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TW201442721A - 糖鏈修飾心房利尿鈉肽 - Google Patents

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TW201442721A
TW201442721A TW103102204A TW103102204A TW201442721A TW 201442721 A TW201442721 A TW 201442721A TW 103102204 A TW103102204 A TW 103102204A TW 103102204 A TW103102204 A TW 103102204A TW 201442721 A TW201442721 A TW 201442721A
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compound
sugar
peptide
modified peptide
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TW103102204A
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Mitsuhiro Iwamoto
Takahiro Yamaguchi
Yutaka Mori
Keiji Saito
Takeshi Honda
Takahiro Nagayama
Original Assignee
Daiichi Sankyo Co Ltd
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Abstract

本發明係提供血中持續性被延長，且保持cGMP上升活性的修飾心房利尿鈉肽。本發明係提供一種修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽、含有該修飾胜肽或其鹽作為有效成分的醫藥等；該修飾胜肽係至少一個之糖物質直接藉由醣苷鍵連結、或藉由連結構造(linker structure)，與至少一個之hANP胜肽連結的修飾胜肽。

Description

糖鏈修飾心房利尿鈉肽
本發明係關於鍵結糖鏈、血中之持續性被改善之糖鏈修飾心房利尿鈉肽、含有其作為有效成分之醫藥等。
心房利尿鈉肽(atrial natriuretic peptide)係具有血管擴張作用、利尿作用細胞增殖抑制作用、靜脈回流量之降低作用、及交感神經活性抑制作用的生物活性胜肽。天然型之hANP因經由血中之中性內肽酶(NEP)切斷而喪失活性、血中半衰期短，故於目前的臨床上，有必要經由點滴等的連續投予。
就延長血中半衰期短的生物活性胜肽之血中半衰期的嘗試而言，可舉例緩釋型製劑之應用、胺基酸之取代或修飾、使白蛋白、免疫球蛋白Fc部分等連結的融合胜肽、附加PEG等之高分子的修飾胜肽等各式各樣的方法。為了應用於利用生物活性胜肽之生物活性的醫藥，有必要將該胜肽所具有的生物活性保持於藥理上必要的程度、延長血中半衰期。所謂將此種延長血中半衰期的生物活性胜肽應用於醫藥的嘗試係已對許多胜肽進行。
於非專利文獻1(Procc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12544-12548)、非專利文獻2(Bioconjugate Chem. 2008, 19,342-348)，已揭示使PEG結合於心房利尿鈉肽(ANP)的修飾胜肽。
專利文獻1(WO2006/076471 A2)中已揭示使PEG結合於腦利尿鈉肽(BNP)的修飾胜肽。
專利文獻2(WO2008/154226 A1)、非專利文獻3(Bioconjugate Chem. 2012, 23, 518-526)中已記載使免疫球蛋白Fc部位結合於ANP的融合蛋白質。
專利文獻3(WO2004/047871 (A2,A3)、專利文獻4(WO2009/142307 A1)中已揭示改變ANP之胺基酸序列的變異體。
然而，未必成功。尤其，可否兼具充分的血中滯留時間、及保持藥理效果所必要的活性，如未實際進行許多試驗的話則無法預測。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1 國際專利公開公報WO2006/076471
專利文獻2 國際專利公開公報WO2008/154226
專利文獻3 國際專利公開公報WO2004/047871
專利文獻4 國際專利公開公報WO2009/142307
非專利文獻
非專利文獻1 Procc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12544-12548,
非專利文獻2 Bioconjugate Chem. 2008, 19, 342-348)
非專利文獻3 Bioconjugate Chem. 2012, 23, 518-526
[發明概要]
本發明係以發現與天然型之人類心房利尿鈉肽(hANP)比較，其血中持續時間被延長，且保持cGMP上升活性的改良胜肽為課題。
本發明者等專心檢討血中持續時間被延長，且保持cGMP上升活性的hANP之修飾的結果，發現以各式各樣的方法使糖鏈鍵結於hANP的修飾胜肽，對GC-A受體表現細胞使細胞內cGMP濃度上升，投予至小鼠時之血中持續時間被延長，此時，即使修飾胜肽投予60分鐘以後，血中之cGMP濃度亦持續地上升等，遂而完成本發明。
本發明提供以下各者。
(1)一種修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其係至少一個之糖物質直接藉由醣苷鍵的連結、或藉由連結構造(linker structure)，而與至少一個之hANP胜肽連結的修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽。
(2)如(1)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係於hANP胜肽之N末端、C末端、及構成胜肽之至少一個之胺基酸的側鏈的至少一處，直接藉由醣苷鍵連結、或藉由連結構造而連結。
(3)如(1)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中hANP胜肽係hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)。
(4)如(1)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係選自至少一種類之單糖類、雙糖類、三糖類、及4個以上之單糖類作醣苷鍵結而成的糖鏈，且一分子中含有複數個糖物質的情形，彼等可為相同，亦可為彼此相異。
(5)如(1)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係4個以上之單糖類作醣苷鍵結而成的糖鏈。
(6)如(5)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係來自糖蛋白質之N鍵結型糖鏈、O鍵結型糖鏈、或彼等之改質糖鏈。
(7)如(6)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質包含下式所表示的糖鏈構造的N鍵結型糖鏈或其還原末端改質糖鏈。
(式中，Gxx係GlcNAc、Glc或Man(包含上述構造的糖鏈，以下，因應GXX的種類而各自稱為「AG(5)」、「AG(5-Glc)」、及「AG(5-Man)」)，『O/N-L』表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵而與連結構造或hANP胜肽鍵結)。
(8)如(7)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係含下式所表示的糖鏈構造的糖鏈，
(式中，Gxx係GlcNAc、Glc或Man(包含上述構造的糖鏈，以下，因應GXX的種類而各自稱為「AG(7)」、「AG(7-Glc)」、及「AG(7-Man)」)，『O/N-L』表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵而與連結構造或hANP胜肽鍵結)。
(9)如(8)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係含下式所表示的糖鏈構造的糖鏈，
(式中，Gxx係GlcNAc、Glc或Man(包含上述構造的糖鏈，以下，因應GXX的種類而各自稱為「AG(9)」、「AG(9-Glc)」、及「AG(9-Man)」)，『O/N-L』表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵而與連結構造或hANP胜肽鍵結)。
(10)如(9)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係含下式所表示的糖鏈構造的糖鏈，
(式中，Gxx係GlcNAc、Glc或Man(包含上述構造的糖鏈，以下，因應GXX的種類而各自稱為「SG」、「SG(Glc)」、及「SG(Man)」)，『O/N-L』表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵而與連結構造或hANP胜肽鍵結)。
(11)如(7)~(10)中任一項之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中於糖物質，Gxx係GlcNAc。
(12)如(11)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係SG。
(13)如(1)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中對於1個hANP胜肽，連結10個以下之糖物質。
(14)如(1)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中對於1個hANP胜肽，連結1個、2個、或3個之糖物質。
(15)如(1)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中1分子中含有2價以上之hANP胜肽。
(16)如(3)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中hANP胜肽與糖物質係藉由連結構造而連結，而連結構造係具有3個原子以上之連結鏈，於至少一處，與糖物質之還原末端作醣苷鍵結，且於至少一處，與hANP胜肽鍵結的化學構造。
(17)如(16)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係於hANP胜肽之N末端、C末端之任一者、或其兩者，藉由連結構造而連結。
(18)如(17)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中連結構造係具有15個原子以下之連結鏈的構造。
(19)如(18)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其係SG-hANP(1-28)(化合物2-1)、hANP(1-28)-SG(化合物2-2)、SG-hANP(1-28)-SG(化合物2-7)、AG(9)-hANP(1-28)(化合物2-10)、SG-三唑-hANP(1-28)(化合物2-12)、SG-硫乙醯胺-hANP(1-28)(化合物2-25)、AG(5)-hANP(1-28)(化合物2-26)、 或者於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)者。
(20)如(16)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中連結構造含有聚氧伸烷基鏈、胺基酸、及包含2個以上之胺基酸的寡肽鏈中的至少一個之構造。
(21)如(20)之修飾胜肽，其中含於連結構造的聚氧伸烷基鏈、胺基酸及/或寡肽鏈係與hANP胜肽之N末端及/或C末端作醯胺鍵結。
(22)如(21)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中聚氧伸烷基鏈係PEG。
(23)如(21)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其係SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-16)、AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-21)、AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-22)、SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG(化合物2-24)、SG-(SG-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-27)、SG-(SG-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-28)、SG-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-29)、SG-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-30)SG-*(SG-)Gln-Mal-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-31)SG-(SG-)Gln-PEG(3)-Mal-hANP(1-28)(化合物 2-32)、SG-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28)(化合物2-36)SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28)(化合物2-37)、 或者於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man),、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)者。
