TW200906849A

TW200906849A - Natriuretic fusion proteins

Info

Publication number: TW200906849A
Application number: TW097120915A
Authority: TW
Inventors: Keith Canada; Uwe Schoenbeck; Eugene R Hickey; Adam Mezo; Kevin Mcdonnell
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int; Syntonix Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2007-06-06
Filing date: 2008-06-05
Publication date: 2009-02-16
Also published as: JP2010530222A; US20100310561A1; CA2689492A1; CL2008001661A1; EP2162464A1; UY31123A1; PE20090311A1; AR066885A1; WO2008154226A1

Description

200906849 九、發明說明： L發明所屬技術領域3 與聯合研究協議相關之說明在如於百靈格殷格翰國際公司（Boehringer Ingelheim 5 International，GmbH)與新通尼斯藥物有限公司（Syntonix Pharmaceuticals, Inc.)間的2004合作研究及技術提昇正式文件中所定義之聯合研究協議下開發包含在此申請案中的一或多個發明。發明領域 10 本發明係關於一種具有利尿、利尿鈉及血管擴張活性之融合蛋白質，特別是連結至抗體Fc區段的利尿鈉胜肽。本發明之融合蛋白質與野生塑利尿鈉胜肽（其提供作為對膜鳥苷酸環化酶之配體）比較具有延長的血漿半生期。本發明亦針對一種編碼於本文揭示的融合蛋白質之核酸分子、 15表現出該蛋白質的表現載體、包含本發明之融合蛋白質及/ 或核酸分子的藥學組成物。根據本發明之組成物可藉由注射給藥。本發明亦關於一種治療或改善能藉由黏結本發明的融合蛋白質來活化NPRA受體以授予患者治療利益之病理症狀的方法。 2〇【先前技術】發明背景利尿鈉胜肽與許多生物功能（包括血管内容積、血壓、鈉尿、利尿及長骨生長之調整)有關。這些胜肽包括例如心房利尿鈉胜肽(ANP)及B型利屎鈉胜肽(BNP)，此二者咸信 5 200906849 在黏結至細胞表面糖蛋白受體利尿鈉胜肽受體a(npra) (其為一種能在配體黏結後催化cGMp之合成的膜鳥苷酸環化酶)後可發揮其細胞效應。在其生物功能當中

，咸信ANP 及證在心血管系統上具有效應且對多種心臟症狀（包括急 5性心衰竭和慢性充血性心衰竭）之治療可為特別有效的治療法。不幸的是，雖然此有臨床應用的指望，ANp及BNp的治療實用性嚴重地受到限制，如内肽酶降解和利尿鈉胜肽清除爻體(NPR-C)主導的内化作用造成這些蛋白質活體内 10具有相當短的半生期。例如，ANP在人類中的血漿半生期大約為二分鐘及BNP估計大約為20分鐘（帕特（Potter)等人，内分泌回顧(Endocrine Reviews) (2006) 27(1) : 42-72)。因此，先前這些胜肽之治療性給藥已經限制為耗時的靜脈内輸液(典型在醫院或其它醫療設施中）。就此本身來說，已 15需要另一種允許醫學更完整地獲得利尿鈉胜肽(諸如，ANP 及BNP)的臨床利益之治療。【發明内容】發明概要本發明係關於一種新穎、具生物活性的融合蛋白質， 20其由一或多個連結至IgG或其它抗體的Fc區域之利尿鈉胜狀組成。於本文亦提供能編碼本發明之利尿鈉融合蛋白質的核酸分子及包含編碼利尿鈉融合蛋白質的多核苷酸序列之表現載體，以用於包括治療或改善NPRA受體的活化能授予患 200906849 者治療利益之病理症狀（包括（但不限於）與利尿、利尿鈉及血管擴張活性異常相關的疾病）之用途。根據本發明的融合蛋白質或核酸分子可存在於包含醫藥上可接受的賦形劑、載劑或稀釋劑之組成物中。 5 在一個觀點中，本發明係有關一種融合蛋白質，其包含一或多個藉由甘胺酸琥珀酸鹽連結子黏結至FC區段之利尿鈉胜肽。如於本文中考慮到’當使用甘胺酸琥珀酸鹽連結子及/或不同長度及序列的胺基酸連結子來連結利尿鈉胜肽與F c區段時，該連結子的甘胺酸殘基連結至F c區段之n 10 終端及號珀酸鹽部分連結至利尿納胜肽的C終端。與該連結子相關的是，其長度及組成物需要能達成該利尿鈉胜肽之延長功效。如於本文中考慮到，該胜肽可在不同方向上連結至Fc區段。在一個方向上，該胜肽之C終端連結至Fc區段的N終端，及在另一個方向上，該胜肽之n終端連結至以區 15段的1^終端。該Fc區段以該枢紐(IgG分子的CH2及CH3區域）的同型二聚體存在，其中該Fc區段從在1§(}樞紐區域内的第一N終端半胱胺酸殘基處開始，且該同型二聚體由在樞紐中來自CysProProCysPro (SEQ ID NO : 1)的半胱胺酸殘基之二個二硫醚鍵保持在一起。 20 在進一步觀點中，本發明包括一種藥學組成物，其包含醫藥上可接受的賦形劑、載劑或稀釋劑及任何於本文所描述之融合胜狀。在額外的觀點中’本發明亦針對一種編碼於本文所揭不之融合蛋白質的核酸分子及表現出該蛋白質的表現載 7 200906849

在另一個觀點中，本發明係關於一種治療或改善嫩八 ;又之活化可授予患者治療利益的病理症狀之方法，其中 /病里症狀包括（但不限於）與利尿、利尿納及血管擴張活性異=相關的疾病，及/或想要弓丨發利尿納㈣職⑷、利尿、二s擴張或_整腎激素血f緊縮素丨ς及盤固醇系統來治療或文c»者這些症狀包括特徵為細胞外流體過量的那些，包括(但不限於)肺水腫。在特別佳的具體實例中，本發明包括-種治療或改善心血管系統的病理症狀之方法，其中該 ίο病理症狀包括(但不限於)慢性心臟衰竭(非缺血）、mi後心臟衰竭（缺血CHF)、急性MI、再灌注損傷、左^室機能障礙 (LVD)、心臟纖維變性、舒張性心臟衰竭及肥厚型心肌病。此外，可藉由本發明之方法來治療或改善高血壓性病症，包括（但不限於）高血壓（例如，肺動脈高血壓、收縮期高血 I5壓、頑固型高血壓)及其它心血管相關的疾病（諸如糖尿病性腎病）。於本文亦考慮到本發明之融合蛋白質及藥學組成物可提供接受冠狀動脈繞道手術(CABG)的患者治療利益。於本文亦考慮到本發明包括使用本發明之融合蛋白質來製ie用於/〇療或改善任何上述提供的病理症狀之藥叫。 20 本發明的這些及其它觀點將在參考下列詳細說明及所附加的圖形後變明瞭。於本文所揭示的全部參考資料其全文It此以參考方式併入本文，如若每篇各別併入般。圖式簡單說明

第1A-B圖：4種重組製造的ANP-Fc融合蛋白質之dNA 200906849 及蛋白質序列。黑體的老鼠IgGK輕鏈信號序列切掉且其不為最後蛋白質產物的一部分。hANP28劃有底線。（GGS)XGG 連結子以斜體表示。第2圖：用於cGMP分析的典型劑量反應曲線。分析在 5 表現出大白鼠NPRA之293T細胞中用於cGMP製造之重組製造的融合蛋白質。第3圖：ANP或融合蛋白質在hNPRA293細胞+/-NEP中引發的cGMP製造。【實施方式2 10 較佳實施例之詳細說明本揭示提供一種包含利尿鈉胜肽及抗體Fc區段之融合蛋白質，其中該利尿鈉胜肽直接或經由連結子結合至該Fc 區段。該融合蛋白質的利尿鈉胜肽與Fc區域提供二個明顯能提供融合蛋白質功效的生物學角色。驚人的是，連結子 15長度亦影響融合蛋白質的功效。本揭示亦提供一種包含至少二個彼此由抗體1^區段分隔的利尿鈉胜肽之融合蛋白質，其中該利尿鈉胜肽直接或經由連結子結合至FC區段。在某些具體實例中，該融合蛋白質包含下列式：

20 X-La-F : F-La-X^X-La-F ： F 其中： X為利尿鈉胜肽； L為包含“a”個胺基酸殘基的連結子； a為矣少0的整數； 200906849 :為化學締合或交聯；及 F為包含一FcRn黏結位置的免疫球蛋白Fc區段之至少一部分。在某些具體實例中，該融合蛋白質包含下列式：

5 X-La-F ： F-La-X 其中 X為一或多個利尿鈉胜肽； L為包含胺基酸殘基的連結子； a為至少0的整數； 10 :為化學締合或交聯；及 F為包含一 FcRn黏結位置的免疫球蛋白Fc區段之至少一部分。在某些具體實例中，該利尿鈉胜肽選自於由下列所組成之群組：ANP、BNP、尿鈉素(Urodilatin)、DNP或其生物 15 活性序列變體。在某些具體實例中，該利尿鈉胜肽為ANP 或 BNP。在某些具體實例中，該融合蛋白質包含至少二個利尿鈉胜肽。在某些具體實例中，X可為多於一個利尿鈉胜肽。在某些具體實例中，二個利尿鈉胜肽皆為ANP。在某些具 20 體實例中，二個利尿鈉胜肽皆為BNP。在某些具體實例中，化學締合（即，（：）)為一共價鍵。在其它具體實例中，化學締合（即，（：）)為一非共價的交互作用，例如，離子交互作用、疏水性交互作用、親水性交互作用、凡得瓦爾交互作用或氫鍵。 10 200906849 在某些具體實例中’該融合蛋白質包含至少二個&區段。在某些具體實例巾’該連結子的長度為至少2、4、6、 9、η、16或2G個胺基酸。在其它具體實例中，該連結子具 5 有至少0、卜 5、7、8、1〇、12、13、14、15、17、18、19、 21、22、23、24、25 ' 26、27、28、29或30個胺基酸，但

是可選擇性較長’例如，長度在30至4〇個胺基酸間或長度在40及50個胺基酸間。在某些具體實例中，該連結子選自於6至11個胺基酸長、11至16個胺基酸長、9至2〇個胺基酸 10長、16至20個胺基酸長、16至25個胺基酸長、2〇至30個胺基酸長、25至35個胺基酸長、3〇至5〇個胺基酸長、3〇至40 個胺基酸長或35至45個胺基酸長。在某些具體實例中，該連結子的長度多於10、多於15、多於20、多於25或多於30 個胺基酸。在某些具體實例中’該連結子選自於甘胺酸琥 15珀酸鹽連結子(L1)、胺基酸連結子或其組合。在某些具體實例中，該胺基酸連結子為GlyGly(L2)、 Gly(SerGlyGly)2SerGly (L3) (SEQ ID NO ： 2)' (GlyGlySer)3GlyGly (L4) (SEQ ID NO : 3)、（GlyGlySer)4GlyGly (SEQ ID NO : 4)、（GlySerGly)5Gly (L5a) (SEQ ID NO: 5)、(GlyGlySer)5Gly 20 (L5) (SEQ ID NO : 6)或(GlyGlySer)6GlyGly (L6) (SEQ ID NO : 7)。在某些具體實例中，該融合蛋白質比相應的野生型利尿鈉蛋白質更具抗蛋白分解降解性。在某些具體實例中，該融合蛋白質顯示出比相應的野生型利尿鈉蛋白質具有較 11 200906849 長的半生期。在某些具體實例中，該融合蛋白質由重組技術、合成化學或半合成化學製得。本揭示提供一種包含SEQ ID NO : 8-11(各別由SEQ ID NO · 33-36編碼）之任何一種的利尿納融合蛋白質。本揭示 5亦提供一種包含SEQ ID NO : 12-13之任何一種的利尿鈉融合蛋白質。本揭示亦提供一種經分離的多胜肽，其與具有選自於由下列所組成之群組的序列之多胜肽具有至少9〇%的序列同一性：SEQ ID NO : 8、SEQ ID NO : 9、SEQ ID NO : 10 10 及 SEQ ID NO : 11。本揭示亦提供一種經分離的多胜肽，其與具有選自於由下列所組成之群組的序列之多胜肽具有至少90%的序列同一性：SEQ ID NO : 12及SEQ ID NO : 13。本揭示亦提供一種經分離的多胜肽，其與具有選自於 15 由下列所組成之群組的序列之多胜肽具有至少95%的序列同一性：SEQ ID NO : 8、SEQ ID NO : 9 ' SEQ ID NO : 10 及 SEQ ID NO : n。本揭示亦提供一種經分離的多胜肽，其與具有選自於由下列所組成之群組的序列之多胜肽具有至少9 5 %的序列 20 同一性：SEQIDNO : 12及SEQIDNO : 13。本揭示亦提供一種經分離的多胜肽，其與具有選自於由下列所組成之群組的序列之多胜肽具有至少9 9 %的序列同一性：SEQ ID NO : 8、SEQ ID NO : 9、SEQ ID NO : 10 及SEQ ID NO.U。 12 200906849 本揭示亦提供一種經分離的多胜肽，其與具有選自於由下列所組成之群組的序列之多胜狀具有至少99%的序列同—性：SEQIDNO : 12及 SEQIDNO : 13。本揭示提供一種包含如描述於本文的利屎鈉融合蛋白 5處之藥學組成物。在某些具體實例中，該融合蛋白質適合用於靜脈内、皮下或口服給藥。本揭示提供一種經分離的核酸分子，其編碼選自於由下列所組成之群組的多胜肽：SEQ IDNO: 8、SEQIDNO : 9、SEQIDNO : 10及SEQIDNO : U。本揭示亦提供一種 10經分離的核酸分子，其編碼選自於由下列所組成之群組的多胜肽：SEQ ID NO : 12及SEQ ID NO : 13。在某些具體實例中’該融合蛋白質使用哺乳動物、原核生物、酵母菌、植物或轉殖基因表現系統重組地製造。本揭示提供一種用來治療或改善特徵為細胞外流體位 15準過多的症狀之方法，其將一治療有效量包含一或多種如描述於本文的利尿鈉融合胜肽之藥學組成物給藥至需要此的患者。本揭示提供〆種用來治療或改善NPRA受體之活化可 k供治療利益的病理症狀之方法，其將一治療有效量包含 20 —或多種如描述於本文的利尿鈉融合胜肽之藥學組成物給藥至需要此的患者。本揭示提供/種用來治療或改善與利尿、利尿鈉及血盲擴張活性異常相關的疾病之方法’其將一治療有效量包含一或多種如描述於本文的利尿鈉融合胜肽之藥學組成物 13 200906849 給藥至需要此的患者。本揭示提供一種想要引發利尿鈉、利尿、血營擴張或 S周整腎激素血管緊縮素Η及搭固醇系統來治療或改善疾病之方法，其將一治療有效量包含一或多種如描述於本文的 5利尿鈉融合胜肽之藥學組成物給藥至需要此的患者。本揭示提供一種用來治療或改善選自於由下列所組成之群組的心血管系統之病理症狀的方法：慢性心臟衰蝎（非缺血）、再灌注損傷、左心室機能障礙(LVD)、心臟纖維變性、舒張性心臟衰竭及肥厚型心肌病，其將一治療有效量 10包含一或多種如描述於本文的利尿鈉融合胜肽之藥學組成物給藥至需要此的患者。本揭示提供一種用來治療或改善選自於由下列所組成之群組的高血壓病症之方法：高血壓、肺動脈高血壓、收縮期高血壓及頑固型高企壓，其將一治療有效量包含—或 15多種如描述於本文的利尿鈉融合胜肽之藥學組成物給藥至需要此的患者。本揭示提供一種用來治療或改善糖尿病性腎病的方法，其將一治療有效量包含一或多種如描述於本文的利尿鈉融合胜肽之藥學組成物給藥至需要此的患者。 20 Α.定義除非其它方面有所定義’否則於本文所使用的全部工藝及科學名稱具有與通常由一般技藝人士所了解本發明適用的相同意義。在發明本文之說明中所使用的術語僅用於描述特別具體實例之目的而不意欲限制本發明。使用標題 14 200906849 以方便讀者且亦不意欲限制本發明。於本文提到之全部公告、專利申請案、專利及其它參考資料其全文以參考之方式併於本文’如為於此以其商標名稱指出的任何品牌藥之包裝說明書。 u 5 ®使用在本文所提出的專利說明書及具體實例中時， " 下列名稱具有所指出的意義。 -除非上下文有明確顯示出，否則單―形式“一”、個，，及“該”意欲同樣包括複數形式。 “融合蛋白質”(例如，“利尿鈉融合蛋白質，，），當該名稱 Π)使用於本文時指為具有至少二個共價連結的多胜肽之蛋白質’其中-個多胜肽來自-種蛋白質序列或區段及另—個多胜肽來自另-種蛋白質序列或區段。通常來說，該融合蛋白質的多胜肽可直接或經由共價的連結子連結。該名稱 (“連結子”)指為胺基酸連結子，諸如聚甘胺酸連結子；或另 15 一種型式的化學連結子，例如，甘胺酸破珀酸鹽連結子、破水化合物連結子、脂質連結子、脂肪酸連結子、聚_連 U 結子等等。該連結子可由長度至少2、4、6、9、11、16或 20個胺基酸組成。再者，該連結子可由至少〇、1、5、7、8、 10、12、13、14、15、17、18、19、21、22、23、24、25、 20 26、27、28、29或30個胺基酸組成，但是可選擇性較長，例如’長度在30至40個胺基酸間或長度在40至50個胺基酸間。該胺基酸選自於20個天然發生的胺基酸(任一種異構形式，D或L)，例如’甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸及離胺酸。該連結子可由多數空間未受阻礙的胺 15 200906849 基酸組成，諸如甘胺酸及丙胺酸。該連結子可包含一定長度範圍的胺基酸殘基’諸如例如’ 6至11個胺基酸長、11至 16個胺基酸長、16至2〇個胺基酸長、16至25個胺基酸長、 20至30個胺基酸長、3〇至35個胺基酸長、35至40個胺基酸 5 長、40至45個胺基酸長或45至50個胺基酸長。這些胺基酸某些可經糖基化。非胜肽連結子亦可能。例如，可使用烷基連結子，諸如—NH--(CH2)s--C(0)--，其中s=2-20。這些烷基連結子可進一步經由任何非空間位阻基團取代，諸如短鏈烷基(例如，Cr-C6)、短鏈醯基、鹵素（例如，c卜Br)、 10 CN'NH2、苯基等等。典型的非胜肽連結子有peg連結子，其中該連結子具有分子量100至5000 kD，較佳為100至 500kD。該胜肽連結子可使用與上所述相同的方式改變以形成衍生物。如描述在本文的實施例中，本發明之融合蛋白質的較佳連結子為含有基本重覆(GGS)X或(GGS)XGG的胺 15 基酸之延伸。例如，X可為從0至16的整數。雖然於本文詳細描述出特定方向，形成融合蛋白質之多胜肽可C終端連結至N終端，雖然它們亦可C終端連結至C終端、N終端至N終端、或N終端至C終端，及該融合蛋白質的多胜肽可呈任何順序。於本文亦考慮到本發明之融合蛋白質可包括二種胜 20 肽融合物。例如，該融合蛋白質可包含一個由二個Fc區段包失的胜肽(例如，Fc-利尿鈉胜肽-Fc)，其中該利尿鈉胜肽直接或經由連結子結合至Fc區段。如於本文中考慮到，當使用甘胺酸琥珀酸鹽連結子來連結利尿鈉胜肽及Fc區段時，該連結子的甘胺酸殘基連結至Fc區段之N終端及琥珀酸 16 200906849 鹽部分連結至利尿納胜肽的c終端。么名稱、合蛋白質”亦指為構成該融合安白質的多胜狀之經保存性改質的變體、多形態變體'對偶基因、突變型、子序列及種間同系物。融合蛋白質可藉由將/來自一種蛋 5白質序列的胺基酸鏈共價連結至來自另一種蛋白質序列之 =基酸鏈來製造，例如，藉由製備-連續編瑪該融合蛋白貝之重、、且多核苷酸或藉由由熟知技藝之人士熟知的合成方法。於本文中所使用的名稱“蛋白質，，可與“多胜肽’’及“胜 10肽”交替使用。 ' ” 酸指為去氧核糖核苦酸或核糖核择酸及其呈單或雙股形式之聚合物。該名稱包括包含已知的核苷酸類似物或經改質的骨架殘基或鍵鏈之核酸，其可合成、天然發生及非天然發生，其具有與參考核酸類似的黏結性質及其以 15類似於參考核苷酸之方式代謝。此等類似物已由熟知技藝之人士熟知及包括例如硫代麟酸醋類（phosphoramidates)及胺基喊酸酯類（phosphoramidates)。除非其它方面有所指出’否則特別的核酸序列無疑地亦包括其經保存性改質的變體(例如，簡併密碼子替代物)及互補序列，和明確指出的 20 序列。如於本文中所使用，名稱“核酸”亦可指為“基因”、 “cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”及“多核苷酸，，。如於本文中考慮到，包含本發明之融合蛋白質的多核苷酸序列在嚴峻條件下雜交至編碼該融合蛋白質的每種各別多胜肽之每種核苷酸序列。因此，編碼該融合多胜肽的 17 200906849 各別多胜肽之多核苷酸序列包括經保存性改質的變體、多形態變體、對偶基因、突變體、子相及種間同源物。序列同一性百分比，，藉由在比較窗口上比較二種最理想的排列序列來測量，其中在比較窗口中的多核苷酸序列 5部分可包括加入或缺失（即，間隙），如與二種序列的最理想排列用之參考序列（其不包含加入或缺失）比較。該百分比藉由測s在二序列中發生相同的核酸鹼基或胺基酸殘基之位置數以產生一相配位置的數目，將該相配位置的數目除以在比較窗口中的位置總數並將結果乘以100來計算，以產生 10 序列同一性百分比。 15 20 名稱多核苷酸序列的“實質上同一性，，意謂著—多核苷酸包含具有至少25%序列同—性之序列。再者，同—性百分比可為從25%至的任何整數。更佳的具體實例至少包括：25%、3G%、35%、4〇%、45%、50%、55%、6〇%、 ▲ /〇，叫·7。、、90%、95%或99%或較高，使用由熟知技藝之人士熟知的程式與參考序列比較；使用標準參數的BLAST較佳。熟知技藝之人士將了解可適合地調整這些值以便考慮到密碼子簡并性、胺基_似性: 讀碼框位置及其類似物㈣定“二種核讀序列編碼的蛋白質之相應同-性。為了這些目的，胺基酸序列之“實質上同-性”正常意謂著至少佩的序列同—性。多胜佳同-性百分比可為從4()%至削％之任何整數。更佳料體實例至少包括6G%、65%、鳩、75%、8()%、阶9〇〇/ ㈣或^。“實質上類似’’的多胜肽制如上㈣到的。序 18 200906849 列，除了不相同的殘基位置可藉由變化保存性胺基酸而不同外。可根據習知方法進行序列之最理想排列的比較，例如’使用史密斯（Smith)及瓦特門（Waterman)的局部同一性 5 演算法 ’（1981)Add. APL. Math. 2 : 482 ;使用尼斗門 (Needleman)及汪奇(Wunsch)的同一性排列演算法，（197〇) J_ Mol. Biol. 48 : 443 ;使用皮耳森(PEARSon)及李普門（Lipman) 的類似性方法之搜尋，（1988) Proc. Natl. Acad. Sd. (U.S.A.) 85 : 2444 ;或使用這些演算法的電腦計算工具(在威斯康辛 10 州遺傳學軟體包袤（Wisconsin Genetics Software Package) 中之GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA (遺傳學電腦組(Genetics Computer Group)(GCG)，575科學，麥迪森博士(Dr., Madison)，Wis.))。合適於決定序列同一性百分比及序列類似性之演算法 15 的較佳實施例有BLAST及BLAST 2.0演算法’其各別描述在歐次諸（Altschul)等人（1977)的 Nuc. Acids Res. 25 : 3389 3402及歐次諸等人（1990)的J. Mol. Biol. 215 : 403410中，且由熟知技藝之人士熟知。核苷酸序列實質上相同的另一個跡象為二種分子是否 20 在適度及較佳為高度嚴峻條件下彼此雜交或雜交至第三核酸。通常來說，高度、適度及低嚴峻雜交條件已由熟知技藝之人士熟知。例如，所選擇的嚴峻條件為低於在所定義的離子強度及pH下，標的序列之50%雜交至完美相配的探針時之溫度(1\„)約5至10°(：;中度嚴峻為低於丁1„約20-29。(：； 19 200906849 及低嚴峻條件的特徵為其溫度低於Tm約40-48°C。嚴峻的雜交條件之實施例可考慮為50%甲醯胺、5X SSC及1%SDS，在42°C下溫育；或5X SSC，1%SDS，在65°C下溫育及在0.2X SSC中洗滌，及0.1%SDS在65°下。參見例如，替森(Tijssen) 5 的生物化學及分子生物學之技術-與核酸探針雜交 (Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Probs)，“雜交原理及核酸分析對策綜述（Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays)”（1993);柏格（Berger)及金 l〇美爾（Kimmel)編輯的分子選殖技術指南（Guide to Molecular Cloning Techniques)，酵素學方法（Methods in Enzymology)，第 152冊，1987。 “胺基酸”於本文中定義為天然發生、人造或合成胺基酸（呈L或D立體異構物形式）之任何一種，除非其它方面有 15詳細指明。名稱“殘基，，可與名稱“胺基酸，，交替使用且當在所提供的胺基酸序列中具有特別的位置時經常會標示出。 “生物活性”指為具有治療或藥理學活性之藥劑，諸如同效劑、部分同效劑或拮抗劑。 “有效量”當提供於本文時指為無毒但是足以提供想要 20的治療效應之量。如將在下列指出，所需要的精確量將隨著患者而不同，其將依患者的年齡、一般症狀、欲治療的症狀之嚴重性、所給藥的特別生物活性藥劑及其類似狀況而定。在任何各別的實例中，適當的“有效，，量可由一般技藝人士參考貼切的教科書及文獻及/或使用例行的實驗來 20 200906849 決定。如於本文中所使用，名稱“FC區段”指為衍生自“γ”幹的抗體之一部分’及其由二個重鏈（其依抗體種類而定，每個提供二至三個固定的區段）組成。該Fc區域黏合至多種細胞 5受體及補體蛋白質而傳達抗體的不同生理效應。如於本文中考慮到，本發明可使用任何顯示出最小至無受動器功能的抗體之Fc區段。這些包括（但不限於）igG卜IgG2、IgG4，但是亦可包括任何序列已經根據由熟知技藝之人士熟知的方法改變以擁有最小的受動器活性之抗體的任何Fc區段。 1〇再者’名稱“Fc區段”可描述為包含枢紐(CH2及CH3區域）的IgG重鏈，其中該IgG重鏈在該樞紐區域内的第一n終端半胱胺酸殘基處開始及在第一及第二N終端半胱胺酸殘基處與另一個Fc區段形成一同型二聚體。亦使用名稱“Fc”來描述該融合蛋白質的一部分。在此上下文中，Fc為包含枢紐(CH2及CH3區段）之IgG重鏈，該 IgG重鏈在該樞紐區域内的第一N終端半胱胺酸殘基處開始及在第一與第二N終端半胱胺酸殘基處與另一個Fc形成一同型二聚體。換句話說，該Fc同型二聚體的每條鏈之n終端胺基酸序列從IgG樞紐區域的CysProProCysPro (SEQ ID 2〇 NO : 1)開始，及二Cys殘基經二硫醚鍵結。如於本文中所使用，當胜肽實質上無細胞物質或無化學前驅物或其它化學藥品時’其可說成經“分離’，或“純化”。本發明之融合胜肽可純化成同種質或其它純度程度。純化程度將以想要的用途為基礎。關鍵特徵為該製備允許 21 200906849 該胜肽即使於相當大量的其它組分存在下亦擁有想要的功能。 “利尿鈉胜肽”當於本文指出時包括哺乳動物利尿鈉因子(ANP、BNP、CNP)、和鮭魚心臟胜肽(托弗冷(Tervonen) 5 等人，内分泌學139(9) : 4021-4025 (1998))及樹眼鏡蛇性 (dendroaspis)利尿納胜肽（DNP)(史魏次（Schweitz)等人，J. Biol. Chem.，267(20) : 13928-13932 (1992))、尿鈉素及類似於此的胜肽、及類似物、活性片段、降解產物、鹽、變體、衍生物及其組合。特別是，人類ANP及BNP包括 10 “hANP28”及“hBNP32”，如揭示在寒川（Kangawa)等人之 Biochem. Biophys. Res. Comm. » 118(1) : 131-139 (1984)；蘇多河（Sudoh)等人之自然，332(6159) : 78-81 (1988);及神林(Kambayashi)等人之FEBS Lett.，1 月 1 日；259(2): 341-5 (1990)中。 15 “利尿鈉胜肽”包括具有利尿鈉活性之胜肽，其包括例如為利尿鈉胜肽之對偶基因變體、直系同源(orthologs)、接合變體及/或物種同系物的胜肽。可使用在技藝中已知之程序獲得全長的基因及cDNA、與用於利尿鈉胜肽的核苷酸序列編碼相應之基因及cDNA的對等基因變體、接合變體、全 2〇長的編碼部分、直系同源及/或物種同系物。例如，可藉由從於本文所提供的序列製得之合適的探針或引子來分離及鑑別對等基因變體、直系同源及/或物種同系物’及使用由熟習該項技術者已知的任何技術來對對等基因變體及/或想要的同系化合物篩選出合適之核酸來源。 22 200906849 不由任何如於本文所指出的特別作用模式所限制，“持續釋放或積存調配物，，之藥物動力學的特徵為顯示出生物效性增加，此由於FcRn黏結及鍵結FcRn的分子從在酸性溶酶體内再循環回一般循環（v給替（Ghetie)及E s沃德 5 (Ward) ’ Annual Rev. Immunol.，18，739-766，（2000))。如於本文中所使用，名稱“半合成，，指為—種合成本發明之融合蛋白質的方法，其包括使用合成化學及重組技術一者例如，於本文所揭示的融合蛋白質之pc區段可重組地製得’同時利尿鈉胜肽及連結子可合成地製得。 1〇 B.胜肽分子本發明係關於一種新穎具生物活性的融合蛋白質，其由一或多個連結至IgG或其它抗體的Fc區域之利尿鈉胜狀組成’而使用於包括治療或改善NPRA受體之活化能授予患者治療利益的病理症狀之用途，其中該病理症狀包括（但不 15限於)與利尿、利尿鈉及血管擴張活性異常相關的疾病。根據本發明之融合蛋白質可存在於一包含醫藥上可接受的賦形劑、載劑或稀釋劑之組成物中。本發明係關於一種如描述於本文的融合蛋白質，其可具有下列通式A或B之一， 23 200906849

