TW200907340A - Fluorescence based assay to detect sodium-calcium exchanger (NCX) "forward mode" modulating compounds - Google Patents

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200907340 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於納-約交換劑（NCX)以及用於決定它 們的活性的方法。更特別地，本發明有關於用以檢測NCX 5 ‘‘運轉模式（forward mode)”調控化合物之螢光為主的分析 法。它更涉及一具有包含表現(expriming) NCX的細胞之 部件的套組以及該具有部件之套組的用途。 【先前技術】 0 對於生命來說，分室作用（compartmentalization)-()是 一個基本要件-利用生物膜做為天然工具來解這個原理。 然而’一脂質雙層-構成細胞膜的的結構-對於大多數離子 與化合物（其運輸對於維持細胞以及生物内的生活機能是 必須的）來說是不通透的（impermeable)。此矛盾的解答在於 5 細胞膜的半通透性特質_必須跨越膜的溶質是藉著特定膜 蛋白而被運輪。這些轉運蛋白（transporters)負責產生並維 持離子梯度 '營養的攝取、代謝物的運輸’傳訊分子的回 收(reuptake)以及毒性與廢棄化合物的處理。因此，轉運蛋 白是有潛力的藥物標靶’其在本文中可能直接影響疾病_ 0 相關聯的異常。 鈉/_交換劑對於從不同細胞移除Ca2+來說是一個重 要的機制。在心臟，它排出透過Ca2+通道而進入的Ca2+ 來起始收縮，同時Na+進入心臟細胞。它在心血管疾病的 關耳外性是例如在 Hobai，JA & 〇’R〇urke3 (2004) Expert 200907340 〇pin_ Investig. Drugs，13, 653-664 中所說明的。因此，製 术產業已發展出抑制NCX的化合物，像是例如在Iwamoto, T. et al. (2004) J. Biol. Chem·, 279, 7544-7553 中所描述 的。Na+/Ca2+交換劑發電地(electorgenically)運送三至四個 5 Na+以交換每一個以反方向移動的Ca2+’像是例如在Hinata， M. et al. (2002) J. Physiol. 545, 453-461 中透過電生理學方 法所顯示的。NCX可以維持細胞質ca2+濃度（[Ca2+]内）低 於細胞外Ca濃度（[Ca2+]外）三到四個數量級（onjers 〇f magnitude)。然而’淨Ca2+運輸的方向是視Na+的電化學 1〇 梯度而定。同時的與連續的運輸模式已被建議是用於Na+ 以及Ca2+的移位(translocation) ’且大多數證據偏向後者。 • 轉運蛋白是一個具有極大潛力的新興標靶家族，提供 - 科學上與經濟上的契機。另一方面，從藥物發現技術 (drug-discovery technologies)的觀點看來，轉運蛋白是一個 15 困難的標靶種類。 鑑定出s周控通道活性（舉例來說，透過阻斷甸的流動 和/或抑制鈣通道的活化）的化合物有相當大的利益。一個 這麼作的標準方法是透過使用膜片箝制實驗(patch damp experiments)。在這些實驗中’細胞必須個別並且依次地受 20 高度技術的操作人員評估，透過測量對膜電位的改變和/ 或測試化合物的施用起反應而跨越細胞膜的每流。 Sea0400 (—種NCX的新專一性抑制劑）在狗心室乳頭肌的 動作電位上的作用被研究並且由K. Acsai於慕尼黑的 “ESC Congress 2004”期間在海報編號2886 (標題：一種專 200907340 一性鈉-鈣交換劑阻斷劑Sea0400在狗心室肌以及Purkinje 纖維中對於心室動作電位與所引起之活性的作用）上與由 C. Lee等人（藥理學與實驗治療雜誌（The j〇urnal 〇f pharmacology and experimental) ； Vol. 311: 784-757, 5 2004 ;標題：SEA0400 [2-[4[(2,5-二氟苯基）曱氧基]苯氧 基]-5-乙氧基苯胺]在心臟Na+/ Ca2+交換劑，NCX1.1，上 來被3平估的抑制性分析）所揭示。 經顯示使用一離子-選擇性電極技術來定量巨大膜片 (patches)内的離子流動，心臟Na+/ Ca2+交換劑具有多重運 10 輸模型（Tong Mook Kang & Donald W. Hilgemann; Nature;