(24)如(20)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中連結構造含胺基側鏈胺基酸、SH側鏈胺基酸、羧基側鏈胺基酸、羥基側鏈胺基酸或苯酚側鏈胺基酸之至少一個之官能基側鏈胺基酸，且於該官能基側鏈胺基酸之側鏈，與糖物質或hANP胜肽連結。
(25)如(24)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中連結構造含至少一個之胺基側鏈胺基酸，且糖物質連結於該胺基側鏈胺基酸之側鏈，且具有以下通式(C)之構造，
(式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上；GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY；N-(AA)係表示來自胺基側鏈胺基酸之側鏈之胺基的氮原子)。
(26)如(25)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中胺基側鏈胺基酸之側鏈胺基及α胺基係與其他胺基酸之α羧基形成醯胺鍵。
(27)如(25)或(26)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中胺基側鏈胺基酸係Lys。
(28)如(27)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其係SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28)(化合物2-14)、[(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28)(化合物2-15)、SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-19)、[SG2-Mal-(SG2-Mal-)Lys-[SG2-Mal-(SG2-Mal-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-20)、SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-hANP(1-28)(化合物2-33)、SG-硫乙醯胺-(SG-硫乙醯胺-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(化合物2-34)、SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-35)、或者於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)者。
(29)如(24)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中連結構造含至少一個之SH基側鏈胺基酸，且糖物質係連結於該胺基側鏈胺基酸之側鏈，並具有以下通式之構造，
(式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上；GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY；S表示來自SH基側鏈胺基酸之側鏈SH基的硫原子)。
(30)如(29)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中SH基側鏈胺基酸係Cys。
(31)如(30)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其係[(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28)(化合物2-17)、[(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28)(化合物2-18)、SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-23)、或者於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)者。
(32)如(24)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中連結構造含至少一個之羧基側鏈胺基酸，且糖物質係連結於該羧酸側鏈胺基酸之側鏈，並具有以下通式之構造，
(式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上；GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY；CO表示來自羧酸側鏈胺基酸之側鏈的CO)。
(33)如(32)之修飾胜肽，其中糖物質係於羧基側鏈胺基酸之側鏈羧基及α羧基的兩者上作N醣苷鍵結，藉由α胺基與其他連結構造或hANP胜肽鍵結。
(34)如(32)或(33)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中羧酸基側鏈胺基酸係Glu、Gln、ASp或Asn。(35)如(34)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其係(SG-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-3)、(SG-)Asn-hANP(2-28)(化合物2-4)、(SG-)Asn-hANP(3-28)(化合物2-8)、SG-(SG-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-9)、SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-13)，或者於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)者。
(36)如(24)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中連結構造含至少一個之苯酚側鏈胺基酸，且糖物質係連結於該苯酚側鏈胺基酸之側鏈，並具有以下通式之構造，
(式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上；GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY；苯酚基表示來自苯酚基側鏈胺基酸之側鏈的苯酚基)。
(37)如(36)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中苯酚基側鏈胺基酸係Tyr。
(38)如(37)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其係hANP(1-27)-(SG-)Tyr(化合物2-6)或者於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)者。
(39)如(24)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中連結構造含有至少一個之羥基側鏈胺基酸，糖物質係於該羥基側鏈胺基酸之側鏈作O-醣苷鍵結，具有以下通式之構造
(式中，GLY表示糖物質，O表示來自羥基側鏈胺基酸之側鏈羥基的氧原子)。
(40)如(39)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中羥基側鏈胺基酸係Ser。
(41)如(40)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其係(SG-)Ser-hANP(2-28)(化合物2-5)
或者於此等之修飾胜肽，糖物質被SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc取代，及/或hANP胜肽被hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)取代者。
(42)如(16)~(41)中任一項之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，作為糖物質，具有1或2個之SG，作為hANP胜肽，具有1個之hANP(1-28)(序列識別號1)，SG係於hANP(1-28)之N末端，藉由具有10個原子以下之連結鏈的連結構造來連結。又，其中，就本發明之修飾胜肽之藥學上可容許的鹽而言，較佳為三氟乙酸鹽或乙酸鹽。
(43)如(1)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其包含下述之化合物2-1、2-3、2-10、2-11、2-12、2-13、2-14、2-15，2-16，2-25，2-26、2-27、2-29、或2-30之式所表示的構造， (化合物2-3)
(化合物2-15)
(於上述式，hANP係包含序列識別號1之胺基酸序列的hANP(1-28)，於該胺基酸序列之N末端，與連結構造作醯胺鍵結)。
(44)一種如(42)或(43)之修飾胜肽之鹽，其中藥學上可容許的鹽係三氟乙酸鹽、或者乙酸鹽。
(45)如(3)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係連結於hANP胜肽之胺基酸側鏈，該經連結的胺基酸係含於hANP胜肽的序列識別號1之胺基酸編號7~23的胺基酸以外的胺基酸。
(46)如(1)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其與未經修飾的hANP(1-28)比較，顯示經延長的血中持續時間，且保持cGMP上升活性。
(47)如(1)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其係對中性內肽酶(endopeptidase)所致的hANP胜肽的分解具有抵抗性。
(48)如(1)之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其與未經修飾的hANP(1-28)比較，顯示3倍以上之水溶性。
(49)一種醫藥，其含有如(1)~(48)中任一項之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽。
(50)如(49)之醫藥，其係循環器官疾病之治療劑或減輕劑。
(51)一種治療或減輕循環器官疾病之方法，其包含投予有效量之如(1)~(48)中任一項之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽。
(52)一種如(1)~(48)中任一項之修飾胜肽之製造方法，其包含連結hANP胜肽、糖物質、及因應必要的連結分子、被轉移化合物的步驟。
(53)如(52)之方法，其包含使用Endo-M或其變異酵素，而使糖鏈轉移至GlcNAc化合物、Glc化合物或Man化合物的步驟。
本發明之修飾胜肽，由於較未經修飾的hANP(1-28)(以下，亦稱為「天然型hANP」)更為延長血中持續時間，且保持cGMP上升活性，於臨床上，藉由非連續投予來表現藥效或對於以天然型無法獲得治療效果的疾病的應用成為可能。又，本修飾胜肽由於與天然型hANP比較顯示更為優異的水溶解性，對於藉由製劑之高用量化或高濃度化等的多樣的投予方法的應用成為可能。因此，藉由本修飾胜肽，對應以天然型hANP無法達成的多樣的醫療需求成為可能。
第1圖係表示SG-oxa/化合物1-12B之NMR圖譜。
[用以實施發明之形態]
以下，詳細地說明本發明。
本發明係提供至少一個之糖物質直接藉由醣苷鍵、或藉由連結構造，而與至少一個之hANP胜肽連結的修飾胜肽。本發明之修飾胜肽與未經修飾的hANP(1-28)比較顯示經延長的血中持續時間，且保持hANP(1-28)所具有的cGMP上升活性。本發明之修飾胜肽係由自然界分離、人工地管理製造步驟而製造，其構造係實質上均一 的修飾胜肽。本發明之修飾胜肽係不包含天然上可存在的、或於活體內或培養細胞內生理上產生的胜肽，此類天然存在的物質本身係明確地被排除於本發明之範圍。
於本發明，「連結」複數之構造單位(例如，hANP胜肽、糖物質、連結構造等)，係指各自之構造單位直接藉由共價鍵鍵結、或者藉由連結構造間接地鍵結，而存於同一分子中。連結構造單位間的化學構造並未特別限定。以直鏈狀之構造連結的情形，成為於一分子含各自之構造單位一個。藉由分枝的構造連結的情形，於一分子中可含有複數個任何之一者、或兩者之構造單位。連結構造與各自之構造單位之間之鍵結樣式並未特別限定，可因應連結的構造單位之種類來選擇鍵結樣式。
<hANP胜肽>
於本發明，「hANP胜肽」係意指包含含有由28個胺基酸所構成的生物活性胜肽的人類型心房利尿鈉肽(human Atrial Natriuretic Peptide：序列識別號1，以下，亦稱為hANP、或hANP(1-28))之胺基酸序列中至少第7位至第27位之胺基酸的胺基酸序列而成的胜肽。hANP係結合於細胞表面上表現的GC-A受體(Chinkers M,et al.,Nature 338；78-83,1989))，使其受體之細胞內功能域存在的鳥苷酸環化酶(guanylate cyclase)活性化，藉由使細胞內之cGMP濃度上升，而發揮其生物活性。天然型之hANP係記載於Biochem.Biophys.Res.Commun.,118卷，131頁，1984年之α-hANP，以一般名卡培立肽 (carperitide)於日本取得製造販賣認可，而被販售(商品名：HANP)。α-hANP係一般而言亦作為Human pro-ANP[[99-126]]而為已知的。