其中’ 該利尿鈉胜肽⑴選自於由下列所組成之群組：一或多種ANP、BNP、尿納素、DNP及其生物活性序列變體；及(ii) 5 可呈胺基酸序列的Ν’至C’方向、胺基酸序列的c，至N，或在多於一個利尿鈉胜肽的實例中，Ν’至C’、C，至Ν’或Ν’至C’ 與C，至Ν，之混合物；及該Fc區段為一包含樞紐(CH2及CH3區域）之IgG重鏈，其中該IgG重鏈在柩紐區域内的第一N終端半胱胺酸殘基處 10 開始及在第一及第二N終端半胱胺酸殘基處與另一個Fc區段(例如，SEQIDNO : 14或SEQIDNO : 17)形成一同型二聚體，其中該Fc區段由FcAB或FcBA表示，其中AB為二Fc區段的Ν’至C，方向及BA為二Fc區段的C’至Ν’方向。如於本文中考慮到’在一個觀點中，本發明具體表現 15 出一種融合蛋白質’其包含至少一種經由連結子結合至抗體的Fc區段之利尿鈉胜肽。該融合蛋白質可實際上包含一 24 200906849 個或二個結合至抗體Fc區段的利尿鈉胜肽。如詳細描述在下列，使用來結合胜肽與Fc區段的連結子之序列及長度可依該融合蛋白質包含一或二個利尿鈉胜肽而變化。本發明的一個觀點係關於一種具有下列通式丄或2之— 5 的融合蛋白質，利尿納胜狀 - 連結子h Fc區段 1 < f? Fc區段利尿鈉胜肽. -連結子- Fc區段 f f ?! 利尿鈉胜肽 -連結子-1 Fc區段其中，該利尿鈉胜肽⑴選自於由下列所組成之群組：一或多種ANP、BNP、展納素、DNP及其生物活性序列變體；及(^) 10 可呈胺基酸序列的Ν’至C’方向、胺基酸序列的c’至N，或在多於一個利尿納胜肽的實例中，Ν’至C’、C’至Ν，或Ν，至C，與C’至Ν’之混合物；該連結子為一或多種選自於由下列所組成之群組的連結子：琥珀酸鹽-甘胺酸連結子（LI)、GlyGly連結子(L2)、 15 Gly(SerGIyGly)2SerGly 連結子（L3)(SEQ ID NO : 2)、 (GlyGlySer)yGlyGly連結子，其中y為3至6(例如，SEQID NO : 3(L4)、4及7(L6))、（GlyGlySer)5Gly(L5)(SEQ ID NO : 25 200906849 6)及(GlySerGly)5Gly連結子(L5a)(SEQIDNO : 5);及該Fc區段為一包含枢紐(CH2及CH3區域）的IgG重鏈，其中該IgG重鏈在樞紐區域内的第一n終端半胱胺酸殘基處開始及在第一與第二N終端半胱胺酸殘基處與另一個Fcg 5 段(例如 ’ SEQIDNO : 14或SEQIDNO : 17)形成一同型二聚體’其中該Fc區段由FcAB或Fcba表示，其中AB為二Fc區段的Ν’至C’方向及BA為二Fc區段的C，至N，方向。在本發明的另一個觀點中，該融合蛋白質具有下列式 3，

ANP|~| 連結 ¥|~| Fc S S ί^Ί 10 - 其中， ΑΝΡ呈ANP(SEQ ID NO: 15)的胺基酸序列之Ν，至 C’(ANPXY)方向或呈ANP的胺基酸序列之C’至N，(ANPYX；^ 向： 15 該連結子為一或多種選自於由下列所組成之群組的連結子：LI、L2、L3、L4、L5、L5a及L6，其中L1為如描述於本文之甘胺酸琥ίά酸鹽連結子，L2為GlyGly連結子、L3 為 Gly(SerGlyGly)2SerGly連結子（SEQ ID NO : 2)、L4為 (GlyGlySer)3GlyGly 連結子（SEQ ID NO : 3)、L5 為 20 (GlyGlySer)5Gly 連結子（SEQ ID NO : 6)、L5a 為 (SerGlyGly)5Gly(SEQ ID NO : 5)及L6為（GlyGlySer)6GlyGly 26 200906849 連結子(SEQ ID NO : 7);及

Fc為⑴包含枢紐(CH2及CH3區域）的IgG重鏈，其中該 IgG重鏈在樞紐區域内之第一N終端半胱胺酸殘基處開始及在第一與第二N終端半胱胺酸殘基處與另一個Fc(例如， 5 SEQ ID NO : 14及SEQ ID NO : 17)形成一同型二聚體；及 (ii)由FclAB、FclBA、Fc2AB或Fc2BA表示，其中Fcl衍生自 IgGl - 分子、Fc2衍生自IgG2分子，AB為Fc的Ν’至C’方向及BA為

Fc的C’至Ν’方向。《在本發明的更另一個觀點中，該融合蛋白質具有下列 10 式！， ANP- -連結子[«) Fc 1 1 ?? S S J_ I 1 ANP· -連結子Fc 其中， ΑΝΡ呈ANP(SEQ ID NO: 15)的胺基酸序列之Ν，至C，方向（ANPXY)或呈ANP的胺基酸序列之C’至Ν’方向 15 (ΑΝΡγχ)，該連結子為一或多種選自於由下列所组成之群組的連結子：L1、L2、L3、L4、L5 ' L5a及L6，其中L1為如描述於本文之甘胺酸琥珀酸鹽連結子，L2為GlyGly連結子、L3 為 Gly(SerGlyGly)2SerGly連結子（SEQ ID NO : 2)、L4為 20 (GlyGlySer)3GlyGly 連結子（SEQ ID NO : 3)、L5 為 (GlyGlySer)5Gly 連結子（SEQ ID NO : 6)、L5a 為 27 200906849 (SerGlyGly)5Gly(SEQ ID NO : 5)及L6為(GlyGlySer)5GlyGly 連結子（SEQIDNO : 7);及

Fc為⑴包含柩紐(CH2及CH3區域）的IgG重鏈，其中該 IgG重鏈在柩紐區域内之第一N終端半胱胺酸殘基處開始及 5 在第一與第二N終端半胱胺酸殘基處與另一個Fc(例如， SEQIDNO : 14或SEQIDNO : 17)形成一同型二聚體；及 (ii)由 FclAB、FclBA、Fc2AB 或 Fc2BA 表示，其中Fcl 衍生自 IgGl 分子、Fc2衍生自IgG2分子，AB為Fc的N，至C，方向及BA為 Fc的C’至Ν’方向。 10 本發明之融合蛋白質為生物活性分子，例如，它們能夠催化cGMP，而且對治療目的更有用’如它們擁有更長的半生期及亦較不受蛋白分解性降解影響。此外，藉由開發 FcRn主導的運輸’於本文揭示的治療性融合蛋白質可藉由快速注射給藥，但是其可顯示出類似慢釋放積存調配物的 15 藥物動力學性質。

本發明之融合蛋白質為一直接或經由連結子結合至抗體（諸如，IgG)的Fc區域之利尿鈉胜肽。藉由結合該胜肽與抗體的Fc區域，這些融合蛋白質顯示出具有比未結合的胜肽更長之半生期。不由任何特別的作用模式所限制，本發 20明之融合蛋白質可在Fc區域黏結至新生兒恆定區片段受體 (FcRn)後經胞飲及分離，及藉由開發FcRn活性載劑系統(該 FcRn途徑將母親抗體(IgG)運輸通過新生動物的腸上皮），可保護於本文所揭示的融合蛋白質位準使其免受細胞内溶酶體（lysozomal)降解和減少曝露至中性内肽酶(NEp)或NpR 28 200906849 /月除文體。該融合蛋白質可在從細胞正常釋放後再循環及傳達至该循環。在此方法中，可避免諸如典塑在配體之大量推注給藥後一起活化NPRA受體。本發明之融合蛋白質的生物效性可更密切地類似慢釋放積存製劑。 5 該&尺11受體表現在數種不同型式的成年人類組織（包括肺、腎及腸）中之内皮細胞表面上。不由任何特別的作用杈式所限制，可開發人類的FcRn受體之正常功能作為給藥生物/舌性ANP-Fc及BNP-Fc融合蛋白質之工具，以用於無數的臨床用途。例如，除了治療或改善心血管系統之病理症 10狀的方法外，本發明之融合蛋白質可使用在治療與利尿、利尿鈉及血管擴張活性異常相關的疾病（其中Npra受體之活化可授予患者治療利益）的方法中。本發明之融合蛋白質可包含任何利尿納胜肽，但是 ANP或BNP較佳。這些蛋白質的人類形式已知為例如SEq 15 ID NO : 15 (NCBI資料庫登錄編號NM_006172)之hANP28 (寒川等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 118(1): 131-139 (1984)及SEQ ID NO: 16 (NCBI資料庫登錄編號NM_002521) 之hBNP32 (神林等人，FEBS Lett 1990年1月 1 日；259(2): 341-5)。除了野生型利尿鈉胜肽之多種結構及序列形式外， 2〇要了解本發明考慮到任何及全部可能的生物活性序列變體’不論是天然發生或經由設計合成。要進一步了解的是，來自任何物種的胜肽皆包含在本發明之範圍内，然而人類胜肽較佳。此外，本發明之融合蛋白質可包含在人類與非人類（例如，來自動物，諸如大白鼠、老鼠、天竺鼠、馬、 29 200906849 牛、豬、羊、狗等等）多胜肽間之任何可能的組合。亦考慮到除了序列變體外，在於本文所揭示的本發明之範圍内包括該胜肽之片段，其中此等片段具有足夠的尺寸而在本發明之方法中具有治療有效性。熟知技藝之人士 5可沒有過度實驗而決定出不會影響生物活性及/或治療效率在胜肽長度及序列變體上的變化。該等蛋白質可為酸性或鹼性鹽形式或可為中性形式。各別的胺基酸殘基亦可藉由氧化或還原改質。在本發明之範圍内的其它變體包括一級胺基酸結構藉 10由與其它胜肽或多胜肽或化學部分(諸如糖基、脂質、碟酸鹽、乙醯基及其類似物）形成共價或聚集結合物而改質之融合蛋白質。可例如藉由將特別的官能基連結至胺基酸側鏈或在N或C終端處來製備共價衍生物。本發明之融合蛋白質可經或未經糖基化。表現在酵母 15菌或哺乳動物表現系統中的融合蛋白質可在分子量及糖化型式上與天然分子類似或稍微不同，端視表現系統而定；在細讀（諸如，大腸桿菌）中編碼多胜肽的DNA表現性提供未糖基化的分子。在某些具體實例中’已發現本發明之二聚物構成物當 20與單體構成物比較時擁有增加的試管内效力。考慮到在利尿納胜肽配體(例如，ANP、BNP等等）與其細胞表面受體間之單體交互作用’連結至抗體Fc區段的利尿納胜肽之二聚物構成物(如描述於本文般)所增加的效力特別驚人。已預期々^述於本文的二聚體構成物將從與細胞及/或受體的互 30 200906849 相作用產生空間位阻’因此，將預測此二聚體構成物具有些微及/或無活性。在某些具體實例中，已發現本發明之單體構成物當與二聚物構成物比較時擁有增加的活體内血清濃度(Cmax)。 5考慮到先前靜脈内給藥單體EP〇-Fc構成物的結果（其顯示出較低的Cmax，如與靜脈内給藥二聚體EPO-Fc構成物比較），連結至抗體Fc區段的利尿鈉胜肽之單體構成物之增加 Cmax (如描述於本文）令人驚訝（參見例如，美國專利申請案公告案號2007/0172928的表4)。 10 該與利尿鈉胜肽結合的Fc區段為IgG的Fc區段較佳，包括（但不限於）IgG卜IgG2或IgG4(參見例如，SEQIDNO : 14或SEQ ID NO : 17)。但是，若經改質以擁有最小或無受動器功能時，可使用其它抗體的Fc區段。人類抗體Fc區段較佳，但是可使用其它物種型式、野生型形式和序列變體， 15 例如，在本文所提供的實施例中所描述之重組Fc分子。在本發明的一個觀點中，該Fc區段由二個來自IgGl或IgG2同型的Fc重鏈組成，其中該樞紐殘基向下移動至在每條鏈上之CPPCP序列以允許該等半胱胺酸殘基之鏈間二硫醚鍵結。理想上，本發明之利尿鈉融合蛋白質包含一Fc區段， 20 其能夠黏合至FcRn受體、觸發此受體的活性載劑功能及造成融合蛋白質傳遞至細胞中。一旦在細胞内，pH改變造成該融合蛋白質從FcRn受體釋放，及該融合蛋白質最後可從細胞釋放回循環中。（魯潘尼恩（R00penian) D.C.等人 (2003)，J. Immun〇i〇gy 17〇 : 3528-3533 ;連蛇（Lencer)W.I. 31 200906849 等人，細胞生物學趨勢15(1) : 5-9 (2005))。如顯示於本文，該使用來結合利尿鈉胜肽與Fc區段的胺基酸連結子之長度及序列可變化。如描述在下列所提供的實施例中’使用NPRA與已鍵結相關的Fc區段之ANP的結 5構模型來預測允許融合Fc的ANP插入NPRA活性位置中所需要的最小連結子距離。如於本文中考慮到，想要的連結子長度為可減少在利尿鈉胜肽與Fc區段間之空間及靜電排斥者。例如，從ANP的C終端之想要的最小距離為12A(離Fc 同型二聚體的最近N終端）及17A(離Fc同型二聚體的其它N 1〇終端）。再者’若該Fc同型二聚體僅具有一個融合的ANP時 (例如’單體）時，4至6個胺基酸長的最小連結子將較佳。若二個ANP胜肽鍵結至Fc同型二聚體(例如，二聚物）及僅有一個ANP鍵結至NPRA受體（即，1 : 1的Fc二聚物：NPRA比率）時’則每個連結子的最小連結子長度為9個胺基酸較佳。對 15二ANP黏合至NPRA(例如，以非固定交替的方式黏合至二個毗連的受體或至1個NPRA受體）來說，含有最小長度12個胺基酸之連結子將較佳。已驚人地發現，增加連結子長度能夠讓融合蛋白質接近該融合利尿鈉胜肽的效力。例如，已發現較長的連結子長度增加利尿鈉胜肽的效力（如藉由 20 試管内引發cGMP的能力來測量），特別是具有連結子長度 20個胺基酸的那些融合蛋白質。已意外地發現，增加連結子長度能夠讓融合蛋白質接近利尿鈉胜肽之效力。具有連結子長度比預測長的那些融合蛋白質顯示出非常改良的效力，特別是具有連結子長度 32 200906849 例如2〇個胺基酸(參見例如，實施例3及6)的那些融合蛋白質。事實上，具有連結子長度比由模型預測長的融合蛋白質之效力接近天然ANP的效力。在本發㈣具體實例中，連結子長度在16至5G個胺基酸間改良該融合蛋白質的效 5力，較佳在16至4G個胺基酸間及最佳在16至3〇個胺基酸間。額外的是，已預計增加連結子長度將增加該融合蛋白質對由贈蛋白分解性降解的敏感度。比較上，實驗意外地闊明較長的連結子長度不受卿影響(參見例如，實 5)。 1〇彳㈣胃知的合成、半合成或重財法製得使用在本