Vol. 427, 5 February 2004;標題：心臟 Na+/Ca2+交換劑的多 ' 重運輸模型）。 - 儘管這些實驗是有根據的並且有益的，卻是非常耗時 且不適合用於調控鈣離子通道活性的化合物的高-通量分 15 析法。 各種不同的技術已被發展作為針對電生理學的標準 方法的替代。舉例來說，放射性流動分析法(radioactive flux assays)已被使用，其中細胞是被曝露以放射性示蹤劑 (radioactive tracer)(例如45Ca)且經放射線-標定的Ca的流 2〇 動被監測。負載有示蹤劑的細胞被暴露於化合物且那些不 論是增強或減少示蹤劑流動的化合物被鑑定為細胞膜中 離子通道的可能活化劑或抑制劑。一個特定的實例被揭示 在 T. Kuramochi et al.; Bioorganic & Medicinal Chemistry; 12 (2004) 5039-5056;標題：作為鈉-鈣交換劑的新穎抑制劑 7 200907340 的苯氧基吼啶衍生物的合成以及結構-活性關係。 EP1031556揭示一種方法，其中Na+/Ca2+交換劑活性是使 用肌膜小泡（sarcolemmalvesicle)來被測量，攝取到肌膜小 泡的Ca2+濃度是藉著測量45Ca放射性而被決定。 、 一些放射性離子-轉運蛋白分析法具有受限的敏感性 與因而不足夠的過時品質。此外，與放射性篩選技術相關 聯的費用於安全問題是阻撓廣泛應用的障礙。 在上面所引述的藥物_發現技術中，使用放射性流動 分析法來鑑定調控離子通道與離子轉運蛋白活性的化合 物是最為接近本發明的先前技術，因為它是一種在其中一 個測試化合物可以透過監測來自細胞的Ca2+流動而被鑑 定為可能活化劑或抑制劑的技術。有關於放射性分析法的 主要問題在於偵測每秒偵測大約1至1000分子的離子轉 運蛋白之有限週轉率的困難性_大約低於多數離子通道的 1〇4 倍。 因此從該技藝狀態所產生的問題是要以一非常好的 敏感性與實用性來發現一種耐用的分析法以供用於高通 量篩選與NCX調控劑的分析。那個問題的解決方案是由 本發明所提供。 【發明内容】 本發明之一標的涉及一種用以決定NCX蛋白活性的 分析法，其中： a)表現NCX的細胞被提供； 8 200907340 b) —用於決定細胞内鈣的有色物質被提供； c) 細胞被接觸以一 NCX活性活化劑；以及 d) 比較來自該有色物質之發光訊號與一在對照組實 驗中所產生的發光訊號之由鈣所媒介的變化。 5 本發明之另一標的涉及一種用以決定NCX蛋白對一 化合物的添加起反應之活性的分析法，其中： a) 表現NCX的細胞被提供； b) —用於決定細胞内鈣的有色物質被提供； c) 細胞被接觸以一化合物，其中在以該化合物處理 1〇 之前，該等細胞已以一 NCX活性活化劑處理過； 以及 - d)比較來自該有色物質之發光訊號與一在對照組實 驗中所產生的發光訊號之由鈣所媒介的變化。 一般來說，所使用的NCX蛋白是哺乳動物來源的， 15 並且特別是人類來源的。該NCX蛋白是選自於NCX1、 NCX2、NCX3、NCX4、NCX5 ’ NCX6 和/或]SfCX7，尤其 是 NCX1，NCX2 和/或 NCX3。

一般來說，被使用在本發明之分析法中的細胞可以衍 生自任何真核細胞生物。在一較佳實施例中，該等細胞為 20 哺乳動物細胞。在一更佳實施例中，該等細胞為CHO (CCL-61)、HEK (CCL-1573)、COS7 (CRL-1651)和 / 或 JURKAT(CRL_1990)細胞。 特別地’被使用在本發明之分析法中的NCX活性活 化劑為離子黴素（ionomycin)。 9 200907340 在一較佳實施例中’該有色物質是作為一能夠進入細 胞並且被水解成一染料的染料前驅物而被添加到細胞，藉 此該染料與鈣在該等細胞中複合並且提供〜發光訊號。^ 者該染料前驅物較佳地可以是一乙醯氣基甲醋衍生物且 5 該染料較佳地可以是詞敏感性螢光染料flu〇、4。在一更佳 實施例中，該發光訊號為螢光且該監測步顿^採用了一 FLIPR裝置。 本發明更有關於一如同前述的分析法的用途，以測試 一化合物有關於作為NCX的一激動劑或拮抗劑的活性。 10 在另一較佳實施例中，本發明有關於一如同前述的分析法 的用途，供用於診斷一與一 NCX改變之表現:關二的疾 _ 病。 本發明更有關於一個具有部件的套組，包含冑： a)表現NCX蛋白之經珠乾的細胞； 15 b) —有色物質； c) 一化合物緩衝液；以及 d) —有色物質緩衝液。 在本發明之具有部件的套組的一較佳實施例中，該有 色物質為辦敏感性螢光染料fluo-4。在另一較佳實施例 2〇 中，所使用的NCX蛋白是哺乳動物來源的，並且特別是 人類來源的。該NCX蛋白是選自於NCX1、NCX2、NCX3、 NCX4、NCX5，NCX6 和/或 NCX7，尤其是 NCX卜 NCX2 和/或NCX3。在另一較佳實施例中， 本發明更有關於一如同前述之具有部件的套組的用 10 200907340 ㈣—化合物有關於作$ NCX的-激動劑或抬抗 劑的活性。在另—較佳實施例中，本發财關於-如同前 述之具有部件的套組的用途，供用於診斷一與一 ncx改 變之表現相關聯的疾病。 