CN101636658A - 用于检测以“促进模式”调控钠钙交换体(ncx)的化合物的基于荧光的测定 - Google Patents
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Abstract
转运蛋白是日渐重要的具有巨大潜力的靶标家族，提供科学的和经济的机会。钠/钙交换体是从多种细胞中除去Ca2+的重要装置。在心脏中，该钠/钙交换体将从Ca2+通道进入的Ca2+排出以发动收缩，而Na+进入心脏细胞。鉴别调控钠/钙交换体活性的化合物具有重要的意义。本发明涉及用于检测NCX以“促进模式”调控化合物的基于荧光的测定。本发明还涉及包含表达NCX的细胞的试剂盒，以及该试剂盒在测试化合物作为NCX激动剂或拮抗剂的活性中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及钠钙交换体(sodium-calcium exchanger，NCX)和检测其活性的方法。更具体地，本发明涉及用于检测NCX以“促进模式(forwardmode)”调控化合物的基于荧光的测定。本发明还涉及包含表达NCX的细胞的试剂盒(a kit of parts)和该试剂盒的用途。
背景技术
生命的基本需要是区室化——以生物膜作为天然工具来实现这一原则。然而，脂双层(细胞膜的基本结构)对于多数离子和化合物是不能渗透的，而这些离子和化合物的转运对于维持细胞和生物体的重要功能必不可少。对于这种矛盾的解答依赖于细胞膜的半渗透性质——必须穿过细胞膜的溶质由特异的膜蛋白来转运。这些转运蛋白负责产生和维持离子梯度、摄入营养物、转运代谢物、重摄入信号分子和处理有毒和废弃的化合物。因此，在本文中，转运蛋白是能够直接影响疾病相关异常的潜在的药物靶标。
钠/钙交换体是从多种细胞中除去Ca2+的重要装置。在心脏中，其将从Ca2+通道进入的Ca2+排出以发动收缩，而Na+进入心脏细胞。其与心血管疾病的相关性例如在Hobai，JA&O′Rourke，B(2004)Expert Opin.Investig.Drugs，13，653-664中描述。因此，制药工业中已开发了抑制NCX的化合物，例如在Iwamoto，T.等人(2004)J.Biol.Chem.，279，7544-7553中所描述的。Na+/Ca2+交换体对于每个移动的Ca2+向相反的方向生电转运3到4个Na+，例如在Hinata，M.等人(2002)J.Physiol.545，453-461中通过电生理学方法显示的。NCX能够维持细胞质的Ca2+浓度(内部[Ca2+])比细胞外Ca2+浓度(外部[Ca2+])低3-4个数量级。然而，净Ca2+转运的方向依赖于Na+的电化学梯度。已经提出了Na+和Ca2+转运(translocation)的同时连续转运模式，并有大量的证据支持后者。
日渐重要的具有巨大潜力的靶标家族，提供科学的和经济的机会。另一方面，在药物发现技术方面，转运蛋白是很难利用的靶标类型。
鉴别调控通道活性的化合物具有重要的意义，所述调控通道活性例如通过阻断钙流动和/或抑制钙通道活性。一个标准的调控方法是通过应用膜片钳实验。在这些实验中，必须由高度熟练的操作者通过测量响应膜电位的改变和/或测试化合物的应用而穿过细胞膜的钙流，来逐个依次评价细胞。K.Acsai(“ESC Congress 2004”in Munich on Poster Nr.2886(慕尼黑“2004 ESC会议”海报Nr.2886)，题目：Effect of a specific sodium-calciumexchanger blocker Sea0400 on the ventricular action potential andtriggered activity in dog ventricular muscle and Purkinje fiber(钠钙交换体阻断剂Sea0400对狗心室肌和浦肯野纤维的心室动作电位和触发活性的影响))和C.Lee等人；(The journal of pharmacology and experimentaltherapeutics(药理学和实验治疗学杂志)；311卷：748-757，2004；题目：Inhibitory profile of SEA0400[2-[4-[(2，5-Difluorophenyl)methoxy]phenoxy]-5-ethoxyaniline]assessed onthe cardiac Na+/Ca2+exchanger，NCX1.1(以心脏Na+/Ca2+交换体NCX1.1评价的SEA0400[2-[4-[(2，5-二氟苯基)甲氧基]苯氧基]-5-乙氧基苯胺]的抑制谱))研究和公开了一种新的特异性NCX抑制剂(Sea0400)对狗心室乳头肌动作电位的影响。
使用离子选择电极技术定量大膜片上的离子流量，发现心脏的Na+/Ca2+交换体具有多样的转运模式(Tong Mook Kang&Donald W.Hilgemann；Nature；427卷，2004年2月5日；题目：Multiple transportmodes of the cardiac Na+/Ca2+exchanger(Na+/Ca2+交换体的多样转运模式))。
在有效和能够提供信息的情况下，这些实验非常费时，且不适合于对调控钙离子通道活性的化合物的高通量测定。
已经开发了多种技术来替代电生理学的标准方法。例如使用放射性流量测定(radioactive flux assay)，其中细胞暴露于放射性示踪物(例如45Ca)，且监测放射性标记的Ca的流量。将载有示踪物的细胞暴露于化合物，那些增加或减少示踪物外向通量的化合物被鉴定为细胞膜中离子通道的可能激活剂或抑制剂。T.Kuramochi等人，Bioorganic&MedicinalChemistry；12(2004)5039-5056；题目：Synthesis and structure-activityrelationships of phenoxypyridine derivates as novel inhibitors of thesodium-calcium exchanger(作为钠钙交换体的新的抑制剂的苯氧基吡啶的合成和结构活性的关系)中公开了一个特定实例。EP1031556公开了用肌纤维膜小泡测量Na+/Ca2+交换体活性的方法，通过测量45Ca放射性来确定肌纤维膜小泡中摄入的Ca2+浓度。