發明中包含(GGS)j覆單位（例如，其中乂為整數從❹至⑹ 的連結子序列(參見例如，伊弗斯(E而）TH等人(2〇〇6)生物化學，45 : 13183-13192)。關於所使用的連結子之實際胺基酸序列，甘胺酸及絲胺酸典型較佳，當在連結子中存在 15甘胺酸時提供彈性及絲胺酸提供溶解度。較佳的連結子序列由這些胺基酸的一系列重覆單組成，例如(GGS)X-GG (例如’其中X為從0至16的整數），諸如GGSGGSGGSGG (SEQ ID NO : 3)或GGSGGSGGSGGSGGSGGSGG (SEQ ID NO : 7)。如上述提及，Fc區段與利尿鈉胜肽的結合方向可變化。例如，該胜肽之羧基終端可藉由正常的胜肽鍵連結至 Fc區段之胺基終端（參見表2，亦可指為方向#1)。再者，該胜肽的胺基終端可連結至該Fc區段之胺基終端（參見表2，亦可指為方向#2)。在後者實例中，該化學遺留琥珀酸鹽部 33 200906849 分來取代該融合物的一個胺基酸。就此本身而論，熟知技藝之人士將了解當在二個胺基終端間不發生正常胜肽鍵結時，後者實例的融合蛋白質無法重組製得。所收集之資料指出方向似乎不影響所提供的融合蛋白質之效力（參見例 5 如，實施例2)。本發明之ANP-Fc融合構成物可包含一或多個ANP、一或多個連結子及一或多個Fc。已由本發明預計下列ANP-Fc 融合構成物。包含ANPXY(構成物l)(SEQIDNO: 15)的典型融合構成 10 物(構成物2)由下列表示： ANPxy-L4-Fc1ab 該構成物包含ANPxy-L4-Fc1ab，其中ANPXY為SEQ ID NO : 15，L4為 SEQ ID NO : 3及FclAB為 SEQ ID NO : 14。 ANPxy-L4-Fc1ab由 SEQIDNO: 8表示。當 ANPxy-L4-Fc1ab 15 構成物經重組製得時，可製造出同型二聚體，例如，該 ANPXY-L4-FclAB可經由二硫醚連結來連結至第二 ANPxy-L4-Fc1ab構成物。典型的融合構成物(構成物3)由下列表示： ANP xy~L6-Fc 1 ab

20 該構成物包含ANPXY-L6-FclAB，其中ANPXY為SEQ ID NO : 15，L6為 SEQ ID NO : 7及FclAB為 SEQ ID NO : 14。 ANPXY-L6-FclAB 由 SEQ ID NO : 9 表示。當該 ANPxy-L6-Fc1ab構成物經重組製得時，可製造出一同型二聚體，例如，ANPXY-L6-FclAB可經由二硫醚連結來連結至 34 200906849 第二ANPxy-L6-Fc1a4；|：成物。典型的融合構成物(構成物4)由下列表示： ANPxy-L4-Fc2ab 該構成物包含ANPxy-L4-Fc2ab，其中ANPXY為SEQ ID 5 NO : 15，L4為 SEQ ID NO : 3及Fc2aASEQ ID NO : 17。 ANPxy-L4-Fc2ab 由 SEQ ID NO : 1〇表示。當該 ANPxy-L4-Fc2ab構成物經重組製得時，可製造出一同型二聚體，例如，ANPxy-L4-Fc2ab可經由二硫醚連結來連結至第二ANPxy-L4-Fc2ab構成物。 10 典型的融合構成物(構成物5)由下列表示： ANPxy-L6-Fc2ab 該構成物包含ANPxy-L6-Fc2ab，其中ANPXY為SEQ ID NO : 15，L6為 SEQ ID NO : 7及Fc2AB*SEQ ID NO : 17。 ANPxy-L6-Fc2ab 由 SEQ ID NO : 11 表示。當該 15 ANPxy-L6-Fc2ab構成物經重組製得時，可製造出一同型二聚體，例如，ANPxy-L6-Fc2ab可經由二硫醚連結來連結至第二 ANPxy-L6-Fc2ab 構成物。典型的融合構成物(構成物6)由下列表示： ΑΝΡγχ-Ll-Fcl^

I

Fc!ab

20 該構成物包含ANPyx-L1-Fc1ab，其中ANPYX為SEQ ID NO : 15方向逆轉從其C’至Ν’終端，L1為琥珀酸鹽-Gly及 FclAB為SEQ ID NO : 14。ANPYX-Ll-FclAB可經由二硫醚連結來連結至第二Fc 1 AB。 35 200906849 典型的融合構成物(構成物7)由下列表示： ANP^-Ll-Fcl^ ANPYX-L1 -Fc 1 ^ 該構成物包含ANPyx-L1-Fc1ab，其中ΑΝΡγχ為SEQ Π) NO : 15方向逆轉從其C’至Ν’終端，L1為琥珀酸鹽-Gly及 5 FclAB為SEQ ID NO : 14。ANPYX-Ll-FclAB可經由二硫醚連結來連結至苐二ΑΝΡγχ-L 1 -Fc 1 ab構成物。典型的融合構成物(構成物8)由下列表示： ANPjjy-LZ-Fel ^

I

Fc1ab 該構成物包含ANPxy-L2-Fc1ab，其中ANPXY為SEQ ID 10 NO : 15 ’ L2 為 GlyGly 及 FclAB 為 SEQ ID NO : 14。 ANPxy-L2-Fc1ab 由 SEQ ID NO : 13表示。ANPxy-L2-Fc1ab 可經由二硫醚連結來連結至第二Fc1ab。典型的融合構成物(構成物9)由下列表示： ANP ^y-L2_Fc1

I ANP^^-Fcl^

15 該構成物包含ANPXY-L2-FclAB，其中ANPXY為SEQ ID NO : 15，L2 為 GlyGly 及 FclAB 為 SEQ ID NO : 14。 ANPXY-L2-FclAB可經由二硫醚連結來連結至第二 ANPXY-L2-FclAB構成物。典型的融合構成物(構成物10)由下列表示：

AB AB ANIV-L4-FC1 | 20

Fcl 36 200906849 該構成物包含ANPXY-L4-FclAB，其中ANPXY為SEQ ID NO : 15，L4為SEQ ID NO : 3及FclAB為SEQ ID NO : 14。 ANPxy-L4-Fc1ab 由 SEQ ID NO : 13 表示。ANPxy-L4-Fc1ab 可經由二硫醚連結來連結至第二Fc1ab。 5 典型的融合構成物(構成物11)由下列表示： 1 ANP^-Fcl^ 該構成物包含ANPXY-L4-FclAB，其中ANPXY為SEQ ID NO : 15，L4為SEQ ID NO : 3及FclAB為SEQ ID NO : 14。 ANPXY-L4-FclAB可經由二硫醚連結來連結至第二 10 ANPxy-L4-Fc1ab構成物。典型的融合構成物(構成物12)由下列表示：

1-fc 1AB

FoU 該構成物包含ANPYX-L3-Ll-FclAB，其中ANPYX為SEQ ID NO: 15方向逆轉從其C’至Ν’終端，L3為SEQ ID NO:2， 15 LI 為琥珀酸鹽-Gly 及 FclAB 為 SEQ ID NO : 14。 ANPYX-L3-Ll-FclAB可經由二硫醚連結來連結至第二 FclAB 。典型的融合構成物(構成物13)由下列表示： ANPy^-L3-L1-Fc 1 沾 ANPyx-L3-L1-Fc1ab

20 該構成物包含ANPyx-L3-L1-Fc1ab ’ 其中 ΑΝΡγχ為 SEQ ID NO: 15方向逆轉從其C’至Ν’終端，L3為SEQ ID NO: 2， 37 200906849 L1 為琥珀酸鹽-Gly 及 FclAB 為 SEQ ID NO : 14。 ANPYX-L3-Ll-FclAB可經由二硫醚連結連結至第二 ANPYX-L3-Ll-FclAB 構成物。典型的融合構成物(構成物14)由下列表示： ANP ^y*L53"Fc1

I

5 ANPXY-L5a-Fc1AB 該構成物包含ANPXY-L5a-FclAB ’其中八仰以為吕丑口 ID NO : 15，L5a為SEQ ID NO : 5及FclAB為SEQ ID NO : 14。 ANPXY-L5a-FclAB可經由二硫醚連結來連結至第二 ANPXY-L5a-FclAB構成物。 10 典型的融合構成物(構成物15)由下列表示：

ANPxY-L5a-Fc1AB

I

Fc.1ab 該構成物包含ANPxY-L5a-FclAB ’其中ΑΝΡχγ為SEQ ID NO : 15，L5a為 SEQ ID NO : 5及FclAB為 SEQ ID NO : 14。 ANPXY-L5 a-Fc 1AB可經由二硫醚連結來連結至第二Fc 1AB。 15 C.融合蛋白質之合成除非於本文有指出，否則本發明之融合蛋白質可藉由熟知技藝之人士熟知的任何數目之蛋白質化學或分子生物學技術製得。（參見例如，刀森(Dawson)等人，Ann. Rev. Biochem.，69 : 923-960 ’ 2000)。可能的合成方案描述在於 20 本文所提供之實施例中及包括合成及半合成化學合成和重組方法。融合蛋白質可全部或部分使用化學方法及使用標準或 38 200906849 非標準胺基酸或化學胺基酸類似物(如適當的話）來製造。該技術包括固相化學（美瑞菲爾德(Merrifield)，J. Am. Chem. Soc. ’ 85 : 2149 ’ 1964 ;豪福騰(Houghten)，Proc_ Natl. Acal. Sci.美國82 : 5132，1985)及用於此多胜肽的自動化合成之 5 設備可商業購得(例如，加州福斯特市(Foster City)的應用生物系統(Applied Biosystems))。可使用習知的方法（諸如，高性能液相層析法）來純化合成胜肽。該合成的融合多胜肽之組成物可使用由熟知技藝之人士熟知的技術藉由胺基酸分析或定序來証實。亦可使用在氧化條件下進一步處理合成 10 蛋白質以獲得適合的天然構成物。參見例如，凱利(Kelley) R.F.及溫克勒（Winkler) M.E.，基因工程原理及方法，誰特羅（Setlow) J.K.，充氣間出版社編輯，Ν·Υ_，第12冊，pp 1-19，1990 ;史丢華（Stewart) J.M_及楊(Young) J.D·，固相胜肽合成皮爾斯化學公司（Solid Phase Peptide Synthesis 15 Pierce Chemical Co.)，洛克福特(Rockford)，111.，1984)。揭示於本文的融合蛋白質亦可藉由包括基因合成、選殖及表現方法的重組技術製得。這些技術熟知及例如在下列中解釋：分子生物學的現在協議（Current Protocols in Molecular Biology)，第 I、II及III冊，1997 (F.M.歐蘇貝爾 20 (Ausubel)編輯）；山姆布魯克（Sambrook)等人，1989，分子選殖：實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港（Spring Harbor)， N.Y. ; DNA選殖：實行方法，第I及II冊，1985 (D.N.葛羅弗 (Glover)編輯）；分子選殖的實行指南；酵素學方法系列（學 39 200906849 術出版杜公司（Academic Press, lnc.));用於哺乳動物細胞的基因轉染載體，1987 (J_H.米勒及M.P.卡羅斯(Calos)編輯，冷泉港實驗室）；及酵素學方法，第154及155冊（各別由吳 (Wu)與葛羅斯門（Grossman)及吳編輯）。 5 簡單來說，本發明之融合蛋白質可藉由習知的選殖或化學合成方法來分離或合成編碼於本文描述的任何胺基酸序列之核酸序列來重組製得。例如，編碼出不同融合蛋白質序列之DNA片段可根據習知的技術或合成，藉由習知的技術（包括自動DNA合成器）同框連接在一起。再者，可使 1〇用在二個連串的基因片段間引起互補凸出物之錨定引子來進行基因片段的PCR放大，其隨後可退火及再放大以產生嵌合的基因序列。該重組的核酸可進一步包含其它核苷酸 K諸如，編碼親和標記物的序列）以使蛋白質純化方法容易。編碼本發明之融合蛋白質的核酸序列可連接至能在合適的相主中表現出該核酸序列之合適表現載體中，接著以已赵連接該核酸序列的表現載體轉化該宿主，在合適於核西九序列表現之條件下培養該宿主’藉此由該宿主表現出由 ^ 所選擇的核酸序列編碼之蛋白質及純化所產生的蛋白質。在此方法中，該連接步驟可進一步考慮將該核酸連接至合適的表現载體中’如此該核酸操作地連結至合適的分泌信號 ' 藉此該胺基酸序列由該宿主分泌出。合適於與本發明吏用的分泌信號包括（但不限於）老鼠IgGK輕鏈信號序列（侯 (H〇)等人，PNAS (2006) 103(25) : 9637-9642)。 40 200906849 如上所述’編碼描述於本文的融合蛋白質之核酸序列可插入能使用來轉化宿主細胞的適當質體或表現載體。通常來說’使用包含複製及控制序列（其衍生自與宿主細胞相容之物種）的質體載體來與那些宿主銜接。該載體通常攜帶 5 一複製位置和編碼能在經轉化的細胞中提供顯型選擇的蛋白質之序列。例如’大腸桿菌可使用pBR322(—種衍生自大腸桿菌物種的質體）來轉化（門戴爾（Mandel) M.等人，J. Mol.