hANP係序列識別號1之第7位與第23位之Cys殘基彼此作雙硫鍵結，形成分子內環構造。對於藉由hANP之GC-A受體的活性化，已知此環構造與其C末端側至第27位Arg殘基之胺基酸為重要的(Silver,MA,,Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.(2006),15,p14-21、A.Calderone,Minerva Endocrinol.(2004),29,p.113-127)。因此，包含此環構造的hANP(7-27)係被認為是使GC-A活性化的最小單位。就本發明之hANP胜肽而言，係包含於序列識別號1)中，亦可刪除自N末端側連續的1至6個之胺基酸、及/或第28位之胺基酸的胺基酸序列的胜肽，較佳為亦可刪除序列識別號1之第1位、第1位及2位、以及第28位之胺基酸之至少一處的胜肽，更佳為包含亦可刪除序列識別號1之第1位、以及第1位及2位之胺基酸的胺基酸序列的胜肽(hANP(2-28)、hANP(3-28)等)，最佳為包含序列識別號1之胺基酸序列的胜肽(hANP(1-28))。
於本發明之修飾胜肽，就hANP胜肽與糖物質不藉由連結構造而直接鍵結的修飾胜肽之例而言，例如，可例示序列識別號1之第1位、5位、6位、25位之Ser以及第28位之Tyr之側鏈的羥基的任一個或複數個與糖物質直接作O-醣苷鍵結者；序列識別號1之第26位之Asn之側鏈的醯胺基與糖物質直接作N-醣苷鍵結者 (關於製造，藉由將該處所之胺基酸作成Asp，使其與將還原末端疊氮化的糖物質反應，亦可形成醯胺鍵)等。
於本發明之修飾胜肽，hANP胜肽與糖物質藉由連結構造而連結的情形，可採用如以下詳述的多樣的連結構造，使構成hANP胜肽的胺基酸之側鏈的官能基、N末端及/或C末端連結。就使糖物質連結的hANP胜肽上之處所而言，較佳為N末端及/或C末端，更佳為N末端。
本發明之修飾胜肽係於一分子中可含有一個之hANP胜肽，亦可為含2個以上之hANP胜肽之多價的hANP修飾胜肽。多價之hANP修飾胜肽係以對連結構造可連結複數個hANP分子的方式，藉由選擇具有複數個可與hANP胜肽鍵結的官能基的連結分子(linker molecule)而可適宜地製造。
<糖物質>
於本發明，「糖物質」係指包含一個單糖的構造單位、或2個以上之單糖藉由醣苷鍵而鍵結的構造單位。於本發明，糖物質亦有標記為『GLY』的情形。又，具體的單糖或糖鏈，例如，有如『GlcNAc-』、『SG-』的方式，作為縮寫來標記的情形。構造式中，以此等之縮寫記載的情形，除了其它指定的情形之外，於還原末端的第1位碳原子，與連結構造或hANP胜肽作O-或N-醣苷鍵結，歸屬於該醣苷鍵的氧原子或氮原子，除了特別定義的情形外，標記作為不含於表示該糖物質的縮寫者。
於本說明書，關於成為糖物質之基本單位的單糖之記載，除了其它指定的情形外，方便上，於其環構造，與構成環的氧原子鍵結，且與羥基(或歸屬於醣苷鍵的氧原子)直接鍵結的碳原子標記為第1位(僅於唾液酸(sialic acid)為第2位)。實施例化合物的名稱係就化學構造全體而附加者，此規則未必可適用。
就含於糖物質的單糖而言，只要具有糖之基本構造者即可，並未特別限定，可使用6元糖、5元糖等各式各樣者。又，可為天然存在的糖，亦可為人工合成的糖，但天然存在的糖為較佳。就單糖而言，例如，可舉例葡萄糖(Glu)、果糖(Flu)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡糖胺(Glc)、N乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、葡糖醛酸(glucuronic acid)(GlucA)、神經胺糖酸(neuraminic acid)(Neu)、唾液酸/N-乙醯基神經胺糖酸(NeuNAc/Neu5Ac)、半乳胺糖(galactosamine)、N乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、木糖(Xyl)、艾杜糖醛酸(iduronic acid)(IdoA)、岩藻醣(Fuc)、醛丙醣(aldotriose)、甘油醛(glyceraldehyde)、醛丁醣(aldotetrose)、赤藻糖(erythrose)、異赤藻糖(threose)、醛戊醣、核糖、來蘇糖(lyxose)、阿拉伯糖、醛己醣(aldohexose)、阿洛糖(allose)、太洛糖(talose)、古洛糖(gulose)、阿卓糖(altrose)、艾杜糖(idose)、酮丙醣(ketotriose)、二羥丙酮、酮丁醣(ketotetrose)、赤藻酮糖(erythrulose)、酮戊醣(ketopentose)、木酮糖、核酮糖(ribulose)、酮己醣(ketohexose)、阿羅酮糖(psicose)、山梨糖、塔格糖(tagatose)等。
就本發明之糖物質而言，亦可使用單糖作複數個醣苷鍵結的寡糖或多糖。就寡糖而言，只要為所欲之數目的單糖作醣苷鍵結者即可，並未特別限定，但例如可舉例，就雙糖類而言，為蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖(trehalose)等，就三糖類而言，為麥芽三糖(maltotriose)、蜜三糖(melezitose)、棉子糖(raffinose)等，就四糖類而言，為蔗果四糖(nystose)、黑曲黴四糖(nigerotetraoses)、水蘇糖(stachyose)等。又，就多糖而言，例如，可例示直鏈澱粉(amylose)、肝糖、纖維素、甲殼素、聚殼糖(chitosan)、軟骨素、軟骨素硫酸、透明質酸、葡聚糖、葡聚糖硫酸等。
本發明之糖物質可為糖鏈。「糖鏈」係指生物內產生、或經代謝生成之2個以上之單糖作醣苷鍵結的天然糖鏈，或亦可為參考天然糖鏈的構造而加以人工改變的改質糖鏈。天然糖鏈係於動物、植物、微生物等呈糖鏈(糖質)存在、或呈糖蛋白質、糖脂質存在，可藉由自此等單離、純化而取得。改質糖鏈係將天然糖鏈的糖鏈構造作人工改變的糖鏈，就改變之方法而言，可於來自天然的糖鏈，將一個以上之單糖以合成化學或酵素化學地添加、取代、及/或刪除，較佳為使用因應非還原末端之糖的醣苷酶(glycosidase)，而使非還原末端之糖刪除的改變。只要糖鏈所含的單糖之數目為2個以上即可，並未特別限定，但例如可選擇約50個以下、約40個以下、約30個以下等之任意數目，但較佳為約25個以下，更佳為約20個以下，又更佳為約15個以下，再更佳為11個以下。
本發明之糖鏈可為直鏈型亦可為分枝型。直鏈型糖鏈係指含於糖鏈的非還原末端以外之單糖的全部，於其環構造除第1位碳原子之外，僅一個碳原子直接或藉由取代基而與其他單糖的第1位(唾液酸則為第2位)碳原子作醣苷鍵結而直鏈狀地連結的糖鏈。
另一方面，分枝型糖鏈係指含於糖鏈之一個以上之單糖，於其環構造除了第1位碳原子之外，於2個以上之碳原子，直接或藉由取代基而與其他單糖之第1位(唾液酸為第2位)碳作醣苷鍵結而分枝的糖鏈。關於糖鏈，不論為直鏈型或分枝型，環構造之第1位碳側之末端(還原末端)係一個單糖，該還原末端之糖之第1位(唾液酸則為第2位)碳係與連結構造或hANP胜肽作成O-或N-醣苷鍵結。
另一方面，糖鏈之非還原末端之單糖係第1位(唾液酸則為第2位)之碳以外，與其他之糖未作醣苷鍵結。糖鏈上，存有與分枝之數同數目之非還原末端，糖鏈之改變係主要於此非還原末端進行。
天然之糖蛋白質中所含的糖鏈可大致區分為鍵結於糖蛋白質之天冬醯胺酸的N鍵結型糖鏈、及鍵結於絲胺酸或蘇胺酸的O鍵結型糖鏈，各自具有特徵的基本構造。於自然界，N鍵結型糖鏈係藉由N醣苷鍵、O鍵結型糖鏈係藉由O醣苷鍵而與蛋白質之胺基酸側鏈鍵結，但於人工，藉由任一種之醣苷鍵亦可使其與其他之化合物鍵結。因此，未限定醣苷鍵之樣式。例如，將糖物質之還原末端疊氮化，藉由使該經疊氮化的糖物質與具有羧基 的化合物於三苯基膦存在下反應，可使具有所欲構造的化合物藉由N-醣苷鍵鍵結於糖物質。又，藉由使糖物質與如醇之具有羥基的化合物反應，可使所欲化合物與糖物質藉由O-醣苷鍵而鍵結。
N鍵結型糖鏈之基本構造係藉由以下之式(構造式(I)、序列式(II))表示，將包含此糖鏈構造的糖鏈稱作AG(5)。
(式中，『O/N-L』表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵而與連結構造鍵結。於上述式，將還原末端之GlcNAc取代為Glc或Man的還原末端改質糖鏈，各自記載為AG(5-Glc)、AG(5-Man))。
N鍵結型糖鏈之多數具有此基本構造，於其非還原末端或分枝糖亦可進一步鍵結糖鏈。
人型糖鏈、或人適合型糖鏈係指已知於人體內未顯示抗原性之糖鏈，於N鍵結型糖鏈，已知有高甘露糖型、複合(complex)型、混成型等。高甘露糖型係於N型基本構造之非還原末端，具有連續複數個甘露糖之富含甘露糖的構造的糖鏈。複合型係指於N鍵結型基本構造 之非還原末端上具有Galβ1-4GlcNAc之功能區(motif)構造的糖鏈。混成型糖鏈係指於N鍵結型基本構造之非還原末端上具有Gal1β-4GlcNAc功能區構造，且具有包含複數個甘露糖的富含甘露糖的構造的糖鏈。
<SG，AG(n)>
就N鍵結型複合型糖鏈之代表而言，可例示雞蛋之卵黃所含的唾液酸糖肽(Sialyl GlycoPeptide：以下，稱為「SGP」)所含的糖鏈，包含以下之構造式(III)及序列式(IV)所示的構造的唾液酸聚糖(Sialyl Glycan，以下，稱為「SG」)。
(式中，『O/N-L』係表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵而與連結構造鍵結。又，於上述式，將還原末端之GlcNAc取代為Glc或Man的還原末端改質糖鏈，各自記載為SG(Glc)、SG(Man))。
SG係可將SGP，如後述以周知之方法與酵素(Endo M，其變異體等)反應，藉由水解而切出，或使其 轉移至所欲化合物而取出。SGP係由雞蛋的卵黃，依據通常方法，例如，記載於WO2011/0278681的方法，可加以單離、純化。又，SGP之純化品已有販售(東京化成(股)、伏見製藥所(股))，而可以購得。
又，可將SG之還原末端的GlcNAc取代為其他糖、將還原末端改質糖鏈利用後述的糖轉移反應而加以製作。各自將SG之還原末端之GlcNAc取代為Glc的還原末端改質糖鏈記載為SG(Glc)、取代為Man的還原末端改質糖鏈記載為SG(Man)。
就可使用作為本發明之糖物質的改質糖鏈的具體例而言，將SG以神經胺糖酸酶(neuraminidase)處理，使2個非還原末端之Neu5Ac刪除的AG(9)(以下之構造式(V)及序列式(VI))，AG(9)以半乳糖苷酶(galactosidase)處理，使2個之非還原末端之Gal刪除的AG(7)(以下構造式(VII)及序列式(VIII))，使AG(7)進一步以N-乙醯基胺基葡糖苷酶(N-acetylglucosaminidase)處理，使2個之非還原末端之GlcNAc刪除的AG(5)(上述，包含N鍵結型基本構造的糖鏈)等。又，於上述，藉由採用SG之還原末端改質糖鏈(例如SG(Glc)、SG(Man)等)來替代SG，而同樣地處理，AG(9)、AG(7)及AG(5)之還原末端改質糖鏈(例如AG(9)之還原末端之GlcNAc被取代為Glc的AG(9-Glc)、AG(9)之還原末端之GlcNAc被取代為Man的AG(9-Man)等)，亦可採用作為本發明之糖物質。
(式中，『O/N-L』表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵與連結構造鍵結。又，於上述式，將還原末端之GlcNAc取代為Glc或Man的還原末端改質糖鏈各自記載為AG(9-Glc)、AG(9-Man))。
(式中，『O/N-L』表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵與連結構造鍵結。又，於上述式，將還原末端之GlcNAc取代為Glc或Man的還原末端改質糖鏈各自記載為AG(7-Glc)、AG(7-Man))。
於本發明之修飾胜肽，只要一分子中至少一個之糖物質連結於hANP胜肽連結即可，糖物質之個數並無上限，例如20個以下，更佳為15個以下，再更佳為12個以下，再更佳為10個以下，再更佳為5個以下，再更佳為1個、2個、3個或4個，最佳為1個或2個。一分子中所含的糖物質可為同一構造者，亦可為相異構造之糖物質混合存在，但全部為同一糖物質者為較佳。
於本發明，使用來自天然存在的糖蛋白質或糖脂質的糖鏈作為糖物質的情形，該糖鏈可使用酵素，而經切斷‧單離，或藉由糖轉移使其轉移至所欲化合物(被轉移化合物)來使用。就此種反應所使用的酵素而言，配合使用的糖鏈構造，可由周知之多樣酵素加以選擇(Endo-A：Li,B.,et al,J.Am.Chem.Soc.127(2005),pp.9692-9693、Endo-F：Wei Huang.,et al,ChemBioChem 12(2011),pp.932-941、Endo-D：Shu-Quan Fan,et al,J.Biol.Chem.287(2012),pp.11272-11281、Endo-S：Wei Huang,et al,J.Am.Chem.Soc.134(2012),pp.12308-12318.)。就此種酵素之例而言，例如，內-B-N-乙醯基胺基葡糖苷酶已知係作為將殼質雙糖(chitobiose)構造之β醣苷鍵水解的一連串酵素家族，因應其由來，已知有Endo-A、Endo-D、Endo-F、Endo-M、Endo-S等。
其中，來自凍土毛黴(Mucor Hiemalis)的Endo-M具有於具有N鍵結型基本構造的糖鏈，將還原末端側之GlcNAc-GlcNAc間之醣苷鍵水解的活性。再者，該酵素亦具有將藉由此水解而被切出之含N鍵結型糖鏈 基本構造中的還原末端第2號的GlcNAc的非還原末端側之糖鏈，轉移鍵結至具有GlcNAc部位的其他被轉移化合物之GlcNAc的第4位的活性(參照Y.Tomabechi,et al,Bioorg.Med.Chem.,18(2010),pp.1259-1264等)。再者，已知有於使用EndoM的同樣之糖轉移反應，作為被轉移化合物，使用具有其他糖單位(例如，Glc、Man等)之構造的化合物替代GlcNAc的情形，亦於該糖單位對應GlcNAc之第4位的位置，進行同樣之轉移反應者(Endoglycosidases-Biochemistry,Biotechnology,Application,Masahiko Endo et al.Kodansha,Tokyo(2006))。