许多放射性离子转运蛋白测定的灵敏度有限，因此不足以定性。另外，放射性筛选技术相关的成本和安全性问题妨碍了扩大应用。
在上述引用的药物发现技术中，用放射性流量测定来鉴别调控离子通道和离子转运蛋白的活性的化合物是与本发明最接近的现有技术，因为该技术中可以通过监测细胞的Ca2+流量来鉴别测试化合物是可能的激活剂或抑制剂。放射性测定的主要问题是基于难于检测离子转运蛋白每秒约1-1000个分子(约比多数离子通道低104倍)的有限的周转。
因此现有技术中出现的问题是确定具有非常好的灵敏度和用于NCX调控剂的高通量筛选和描述(profiling)的强化测定。本发明提供了该问题的解决方案。
发明概述
本发明的一个主题涉及检测NCX蛋白质的活性的测定，其包括：
a)提供表达NCX的细胞；
b)提供检测细胞内钙的有色物质；
c)将细胞与NCX活性激活剂接触；和
d)将钙介导的所述有色物质的发光信号的改变与对照实验中产生的发光信号进行比较。
本发明的另一主题涉及检测响应其他化合物的NCX蛋白质的活性的测定，其包括：
a)提供表达NCX的细胞；
b)提供检测细胞内钙的有色物质；
c)将细胞与化合物接触，其中在用所述化合物处理所述细胞之前，用NCX活性激活剂处理所述细胞；和
d)将钙介导的所述有色物质的发光信号的改变与对照实验中产生的发光信号进行比较。
一般而言，所使用的NCX蛋白质是哺乳动物来源，特别是人来源。该NCX蛋白质选自NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6和/或NCX7，特别是NCX1、NCX2和/或NCX3。
一般而言，在本发明的测定中所使用的细胞可以衍生自任意的真核生物。在优选实施方案中，所述细胞为哺乳动物细胞。在更优选的实施方案中，所述细胞为CHO(CCL-61)、HEK(CCL-1573)、COS7(CRL-1651)和/或JURKAT(CRL-1990)细胞。
特别地，在本发明的测定中所使用的所述NCX活性激活剂为离子霉素。
在优选实施方案中，所述有色物质以染料前体的形式被加入到所述细胞中，该染料前体能够进入所述细胞并水解成染料，其中，所述染料在所述细胞中与钙复合并提供发光信号。进一步，所述染料前体可以优选为乙酸甲酯(acetoxymethylester)衍生物，且所述染料可以优选为钙敏感的荧光染料fluo-4。在更优选的实施方案中，所述发光信号为荧光，且所述监测步骤c)中采用FLIPR装置。
本发明还涉及上述测定在测定化合物作为NCX激动剂或拮抗剂的活性中的用途。在另一优选实施方式中，本发明涉及上述测定用于诊断与NCX的表达改变相关的疾病中的用途。
本发明还涉及试剂盒，其包含：
a)表达NCX蛋白质的冻干细胞；
b)有色物质；
c)化合物缓冲液；和
d)有色物质缓冲液。
在本发明的试剂盒的优选实施方案中，所述有色物质为钙敏感的荧光染料fluo-4。在另一优选实施方案中，所使用的NCX蛋白质是哺乳动物来源，特别是人来源。该NCX蛋白质选自NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6和/或NCX7，特别是NCX1、NCX2和/或NCX3。在另一优选实施方案中，
本发明还涉及上述试剂盒在测定化合物作为NCX激动剂或拮抗剂的活性中的用途。在另一优选实施方式中，本发明涉及上述试剂盒用于诊断与NCX的表达改变相关的疾病的用途。
发明详述
术语“测定”指检测系统或物体的性质的过程。测定是生物测定的常用术语的简称，是一种体外实验类型。测定一般旨在测量物质对活的生物体的作用。测定可以是定性的或定量的，它们在新药的开发中很重要。
本发明的测定提供了宽泛的动态范围，从而能够检测NCX蛋白质的活性。特别地，本发明使一种快速有效的测定可以用于筛选和描述制药上有效的化合物，该化合物特异地与NCX蛋白质相互作用并调控NCX蛋白质的活性。
本发明中的术语“NCX蛋白质”或“NCX”指下述列出的Na+/Ca2+交换体蛋白质中的任意一种或几种的组合：NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6、NCX7。尤其优选的是NCX1、NCX2和/或NCX3，它们的氨基酸序列分别相应为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
此类NCX蛋白质可以衍生自任意脊椎动物，特别是哺乳动物物种(例如狗、马、牛、小鼠、大鼠、犬类、兔、鸡、类人猿、人等)。NCX可以从此类脊椎动物生物体的组织探针分离，或可以通过能表达NCX蛋白质的重组生物材料而制备。
术语“NCX蛋白质”指具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQID NO：3中包含的核酸序列所编码的氨基酸序列优选在至少约25、50、100、200或500或更多氨基酸的区域上具有大于约80％、85％、90％氨基酸序列同一性、优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽、多形变体、突变体和种间同源物。
术语“生物材料”指含有遗传信息并能自我繁殖或在生物系统中繁殖的任意材料。重组生物材料为通过本领域技术人员熟知的重组技术的方法产生、已经改变或修饰的任意生物材料。
下述参考文献为克隆特定NCX蛋白质的实例：Nicoll，DA.等人克隆了犬类的Na+/Ca2+交换体NCX1(Science.250(4980)：562-5，1990；题目：Molecular cloning and functional expression of the cardiac sarcolemmalNa(+)-Ca2+exchanger.(心脏肌纤维膜Na(+)-Ca2+交换体的分子克隆和功能性表达))。Komuro，I.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(10)，4769-4773，1992；题目：Molecular cloning and characterization of the humancardiac Na+/Ca2+exchanger cDNA(人心脏Na+/Ca2+交换体cDNA的分子克隆和表征))和Kofuji，P.