TWI379685B - - Google Patents

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137.9685 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種化合物之新應用，尤其係關於一種 利用由牛樟芝（)萃取物中所分離純化 之化合物抑制膀脱癌腫瘤細胞生長之用途。 【先前技術】 根據流行病學的調查，膀胱癌(bladder cancer)為泌尿生殖系統 .腫瘤中最常見的癌症，而且發生率有逐年增加的趨勢，常好發於 男性，男性的發生率通常是女性的二到五倍。膀胱癌之發生與許 多因素有關，而依據統計，與經常暴露於存在有化學致癌物如染 料中的苯胺(aniline)或芳香胺(aromatic amine)類化合物的環境下有 密切關係’譬如油漆、皮革卫人、卡車司機及錯管卫人等較易 罹患膀胱癌，其他危險因子包括抽菸、咖啡、茶、止痛藥、人工 甘味劑或慢性泌尿道發炎等也有可能導致膀胱癌的發生。 由於膀胱的位置是在下腹部的骨盆腔内，故膀胱癌初期多半 無法直接被觸診到’較難及早發現並適時給料療，當患者出現 血尿、頻尿、解尿困難、解尿疼痛、尿急與尿液滯留、膀胱炎、 上泌尿道感料不適症狀時，大多已非補癌症，常導致治療成 效有限及預後狀況不佳。臨床上，膀胱癌之治療會依腫瘤的大小、 侵犯程度及病患身體狀況的不同，由醫師評估後，進行手術切除 治療、化學藥物治療及放射線治療等，然而儘管隨著醫藥科技的 進步’手術、化學躲或放射絲法在雜癌的治療成績都有明 1373685 -顯的提升，但化療或放射線治療會引發許多畐,^作用或併發症，此 外’研究指“於膀胱癌治療後常會有復發與轉移的情況，實際 上其整體治療率(五年存活率)並沒有明顯的改善。因此可有效治療 膀胱癌且不易產生副作用之物質的研發係為迫切需要。 牛樟芝⑼從），在台灣民間又稱為樟菇、 掉菰、樟内藏、牛樟兹或紅樟，是本省獨有之藥用_，其係屬 於非褶菌目㈣、多孔菌科(/)咖嶋叫之 #多年生蕈菌類。由於樟芝在自然界中僅寄生於台灣特有的保育 類牛樟木樹幹之中空心材内壁組織上，加上人為的盜伐，使^ 寄生於其中方能生長之野生牛樟芝數量更形稀少，且由於 在自然狀態下樟芝子實體的生長相#賴，_野生樟芝數量 少且價格昂貴。 牛樟芝之子實體為多年生’無柄，呈木栓質至木質， 其具強烈之樟樹香氣’且形態多變化，有板狀、鐘狀、馬 籲蹄狀或塔狀。初生時為扁平型並呈鮮紅色，之後其周邊會 呈現放射反捲狀，並向四周擴展生長，顏色亦轉變為淡红 褐色或淡黃褐色，並有許多細孔，且其係為牛掉芝之藥用 價值最豐富的部位。 在口灣民俗醫學上，牛樟芝具有祛風行氣、化齋活灰、 溫中消積、解毒消腫以及鎮靜止痛之功效，並視為上好的解毒劑， 凡食物中毒’腹《寫"區吐’農藥中毒均有解毒作用，此外對改善 肝、胃機麟概血賴環疾辆具有_轉功效。牛掉芝^ 1379685 .同一般食藥用之蕈菇類，具有許多複雜的成分，已知的生 理’舌性成分中’包括：三薛類化合物（triterpenoids)、多 醣體（polysaccharides，如；5 -D-葡聚醣）、腺苷（adenosine )、 維生素(如維生素B、菸鹼酸）、蛋白質（含免疫球蛋白）、 超氧歧化酵素（superoxide dismutase，SOD)、微量元素（如： I丐、磷、錄）、核酸、固醇類以及血壓穩定物質（如ant〇dia acid；) 等，此些生理活性成分被認為具有抗腫瘤、增加免疫能力、 • 抗過敏、抗病菌、抗高血壓、降血糖及降膽固醇等多種功 效，且有助於護肝及肝臟相關疾病之治療。 有關樟芝的成分研究，大多著重在大分子的多醣體 (polysaccharides)和小分子的三萜類（triterpenoids)和固醇類 (steroids)，其中’樟芝含有大分子之多醣體，以不同單糖組成存 在於其子實體及菌絲體中，但經光譜分析後皆含有具生理活性之 /3-D-葡聚醣(/3-D-glucans);三萜類化合物是由三十個碳元素 • 結合成六角形或五角形天然化合物之總稱，牛樟芝所具之 苦味即主要來自三萜類此成分，且其亦係被研究最多之成 份。從子實體得到的三萜類化合物有antrocin、4,7-二曱氧基·5_ 甲基-1,3-苯並二氧環（AJ-dimethoxy-S-methy-lJ-benzodioxole) 和2,2'，5,5’-四 曱氧基-3,4,3’，4'-雙-亞甲 二氧基 -6,6’-二甲基聯苯（2,2’，5,5'，teramethoxy-3,4,3'，4’_bi-methyl enedioxy-6,6’-dimethylbiphenyl) (Chiange<3/”1995)，以麥角 甾炫（ergostane)為骨架之新三萜類化合物antcin A、antcinB、 137.9685 antcin C antcin E、antcin F、methyl antcinate G 和 methyl antcinate Η (Chemg β < 1995，1996)。子實體另含以麥角甾烷為骨架的化 合物包含Zhankuic acid A、B 及C zhankuic acid D 和zhankuic acid E (Chen and Yang, 1995 ; Yang 1996) ’ 以羊毛甾烷（lanostane) 為骨架的新化合物15α -乙醯·去氫硫色多孔菌酸（μ α -acetyl-dehydrosulphurenic acid )、去氫齒孔酸