〃 本發明的詳細說明 術《。分析法(assay)’’意指一個操作程序，|中一系统 或物體驗質賴量。分析法是—财關生物學分析法之 間略表達的常用術語並且是活體外實驗的一種。分析法虫 1〇 ㈣被被實施以測量—物質在-活性生物體上的作用。分 析法可以疋疋性或定量，它們在新藥物的發展中是必要 的。 忒私的分析法提供一個廣泛的動態範圍以使得一 NCX蛋白的活性可以被決定。特別地本發明令一用於篩選 1 並且刀析钻學上有效之化合物（其專一地與一 蛋白的 活性交互作用並且調控該NCX蛋白的活性）的快速，有效 率的分析法變得可行的。 一術語“NCX蛋白，，或“NCX，，在本發明的上下文中理應 表示具有下列Na+/ Ca2+交換劑蛋白之列表的任何一者（不 *° 論是單獨或彼此組合）：NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、 NCX5 > NCX6 > NCX7 ° 特別被偏好的是NCX1，NCX2和/或NCX3，其胺基 酸序列分別地對應於序列辨識編號：1，序列辨識編號：2 以及序列辨識編號：3。 11 200907340 此NCX蛋白可以衍生自任何脊椎動物並且特別是哺 乳動物物種(例如狗、馬、牛、小鼠、大鼠、犬、兔、雞、 類人猿、人類或其他）。該NCX可以是分離自此類脊椎動 物生物的組織探針或可以藉著能夠表現NCX蛋白之重組 5 型生物材料的方法而被製造。 術s吾NCX蛋白”意指多肽、多型變異體、突變體以及 種間同源物，其具有一胺基酸序列相對於被包含於序列辨 識編號.1，序列辨識編號：2以及序列辨識編號：3内的 核酸序列所編碼之胺基酸序列具有高於大約8〇%胺基酸 10 序列相同性、85%、90%，較佳地 91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97% ’ 98%或99%或更高的胺基酸序列相同性， 較佳地超過一個具有至少大約25、50、100、200，或500， 或更多胺基酸的區域。 術語“生物材料(biological material)，，意指任何含有遺 15 傳訊息並且可以複製自身或在一生物系統中被複製的材 料。重組型生物材料是任何藉由該技藝中習於技藝者所熟 知的重組技術而被生成，經改變或修飾的生物材料。 下列參考文獻是選殖特定NCX蛋白的實例：犬Na+/ Ca2+交換劑NCX1已被Nicoll, DA.等人所選殖（science. 2〇 250(4980): 562_5, 1990;標題：心肌膜 Na(+)-Ca2+交換劑的 分子選殖以及功能性表現）。人類Na+/Ca2+交換劑NCX1 已被 Komuro, 1_ 等人（proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4769-4773, 1992;標題：人類心臟Na+/Ca2+交換劑cDNA的 分子選殖以及特性描述）以及Kofuji，Ρ·等人(Am. J. Physiol. 12 200907340 263 (Cell Physiol· 32): C1241-C1249, 1992;標題：Na-Ca 交 換劑在不同組織中的表現：一個使用經選殖的人類心臟 Na-Ca交換劑的研究）所選殖。人類Na+/Ca2+交換劑NCX2 已被 Li，Z.等人所選殖(J. Biol. Chem. 269(26): 17434-9, 1994;標題：細胞膜Na(+)-Ca2+交換劑的NCX2異構型的 選殖）。大鼠Na+/Ca2+交換劑NCX3已被Nicoll, DA.等人 所選殖（J. Biol· Chem. 271(40): 24914-21, 1996;標題：一個 第三種哺乳動物Na+/Ca2+交換劑NCX3的選殖）。人類 Na+/Ca2+交換劑NCX3已被Gabellini, N.等人所選殖(Gene. 298: 1-7, 2002;標題：人類SLC8A3基因以及組織特異性 Na+/Ca2+交換劑3異構型）。 術語“多肽”、“肽”以及“蛋白質”在此處被交替地使用 來意指胺基酸殘基的聚合物。該術語應用於胺基酸聚合 物，其中一或多個胺基酸殘基是一個對應天然存在之胺基 酸的人工化學模擬物，還有天然存在的胺基酸聚合物以及 非天然存在的胺基酸聚合物。 術語“NCX蛋白的活性”意指從一細胞移除細胞内 Ca2+的機制。在心臟，它排出已透過Ca2+通道而進入的Ca2+ 來起始收縮，同時Na+進入心臟細胞。它在心血管疾病的 關聯性是例如在 Hobai, JA & 0’Rourke，B (2004) Expert 〇pin. Investig. Drugs, 13，653-664 中所說明的。因此，製 藥產業已發展出抑制NCX的化合物，像是例如在Iwamoto, T. et al, (2004) J. Biol. Chem·，279, 7544-7553 中所描述 的。