等人(Am.J.Physiol.263(Cell Physiol.32)：C1241-C1249，1992；题目：Expression of the Na-Ca exchanger in diversetissues：a study using the cloned human cardiac Na-Ca exchanger(在不同组织中Na-Ca交换体的表达：使用克隆的人心脏Na-Ca交换体的研究))克隆了人类的Na+/Ca2+交换体NCX1。Li.Z.等人克隆了人类的Na+/Ca2+交换体NCX2(J.Biol.Chem.269(26)：17434-9，1994；题目：Cloning of theNCX2 isoform of the plasma membrane Na(+)-Ca2+exchanger(质膜Na(+)-Ca2+交换体的NCX2同种型的克隆))。Nicoll，DA.等人克隆了大鼠的Na+/Ca2+交换体NCX3(J.Biol.Chem.271(40)：24914-21.1996；题目：Cloning of a third mammalian Na+/Ca2+exchanger，NCX3(第3哺乳动物Na+/Ca2+交换体NCX3的克隆))。Gabellini，N.等人克隆了人类的Na+/Ca2+交换体NCX3(Gene.298：1-7，2002；题目：The human SLC8A3 gene andthe tissue-specific Na+/Ca2+exchanger 3 isoforms(人SLC8A3基因和组织特异性Na+/Ca2+交换体3同种型))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”此处可以互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于下述氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应于天然存在氨基酸的人工化学模拟物；以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“NCX蛋白质的活性”指从细胞内除去细胞内Ca2+的机制。在心脏中，其将从Ca2+通道进入的Ca2+排出以发动收缩，同时Na+进入心脏细胞。这与心血管疾病相关，例如在Hobai，JA&O′Rourke，B(2004)ExpertOpin.Investig.Drugs，13，653-664中阐明的。因此，制药工业中已经开发了抑制NCX的化合物，例如在Iwamoto，T.等人(2004)J.Biol.Chem.，279，7544-7553中所描述的。Na+/Ca2+交换体对于每个移动的Ca2+向相反的方向生电转运3到4个Na+，例如在Hinata，M.等人(2002)J.Physiol.545，453-461中通过电生理学方法显示的。NCX能够维持细胞质的Ca2+浓度(内部[Ca2+])比细胞外Ca2+浓度(外部[Ca2+])低3-4个数量级。然而，净Ca2+转运的方向依赖于Na+的电化学梯度。已经提出了Na+和Ca2+转运的同时连续转运模式，并有大量的证据支持后者。通过测量与钙复合的合适有色物质所产生的发光的增强来确定NCX蛋白质的活性。
术语“表达NCX的细胞”指内源表达目的交换体的细胞或重组细胞。
术语“重组”当指例如细胞、或核酸、蛋白质、或载体使用时，表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体通过引入异种核酸或蛋白质而被修饰，或通过改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者表示所述细胞衍生自被这样修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达在细胞天然形式(非重组)中没有的基因，或表达异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。在本发明中，所述重组一般指被编码NCX蛋白质的核酸序列所转染的细胞。
该测定可以通过将所述细胞以合适培养基在合适容器中培养而简单地进行。该细胞可以是天然存在的细胞、天然细胞、建立的细胞系、商业上可获得的细胞、经遗传修饰的细胞等等，只要所述细胞能在测定过程中维持并能在培养基中预期地生长即可。
可进行本发明的测定的合适细胞包括原核细胞、酵母或更高级的真核细胞，尤其是哺乳动物细胞。原核细胞包括革兰氏阴性和革兰氏阳性生物。该细胞通常是哺乳动物细胞，例如人类细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、中国仓鼠细胞等等。发现是合适的细胞包括CHO、COS7、JURKAT、HeLa、HEKs、MDCK和HEK293细胞。
可以通过众所周知的方法制备细胞(Current protocols in cell biology(现代细胞生物学方法)，John Wiley&Sons Inc，ISBN：0471241059)或可以购买细胞(Invitrogen Corp.，Sigma-Aldrich Corp.，Stratagene)。
术语“有色物质”尤其指钙敏感的荧光染料。该染料前体的特征是在测定条件下不发光，其为能够进入细胞的酯类，并在细胞内水解成发光的含氧化合物，并且在与钙复合后发光增强。选择该酯类为易于被细胞内水解酶所水解。
术语“能进入细胞”指前体能够穿过细胞膜并在细胞中被水解，该染料前体在特异pH、温度等条件下以不同的速度进入细胞，或在特异条件下不进入细胞。
使用众所周知方法将所述有色物质加入细胞(Current protocols in cellbiology，John Wiley&Sons Inc，ISBN：0471241059)。
所用的有色物质是常规的和商业上可获得的试剂(Invitrogen Corp.)，以及也可以使用在实验室合成的试剂。
许多满足上述条件的商业上可获得的染料都是已知的。用于监测Ca2+的荧光染料是众所周知的，并在分子探针目录第9版20.1-20.4节详细描述。这些染料通常具有连接于荧光核的两个二-羧甲基氨基基团，该荧光核例如荧光素、罗丹明、香豆素、氨苯基吲哚(aminophenylindoles)等等。这些化合物多数为3，6-二氧取代的呫吨(xanthenes)，其中，前体中的含氧基团被取代，而在发光染料中它们未被取代。通常有乙酸甲基基团保护酚和酸。例如参见Fluo3/4、Fura2/3、钙荧光素绿(calcein green)等等。乙酰基的水解导致发光的产生。前体能穿过细胞膜并在细胞内水解。