成為Endo-M之基質的糖鏈構造若為具有N鍵結型基本糖鏈構造者，可將高甘露糖型、複合型、混成型等之多樣的糖鏈作為基質，AG(5)、AG(7)，AG(9)及SG亦成為Endo-M之基質。又，為Endo-M之變異體的Endo-M N175Q係維持Endo-M之基質特異性、及糖轉移活性的同時，使水解活性減低的變異體，尤其藉由糖鏈轉移反應使糖鏈鍵結於所欲化合物的情形，Endo-M N175Q為較佳。使用Endo-M N175Q的情形，就糖鏈供給源而言，例如，亦可使用如SG-Oxa之糖鏈部分被切出者，亦可使用SGP之類的糖胜肽、糖蛋白質(Midori Umekawa et al.JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,285,2010,pp.511-521(亦有記載其他變異體的報告例)，Endo-M及其變異酵素可藉由周知方法以遺傳工程製造。又，Endo-M及Endo-M N175Q亦可為作為市售試藥而購入(販售：東京化成工業(股))。
藉由水解酵素將糖鏈切出來使用的情形，使基質與水解酵素，於適切溫度、時間下反應，由獲得的反應液可將糖鏈單離。
經切出的糖鏈係可作為糖鏈本身使用，亦可將其還原末端加以修飾來使用。例如，於還原末端具有GlcNAc的糖鏈之情形，藉由將該糖鏈以DMC處理，於GlcNAc之環構造之第1位碳原子鍵結的羥基與第2位碳原子鍵結的N-乙醯基之間形成唑啉環，可作為GLY(GlcNAc)-oxa(具體而言為SG-Oxa)單離。如此切出的糖鏈藉由作為對連結分子(GlcNAc化合物)之轉移反應的基質來使用，而可鍵結於所欲之化合物。
又，藉由糖轉移酵素使糖鏈轉移至所欲化合物的情形，使基質(糖鏈供與物質)、被轉移化合物及糖轉移酵素素，於適切的溫度、時間下反應，由獲得的反應液，可將作為目的的糖鏈轉移‧鍵結至被轉移化合物的糖鏈鍵結化合物加以單離而獲得。例如，使用SGP作為基質、使用GlcNAc-化合物作為被轉移化合物、使用Endo-M N175Q作為糖轉移酵素的情形，將適量之GlcNAc化合物、因應該GlcNAc化合物所含的GlcNAc價數的用量之SGP，於Endo-M-N175Q、依所欲適量之DMSO存在下，於20~40℃(較佳為20~30℃、更佳為22~27℃、最適為25℃)，振盪1~10小時(較佳為2~8小時，更佳為3~6小時)，使用逆相HPLC(ODS，將0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液來使用)而可加以純化。
利用此種轉移反應，利用後述各式各樣的GlcNAc化合物，對糖鏈之還原末端，可使胺基(SG-NH2等)、羧基(SG-A等)疊氮基(SG-N3等)、順丁烯二醯亞胺基(SG-M)、α-碘化乙醯基醯胺基(SG-I)等之官能基鍵結，據此，可使糖鏈與所欲之連結構造連結。
如此獲得的糖鏈鍵結化合物亦可直接與hANP胜肽鍵結，亦可藉由其他連結分子而與hANP胜肽連結。
本文中，就「被轉移化合物」而言，包含第1位碳的醣苷鍵以外未受修飾的糖，且只要為作為上述等轉移反應之糖受體作用的化合物即可，並未限定。就被轉移化合物而言，較佳可使用含GlcNAc作為前期糖的「GlcNAc-化合物」(於後文詳述)、含Glc作為糖的「Glc-化合物」、含Man作為糖的「Man-化合物」等，最佳為GlcNAc-化合物。
<連結構造>
於本發明所謂的連結構造係意指於本發明之修飾胜肽中作為hANP胜肽與糖物質連結的媒介之化學構造。連結構造係於至少一處與hANP胜肽鍵結，於至少一處與糖物質作醣苷鍵結。
關於hANP胜肽與連結構造之鍵結，可於hANP胜肽之N末端胺基、C末端羧基、各自構成胺基酸之至少一個之側鏈之任一位置鍵結，鍵結處所可為一個處所，亦可為複數個處所。鍵結於胺基酸側鏈的情形，於序列識別號1之第1位、5位、6位、25位之Ser以及第28位 之Tyr之側鏈的羥基、第26位之Asn之側鏈的醯胺基等，可使具有因應各自之官能基的官能基的所欲化合物鍵結。
於本發明之修飾胜肽或其部分構造之標記，胺基酸或胜肽只要未特別記載，左側標記成為N末端(胺基)、右側標記成為C末端(羧基)。胺基酸或胜肽之右側附有『*』來記載的情形(例如，Gln*)，使前述規則逆轉，左側成為表示C末端、右側成為表示N末端。
又，標記胺基酸的情形，直接鍵結於成為中心的碳原子(α碳)之作為胺基酸之必須構造，將胺基及羧基各自標記為「α胺基」及「α羧基」。
於hANP胜肽之N末端(胺基)或C末端(羧基)之至少一方與糖物質連結的情形，hANP胜肽與連結構造為醯胺鍵結。於hANP胜肽之N末端，藉由糖物質與連結構造而連結的修飾胜肽係如以下方式的標記。
GLY-L-hANP (A)
(式中，GLY表示糖物質，L表示直鏈或分枝為2個以上的連結構造，hANP表示hANP胜肽。L係與GLY作O-或N-醣苷鍵結，L為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY。L係與hANP胜肽之N末端作成醯胺鍵)。
於本說明書，修飾胜肽或其部分構造之標記中，胺基酸或胜肽係於其N末端之胺基與其他連結物連結的情形，表示經連結的構造單位的記號係在表示該胜肽或胺基酸的記號之左側，附連字號，未附括弧而記載，此情形之連字號係表示胜肽或胺基酸之胺基與連結構造 具有的羧基之間形成的醯胺鍵。例如，Asn之胺基與SG連結的構造係標記為『SG-Asn』。
又，於hANP胜肽之C末端藉由連結構造而與糖物質連結的修飾胜肽係如以下方式標記。
hANP-L-GLY (B)
(式中，GLY表示糖物質，L表示直鏈或分枝成2個以上的連結構造，hANP表示hANP胜肽。L係與GLY作O-或N-醣苷鍵結，L為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY。L係與hANP胜肽之C末端作醯胺鍵結)。
即，於本說明書中的修飾胜肽或其部分構造之標記，胺基酸或胜肽係於其C末端之羧基與其他構造單位連結的情形，表示連結的構造單位的記號係在表示該胺基酸或胜肽的記號之右側附上連字號，未附括弧而記載，此情形之連字號係表示胜肽或胺基酸之C末端羧基與連結構造具有的胺基(或疊氮基)之間所形成的醯胺鍵。例如，SG連結於Tyr之羧基的構造係標記為『Tyr-SG』。
又，於本發明，於hANP胜肽之N末端及C末端之兩者連結糖物質的修飾胜肽，係依據上述規則，以如下之式C的方式記載。
GLY-L1-hANP-L2-GLY (C)
(式中，GLY表示糖物質，L1及L2可為相同，亦可為相異，表示直鏈或分枝為2個以上的連結構造，hANP表示hANP胜肽。L1及L2係與GLY作O-或N-醣苷鍵結，L1或L2為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目 之GLY。L1及L2係與hANP胜肽之N末端及C末端之兩者作醯胺鍵結)。
再者，於本發明之修飾胜肽或其部分構造，於胺基酸之側鏈，與糖物質連結的情形之部分構造係如以下之式D的方式加以標記。
(GLY-)AA (D)
(式中，GLY表示糖物質，A.A表示任意之胺基酸，該胺基酸之側鏈係直接或藉由連結構造與GLY作O-或N-醣苷鍵結)。
即，關於本說明書中的修飾胜肽或其部分構造之標記，於胺基酸或胜肽於側鏈之官能基與其他構造單位連結的情形，表示經連結的構造單位的記號係在表示經連結的胺基酸的記號之左側附上連字號及括弧而被記載。此情形之連字號係表示含糖物質之還原末端中的醣苷鍵的化學構造。此情形之連結係藉由連結構造的情形，亦有於該連結構造明記特徵的構造的情形(例如，(SG-PEG(3)-)Asn等)，但亦有於不具有特徵的構造的情形或未特定記載連結構造的情形則省略(例如，(SG-)Lys等)記載的情形。又，實施例化合物之名稱係表示由併記的構造式而構成的具體的化合物。
依據此類規則，SG連結於Lys之側鏈胺基與α胺基之兩者的部分構造係以如『SG-(SG-)Lys』的方式被標記。又，同樣地SG連結於Glu之側鏈羧基與α羧基之兩者的部分構造係標記為『(SG-)Gln-SG』或『SG-(SG-)Gln*』(Asp及Glu係側鏈之羧基形成醯胺鍵 的情形，成為與Asn/Gln相同的構造。Gln*係表示左側為羧基、右側為胺基)。
又，於一分子中含有複數個hANP胜肽的情形，採用各別標記方法。例如，Lys之α羧基連結於糖物質，於α胺基與側鏈胺基之兩者，各自藉由PEG連結物而連結hANP胜肽之N末端的情形，作成如『GLY-Lys*(-PEG-hANP)2』之方式的標記。
糖物質與連結構造係於糖物質之還原末端之第1位碳，以N-或O-醣苷鍵鍵結。此時之醣苷鍵之立體配置可選擇α位及β位之任一者，依據周知之方法(Tomoya Ogawa,et al,Agric.Biol.Chem.47(1983),pp.281-285.、Mamoru Mizuno,et al,121(1999),pp.284-290.)，可選擇性合成任一者之鍵結樣式。使用來自天然之糖蛋白質的糖鏈的情形，較理想為選擇與該糖鏈於天然型之鍵結樣式相同的樣式，例如，糖物質為SG或其改質糖鏈的情形，較理想為與連結構造之醣苷鍵選擇β位。
於本說明書，將糖物質作為記號(例如，GLY、SG、GlcNAc等)來記載的情形，除了另有定義的情形之外，將至還原末端之碳，作成含於該記號，歸屬於N-或O-醣苷鍵的N或O，作成未含於該記號。又，同樣地，將hANP胜肽作記號(例如，hANP、hANP(1-28)等)來標示的情形，原則上N末端之-NH、及C末端之C=O係作成含於該記號者來標示。又，只要未特別指明，左側係標記作為N末端、右側係標記作為C末端。即，未受修飾的hANP胜肽係標記成H-hANP-OH。
本發明之修飾胜肽所含的連結構造之化學構造具有至少一個之糖物質與醣苷鍵結的氧原子或氮原子、及至少一個之hANP胜肽與醯胺鍵結的部分構造(以醯胺鍵鍵結的情形為NH或C=O，連結於hANP胜肽之側鏈的情形為因應各側鏈之構造的構造(後述))。其以外之構造並未限定，可為來自單一分子者，亦可使複數之分子鍵結、包含複數之部分構造者。如此，成為連結構造之由來的分子稱為「連結分子」。含複數之部分構造的情形，有將彼等之部分構造合併於該部分構造記載為如『Lx』之方式者。例如，與糖物質直接鍵結的部分構造係標記為『Lg』，該部分構造並未包含與hANP胜肽直接鍵結的構造，但於此以外之點，全部滿足適用連結構造的定義。又，與hANP胜肽直接鍵結的部分構造係標記為『Lp』，除歸屬於與糖物質之醣苷鍵的構造外，滿足適用連結構造的全部定義。
於本發明之連結構造，歸屬於醣苷鍵的N或O與hANP胜肽直接鍵結的原子(作醯胺鍵結的情形，歸屬於該醯胺鍵的N或C)以最短連繫的原子鏈稱為「連結鏈」。連結鏈含歸屬於上述鍵結的各自之原子。例如，(GLY)-O-CH2-C(=O)-(N term hANP)所表示的修飾胜肽係具有包含3原子之連結鏈的連結構造。又，(GLY)-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-(C term hANP)所表示的修飾胜肽係成為具有包含5原子之連結鏈的連結構造。本發明之連結構造只要為具有3原子以上之連結鏈者即可，並未特別限定，但例如可為200原子以下之連 結鏈，較佳為約150原子以下之連結鏈，更佳為100原子以下之連結鏈，再更佳為70原子以下、50原子以下或30原子以下之連結鏈，最佳為20原子以下、15原子以下或10原子以下之連結鏈。為了形成此種連結構造，藉由使用複數個連結分子可做出複雜、長的連結鏈之連結構造，但較佳為採用5個以下之連結分子，較佳為包含使用4、3、2或1個之連結分子的連結構造的修飾胜肽。
本發明之連結構造來自一個連結分子的情形，該連結分子係一分子中含有與糖物質作醣苷鍵結的官能基、及與hANP胜肽鍵結的官能基兩者的化合物，例如胺基酸或胜肽等因具有胺基與羧基而較佳，又於側鏈具有胺基、羧基、羥基等的胺基酸為更佳。就此種連結分子之具體例而言，例如，可例示HO-CH2-COOH、HO-CH2-CH2-NH2、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、離胺酸等。
本發明之連結構造係來自複數個連結分子的情形，就該連結分子而言，使用至少含可與糖物質作醣苷鍵結的官能基的化合物、及可與hANP胜肽鍵結的官能基的化合物。若進一步具有此2個化合物可直接鍵結的官能基，亦可直接鍵結，再者亦可以其他化合物作為媒介而連結。此種連結分子彼此之鍵結可適用周知之方法，並未特別限定，但例如，胺基與羧基所致的醯胺鍵、SH基與順丁烯二醯亞胺基之鍵結、SH基與碘乙醯基之鍵結、苯酚基與三唑二酮基之鍵結(Hitoshi Ban,et al, 132(2010),1523-1525.)。可例示醇與羧基所致的酯鍵結、疊氮基與乙炔基之Husgen反應所致的鍵結等。就本發明採用的連結分子而言，可適宜選擇具有與此等鍵結樣式一致的官能基者，而用於連結構造之形成。
本發明之修飾胜肽，就全體而言因有必要呈現一定的親水性，連結構造具有一定以上的大小的情形，採用親水性高的構造者為較佳。就此種構造之例，例如，可舉例聚氧伸烷基、聚醯胺《其他生物學上適用的重複構造》等。
就聚氧伸烷基而言，例如，可例示聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚丁二醇、聚乙烯醇(PVA)等，但較佳為PEG。於本說明書，標記含PEG的連結構造的情形，乙氧基之重複次數記載成如PEG(3)、PEG(11)的方式。就具有如此構造的修飾胜肽而言，例如，可例示化合物2-13、2-27至2-34等。
又，本發明之連結構造中亦可含有胺基酸、或2個以上之胺基酸作胜肽鍵結的寡肽鏈。此種胺基酸或寡肽鏈係與hANP胜肽之N末端或C末端直接作醯胺鍵結，可取hANP胜肽之胜肽鏈被延長的構造。又，hANP胜肽係可藉由胜肽以外之構造來連結，亦可具有彼等兩者之構造。
就本發明之連結構造所含的胺基酸而言，只要同一個碳上具有氫原子、胺基及羧基鍵結的胺基酸構造即可，並未特別限定，可為天然型之胺基酸，亦可為人工之胺基酸。就人工之胺基酸而言，可為如D胺基酸之 合成製造的胺基酸，亦可為天然型胺基酸之側鏈經人工修飾的改質胺基酸，但較佳為天然型胺基酸、或改質胺基酸，更佳為天然型胺基酸。本發明之修飾胜肽被利用作為醫藥之有效成分的情形，連結構造所含的胺基酸係其本身不具有固有之生物活性者為較佳，採用Gly或胺基酸側鏈與其他構造鍵結的胺基酸為較佳。就含此種胺基酸的連結構造之例而言，可舉例含Gly或包含2個以上之Gly的寡Gly，於N末端及C末端與hANP胜肽及糖物質連結者。就此種修飾胜肽之具體例而言，例如，可舉例作為糖物質採用SG(Glc)，含Gly作為連結物的化合物2-40等。