Na+/Ca2+交換劑發電地運送三至四個Na+以交換每一 13 200907340 個以反方向移動的Ca2+，像是例如在Hinata, M. et al. (2002) J. Physiol. 545, 453-461中透過電生理學方法所顯示的。 NCX可以維持細胞質Ca2+濃度（[Ca2+]内）低於細胞外Ca2+ 濃度（[Ca2+]外）三到四個數量級。然而，淨Ca2+運輸的方向 5 是視Na+的電化學梯度而定。同時的與連續的運輸模式已 被建議是用於Na+以及Ca2+的移位，且大多數證據偏向後 者。NCX蛋白的活性是藉著測量由一適當有色物質與飼複 合所生成的經增強之發光而被決定。 術語“表現NCX的細胞”意指内源性地表現感興趣之 10 交換劑的細胞或重組型細胞。 術語“重組型（recombinant)”當被使用在有關於，例如 細胞，或核酸、蛋白質，或載體，表示該細胞、核酸、蛋 白質或載體已透過引入一異源性核酸或蛋白質或一天然 核酸或蛋白質的改變而被修飾，或該細胞是衍生自一被這 15 樣修飾的細胞。因此，舉例來說，重組型細胞表現在細胞 的天然（非重組型）形式中不會被發現到的基因或除此之外 表現被異常地表現，低於被表現的或一點都不被表現的天 然基因。在本發明中這典型地意指已被轉染以編碼NCX 蛋白之核酸序列的細胞。 20 該分析法是透過將細胞生長在一具有一適當培養基 的恰當容器中而被簡易地施行。該細胞可以是天然存在的 細胞、一天然細胞、一已被建立的細胞株、一商業上可取 得的細胞、一經遺傳修飾的細胞等等，只要該細胞可以在 分析期間被維持並且所欲地生長於一培養基。 14 200907340 用於產生該標的分析法的適當細胞包括原核生物、酵 母菌，或高等真核生物細胞，特別是哺乳動物細胞。原核 生物包括革蘭氏陰性與革蘭氏陽性生物。該等細胞通常將 是哺乳動物細胞，諸如人類細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、 5 中國倉鼠細胞等等。被認為是便利的細胞包括CHO、 COS7、JURKAT、HeLa、HEKs、MDCK 以及 HEK293 細 胞。 細胞可以利用已知方法（Current protocols in cell biology，John Wiley & Sons bic, ISBN: 0471241059)來被製 10 備或可以被講買（Invitrogen Corp·, Sigma-Aldrich Corp.,

Stratagene) ° 術語“有色物質”特別是意指一鈣敏感性螢光染料。該 染料前驅物的特徵不僅是在分析條件下是會發光的，是一 個能夠進入細胞並且細胞内地被水解成發光氧化合物的 15 酯，以及因為與鈣複合而提供經增強的發光。該酯是被選 定為易感於細胞内水解酶的水解。 術語“能夠進入細胞（capable 〇f entering the cells)，，表 示前驅物能夠跨越細胞膜並且在細胞内被水解，染料前驅 物在pH、溫度專專的特定條件下進入細胞、以不同速度 20 進入細胞或在特定條件下不進入細胞。 有色物質是使用已知操作步驟（Current protocols in cell biology，John Wiley & Sons Inc, ISBN: 0471241059)而 被加入到細胞。一有色物質的使用是習知的並且是商業上 可取得的試劑（Invitrogen Co卬.）還有在實驗室中所合成的 15 200907340 試劑可以被使用。一些滿足上列條件的商業上可取得的染 料為已知的。用於監测Ca2+的螢光染料為已知的並且被詳 細地描述在分子探針目錄(M〇lecularPr〇bes catal〇g)，第9 版的段落20.1-20.4中。他們通常具有兩個雙-羥基曱胺基 5 基團接附於一螢光核（諸如螢光素、玫瑰紅(rhodamines)、 香豆素（coumarins)、胺基苯基〇弓卜朵（amin〇phenylindoles)， 以及其他）。大部分地該等化合物為3,6_二氧經取代的0山 星’其中該前驅物的氧基團被取代且在發光染料中他們是 未被取代的。通常有保護酚以及酸的乙醯氧曱基基團。參 10 見，例如，F1u〇3/4、Fura2-3、妈黃綠素綠（calcein green) 等等。乙酿基基團的水解造成發光產物。前驅物能夠跨越 • 細胞膜並且在細胞内被水解。 術語“發光”意指“冷光，，，來自其他能量來源的光，其 發生在正常或較低的溫度。在發光中，一些能量來源將一 15 原子的一個電子從其“基，，(最低能量）態踢進一“激，，(較高 能1)‘癌；接著該電子以光的形式回送能量以使得它可以 掉回其“基”態。有各種不同的發光，各別根據能量來源， 或者是對於發光來說的刺激物為何而被命名。 術語“螢光”意指一種發光，大部分被發現為一呈冷體 20 的光學現象’其中一光子的分子吸收觸發另一個具有一較 長波長之光子的發射。吸收的以及發射的光子間的能量差 如同分子震動或熱般結束。通常吸收的光子是在紫外線範 圍内’且發射的光是在可見光範圍内，但這會視吸收曲線 以及知·疋營光團（f!u〇r〇ph〇re)的斯托克斯位移（St〇kes shift) 16 200907340 而定。榮光是根據礦物質榮石（由氣化約所組成，其通常 展現此現象）而被命名。 來自指示染料(indicator dyes)的螢光可以利用一亮度 計（luminometer)或一螢光成像器（fluorescence imager)而被 5 測量。一個被偏好的^[貞測儀器為Fluorometric Imaging