Biol. 53 : 154 ’ 1970)。質體pBR322包括抗氨比西林及四環素基因，因此提供容易選擇的方法。其它載體包括不同構 10形，諸如不同啟動子（其在表現上經常重要）。使用於哺乳動物表現的載體經常包括導致高重組蛋白質表現之構成性 CMV啟動子。這些載體亦包括使用來產生穩定表現的細胞株之選擇序列基因。該宿主細胞可為原核或真核生物。對選殖及表現出 15 DNA序列以產生母多胜肽、經多胜肽取代的片段、經殘基取代的多胜肽及多胜肽變體來說，原核生物較佳。此由熟知技藝之人士熟知的原核生物細胞包括（但不限於）大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（B subtillus)及綠膿桿菌細胞株。除了原核生物外，可使用真核有機體(諸如，酵母菌培養物）或衍生 2〇自多細胞有機體之細胞。亦可使用脊椎動物的細胞作為有用的宿主細胞株。有用的細胞及細胞株已由熟知技藝之人士熟知及包括（但不限於）HEK293細胞、HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株、W138、293、BHK、COS-7及MDCK 細胞株。 200906849 本發明亦關於編碼本發明的利尿鈉融合蛋白質之經分離或純化的多核苷酸。如上述討論，可使用能編碼融合蛋白質、其片段或其功能同等物之本發明的多核苷酸來產生可在適當的宿主細胞中指揮該融合蛋白質、其片段或其功 5此同等物之表現的重組核酸分子。由此多核苷酸所編碼之融合多胜肽產物可藉由操控該編碼序列之分子來改變。由於基因碼固有的簡并性，在實行本發明用來表現出該融合多胜肽時，可使用能編碼實質上相同或功能相等的胺基酸序列之其它DNA序列。此等DNa序列包括能在描述 10於本文之低、適當或高嚴峻條件下雜交至揭示於本文的編碼序列或其補體那些。可根據本發明使用之經改變的核苷酸序列包括能產生一可編碼相同或功能相等的基因產物之序列的不同核苷酸殘基之缺失物、加入物或取代物。該基因產物其自身可包 15括產生悄然變化之胺基酸殘基的缺失物、加入物或取代物。本發明之核苷酸序列可經設計以改變該融合蛋白質編碼序列而用於多種末端用途，此設計包括（但不限於)修改基因產物之加工及表現的改變。例如，可使用在技藝中熟知的技術(例如’插入或刪除限制位置）引進突變，以改變糖化 2〇型式、磷酸化作用；產生及/或破壞轉譯、起始及/或終止序列；或在編碼區域中產生變化；促進進一步試管内改質等等。熟知人士將了解許多在所提供的核酸構成物中產生改變之方法。此熟知的方法包括例如定點突變、使用變性寡核苷酸的PCR放大、將包含該核酸的細胞曝露至化學突變 42 200906849 試劑或輻射、想要的寡核苷酸之化學合成（例如，與連接及 /或選殖以產生大的核酸相關連)及其它熟知的技術。可藉由培養合適的宿主/載體系統以表現出本發明之 DNA的重組轉譯產物，然後從培養媒質或細胞萃取物純化 5 來製備經純化的融合蛋白質。例如’首先可使用商業可購得的蛋白質濃縮過濾器（諸如例如，阿米空(Amicon)或微孔佩立空（Millipore Pellicon)超微濾單元）濃縮來自能將重組多胜肽分泌至培養媒質中之系統的上清液。在濃縮步驟後，可將此濃縮物施加至合適的純化基質。亦可使用親和 10層析法或逆相高性能液相層析法(RP-HPLC)來純化本發明之融合蛋白質。可根據習知的方法製造本發明之經純化的融合蛋白質之單株或多株抗體。例如，於本文描述出可製造出能特別識別一或多種差別地表現出基因表位抗原之抗體的方法。 15此等抗體可包括（但不限於)上述之任何多株抗體、單株抗體 (mAbs)、人化或後合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab，)2 片段、由Fab表現性資料庫產生的片段、抗遺傳(抗Id)抗體及表位抗原黏結片段。為了製造於本文讨論的融合蛋白質之抗體，可藉由注 20射該多胜肽或其部分來免疫多種宿主動物。此等宿主動物可包括(但不限於）兔子、老鼠及大白鼠。玎使用多種佐藥來增加免疫反應，端視宿主物種而定，其中該佐藥包括（但不限於)佛恩德氏(Freimd，s)(完全及不完全）、礦物凝膠(諸如，氬氡化鋁）、表面活性物質（諸如，溶血卵磷脂、普盧蘭尼充 43 200906849 (Pluromc)多元醇、多價陰離子、胜肽、油乳液、鍮孔帽貝血藍蛋白、二硝基酚)及潛在有用的人類佐藥（諸如BCG(卡 "田）及短棒狀桿痛（Corynebacterium parvum))。多株抗體為衍生自已經抗原（諸如，標的基因產物）或其 5抗原功能衍生物免疫的動物血清之抗體分子的異質性群體。為了製造多株抗體，可藉由注射多胜肽或其部分且補充以佐藥（亦如上述描述）來免疫宿主動物（諸如’上述描述的那些）。單株抗體（其為特別抗原的抗體之同質性群體）可藉由 10在培養時由連續的細胞株提供抗體分子之製造的任何技術獲得。這些包括（但不限於）科勒（Kohler)及米爾斯坦 (Milstein)的雜腫瘤技術（1975，自然，256 : 495-497 ;及美國專利案號4,376,110);人類8細胞雜腫瘤技術（考斯伯 (Kosbor)等人，1983，今日免疫學（ImmunologyToday)，4 : 15 72 ;扣雷（Cole)等人，1983，Proc_ Natl. Acad. Sci. USA 80 : 2026-2030);及EBV-雜腫瘤技術(扣雷等人，1985，單株抗體及癌治療，阿連R.里斯公司（Alan R.Liss, Inc·)，第77-96 頁）。此抗體可為包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD之任何免疫球蛋白種類及其任何副型。產生本發明之mAb的雜腫瘤 2〇可試管内或活體内培養。其能活體内製造出高滴定濃度的 mAbs，此使得其為目前較佳的製造方法。此外，可使用已發展用來製造“嵌合抗體”的技術(莫里森（Morrison)等人，1984，Proc. Natl. Acad. Sci.，81 : 6851-6855 ;紐柏格(Neuberger)等人，1984，自然，312 : 44 200906849 604-608 ;武田（Takeda)等人，1985，自然，314 : 452-454)，其藉由將來自適當的抗原特異性之老鼠抗體分子的基因與來自適當生物活性的人類抗體分子之基因粘接在一起。嵌合抗體為一種不同部分衍生自不同動物物種的分子，諸如 5 具有衍生自鼠科mAb及人類免疫球蛋白恆定區的可變或高變異區域那些。再者，可採用已描述用來製造單鏈抗體的技術（美國專利案號4,946,778 ;柏德(Bird)，1988，科學，242 : 423-426 ; 哈斯通（Huston)等人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 10 5879-5883;及沃德(Ward)等人，1989,自然，334: 544-546)，以製造出不同表現的基因-單鏈抗體。經由胺基酸跨橋連結該Fv區域的重及輕鏈片段來產生單鏈多胜肽而形成單鏈抗體。最佳的是’可採用對“人化的抗體”之製造有用的技術 15來製造揭示於本文之多胜肽、片段、衍生物及功能同等物的抗體。此技術揭示在美國專利案號5,932,448; 5,693,762 ; 5,693,761 ； 5,585,089 ； 5,530,101 ; 5,910,771 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ； 5,789,650 ； 5,545,580 ； 5,661,016 ；及5,770,429中，此些揭示其全文全部以參考方式併入本文。 20 可藉由已知技術來產生能識別特定的表位抗原之抗體片段。例如，此片段包括（但不限於）·· F(ab，)2片段（其可藉由抗體分子之胃液素消化來製造)及Fab片段（其可藉由還原 F(ab )2片段的一硫喊跨橋產生）。再者，可建構Fab表現性資料庫（休斯(Huse)等人，1989，科學，246 : 1275-1281)，以 45 200906849 允許快速及容易地鑑別出具有想㈣特異性之單株Fab片段。 D.藥學组成物 5 10 15 20 本發明之利尿鈉融合蛋白質可以一藥學組成物給藥而使用在治療或改善NPRA受體之活化授予患者治療利益的病理症狀之方法中，其中該病理症狀包括（但不限於声利尿、利尿減血管擴紐料常相_疾病及/或想要引發利尿鈉、利尿、血管擴H調整腎激素血管緊縮素 (angi〇tensiS)im__統來治療或改善者。此等病理症狀包括諸如上述詳細描述的心血管系統失調。這些症狀包括特徵為細胞外流體過量的那些，包括(但不限於)慢性心臟衰竭(CHF)及肺水腫。在_佳的具體實射，本發明包括治療或改善^血管线的病理症狀之方法，其巾該病理症狀包括（但不限於)慢性心臟衰竭（非缺金）、⑷後心臟衰竭 (缺ACHF)、急刪、再灌注損傷、左心室機能障礙(lvd)、心臟纖維變性、舒張性錢衰蝎及肥厚型心肌病。此外，可藉由本發明之方法治療或改善的高轰壓性病症包括(伸不限於）高血壓(例如肺動脈高轉、收義高血壓、頌固型高血壓）及其它心血管相關的疾病（諸如糖尿病性腎病）。於本文亦考慮到本發明之融合蛋白f及藥學喊㈣冠狀動脈繞道程序的患者提供治療利兴。夂用於根據本發明之用途的藥式，以-舒種纽學可接受於不同給藥方法，例如，藉來配製而用八或吹入(透過口或鼻）或局 46 200906849 服頰、非經腸式或直腸給藥。例如，非經腸式可包括皮膚内、肌肉内、腹膜内、靜脈内、皮下、鼻内及硬膜外給藥。該化合物可藉由任何方便的途徑給藥，例如藉 5由輸液或快迷注射、藉崎過上皮或《皮㈣層吸收如口黏膜、直腸及腸賴等等），且可與其它生物活性藥劑才、=藥D亥給藥可全身或局部性。在較佳的具體實例中， =要藉由任何合適的途徑將本發明之藥學組成物引進受影二:、織中。亦可使用肺部給藥，例如，使用吸入器或嘴霧器及含有霧化劑之調配物。 10 η錢學紙成物可進-步包含媒劑或載劑（包括醫藥上可接立受的載劑）。在特定的具體實例中，名稱“醫藥上可接 y意謂著由聯邦或州政府管理機構認可或編列在美國藥典或其它一般認識使用於動物及更特別是人類的藥典中。名稱“載劑，，指為與藥學組成物給藥的稀釋劑、佐藥、賦形 15劑或媒劑。此等醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油類，包括石油、動物、蔬菜或合成來源那些，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。當該藥學組成物靜脈内給藥時，水為較佳的載劑。亦可使用鹽液溶液及水性右旋糖及甘油溶液作為液體載劑，特別是可注射溶液。合適 2〇的醫藥賦形劑包括歸、葡萄糖、乳糖n明膠、麥芽、米、麵粉、白垄、石夕凝膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、經乾燥的脫脂牛奶、甘油、丙烯、-醇、水、乙醇及其類似物。若必要時，該組成物亦可包含較少量的潤溼或乳化劑或pH緩衝劑。這些組成物可採用溶 47 200906849 液、懸浮液、乳液、錠劑、藥片、膠囊、粉末、持續釋放調配物及其類似形式。該組成物可與傳統的結合劑及載劑 (諸如，三酸甘油脂）配製為栓劑。口服調配物可包括標準載劑，諸如醫藥等級的甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖 5 精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。合適的醫藥載劑之實施例描述在E.W.馬丁(Martin)之“雷寧頓氏(Remington’s)醫藥科學” 中（其全文以參考方式併入本文）。該調配物應該適合於給藥模式。對口服給藥來說，該藥學組成物可採用例如錠劑或膠 10 囊形式，其藉由習知方法與醫藥上可接受的賦形劑來製備，其中該賦形劑有諸如黏結劑（例如，預糊化的玉蜀黍澱粉、聚乙烯吼咯啶酮或羥丙基甲基纖維素）；摻合料(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣）；潤滑劑（例如，硬脂酸鎂、滑石或二氧化矽）；崩解劑（例如，馬鈴薯澱粉或澱粉羥基乙 15 酸鈉）；或潤溼劑（例如，硫酸月桂酯鈉）。該錠劑可藉由在技藝中熟知的方法來塗佈。口服給藥用之液體製劑可採用例如溶液、糖漿或懸浮液形式，或它們可顯現如為乾燥產物而在使用前以水或其它合適的媒劑構成。此液體製劑可藉由習知的方法與醫藥上可接受的添加劑來製備，其中該 20 添加劑有諸如懸浮劑（例如，山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化的可食用脂肪）；乳化劑（例如，卵峨脂或刺槐）；非水性媒劑（例如，扁桃仁油、油狀醋、乙醇或精顧的蔬菜油）；及防腐劑（例如，對-羥基苯甲酸曱基或丙基酯或山梨酸）。如適當的話，該等製劑亦可包括緩衝鹽、香料、色素及變 48 200906849 甜劑。若適當的話，可合適地配製口服給藥用之製劑以提供該活性化合物的控制釋放。若適當的話，對頰給藥來說，該組成物可採用以習知 5 方式配製之錠劑或菱錠劑形式。在另一個具體實例中，本發明之融合蛋白質用於吸入或吹入（透過口或鼻）給藥。就此本身而論，該用於根據本發明之用途的化合物可方便地以氣霧噴灑製劑形式從加壓包裹或喷霧器輸送，隨著使用合適的推進劑，例如，二 10 氯二氟甲烷、三氣氟甲烷、二氣四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。在加壓的氣霧劑之實例中，該劑量單位可藉由提供一閥來決定以便輸送一經計量供應的量。可配製使用於吸入器或吹入器的例如明膠膠囊及藥筒，其包含該化合物與合適的粉末基料（諸如，乳糖或澱粉）之粉末混合 15 物。在特別佳的具體實例中，可將本發明之藥學組成物配製成用於注射（例如，藉由快速注射或連續輸液）之非經腸式給藥。此外，如於本文中考慮到，本發明之融合蛋白質及藥學組成物可合適於需要其（例如，C H F之長時間治療)之患 20 者自己注射。注射用調配物可以單位劑形（例如，在安瓿中或在多劑量容器中）與所加入的防腐劑呈現。該組成物可採用諸如懸浮液、溶液或在油狀或水性媒劑中的乳液形式，及可包括調配劑，諸如懸浮、安定及/或分散劑。再者，該活性成分可呈能在使用前以合適的媒劑（例 49 200906849 經冷凍乾燥重新構成然如，無菌無發熱質水)構成之粉末形式。例如，的蛋白質組成物可經吸入、或在合適的媒劑中後注射。知的栓劑基料（諸如諸如，栓劑或保留灌該化合物亦可配製成例如包含習 5 可可脂或其它甘油酯）之直腸組成物，腸0 除了先前描述之調配物（其可具有類似於慢釋放調配物的藥物動力學）外，該等化合物亦可配製為一實際的積存製劑。此長作用調配物可藉由植入（例如，皮下或肌肉内） 10或藉由肌肉内注射給藥。因此，例如，該等化合物可以合適的聚合或疏水物質（例如，如為在可接受的油中之乳液) 或離子交換樹脂來配製’或如為略微可溶的衍生物（例如，如為略微可溶的鹽）。若必要時，該組成物可存在於一包裹或分散器裝置 15中，其可包含一或多個包含該活性成分之單位劑形。該包裹可例如包含金屬或塑膠箔，諸如泡殻包裝。該包裹或分散器裝置可伴隨著給藥用法說明。合適於使用在本發明中的藥學組成物包括一包含有效量的活性成分以達成意欲的目的之組成物。有效劑量之決 20定適當地在熟習該項技術者的能力内。例如，對任何化合物來說，可初始地在細胞培養分析物（例如，瘤細胞）中或在動物模型（通常為老鼠、兔、狗或豬）中估計治療有效劑量。亦可使用動物模型來決定適當的濃度範圍及給藥途往。可在動物模型中調配出一劑量以達成一包含IC5〇(即’達成症 50 200906849 狀的最大抑制一半之測試化合物濃度）的循環血漿濃度範圍。此訊息然後可使用來決定在人類中有用的劑量及給藥途徑。治療有效劑罝或有效量，，指為無毒但是足以提供想要 5的治療效應之活性成分的量。可藉由標準醫藥程序在細胞試驗或實驗動物中測量治療功效及毒性，例如，ED50(群體的50°/。治療有效之劑量）及LD5〇(群體的50%致死之劑量）。在中毒與治療效應間之劑量比率為治療指標，及其可表現為LD50/ED50之比率。具有大的治療率之藥學組成物較 10佳。將從細胞培養試驗及動物研究所獲得的資料使用來配製用於人類用途之劑量範圍。包含在此組成物中的劑量在包括具有些微或無毒性的ED50之循環濃度的範圍内較佳。該劑量可依所使用的劑形、患者之敏感度及給藥途徑在此範圍内變化。 15 精確劑量將由從事者按照與需要治療的患者相關之因素决疋。調整劑量及給藥以提供足夠位準的該活性部分或維持想要的效應。可考慮到的因素包括疾病狀態之嚴重性、患者的一般健康狀況、患者的年齡、體重及性別、飲 ^食、給藥時間及頻率、藥物組合、對治療的反應靈敏度及耐雙性/反應。長作用藥學組成物可依特别調配物的半生期及廓清速率而每3至4天、每週或每二週給藥一次。正常劑量的量可依給藥途徑從〇.!變化至1〇〇，咖微克’至最高總劑量約W。至於特別劑量及傳遞方法的指導則提供在文獻中且通常可由從事技藝者獲得。熟習該項技 51 200906849 術者將使用除了用於蛋白質或其抑制劑外之核苷酸用的不同調配物。類似地’多核苦酸或多胜狀之傳遞將對特別的細胞、症狀、場所等等特定。合適於蛋白質之口服給藥的醫藥調配物描述例如在美國專利5,〇〇8，114 ; 5,505,962 ; 5,641,515 ； 5,681,811 ； 5,700,486 ； 5,766,633 ； 5,792,451 ； 5,853,748 ; 5,972,387 ; 5,976,569 ;及6,051，561 中。本發明進一步提供一種用於上述任何方法的成套配方。此成套配方典型包含二或更多種進行於本文所描述的方法所需要之組分。該組分可為化合物、試劑、容器及/或 10 設備。例如’在成套配方内的一個容器可包括包含本發明之融合蛋白質的藥學組成物。一或多個額外的容器可裝進元素（諸如’試劑或緩衝劑）或欲使用在給藥該藥學組成物之方法中的設備。於本文亦考慮到本發明之融合蛋白質及藥學組成物可 15早獨或與可使用來冶療任何於本文描述的病理症狀之其它化合物或物質組合著給藥。可與本發明之治療組合著使用的此化合物或調配物包括例如利尿劑、P阻斷劑及Ang 11受體阻斷劑。經考量描賴本文之本發明不限於賴述的特別方 20 法、協定及試#I，如這些可變化。亦要了解於本文所使用的術語僅用於描述出特別的具體實例之目的，而不意欲以任何方式限制本發明的範圍。 =㈣類似或等於於本文所描述的那些之任何方 / 、貫仃或測忒本發明，但現在將描述出較佳的方 52 200906849 豉置及物處。於本文描述的全部參考資料明媒地以參考方式併入本文。實施例在下列立即提供與於本文所描述的實施例相關之物質 5 及方法： ANP-Fc融合/NPRA交互作用的結構模型：連結，1 ANP鍅钴卜姑由以結構為基礎的模型，使用NPRA及&結晶結構來決定人]^)及1^ 融合物的連結子需求(RCSB PDB資料庫3£)結晶結構數值， 10各別為1T34 (含有ANP的共結構）及1HZH，H.M.伯門 (Berman) ’ J_威斯特布魯克(westbrook)，Z.芳（Feng)，G.吉利蘭德(Gilliland)，T.N·畢黑特(Bhat)，H.威西格(Weissig)， Ι·Ν_辛迪阿羅浮(Shindyalov) ’ P.E.鮑内（Bourne):蛋白質資料銀行。核酸研究，28，第235-242頁（2000))。這些結構位 15於下列之空間中：（a)ANP的C終端與Fc的N終端彼此最接近’在其之間更含有足夠空間以減少空間及靜電排斥；及 (b)至二聚體的NPRA之二個F425殘基(在人類全長NPRA序列中的F457)末端，以減少與導致朝向NPRA的穿透膜區域之殘基的可能交互作用（其預測以V474開始）。一旦二種結 20 構的位置完成，測量在ANP的C終端與Fc的N終端間之距離；將此值除以3.5及去除尾數上提至最接近的整數，以提供經預測為“Fc-連結子-hANP28”或“hANP28-連結子_Fc” (即，各別為方向#1或方向#2，前述第19頁）融合物（其為 NPRA的可實行配體）所需之最小胺基酸(aa)數（實施例：距 53 200906849 離=12人。最小連結子長度=12/3_5=3_4=>4&&連結子）。值3.5 代表在β-薄片中的平均胺基酸跨距(從在一個胺基酸中的氮原子至在毗連的胺基酸中的氮原子之距離）。二聚物Fc融合(2 ΑΝΡ遠結，1 ΑΝΡ鍵結）：i尊循所概述 5用於單體Fc融合物的程序，其中加入在其如於1T34，RCSB PDB資料庫3D結構中所定義之黏結構成物中，從在Fc上的第二N終端朝向一個ANP-NPRA三聚體錯合物及一個ANP 胜肽發展第二連結子的要求(H.M.伯門，J.威斯特布魯克， Z.芳，G.吉利蘭德’ T.N.畢黑特，H_威西格，I.N.辛迪阿羅 10浮，Ρ·Ε_鲍内：蛋白質資料銀行。核酸研究，28，第235-242 頁(2000))。 ^聚物Fc融合物（2 ΑΝΡ連結，2 ΑΝΡ鍵鈷）：_循所概述用於單體Fc融合的程序，其中加入從在Fc上的第二N終端朝向二個ANP-NPRA三聚體錯合物發展第二連結子之要 15 求。

CysFc之選殖、表現及純化：載體pEE12,4得到隆曰集團（Lonza group)(貝索 (Basel) ’瑞士（Switzerland))的許可。使用標準PCR技術 (pSYNFc-001、pSYNFc-007)，從含有老氣⑹信號序列（在 2〇下列呈粗黑體）的人類白血球cDNA資料庫獲得來自lgGl之人類Fc序列。從pSYNFc-007(pSYNcysFc-002)獲得含有老鼠 lgK信號序列的CysFc序列。然後，經由中間選殖步驟 (pSYNcysFc-003)將CysFc序列選殖進入pEE12.4中，以產生 pSYNcysFc-004。CysFc-004具有下列胺基酸序列： 54 200906849

METDTLLLWVLLLWVPGSTGCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL 5 TKNQVSLTCVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK(SEQ ID NO : 18)。根據製造者的用法說明，藉由電穿孔法，以40微克之 Pstl線性化的pSYNcysFc-004來轉染隆日CHOK 1 Sv懸浮細 10 胞（lxl〇7細胞）。以2500細胞/井的播種密度將細胞板置在 40x96井板中。二十四小時後，初始以25pMMSZ選擇及在 37°C/5%C〇2下培養細胞三週。在採用於無血清懸浮液培養前，將經轉染的細胞從96井板擴展開至24井板至T25及T75 燒瓶。使用蛋白質A免疫沉殿(immunoprecipitation)程序接 15著非還原性SDS-PAGE分析來監視CysFc-004 (CysFc)在生長曲線期間於無血清懸浮液中的表現程度。根據這些生長曲線，選擇用於製造的細胞株9F4。從20升的9F4細胞（其以5xl〇5細胞/毫升播種在3升費爾恩巴赫（Fernbach)燒瓶（1升細胞/燒瓶）中）來製造 20 Cys-Fc-004(CySFc)。在製造進行的最後時，藉由離心機移出細胞及藉由切向流動過濾來濃縮經處理的媒質4倍。 CysFc-004藉由蛋白質A色層分析法純化，以杜爾貝科 (Dulbeccos) PBS (DPBS)接著包含〇_9 M NaCl之DPBS來清洗管柱。以包含0.15M氣化鈉的〇.!皿檸檬酸鈉(ρΗ 3·4)沖提 55 200906849 該蛋白質。然後，將蛋白質逆過濾進入DPBS中及貯存在4 °C下直到使用。 C終端ANP硫酯之合成：在 Advanced ChemTech 3960 合成器上，在 Fmoc-5 Gly-NovaSyn® TGT (諾瓦生化(Novabiochem))上，藉由標準 Fmoc-固相胜肽合成法，使用HBTU作為柄合劑、Ν,Ν-二異丙基乙基胺(DIEA)作為鹼及Ν,Ν-二甲基曱醯胺(DMF)作為溶劑來合成ΑΝΡ胜肽(0.1毫莫耳）。在自動合成後，藉由以 0.218克（10當量）的二碳酸二三級丁酯（Boc20)及174微升(20 10 當量）在1〇毫升DMF中的DIEA手動處理該樹脂來保護N終端，及允許在室溫下混合過夜。真空過濾該反應及以DMF 與二氣甲烷(DCM)清洗該樹脂。藉由在含有1，1,1，3,3,3-六氟 -2-丙醛(HFIP)的DCM中，在50毫升3 : 7的HFIP : DCM中之溫和酸裂解二小時，從該樹脂裂解出經完全保護的胜肽。 15 將該樹脂過濾至已預先稱重的圓底燒瓶中及在真空中濃縮該過濾物過夜，產生含有自由態C終端之經保護的胜肽。為了產生硫酯，以在10毫升之DMF中1.5當量的甘胺酸苄基硫酯鹽酸鹽(Gly (SBn) HC1)、1.5當量的PyBOP(諾瓦生化)及4.5 當量的DIEA來處理此物質，並攪拌18小時。再次在真空中 20 濃縮該反應混合物18小時。藉由以25毫升之裂解混合劑 (23·75毫升的三氟醋酸(TFA)、0.625毫升的三異丙基矽烷 (TIS)、0.625毫升的乙二硫醇(EDT))處理該經保護的胜肽硫酯二小時45分鐘來去保護；在此之後，加入0.625毫升的溴三曱基矽烷(T M S B r)及讓其混合15分鐘。濃縮該反應混合物 56 200906849 及以冷的二乙基醚（Et2〇)沉澱該胜肽硫酯粗產物。離心胜肽，傾出上層液及以冷的Et20磨碎胜肽粗產物二次。然後，藉由逆相製備型HPLC (菲農門耐克斯丘比特(Phenomenex Jupiter) 5u C4 300 A管柱，250x21.20毫米）來純化該胜肽粗 5 產物；HPLC方法參數編列在下列。藉由LC/MS (應用生物系統(Applied Biosystems)，美若冷(Mariner))來分析餾分用以鑑定，及儲備包含>90%胜肽的餾分，迅速冷凍及冷凍乾燥產生該純的ANPC終端硫酯。 N終端ANP硫酯之合成： 10 在 Advanced ChemTech 396Ω 合成器上，在 Fmoc-

Tyr(tBu)-NovaSyn® TGT (諾瓦生化)上，藉由標準Fmoc-固相胜肽合成法’使用HBTU作為耦合劑、DIEA作為鹼及DMF 作為溶劑來合成ANP胜肽(0_1毫莫耳）。在自動合成後，藉由以0.100克的琥珀酸酐（10當量）及174微升（10當量)在10毫 15 升DMF中的DIEA，在室溫下手動處理該樹脂二小時，將該 N終端轉換成自由態羧酸。經由真空過濾移除反應成分，及各別以DMF與DCM清洗樹脂。為了產生硫酯，以在10毫升 DMF中0.109克(5當量）的Gly(SBn)-HC卜0.260克(5當量）之 PyBOP(諾瓦生化)及261微升（15當量）的DIEA處理此物質， 20 及在室溫下攪拌18小時。然後，經由真空過濾移除反應成分並以DMF及DCM清洗樹脂。藉由以25毫升的裂解混合劑 (23.75毫升TFA’ 0·625毫升T1S，0.625毫升EDT)處理二小時 45分鐘，從該樹脂裂解出經保護的胜肽硫酯及去保護，在此之後，加入0.625毫升的TMSBr及讓其混合15分鐘。過濾 57 200906849 該反應成分，保存過滤物。濃縮過濾物及以冷的二乙基醚 (Et20)沉澱胜肽硫酯粗產物。離心該胜肽’傾出上層液及以冷的Et2◦磨碎胜肽粗產物二次。然後，藉由逆相製備型 HPLC，如先前描述般純化該胜肽粗產物。藉由LC/MS(應 5用生物系統’美若冷)來分析餘分用以鑑定及儲備包含>90% 胜肽的顧分’迅速冷束及冷束乾燥以產生純的ANP C終端硫酯。結構/序列及質譜資料顯示在下列及在表1中。 ANPXy-L2-节基硫酵基團（胜狀a): H2N [SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRYGG]人 (SEQ ID NO： 19) 10 ANPxy-L4-节基硫醇基團（胜肽B): H2N [SLRRSSCFGGRmdpj, gaqsglgcnsfryggsggsggsggj ^ (SEQ ID NO: 20) ^

ANP L5a-苄基硫醇基團（胜肽c) : 15 h2n-[slrrsscfgGRiwid

Rigaqsglgcnsfrygsggsggsggsggsggi (SEQ ID NO: 21)

Xi 苄基硫酵基團-Gl>祕议私也 y獍珀酸鹽-ANPYX(胜肽D):〇r 人 Υα苄基硫醇基困-Gl

N-[SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY]-C02H (SEQ ID NO: 22) 。 y、崠珀酸鹽-L3-ANPYX(胜肽E):cr 人Vv [e§SG§GGSaSLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY]-C02H (SEQ ID NO： 23) 58 200906849 表1 :質譜資料胜肽 MW計算的（Da) MW親察到（Da) D 3345.84 3345.28 (M+l) A 3302.82 3302.29 (M+l) 3417.12 (M+TFA) B 3906.37 3905.31 (M+l) 4020.14 (M+TFA) E 3949.39 3950.14 (M+l) C 4251.68 4251.58 (M+l) 4365.54 (M+TFA) *如藉由LCMS從多電荷胜肽離子之單離子轉換方法來測量 ANP硫酯胜肽結合至Cys-Fc : 5 將ANP胜肽S-苄基硫酯結合至Cys-Fc的N終端。以2-巯基乙烧續酸納鹽(MESNA ’西格瑪-亞得富（Sigma-Aldrich)) 處理Cys-Fc(5毫克/毫升在PBS中，pH 7.4)，如此MESNA的最後濃度為20mM。將胜肽硫酯加入至反應混合物(2-6莫耳當量，依胜肽而定）及允許在室溫下溫和地混合18小時。根 10 據試驗階段規模反應來選擇實際的胜肽當量數，以便形成相等百分比的單體（每Fc含1 ANP胜肽）及二聚物（每fc含2 ANP胜肽)結合物。將該反應混合物粗產物在pbs中稀釋成1 毫克/毫升及對PBS (pH 7.4)徹底透析（在24小時内7次改變）。使用NuPage SDS-PAGE凝膠（因維錯俊(invitrogen))來 15 測量反應程度。在蛋白質純化前，將該結合物透析進入 50mM Tris-HCl緩衝液pH 7.2 中。 59 200906849 半合成ANP-Fc結合物之純化：以1 Μ醋酸鈉pH 5.0將經透析的ANp_Fc結合物反應混合物調整至50 mM醋酸鈉pH 5.0之最後濃度，然後將其過濾過0.8/0.2μΜ注射器過;慮器。將此經淨化的溶液負載到1 χ j 〇 5公分已填充經50 mM醋酸鈉ΡΗ 5.5平衡之弗瑞克托普瑞普 (Fractoprep) S〇3_650(M)陽離子交換樹脂(CEX)的管柱上。在負載後，以3倍管柱體積(CV)的平衡緩衝液清洗管柱。使用從0]\4-0_5]^的氯化鈉(在50111]^醋酸鈉中？115.5)以線性梯度沖提該蛋白質超過30 CV。使用NuPage SDS-PAGE凝膠 10 (因維錯俊）來分析餾分及一起儲備包含多數單體結合物的餾分，同時分別一起儲備包含多數二聚物結合物之餾分。首先，使用1M Tris pH 7.2的貯存溶液將匚丑乂總庫調整至〇·1Μ Tris pH 7.2，然後使用3M硫酸銨貯存溶液調整至11^1 硫酸銨。在以0.8/0·2μΜ注射器過濾器過濾後，將此經淨化 15的蛋白質溶液負載到1χ1〇公分填充以已與50mM Tris，1Μ 硫酸銨，ΡΗ 7·2預先平衡的EMD弗瑞克托傑爾（Fract〇gd) TA650(S)硫親和力樹脂之管柱上。在以3CV的平衡緩衝液洗滌管柱後，使用從1.0厘至0.33]^的硫酸銨，以遞減的線性梯度沖提該蛋白質超過2〇cv。此接著為梯度從〇 33河至〇 20 Μ硫酸銨的步驟。使用SDS_PAGE凝膠來鑑別包含高純化的結合物之波峰餾分，然後儲備在一起。對著丨χ杜爾貝科磷酸鹽緩衝鹽液（1升x2改變）（因維錯俊）透析最後的總庫。使用UV-280奈米分析纟測量蛋白質濃度。#需要時，使用阿米空超-15離心機濃度單元（Amicon Ultra-15 Centrifugal 200906849

Concentration Unit))(微孔）來濃縮最後的蛋白質。最後的蛋白質殺菌過濾過〇_2μΜ過濾器，然後將液份貯存在_8〇。〇下。半合成的ANP-Fc融合物之尺寸排除色層分析法：