术语“发光”指“冷光”，来源于其它能源的光，可以在正常和低温条件下发光。在发光时，一些能源将原子中的电子从其“基础”(最低能量)状态激发到“受激”(较高能量)状态；然后所述电子以光的形式归还能量从而退回到其“基础”状态。有几种发光，分别根据能量源类型或激发发光的类型而命名。
术语“荧光”指在冷物体中主要以光学现象体现的发光，其中吸收光子的分子激发了另一具有较长波长的光子的发射。吸收和发射的光子之间的不同能量体现为分子振动或加热。通常所述吸收光子在紫外线区，而发射光在可见区，但是这依赖于特殊荧光团的吸光度曲线和斯托克斯频移(Stokes shift)。荧光以矿物萤石命名，萤石由氟化钙组成，其通常显示上述现象。
指示剂染料的荧光可以用发光计或荧光成像仪来检测。一种优选的检测仪器是荧光成像读板仪(FLIPR)(Molecular Devices，Sunnyvale，Calif.)。该FLIPR特别适合于使用本发明的方法的高通量筛选，因为它结合了能同时吸取96或384孔微量滴定板的整合液体操作系统和使用连接电荷耦合装置成像照相机的氩激光器(argon laser coupled to a charge-coupled deviceimaging camera)的快速动力学检测方法。
可以使用水母发光蛋白系统来替代钙指示剂染料的使用。所述水母发光蛋白系统使用蛋白质：水母发光蛋白，该蛋白质部分结合于亲脂的生色团腔肠素(coelenterazine)，形成脱辅基水母发光蛋白(apoaequorin)和腔肠素的组合即为水母发光蛋白。脱辅基水母发光蛋白有3个钙结合位点，当结合钙时，水母发光蛋白的脱辅基水母发光蛋白蛋白质改变其构象。这种构象的改变引起腔肠素被氧化成为coelenteramide、CO2和蓝光的光子(466nm)。该光子可以用合适的仪器检测。
使用水母发光蛋白的综述见Créton等人，1999，Microscopy Researchand Technique 46：390-397；Brini等人，1995，J.Biol.Chem.270：9896-9903；Knight&Knight，1995，Meth.Cell.Biol.49：201-216。美国专利No.5,714,666也值得注意，该专利中描述了通过向表达脱辅基水母发光蛋白的哺乳动物细胞中添加腔肠素辅因子来测量哺乳动物细胞中细胞内钙的方法。
NCX多核苷酸和多肽序列的“抑制剂”、“激活剂”和“调控剂”用来指使用NCX多核苷酸和多肽序列的基于细胞的测定所确定的激活、抑制或调控分子。
“抑制剂”是例如结合NCX蛋白质、部分或全部阻断活性、降低、阻止、延缓激活、不激活、降低敏感性或下调NCX蛋白质的活性或表达的化合物，例如拮抗剂。
“激活剂”是增加、开启、激活、有利于、增强活性、增强敏感性、激动(agonize)、或上调NCX蛋白质的活性。优选的NCX激活剂为离子霉素，即来自密团链霉菌(Streptomyces conglobatus)的离子载体。
抑制剂、激活剂或调控剂也包括NCX蛋白质的遗传修饰形式(例如具有改变的活性的形式)，以及天然存在和合成的配体、拮抗剂、激动剂、肽、环肽、核酸、抗体、反义分子、核酶、小的有机分子等等。
术语“化合物”或“测试化合物”或“测试候选物”或其语法等同物描述被测试调控NCX活性的能力的天然存在或合成的任意分子，例如蛋白质、寡肽、小的有机分子、多糖、脂类、脂肪酸、多核苷酸、寡核苷酸等等(Current protocols in molecular biology，John Wiley&Sons Inc，ISBN：0471250961)。该测试化合物可以是测试化合物文库的形式，例如提供充足范围多样性的组合库或随机库(Current protocols in molecular biology，John Wiley&Sons Inc，ISBN：0471250937)。测试化合物可任选地连接于融合配偶体，例如靶向化合物、援救化合物、二聚化合物、稳定化合物、寻址(addressable)化合物、和其它功能性部分。通常，通过鉴定具有某些所希望的性质或活性(例如活性增强)的测试化合物(称为“先导化合物”)、产生先导化合物的变体和评价那些变体化合物的性质和活性，可以产生具有有用性质的新的化学个体。优选地，此类分析应用高通量筛选(HTS)方法。
所述抑制剂、激活剂和测试化合物可以通过在细胞培养之后注射到培养基中而被加入到该细胞中，或者在细胞培养之前它们就存在于培养基中(Current protocols in cell biology，John Wiley&Sons Inc，ISBN：0471241059)。
细胞可以在所述抑制剂、激活剂和/或测试化合物上生长到合适的数量，或细胞可以铺种于所述抑制剂、激活剂和/或测试化合物上且在使用前不再进一步生长。所述细胞可以附着在所述抑制剂、激活剂和/或测试化合物上，或者，对于在细胞被置于或生长在孔中的实施方案，所述细胞可以是悬浮于孔中液体中的悬浮细胞。
术语“对照实验”指同时进行的不同类型的实验。技术人员将认识到与此处所述的方法一同进行对照实验通常是有利的。
例如，对于确定NCX蛋白质活性的测定进行对照测定通常是有帮助的，在该对照测定中，除细胞不表达目的NCX蛋白质以外，这些细胞优选与在该测定中使用的细胞基本相同。此外，对于确定响应添加化合物的NCX蛋白质活性的测定进行对照测定通常是有帮助的，在该对照测定中，使用本发明的测定中的化合物来测试细胞，除细胞不表达目的NCX蛋白质以外，这些细胞优选与在本发明所述测定中使用的细胞基本相同。通过此种方式，可以确定通过该测定鉴别的化合物确实通过目的NCX蛋白质行使作用，而不是通过某种意料不到的非特异性机制。此类对照细胞的一种可能是使用非重组的母细胞，其中实际实验的细胞表达目的NCX蛋白质。
其它对于确定响应添加化合物的NCX蛋白质活性的测定的对照测定是不添加测试化合物(低对照)而进行以及以高浓度测试化合物(高对照)而进行。
其它类型的对照可以包括以通过本发明的测定而鉴别的化合物作为目的NCX蛋白质的激动剂或拮抗剂，并以现有技术的方法测试这些化合物从而确认这些化合物在以现有技术的方法测试时也是激动剂或拮抗剂。
此外，本领域技术人员已知通过将测定值与标准值进行比较而进行统计学分析也是期望的。