Plate Reader (FLIPR)(Molecular Devices, Sunnyvale, Calif)。FLIPR相當適合於使用本發明之方法的高通量篩 選，因為它合併能夠同時吸取到一微量滴定盤的96或384 井的整合液體插作以及使用偶合到一電極-偶合裝置成像 1〇 相機之氬雷射的快速動力學偵測。 使用鈣指示染料的一個替代品是使用多管水母素 (aequorin)系統。該多管水母素系統使用蛋白質缺辅基多管 水母素(apoaequorin) ’其結合到親脂發色團腔腸素而形成 被知曉為多管水母素之缺辅基多管水母素與腔腸素的組 15 合。缺辅基多管水母素具有三個鈣結合位址並且，一但鈣 結合，多管水母素的缺輔基多管水母素部份改變其構型。 這個在構型上的改變導致腔腸素被氧化成 coelenteramide ’ C02，以及一個具有藍光(466 nm)的光子。 此光子可以利用適當儀表來被偵測。有關於使用多管水母 20 素的回顧’參見 Cr6ton et al.，1999, Microscopy Research and Technique 46:390-397; Brini et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:9896-9903; Knight & Knight, 1995, Meth. Cell. Biol. 49:201-216。亦被關注的可能有美國專利第5,714,66號， 其描述在哺乳動物細胞中藉著加入腔腸素輔因子到表現 17 200907340 缺辅基多管水母素的哺乳動物細胞以測量細胞内鈣的方 法。 NCX夕核皆酸以及多狀序列的“抑制劑”，“活化劑” 以及“調控劑’’被用於意指使用NCX多核苷酸以及多肽序 5 列之以細胞為主的分析法而被鑑定的活化、抑制，或調控 分子。“抑制劑”是例如結合、部份或完全阻斷活性、降低、 防止、延遲活化、去活化、減敏，或下降調節蛋白 表現或活性的分子，例如拮抗劑。“活化劑”是增加、開放、 活化、促進、增強活化、增敏、激動，或上升調節NCx 10 蛋白活性的化合物。一個被偏好的NCX活化劑是離子黴 素’來自Streptomyces conglobatus的離子載體。抑制劑、 活化劑或調控劑也包括NCX蛋白的經遺傳修飾之形式 (versions)，例如，帶有經改變之活性的形式，還有天然存 在以及合成的配位子、括抗劑、激動劑、肽、環肽、核酸、 15 抗體、反義分子、核糖酵素、小的有機分子以及類似物。 術語“化合物’’或“測試化合物”或‘‘測試候選物，，或其文 法上同義子彳田述任何要被測試有關調控NCX活性之能力 的分子’不論是天然存在或合成的’例如蛋白質、寡肽、 小的有機分子、多醣、脂質、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷 20 酸等等（Current protocols in molecular biology，John Wiley & Sons Inc，ISBN: 0471250961)。測試化合物可以是呈一個 測試化合物存庫（library)的形式，諸如提供足夠範圍的多 樣性的組合式或隨機式存庫（Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc, ISBN: 18 200907340 0471250937)。測試化合物選擇性地被結合到一融合搭檔 (fusion partner) ’例如標乾化合物、救難化合物（rescue compound)、二聚化合物、安定化合物、可定址化合物， 以及其他功能性部分。習知地，帶有可應用性質的新穎化 5 學實體是透過鑑定一帶有某些所欲性質或活性（例如增強 的活性）的測試化合物（被稱為“先導化合物（lead compound)”）、創造先導化合物的變異體，以及評估那些 變異化合物的性質與活性而被產生。較佳地，高通量篩選 (high throughput screening, HTS)法是被採用於此一分析 10 法。 該抑制劑，活化劑以及測試化合物可以藉著在細胞已 被生長之前被注射到培養基或在細胞生長之前就存在於 培養基中而被加入至細胞（Current protocols in cell biology， John Wiley & Sons Inc，ISBN: 0471241059)。 