使用分析用尺寸排除色層分析法（SEC_HPLC)來評估 5半合成的ANp-Fc融合蛋白質之聚集狀態。以pbs，pH 7.4+250mM NaCl來平衡TSKgel超級SW2000 4.6毫米（東曹生物科學(Tosoh Biosciences)) SEC-HPLC管柱。進行在曲線下之面積積分，以估計在每個波峰中的總蛋白質百分比。例如，使用PBS，卩117.4及25〇1111^[犯(1!1作為溶離劑， 10 以流速0.4毫升/分鐘跑過TSKgel超級SW2000 4_6mM(東曹生物科學）SEC-HPLC管柱。每次分析注射5微升1.0毫克/毫升的樣品。在每個注射組前及後，注射拜歐雷德(Biorad) MW標準物（CAT#151-1901)以保証管柱的完整性。在半合成ANP-Fc融合物中“自由態”胜肽的特徵： 15 使用逆相色層分析法來測量在純化的半合成ANP-Fc 融合預備物中之“自由態”未結合的ANP胜肽污染物位準。蛋白質C4逆相管柱（葛雷絲維戴克(Grace Vydac))注射以1 〇〇微克經純化的半合成Fc融合蛋白質。二種動相為A) 0.1% TFA在水中；及B)0.1%TFA在乙腈中。使用下列梯度曲線 2〇在總進行時間50分鐘内進行逆相色層分析法：0.5分鐘在 5%B下，5-35分鐘向上跳躍至95%B ’ 35-40分鐘保持在 95%B，40-42分鐘向下跳躍至5%B，42-50分鐘保持在5%B。另一次進行則攙入0.1微克的“自由態”ANP胜肽(〇.1微克峰等於1.3莫耳％)，以顯現出可能的污染物之預計位置及波峰 200906849 高度。此方法的“自由態” ANP偵測之下限為i莫耳％ ANp污染物位準。胜肽二硫醚連結在半合成ANp_Fc融合物中的特徵：在pH 5.25，37°c下進行ANP-Fc融合物的胰蛋白酶消化 5 18小時，保存該二硫醚(Cys-Cys)連結。將該胰蛋白消化液 (tryptic digest)分成二個液份，其之一藉由dTT還原及以2、碘乙醯胺覆蓋。將經還原的樣品(0.5-1.0毫奈莫耳）負載到鉤至奈米-LC/MS/MS之自裝填的C18毛細管管柱（1〇公分）上。使用西奎斯特（Sequest)進行胜肽定序或重新。以相同 10方法（還原及非還原）來處理自由態胜肽（氧化形式）及使用作為正對照。使用安捷侖（Agilent) 1100 HPLC二元系統及熱 LCQ-Advantage離子捕集器質譜儀來LC/MS/MS分析。使用 ANP-Fc融合物之未結合的ANP胜肽類似物（包括GS連結子 15 區域)作為鑑別實驗的正對照。以100 mM醋酸銨(pH 5.25) 將3微克的胜肽-Fc融合物（1微克的自由態胜肽呈氧化形式）稀釋至最後體積30微升。將10微升〇.〇1微克/毫升的胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶黃金，MS等級，普羅美加(Promega))加入至蛋白質/胜肽溶液及在37°C下進行消化18小時。將消化樣 20 品分成二個20微升的液份。一個消化樣品液份（非還原狀態）立即冷凍及貯存在-20°C直到分析。第2液份在真空中乾燥及以20微升的 50 mM Tris-HCl及 1 mM EDTA (pH 8_0)再溶解。加入一微升的DTT (0.2 Μ)及在56°C下培養該溶液30分鐘。隨後，加入一微升的2-碘乙醯胺(〇·5 M)及在黑暗中進 62 200906849 行反應30分鐘以產生硫醇-覆蓋的消化樣品。未結合的胜肽消化樣品以水稀釋五倍。將〇 5微升經消化的胜肽_ F c融合物 (或1微升經消化的胜肽）負載到用於奈米_lc/ms/ms分析的自裝填C18毛細管LC管柱上(YMC C18, 5微米，10公分長）。 5分流0 ·2毫升/分鐘的H p L C幫浦流速以獲得用於毛細管L C 之1微升/分鐘。所使用的動相為〇〇5 Μ醋酸在水中（Α)及 0 · 0 5Μ醋酸在乙腈中（Β)。該LC/MS資料(非還原及還原）與消化片段之可能的二硫醚交疊連結相符合之理論質量比較，以決定在ΑΝΡ胜肽内是否形成適合的二硫醚。還原的胜肽 10片段序列藉由MS/MS資料之西奎斯特資料庫搜尋來証實。半合成的ANP-Fc融合物之FcRn黏結性質的特徵：讓經純化之可溶的人類FcRn在ρη=6·0下鍵結至比亞核心(BIAcore)晶片表面。半合成的ANP_Fc融合物以一系列不同濃度在晶片表面上流動。使用比亞核心比亞伊哇(BiaEval) 15軟體，藉由非線性回歸至含有二個無互相作用黏結位置的模型來擬合該平衡反應(Req)。此模型假設在塗佈FcRn的感應晶片上有二個Fc黏結位置（Kdi,Kd2)，以提供整體觀察的黏結。例如，如由比亞核心推薦（比亞應用（Biaapplicati〇ns)手 2〇冊’版本AB ’第4·2節）般，可溶的人類FcRn使用1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二醯亞胺鹽酸(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)’藉由胺耦合交聯至CM5感應晶片的葡萄聚糖表面。為了固定，以1〇 mM醋酸鈉，pH 4.5將FcRn稀釋至 10微克/毫升。以1 Μ乙醇胺鹽酸pH 8_5阻斷在葡萄聚糖上的 63 200906849 殘餘位置。FcRn固定至在感應晶片上的一個流動槽’同時對照流動槽以乙醇胺阻斷以用於參考扣除。為了 ANP-Fc結合物之分析，將塗佈FcRn至400至600反應單元(RU)的最後密度。使用此塗佈程度，以保証該感應晶片可藉由在允許 5 的注射時間内注入Fc蛋白質而完全飽和，同時仍然提供合理的#號。在pH 6下使用50 mM攝酸納、100 mM氯化納、 0·01%界面活性劑P20(比亞核心AB)來進行實驗。以30微升/ 分鐘’在FcRn-CM5晶片上注入11-2倍在1 μΜ至1 nM的 ANP-Fc或對照蛋白質間的連續稀釋物5分鐘。然後，以流 10動的緩衝液從該晶片分離鍵結的蛋白質2.5分鐘。以30微升 /分鐘注射pH 7.4 HBS-P緩衝液(〇.〇1 Μ希皮士(Hepes)，ρυ 7.4 ’ 0.15 M NaQ，0.005%v/v界面活性劑P2〇)27秒，從讀晶片移除任何殘餘的蛋白質。其次，使用比亞伊哇軟體版本3.丨（比亞核心AB)來分析 15感應圖（Sensorgrams)及使用空白緩衝液做基線校正，然後平均基線。當將所提供的蛋白質濃度注射到晶片上，信號逐漸到達最大穩定水準。假設此為在平衡時的黏結程度及所觀察的信號為稱為Req(在平衡時的反應單位）。㈣值對著濃度繪製’然後，使用比亞伊唾軟體藉由將該資料擬合至 2〇異質性配體模型來導出平衡親和力常數(Kd，s)。此模型假設在感應晶片上有二個無交互作用的祕喊結位置。因此， KD值以二個分別的、值報導，其對理論最大的觀察㈣值 (Rmax)提供某些分量％。重組ANP-Fc融合蛋白質製造及特徵： 64 200906849 ANP-Fc融合物槿成物基咮：根據習知的寡核苷酸合成技術來合成四種DNA序列，及將其次選植進入載體 pJ13(DNA2.0公司）中。每種構成物包含相同的基本順序：所《ί/ΙΙΙ限制酵素(RE)位置，接著為寇日克(Kozak)序列、老 5 鼠IgGK輕鏈信號序列、人類ANP28序列、連結子序列、人類Fc γ序列，接著為另一個re位置。寇曰克序列及老鼠IgGK 輕鏈信號序列與在載體pSYN-Fc-015中的序列 (pcDNA3.1/IgK sig seq-hFc)相同。pSYN-Fc-015載體表現出與在NCBI資料庫中登錄編號y_14735的序列相配之IgGl同 10 型蛋白質的Fc蛋白質。人類ANP28序列來自NCBI資料庫具有登錄編號NM_〇〇6172 (SEQ ID NO : 15)。連結子序列編碼由甘胺酸及絲胺酸殘基之重覆物組成的11或20 aa胜肽，對 11 aa連結子(L4)來說為(GGS)3GG (SEQ ID NO: 3)及對20 aa連結子(L6)來說為(GGS)6GG (SEQ ID NO : 7)。構成物 15 pJ13-ANP28-ll aa-hFcl及pJ13-ANP28-20 aa-hFcl 包括與在包含及s/>EI RE位置的pSYN-Fc-015中之人類Fc γ 1序列的第一 39bp相同之序列。構成物pJl3-ANP28-ll aa-hFc2及 pj 13-ANP28-20 aa-hFc2與二種先前描述經由連結子序列的構成物相同，除了全部的人類Fc γ 1序列以人類Fc γ 2序列 20 置換外。在人類Fc2序列後存在一£cori限制。以Z/zWIII及五coRI消化該表現載體pSYN-Fc-015，及移除包含寇日克序列、老鼠IgGK輕鏈信號序列及全部的Fc γ 1 序列之片段。使用標準分子生物學技術來分離5.4kb載體骨架。構成物 PJ13-ANP28-11 aa-hFc2 及 pJ13-ANP28-20 65 200906849 aa-hFc2每種以//ζ·«ί/ΙΙΙ及EcoRI消化；使用標準分子生物學技術從pJ13-ANP28-ll aa-hFc2分離出858bp片段，及從 pJ13-ANP28-20 aa-hFc2分離出885bp片段。每種皆包含寇日克序列、老鼠IgGk輕鏈信號序列及11 aa連結子(L4)或20 aa 5 連結子(L6)任一種，接著為全部的FcY2序列。5.4kb載體在 4°C下以T4 DNA連接酶連接至858bp片段或885bp片段任一種過夜。連接的DNA轉化進入細菌株DH5ot中，將其板置到 LB+氨比西林板上及在37°C下培養過夜。隔天早晨，將該等板從培養器中移出及將來自每個連接/轉化板的數個單 10 一菌落每個拾入15毫升包含氨比西林之LB媒質中，及在 37°C下於震動培養器中生長過夜。隔天，採集細菌細胞及使用 QIAprep Spin Miniprep Kit (奎阿金公司（Qiagen Inc·)) 來分離質體DNA。送出液份用以定序，以證實DNA序列（艾基科特（Agencourt))。 15 以他Will及來消化載體pSYN-Fc-015及分離6kb 載體骨架。此可移除寇日克序列、老鼠IgGK輕鏈信號序列及Fc γ 1序列的第一37bp。以及來消化構成物 pJ13-ANP28.il aa-hFcl 及 pJ13-ANP28-20 aa-hFcl ;從 pJ13-ANP28-ll aa-hFcl 分離出 209bp 片段及從 20 pJ13-ANP28-20 aa-hFcl分離出236bp片段。每個片段皆包含寇曰克序列、老鼠IgGK輕鏈信號序列及11 aa連結子(L4)或 20 aa連結子(L6)任一種和Fcg 1序列的第一37bp。將6kb載體連接至209bp片段或236bp片段之任一種；如先前描述般進行轉化、DNA質體預備物及定序。 66 200906849 _^^^?4(：_融金物之哺乳動物表現性：___用短暫轉染方法，以1升的規模在HEK293細胞株中進行該ANp融合構成物的初始表現性。HEK293細胞在富力史戴爾（FreeStyle)293 媒質中生長及使用293費克聽(Fectin)試劑及如由製造商（因 5維錯俊)所描述的規則來轉染。經短暫轉染的細胞在旋轉器塗佈機燒瓶中於37 C及5%C〇2下生長且以9〇 rpm撥動。每日監視細胞其細胞密度、生存能力及直徑、葡萄糖位準、乳酸鹽、麩醯胺酸及pH。在藉由離心機於36〇〇 rpm下轉染 15分鐘後72小時，採集經處理的媒質及新鮮輸送至純化。 10藉由SDS-PAGE及西方墨點分析法來測量表現程度。一旦對每種構成物測量表現程度，進行多種放大方法 (包括20升短暫轉染及穩定總庫產生）以產生所需求的蛋白質。使用PEI-25試劑，在50升搖攞式生物反應器中進行2〇升短暫轉染。將25毫克的DNA液份稀釋進入250毫升富力史 15戴爾293媒質中，及將75毫克的PEI-25液份稀釋進入250毫升的相同媒質中。然後，將該DNA樣品與PEI溶液混合。在室溫下培養15分鐘後，將該DNA: PEI混合物與1〇升新鮮負载的HEK293細胞在細胞密度2百萬/毫升下負載進入搖攞式生物反應器中。將搖攞式生物反應器設定成在37°C及5% 2〇 C〇2下搖晃角度8度及搖晃速度22 rpm。在轉染後五小時，將升富力史戴爾293媒質負載進入搖攞式生物反應器中。母日監視細胞其細胞密度、生存能力及直徑、葡萄糖位準、乳酸鹽、麩醯胺酸及pH。在藉由離心機於3600 rpm 下轉染15分鐘後120小時採集經處理的媒質及新鮮輸送至 67 200906849 純化。藉由SDS-PAGE及西方墨點分析法來測量表現程度。在燒瓶令開始穩定總庫產生，其中以400微克/毫升的G4】8 選擇安定細胞，然後將其轉移至旋轉器中。一旦細胞在這些條件下安定’擴展開它們及在旋轉器或搖擁式生物反應 5器中進行4-5升的行程。 41下使用AKTA系，’克(GE保健）或拜歐歐普替斯(Bi〇〇ptix) 1 〇(愛思扣(isc〇))進行純化。每升經處理的媒質加入五毫升蛋白質酶抑制劑混合劑（西格瑪）13管柱填充以每升經處理的媒質3_4毫升之蛋 10白質A陶瓷HyperDF®樹脂（波爾（Pall))，且於丨毫升/分鐘下與1〇CV的平衡緩衝液（lx杜爾貝科PBS不含Mg/Ca，pH 7.3，因維錯俊）平衡。以丨_5毫升/分鐘（依媒質體積而定）將經處理的媒質負載到管柱上過夜。然後，在1〇cv序列中，以清洗緩衝液1(DPBS不含Mg/Ca，PH 7.3)、清洗緩衝液 15 2(DPBS不含Mg/CaPH7.3+lMNaCl)，然後再次為清洗緩衝液1來清洗樹脂。以10CV沖提緩衝液(〇. 1Μ甘胺酸/HC1、pH 2.5在犯2〇)，在2.5毫升/分鐘下沖提鍵結的蛋白質。立即以 300微升（10%餾分）中和緩衝液Tris-HCl pH 8.0，因維錯俊）來中和3毫升鶴分。使用sHde-A-Lyzer卡匿（皮爾斯）對著 20 PBS(亥克隆(Hyclone))(2x5升，總共22小時）來透析餾分總庫，及使用阿米空超_15 10kDaMWCO濃縮器（微孔）濃縮至 1 -2毫克/毫升。液份在液態氮中迅速冷凍，然後貯存在_8〇〇c 下。最後產物在提交用於生物功能分析前，使用sds_page (非還原及還原）、分析性超速離心法及質譜分析標出特徵。 200906849 使用凝膠-凝塊LAL試劑（鳕魚岬夥伴（The Associates of

Cape Cod))來測量内毒素污染程度。會組ANP-Fc融合蛋白質之分析性超速離心法：進行沉降速度實驗以評估經純化的ANp-Fc融合物之純度及聚集 5 含量。藉由在包含10 mM構酸鈉、150 mM NaCl ’ pH 7.3之磷酸鹽緩衝鹽液緩衝液中的沉降速度來評估ANP-Fc融合物。將樣品負載進入包含雙扇形活性碳-伊碰中央物件 (double-sector charcoal-epon centerpieces)及石英窗口的離心機槽中。使用貝克曼(Beckman) XLI分析超速離心機，在 10 280奈米、50,000 rpm及20°C下收集資料。使用自動化安通-帕爾（Anton-Paar) AMVn/SP3-V 黏度計及 DMA4500/ DMA5000光密度計，在20°C下測量溶液密度及黏度。使用程式SEDFIT版本9.3b(2)來分析沉降資料。重組製造的ANP-Fc融合物之質譜分析：進杆皙f善f驗 15 以測量完整的分子量，經由酵素消化及胜肽映射進行部分序列確認，及鑑別ANP-Fc融合物的降解產物。為了評估完整的分子量，以流速40微升/分鐘將5微升融合蛋白質注射到丘比特（Jupiter) C4管柱（5u，300A， 1.0x150毫米）上。以梯度從0%至1〇〇%Α在40分鐘内沖提蛋 20 白質[動相A為98/2/0.06 (水/乙腈/TFA)及動相B為 95/5/0.052 (乙腈/7K/TFA)]。流出物流入微質譜夸錯阿替瑪 (Micromass Quattro Ultima)質譜儀（其以2秒的掃描時間掃描從900-1500amu)。資料使用程式美斯安特(MaxEnt)l去卷積，以產生分子量。 69 200906849 以騰蛋白酶或Endo_LysC (80丨〇_丨08)來消化融合蛋白質以用於胜肽映射及降解分析。簡單地說，變質、還原及烷基化25微升的每種樣品。加入胰蛋白酶或Endo-LysC，及在 37C的水槽中培養樣品過夜。經由HPLC/FTMS進行分析。 5該裝置在層析分離期間以大約50,000解析度產生多重掃描。以準禮性〇.〇〇〇5%的相對誤差測量每種沖提胜肽的質量。以普羅夸爾（pr〇Qual)程式（3)處理資料以產生胜肽地圖。若理論值在實驗測量值的0 0005%内時，則與根據酵素特異性所預測的胜肽相符。亦藉由尋找與可能的胺基酸缺 10失相應之質量來研究Endo-LysC資料用於N-末端截斷物。不像胰蛋白酶，Endo-LysC實驗允許用於完整胺基末端區域的觀察。用於試管内NPRA細胞分析之安定細胞株的產生·· 從歐力基因技術有限公司（OriGene Technologies，Inc.)) 15 (洛克維列（Rockville)，MD)購買包含質體的全長人類 NPRA、人類NPRB及人類GUCY2C (NPRC)序列，然後將其次選殖進入pcDNA3.1方向性哺乳動物表現載體（因維錯俊）中。每個構成物的插入方向及核苷酸序列已藉由外部供應商（西克瑞特公司（SeqWright，Inc.))證實。該pCDNA3.1NPR 20 選殖物使用里剖費克塔胺（Lipofectamine)(因維錯俊）轉染進入HEK293細胞中，其中使用G418選擇表現出人類 NPRA、人類NPRB或人類NPRC的安定細胞株。使用描述在下列之利尿納胜肽引發的cGMP分析來篩選選殖物。（npra 選殖物以人類ANP處理，同時NPRB選殖物以人類CNP處理 70 200906849 (西格瑪)）。擴展開高cGMP產生選殖物。使用1251 ANP黏結分析來篩選NPRC選殖物。擴展開125I ANP高結合劑。細胞株在包含100微克/毫升的盤尼西林/鏈黴素、L_麩酿胺酸、 400微克/毫升的G418及10% FBS(亥克隆）的DMEM中生 5 長。HEK293T-GCA(表現出大白鼠NPRA的細胞)(林空帕特 (Lincoln Potter)，MN明尼阿波里斯市（Minneapolis)/聖保羅 (St. Paul)的明尼蘇達州分子生物學及生物物理學大學 (Molecular Biology and Biophysics University of Minnesota) 生物化學系）在包含100微克/毫升的盤尼西林/鏈黴素、L-麩 10 醯胺酸'潮黴素(hygromycin)B及10% FBS之DMEM中生長。利尿鈉胜肽融合蛋白質引發的cGMP分析：從西格瑪購得>95%HPLC純度的利尿鈉胜肽。使用以漢克斯(Hanks)為基礎的細胞分解媒質（吉普扣（Gibco))來採集生長至90%群集的HEK293 NPRA細胞。清洗細胞及以每 15 毫升3·3χ105個細胞再懸浮於預升溫的杜爾貝科PBS，pH 7.4，25 mM希皮士，0.1%BSA，500 μΜ 3-異丁基-1-曱基黃嘌呤(ΙΒΜΧ)[分析緩衝液]中。在歐普替板(〇ptiplate)-96白色不透明的96井微板(Microplates)(博精）中進行分析。將15 微升的細胞懸浮液加入至15微升在分析緩衝液中之2 X融合 20蛋白質（一式三份）及在37°C下培養20分鐘。使用打擊獵人 (HitHunter)TMcGMP分析成套配方（狄斯卡夫rx股份（有限）公司（DiscoveRx Corporation))來測量cGMP濃度。使用在XL 擬合（XLfit) 4_2資料分析軟體(ID商業溶液有限公司（ID Business Solutions, Ltd.))中的雷文堡馬夸特（Levenburg 71 200906849

Marquardt)演算法所擬合之四個參數邏輯方程式來產生 cGMP產生劑量反應曲線。 125IANP黏結分析：以0.2%的聚乙烯亞胺（PEI)(西格瑪）塗佈微孔多筛 5 (Millipore Multiscreen)玻璃纖維過濾器微滴板，及以黏結緩衝液(RPMI，0_1%BSA)藉由真空過濾清洗。將1〇〇毫升在黏結緩衝液中1*1〇6 HEK293-NPRC細胞選殖物懸浮液加入至每個井。將100毫升2X 125Ι-ΑΝΡ+/-1〇〇〇χ冷ANP(非特定的黏結對照）加入至適當的井。在執道式搖動器上，於室溫下培 10 養該板二小時。在培養後’使用真空歧管，以200微升的冷黏結緩衝液接著200微升含有清洗緩衝液（i〇mM Tris， 200mM NaC卜0.02% BSA)之最後清洗液來清洗該等板 5X。在室溫下乾燥該過濾器。將30微升微閃燦液 (Microscint)20加入至每個井。在博精脫普康（T〇pcount) 15 NTX液體閃爍計數器上讀取該等板。 ANP-Fc在大白鼠中的藥物代謝動力學(phayarnacokinetics): 母威斯塔大白鼠(〜100克；4隻大白鼠/蛋白質）靜脈内給藥〇·5毫克/公斤在PBS中的單體(構成物14)及二聚物（構成物15)或單體(構成物10)及二聚物（構成物11)。在給藥後的 20 卜 2、4、8、24、48及72小時（構成物 15)或0.25、卜 2、4、 8 ' 24、48及72小時(構成物1〇、11及14)處，藉由尾巴刻痕來收集每隻大白鼠的血液。將血液(2χ60微升液份）收集至包含6微升3.2%檸檬酸鈉的微毛細管（費希爾科學（Fisher Scientific)，CAT#22-362-574)中及藉由離心機產生血漿。將 72 200906849 血漿貯存在-2crc下直到進行ELISA分析。 ANP-Fc在新生大白鼠中的口服吸收： /天大的新生威斯塔大白鼠(4隻大白鼠/組）π服給藥 0M克>/公斤在PBS中的ANP_Fc二聚物(構成物⑷，並補充 5 5毫克/毫升的大豆騰蛋白酶抑制劑(加生化心丨we㈣；目錄#650357)。在給藥後之丨、2、4、8、24、48及72小時處從大白鼠組刺穿心臟收集血液。將血液(7〇〇微升）收集至〇1 體積3.2%檸檬酸鈉中及藉由離心機產生灰浆。將企聚貯存在-20°C下直到藉由ELIS A分析。 10 ANP/Fc ELISA ：在4°C下，於50mM碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液？119 6中，以5微克/毫升（50微升/井）的老鼠抗人類ANp(美國生物學 (US Biologicals)，CAT#A4150)塗佈 96 井板（寇史達 (Costar)，目錄#369)過夜。在室溫(rt)下，以3〇〇微升/井包 15含5%牛血清白蛋白（PBS/5% BSA)的PBS(傑克森免疫研究