就具有側鏈構造的胺基酸而言，例如，可採用如Lys之側鏈具有胺基的「胺基側鏈胺基酸」、如Cys之側鏈具有SH基的SH基側鏈胺基酸、如天冬胺酸或麩胺酸之側鏈具有羧基的羧基側鏈胺基酸、如絲胺酸之側鏈具有羥基的羥基側鏈胺基酸、如酪胺酸之側鏈具有p-苯酚基的苯酚側鏈胺基酸等。關於此等具有側鏈構造的胺基酸，因可於與α碳鍵結的胺基及羧基以及側鏈之官能基之3點上連結，為了形成分枝的連結構造，含有具此等側鏈構造的胺基酸之至少一者為較佳。
胺基側鏈胺基酸係於側鏈具有至少1個胺基(醯胺基除外)的胺基酸即可，並未特別限定，但就天然胺基酸而言，係Lys。就人工胺基酸而言，例如，可例示使1,2-二胺基乙烷之類的2價胺於Glu或Asp之側鏈羧基反應的改質胺基酸等。
連結構造係含至少一個之胺基側鏈胺基酸，且糖物質於該胺基側鏈胺基酸之側鏈連結的情形，可具有以下之通式之部分構造。
(式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上。GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY。N-(AA)表示來自胺基側鏈胺基酸之側鏈之胺基的氮原子，(AA)含胺基酸基本構造及連結於側鏈胺基的構造部分)。
具有此種部分構造的連結構造係對胺基側鏈胺基酸、或含其之連結分子，於羧基導入保護基，其次，使以『GLY-Lg-COOH』表示的連結分子反應，將羧基脫保護，藉由與hANP胜肽、或Lp鍵結而可加以製造。於此反應，胺基側鏈胺基酸之α-胺基為自由的情形，Lg係藉由於側鏈之胺基與α胺基之兩者作醯胺鍵結而可形成具有分枝構造的連結構造。例如，具有如SG-(SG-)Lys之部分構造的修飾胜肽。就此種化合物之具體例而言，可例示化合物2-14、2-35等。
又，於同樣之製造，藉由將Lg(-糖物質)與Lp(-hANP胜肽)替換，可製造於胺基側鏈胺基酸之側鏈具有連結hANP胜肽的部分構造的修飾胜肽。此種部分構造係對胺基側鏈胺基酸、或含其之連結分子，於羧基導入保護基，其次使以『Lp-COOH』表示的連結分子反 應，將羧基脫保護，藉由使Lg或糖物質鍵結於該羧基而可加以製造。於此反應，胺基側鏈胺基酸之α-胺基為自由的情形，Lp係藉由於側鏈之胺基與α胺基之兩者作醯胺鍵結，而可形成具有分枝構造的連結構造。例如，具有如Lp-(Lp-)Lys-Lg之部分構造的修飾胜肽。就此種化合物之具體例而言，可例示化合物2-38、2-39等。再者，藉由採用與具有其他之多樣構造的連結分子之組合，可適當地製造如一分子中含複數個糖物質及/或複數個hANP胜肽之類的修飾胜肽。
又，將胺基側鏈胺基酸彼此，於側鏈胺基與α胺基之各自，藉由重複使相同胺基側鏈胺基酸之α羧基與醯胺鍵形成，形成具有多數胺基的構造，藉由使該構造與Lg鍵結，可形成胺基與同數目之糖物質連結的連結構造。例如藉由於此種分枝的胜肽之複數個胺基，使用例如HATU之類的縮合劑，使具有羧基的糖鏈反應，可將複數個糖鏈經由分枝胜肽而導入。就此方式製造的修飾胜肽而言，例如，可舉例『SG-[SG-(SG-)Lys-]Lys』、『SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)Lys-]Lys』之類的連結構造。就此種修飾胜肽之具體例而言，可例示化合物2-14、2-35。
SH基側鏈胺基酸係於側鏈具有至少一個SH基的胺基酸即可，並未特別限定，但就天然胺基酸而言為Cys。就人工胺基酸而言，例如，可例示於Lys之側鏈胺基使例如具有HOOC-R-STr(三苯甲基硫化物)構造的化合物反應，或於Glu或Asp之側鏈羧基使例如具有 H2N-R-STr構造的化合物反應而獲得之具有SH基的改質胺基酸等。
連結構造係含有至少一個之SH基側鏈胺基酸，且糖物質連結於該SH基側鏈胺基酸之側鏈的情形，可具有以下之通式之部分構造。
(式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上。GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY。S表示來自SH基側鏈胺基酸之側鏈SH基的硫原子，(AA)含有胺基酸基本構造及連結於側鏈胺基的構造部分)。
具有此種部分構造的連結構造係可藉由對SH基側鏈胺基酸、或含其的連結分子，使以(GLY)-Lg-N順丁烯二醯亞胺所表示的連結分子反應來製造。於此反應，於SH基側鏈胺基酸之α-胺基及/或α羧基，可與其他糖物質連結，據此可形成具有分枝構造的連結構造。例如於此種分枝的胜肽之複數胺基使SH基經保護的3-巰基丙酸反應，將胜肽之C末端脫保護並鍵結於hANP胜肽後，藉由將SH基脫保護，使具有順丁烯二醯亞胺基的糖鏈於0.2M磷酸緩衝液(pH6.75)中反應，可將複數個糖鏈經由分枝胜肽而導入。就此種化合物之具體例而言，可舉例化合物2-19、2-20、2-23等。
又，於同樣之製造，藉由將Lg(-糖物質)與Lp(-hANP胜肽)替換，可製造於SH基側鏈胺基酸之側鏈具有連結hANP胜肽的部分構造的修飾胜肽。再者，藉由採用與具有其他多樣構造的連結分子組合，可適當地製造如一分子中含複數個糖物質及/或複數個hANP胜肽的修飾胜肽。
羧基側鏈胺基酸只要於側鏈具有至少一個羧基的胺基酸即可，並未特別限定，但就天然胺基酸而言為Asp或Glu。就人工胺基酸而言，例如，可例示於Lys之側鏈胺基使如順丁烯二酸的2價羧酸反應的改質胺基酸等。
連結構造係含至少一個之羧酸基側鏈胺基酸，且糖物質連結於該羧酸基側鏈胺基酸之側鏈的情形，可具有以下通式之部分構造。
(式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上。GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY。CO表示來自羧酸側鏈胺基酸之側鏈的CO，(AA)含胺基酸基本構造及連結於側鏈胺基的構造部分)。
具有此種部分構造的連結構造係對羧基側鏈胺基酸、或含其的連結分子，因應必要於胺基導入保護基，其次，使以『Lg-NH2』表示的連結分子反應後，可 藉由將胺基脫保護，與Lg或hANP胜肽之C末端鍵結而加以製造。於此反應，羧基側鏈胺基酸之α-羧基為自由的情形，Lg係藉由於側鏈之羧基與α羧基兩者作醯胺鍵結，可形成具有分枝構造的連結構造。例如藉由於具有此種分枝的複數個羧基的胜肽，使用三氟乙酸酐與N-羥基琥珀醯亞胺而將羧酸活性化，使具有胺基的糖鏈(SG-NH2等)反應，可將複數個糖鏈經由分枝胜肽而加以導入。就此種部分構造而言，例如，使用Glu作為羧基側鏈胺基酸與SG連結的情形，係以『-(SG(Lg)-)Gln-(Lg)SG』表示(由於因Glu及Asp之側鏈形成醯胺鍵，此情形成為與Gln/Asn相同的構造)。就此種修飾胜肽之具體例而言，可例示化合物2-31、2-32等。
又，於同樣之製造，藉由將Lg(糖物質)與Lp(hANP胜肽)替換，可製造於羧基側鏈胺基酸之側鏈具有連結hANP胜肽的部分構造的修飾胜肽。具有此種部分構造的連結構造係對羧基側鏈胺基酸、或含其的連結分子，因應必要於胺基導入保護基，其次，使以『(hANP)-Lp-NH2』表示的連結分子反應後，可藉由將胺基脫保護，與具有適切官能基的Lg鍵結而加以製造。於此反應，羧基側鏈胺基酸之α-羧基為自由的情形，Lp係藉由於側鏈之羧基與α羧基之兩者作醯胺鍵結，可形成具有分枝構造的連結構造。例如藉由於具有此種分枝的複數個羧基的胜肽，使用三氟乙酸酐與N-羥基琥珀醯亞胺而將羧酸活性化，使具胺基的Lp或hANP胜肽之N末 端胺基反應，可製造將複數個hANP胜肽經由分枝胜肽導入之多價hANP之修飾胜肽。就此種部分構造而言，例如，使用Glu作為羧基側鏈胺基酸而與hANP連結的情形，係以『SG Gln-(Lp-hANP)2』表示(由於因Glu及Asp之側鏈形成醯胺鍵，此情形成為與Gln/Asn相同構造)。再者，藉由與具有其他多樣構造的連結分子組合，可適當地製造如一分子中含複數個糖物質及/或複數個hANP胜肽的修飾胜肽。
又，將羧基側鏈胺基酸彼此，於側鏈羧基及α羧基之各自，藉由重複與其他羧基側鏈胺基酸(可為相同種類，亦可為相異，但同種類為較佳)之α胺基形成醯胺鍵，形成具有多數之羧基的構造，藉由將該構造與Lg以上述反應鍵結，可形成羧基與同數目的Lg連結的連結構造。就此種連結構造之部分構造而言，例如，『H-[(SG-)Gln-SG]Gln-SG』等。
再者，於羧基側鏈胺基酸之羧基，將糖物質藉由N醣苷鍵而使其直接連結，可形成以下部分構造。
(式中，GLY表示糖物質，NH-CO-(AA)表示來自羧基側鏈胺基酸之側鏈的醯胺構造，(AA)含胺基酸基本構造及連結於側鏈胺基的構造部分)。
此種部分構造係藉由對羧酸側鏈胺基酸、或含其的連結分子，使還原末端疊氮化的糖物質，於三苯基膦存在下反應，使糖物質之還原末端與側鏈作N-醣苷 鍵結而可加以製造。又，藉由依據實施例的方法，可合成具有於羧基側鏈胺基酸之α-羧基連結糖物質的構造的化合物。就此種修飾胜肽之具體例而言，可舉例化合物2-3、2-4、2-8、2-9、2-13、2-21、2-22、2-27，2-28、2-38、2-39等。
苯酚基側鏈胺基酸係只要於側鏈至少具有一個p-苯酚基的胺基酸即可，並未特別限定，但就天然胺基酸而言，為Tyr。就人工胺基酸而言，例如，可例示於Glu或Asp之側鏈羧基使p-胺基苯酚反應的改質胺基酸等。
連結構造係含至少一個之苯酚基側鏈胺基酸，且糖物質連結於該胺基酸之側鏈的情形，可具有以下通式之部分構造。
(式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上。GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY。苯酚基表示來自苯酚側鏈胺基酸之側鏈的苯酚基，(AA)含胺基酸基本構造及與連結於側鏈胺基的構造部分)。
具有此種部分構造的連結構造係藉由對苯酚基側鏈胺基酸、或含其之連結分子，使以(GLY)-Lg-N三唑二酮(*)表示的連結分子反應而可加以製造。於此反 應，可於苯酚基側鏈胺基酸之α-胺基及/或α羧基連結其他糖物質，據此可形成具有分枝構造的連結構造。例如藉由將具三唑二酮構造的GlcNAc以N-溴琥珀醯亞胺活性化，使其與hANP反應而可於hANP之第28位的Tyr之苯酚側鏈選擇性導入GlcNAc構造，藉此可進行糖鏈轉位反應。就此種化合物之具體例而言，可舉例化合物2-6等。
羥基側鏈胺基酸係只要於側鏈具有至少一個羥基的胺基酸即可，並未特別限定，但就天然胺基酸而言，為Ser或Tyr。就人工胺基酸而言，例如，可例示於Asp或Glu之側鏈羧酸使2-胺基乙醇之類的胺基醇反應而獲得的改質胺基酸等。
又，於同樣之製造，藉由將Lg(糖物質)與Lp(hANP胜肽)替換，可製造於苯酚基側鏈胺基酸之側鏈具有連結hANP胜肽的部分構造的修飾胜肽。再者，藉由與具有其他之多樣構造的連結分子組合而加以採用，可適當製造如一分子中含複數個糖物質及/或複數個hANP胜肽的修飾胜肽。
連結構造係含至少一個之羥基側鏈胺基酸，且糖物質連結於該胺基酸之側鏈的情形，可具有以下通式之部分構造。
(式中，GLY表示糖物質，O表示來自羥基側鏈胺基酸之側鏈羥基的氧原子，(AA)含胺基酸基本構造及連結於側鏈胺基的構造部分)。
具有此種部分構造的連結構造係藉由對羥基側鏈胺基酸、或含其的連結分子，於將糖物質形成O-醣苷鍵的條件下反應，可加以製造。於此反應，於羥基側鏈胺基酸之α-胺基及/或α羧基可與其他糖物質連結，據此可形成具有分枝構造的連結構造。例如於具有三氯乙醯亞胺酯(acetimidate)構造的葡糖胺衍生物，於三氟甲磺酸三甲基矽烷存在下，使絲胺酸之側鏈羥基反應後藉由經過數步驟，可經由O-醣苷鍵而於絲胺酸側鏈導入GlcNAc，藉此可進行糖鏈轉位反應。就此種修飾胜肽之具體例而言，可舉例化合物2-5等。
又，於同樣之製造，藉由將Lg(糖物質)與Lp(hANP胜肽)替換，可製造於羥基側鏈胺基酸之側鏈具有連結hANP胜肽的部分構造的修飾胜肽。再者，藉由與具有其他多樣構造的連結分子組合而加以採用，可適當地製造如一分子中含複數個糖物質及/或複數個hANP胜肽的修飾胜肽。
藉由使用包含含複數個具有此種側鏈構造的胺基酸的寡肽的連結分子、或含一個以上之各自的胺基酸的複數個連結分子，進行上述各種反應，可使所含官能基側鏈與同數目以上之糖物質連結。就此類寡肽而言，只要含具上述側鏈的胺基酸即可，並未特別限定，但進一步含一定數目的Gly為宜，彼等為規則地並排的重複序列者為較佳。例如，將具有側鏈的胺基酸作成Xaa的情形，以(Xaa-Gly m)n(m、n係彼此獨立表示1以上之自然數)表示的寡肽為較佳。n、m係各自無特別上限， 但較佳為10以下，更佳為7以下，於m進一步為3以下者較佳。就具體的寡肽而言，可例示(Cys-Gly)3、(Cys-Gly)5,、(Lys-Gly-Gly)3、(Tyr-Gly-Gly-Gly)3等，但未限定於此等。就具有此種構造的修飾胜肽之具體例而言，可例示化合物2-15、2-17、2-18等。
藉由適宜組合如上述之各種之連結分子、GlcNAc-化合物而使其鍵結，可合成設計為所欲構造的連結構造。此種連結構造可設計成非常多樣的構造，又，可控制所鍵結的糖物質之數目。藉由此方式之設計、合成，可製造富變化的修飾胜肽。
<製造方法‧GlcNAc化合物>
於本發明，糖物質與連結構造作O-醣苷鍵結的修飾胜肽係藉由於將N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)唑啉化的GlcNAc-oxa(或者，將於其GlcNAc部位所含的3個羥基藉由乙醯基化而保護者之類的關連物質)，使具有羥基的連結分子(例如羥乙酸苄酯、絲胺酸、酪胺酸之類的羥基側鏈胺基酸等)反應而可加以製造。又，糖物質與連結構造作N-醣苷鍵結的修飾胜肽係可藉由使具有疊氮基的糖物質與具有羧基的連結分子，於三苯基膦存在下反應，而加以製造。
於本發明之修飾胜肽，將具有糖鏈構造的糖物質作為糖物質連結的情形，適當修飾糖鏈之還原末端，可鍵結於連結分子，又，合成具有特定糖單位與所欲構造的被轉移化合物(例如，GlcNAc化合物)，藉由使用糖鏈轉移酵素(例如，Endo-M N175Q)使糖鏈轉移至其糖單位(例如，GlcNAc)，亦可加以製造。