細胞可以在抑制劑，活化劑和/或測試化合物上被生 長到適當數量，或它們可以被置放其上並且被使用而沒有 進一步的生長。細胞可以是貼附於抑制劑’活化劑和/或測 试化合物或’在那些實施例中細胞可以被置放或生長在井 中’細胞可以是被懸浮在井内的液體中的懸浮細胞。 術語“對照組實驗(control experiment)’’意指不同實驗 應該被同時進行。技藝人士將理解到：連同與此處所述的 方法一起進行對照組通常是有利的。 舉例來說，有一個用於供決定NCX蛋白活性的分析 法（其中’細胞基本上較佳地相同於被用在本分析法中的 19 200907340 細胞，除了這些細胞不會表現感興趣之NCX蛋白）的對照 組將是有幫助的。再者，有一個用於供決定NCX蛋白對 添加一化合物有反應之活性的分析法（其中該等化合物是 在本發明的分析法中被測試來對抗細胞，該等細胞基本上 5 較佳地相同於被用在本分析法中的細胞，除了這些細胞不 會表現感興趣之NCX蛋白）的對照組將是有幫助的。這樣 的方式可以決定：透過此分析法而被鑑定的化合物確實透 過感興趣的NCX蛋白而非透過一些非預期之非-專一性機 制來展現它們的作用。有關於此類對照組細胞的一個合適 1〇 者將是使用非-重組型母細胞，其中實際實驗組的細胞表 現感興趣之NCX蛋白。 其它用於供決定NCX蛋白對一化合物添加有反應之 活性的分析法之對照組將是不添加一測試化合物地來進 行該分析法（低對照組）以及添加一高濃度測試化合物來進 15 行該分析法（高對照組）。對照組的其他類型涉及取用化合 物（它們藉著本發明的分析法而被鑑定為感興趣之NCX蛋 白的激動劑或拮抗劑）並且在先前技藝的方法中去測試那 些化合物以確認那些化合物當在那些先前技藝方法中被 測試時也是激動劑或拮抗劑。再者，一個習於該技藝者將 20 明白：透過將分析數值與標準數值比較來進行統計分析是 需要的。 術語“激動劑”以及“拮抗劑”意指受體效應子分子 (receptor effector molecules) ’其經由一受體來調控訊息傳 遞。受體效應子分子能夠結合到受體，雖然不必然地經由 20 200907340 在天然配位子的結合位址。當受體效應子被單獨地使用， 它可以調控訊息傳遞（亦即，可以是代用配位子），或可以 在天然配位子的存在下改變訊息傳遞，不論是增強或抑制 天然配位子的傳訊。舉例來說，“拮抗劑，，是阻斷或降低受 體的訊息傳遞活性的分子，例如，它們可以競爭性地、非 競爭性地，和/或異位地抑制來自一受體的訊息傳遞，而“激 動劑”使可能、誘發或除此之外增強一受體的訊號傳遞活 性。 術語“與一 NCX改變之表現相關聯的疾病，，意指擴張 10 型心肌病（dilated cardiomyopathy)、冠狀心臟病（coronary heart disease)、心律不整（arrhythmia)、心臟衰竭（heart • failure)等等。 為了方便起見，本分析法的有色物質以及其他組份可 以被提供於套組内，其中有色物質可以像是可復原的粉末 15 或像是冰上、配於一緩衝液中的有色溶液般存在。該套組 也可以包括緩衝液、活化劑、抑制劑、測試化合物、表現 NCX蛋白的細胞等等。細胞可以像是康乾的細胞般存在。 該具有部件的套組可以被用作為供診斷擴張型心肌病、冠 狀心臟病、心律不整、心臟衰竭等等的診斷套組。 20 下列圖式與實施例未限制保護範疇地更詳盡地插述 本發明，描述以螢光為主的細胞NCX分析法的典型結果。 【實施方式】 1.分析法操作步驟 21 200907340 i·1.分柝試劑 +叙成物被用作為供分析的試劑： 試劑 ——— 化學品 註記 为析緩衝液 3.5 mM CaCl2 丙磺舒在使用當天從 133.8 mMNaCl 一配於IN NaOH中 4.7 mM KC1 而新鮮配置的1M溶 1.25mMMgCl2 液來被添加 0.01%普盧蘭尼克-F127 10 mM Hepes/NaOH pH 7.5 5 mM葡萄糖 2.5 mM丙續舒 染料負栽緩衝液 含有 Fluo-4/AM 從一配於 2 μΜ Fluo-4/AM 0.1 % BSA的分析緩衝液 DMSO的1 mM原液 〜、'S1—_ 被添加 化合物緩衝液 分析緩衝液 化合物從一配於 不同化合物濃度 DMSO的10 mM原液 —--—- 被添加 離子載體溶液 含有 0.3% BSA 離子黴素從一配於 6 μΜ離子黴素的分析緩衝液 DMSO的10 mM原液 被添加 正對照組緩衝液 低)離子載體溶液 A000135933 從一配 高)分析緩衝液 於DMSO的10 mM原 15-45 μΜΑ000135933 液被添加 22 200907340 1.2.分析法操作步驟 1] 在實驗之前的20-24 h，細胞被懸浮於不具有抗生素的 生長培養基(Nutrient Mixture FI2 (HAM) Invitrogen, Karlsruhe, 5% FCS，Biochrom，Berin)中並且被接種到 5 96-井黑色透明底部平盤(25000細胞/井配於100 μΐ中）。 