 16.1 ' 16.12' 17.67'25.67 ' Ο 26.44、26.74、27.00、39.71、39.81、4.027、43.34、59.22、 60.59、120.97、123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、 138.05、160.45 與 197.12。 經將4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三甲基 -2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯酮與化學式資料庫比對後， 並未發現與前述相同之化合物結構，因此，此化合物係一 新穎且前所未見之化合物。 Ο 實施例2 : 體外抗乳癌腫瘤細胞之活性測試 為進一步測試實施例1中所發現化合物對腫瘤細胞之 抑制效果，本實施例將根據美國國家癌症研究所（National Cancer Institute, NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，首先取實施 例1中所分離之4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三 甲基-2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯酮化合物，加入MCF-7 與MDA-MB-231人類腫瘤細胞培養液中，進行腫瘤細胞存 11 201034657 活性之測試。細胞存活性之測試可採習知之MTT分析法進 行分析，而MCF-7與MDA-MB-231皆係人類之乳癌腫瘤 細胞系。 ΜΤΤ分析法是一種常見用於分析細胞增生（ceii proliferation)、存活率（percent of viable cells )以及細胞 毒性（cytotoxicity )的分析方法。其中’…丁丁㈠-!» dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide )為一 黃色染劑，它可被活細胞吸收並被粒腺體中的琥珀酸四峻 〇 還原酶（succinate tetrazolium reductase)還原成不溶水性 且呈藍紫色的formazan，因此藉由formazan形成與否，即 可判斷並計算細胞之存活率。 首先將人類乳癌細胞MCF-7與MDA-MB-231分別於 含有胎牛血清之培養液中培養24小時。將增生後之細胞以 PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶-EDTA處理細胞，隨 後於l，200 rpm下離心5分鐘，將細胞沈澱並丟棄上清液。 Ο 之後加入10 ml的新培養液，輕微搖晃使細胞再次懸浮， 再將細胞分置於96孔微量盤内。測試時，分別於每一孔内 加入30、10、3、1、〇·3、0.1與0.03 pg/ml牛樟芝乙醇萃 取物（對照組，未經純化分離之總萃取物）以及4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯酮（試驗組），於37°C、5% C02下培養48小時。 其後，於避光的環境下於每一孔内加入2.5 mg/ml的MTT， 反應4小時後再於每一孔内加入1〇〇 μΐ的lysis buffer終止 12 201034657 反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測定 其吸光值’藉以計算細胞的存活率，並推算出其生長半抑 制率所需濃度（即IC5Q值），其結果如表一所示。 表一：體外對乳癌腫瘤細胞存活率之測試結果 測試樣品 IC50 ( pg/ml) 對照組（加入牛樟芝萃取物） MCF-7 11.132 MDA-MB-231 25.812 試驗組（加入式2) MCF-7 0.852 MDA-MB-231 1.031 由表一中可知’藉由4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7，11-二曱基-2,6，l〇-十二碳三烯）_2_環己烯酮的作用， 其對於MCF-7人類乳癌腫瘤細胞之ICw值為〇 852叩/ml， 對於MDA-MB-23!人類乳癌腫瘤細胞之IC5〇值則為1〇31 吨/m卜相較於牛樟芝萃取混合物所測得之心值係低的 多’因此可證實牛樟芝萃取物中之4_經基_2,3_二甲氧基冬 甲基-5 ( 3,7,⑴三T基_2,6，10_十二碳三烯）·2_環己烯鲷確實 能夠利用於乳癌腫瘤細胞生長之抑制。 