(dehydroebudcoic acid )與去水硫色多孔菌酸 (dehydrasulphurenic acid) 〇 雖然由目前諸多之實驗可得知牛棒芝萃取物具有前述 功效’且其所含成分亦_被分析出，但究竟萃取物中之 何種有效成何促成牛樟芝之抑她症倾，並未發表且 體之相關有贱分，有待進^ 找出該萃取物中所含真正有效抑制二= 利於牛樟芝抑癌相關機轉的研究，並對牛樟上= 例如膀胱癌之治療與預防有莫大的助兴 之應用於癌症 【發明内容】 為明瞭牛樟芝萃取物中 果’本發明由牛樟芝萃取 可成刀具有抑癌之效 之化合物 ； 〃離純化出具下制構式(1) 1379685 乙醇 耩由前述化合物，本發明係將其應用於抑制腫瘤細胞生長 上’使能進-步細包括於治療癌症之醫藥域财，增益癌症 之治療效果。本個對該化合物的_範圍包括對於膀脱癌腫瘤 細胞之生長抑制’藉由抑制該等腫瘤細胞之迅速生長，進 腫瘤之增生，视_瘤之統。其巾，之化合物 4山-經基-2,3·二甲氧基冬甲基_5(3,7儿三甲基_2,61〇_十二 兔二稀）-2·核己細銅。

另—方面，本發明中亦可將式⑴或/與式⑺之化合物 利用於抑制膀胱癌腫瘤細胞生長之醫藥組成物的成分中。 前述醫藥組成物除包括有效劑量之式⑴或/與式(2)之化人 物外，尚可包括藥學上可接受的載體。載體可為賦形劑 水）、填充劑（如嚴糖或澱粉）、黏合劑（如纖維素衍生物 稀釋劑、崩解割、吸收促進劑或甜味劑，但並未僅限於此 本發明醫藥組成物可依-般習知藥學之製備方法生 造，將式（1)或/與式(2)有效成分劑量與一種以上之载體 混合，製備出所需之劑型’此劑型可包括錠劑、粉劑 劑、膠囊或其他液體製劑，但未以此為限。 ’ 以下將配合圖式進-步說明本發明的實施方式，下 所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定 ^ 之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和 圍内’當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護 巴 視後附之申請專利範圍所界定者為準。 田 137.9685 【實施方式】 經萃取過後之牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物，可 進一步藉由高效液相層析加以分離純化，之後再對每一分 液（fraction)進行抑癌效果的測試。最後，則針對具抑癌 效果之分液進行成分分析，將可能產生抑癌效果的成分分 別進一步做膀胱癌腫瘤細胞之抑制效果測試。最終即發現 本發明中如式（1)/式（2)之化合物係具有抑制膀胱癌腫瘤細 胞生長之效果。 為方便說明本發明，以下將以式（2)之4-羥基-2,3-二曱 氧基-6-甲基-5 ( 3,7，11-三曱基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環己 烯酮化合物進行說明。此外，為證實4_羥基-2,3-二曱氧基 -6 -甲基-5 ( 3，7,11-二曱基-2,6,10 -十二碳二稀) -2-環己稀嗣 化合物對腫瘤細胞生長之抑制效果，本發明中係以MTT分 析法，根據美國國家癌症研究所（National Cancer Institute, NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，對膀胱癌腫瘤細胞進行細胞 存活率之測試。由該些測試證實’ 4-經基-2，3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三曱基_2,6，10_十二碳三烯）-2-環己烯酮對 於膀胱癌腫瘤細胞：TSGH-8301細胞系可降低其存活率，相 對之下並可同時降低生長半抑制率所需濃度（即IC5〇值）， 因此得藉由4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7,11-三甲基 -2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯酮，應用於膀胱癌腫瘤細胞 之生長抑制上，而進一步可利用於膀胱癌之治療。