(Jackson ImmunoResearch)#001-000-162)阻斷該板2小時。在P B S / 5 % B S A中稀釋標準品及樣品（1 〇〇微升/井）且在RT下培養2小時。標準曲線範圍從0.039奈克/毫升至1〇奈克/毫升。在替肯(Tecan)板清洗機中，以300微升/井包含0.05%屯 20 (Tween)-20的PBS(PBST)清洗該板三次。然後，在室溫下於 PBS/5%BSA中，以1 : 7,500稀釋之100微升/井結合抗體的山羊抗人類（Fc特定的）揮菜過氧化酶(HRP)(皮爾斯生物工藝學（Pierce Biotechnology) ’ CAT#31414)來培養該板 3 小時。在RT下以100微升/井的TMB超敏感基材（生物Fx實驗室 73 200906849 (BioFx Laboratories) ’ CAT#TMBS)發展大約 6分鐘前，以 300 微升/井PBST清洗該板四次。藉由加入0.25 Μ硫酸（100微升 /井）終止反應。在光譜馬克斯（Spectromax)讀盤器中’於 450(-600)奈米下讀取該板。 5 實施例1 :預測最小連結子距離的結搛棋型進行結構模型，以測量Fc與ANP融合所需要之連結子。二分子經定向以減少距離和減少空間及靜電排斥，從 ANP的C終端之最小距離為12A(離該Fc二聚物的最近N終端）及17A(離該Fc二聚物的其它N終端）。若Fc二聚物僅具有 10 —個融合的ANP時，將建議4至6 aa最小連結子長度。在二個ANP胜肽鍵結至Fc二聚物中，若僅有一個ANP鍵結（以1 : 1的Fc二聚物：NPRA比率）時，然後將建議每個連結子之最小連結子長度為9 aa。對二ANP以1 : 2的Fc二聚物：NPRA 比率黏合來說，將建議具有最小長度12 aa的連結子。 15 實施例2 :合成ANP融合番白晳之合成及牿後使用合成化學來產生以連結子融合至IgGl同型的人類 Fc之hANP28胜肽。所產生的半合成ANP-Fc融合分子顯示在表2中。所測試的連結子有甘胺酸琥珀酸鹽（L1)、 GlyGly(L2)、（GlyGlySer)3GlyGly(L4) (SEQ ID NO : 3)及 20 01丫(86心1丫0以)286心1丫([3)(5£(510]^0:2)。使用甘胺酸(0)

加入彈性，同時嵌入極性絲胺酸(S)加入溶解度。具有連結子的hANP28胜肽在二個方向上連結至重組製造的 Cys-Fc : 1) hANP28+連結子的C終端融合至Cys-Fc的N終端 [方向#1]，及2)連結子+hANP28的N終端融合至Cys-Fc之N 74 200906849 終端[方向#2]。第一方向的合成化學產生完整的胜肽鍵結結構，同時第二方向的化學遺留琥珀酸鹽部分取代該融合物之一個胺基酸。使用由陽離子交換色層分析法接著硫親和層析法所組 5 成的二步驟純化方法來純化該半合成ANP-Fc結合物。陽離子交換步驟分離Cys-Fc、單體結合物(每個Fc含1個ANP胜肽) 及二聚物結合物（每個Fc含2個ANP胜肽），同時亦移除蛋白質聚集物。各別的ANP-Fc結合物陽離子交換總庫各自獨立地完成硫親和層析純化步驟，以移除未結合的自由態ANP 10 胜肽及“拋光”單體及二聚物結合物種。使用SEC-HPLC、逆相色層分析法、質譜及分子黏結分析法廣泛地找出該經純化的半合成ANP28 -Fc融合物之特徵。使用來評估聚集的SEC-HPLC顯示出經純化的預備物包含>90%之預計MW物種。逆相層析法方法經建立以監視該 15 “自由態”未結合的ANP胜肽在最後總庫中之位準。已證實合成的預備物具有少於1莫耳％的“自由態’’ANP胜肽污染物。使用質譜技術來評估二硫醚鍵結形成的品質。質譜的結果指出具有較長的連結子之半合成構成物顯示出混合小百分比的二硫醚鍵結。當混合的二硫醚之百分比經估計為 20 總量的非常小分量時，該合成的預備物對進一步分析來說視為好的。最後’進行比亞核心分析以監視該半合成 ANP-Fc融合蛋白質黏結至經固定之可溶的人類FcRn。進行此分析，以證實該合成化學不會改變Fc區段之FcRn黏結能力。觀察到在FcRn黏結中無明顯改變。 75 200906849 —旦該半合成的ANp_Fc融合構成物之品質經証實，由二個不同的實驗室以人類NPRA cGMP誘導分析測試其效力，及使用二種不同方法來處理資料（表2:實驗室1及2與結果1及2)。藉由解釋原始相對發光單位(RLU)產生來自實 5驗室1及2二者的結果卜藉由在相同分析中比較該RLU與由已知濃度的cGMP所組成之標準曲線產生來自實驗室丨的結果2。在二分析中所產生的EC5〇值顯示出相同趨勢。所看見的一個趨勢為该二聚物構成物在此分析中比各別單體構成物具有更高的強效性。亦清楚的是，該具有短(2 aa)連結子 10之ANP-Fc融合物相對於具有較長（11 aa)連結子的那些弱至少2倍。 H·.半合成ANP-Fc融合物及來自人類NPRA轉染細胞的 cGMP誘導反應構成物編說構成物式 CGMP EC5〇 (nM) Labi (結果1) cGMP EC5〇 (nM) Labi (結果2) cGMP EC5〇 (nM) Lab2 (結果1) 6 ANP^-Ll-Fcl^ j 68 ±23 150 ±49 ΝΑ FcIab (n=4) (n=4) 7 ΑΝΡγχ-Ll-Fcl^ 45 ±22 114±40 ΝΑ ΑΝΡγχ-Ll-Fcl^ (n=3) (n=3) 8 ANP-^y^-Fcl^ i 234±199 329 ± 57 282+ 123 Fc^ab (n=2) (n=2) (n=3) 9 ANPxy^-FcI^ | 128±161 118 ± 55 88 ±21 ANPxy^-FcI^ (n=4) (n=3) __ (_ 76 200906849 10 ANPX Y-L41 沾 PcIab 85 ± 16 (n=2) 327 ± 65 (n=2) 100 ±39 (n=4) 11 ANPxy-l^-fc 1 沾 ! A^xy-L4_Fc 1 仙 19 士 4 (n=2) 68 ±23 (n=2) 26± 11 (n=4) 12 ANPyx-L3-L 1-『c 1AB I FcIab 47 土 6 (n=4) 158 ±101 (n=4) 77 ±20 (n=3) 13 ANP^U-LI-FcIab ! ANPyx-L3-L1-Fc1ab 19± 11 (n-4) 66 ±55 (n=4) 24 ±2 (n=3) 14 ANPXY-L5a-Fc1AB 1 1 ΑΝΡχγ-LSa-Fcl^ NA 14± 1 (n=2) 15 ANPxY~L5a-Fc1AB 1 1 Fc1ab. NA 83 ±51 (n=3) 為了評估在連結子長度與效力間之相關聯性，產生具有16 aa連結子(L5a)的ANP-Fc融合物(指為構成物14及構成物15)。為了評估甚至較長的連結子，產生重組2〇 aa(L6)連 5結的ANP_Fc融合蛋白質。在二實例中，該較長連結子的組成物保持與(GGS)x重覆型式一致，其中χ為從〇至16的整數。該單體與二聚體具有16個胺基酸連結子(L5a)的ANp_Fc 構成物二者(顯示在表2中）闡明提高試管内活性而超過川固胺基酸連結子（L4)構成物。4 了證實所產生的半合成 10 ANP-Fc融合蛋白質與重組製造的ANp_Fc融合物相同，亦製得模仿構成物η的重組構成物作為啊及卿&融合物 77 200906849 二者。分析人類ANP28胜肽在特定經NPRA轉染的293或293T 細胞物種中之cGMP產生。產生cGMP的最大刺激之一半的融合蛋白質濃度值編列在表3中。由人類ANP28胜肽刺激在 5 表現出大白鼠NPRA(rNPRA)的293T細胞及表現出人類 NPRA(hNPRA)與犬科NPRA(caNPRA)的293細胞中產生 cGMP之劑量反應曲線顯示在第2圖中。表3 : ^特定經NPRA轉染的29ί或293T細胞物種中之cGMP 產生的分析結果。配髖分析型式平均EC50 nM StdDev N ANP cGMP-hNPRA 293 0.82 0.51 15 ANP cGMP-Rnpra 293 0.33 0.06 2 ANP cGMP-hNPRA 293 1.00 0.57 16 ANP cGMP-rNPRA 293 0.67 0.19 4 ANP cGMP-caNPRA 293 1.34 1.43 3 10 實施例3 :重組ANP融合香白皙產生重組ANP-Fc融合蛋白質的快速產生用之製造平台。該方法以“基礎” Fc融合載體開始，其允許DNA匣快速且無縫地插入到IgGl或IgG2 Fc之N終端上。使用將枢紐區 15 域切成相同的CPPCP樞紐殘基，因此保証在二個同型上連結子延伸與ANP融合物將相等地延伸之此方法來產生對 IgGl及IgG2同型二者之Fc融合物。所產生的四種重組 ANP-Fc融合蛋白質之各別DNA及蛋白質序列由SEQ ID NO : 24-31表示（參見例如，第1A-B圖）。這些融合蛋白質每 78 200906849 種皆包含N終端老鼠IgGK輕鏈信號序列 METDTLLLWVPGSTG (SEQ ID NO : 32)，其會被裂解掉且非為最後蛋白質產物的部分。黑體的ANp_Fc融合構成物最初使用1升的短暫哺乳動物表現接著親和層析法來產生。此 5製造方法典型產生1-3毫克/升>90%的純蛋白質（藉由 SDS-PAGE)。為了滿足增加的蛋白質需求，成功地執行二種其它，乳動物表現技術（大規模(20升)短暫轉染及安定總庫產生）二者。這二種方法每升比起始的1升短暫轉染產生至少3倍多的蛋白質。這些方法全部提供製造多於5〇毫克欲 10使用於試管内及活體内分析的每種重組構成物。未還原的 ANP-Fc融合物之預涓丨J MW為57.5kDa，同時經還原的 ANP-Fc融合物之預測的MW為28.7kDa。為了補足重組製造平台，適當放置一特性描述平台以保言正欲測試的ANP-Fc融合物之品質。當hANP28具有此高效 15力（參見表4)及其序列包含許多官能性所需要的關鍵性胺基酸及二硫醚時，使用質譜（完整的質量及胰蛋白消化液）來監視在所產生的此批號中之“自由態’’ hANP28胜肽濃度及裂解產物二者。亦執行質譜Endo-LysC消化方法來評估 ANP-Fc融合胜肽的N終端末端。僅選擇含有>90%的完整N 20 終端之批號用於進一步分析。藉由在分析性超速離心機中的沉降速度實驗來測試聚集程度，其中該等批號發現包含 >85%單體。 79 200906849 妻·4 :一名多種NPRA細胞型式上產生之重組ANP-Fc融合物及 cGMP誘導反應構成物編銳構成物式1’2 cGMP EC50(nM) 人類NPRA cGMP EC50(nM) 大白鼠NPRA cGMP EC50(nM) 狗 NPRA cGMP EC50(nM) 猴子NPRA 1 ΑΝΡχγ 1±0.5 (n=32) 0.7±0.2 (n=4) 1.3±1.4(n=3) 0.5±0.2 (n=3) 2 ANPxy-L4- FcIab 41 ±20 (n=6) 55±33 (n=3) 31±16(n=3) 27±18 (n=3) 3 ANPxy-L6- FcIab 10±10(n=12) 25±12 (n=9) 11±11 (n=9) 12±8 (n=3) 4 ANPXY-L4- Fc2ab 27±17(n=5) 57+29 (n=5) 46±23 (n=3) 18±10(n=3) 5 ANPxy_L6- Fc2ab 6±3 (n=3) 12±9 (n=3) 6±2 (n=3) 5±3 (n=3) 1參見例如，式3及4 2注意二種不同鏈的Fc區段將在重組表現後二聚化，因此形成ANP之二聚物。在NPRA cGMP誘導分析中測試重組製造的ANP-Fc融合構成物。至今所測試的重組ANP-Fc融合蛋白質在大白鼠、犬及猴子分析中顯示出好的交互反應性。11 aa連結子 (L4)重組製造的ANP-Fc融合蛋白質在效力上類似於它們模 1〇仿之半合成構成物“構成物11”。此說明以半合成ANP-Fc融合物所產生的效力資料為從重組產生的蛋白質所看見之典型。如所預計，在Fc同型中的變體(Fcl對Fc2)在效力上不具有明顯衝擊。當比較多種連結子長度時可看見最引人注目的效力效應。20 aa連結子(L6)重組製造的ANP-Fc融合蛋白 15 質明顯比相應的Π aa連結子(L4)融合蛋白質強效多2倍。半合成16 aa連結子（L5) ANP-Fc融合蛋白質構成物14具有 14±lnM(n=2)的人類NPRAcGMPEC50。考慮到半合成及重組ANP-Fc融合物效力資料，試管内效力與連結子長度有 80 200906849 直接相關聯性，其中20 aa>16 aa>ll aa>2 aa。藉由分析其在表現出NPRB的細胞株中之功效來評估重組ANP-Fc融合蛋白質之選擇性。在表現出大白鼠、犬及猴子NPRA的HEK293細胞株中測試該ANP-Fc融合蛋白質 5 之物種交互反應性。所測試的ANP-Fc融合物在大白鼠、犬及猴子NPRA主導的cGMP分析中具有好的交互反應性（表 4)。當在表現出人類、狗及猴子NPRA的細胞中測試時，該等ANP-Fc融合蛋白質具有幾乎相等的劑量反應值。這些結果未驚人地提供人類、狗及猴子ANP28為100%同源的事 10 實。另一方面，大白鼠NPRA的劑量反應值弱〜2倍，此可能由於事實上大白鼠ANP與人類ANP差異一個胺基酸。當以人類NPRA cGMP分析來分析時，野生型大白鼠ANP具有 EC50稍微高於人類ANP。資施例4 :活體内第物動力畢研资 15 進行活體内藥物動力學研究以進一步找出本發明之融合蛋白質的特徵。使用靜脈内給藥至威斯塔大白鼠中來獲得半合成 11 (L4)及16(L5)胺基酸連結的ANP_Fc融合單體(各別為構成物10及構成物14)及二聚物（各別為構成物丨丨及構成物15)之 2〇藥物動力學性質。使用二種不同的ELISA來偵測蛋白質。使用ANP/Fc ELISA來偵測完整的ANP-Fc。使用Fc/Fc ELISA來偵測Fc蛋白質因此測量完整的ANp_Fc及Fc二者，以研究ANP胜肽降解的可能性。雖然二種型式的構成物之半生期類似（表5)，但二單體 81 200906849 構成物（構成物10及構成物14)擁有增加的cmax而超過二聚物(構成物11及構成物15)。此產生單體的AUC，其比相鹿的二聚物大>5倍(表5)。在一種連結子長度間於其藥物動力學上無偵測到明顯差異。此外’已發現ANP/Fc及Fc/Fc偵測方法提供明顯不同的結果’其中Fc/Fc ELISA提供提高的金清濃度及延長半生期。此資料建議ANP-Fc融合物具有活體内隨著時間部分降解的性質。表11_單體及二聚物在威斯塔大白鼠中的藥物動力學參數

藉由進行單一劑量大白鼠pk研究來評话重叙ANP_Fc 融合候選物的藥物代謝動力學。經由靜脈内或皮下注射對史普拉克道立(Spmgue Dawley)大自鼠提供丨毫克/公斤劑量的ANP-Fe齡物之單—快粒射。對對肋動物提供媒劑對照PBS注射。在多個時間轉、Q Q 5、丨、* u、 m 12〇及168小時）處收集灰聚樣品。對動物取樣 1星期’而偶發事件組進行最高3週。在採取樣品後，隔離該些動物及以三明治ELISA法分析含有而A及抗蛋白酶肽的血漿樣品，其巾ANP以單株紐捕捉及以抗人類&抗 82 15 200906849 體偵測。ELISA具有1奈克/毫升的敏感度及可使用來偵測在大白鼠血漿中的ANP-Fc融合蛋白質。此大白鼠ρκ資料准許比較ANP-Fc融合蛋白質與天然配體hANp28的活體内半生期。

使用靜脈内大量推注將4種重組ANP-Fc融合物給藥至 5大白鼠中所獲得的PK資料顯示在表6中。所獲得的資料闡明融合蛋白質之終半衰期（T1/2)值(〜u_17小時）明顯比天然的人類ANP長。天然的ANP經報導在大白鼠中具有0.3分鐘的 T1/2及在人類中的T1/2為2_3分鐘。靜脈内給藥的!》!^資料亦顯不出ANP-Fc融合物顯示出低廓清率及適當的體積或分 10佈。從靜脈内給藥的PK資料來看，四種重組ANP_Fc蛋白質無法區別。 Μυβ清率(CLp)、體積分佈(Vss)、半生期(tl/2)及平均共振時間(MRT)資料之表列。構成物編號 2 CLp (毫升/分鐘/公斤） Vss (升/公斤） 2.77 0.49 T1/2 (小時） 12.3 MRT (小時) 2.94

從皮下給藥4種重組ANP_Fc融合物至大白鼠所獲得的 PK資料顯示在表7中。所獲得之資料建議該等融合物具有一慢吸收階段，此造成其具有較長的半生期（〜18-23小時）。但是，進行皮下給藥產生低血漿濃度位準《從所獲得的皮下給藥PK資料來看，在四種重組ANP-Fc融合蛋白質間無清楚 83 200906849 的區別。

2202 所獲得的最大血清濃度(cmax)、所觀察到的在之構成物編號 Cmax (奈克/毫升） ( 2 70.8 3 71.1 ~Tl 53.5 5 44 5 黏附至治療有關聯的ANP胜肽之Fc的存在能夠經由

FcRn運輸途徑非侵入性傳遞ANp_Fc蛋白質。所提供的是，新生大白鼠在生命的第一個15天内於腸子中擁有高1?(；1111表現程度，它們對研究FcRn運輸提供有用的模型。因此，為了評估FcRn運輸的效率，對新生大白鼠提供單一口服劑量 1〇〇·5毫克/公斤的ANP-Fc二聚物（構成物14卜資料建議 ANP-Fc蛋白質無法有效率地被攝取，及在腸子中有明顯的蛋白資分解，如由僅有Fc的ELISA所提供之大的信號闡明。宜座全Hi由NEP闞明融合蛋白質增加抗蛋白分解降解性中性内肽扭（NEP，亦稱為腦啡肽酶（NepriiySisn)， 15 CALLA中性内肽酶24.11，EC 3.4.24.11)為一種型式II完整的膜蛋白質。NEP為一種關於數種蛋白質型式（包括利尿鈉胜肽、腦啡肽及物質P)之降解的辞金屬胜肽酶，且認為是從循環移除30至50%的ANP之原由。參見例如，j.肯尼 (Kenny)等人，Biochem. J. (1993) 291，8348 (1993)。已經 84 200906849 發展試管内NEP穩定性分析，用以使用作為試管内工具以研究此廓清率機制。將1 〇〇奈克的重組人類NEP(R&D系統）溶解在cGMP分析緩衝液中及加入至包含0 〇1μΜ ANp(西格瑪）或融合蛋白 5質的聚丙烯微滴板之井。在室溫下培養該板60分鐘。對每個井加入在無鈣鎂的PBS(吉普扣）中之EDTA(西格瑪）至1〇 mM，以終止反應。如上所述般進行利尿鈉胜肽融合蛋白質引發的cGMP分析。將15微升經NEP處理的反應混合物加入至該細胞懸浮液及對cGMP製造分析。資料（一式三份井之 10平均）指出所測試的構成物在NPRA主導的cGMP製造中於效力上並無顯示出任何明顯減低（參見例如，第3圖）。全細胞黏結闞明測量表現在全細胞中的人類NPRA之天然配體hANP的結合親和性(KD)。在4°C下，於塗佈PEI的96井玻璃纖維過 15濾板中，以已知濃度經1251標定的hANP28來培養轉染人類 NPRA的HEK293細胞2小時。以冰冷的緩衝液藉由真空過濾清洗板及讓其乾燥。加入閃爍體及在脫普康（Topcount)閃爍計數器上計數該等板。使用平衡模型350(米迦勒斯·門天 (Michaelis-Menten)方程式[((BLmax*x)/(Kd+x))])來計算 20 0.42 nM hANP黏結至NPRA的 Kd值。使用放射性配體全細胞受體黏結分析，藉由進行異種黏結競爭分析來比較構成物1 (h A N P 2 8)對融合蛋白質的相對結合親和性。在4°C下，於塗佈PEI的96井玻璃纖維過濾板中，以固定量經1251標定的ANP+/-過量未標記之ANP或不 85 200906849 同濃度的融合蛋白質來培養NPRA轉染子2小時。使用真空過濾清洗板及讓其乾燥。加入閃爍體及在脫普康閃爍計數器上計數該等板。使用XLfit 4_2擬合曲線及使用劑量反應一個位置模型（Dose Response One Site Model) 205 ([4個參 5 數擬合：y=A+((B-A)/(l+C/x)AD)))])來測量IC50值（表8)。使用下列式（1=1<：5〇/[1+([[]/1^)])來計算&值（參見例如，表 8)，其中Ki為未標定的配體之平衡分解常數，IC5()為造成5〇% 黏結抑制的濃度，[L]為放射性配體的濃度&Kd為放射性配體的平衡分解常數。候選者對NPRA的親和力比天然配體少 10 40至200倍。所測試的每種配體之親和力等級為：構成物卜構成物5>構成物3>構成物4>構成物2。 M^LhANP28及每種重組ANP_Fc融合蛋白質之冗5〇、κ及相對親和力值。

15 Μ為了清楚了解的目的前述發明已藉由_及實施例描述出某些細節，將由熟習該項技術者按照本發明之教導容易地明瞭，可向那裏製得某些改變及改質而沒有離開於本文的赫（包㈣加的具體實例)之精神或範圍。 86 200906849 I：圖式簡單說明】第1A-B圖：4種重組製造的ANP-Fc融合蛋白質之DNA 及蛋白質序列。黑體的老鼠IgGK輕鏈信號序列切掉且其不為最後蛋白質產物的一部分。hANP28劃有底線。（GGS)XGG 5 連結子以斜體表示。第2圖：用於cGMP分析的典型劑量反應曲線。分析在表現出大白鼠NPRA之293T細胞中用於cGMP製造之重組製造的融合蛋白質。第3圖：ANP或融合蛋白質在hNPRA293細胞+/-NEP中引發的CGMP製造。 I；炙要元件符號說明】 (無） 87 200906849 序列表列 <110>百靈播殷輅翰國際公同及新通底斯藥物有陳公句 <120>利屎_融合蛋白臂 <m> 1 <16〇> 36