2] 培養基被丟棄並且接著1〇〇 μ1的染料負載緩衝液被加 入且平盤於室溫下被培養在黑暗中歷時75 min。 3] 染料負載緩衝液是藉著利用1〇〇 μι的分析缓衝液洗滌 3次而被移除。緩衝液被丢棄。 ίο 4] 80 Μ之化合物平盤被加入且平盤被儲存於16°C下歷時 30 min。 5]平盤被轉移到FLIPR中並且使用下列操作步驟（包括加 . 入40 μΐ之離子载體平盤）而被分析： 1.1FLIPR實驗設定參數 曝光 —---- —-------- 〇·5 秒(於 1.2W) F-停止 F/2 滤光片 — · 1 1.1.1圖像設定 ----------— 根據樣本的負偏移：關閉 空間均勻度校正：關閉 ----------一 負對照組校正：關閉 ------ 1.1.2第一序列 最初期間 ------- 2 sec 23 200907340 最初計數 100個框架 框架後添加 5 添加南度 70 μΐ 添加速度 40 μΐ/sec 添加體積 40 μΐ 混合 1x40 μΐ 統計學 統計1 總和25-45 (偏置截止） 1.3.數據分析 測試物質在NCX細胞中的抑制活性： •5 私P制的計算： 計算是以統計數值輸出為主。原始數據是根據下列而 被轉換成抑制： 樣本-平均低對照組 % —抑制平均高對照組-平均低對照組) 10 平均高對照組是衍生自具有離子黴素之10或30 μΜ Α000135933的八個成對樣本的平均差異。平均低對照組 是衍生自離子黴素對照組。增加基準螢光高於1.3倍的化 合物被摒除。 15 2. 分析樣本 2.1.高以及低對照組的反應 24 200907340 在加入2μΜ的離子黴素之後，高以及低對照組的典 型螢光反應被顯示在第2圖中以及如同下列般：若Ν(：χι 是活化的（低對照組），在離子黴素加入之後進入細胞的好 被運出細胞。數秒鐘之後，細胞的初始鈣負載被再建立。 5 NCX1的抑制在離子黴素加入之後引起螢光增加，因為細 胞質約的增加（高對照組，30 μΜΑ000135933)。 2.2 工具物質：α〇〇〇135933 新的NCX1抑制劑Α000135933在第一個HTS篩選中 10 被發現到。第3，4以及5圖顯示不同濃度的Α000135933 的一個典型劑量依賴性反應。具有一平均IC5〇為5.9 μΜ 的Α000135933是一個好的NCX1抑制劑並且從那時起在 分析法中被用作為工具物質。此化合物的一 IC50被加到每 個平盤中作為對照組。有關於此實施例的S/B比以及z， 15 值是非常好的。連同A000135933的IC50，這些參數被用 來指明有關於每個平盤的好的分析表現： 1. S/B 大於 2。 2· z’值介於0.5與0.7。 3.工具化合物A000135933的IC5〇必須大約平均為 20 5.9 μΜ。 2.3.工具物質：分析樣本 一分析是利用4個化合物的IC5〇以二重複來被施行 (第6圖）。四種化合物是來自同一個化合物種類。一個化 25 200907340 合物是好的NCX1抑制劑(Α000Π5933)，兩個化合物顯示 中等程度的抑制（A〇〇〇i36648，A000104243)以及一個在濃 度範圍内是不活化的（A000103746)。這個實施例指出該分 析法適於篩選NCX1抑制劑並且建立結構活性關係。 5 2.4· 與電生理學的相關性 比較衍生自以螢光為主之分析法的數據與一直接電 生理學方法（l〇ngate，s SURFE2R技術）是評估此分析法表 現的最好方式。這兩個極為相異的技術間的相關性相當地 ίο 好（第7圖）。 利用SURFE2R而被測量的抑制是較高的（平均 14%)，除了一個化合物於衍生自間接FUPR分析法的分 析。 15 【圖式簡單說明】 第1圖： 第la圖顯示由序列辨識編號：1所表示的NCX1之多 核苷酸序列。 第lb圖顯示由序列辨識編號：2所表示的NCX2之 20 多核苷酸序列。 第lc圖顯示由序列辨識編號：3所表示的NCX3之多 核苷酸序列。 第2圖：在加入離子黴素之後，CHO-NCX1細胞的螢 光訊號。由於細胞質約的上升，NCX1的抑制（高對照組， 26 200907340 30 μΜ A000135933，紅色）造成一螢光增加。在數秒鐘之 後，活化的NCX1建立初始鈣負載（低對照組，黑色）。 第3圖： 原始數據：在加入離子黴素用於不同濃度的 5 Α000135933之後’螢光變化的動力學。從50到90s的螢 光數值總合被用於計算相較於對照組的螢光變化百分 比。結果被顯示於第4圖中。 第4圖： 有關於具有高以及低對照組與不同濃度Α000135933 10 的96井平盤的分析統計。針對背景比（S/B)、ζ，以及不同 濃度Α000135933在50以及90秒間的螢光增加的計算訊 號被列出（亦參見第2圖）。對此實施例來說Α000135933 的計算 IC50 為 7.16 μΜ (平均 IC50 : 5.9 μΜ)。 第5圖： 15 螢光增加百分比相對Α000135933的化合物濃度的圖 式以及對應擬合曲線（fit curve)。對此實施例來說 A000135933 的計算 IC50 為 7.16 μΜ (平均 IC5〇 : 5.9 μΜ)。 第6圖： 第6圖顯示FUPR所印出的原始數據。 20 第7圖： 一化合物類的以NCX1螢光為主的FLIPR分析法與以 電生理學為主之SURFE2R技術間的相關性。NCX1的抑 制在兩例中是於10 μΜ下被測量。 27 200907340 【主要元件符號說明】 無 28