术语“激动剂”和“拮抗剂”指通过受体调控信号转导的受体效应物分子。受体效应物分子能结合受体，尽管不一定在天然配体的结合位点结合。受体效应物单独使用时可以调控信号转导，即可以代替配体，或者可以在天然配体存在的情况下改变信号转导，通过天然配体来增强或抑制信号发放。例如，“拮抗剂”是阻断或降低受体的信号转导活性的分子，例如它们可以竞争、非竞争和/或变构地抑制来自受体的信号转导，而“激动剂”加强、诱导或另外增强受体的信号转导活性。
术语“NCX的表达改变相关的疾病”指扩张型心肌病、冠心病、心律不齐、心力衰竭等等。
为了方便起见，可在试剂盒中提供测定中的有色物质和其它组分，其中所述有色物质可以以可重构的粉末形式存在或以冰上冷却的溶液形式存在于缓冲液中。所述试剂盒还可以包括缓冲液、激活剂、抑制剂、测试化合物、表达NCX蛋白质的细胞等等。所述细胞可以是冻干的细胞。所述试剂盒可以用作诊断扩张型心肌病、冠心病、心律不齐、心力衰竭等等的诊断试剂盒。
实施例
1.测定步骤
1.1测定试剂
下列化学品成分用作测定的试剂：
| 试剂 | 化学品 | 注释 |
| 测定缓冲液 | 3.5mM CaCl2133.8mM NaCl4.7mM KCl1.25mM MgCl20.01％Pluronic F-12710mM Hepes/NaOH pH 7.55mM葡萄糖2.5mM丙磺舒 | 在使用当天加入新鲜的在1NNaOH中的1M丙磺舒(Probenecid)溶液。 |
| 染料上样缓冲液 | 含有2μMFluo-4/AM0.1％BSA的测定缓冲液 | 加入在DMSO中的1mMFluo-4/AM储液 |
| 化合物缓冲液 | 测定缓冲液多种化合物浓度 | 加入在DMSO中的10mM化合物储液 |
| 离子载体溶液 | 含有0.3％BSA6μM离子霉素的测定缓冲液 | 加入在DMSO中的10mM离子霉素储液 |
| 阳性对照缓冲液 | 低)离子载体溶液高)测定缓冲液15-45μM A000135933 | 加入在DMSO中的10mMA000135933储液 |
1.2测定步骤
1]在实验前20-24小时，将细胞悬浮于无抗体的生长培养基(NutrientMixture F12(HAM)Invitrogen，Karlsruhe，5％FCS，Biochrom，Berlin)中，并接种于96孔黑色透明底平板中(100μl中25000个细胞/孔)。
2]弃去培养基，随后加入100μl染料上样缓冲液，并将平板在室温下于黑暗中孵育75分钟。
3]用100μl测定缓冲液洗涤3次以除去染料上样缓冲液。弃去缓冲液。
4]加入来自化合物平板的80μl液体，将平板在16℃储存30分钟。
5]将平板转移到FLIPR中，并用下述方案测定(包括来自离子载体平板的40μl添加物)。
1.3数据分析
在NCX细胞中测试化合物的抑制剂活性
抑制的计算
基于统计学输出进行计算。根据如下公式将原始数据转换成抑制：
高对照均值为来自具有离子霉素的10或30μM A000135933的8对样品的平均差异。低对照均值来自离子霉素对照。放弃使基础荧光增加高于1.3倍的化合物。
2.测定实施例
2.1高对照和低对照的响应
在添加2μM离子霉素后，高对照和低对照的典型荧光响应示于图2中，如下所述：如果NCX1有活性(低对照)，那么在添加离子霉素后进入细胞的钙会被转运到细胞外。几秒钟以后，细胞恢复初始钙负载。NCX1的抑制由于增加了细胞溶质中的钙而导致添加离子霉素后荧光增加(高对照，30μM A000135933)。
2.2工具物质：A000135933
在首次HTS筛选中发现新的NCX1抑制剂A000135933。图3、4和5显示不同浓度的A000135933的典型剂量依赖响应。
A000135933是良好的NCX1抑制剂，其平均IC50值为5.9μM，且发现后即被用作测定中的工具物质。在每个平板中添加IC50(浓度)的该化合物作为对照。此种实验的S/B比例和z’值非常好。这些参数与A000135933的IC50值共同用于表示每个平板的良好的测定性能：
1.S/B大于2。
2.z’值为0.5-0.7。
3.工具化合物A000135933的IC50的必须在均值5.9μM左右。
2.3工具物质：测定实施例
以4个化合物的IC50各进行两次测定(图6)。所述4个化合物来自同样的化合物种类。一个化合物为良好的NCX1抑制剂(A000135933)，两个化合物显示中等的抑制作用(A000136648，A000104243)，且一个化合物在所述浓度范围无活性(A000103746)。该实施例表明所述测定适合于筛选NCX1抑制剂和建立结构活性关系。
2.4与电生理学的相关性
以直接的电生理方法(Iongate′s SURFE2R技术)对基于荧光的测定所获得的数据进行比较是评价该测定的性能的最好方式。这两种非常不同的技术的相关性很好(图7)。
除一种化合物以外，以SURFE2R测量的抑制作用(均值14％)高于直接FLIPR测定所获得的抑制作用。
附图描述
图1：
图1a显示SEQ ID NO：1代表的NCX1的多核苷酸序列。
图1b显示SEQ ID NO：2代表的NCX2的多核苷酸序列。
图1c显示SEQ ID NO：3代表的NCX3的多核苷酸序列。
图2：
添加离子霉素后，CHO-NCX1的荧光信号。NCX1的抑制(高对照，30μM A000135933，红色)由于增加了细胞溶质中的钙而导致荧光增加。在几秒钟之后，有活性的NCX1建立初始的钙负载(低对照，黑色)。
图3：
原始数据：对不同浓度的A000135933添加离子霉素后，荧光改变的动力学。用50-90秒的荧光值总数与对照相比较来计算荧光改变的百分比。结果示于图4中。
图4：
具有高对照和低对照以及不同浓度A000135933的96孔板的测定统计。图中列出了计算的信噪比(S/B)、z’和不同浓度A000135933的50-90秒的荧光值增加(参见图2)。在该实施例中，A000135933的计算IC50值为7.16μM(平均IC50：5.9μM)。
图5：
与A000135933的化合物浓度相比的荧光增加百分比的图和相应的拟合曲线。该实施例中，A000135933的计算IC50值为7.16μM(平均IC50：5.9μM)。
图6：
图6显示从FLIPR打印出的原始数据。
图7：
一种化合物种类的基于NCX1荧光的FLIPR测定与基于电生理学的SURFE2R技术的相关性。在两种情况下，在10μM测量NCX1的抑制。