<170>佩騰英版本3J <21Q> 1 <m> s <2I2> pm <Π3>人造 <2ZQ> , 一 <223» 1^3搞紐區域序列 <4m> I cys Pra Pm Cys pro <21Q> 1 9 <212> PRT <213>人造 <220> <223> l3 <400> 2 |1y ser Qly sly |®r Gly Cily Sftf Sly <21Q> 3 <211> 11 <212> PRT <21$> A.ii <22 0> <223:> L4 <4〇〇> 3 Gly Cly S€r sly 1 fy Ser 6ly Gly ser Gly 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> 人造 <220> <22 3> 連結子 <400> 4 200906849

Gly Gly ser Gly Gly ser ely ely ser Sly €ly s«r Gly Gly 15 10 <210> 5 <211> 16 <2K> PRT <2i3>人造 <220> <223> L5a

<4W> S J|y Sly ely ser Gly Gly ser Gly Gly ser Gly Gly Ser Gly aTy S€r <210> β <211> 16 <212^· PRT <2X3>人造 <220> <223> L5 c400> 6

Gly Gly Ser Gly |Ty ser Gly Gly ser Gly Gly ser Gly Gly ser ely <210> 7 <211> 20 <212> PRT <2U>人造 <22U> <ZZ3> L6 <400> 7

Gly <3ly sef (Sly |ly $er <3Ty <3ly ser Gly ser Gly Gly ser sly illy Ser Qljf •<210> S <211>· 261 <m> PWt <213> λ造 <223> A^iPKy'-L4-Fclai (蛋白質） <220> «223> MISQJI 徵 <211> (1)., C26I) 200906849 «223>該蛋白貿可二聚化 <400> 8

Ser Leu Arg Arg ser ser cys Pht 6ly 〇7y Arg wet Asp Arg lie Gly 1 5 10 IS- ATa sin ser Gly uu Gly Cys mu s«r Phe Are Tyr sly Gly ser Gly 20 2$ 30

Sly ser Gly «1y ser Qly 6T^ cys pro wm cys pro Ala pw alu Leu 3S 40 45 L«y sly ely pro ser val Phe Leu Phe Pro Pro Pro Lys Asp Thr

Uw Met rle ser Arg Thr ?ro Qlu val Thr cys val val val Asp Val S5 70 ?5 80 ser His slu Asp pro slu val Lys Fhe Mn Trp Tyr Val Asp Gly val SS 90 95

Glu Val His Asm Ala Lys Thr Lys Pno Arg <i1u slu <3ln Tyr Asn ser 100 10S 1X0

Thr Tvr Arg val val sar val teu xhr* val Leu His Gin Asp rrp Leu

115 120 12B

Asn Lys Glu Tyr Lys c^s Lys val Ser asd Lys Ala Leu Pro Ala

III 140

Pro lie Glu lvs Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin f»ro Afg slu Pro 14 S ISO 155 160

Girt Val Tyr Thr Leu Pro ργό Ser Ar§ Asp elu Leu 了hr Lys Asn Girt 165 170 175 va*l ser Leu Thi* cys Leu val iu_ys Gly Phe Tyr pro ser Asp ϊΐβ Ala 180 U5 190

val Glu tro sly Ser Asn Gly Gin Pro elu Asn Asn Tvr lv.s Hir Thr m 200 20S pro Pro val ley Asp ser asp GTy ser Phe phe L,eu Tyr ser Lys Leu 210 215 220

Thr val asP i^s ser Arg irrp Sin Gin Gly Asrs v.mt phe Ser cys s.er 22S 230 235 240 3 200906849 val Met His Glu Ala Leu His ash His Tyr Thr Sin Lys ser ^設 ser

Leu ser Pro Gl^ Lys <210> 9 <211> 270 <m> PRT <213> A*i： <220> <223> ANPxy-L6，Felab (蛋白質） <220> <221> MISCL·轉徵 <222> CD..C270) <223>讓蛋白質可二聚化 <4〇<b· 9 |er Leu Arg Arg ser Cys Phe Gly |1y .Aff 嫩t A$P Af9 |^e Gly

Ala Gin ser Gly l«u Gly cys ash ser Phe Ar*g Ty** fly Ser Gly 2D 25 30

Gly Ser Gly Gly ser gTv Gly ser Gly sly se*" <»Ty Ser Gly Gly 35 40 4S

Cys Ργό pro cys pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser val Phe SO 55 邱

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lvs Asp Thr Leu Wet lie ser Atg Thr Pro 6S 70 75 80

Gly val Thr cys val val val Asp val ser His gTu Asp Pm Glu val 85 90 95

Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu val His Asm Ala Lys Thr 100 105 HO

Lys Pro Arg Glu Slu Gin Tyr Asn ser Thr Tyr Arg val val Ser val 115 120 125

Leu Thr val Leu His (STn Asp Trp Leu Asn cly s.ys Glu Tyr Lys Cys 130 13S X4〇 ser 160

Lys val ser Asn： Lys Ala Leu Pro Ala Pro ile G]y Lys Thr Ile 145 ISO 155 200906849

Lys Ala Uys Gly 幻ρ ργό Arg Pro Gin val Tyr Thr Leu pro pro l〇5 170 17S ser Arg Asp Glu Leu τίι「 180

Lys Asn Gin vaT Ser Leu Thr 185

Cys 190

Leu val

Lys Gly Phe Tyr pro ser Asp He Ala val Glu Trp Glu ser· ash Gly 1&S 200 205

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro val Leu Asp ser Asp 210 215 220

Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr vaT Asp Lys Ser Arg Trp 230 23S 240 G)n €ln Gly Asn val Phe ser cys ser val «et h1s G1u Ala Lfu His

Asn His Tyr Thr cln lys ser Leu ser Leu Ser pro Gly uys 260 265 270 <210> 10 <211> 260 <212> prt <2：L3> 人造 <220> <223> ANPxy-L4-Fc2ab (蛋白質) <220> <221> MISC_ 特徵 <222> (1).^2601) <223>該蛋白質可二聚化 <400> 10

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys phe Gly Gly Arg Μβε Asp Arg lie Gly

Ser 25 phe Arg ryr Gly ser Gly

Ala Gin ser Sly 20

Leu Gly cys Asn

Gly Ser Gly Gly ser Gly Gly Cys pro pro Cys Pro Ala Pro Pro val

Ala Gly Pro ser Val Phe Leu phe Pro Pro ί-ys l~ys Asp Thr Leu SO 5S o0

Met lie ser Arg Thr Pro Glu val TV\r cys val val val Asp val ser 5 200906849

6S 70 7S SO

His Glu ASP pro ,lu val ,ln Phe Asn jrp ,yr val ASp ely val 6lu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Ar? alu du Gin Phe Asn Ser Thr

Phe Arg val Val Ser val Leu Thr val val His Gin Asp Trp Leu Asn 115 120 125

Gly Lys Glu Tyr Lys cy$ l^| val ser Asn Lys Leu Pro Ala pro lie Glu Lys Thr He ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 145 150 155 160 val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn GTn Val 165 170 175 ser Leu Thr cys Leu val Lys <5ly Phe τντ Pf〇 ser Asp lie Ala val 180 IS 5 190

Glu Trp Glu. Ser Asn Gly Gin pro Olu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 195 200 205

Pro Met L«u Asp ser Asp ely ser Phe phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr 210 215 220 val ASp Lys Ser Arg xrg 6ln Cln Gly Asn val Phe ser Cys ser val

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 245 250 255

Ser Pro Gly Lys 260 <210> 11 <211> 269 <212> PRT c213> 人造 <220> <223> ANPxy~L6-Fc2ab <220> <221> MISC-特徵 <222> (1)..(269) 200906849

<223>該蛋白質可二聚化 <400> IX

Ser Leu Arg Arg ser ser Cys Phe Gly Gly Arg wet asp Arg lie Gly 15 10 15

Ala Gin ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Gly Gly Ser Gly 20 25 30

Gly ser Gly Gly Ser* Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly ser Gly Gly 3S 40 45 cys Pro pro Cys Pe*〇 Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro ser vaT Phe Leu 50 5S 60

Phe Pro Pro i_ys Pi*〇 Lys Asp 了hr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 65 70 75 8〇

VaT Thr cys val val val Asp val ser His Glu Asp Pro Glu vaT Gin 85 90 95 phe Asn Trp TVr val Asp Gly val Glu vaT His ash Ala Lys Thr uys 100 105 110 pro Arg Glu Glu Gin Phe Asri ser Thr Phe Arg val val ser val Leu 115 120 125

Thr val val His Asp Trp Leu As, ,1y Lys flu ryr .ys cys Lys val ser ash Lys Gly Leu pro Ala »r〇 lie Glu Lys Thr He Ser Lys 14S 150 155 160

Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro GTn val Tyr Thr Leu pro Pro Ser V 165 170 175

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val ser Leu Thr Cys Leu val Lys ISO 185 190

Gly Phe Tyr Pro ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Glr» 19S 200 205

Pro Glu Asn Asn Tyr tys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp ser Asp Gly 210 215 220

Ser Fhe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp uys Ser Arg Trp Gin 225 230 235 240 7 200906849

Gin 6ly Asn Val Phe Ser Cys Ser VaT Met His Glu Ala Leu His Asn 245 250 255

His Tyr Thr Gin Lys ser Leu ser Leu ser Pro Gly Lys 260 26S <210> 12 <211> 251 <212> pprr <213>人遍 <220> <223> ANPxy-L2-Fclab (蛋白質) <220> <22.3> MISC 特徵 <22l> Cl)..a51) <223>該蛋白貿可二聚化 <400> 12 Ser Leu Arg Arg ser ser cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg He sly 1 5 l〇 15

Ala Gin Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Gly Gly cys Pro 20 25 30 pro Cys Pro Ala Pro Pro vaH Ala Gly Pro ser val Phe Leu Phe Pro 35 40 45

Pro Lys Pf*o Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr pro Glu Val Thr SO S5 6〇 cvs val val val Asp val ser His Glu Asp pro Glu val Gin Phe Asn 5§ 70 7S 80 Trp Tyr val Asp Gly wet Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg

Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg val 100 l〇5 val Leu Thr val 110 val HiS GU ASP Trp Leu Mn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val ser

AsnkIS

Glv teu Pro Ala Pro lie GTu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys 13S 140

61y Gin Pr0 Arg Glu 14 S pro Gin val Tyr Thr Leu pro Pro ser Arg Glu 150 IS 5 160 200906849 6lu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr cys Leu Val Lys GTy Phe 16S 170 175

Tyr Pro Ser Asp lie Ala val Glu 了rp Glu ser Asn Gly Gin Fro Glu 180 185 190

Asn Asn tyr Lys Thr Thr fto Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe. 195 200 20S

Pfe uu T,r ser ,ys Thr vaT Asp L,s ser frg xrp Gln G1n .ly

Asn val Phe Ser cys ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His 225 230 235

Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 245 250 <210> 13 <211> 260 <212> PRT <213>人邊 imi ANPxy-L4«:lab (蛋白質)-2 <22〇> <221> MISC 特徵 <222> Cl)..C260) <22 3>該蛋白質可二聚化 <400> 13

ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg He Gly IS 10 IS

Ala Gin ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr Gly Gly Ser Gly 20 25 30

Gly ser aly Gly Ser Gly Gly C^s Pro Pro cys pro Ala Pro pro val

Ala Civ ,ro ser val Phe ,eu Phe Pro Pro ,ys ,ro LyS ASp Thr uu

Met rle ser Arg Thr pro Glu val Thr cys val val val Asp val ser 65 ?0 75 80

His Glu Asp pro Glu val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly val Glu 9 200906849 85 90 95 val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Ar| Glu Glu Gin Phe Asn ser rhr 100 10 110

Phe Arg val val Ser val Leu Thr val val His Gin asp Trp Leu Asn US 120 125

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val sei* Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 130 135 140 lie Glu Lys Thr He ser Lys Tlir Lys Gly GTn Pro Arg Glu pro Gin 145 ISO 15 S 160

Val Tyr Thr Leu pro Fro ser Arg gTu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val 165 170 175

Ser Leu Thr c^s Leu val Lys Gly Phe Tyr pro Ser Asp lie Ala Val 185 190

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Glr Pro Glu Asn Asn Tvr Lys Thr Thr Pro

195 200 20S pro Met Leu Asp ser Asp Gly Ser phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr 2X0 215 220 vaT Asp Lys $er Arg Trp Gin Gin Gly Asn vaT Phe Ser Cys Ser val 225 230 235 240

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys ser Leu ser Leu 245 2SO 255 ser Pro Gly Lys

ZdO <210> 14 <211> 222 <212> PRT <213> 人 ii. <220> <223> FclAB <4〇〇> 14

Cys Pro pro cys A]a Pro 幻11 Leu LeiJ Gly Gly pro ser va*1 Phe 1 5 l〇 IS

Leu Phe Pro Pro Lys pf>〇 Lys Asp Thr Lew Met lie ser Arg Thr Pro 20 25 30 10 200906849 QTu val Thr Cys vaT val val Asp Val Ser ms g»u asp Pro slu Val 35 40 45

Lys Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Typ Asn Ser Thr Tyr Arg vaT val ser Val 65 70 75 SO

Leu Thr val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu ryr Lys cys 85 90 95

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie ser 100 105 110

Lys Ala Lys GTy Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 115 120 125 ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr cys Leu Val 13§ 一- 135 140

Lys 145 .Gly Phe Tyr ργό ser Asp lie Ala val Glu Trp Glu ser Asn Gly

1SS 160

Gin Pro Glu Asn asd Tyr Lys Thr Thr .Pro Pro val Leu Asp ser Asp 165 170 175

Cly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr val Asp Lys ser Arg Trp 180 185 190

Gin Gin Gly Asn Val Phe ser cys ser val Met His Glu Ala Leu His 19S 200 205

Asn His Tvr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys 210 21S 220 <210> 15 <211> 28 <212> PRT <213>人造 <220> <223> hANP2«

<400> IS

Ser Leu Arq Arg ser ser cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Χΐδ Gly 1 5 10 15 11 200906849

Ala Gin ser Gly Leu Gly cy$ Asn ser Phe Arg Tvr 20 25 <210> 16 <211> 3-2 <212> pirr <213>人造 <220> <223> hBNP32 <40Q> 16

Ser pro tys Met val Gin Gly Ser 61y cys Phe Gly Arg Lys Met Asp 1.5 10 15

Arg He Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys tys VaT Leu Arg Arg His 20 25 30 <210> 17 <2U> 221 <212> PRT <213>人造 <220> <223> Pc2AS <400> 17

Cys Pro Pro cys pro Ala Pro pro val Ala Gly Pro Ser val Phe Leu 1 S 10 IS

Phe pro pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 val Thr val val val Asp val ser His Glu ASp Pro Glu val ,ln

Phe Asn Trp Tyr val Asp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr tys 50 55 60

Pro Arg Glu al, Gin Phe Asn ser Thr Phe ΑΓβ val val ser va! Leu

Thr Val Val His |1n Asp Trp Leu Asn G^y Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

val Ser Λ,η ^ dy Leu Pro Ma Pro ZU d，Ly, Th, Xle LyS

Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu pro Pro ser 115 120 125 12 200906849

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val Ser* Leu Thr Cys Leu val Lys 130 135 I4D

Civ Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala val Slu Trp Glu Ser Asn <STy <ϊΊπ 14¾ 150 1S5 160

Pro 〇lu Asn Asn T^r Lys Thr Thr ,ro Pro Met Leu Asp Ser Asf ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr vaT Asp tys ser Arg Trp Gin

Gin Gly Asn val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 20$

His .Thi* Gin uys Ser &今y Ser Leu Ser· Pi*o lys 215 220 <210> 18 <211> 239 <212> PRT <213>人造 <220> <223> cysFc-004 <400> 18

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp val Leu Leu Leu Trp val pro 1 5 10 15 iily ser Thr Gly cys Pro Pro cys pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 25 30 pro ser Val Phe Leu Phe Pro pro Lys pro Lys Asp Thr i€u Met lie 35 40 45 55

Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val val val Asp Ser His Gly Asp pro Glu val t*ys Phe Asn 了「p Tyr Val Asp Gly val Glu val His Asn 65 70 75 80

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tgr Asn ser Thr Tyr Arg val vaT Ser val Leu Thr val leu His Gin asp Trp Leu Asn ^1y Lys Glu 100 10 s 110 13 200906849

Tyr (Lys 致I Lys val ser .Asn Ala Leu Pro Ala 幻u 啡

Lys 120 125

Thr lie ser Lys Ala Lys Gly «In pro Arg Glu Pro sin Val lyr Thr 130 135 140

Leu pto pro ser Arg Asp <slu flir l^s Ajn. sin val ser t&s Thr 145 ISO 1SS 160 cys val tys Gly phn tyr Pro Ser Asp lie Ala val Glu Trp ciu ser 165 170 175

Asn fily sin Pro Glu Asn Asrt Tyr L|| ifir Thr pro Pro val Leu Asp iao 190

Asp |1| set* phe Phe Leu T^r ser Lys teu Tlir val .Asp Lys s«r 205 220

扭芝 Asn 的s Tyr Thr Girt Lys Ser Leu ser i-eu ser* Pro sly Lys 225 230 23S <21(^ 19 <21J> 30 <212> prt <213>人造 <220> 4 <223> St.ttA <40Cb 19 Ser Leu m§ Arg |ej« sar cy§ <s]y 〇iy Arg Hat Asp Arg lie y 15

Ala Gin： ser

Leu sly cys Asrt ser Ph€ Arg Tyr Gly |1y <210> 20 <21l> 39 <212> ριϊΤ <22J>人造 <220> <223> littB <400> 20

!er Leu Afg ser4 ser cys Phe Gly Gly Arg 赚f Asp Arg ϊΐθ Gly 5 10 IS 14 200906849

Ala Gin S«r Gly L€〇 Gly cys Asm ser Phe Arg Tyr sly <；ly $er sly 20 ZS 30 &y Ser Sly 6Ty ser ely sly 35 T"* 14"° 2 4 p人 <21〇> <211> <212> <213> <22 Θ> <223>躁肽C <«0> Zl

ser Leu Arg Arg s«r ser cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg He Gly l 5 10 IS

Ala sin ser cly Leu Gly cys Asn ser Fhe Ars Tyr <i1y Ser Gly sly 25 30 δ€Γ <Sly Gly ser sly ser aly sly sir Gly sly 3S 40 <210> 22 <213> 2S <212> fftT, <213>人造 ·<220>· <22 3> &AD <400> 22

ser Leu Arg Arg Ser ser Cys Phe ©1y Sly Arp «et Asp- Arg lie Gly I S 10 IS

Ala sin Ser Gly Leu Gly €ys Astt ser Phe A(*g 丁yr* 20 2S <2105- 23 <211> 3? <212> prt <213>人造 <220>

<22 a> m«AR <400> 23 sly ser Gly Ser Cly Gly Ser Gly ser Arg Arg Ser sej* cys 15' 10 13 15

Phe Gly 6ly Arg !^t Asp Arg lie |1y Ala Gin $$.r qly l^u Gly Cys

Asn Ser f^ie Arg tyr 35

<210> 24 <211> 84B <212> DNA <213>人逢 <220> <22私ANPxy、U-RI為M核穿酸>+信霞序残 <40D> 24 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt agcctgcgga gatccagctg cttcg^gggc aggatggaca ggattggagc ccagagcgga ctg^spctgta acagcttccg gtacggcgga tccggcgggt ccggcgsatc cggcggatgc ccaecetgcc eagccccggia actgctg^gc gg茲ecgtc通g tcxtxctctt cxxccca^^ cexaaiggaca· cxeteat^at ctxcxgg总<x eetga_ggtc通 c孩tgegtggt ggfcgg孩cgtg agccacgaag accctgaggt CMgttcaac tggtacgtgg acc©cgtg§a pgtgcataat gctaagacaa a^ctgcggga §§agcagtac aaca^cacgt accgtgrtggt cagcptcctc auxgtcxtgc &ceaggactg gctga^tggc aaggagtaca aptgcaapgt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga §aaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca capgtgtaca ccctgcctcc atcctgcgat gagctgacca agaaccaggt cagcctgaec tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtg§ agtgggagag caatgfggca^ ccgg兹gaaca 在ctaca在g&c cacgcctccc gtgtirggdct ccg思eg穿etc cttcttcctc t在c在gcaagc txaccgtgg在 caagagcatgg tgacage逢gg ggaaegtett ctxatigctcc gtgatgcatg aggetetgea caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa <21fc 25 <211> 281 <212> PUT <213> <220> <223> ANPxy毛木Fc latK蛋白質H信號序列 <400> 25

Glu Thr Asp Thr Leu Trp val leu leti Trp Val Pro 1 5 10 IS 60 120 1B0 240 300 法60 420 480 540 600 660 720 780 δ40 843 16 200906849 20

Gly ser Thr Gly Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met

Asp Arg He ^ly Ala €ln Ser <ily teu Gly cys ksn Ser Phe Arg Tyr ** 4·0 35 45

SO

Gly Gly ser Gly ser Gp Gly ser Gly Gly gs Pro Pro cys Pro

Ala Pro Glu Leu Leu Gly 6ly pro ser vat Phe lcu Phe pro Pro tys 65 70

Pro Lys Asp Thr Leu Met lie ser Arg Thr pro Glu val Thr cys val

8S 95 val val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys phe Asn Trp Tyr

' ίσο 105 HO val Asp Gly val Glu val His Asn Ala Lys 了hr Lys P£〇 Arg Glu Glu 115 120 125

Gin Ύψ· Asn ser Thr Tyr Arg val vaT ser val Leu Thr VaT Leu His 欲 Asp 了卬 Leu Asn 错 Lys Glu Tyr Lys g| Lys val ser ash 溢

Ala Leu pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin 165 170 175

Pro Arg GTu Pro 5ln val Tyr Thr Leu pro pro ser Arg Asp Glu Leu 180 185 190

Thr Lys Asn G?n val Ser Leu Thr Cys teu val Lys Gly f»he Tyr pro 195 200 205 ser Asp lie A】a. va*[ Glu τ「ρ Glu ser Asn Gly G"ln Pro Glu Asrt Asm 210 215 220

Tyr tys Thr Thr pro Pro val Leu Asp ser Asp Gly ser Phe Phe Leu 225 之30 235 240

Tyr ser Lys ,eu val Lys ser ^ τ.ρ Gln 61n 〇1y Asn Val

Phe Ser cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin 260 265 270 17 200906849

Lys Ser Leu ser ueu Ser pro <i1y Lys <210> 26 <211> 870 <212> Dt^iA <213>人造 <220> <223> AN_Pxy»Lf Fc〗aM核嘗酸>+信號序列 <4D0> 26 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt agcctgcgga gatccagctg cttcgggggc aggatggaca ggattggagc ccagagcgga ctgggctgta acagcttccg gtacggcgga tccggcgggt ccggcggctc cggcggctcc ggcgggtccg gcggatccgg cggatgccca ccgtgcccag ctccggaact gctgggcgga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtxaa gttcaaetgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgcgatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagasca在ct acaagaccac gcctcccgtg ttggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa <210> 27 <Z11> 290 <212> PRT <213>人造适訖ANPxy-L6*Fc〗ab (蛋白質)+信號序列 <400> 27