於本發明，「GlcNAc-化合物」係包含除第1位碳之醣苷鍵以外未受修飾的GlcNAc、及可與其他分子鍵結的官能基之化合物、或與hANP胜肽連結之化合物。GlcNAc-化合物係，例如，可為一分子中作為單糖之GlcNAc與所欲之化合物、胺基酸等作醣苷鍵結的化合物，例如如AG(5)之於非還原末端具有GlcNAc的糖鏈或與其鍵結的化合物。化合物與GlcNAc之間之醣苷鍵可於α位，亦可於β位進行轉移反應(Endoglycosidases：Masahiko Endo,et al Biochemistry,Biotechnology,Application)，但轉移後之糖鏈構造，係參考天然糖鏈者的情形，與該天然型糖鏈為相同樣式者為較佳。例如，轉移後之糖鍵結化合物具有SG的情形，於GlcNAc化合物β位亦為較佳。
GlcNAc化合物可依據周知之各式各樣方法來製造。例如，將葡糖胺、4,5-二氫-2-甲基唑并5’,4’：1,2]-3,4,6-三-O-乙醯基-1,2-二去氧-α-葡萄哌喃糖(下述式，參照Bull.Chem.Soc.Jpn.,2003,76,485-500))等作為起始物質，
以具有所欲構造、官能基的方式而可適當地合成。就此種GlcNAc化合物之具體例而言，可舉例具有羧基的化合物1-2C、具有胺基的化合物1-7A等、具有三唑二酮基的化合物1-6D等。又，使胺基酸連結於GlcNAc 的GlcNAc化合物係對胺基與羧基之任一者，選擇地附加保護基而可合成。就具體例而言，可例示Boc-(GlcNAc-)Ser(化合物1-1D)，Boc-(GlcNAc-)Asn(J.Am.Chem.Soc.,1999,121,284-290)、(GlcNAc-)Gln等。
藉由使如上述之GlcNAc-化合物與其他連結分子或胜肽鍵結，可合成具有多樣構造、鍵結官能基的GlcNAc化合物，此類多樣的GlcNAc化合物可利用於本發明之修飾胜肽之製造。例如，藉由使具有胺基(羧基)的GlcNAc化合物與具有羧基(胺基)及所欲構造、官能基的連結分子鍵結，可合成具有所欲官能基的GlcNAc化合物(具體例：具有順丁烯二醯亞胺基的化合物1-7B等)。
又，例如，藉由使具有胺基(羧基)的GlcNAc化合物與具有羧基(胺基)的PEG連結分子鍵結，可合成具有所欲長度之PEG的GlcNAc化合物(具體例：化合物1-3A，1-4B、1-5A、1-19等)。又，藉由替代PEG，使用聚Gly或聚(Ser-Gly)之類的聚醯胺，可合成具有所欲長度之聚醯胺連結物的GlcNAc化合物(具體例：化合物1-21B等)。本文中，藉由採用側鏈具有官能基者作為聚醯胺所含的胺基酸，可於該官能基進一步使GlcNAc化合物鍵結。
又，本發明所使用的GlcNAc-化合物可為一分子中含複數個單獨之GlucNAc的化合物。此種多價之GlcNAc化合物係可舉例於前述胺基酸使2個GlcNAc作N-醣苷鍵結者、或將上述之GlcNAc-化合物，複數個鍵結於連結分子者等。例如，藉由將如Lys之於側鏈具有 胺基的胺基酸作為連結分子，使其與2當量之具有羧基的GlcNAc化合物反應，可合成如GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-OH之具有2個GlcNAc及1個羧基的GlcNAc化合物。再者，藉由使此GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-OH與離胺酸(胺基側鏈胺基酸)反應，可合成4價之GlcNAc化合物，藉由重複此步驟下可合成含有多數個GlcNAc的GlcNAc化合物。又，GlcNAc化合物具有複數個官能基的情形，於其一部分導入保護基而使GlcNAc連結後，脫保護，藉由使於該脫保護的官能基使其他GlcNAc化合物鍵結，亦可合成多價之GlcNAc化合物(具體例：化合物1-5B)。將此種手法，依據通常方法，藉由適當重複、及/或組合，可合成多樣的GlcNAc化合物。
又，關於前述之GlcNAc-化合物之定義、形態等，將GlcNAc取代為Glc、Man的化合物各自定義為Glc-化合物、Man-化合物，此等亦較佳被採用作為用以製造本發明之修飾胜肽的被轉移化合物。
於本發明之修飾胜肽之製造，藉由使hANP、糖物質、連結分子、被轉移化合物等之中間體適宜鍵結‧轉移等而可加以製造，但其製造之順序並未特別限定，可依據通常方法，依據各式各樣的方法加以製造。各自之中間體之具有的官能基係因應該製造步驟，依據通常方法，適宜地進行活性化、不活性化、保護基之添加、脫保護等。
糖物質之連結可採各式各樣的方法。例如，於具有GlcNAc、Glc等的連結分子使糖鏈轉移，可將該糖鏈鍵結連結分子連結於hANP胜肽。又，藉由將使Glc或GlcNAc與hANP胜肽連結的中間體作為被轉移化合物，使糖鏈轉移，亦可製造修飾胜肽。糖物質之具有的羥基藉由適宜地經過乙醯基化、脫乙醯基化等之步驟，可抑制不要的副反應。
<機能、活性>
本發明之修飾胜肽與未經修飾的hANP(1-28)比較，顯示經延長的血中持續時間、及優異的水溶性，且保持cGMP上升活性。hANP(1-28)因自血中會快速地消失，臨床上有必要連續投予，但本發明之修飾胜肽藉由非連續投予亦可發揮藥理效果。又，本發明之修飾胜肽因顯示較天然型hANP更優異的水溶性，可適用於含高濃度有效成分的製劑。如此，藉由本發明之修飾胜肽之特性，採用歷來之天然型hANP無法達成的投予方法、投予路徑、製劑技術者係成為可能，不僅可用於急性之循環器官系統疾病之治療，而且用於慢性之循環器官系統疾病(高血壓症或慢性心臟疾病等)之治療亦成為可能。再者，本發明之修飾胜肽亦有用於作為生物學的研究工具。天然型hANP長期間存在於血中的情形之組織轉移性等並不清楚，但藉由投予本發明之修飾胜肽，如此調查局部存在或hANP長期間存在於血中對於活體的影響成為可能。本發明之修飾胜肽之血中持續性係依據試驗例3之方法，可藉由檢測對動物投予後之末梢血中之cGMP 濃度、及/或末梢血樣品中所含有的該修飾胜肽而加以試驗。本發明之修飾胜肽係於投予體內後，即使約15分鐘後亦維持使末梢血中之cGMP濃度上升的效果，更佳為即使投予約30分鐘後亦維持該效果，更佳為投予約45分鐘後亦維持該效果，再更佳為投予約60分鐘後亦維持該效果。又，關於自修飾胜肽之投予後之末梢血之該修飾胜肽的檢測，即使約30分鐘後被檢測出者為較佳，更佳為約45分後亦被檢測出者，又更佳為約60分鐘後亦被檢測出者，再更佳為約90分鐘後亦被檢測出者。
本發明之修飾胜肽係藉由與糖物質連結，顯示優異的水溶性。此優異的水溶性亦進一步受連結構造之化學構造的影響。就每1ml水之溶解量而言，相對於天然型hANP係32mmol則凝膠化，本發明之修飾胜肽因溶解60mmol以上、較佳為80mmol以上、又更佳為100mmol(例如，具體而言為112mmol)，故具有約2倍以上、較佳為約3倍以上之水溶性。
本發明之修飾胜肽之血中持續時間係可藉由將修飾胜肽投予活體，於一定時間時採取血液，檢測該血液樣品中所含的修飾胜肽而可加以測定。就修飾胜肽之檢測方法而言，例如，可使用藉由LC-MS之檢測、使用特異性辨識hANP之環構造的抗體的ELISA法等之各式各樣的方法。又，以表現cGMP上升活性的用量投予本發明之修飾胜肽的情形，藉由使用市售之測量套組測定該血液樣品之cGMP量，與投予開始前之血中之cGMP量比較，可測定血中之修飾胜肽之持續時間作為生物活性。 又，藉由將修飾胜肽以放射性同位素標識，將血液樣品以SDS-PAGE等分離，檢測放射性訊號，亦可檢測出。
於本發明，「血中持續時間被延長」係指與天然型hANP比較，顯示長的血中持續時間。於對猴之皮下投予，天然型hANP因於投予後30分鐘之時間點未由血中檢測出，若於30分鐘之時間點可檢測出的話，可視為血中持續時間被延長。又，於同樣的對猴之皮下投予，血中cGMP量的上升，因為天然型Hanp係於投予後60分鐘回到與投予前相同水平，於投予60分鐘之時間點顯示較投予前更高cGMP量的情形，可視為血中持續時間被延長。
又，本發明之修飾胜肽係對由於NEP所致的hANP胜肽之分解具有耐性，被認為是持續時間被延長的要因之一。如此，NEP分解耐性可以周知之方法測定。
本發明之修飾胜肽之cGMP上升活性可藉由將表現GC-A受體的細胞以調整為至充分量之濃度梯度的被驗物質來刺激後，將細胞溶解而測量此細胞溶解液中之cGMP濃度，鑑定最大之cGMP濃度(Emax)而測定。本發明之修飾胜肽「保持cGMP上升活性」係指修飾胜肽所示的最大cGMP濃度與天然型hANP之最大cGMP濃度比較，約30%以上，較佳為約50%以上，更佳為約70%以上。本發明之修飾胜肽與天然型hANP比較，可高濃度地製劑化，且因顯示延長的血中持續時間，以所謂EC50值之類的指標定義活性並不適當，使濃度上升的情形之最大活性若可顯示天然型之一定以上的活性，於臨床上，持續地、及或高濃度投予的情形，可獲得充分的藥效。
本發明提供含有本發明之修飾胜肽作為有效成分的醫藥。
<醫藥>
可使用作為本發明之醫藥之有效成分的物質亦可為上述修飾胜肽之藥學上可容許的鹽。即，於本發明，上述物質之無機酸，例如鹽酸、硫酸、磷酸，或有機酸，例如甲酸、乙酸、丁酸、三氟乙酸(TFA)、琥珀酸、檸檬酸等之酸加成鹽，亦可作為有效成分來使用。或者，於本發明，亦可將上述的物質之鈉、鉀、鋰、鈣等之金屬鹽、有機鹼的鹽之形態作為有效成分來使用。如此，本發明之修飾胜肽之鹽可為hANP胜肽部分之鹽，亦可於糖物質之構造形成鹽。就本發明之修飾胜肽之鹽而言，較佳為於hANP胜肽部分形成藥學上可容許的鹽者，更佳為於hANP胜肽部分形成三氟乙酸鹽或乙酸鹽者，又，本發明之醫藥組成物可作為其有效成分的物質之游離形，或亦可為其藥學上可容許的鹽。
可使用作為本發明之醫藥之有效成分的物質或其藥學上可容許的鹽係與周知之藥學上可容許的載體、賦形劑、稀釋劑等混合而以醫藥上一般使用的投予方法，即經口投予方法、或經粘膜投予、靜脈內投予、肌肉內投予或皮下投予等之非經口投予方法而投與至個體者為較佳。
可使用作為本發明之醫藥之有效成分的物質之投予量，依疾病之種類、個體(患者)之年齡、體重、症狀的程度及投予路徑等而異，但一般而言就每1日之 投予量之上限而言，例如約100mg/kg以下，較佳為約50mg/kg以下，又更佳為1mg/kg以下。又，就每一日之投予量之下限而言，例如約0.1μg/kg以上，較佳為0.5μg/kg以上，更佳為1μg/kg以上。
本發明之醫藥之投予頻率依使用的有效成分、投予路徑、及處置的特定疾病亦會變動。例如將胜肽性物質經口投予的情形，每一日以4次以下之投予次數作為處方者為較佳，又非經口投予，例如靜脈內投予的情形，可使用通常之注射器加以注射，亦可利用輸液幫浦(infusion pump)、導管等而持續地投予。又，以皮下注射、肌肉內注射等之路徑投予者較佳，於此情形，可利用通常使用的各式各樣的投予裝置。
將本發明之醫藥之有效成分調製作為液劑的情形，可將本發明之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，溶解於水性溶媒，因應必要，添加安定化劑、pH調整劑、界面活性劑等而調製。又，作成冷凍乾燥製劑的情形，可將如上述調製的液劑冷凍乾燥，使用時以生理食鹽水、注射用水、葡萄糖液等溶解來使用。
本發明之醫藥係藉由對於因為對GC-A作用使cGMP量上升而可加以治療的疾病之患者投予，而具有治療該疾病的效果。本文中，疾病或症狀之「治療」係指將藉由GC-A之活性化而期待正常化的病的症狀之進行加以延遲、減輕、緩和及/或抑制，而致使症狀接近正常化。藉由於疾病早期或疾病風險高的狀態下開始投予，被期待抑制疾病之重症化或發病的效果。又，過去 罹患該疾病者，有再發、或陷入慢性化的危險性，但藉由對此種患者繼續地投與本發明之醫藥，可期待再發或慢性化的風險減少。此種效果亦包含於治療。
就此種疾病而言，例如，高血壓、急性心衰竭(包含急性心衰竭發症後的病狀管理)、慢性心衰竭、缺血性心臟病、急性腎炎(包含急性腎炎發症後的病狀管理)、慢性腎炎、急性腎衰竭(包含急性腎衰竭發症後的病狀管理)、慢性腎衰竭、缺血性心臟病(心肌梗塞等)、惡性腫瘤之轉移、肝纖維化、肝硬化、透析中的組織之粘連、纖維化等。
[實施例]
以下，使用實施例，以具體地說明本發明。實施例所示者係本發明之實施形態之一例，本發明並未受此等例之限定。
實施例1係本發明之修飾胜肽之製造中間體之連結分子、GlcNAc化合物、糖物質或其衍生物之製造例，實施例2係使用彼等中間體之修飾胜肽之製造例。試驗例係試驗本發明之修飾胜肽之特性或效果之例。
[實施例1] <實施例1-1>
(1-1A)乙酸[(2R,3S,4R,5R,6R)-3,4-二乙醯氧基-6-羥基-5-(2,2,2-三氯乙氧基羰基胺基)四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物1-1A，下述式之化合物)之合成
將葡糖胺鹽酸鹽(10.0g，46.38mmol)與碳酸氫鈉(11.7g，139mmol)溶解於水(100mL)，室溫下滴加氯甲酸2,2,2-三氯乙酯(7.66mL，55.7mmol)，並攪拌1小時。於反應溶液中添加1N鹽酸並中和，濾取生成的沉澱。以水將固體洗淨後，以真空幫浦乾燥。將獲得的固體溶解於吡啶(50mL)，於室溫添加乙酸酐(24.1mL，255mmol)並攪拌整夜。減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(己烷：乙酸乙酯=80：20-33：67，v/v)，獲得呈無色油狀物之中間體之粗生成物(19.4g)。
將獲得的中間體之粗生成物(19.4g)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(200mL)，於室溫添加肼乙酸鹽(4.01g，44.5mmol)並攪拌1小時。將反應液以乙酸乙酯稀釋，以10%食鹽水洗淨2次，以飽和食鹽水洗淨1次。以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(己烷：乙酸乙酯=80：20-25：75，v/v)，獲得呈白色固體之目的物1-1A(11.6g，2步驟產率52%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：5.42(1H,d,J=9.8Hz),5.37-5.32(2H,m),5.16-5.10(1H,m),4.80(1H,d,J=11.7Hz),4.64(1H,d,J=12.1Hz),4.26-4.22(2H,m),4.17-4.12(1H,m),4.09-4.03(1H,m),3.46-3.43(1H,m),2.10(3H,s),2.05(3H,s),2.02(3H,s).