實施例3 : 體外對乳癌腫瘤細胞辅助治療之活性測試 不凋珥保你很據美 ,^ -Θ1| ,, 、，* 、 九研的懘外篩檢模 式進们貝“式。百先，取人類乳癌細胞娜7邀 MDA捕·23卜分別於含有胎牛血清之培養液中培養〜、 13 201034657 時後’將增生後之細胞以PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋 白酶-EDTA處理細胞，隨後於1200 rprn下離心5分鐘， 將細胞沈殿並丟棄上清液。之後加入1〇 ml的新培養液， 輕微搖晃使細胞再次懸浮。測試前，先加入〇.〇017 Mg/ml 紫杉醇（Taxol)處理細胞72小時，再將細胞分置於96孔 微量盤内，之後分別於每孔内加入〇 pg/ml (對照組），30、 10、3、卜0.3、0.1與〇 〇3 μ§/ιη1實施例！中所分離之4-羥基-2,3_二甲氧基-6-甲基_5 ( 3,7，11-三甲基-2,6,10-十二碳 Ο 二稀）·2-環己稀酮（試驗組），於37°C、5% C02下培 養48小時。其後，於避光的環境下於每一孔内加入2.5 mg/ml的MTT，反應4小時後於每一孔内加入100 μΐ的lysis buffer終止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波 長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率，並推算出其 生長半抑制所需濃度（即IC5()值），其結果如表二所示。 表二：體外對乳癌腫瘤細胞經紫杉醇輔助治療後抑制 之測試結果 測試樣品 結果 對照組 細胞存活率（％) MCF-7 (0.0017 pg/ml Taxol) 65 ±1 MDA-MB-231 (0.0017 pg/ml Taxol) 76±3 試驗組 IC50 (pg/ml) MCF-7 (0.0017 pg/ml Taxol+式 2) 0.009 MDA-MB-231 (0.0017 pg/ml Taxol+式 2) 0.011 14 201034657 由表二中可知，透過紫杉醇之協同作用，4•羥基_2,3_ 二甲氧基_6•甲基_5 (3,7，n_三甲基_2,6鼻十二碳三稀 環己烯晴於MCF_7人類乳癌腫瘤細胞之IC5〇值降為〇〇〇9 Mg/m卜對於MDA_MB_231人類乳癌腫瘤細胞之ic5q值亦 降為約0.011 μ§/ηι卜因此可證實牛樟芝萃取物中之4_羥基 _2,3-二甲氧基·6_甲基_5 ( 3,7，η_三甲基_2,6，1〇_十二碳三 烯）-2 -環己烯酮確實能夠利用於乳癌腫瘤細胞生長之抑制， 且在紫杉醇之協同作用下，有更佳之抑制效果。 實施例4 : 體外抗肝癌腫瘤細胞之活性測試 本測試亦係根據美國國家癌症研究所抗腫瘤藥物篩檢 模式進行，將實施例1中所分離之4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 ( 3,7，11-三曱基_2,6,10-十二碳三烯）環己烯酮化合 物，加入Hep 3Β與Hep G2人類肝癌腫瘤細胞培養液中進 行培養，藉以進行腫瘤細胞存活性之測試。 首先將人類肝癌細胞Hep 3B與Hep G2分別於含有胎 牛金清之培養液中培養24小時。將增生後之細胞以PBS 清洗一次’並以1倍之胰蛋白酶_EDTa處理細胞，隨後於 l，200rpm下離心5分鐘，將細胞沈澱並丟棄上清液。之後 加入10 ml的新培養液，輕微搖晃使細胞再次懸浮，再將 細胞分置於96孔微量盤内。測試時，分別於每一孔内加入 30、10、3、1、0.3、〇.1與0.03 pg/ml之牛樟芝乙醇萃取 物（對照組’未經純化分離之總萃取物）以及30、10、3、 15 201034657 0·3 Ο」轉0.03 Mg/mi之4-輕基-2,3-二曱氧基-6-甲基 (3,7，11-三甲基_2,6，ι〇_十二碳三烯）_2•環己烯酮（試驗 組）’於37〇C、5% C〇2下培養48小時。其後，於避光 的婊丨兄下於每〜孔内加入2.5 mg/ml的MTT，反應4小時 後再於每一孔内加人100 μΐ的lysis buffer終止反應。最後 j酵素免疫分析儀在57〇 nm吸光波長下測定其吸光值， 藉以計算細胞的存活率，並推算出其IC5G值，其結果如表 三戶斤示。 〇 表三··體 外對肝癌腫瘤細胞抑制之測試結果