茲對前 述實施方式詳盡說明如下： 實施例1 : 9 1379685 4-羥基-2,3-二甲氧基_6-曱基_5 (3 711_三曱基_2,6，l〇_十二 碳三稀）-2-環己烯酮的分離 將100克左右之牛樟芝菌絲體、子實體或二者之混合 物’置入三角錐形瓶中，加入適當比例的水與醇類 (70%〜100%醇類水溶液），其中該醇類較佳為乙醇，於 20〜25 C下擾拌萃取至少1小時以上，之後以濾紙及0.45 μιη濾膜過濾，收集濾液即得牛樟芝萃取液。 將前述收集之牛樟芝萃取液，利用高效能液相層析儀 (High Performance Liquid chromatography)’ 以 RP18 的層析 管（column)進行分析，並以曱醇(a)及〇.l〇/0〜0.5%醋酸水溶 液(B)做為移動相（mobile phase)(其溶液比例係：0~1〇分 鐘，B比例為95%〜20%; 10〜20分鐘，B比例為20%~1〇% ; 20〜35分鐘，B比例為10%〜90%; 35〜40分鐘，B比例為 10%〜95%)，在每分鐘1 ml之速度下沖提，同時以紫外-可見光全波長俄測器分析。 將25分鐘至30分鐘之沖提液收集濃縮即可得淡黃色 粉末狀之固體產物，此即4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5 (3,7，11_三曱基-2,6，10-十二碳三烯）-2_環己烯酮。經分 析，其分子式為C24H38 04，分子量390，熔點（m.p.)為 48°C〜52°C。核磁共振（NMR)分析值則如下所示： ^-NMRCCDCls) 5 (ppm) ： 1.51 ' 1.67 > 1.71 > 1.75 > 1.94 > 2.03、2.07、2.22、2.25、3.68、4.05、5.07 與 5.14。 13C-NMR(CDC13)5 (ppm): 12.31、16.卜 16.12、17.67、25.67、 26.44、26.74、27.00、39.7卜 39.81、4.027、43.34、59.22、 1379685 60.59、120.97、123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、 138.05、160.45 與 197.12。 實施例2 : 體外抗膀胱癌腫瘤細胞之活性測試 為進一步測試實施例1中所發現化合物對腫瘤細胞之 抑制效果’本實抱例將根據美國國家癌症研究所（National • Cancer Institute, NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，首先取實施 例1中所分離之4-羥基-2,3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三 甲基_2,6,10-十_一石厌二缔）-2-環己稀嗣化合物，加入含有人 類膀胱癌腫瘤細胞TSGH-8301的培養液中，進行腫瘤細胞 存活性之測試。其中’細胞存活性之測試可採習知之Μττ 分析法進行分析’而膀胱癌腫瘤細胞TSGH-8301係為人類膀 胱癌細胞株(human bladder carcinoma cell line)。 MTT分析法是一種常見用於分析細胞增生（eeu proliferation)、存活率（percent of viable cells)以及細胞 毒性（cytotoxicity )的分析方法。其中，MTT ( 5 dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide)為一 黃色染劑’它可被活細胞吸收並被粒腺體中的玻轴酸四。坐 還原酶（succinate tetrazolium reductase)還原成不溶水[生 且呈藍紫色的formazan，因此藉由formazan形成與否，民 可判斷並計算細胞之存活率。 137.9685 首先將人類膀胱癌細胞TSGH-8301於含有10%胎牛血 清(fetal bovine serum)之DME1V[培養基進行培養，該培養基尚 包含100 IU/ml之盤尼希林(Penicillin)，及100 mg/ml之鏈 黴素（Streptomycin)，並於5 % C02，37 °C環境中培養24小時。 將增生後之細胞以PBS清洗一次，並以1倍之騰蛋白酶·ε〇τΑ處 理細胞’隨後於l，200rpm下離心5分鐘，將細胞沈澱並丟棄上清 液。之後加入10 ml的新培養液，輕微搖晃使細胞再次懸浮，再將 細胞分置於96礼微量盤内。測試時’分別於每一孔内加入3〇、1〇、 • 3、1、0·3、0.1與0.03 pg/ml的牛樟芝萃取液作為對照組(未經純 化分離之總萃取物）；以及於每一孔内加入30、1〇、3、1、0.3、 0.1與0_03 pg/ml的4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三曱基 -2,6，10-十二碳三稀)-2·環己稀酮作為試驗組，於37°c、5% C〇2下 培養48小時。