Claims (1)

1. 200907340 十、申請專利範圍： 1. 一種用以決定NCX蛋白活性的分析法，包含有： e) 提供表現NCX的細胞； 提供一用於決定細胞内鈣的有色物質； 5 g)令細胞與一 NCX活性活化劑接觸；以及 h)比較來自該有色物質之發光訊號與一在對照組實驗 中所產生的發光訊號之由舞所媒介的變化。 。 2. 如申凊專利範圍第1項的分析法，其巾該NCX蛋白是_ 具有下歹情NCX蛋白：NCX1、NCX2、NCX3。 3. 如申凊專利|巳圍第1項的分析法，其中該NCX蛋白是哺 礼動物來源的，較佳地來自大鼠、小鼠、狗、牛、豬、 ' 猿類或人類。 《如申料利第丨項的分析法，其中料細胞選自下 15 =所構成的群組：CH0、HEK、C0S7以及JURKAT細 5·如申請專利範圍第！項的分料，其中該有色物質是作 為-能夠進人細胞並且被水解成一染料的染料前驅物而 破加入至該細胞，藉此染料與鈣在該等細胞 提供一發光訊號。 2〇 6·=申請專利範圍第！與5項的分析法，其中該發光訊號 為螢光且該監測步驟c)採用一 FLIPr裝置。 •如申4專利fen第5項的分析法’其中該染料前驅物是 乙醯氧基甲酯衍生物。 如申请專利第5項的分析法，其中該染料是妈敏感 29 200907340 性螢光染料fluo_4 〇 9. 如申凊專利範圍第J至8 ^ 活化劑為離子黴素。 4 /、中该NCX活性 10. j如申請專利範圍第！至9項之 物有關作為NCX激動劑或拮抗劑的用途。她-化合 1.—種如申請專利範圍第丨至9 於診斷一盥ΝΓΧ柃燧+主項之刀析法的用途，供用 m /、NCX改變之表現相關聯的疾病。 12. :種用以測定NCX蛋白對-化合物的添加起反庫之活 性的分析法，包含有·· 應之活 a)提供表現NCX的細胞； b) c) d) Φς：供用於決定細胞内妈的有色物質； 15 20 令細胞與一化合物接觸，其中在以該化合物處理之 前，該等細胞已以一 NCX活性活化劑處理過；以及 比較來自該有色物質之發光訊號與一在對照組實驗 中所產生的發光訊號之由鈣所媒介的變化。 13. 如申請專利範圍第12項的分析法，其中該ncx蛋白是 一具有下列的NCX蛋白：NCX1、NCX2、NCX3。 14. 如申請專利範圍第12項的分析法，其中該NCX蛋白是 哺乳動物來源的，較佳地來自大鼠、小鼠、狗、牛、豬、 猿類或人類。 15. 如申請專利範圍第12項的分析法，其中該等細胞選自下 列所構成的群組：CHO、ΗΕΚ、COS7以及JURKAT細 胞。 16.如申請專利範圍第12項的分析法，其中該有色物質是作 30 200907340 能夠進人細胞並且被水解成-染料的染料前驅物而 二 =:藉此染料與物等細胞中複合並且 5 17.=Γΐ圍第12與16項的分析法，其中該發光訊 :虎J螢光且，亥監測步驟e)採用—FLIPR裝置。 =請2範圍第16項的分析法，其中該染料前驅物是 乙醯虱基甲酯衍生物。 19.如申請專利範圍第16 . ^ ^ ^ 性勞光染料W4。 ”析法，其中錢料是妈敏感 10 20. 如申請專利範圍第12 為一 NCX拮抗劑。 21. 如申請專利範圍第12 化劑為離子黴素。 至19項的分析法，其中該化合物 至19項的分析法’其中該NCX活 15 22.—種具有部件的套組，包含有： a) 表現NCX蛋白之經滚乾的細胞. b) 一有色物質； c) 一化合物緩衝液；以及 d) 一有色物質緩衝液。 23·如申峋專利範圍第22項 物皙曰征心貝之具有藉的套組’其中該有色 物質疋鈣敏感性螢光染料flu(>4。 24.如申請專利範圍第a盥 ^ ^項之具有部件的套組，其中 該 NCX 蛋白是 一 g jk- -ττ τη jll. 、 nog。 列的NCX蛋白：N⑶、獄2、 25.如申請專利範圍第 22與23項之具有部件的套組，其中 20 200907340 °亥NCX蛋白是哺乳動物來源的，較佳地來自大鼠、小 鼠、狗、牛、豬、猿類或人類。 6· 一，如中請專利範圍第22至25項之具有部件的套組來 測试一化合物有關作為NCX激動劑或拮抗劑之活性的 用途。 27’ —種如申請專利範圍第22至25項之具有部件的套組的 用途，供用於診斷一與NCX改變之表現相關聯的疾病。 32