1C 5.121 18.631 0.005 1.679 對照組(加入牛樟芝萃取物） Hep 3B Hep G2 2) 試驗組(加入式 ❹

Hep 3B Hep G2 (，7，11 一曱基-2,6，l〇_十二碳三烯） 其對於Hep 3B人類肝癌腫瘤細胞作用’ ，對於Hep G2人類肝癌殖瘤細跑“ 7 =05 1.679 μ_1 ’相較於牛樟芝萃取混合物=:為 基.6_甲基_5 (^三f 基妙二$甲氧 酮嫁實能夠利用於肝癌腫瘤細胞生長烯）2%己稀 16 201034657 實施例5 : 體外對肝癌腫瘤細胞輔助治療之活性測試 本測試同樣係根據美國國家癌症研究所的體外筛檢模 式進行測試。首先，取人類肝癌細胞Hep 3B與Hep G2， 分別於含有胎牛血清之培養液中培養24小時後，將增生後 之細胞以PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶_EDTA處理 細胞，隨後於1,200 rpm下離心5分鐘，將細胞沈澱並丟棄 0 上清液。之後加入10 ml的新培養液，輕微搖晃使細胞再 次懸浮。測試前，先於Hep 3B細胞株試驗加入0.0043 pg/ml Lovastatin ’而於Hep G2細胞株試驗加入〇_〇〇17 pg/ml紫 杉醇（Taxol) ’處理細胞72小時’再將細胞分置於96孔 微量盤内’之後分別於每孔内加入〇 pg/ml (對照組），3〇、 10、3、1、0.3、0.1與〇.〇3 pg/ml實施例1中所分離之4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5 ( 3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳 三烯）-2-環己烯酮（試驗組），於37。〇、5% c〇2下培養 r 48小時。其後’於避光的環境下於每一孔内加入2.5 mg/ml 的MTT’反應4小時後於每一孔内加入loo μΐ的iySis buffer 終止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下 測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率，並推算出其ic50 值’其結果如表四所示。 表四·體外對肝癌腫瘤細胞經紫杉醇輔助治療後抑制 之測試結果 結果 測試樣品 17 201034657 對照組 細胞存活率（％)

Hep 3B (0.0043 pg/ml Lovastatin) 61±3

Hep G2 (0.0017 pg/ml Taxol) 81±2 試驗組 IC5Q (pg/ml)

Hep 3B (0.0043 pg/ml Lovastatin+式 2) 0.002

Hep G2 (0.0017 pg/ml Taxol + 式 2) 0.008 由表四中可知，透過Lovastatin及紫杉醇之協同作用， 4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5 ( 3,7，1卜三曱基-2,6,10-十二 〇 碳三稀）-2-環己烯酮對於Hep 3B人類肝癌腫瘤細胞之IC50 值降為0.002 pg/ml，對於Hep G2人類肝癌腫瘤細胞之IC50 值亦降為約0.008 gg/ml，因此可證實牛樟芝萃取物中之4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5 ( 3,7,11-三曱基-2,6，10-十二碳 三烯）-2-環己烯酮確實能夠利用於肝癌腫瘤細胞生長之抑 制，且在紫杉醇之協同作用下，有更佳之抑制效果。 實施例6 : 0 體外抗攝護腺癌腫瘤細胞之活性測試 本測試亦係根據美國國家癌症研究所抗腫瘤藥物篩檢 模式進行，將實施例1中所分離之4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5 ( 3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯酮化合 物，加入LNCaP與DU-145人類攝護腺癌腫瘤細胞培養液 中進行培養，藉以進行腫瘤細胞存活性之測試。 首先將人類攝護腺癌細胞LNCaP與DU-145分別於含 有胎牛血清之培養液中培養24小時。將增生後之細胞以 18 201034657 PBS清洗一次，並以1倍之胰蛋白酶-EDTA處理細胞，隨 後於1,200 rpm下離心5分鐘’將細胞沈澱並丟棄上清液。 之後加入10 ml的新培養液，輕微搖晃使細胞再次懸浮， 再將細胞分置於96孔微量盤内。測試時，分別於每一孔内 加入30、10、3、1與0.3 pg/ml牛樟芝乙醇萃取物（對照組， 未經純化分離之總萃取物）以及30、1〇、3、1與〇.3 jLig/m!由 實施例1所分離之4-羥基-2,3-二甲氧基_6_曱基_5 (3,7，u_ 三甲基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯_(試驗組），於37〇c、 〇 5% C〇2下培養48小時。其後，於避光的環境下於每一 孔内加入2.5 mg/ml的MTT，反應4小時後再於每一孔内 加入100 μΐ的lysis buffer終止反應。最後以酵素免疫分析 儀在570 nm吸光波長下測定其吸光值，藉以計算細胞的 存活率，並推算出其IC5G值，其結果如表五所示。 表五：體外對攝護腺癌腫瘤細胞抑制之測試結果 測試樣品 忙50 ( pg/ml) 對照組(加入牛樟芝萃取物） LNCaP 11.491 DU-145 41.392 試驗組(加入式2) LNCaP 2.378 DU-145 1.812 由表五中可知，藉由4_羥基-2,3-二甲氧基_6_曱基_5 (3,7,11-二曱基-2,6,10-十二石炭三：-2-環己稀_的作用， 19 201034657 其對於L N C aP人賴護㈣_細蚊！ c $。值 gg/ml，對於DU-145人類攝護腺癌腫瘤細胞之*為2.378 為1.812 _卜相較於牛樟芝萃取混合物所測得^值則降 係低的多，因此可證實牛棒芝萃取物中之4_ C二值 氧基-6-甲基-5(3,7,11-二甲芙261〇_^__山 ’ 一甲 —T基-2,6,10-十二碳三稀） 烯嗣確實能夠利用於攝護腺癌腫瘤細胞生長之抑制。…展己 實施例7 : 〇體外對攝護腺癌腫瘤細胞辅助治療之活性測試 本測試同樣係根據美國國家癌症研 式進行測試。首先’取人類攝護腺癌細 DU-M5,分別於含有胎牛血清之培養液中培養Μ 與 將增生^之細胞以咖清洗_次，並以1倍之胰蛋白酶 -EDTA處理細胞，隨後於u〇〇啊下離心5分 胞沈殿並丢棄上清液。之後加入1〇ml的新培養液丄 搖晃使細胞再次懸浮。測試前，先於LNCap細 驗= 〇入0蕭紫杉醇，而於购45胞賴驗加入〇〇〇43 吨編紫杉醇分別處理細皰72小時，㈣細胞分置於％ 孔微1盤内，之後分別於每孔内加人Q Μ# (對照組）， 30 10 3 1 0.3、0.1與〇·〇3μβ/ιη1於實施例1中所分 離之4-輕基-2,3-二甲氧基_6_甲基_5 (3,7,u_三甲基_2,6,1〇_ 十二碳三烯環己稀_(試驗組），於3rC、5% C〇2下