(1-1B)乙酸[(2R,3S,4R,5R,6S)-3,4-二乙醯氧基-6-(2,2,2-三氯乙烷亞胺基(ethaneimidoyl))氧基-5-(2,2,2-三氯乙氧基羰基胺基)四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物1-1B，下述式之化合物)之合成
將1-1A(5.00g，10.4mmol)溶解於二氯甲烷(35mL)，於0℃添加三氯乙腈(10.4mL，104mmol)與二氮雜雙環十一烯(0.467mL，3.12mmol)。將反應液升溫至室溫，並攪拌40分鐘。減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(己烷：乙酸乙酯=75：25-50：50，v/v)，獲得呈無色油狀物之目的物1-1B(3.70g，產率57%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.81(1H,s),6.43(1H,d,J=3.9Hz),5.37-5.34(1H,m),5.27-5.22(2H,m),4.72(2H,dd,J=16.2,11.9Hz),4.32-4.26(2H,m),4.16-4.10(2H,m),2.09(3H,s),2.06(6H,s).
(1-1C)(2S)-3-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基-2-(三級丁氧基羰基胺基)丙酸苄酯(化合物1-1C，下述式之化合物)之合成
將1-1B(2.77g，4.44mmol)溶解於二氯甲烷(50mL)，於室溫添加(2S)-2-(三級丁氧基羰基胺基)-3-羥基丙酸苄酯(1.31g，4.44mmol)與三氟甲磺酸三甲基矽酯(8.0μL，0.0444mmol)並攪拌1小時。添加三乙基胺(0.1 mL)並減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(己烷：乙酸乙酯=75：25-33：67，v/v)，獲得呈白色固體之中間體之粗生成物(2.01g)。
將獲得的中間體之粗生成物(2.01g)溶解於乙酸酐(50mL)，依序以0.1N鹽酸、甲醇、二乙醚洗淨，並於室溫添加經乾燥的鋅(1.5g，22.9mmol)，攪拌6小時。反應液以矽藻土過濾，減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化2次(己烷：乙酸乙酯=50：50-0：100，v/v)，獲得呈無色固體之目的物1-1C(0.846g，2步驟產率31%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.40-7.33(5H,m),5.52-5.43(2H,m),5.29-5.15(3H,m),5.04(1H,t,J=9.6Hz),4.70(1H,d,J=8.2Hz),4.49-4.46(1H,m),4.27-4.23(2H,m),4.11-4.07(1H,m),3.84(1H,dd,J=10.6,3.5Hz),3.75-3.73(1H,m),3.64-3.62(1H,m),2.07(3H,s),2.03(3H,s),2.02(3H,s),1.94(3H,s),1.46(9H,s).
(1-1D)(2S)-3-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基-2-(三級丁氧基羰基胺基)丙酸(化合物1-1D，下述式之化合物)之合成
於1-1C(846mg，1.35mmol)中添加10%鈀碳(約50%水濕潤品)(150mg)與乙酸乙酯(5mL)及乙醇(5mL)，並 於氫氣環境下於室溫攪拌3小時。藉由過濾反應液並減壓餾除溶媒，獲得呈無色油狀物(740mg)之中間體之粗生成物。
將獲得的中間體之粗生成物(740mg)溶解於甲醇(10mL)，添加0.5M甲醇鈉-甲醇溶液(14mL，7.0mmol)並於室溫攪拌20小時。於反應液中添加Dowex-50至反應液成為弱酸性後，藉由過濾並減壓餾除溶媒，獲得呈淡褐色固體(543mg，2步驟產率98%)之目的物1-1D。
1H-NMR(CD3OD)δ：4.44(1H,d,J=8.8Hz),4.28-4.25(1H,m),4.16(1H,dd,J=10.4,4.4Hz),3.87(1H,dd,J=12.0,2.0Hz),3.80(1H,dd,J=10.4,4.4Hz),3.68(1H,dd,J=12.0,5.6Hz),3.62-3.58(1H,m),3.45(1H,dd,J=10.5,8.5Hz),3.29-3.24(2H,m),2.00(3H,s),1.44(9H,s).
FAB-MS：計算值C16H28N2O10：[M+H]+ 409，實測值409.。
<實施例1-2>
(1-2A)2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙酸苄酯(化合物1-2A，下述式之化合物)之合成
將依據Bull.Chem.Soc.Jpn.,2003,76,485-500之記載而製造的4’,5’-二氫-2-甲基唑并 [5’,4’：1,2]-3,4,6-三-O-乙醯基-1,2-二去氧-α-葡萄哌喃糖(4.30g，13.1mmol)溶解於二氯乙烷(50ml)，於室溫添加羥乙酸苄酯(5.56ml，39.1mmol)、p-甲苯磺酸吡啶鎓(1.64g，6.53mmol)，加熱回流3小時。冷卻反應溶液後，冰冷下，加到飽和碳酸氫鈉水溶液中，以二氯甲烷萃取有機物。將有機層以1N鹽酸水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(己烷：乙酸乙酯=60：40-0：100，v/v)，獲得呈無色固體(3.45g，產率53%)之目的物1-2A。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.37-7.34(5H,m),5.85(1H,d,J=8.8Hz),5.16-5.08(4H,m),4.66(1H,d,J=8.3Hz),4.33(2H,s),4.22(1H,dd,J=12.2,4.4Hz),4.09(1H,dd,J=12.2,2.4Hz),4.07-4.02(1H,m),3.64-3.62(1H,m),2.05(3H,s),2.01(3H,s),1.99(3H,s),1.91(3H,s).
(1-2B)2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙酸(化合物1-2B，下述式之化合物)之合成
將1-2A(3.45g，6.96mmol)溶解於甲醇(54ml)，添加20%氫氧化鈀碳(690mg)，並於氫氣環境下室溫中攪拌3.0小時。以矽藻土過濾，並減壓餾除溶媒。添加二異丙基醚而濾取獲得的固體，獲得呈無色固體(2.72g，產率96%)之目的物1-2B。
1H-NMR(CDCl3)δ：6.36(1H,d,J=8.8Hz),5.21-5.10(2H,m),4.70(1H,d,J=8.8Hz),4.39(1H,d,J=16.9Hz),4.32(1H,d,J=16.9Hz),4.28(1H,dd,J=12.2,4.9Hz),4.15(1H,dd,J=12.2,2.4Hz),4.11-4.05(1H,m)3.72-3.70(1H,m),2.10(3H,s),2.07(3H,s),2.04(3H,s),1.97(3H,s).
(1-2C)2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙酸(化合物1-2C，下述式之化合物)之合成
將1-2B(2.72g，6.73mmol)溶解於甲醇(42ml)，於室溫添加5mol/L甲醇鈉-甲醇溶液(2ml,10mmol)後，於室溫攪拌一晚。反應結束後，添加蒸餾水(4ml)後，添加離子交換樹脂(Dawex50wx8)並作成pH3，過濾反應溶液，並減壓餾除溶媒。添加二異丙基醚而濾取獲得的固體，獲得呈無色固體(2.72g，產率96%)之目的物1-2C。
1H-NMR(D2O,TMSP)δ：4.57(1H,d,J=8.6Hz),4.17(2H,s),3.91(1H,dd,J=12.5,1.6Hz),3.77-3.72(2H,m),3.56-3.41(3H,m),2.05(3H,s).
ESI-LC-MS：計算值C10H17NO8：[M+H]+ 280，實測值280.。
<實施例1-3>
(1-3A)3-[2[2[2[2[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙 醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-3A，下述式之化合物)之合成
將1.20mmol/g之2-氯三苯甲基氯樹脂(694mg，0.833mmol)置入固相合成用之管柱，添加二氯甲烷(5mL)並振盪5分鐘。過濾後，添加3-[2[2[2[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(488mg，1mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(730μL，4.17mmol)之二氯甲烷(5mL)溶液，並於室溫攪拌2小時。過濾後，以二氯甲烷混合溶液(二氯甲烷：甲醇：N,N-二異丙基乙基胺=85：10：5，v/v)洗淨3次、以二氯甲烷洗淨3次、以N,N-二甲基甲醯胺洗淨3次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(5mL)並振盪5分鐘後過濾；進行此操作4次。以N,N-二甲基甲醯胺洗淨3次、以二氯甲烷洗淨3次、以二乙醚洗淨3次，並以真空幫浦乾燥。獲得的樹脂(800mg)之中，將一部分(200mg)置入固相合成用之管柱，添加N,N-二甲基甲醯胺(2.5mL)、三乙基胺(406μL，2.92mmol)、水(0.5mL)。於其中，添加將1-2C(174mg，0.625mmol)與N,N-二甲基甲醯胺(3mL)與三乙基胺(174μL，1.25mmol)與二甲基硫代磷醯氯(80mg，0.625mmol)於室溫攪拌1小時的溶液。於室溫攪拌2小時後，過濾並將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨3次、以二氯甲烷洗淨3次。添加1%三氟乙酸/二氯甲烷溶液(2mL)，並振盪2分鐘後回收氯液；進行此操作10次。減壓餾除回收 的溶液而獲得粗生成物。藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，獲得呈白色固體(25mg)之目的物1-3A。
ESI-LC-MS：計算值C21H38N2O13：[M+H]+ 526，實測值526.。
<實施例1-4>
(1-4A)3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-4A，下述式之化合物)之合成
將3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(320mg，0.38mmol)溶解於甲醇(2ml)與蒸餾水(2ml)，於0℃添加1N氫氧化鈉水溶液(1ml)，並於室溫攪拌1.5小時。於0℃添加1N鹽酸(1ml)，並於減壓下餾除有機溶媒。添加蒸餾水(10ml)，並以二氯甲烷洗淨後，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，作冷凍乾燥而獲得呈無色油狀物質之目的物1-4A(233.5mg，99%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.63(2H,br s),3.79(2H,t,J=5.1Hz),3.75(2H,t,J=5.9Hz),3.70-3.68(2H,m),3.65-3.61(42H,m),3.21-3.17(2H,m),2.58(2H,t,J=5.9Hz).