序列表
<110>塞诺菲-安万特股份有限公司
<120>用于检测以“促进模式”调控钠钙交换体(NCX)的化合物的基于荧光的测定
<130>DE2007-007
<140>PCT/EP2008/001707
<141>2007-04-03
<150>102007011913.7
<151>2007-03-13
<160>3
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>973
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Met Tyr Asn Met Arg Arg Leu Ser Leu Ser Pro Thr Phe Ser Met Gly
1 5 10 15
Phe His Leu Leu Val Thr Val Ser Leu Leu Phe Ser His Val Asp His
20 25 30
Val Ile Ala Glu Thr Glu Met Glu Gly Glu Gly Asn Glu Thr Gly Glu
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Glu Pro Gln Asp Pro Ser Phe Gly Asp Lys Ile Ala Arg Ala Thr Val
65 70 75 80
Tyr Phe Val Ala Met Val Tyr Met Phe Leu Gly Val Ser Ile Ile Ala
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Asp Arg Phe Met Ser Ser Ile Glu Val Ile Thr Ser Gln Glu Lys Glu
100 105 110
Ile Thr Ile Lys Lys Pro Asn Gly Glu Thr Thr Lys Thr Thr Val Arg
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Ile Trp Asn Glu Thr Val Ser Asn Leu Thr Leu Met Ala Leu Gly Ser
130 135 140
Ser Ala Pro Glu Ile Leu Leu Ser Val Ile Glu Val Cys Gly His Asn
145 150 155 160
Phe Thr Ala Gly Asp Leu Gly Pro Ser Thr Ile Val Gly Ser Ala Ala
165 170 175
Phe Asn Met Phe Ile Ile Ile Ala Leu Cys Val Tyr Val Val Pro Asp
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Gly Glu Thr Arg Lys Ile Lys His Leu Arg Val Phe Phe Val Thr Ala
195 200 205
Ala Trp Ser Ile Phe Ala Tyr Thr Trp Leu Tyr Ile Ile Leu Ser Val
210 215 220
Ile Ser Pro Gly Val Val Glu Val Trp Glu Gly Leu Leu Thr Phe Phe
225 230 235 240
Phe Phe Pro Ile Cys Val Val Phe Ala Trp Val Ala Asp Arg Arg Leu
245 250 255
Leu Phe Tyr Lys Tyr Val Tyr Lys Arg Tyr Arg Ala Gly Lys Gln Arg
260 265 270
Gly Met Ile Ile Glu His Glu Gly Asp Arg Pro Ser Ser Lys Thr Glu
275 280 285
Ile Glu Met Asp Gly Lys Val Val Asn Ser His Val Glu Asn Phe Leu
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Asp Gly Ala Leu Val Leu Glu Val Asp Glu Arg Asp Gln Asp Asp Glu
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Glu Ala Arg Arg Glu Met Ala Arg Ile Leu Lys Glu Leu Lys Gln Lys
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His Pro Asp Lys Glu Ile Glu Gln Leu Ile Glu Leu Ala Asn Tyr Gln
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Val Leu Ser Gln Gln Gln Lys Ser Arg Ala Phe Tyr Arg Ile Gln Ala
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370 375 380
Asp Gln Ala Arg Lys Ala Val Ser Met His Glu Val Asn Thr Glu Val
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Thr Glu Asn Asp Pro Val Ser Lys Ile Phe Phe Glu Gln Gly Thr Tyr
405 410 415
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Gly Thr Ala Asn Ala Gly Ser Asp Tyr Glu Phe Thr Glu Gly Thr Val
450 455 460
Val Phe Lys Pro Gly Asp Thr Gln Lys Glu Ile Arg Val Gly Ile Ile