其後，於避光的環境下於每一孔内加入2 5 mg/ml 的MTT ’反應4小時後再於每一孔内加入100 μ1的lysis buffer終 止反應。最後以酵素免疫分析儀在570 nm吸光波長下測定其吸光 值，藉以計算細胞的存活率，並推算出其生長半抑制率所需濃度 鲁 （即IC5〇值）’其結果如表一所示。 表一：體外對膀胱癌腫瘤細胞存活率之測試結果 --空式樣 °〇P ICsn C ug/mn 试驗組（加入式2) TSGH-8301___1 〇5 由表一 t可知，藉由4-羥基-2,3-二甲氧基·6_曱基 (3,7，11·三曱基-2,6，l〇-十二碳三稀）_2_環己稀酮的作用， 其對於TSGH-8301人類膀胱癌腫瘤細胞之ICsq值為i 〇5 1379685 • μ g / m 1，相較於對照組牛樟芝萃取混合物所測得之IC 5 ο值（表 中未示）係低的多，因此可證實牛樟芝萃取物中之4-羥基 -2,3-二曱氧基-6-曱基-5(3,7，11-三曱基-2,6，10-十二碳三 烯）-2-環己烯_確實能夠利用於膀胱癌腫瘤細胞生長之抑 制。 綜上所述，本發明分離自牛樟芝之4-羥基_2,3-二曱氧 基-6-甲基-5 (3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯 酮化合物，係可有效抑制膀脱癌腫瘤細胞之生長。另一方 面，因牛樟芝環己烯酮化合物係為天然萃取之物質，故其 應用於抑制膀胱癌時，並不會引起患者不適或產生毒性、 併發症等其他副作用，且其亦可與化療藥劑並用，以減少 化療藥物使用劑量並降低該些化療藥劑所引發之副作用； 此外，亦可將其製備成治療膀胱癌之醫藥組成物，其中， 該醫藥組成物除包含有效劑量之牛樟芝環己烯酮化合物 外，尚可包括藥學上可接受的載體。載體可為賦形劑（如 水）、填充劑（如嚴糖或殿粉）、黏合劑（如纖維素衍生物）、 稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味劑，但並未僅限於此。 本發明醫藥組成物可依一般習知藥學之製備方法生產製 造，將有效成分劑量之牛樟芝環己烯酮化合物與一種以上 之載體相混合，製備出所需之劑型，此劑型可包括錠劑、 粉劑、粒劑、膠囊或其他液體製劑，但未以此為限。藉以 達到治療膀胱癌腫瘤疾病之目的。 13

Claims (1)

1. 公告本; 第MI30421就，101年8月修正頁 七、申請專利範圍： 1.-種將下列化合物利用於製備抑制膀胱癌腫瘤細 胞唑長之藥物的應用，其中該化合.物係4-羥基-2,3-二曱氧 基-6-甲基-5·(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯）-2-環己烯 鲷 (4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(3,7,l 1-trymethyl-dode ca-2J6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone) s 2·如申請專利範圍第1項所述之應用，其中該化合物 係由牛樟芝萃取物所分離製得。 '3.如申請專利範圍第2項所述之應用，其中該化合物 係由牛樟芝之水萃取物所分離製得。 4. 如申請專利範圍第2項所述之應用，其中該化合物 係由牛樟芝之有機溶劑萃取物所分離製得β 5. 如申請專利範圍第4項所述之應用，其中該有機溶 劑係選自酯類、醇類、烷類及齒烷所组成之群組9 6. 如申請專利範圍第5項所述之應用，其中該醇類係 6醇。 7. 如申請專利範圍第1項所述之應用，其中該膀胱癌 腫瘤細胞係TSGH-8301細胞系。 8. —種用於抑制膀胱癌腫瘤细胞生長之醫藥組成物， 包括一有效劑量如申請專利範園第1項所述之化合物以及 一藥學上可接受之載體〗 9. 如申請專利範圍第8項所述之醫藥組成物，其中該 化合物係牛樟芝萃取物所分離製得。 1379685 10·如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物，其中該 化合物係由牛樟芝之水萃取物所分離製得。 • 11.如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物，其中該 化合物係由牛樟芝之有機溶劑萃取物所分離製得。 12. 如申請專利範圍第11項所述之醫藥組成物，其中該 有機溶劑係選自酯類、醇類、烷類及卤烷所組成之群組。 13. 如申請專利範圍第12項所述之醫藥組成物，其中該 醇類係乙醇。 • 14.如申請專利範圍第8項所述之醫藥“成物，其中該 膀胱癌腫瘤細胞係TSGH-8301細胞系。