^養48 *時其後，於避光的環境下於每一孔内加入W mg/ml的ΜΤΤ ’反應4小時後於每—孔内加人剛…的如is buffer終止反應。最後以酵素免疫分析儀在W吸光波 20 201034657 長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率，並推算出其 IC5G值’其結果如表六所示。 表六：體外對攝護腺癌腫瘤細胞經紫杉醇輔助治療後 抑制之測試結果 測試樣品 結果 對照組 細胞存活率（％) LNCaP (0.0017 pg/ml Taxol) 56 土 3 DU-145 (0.0043 pg/ml Taxol) 70+2 試驗組 IC5〇 (Mg/niD LNCaP (0.0017pg/ml Taxol+式 2) 0.961 DU-145 (0.0043pg/ml Taxol+式 2) 0.515 由表六中可知，透過紫杉醇之協同作用，4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5(3,7，11-三甲基-2,6，1〇_十二碳三烯）-2-環己烯酮對於LNCaP人類攝護腺癌腫瘤細胞之IC5G值降為 0.961 pg/m卜對於DU-145人類攝護腺癌腫瘤細胞之；π：% ❹值亦降為約0.515 pg/ml ’相較於牛樟芝萃取混合物所測得 之IC5〇值係低的多’因此可證實牛樟芝萃取物中之4-經基 -2,3- 一甲氧基-6-甲基-5 ( 3，7,11-三曱基_2 6,10 -十二石炭二 烯）-2-環己烯酮確實能夠利用於攝護腺癌腫瘤細胞生長之抑 制，且在紫杉醇之協同作用下，有更佳之抑制效果。 實施例8 : 體外抗氧化活性之試驗 21 201034657 一般抗氧化活性之測試’係利用人類低密度脂蛋白 (human low density lipoprotein，LDL)，加入銅離子（Cu2+) 與待測樣本進行氧化反應’檢測LDL上二烯之反應結果後， 以維生素E之水溶性類似物Trolox作為對照（τΓο1〇χ濃度為 2 μΜ時，其效力值訂為標準值ι·0)，計算出待測樣本之抗氧 化活性。 首先準備二次純水(控制組），並配製5mM磷酸鈉緩衝溶 液（sodium phosphate buffer ’ SPB )、1 μΜ 與 2 μΜ 的 Trolox ❹（對照組)及40pg/ml由實施例1中所分離之4_經基_2,3_二曱氧 基-6-甲基-5 (3,7，11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯）_2_環己烯酮 (試驗組）。利用酵素法測得低密度膽固醇濃度(LDL_C)後， 利用5 mM SPB.將LDL稀釋至〇.1〇〜0.25 mg/ml間。取96孔 的石英微量盤’於其中先加入1〇〇 μ1之LDL，再分別加入前 述預定濃度的Trolox及由實施例1中所分離之化合物，之後 再分別加入CuS〇4溶液以啟動氧化反應(每一 25〇…孔中的銅 ^ (11)濃度為5.0 μΜ)，最後將該微量盤置於酵素免疫微量盤 分析儀（ELISA reader)中進行檢測。酵素免疫微量盤分析儀 檢測波長設為232 nm，溫度設為37°C，偵測時間為12小時， 採樣間隔時間為15分鐘，其結果如表七所示。 表七：體外抗氧化活性之刺試結果 測試樣品 Tlag(分） △Tlag(分） 效力值 氏0(控制組，Tlago) 185 1 μΜ Trolox (對照組） 266 81 0.48 2 μΜ Trolox 344 159 1.00 22 201034657 40 pg/mL 式 1_439 208 1.30 註1 : Tlag(分）係指在吸收光波長為234 nm下，延滯期（lag phase)與連鎖期（propagation phase)的交差點；ATlag(分) 係指各測試樣品Tlag時間與Tlag〇時間的差值。 註2 :效力值>0.5時，表示其具抗氧化作用。 由表七中可知，4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三 曱基-2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯酮具有1.30之效力值，其 比具抗氧化能力之標準值0.5高出甚多，亦即，其具有相當之 抗氧化能力，因此可用作保健食品、飲食品、醫藥品、化妝品 當中之成分，藉由其抗氧化能力達到預防心血管疾病或避免細 胞突變等效用，使對於施用之人體健康產生莫大的助益。 23 201034657 【圖式簡單說明】 無 【主要元件符號說明】