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Asp Asp Asp Ile Phe Glu Glu Asp Glu Asn Phe Leu Val His Leu Ser
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Asn Val Lys Val Ser Ser Glu Ala Ser Glu Asp Gly Ile Leu Glu Ala
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Pro Val Thr His Val Ser Glu Ser Ile Gly Ile Met Glu Val Lys Val
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Leu Arg Thr Ser Gly Ala Arg Gly Asn Val Ile Val Pro Tyr Lys Thr
565 570 575
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Ile Leu Gly Glu His Thr Lys Leu Glu Val Ile Ile Glu Glu Ser Tyr
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Thr Val Ser Ala Gly Glu Asp Asp Asp Asp Asp Glu Cys Gly Glu Glu
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Ala Ser Ile Gly Asn Val Thr Gly Ser Asn Ala Val Asn Val Phe Leu
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Gly Ile Gly Val Ala Trp Ser Ile Ala Ala Ile Tyr His Ala Ala Asn
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Arg Arg Pro Glu Ile Gly Gly Glu Leu Gly Gly Pro Arg Thr Ala Lys
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Leu Leu Thr Ser Cys Leu Phe Val Leu Leu Trp Leu Leu Tyr Ile Phe
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Phe Ser Ser Leu Glu Ala Tyr Cys His Ile Lys Gly Phe
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<210>2
<211>921
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Ala Pro Leu Ala Leu Val Gly Val Thr Leu Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
Pro Cys Ser Gly Ala Ala Thr Pro Thr Pro Ser Leu Pro Pro Pro Pro
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50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Ser Val Ile Glu Val Cys Gly His Asn Phe Gln Ala Gly Glu Leu
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Gly Pro Gly Thr Ile Val Gly Ser Ala Ala Phe Asn Met Phe Val Val
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Ile Ala Val Cys Ile Tyr Val Ile Pro Ala Gly Glu Ser Arg Lys Ile
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Val Phe Ala Trp Met Ala Asp Lys Arg Leu Leu Phe Tyr Lys Tyr Val
245 250 255
Tyr Lys Arg Tyr Arg Thr Asp Pro Arg Ser Gly Ile Ile Ile Gly Ala
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Ala Glu Ala Pro Gly Glu Leu Gly Gly Leu Gly Pro Gly Pro Ala Glu
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Ala Arg Glu Leu Asp Ala Ser Arg Arg Glu Val Ile Gln Ile Leu Lys
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Ile Ala Asn Tyr Tyr Ala Leu Leu His Gln Gln Lys Ser Arg Ala Phe
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Gly Ile Ile Asp Asp Asp Ile Phe Glu Glu Asp Glu His Phe Phe Val
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Cys Arg Leu Glu Val Ile Ile Glu Glu Ser Tyr Asp Phe Lys Asn Thr