Mat Glu Thr asp Thr Leu teu teu Trp val Leu Leu ueu Trp val Pro 1 5 10 15

Gly ser Thr Gly Ser Leu A「g Arg ser Ser cys Phe Gly Gly Arg Met 20 25 30 60 120 180 240 300 360 420 4SD 540 600 660 720 780 840 870 18 200906849

Asp Arg He Gly Ala G'ln ser GTy Leu cTy Cys ash Ser Phe Arg Tyr 35 40 45 Gly Gly ser G】y Gly se广 Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly 50 55 60 <3Ty ser Gly Gly cys Pro pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly sly pro ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 85 90 95 Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val val val Asp Val Ser His Glu 100 105 110

Asp Fro Glu val Lys Phe Asn Trg Tyr val Asp Gly val Glu val His

Asrs Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu Glu Gin ^yr Asn Ser Thr Tyr Arg 130 135 140 val vaT Ser Val Leu Thr val teu Nis Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 145 ISO 155 160

Glu Tyr Lys cys Lys val ser Asn Lys A；^ Leu pro Ala Pro 13 Glu 7 16S 170 175

Lys Thr lie ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr y 180 185 19〇

Thr Leu Fro Pro ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 195 200 205

Thr cys Ueu val lvs <sly Phe Tyr Pro ser Asp He Ala val Glu Trp 210 215 220

Glu ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr lvs Thr Thr Pro Pro val 225 230 235 240

Leu Asp ser Asp Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp

Lys ser Arg Trp Gin Gly Asn val Phe Ser Cys Ser Met His 260 265 270

Glu Ala teu HIS ASh His Tyr Thr Gin Lys Ser L€u Ser teu Ser pro 275 280 2S5 19 200906849 <210> 28 <211> S40

<212> DUA 人造 <22D> ^ ^ <223> ANPxy-核苷酸)+信號序列 <40Q> 28 atggagacag acacaetcct gctatg^gta ctgctgctxt 旮pgttccagg ttccactggt e〇 a§cctgc§ga garccagctg cttcgggagc ^gatflgaca ggattggagc ccagsgcgga 120 ctgggctgta acagcttccg gtac^tgga tccggcgggt ccggcggatc cggtggatgt 1H0 ccaccttgcc cagcaccacc tgtggcagga ccttcagtct tcctcttccc cccaaaatcc 240 兹sggac翕cce t:gartgiitctc ca§aacccc:t g孩ggtcacgt gcgtggtggt ggstcgtgdigc 300 cacgaagacc ccpaggtcca gttcaactgg tacgtggacg SCQtsgaggt gcataatgcc 360 aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc 420 gtcgtgcacc aggactggct g^acggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagpc 480 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag ^gc^gccccg agaaccac^g S40 gtgtacaccc tgcceecatic ccggga^g压g atgaccaaga 在ccsggtcag cct§袅cctgc 600 ctegtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt 9B939^Scaa tgggcagccg 660 gagaacaact acaagitccac acctcccatg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 720 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcaggg§a acgtcttctc atgctccgtg 780 atgcatgagg ctctgcaeaa ccactateaca ca^aagagcc tctccctptc tccgggtaaa 840 <21Q> <21l> 280 <212> PRT <213>人造 <220>

<22办AMPx^L本蛋白質）+信號序列 <400> 2S wet Glu Th r asp it* r teu uu teu 了rp val Leu wu leu 丁fp val Pro

1 S i〇..... IS

Cly Ser Thr aly ser lw Arg Arg Ser ser Cys Phe sly sV Arg Net 20 25 30

Asp Arg 1¼ <sly Ala aln Ser Gly L^y Gly cys «η ser Phe Arg Tyr 35 40 45 20 200906849

Gly |ly ser Gly Gly Ssr Gly Gly ser Gly Gly c^s Pro pro cys Pro

Ala Pro pro vaT Ala Gly Pro Ser VaT Phe Leu Phe Pro pro Lys pro 65 70 75 80

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu val rhr Cys Val val 85 90 95

Val asd val ser His GTu Asp Pro Glu Val Gin ?he Asn Trp Tyr val 100 10S 110

Asp Gly val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 115 120 125

Phe Asn Ser Thr Phe Arg val val ser val Leu Thr val vaT His Girt 130 135 140

Asp Trp Leu Asn Gly L|s Glu Tyr lys cys Lys val ser Asn Lys Gig

Leu pro Ala Pro lie 61 ϋ Lys Thr He Ser Lys Thr Lys Gly Gin pro 165 170 175

Ara Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu pro Pro ser Arg Glu Glu Met Thr 180 18S 190

Lys Asn Gin val ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro ser 195 200 205 ASP lie Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 210 215 220

Lys Thr THr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Oly Sar Phe ,he teu T^r ser Lys Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin aly Asn va) Phe 245 2S0 2S5

Ser Cys ser val Met his Glu ATa Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 260 265 270

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly l.ys 275 280 <210> 30 21

Cys Phe Gly Gly Arg Met 200906849 <2H> S6? <2H> DMA <233>人造 <220> <223>八】视\>-1*64^:2油《核蝥酿)+信ft序列 <400> 30 ^tteaflacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttcoiQQ ttccactggt agcctgcsga gatccagctg cttcgggggc aggaxggaca ^gartggagc ccagagcgga ctgtQctgta ae為gcttccg gt政cggcgga tccggcgggrt ccggcggctc cs§cggctce ggcgggtccg fcggatccgg cggatgccca ectrtgox在g cacracctgt ggca^g^cxt te&gtcttcc tcttccccxc 茲孩Mcccaag. g^c^ccctga tgatctccag ^.acxcctga^g gtcacgtgcg t^t〇®tgga cgtsagccac gaagaccccg aggtccsgtt caactggta.c gtggacggcg tfgaggtgca taatgccaag acaaagccac ggg^ggagca gttcaacagc acgttccgtg tggtcagcgt cctcactgtc gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa accata违gggc iagcxcxg在g茲这ex扣:遂ggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggaga丈g atcaagaacc eggtc^gcct ^acctgcctg gttaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gt^gagtggg 在gajica在tgg gcagccggag a通caactac3 这g送ccacacc tcceatgctg g&rtccgacg gctccttctt tctctacagc aagttcaccg tggacaagag caggtggcag caogggaacg tcttctcatg ctccgtgatg ratgaggctc tgcacaacca ctacacacag aag迳gcctct cectgtctxc gggt逢基a <210> 31 <211> 2 餺

<212> ^RT <213> Ask ANPxy4j^R2aM蛋白寶)+譆號序列 <40〇> 31

Met βΐυ thr Asp Thr mil Leti l糾丁rp val tey teu Leu Trp PrG 1 5 10 15 G1y se. Thr gy ser U« Ar9 Arg Ser S6r

Asp Arg lie sly Ala Gin Gly Leu Gly cys A'sn ser* rte AT® tyr 35 40 45 <Slv Gly ser sly Gly ser* Gly Gly Sef Gly Gly Set* Gly Cly S«r SO 55 60 60 120 180 240 SOD 360 420 4舫 540 600 660 720 78D 840 867 22 200906849

Gly Ser Sly Gly cys pro Pro rs p7 a A1 ro s cy

Pro val Ala Gly Pro 80 ser val Phe Leu Phe pro pro 85

s. A s νδ L9 o Γ p ys L

Thr Leu He Ser 95

Arg Thr Pm <Slu val Thr Cys 100 al V 1 5valo 1 a v

Pro Glu val Giri Phe Asn trp 115 p s Λ 1 a V Γ o- s

s. 1 A G val ser Mis <»1u A$pno

val Glu val His Asn 12 S

Ala Lys Thr Lys pro Arg elu 130 13S sl A e h p n I G u 61 ser Thr· Phe Arg Val 140

Val ser val Leg Tlir val Val 145 ISO

1 6 s ami H

Γ 5 X X p s A

Leu A.sn <3ly Lys Glw 160

Tyr Lys cys Lys val ser Mnies

Π p y o e-7 L. X V <sl ys L

aU pro ne GTu Lys 1?S

Thr lie ser L|s Thr tys <»ly 1 G 9 Γ A 05 r 8 F 1 n 61 pro Sin Val Tyr Thr 190

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Gltr 1§5 s Ly Γ h T etDO M2

Gfn val Ser i.eu ilir 205 cy$ Ley val Lys Qly Phe Tyr 210 215 11 p s A er s £ p

Ala val G1m Trp Glu 220

Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 22S 230

1P2 5 Ly r ry n s A

Thr Pro Pro Met Leu 240

Asp Ser Asp STy Ser Phe Phe 2.45

y L er50 s 2 Γ Ty y e L

Leu flir Val Asp Lys 255 ser Arg Trp GTn Glo Gly Asn 260

1- 3 V

Ala Leu His Asn His Tyr Thr 275 62

y 0 c L Γ Γ 0 e s s 65 s h6. y P2 L ser val Net His ,1u ser Leu： ser pro sly 285

Lys <21〇> 32 23

<211> X5 <212> WT <213>人造 <2之3>老鼠1# |[輕鏈儅貌序列 <400> 32 r Thr asp r im teu rrp val 10 pro uly ser Thr

Sy <210> <212> <2I3> 33 783 mA ^ AN：^L4^Fclab (tt § m <>33 a^icctgcgga gatccagc^g cttcggssgc aggatggaca ggattggagc ccagagcgga ctgggctgta acagcttccg gtacggcgga tccggcgggt ccggcggatc cggcggatgc ccaccgtgcc cagctccgga actgctgggc ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa ctcaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgag^t caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gcc在agacsa agccgcgggst ggsgcsgtac 及acagcacgt accgtgtggt c^^cgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca a^tgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga ga^aaccatc tccaaagcca aa^ggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc 送tcccgcgat gmgctgstcca agaustec:茲@gt; tgcxtggtc在狂狂g旮cttxt在 txccagcgdC 在tcgcegtrgg 鼓gtgggagag caatgggc酱g ccggagaaca actacaagac tacgcctccc gtgttggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcafg tggcagcagg ggaacgtttt ctcatgctcc gtgatpc往tg eggctxtgca caaccactac 孩 cgcagaaga gcctctccct gtctecgggt 孩及欲 <210> 34 <2I1> BIO <212> ΠΗΑ <213>人:造 ^220> <22 B> A.NPw，L64ic 1 油（筏苷酿> <400> 34 agcctgc§ga ^atccagctg cttcgggggc aggats^ata ggattggagc ccagagcgga ctgggctgta acagcttccg gtacggcgga tccggcgggt-ccggcggctc cggcggctcc ggcgggtttg gcggatccgg cggatgccca ccgtgcccsg ctccggaact gctgggcgga 60 120 180 240 300 420 4βΟ S40 600 660 720 7S0 783 60 120 180 24 200906849 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtc在 cat gcgtggnggt 93这cgtgagc c迕eg鸢在gacc ctgsggtc霣这 gtte违sctgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagt c^cgggagga gcagtacaac ageacgtacx gtgtggtc狂9 c^tcctcacc gtcctsK：衣ee 在5¾这ct:ggct: g&attggcaag gagtacajigt gcaaggtctc casteaaagce ctcceagccc cc袅tegag兹这 saccittctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gt^tacaccc tgcccccatc ccgcgatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggc^fccg gagaacaact acaagaccac gcctccegtg ttggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg dgcagggg& 这cgtelrlxtc 3t:gctcegtg 在irgcatg这gg trtrctgcicaa ec^ctacacg ca^tagagcc tctccctgtc teeg^gtaaa <210> 35 <2U> 7E0

<212> DNA <Π3>人造 ;^220> «223> ANPx.y-L4-Pc.2ab(核菇靉》 <4〇0> 35 agcctgcgga g违tccagcti cttcgggggc aggiitggAC这 ggattggagc ccag在gegg违 ctgggctgta acagcttccg gtacggcgga tccggcgggt ccggcggatc eggeggatge ecaccttgcc esigc玫ccace tgtggcatgga cettxagtcl: tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tgatgatctc cagaacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggscgtgagc cacgaagacc ccgaggtcta gttcaacrgg tacgtggacg gcptggaggt gca^aatgte 孩孩gc这孩这gc caLcgggagg违 gcagttc这ac 这gcacgttcic gtgtggtcuigi cgtcctc&ec gtegxgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caaca^ggc ctcccagccc ccatcgagta aaccatctec aaaaccaaag ggcapccccp agiiaccacmg gtgtacaccc tgcccccatc ccgggag^ag at^accaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtx涯aag gettet我ccc cagcg^catc gccgtggagi gggsgagea基 t§ggcagccg gagaacaact acaagaccac acctcccatg ctggactcc^ atggetcett cttcctctac ^gcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg citecatflagg ctctgcacam ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa <210> 36 <211> 807 <212> DNA <213>人造 240 JOO 360 420 4SG 540 600 660 im 780 810 60 120 180 MO 3D0 360 420 480 540 600 660 720 780 25 200906849 <220> <223> ANPxy-L6-Fc2.ab (核苷酸） <40〇> 36 agcctgcgga gatccagctg cttcgggggc aggatggaca ggattggagc ccagagcgga 60 ctgggctgta acagcttccg gtacggcgga tccggcgggt ccggcggctc cggcggctcc 120 ggcgggtccg gcggatccgg cggatgccca ccttgcccag caccacctgt ggcaggacct 180 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctga tgatctccag aacccctgag 240 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 300 gtggacggcg tggjaggtgca taatgccaag acaaagccac gggaggagca gttcaacagc 360 acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc gtgcaccagg actggctgaa eggcaaggag 420 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 480 accaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 540 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 600 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacacc tcccatgctg 660 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 720 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 780 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 807 26

Claims

200906849 十、申請專利範圍： 1. 一種包含利尿鈉胜肽及抗體Fc區段的融合蛋白質，其中該利尿鈉胜肽直接或經由連結子結合至該Fc區段。 2. 如申請專利範圍第1項之融合蛋白質，其中該融合蛋白 5 質包含下列式： X-La-F : F-La-X或 X-La-F : F，其中， X為利尿納胜肽； L為包含胺基酸殘基的連結子； 10 a為至少0的整數； :為化學締合或交聯；及 F為包含一FcRn黏結位置的免疫球蛋白Fc區段之至少一部分。 3_如申請專利範圍第1或2項之任何一項的融合蛋白質，其 15 中該利尿鈉胜肽選自於由下列所組成之群組：ANP、 BNP、尿鈉素、DNP或其生物活性序列變體。 4. 如申請專利範圍第1或2項之任何一項的融合蛋白質，其中該利尿鈉胜肽為ANP或BNP。 5. 如申請專利範圍第1或2項之任何一項的融合蛋白質，其 20 中該融合蛋白質包含至少二個利尿鈉胜肽。 6. 如申請專利範圍第1、2或5項之任何一項的融合蛋白質，其中二利尿鈉胜肽為ANP。 7. 如申請專利範圍第1、2或5項之任何一項的融合蛋白質，其中二利尿鈉胜肽為BNP。 200906849 :申叫專利範圍第丨或2項之任何—項的融合蛋白質，其融合蛋白質包含至少二個Fc區段。 9·如申請專利_第丨或2項之任何—項的融合蛋白質，其中該連結子為6個絲酸長、11個胺基酸長、關胺基 5 酸長或2〇個胺基酸長。 1〇_如申請專利範圍第U2項之任何一項的融合蛋白質，其中該連結子為6至11個胺基酸長、^16個胺基酸長、 16至20個胺基酸長、16JL25個胺基酸長或如至删胺基酸長。 10 11·如中請專利範圍第_項之任何—項的融合蛋白質，其中該連結子為甘胺酸琥珀酸鹽連結子、胺基酸連結子或其組合。 12·如申請專利範圍第1或2項之任何一項的融合蛋白質，其中該胺基酸連結子為GlyGly (L2)、 15 Gly(SerGlyGly)2SerGly (L3) (SEQ ID NO ： 2) ' (GlyGlySer)3GlyGly (L4) (SEQ ID NO : 3)、 (GlyGlySer)4GlyGly (SEQ ID NO : 4)、（GlySerGly)5Gly (L5a) (SEQ ID NO : 5)、（GlyGlySer)5Gly (L5) (SEQ ID NO : 6)或(GlyGlySer)6GlyGly (L6) (SEQ ID NO : 7)。 2〇 13. —種包含至少一或多個藉由抗體Fc區段彼此分離的利尿鈉胜肽之融合蛋白質，其中該利尿鈉胜肽直接或經由連結子結合至該Fc區段。 14.如申請專利範圍第13項之融合蛋白質，其中該融合蛋白質包含下列式： 200906849 X-La-F : F-La-X，其中 X為一或多個利尿納胜肽； L為包含胺基酸殘基的連結子； 5 a為至少0的整數； :為化學締合或交聯；及 F為包含一FcRn黏結位置的免疫球蛋白Fc區段之至少一部分。 15. 如申請專利範圍第14項之融合蛋白質，其中X為多於一 10 個利尿鈉胜肽。 16. 如申請專利範圍第13或14項之任何一項的融合蛋白質，其中該利尿鈉胜肽選自於由下列所組成之群組： ANP、BNP、尿鈉素、DNP或其生物活性序列變體。 17_如申請專利範圍第13或14項之任何一項的融合蛋白 15 質，其中該利尿鈉胜肽為ANP或BNP。 18_如申請專利範圍第13或14項之任何一項的融合蛋白質，其中二利尿鈉胜肽為ANP。 19_如申請專利範圍第13或14項之任何一項的融合蛋白質，其中二利尿鈉胜肽為BNP。 20 20.如申請專利範圍第13或14項之任何一項的融合蛋白質，其中一個利尿鈉胜肽為ANP及另一個為BNP。 21.如申請專利範圍第13或14項之任何一項的融合蛋白質，其中該連結子為6個胺基酸長、11個胺基酸長、16 個胺基酸長或20個胺基酸長。 3 200906849 22_如申請專利範圍第13或14項之任何一項的融合蛋白質’其中該連結子為6至η個胺基酸長、11至16個胺基酸長、16至20個胺基酸長、16至25個胺基酸長或2〇至3〇個胺基酸長。 5 23·如申請專利範圍第13或14項之任何一項的融合蛋白質，其中該連結子為甘胺酸琥珀酸鹽連結子、胺基酸連結子或其組合。 24.如申請專利範圍第13或14項之任何一項的融合蛋白質，其中該胺基酸連結子為GlyGly(L2)、 10 Gly(SerGlyGly)2SerGly (L3) (SEQ ID NO : 2)、 (GlyGlySer)3GlyGly (L4) (SEQ ID NO ： 3) > (GlyGlySer)4GlyGly (SEQ ID NO : 4)、（GlySerGly)5Gly (L5a) (SEQ ID NO : 5)、（GlyGlySer)5Gly (L5) (SEQ ID NO : 6)或(GlyGlySer)6GlyGly (L6) (SEQ ID NO : 7)。 15 25·如申請專利範圍第13或14項之任何一項的融合蛋白質’其中該連結子為6個胺基酸長、11個胺基酸長、16 個胺基酸長或20個胺基酸長。 26. 如申請專利範圍第卜2、13或14項之任何一項的融合蛋白質，其中該融合蛋白質比相應的野生型利尿鈉蛋白質 20 更具抗蛋白分解降解性。 27. 如申請專利範圍第1、2、13或14項之任何一項的融合蛋白質’其中該融合蛋白質顯示出具有比相應的野生型利尿鈉蛋白質長之半生期。 28. 如申請專利範圍第1、2、13或14項之任何一項的融合蛋 200906849 白質，其中該融合蛋白質藉由重組技術、合成化學或半合成化學製得。 29. —種利尿鈉融合蛋白質，其包含SEQ ID NO : 之任何一種。 5 30· —種利尿鈉融合蛋白質，其包含SEQ ID NO : 12-13之任何一種。 31. —種經分離的多胜肽，其與具有選自於由下列所組成之群組的序列之多胜肽具有至少90%的序列同一性：SEq ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ id NO: 10 11。 32. —種經分離的多胜肽，其與具有選自於由下列所組成之群組的序列之多胜肽具有至少90%的序列同~性：seq ID NO : 12及 SEQ ID NO : 13。 33. 一種經分離的多胜狀，其與具有選自於由下列所組成之 15 群組的序列之多胜肽具有至少95%的序列同一性：seq ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及 SEQ id NO : 11 ° 34. —種經分離的多胜肽，其與具有選自於由下列所組成之群組的序列之多胜肽具有至少95%的序列同一性：SEq 2〇 ID NO : 12及 SEQ ID NO : 13。 35. —種經分離的多胜肽，其與具有選自於由下列所組成之群組的序列之多胜肽具有至少99%的序列同一性：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及 SEQ id NO : 200906849 36. —種經分離的多胜肽，其與具有選自於由下列所組成之群組的序列之多胜肽具有至少99%的序列同一性：SEQ ID NO : 12及 SEQ ID NO : 13。 5 10 15 37· —種經分離的核酸分子，其編碼一種包含選自於由下列所組成之群組的胺基酸序列之多胜肽：SEQ ID NO : 8、 SEQ ID NO : 9、SEQ ID NO : 10 及 SEQ ID NO.U。 38. —種經分離的核酸分子，其編碼一種包含選自於由下列所組成之群組的胺基酸序列之多胜肽：SEQ ID NO : 12 及 SEQ ID NO : 13。 39· —種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第丨、2、13或 14項之任何一項的融合蛋白質。 4〇·如申請專利範圍第39項之藥學組成物，其中該融合蛋白質適用於靜脈内、皮下或口服給藥。 41.如申請專利範圍第39奴藥學組成物，其中該融合蛋白質適用於靜脈内給藥。 42·如申請專職圍W、2、u幻4奴純—項的融合蛋白質’其中紐合蛋白質❹哺乳動物、原核生物、酵母菌、植物或轉殖基因表現系統重組地製造。 ^種如巾料·_39項之藥學㈣物的料，其使來製造用於治療或改善特徵為細胞外流體的症狀之藥劑。幻夕 St申請專利範圍第39項之藥學組成物的用途，其矛J益的病理症狀之藥劑。 20 200906849 45. —種如申請專利範圍第39項之藥學組成物的用途，其使用來製造用於治療或改善與利尿、利尿鈉及血管擴張活性異常相關的疾病之藥劑。 46. —種如申請專利範圍第39項之藥學組成物的用途，其使 5 用來製造用於治療或改善想要引發利尿鈉、利尿、血管擴張或調整腎激素血管緊縮素II及醛固醇系統的疾病之藥劑。 47. —種如申請專利範圍第39項之藥學組成物的用途，其使用來製造用於治療或改善選自於由下列所組成之群組 10 的心血管系統之病理症狀的藥劑：慢性心臟衰竭（非缺血）、再灌注損傷、左心室機能障礙(LVD)、心臟纖維變性、舒張性心臟衰竭及肥厚型心肌病。 48. —種如申請專利範圍第39項之藥學組成物的用途，其使用來製造用於治療或改善選自於由下列所組成之群組 15 的高血壓病症之藥劑：高血壓、肺動脈高血壓、收縮期高血壓及頑固型高血壓。 49. 一種如申請專利範圍第39項之藥學組成物的用途，其使用來製造用於治療或改善糖尿病性腎病的藥劑。 7