Claims (1)

1. 201034657 七、申請專利範圍： 1、 一種化合物，該化合物係4-羥基-2,3-二曱氧基-6_曱基 •5 (3,7，11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己烯酮 ( 4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,l 1- trimethyl -dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone )° 2、 如申請專利範圍第1項所述之該化合物，其係分離自 牛掉芝。 3、 一種將如申請專利範圍第1項所述化合物利用於製 備抑制乳癌腫瘤細胞生長之藥物的應用。 4、 如申請專利範圍第3項所述之應用，其中該乳癌腫瘤 細胞係MCF-7或MDA-MB-231細胞系。 5、 一種將如申請專利範圍第1項所述化合物利用於製 備抑制肝癌腫瘤細胞生長之藥物的應用。 6、 如申請專利範圍第5項所述之應用，其中該肝癌腫瘤 細胞係Hep 3B或Hep G2細胞系。 7、 一種將如申請專利範圍第1項所述化合物利用於製 備抑制攝護腺癌腫瘤細胞生長之藥物的應用。 8、 如申請專利範圍第7項所述之應用，其中該攝護腺痒 腫瘤細胞係LNCaP或DU145細胞系。 … 9、 一種將如申請專利範圍第丨項所述之化合物利用於夢備具 抗氧化活性之藥物的應用。 一 25 201034657 10、一 種 利用於抑制腫瘤細胞生長之醫藥組成物，包括一有效 劑量如申請專利範圍第 1項所述之化合物以及一藥學上可 接受之載體，其中該腫瘤細胞係選自乳癌、肝癌或攝護腺 癌之腫瘤細胞。

   26 201034657 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（無> 圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： Ml 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：

   OH h3c、〇

   〇、ch3

   201034657 micranthum. Phytochemistry. 41 ： 1389.1392 )。虽隹，然由 目％諸多之實驗可得知牛樟芝萃取物具有抑癌之功效 (如前述Chen (1995)) ’但究為何種有效成分可達到抑 制腫瘤細胞效果之研究，目前則仍處於試驗階段，並 未有具體之有效成分發表’故若能將該萃取物進一步 純化分析’找出其真正有效抑癌成分，對於人類癌症 之治療實將產生莫大的助益。 〇 【發明内容】 為明暸牛樟芝萃取物中究竟是何成分具有抑癌之 效果’本發明由牛樟芝萃取物中分離純化出具式G)結 構式之新穎化合物；

   其中，X係氧（〇 )或硫（S )，Y係氧或硫；R! 係氫基（H)、曱基（ch3)或(CH2)m-CH3，R2係氫基、 曱基或(CH2)m-CH3，R3係氫基、曱基或(CH2)m-CH3， m= 1 〜12 ; n= 1 〜12。 如式（1)結構式之化合物中，較佳者為如下所示式 (2)之化合物：