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Val Asp Lys Leu Ile Lys Lys Thr Asn Leu Ala Leu Val Ile Gly Thr
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Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Gly Ser Arg Glu Glu Arg Leu Pro Ser
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Gly Val Ser Ile Leu Val Ile Gly Leu Leu Thr Ala Leu Ile Gly Asp
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Leu Ala Ser His Phe Gly Cys Thr Val Gly Leu Lys Asp Ser Val Asn
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Ser Lys Val Ala Ala Leu Gln Asp Gln Cys Ala Asp Ala Ser Ile Gly
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<211>924
<212>PRT
<213>人
<400>3
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805 810 815
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820 825 830
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Gln Glu Phe His Val Ser Ala Gly Thr Leu Ala Phe Ser Val Thr Leu
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885 890 895
Ala Thr Thr Trp Leu Phe Val Ser Leu Trp Leu Leu Tyr Ile Leu Phe
900 905 910
Ala Thr Leu Glu Ala Tyr Cys Tyr Ile Lys Gly Phe
915 920
Claims (27)
1、检测NCX蛋白质活性的测定，其包括：
a)提供表达NCX的细胞；
b)提供检测细胞内钙的有色物质；
c)将细胞与NCX活性激活剂接触；和
d)将钙介导的所述有色物质发光信号的改变与对照实验中产生的发光信号进行比较。
2、根据权利要求1所述的测定，其中所述NCX蛋白质为以下列出的NCX蛋白质：NCX1、NCX2、NCX3。
3、根据权利要求1所述的测定，其中所述NCX蛋白质为哺乳动物来源，优选来源于大鼠、小鼠、狗、牛、猪、猿或人。
4、根据权利要求1所述的测定，其中所述细胞选自CHO、HEK、COS7和JURKAT细胞。
5、根据权利要求1所述的测定，其中所述有色物质以染料前体添加到所述细胞中，该染料前体能够进入细胞并被水解成染料，从而在所述细胞中该染料与钙复合并提供发光信号。
6、根据权利要求1和5所述的测定，其中所述发光信号为荧光，所述检测步骤c)采用FLIPR装置。
7、根据权利要求5所述的测定，其中所述染料前体为乙酸甲酯衍生物。
8、根据权利要求5所述的测定，其中所述染料为钙敏感的荧光染料fluo-4。
9、根据权利要求1-8中任一项所述的测定，其中所述NCX活性激活剂为离子霉素。
10、根据权利要求1-9中任一项所述的测定在测试化合物作为NCX激动剂或拮抗剂的活性中的用途。
11、根据权利要求1-9中任一项所述的测定用于诊断与NCX的表达改变相关的疾病的用途。
12、测定响应化合物的加入的NCX蛋白质活性的测定，其包括：
a)提供表达NCX的细胞；
b)提供检测细胞内钙的有色物质；
c)将细胞与化合物接触，其中在用所述化合物处理所述细胞之前，用NCX活性激活剂处理所述细胞；和
d)将钙介导的所述有色物质发光信号的改变与对照实验中产生的发光信号进行比较。
13、根据权利要求12所述的测定，其中所述NCX蛋白质为以下列出的NCX蛋白质：NCX1、NCX2、NCX3。
14、根据权利要求12所述的测定，其中所述NCX蛋白质为哺乳动物来源，优选来源于大鼠、小鼠、狗、牛、猪、猿或人。
15、根据权利要求12所述的测定，其中所述细胞选自CHO、HEK、COS7和JURKAT细胞。
16、根据权利要求12所述的测定，其中所述有色物质以染料前体添加到所述细胞中，该染料前体能够进入细胞并被水解成染料，从而在所述细胞中该染料与钙复合并提供发光信号。
17、根据权利要求12和16所述的测定，其中所述发光信号为荧光，所述检测步骤c)采用FLIPR装置。
18、根据权利要求16所述的测定，其中所述染料前体为乙酸基甲酯衍生物。
19、根据权利要求16所述的测定，其中所述染料为钙敏感的荧光染料fluo-4。
20、根据权利要求12-19所述的测定，其中所述化合物为NCX拮抗剂。
21、根据权利要求12-19所述的测定，其中所述NCX激活剂为离子霉素。
22、试剂盒，其包含：
a)表达NCX蛋白质的冻干细胞；
b)有色物质；
c)化合物缓冲液；和
d)有色物质缓冲液。
23、根据权利要求22所述的试剂盒，其中所述有色物质为钙敏感的荧光染料fluo-4。
24、根据权利要求22和23所述的试剂盒，其中所述NCX蛋白质为以下列出的NCX蛋白质：NCX1、NCX2、NCX3。
25、根据权利要求22和23所述的试剂盒，其中所述NCX蛋白质为哺乳动物来源，优选来源于大鼠、小鼠、狗、牛、猪、猿或人。
26、根据权利要求22-25中任一项所述的试剂盒在测试化合物作为NCX激动剂或拮抗剂的活性中的用途。
27、根据权利要求22-25中任一项所述的试剂盒用于诊断与NCX的表达改变相关的疾病的用途。
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