(1-4B)3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-4B，下述式之化合物)之合成
將1-2C(36.6mg，0.13mmol)溶解於二甲基甲醯胺(500μl)，於室溫添加三乙基胺(45.7μl，0.33mmol)後，於0℃添加二甲基硫代磷醯氯(16.9mg，0.13mmol)之二甲基甲醯胺溶液(500μl)，並於0℃攪拌0.5小時。
將1-4A(67.5mg，0.11mmol)溶解於二甲基甲醯胺(500μl)，於0℃添加調製的活性酯，並於室溫攪拌6小時。添加蒸餾水(3ml)、乙酸(100μl)，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，作冷凍乾燥，而獲得呈無色油狀物質之目的物1-4B(31.0mg，32%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.62(1H,d,J=6.8Hz),7.40(1H,t,J=5.4Hz),4.47(1H,d,J=8.3Hz),4.27(1H,d,J= 16.1Hz),4.22(1H,d,J=16.1Hz),3.90(1H,dd,J=12.0,3.2Hz),3.81(1H,dd,J=12.2,4.9Hz),3.77(2H,t,J=6.1Hz),3.74-3.52(54H,m),3.39-3.34(2H,m),2.59(2H,t,J=6.1Hz),2.08(3H,s).
MALDI-TOF-MS：計算值C37H70N2O21：[M+Na]+ 901，實測值901.。
<實施例1-5>
(1-5A)3-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]胺基-2-(三級丁氧基羰基胺基)-4-側氧丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-5A，下述式之化合物)之合成
將3-[2-[2-[2-[2-(三級丁氧基羰基胺基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(200mg，0.547mmol)溶於4N鹽酸-二烷溶液(2mL)，於室溫攪拌1小時。減壓餾除溶媒並以真空幫浦乾燥，獲得呈淡褐色油狀物(165mg)之中間體之粗生成物。
將依據J.Am.Chem.Soc.,1999,121,284-290.之手法所製造的(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]胺基]-2-(三級丁氧基 羰基胺基)-4-側氧丁酸(158mg，0.364mmol)及HATU(138mg，0.364mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(3mL)，添加N,N-二異丙基乙基胺(128μL，0.728mmol)，並於室溫攪拌1分鐘。將此溶液加到獲得的中間體之粗生成物(54.9mg)，再添加N,N-二異丙基乙基胺(128μL，0.728mmol)而於室溫攪拌0.5小時。將反應液以水稀釋，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，獲得呈白色固體(53mg，2步驟產率43%)之目的物1-5A。
ESI-LC-MS：計算值C28H50N4O15：[M+H]+ 683，實測值683.
(1-5B)3-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]胺基]-2-[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙醯基]胺基]-4-側氧丁醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-5B，下述式之化合物)之合成
於1-5A(53mg，0.0777mmol)中添加30%三氟乙酸水溶液，並於室溫攪拌7小時。以水稀釋並進行冷凍乾燥，獲得呈淡褐色油狀物(45mg)之中間體之粗生成物。
將1-2C(65.1mg，0.233mmol)與三乙基胺(65μL，0.466mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)，並於0℃添加二甲基硫代磷醯氯(30mg，0.233mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(0.5mL)溶液。升溫至室溫，並攪拌1小時。將此溶液冷卻至0℃，添加獲得的中間體之粗生成物(45mg)與三乙基胺(152μL，1.088mmol)與N,N-二甲基甲醯胺(2.5mL)與水(0.5mL)之混合溶液。升溫至室溫，並攪拌8小時。反應液以水稀釋，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，獲得呈白色固體(9.25mg，2步驟產率14%)之目的物1-5B。
MALDI-TOF-MS：計算值C33H57N5O20：[M+H]+ 844，實測值844.。
<實施例1-6>
(1-6A)乙酸[(2R,3S,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-3,4-二乙醯氧基-6-[2-(4-硝基苯基)乙氧基]四氫哌喃-2-基]甲基(化合物1-6A，下述式之化合物)之合成
將依據Bull.Chem.Soc.Jpn.,2003,76,485-500之記載所製造的4,5-二氫-2-甲基唑并[5’,4’：1,2]-3,4,6-三-O-乙醯基-1,2-二去氧-α-葡萄哌喃糖(1.00g，3.04mmol)溶解於二氯乙烷(10ml)，於室溫添加分子篩 4A(312mg)、2-(4-硝基苯基)-乙醇(2.54g，15.2mmol)、(+)-樟腦磺酸(0.78g，3.34mmol)，並於60℃攪拌3小時。將反應溶液添加至飽和碳酸氫鈉水溶液，以乙酸乙酯萃取有機物。將有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(己烷：乙酸乙酯=67：33-0：100，v/v)，獲得呈無色固體(1.51g，產率65%)之目的物1-6A。
1H-NMR(CDCl3)δ：8.14(2H,d,J=8.9Hz),7.38(2H,d,J=9.0Hz),5.32(1H,d,J=8.6Hz),5.21(1H,dd,J=10.6,9.4Hz),5.07(1H,t,J=9.6Hz),4.63(1H,d,J=8.2Hz),4.25(1H,dd,J=12.1,4.7Hz),4.20-4.12(2H,m),3.88(1H,dt,J=10.6,8.6Hz),3.72-3.64(2H,m),3.06-2.93(2H,m),2.09(3H,s),2.03(3H,s),2.03(3H,s),1.84(3H,s).
(1-6B)乙酸[(2R,3S,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-3,4-二乙醯氧基-6-[2-(4-胺基苯基)乙氧基]四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物1-6B，下述式之化合物)之合成
將1-6A(982.0mg，1.98mmol)溶解於乙酸乙酯(12ml)與乙醇(12ml)，添加10%鈀碳(250mg)，氫氣環境下於室溫攪拌1.5小時。以矽藻土過濾，減壓餾除溶媒，獲得呈無色固體(758mg，產率82%)之目的物1-6B。
1H-NMR(CDCl3)δ：6.99(2H,d,J=8.6Hz),6.61(2H,d,J=8.6Hz),5.32(1H,d,J=9.0Hz),5.24(1H,dd,J=10.6,9.4Hz),5.06(1H,t,J=9.6Hz),4.60(1H,d,J=8.2Hz),4.26(1H,dd,J=12.1,4.7Hz),4.15-4.04(3H,m),3.84(1H,dt,J=10.6,8.4Hz),3.68-3.58(4H,m),2.78-2.77(2H,m),2.09(3H,s),2.02(3H,s),2.02(3H,s),1.88(3H,s).
(1-6C)乙酸[(2R,3S,4R,5R,6R)-5-乙醯胺-3,4-二乙醯氧基-6-[2-[4-[(乙氧基羰基胺基)胺甲醯基胺基]苯基]乙氧基]四氫哌喃-2-基]甲酯(化合物1-6C，下述式之化合物)之合成
將1-6B(568.0mg，1.22mmol)溶解於四氫呋喃(22ml)，於室溫添加三乙基胺(424μl，3.04mmol)後，於-10℃添加氯甲酸4-硝基苯酯(441.8mg，2.19mmol)，於室溫攪拌1.5小時。於室溫添加三乙基胺(424μl，3.04mmol)後，添加肼甲酸乙酯(228.2mg，2.19mmol)，於室溫攪拌30分鐘。將反應溶液加到水中，以乙酸乙酯萃取有機物2次。將有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(二氯甲烷：甲醇=100：0-90：10，v/v)， 獲得呈無色泡狀物質(650.4mg，產率90%)之目的物1-6C。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.88(1H,br s),7.24(2H,s),7.02(2H,d,J=8.2Hz),6.58(1H,br s),5.27(1H,t,J=10.0Hz),5.04(1H,t,J=10.0Hz),4.64(1H,d,J=8.6Hz),4.27-4.05(5H,m),3.90-3.81(1H,m),3.73-3.68(1H,m),3.61-3.55(1H,m),3.49(2H,d,J=4.3Hz),2.85-2.70(2H,m),2.07(3H,s),2.00(6H,s),1.82(3H,s),1.27(3H,t,J=9.4Hz).
(1-6D)N-[(2R,3S,4R,5R,6R)-3-乙醯胺2-[2-[4-(3,5-二側氧-1,2,4-三唑啶-4-基)苯基]乙氧基]-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-3-基]乙醯胺(化合物1-6D，下述式之化合物)之合成
將1-6C(650.0mg，1.09mmol)溶解於甲醇(30ml)，於室溫添加碳酸鉀(451.8mg，3.27mmol)並於60℃攪拌9.5小時。冷卻至室溫後，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得呈無色固體(462.4mg，85%)之目的物1-6D。
1H-NMR(CD3OD)δ：7.35(4H,dd,J=13.1,8.8Hz),4.36(1H,d,J=8.2Hz),4.17(1H,dt,J=11.0,4.8Hz),3.87(1H,dd,J=11.9,2.2Hz),3.70-3.62(3H,m),3.39(1H,dd,J=10.2,8.6Hz),3.28-3.22(2H,m),2.90(2H,t,J=6.3Hz).
ESI-TOF-MS：計算值C18H24N4O8：[M+H]+ 425，實測值425.。
<實施例1-7>
(1-7A)2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙基胺(化合物1-7A，下述式之化合物)之合成
將N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙基疊氮(500mg，1.72mmol)溶解於乙醇(20ml)，添加10%鈀碳(200mg)，氫氣環境下於室溫攪拌3小時。以矽藻土過濾，減壓餾除溶媒而獲得呈無色固體(460mg，產率定量)之目的物1-7A。
1H-NMR(CD3OD)δ：4.38(1H,d,J=8.3Hz),3.90-3.82(2H,m),3.69-3.55(2H,m),3.46-3.40(1H,m),2.80-2.73(2H,m),1.98(3H,s).
(1-7B)N-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙基]-3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙醯胺(化合物1-7B，下述式之化合物)之合成
將1-7A(100mg，0.378mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺，添加3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙酸2,5-二側氧吡咯啶-1-基酯(0.126mg，0.473mmol)，於室溫攪拌3小時。反應液以水稀釋，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，獲得呈白色固體(93mg，產率59%)之目的物1-7B。
1H-NMR(CD3OD)δ：6.82(2H,s),4.38(1H,d,J=8.6Hz),3.89-3.87(1H,m),3.78-3.75(3H,m),3.66-3.62(3H,m),3.44-3.38(1H,m),2.67(4H,s),2.46(2H,t,J=7.0Hz),1.98(3H,s).
ESI-LC-MS：計算值C17H25N3O9：[M+H]+ 416，實測值416.。
<實施例1-8>
(1-8A)2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-乙醯胺-3-三苯甲基硫烷基丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-三苯甲基硫烷基丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-三苯甲基硫烷基丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-三苯甲基硫烷基丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-三苯甲基硫烷基丙醯基]胺基]乙酸(化合物1-8A，下述式之化合物)之合成
將1.20mmol/g之2-氯三苯甲基氯樹脂(833mg，1.00mmol)置入固相合成用之管柱，添加二氯甲烷(7.5mL)並振盪l0分鐘。過濾後，添加2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙酸(594mg，2mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(0.86mL，5mmol)之二氯甲烷(7.5mL)溶液，並於室溫攪拌2小時。過濾後，以二氯甲烷混合溶液(二氯甲烷：甲醇：N,N-二異丙基乙基胺=85：10：5，v/v)洗淨3次、以二氯甲烷洗淨3次、以二乙醚洗淨3次。以真空幫浦乾燥，回收樹脂(1.83g)。將回收的樹脂之一部分(1.37g)置入固相合成用之管柱。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(20mL)並振盪5分鐘，過濾反應液；進行此操作4次。以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，添加(2R)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32g，2,25mmol)與HATU(856mg，2.25mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(582μL，4.50mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(15mL)並於室溫振盪30分鐘。過濾後，以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(20mL)並振盪5分鐘，過濾反應液；進行此操作4次。以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，添加2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙酸(669mg，2.25mmol)與HATU(856mg，2.25mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(582μL，4.50mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(15mL)並於室溫振盪30分 鐘。過濾後，以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(20mL)並振盪5分鐘，過濾反應液；進行此操作4次。以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，添加(2R)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32g，2,25mmol)與HATU(856mg，2.25mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(582μL，4.50mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(15mL)並於室溫振盪30分鐘。過濾後，以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(20mL)並振盪5分鐘，過濾反應液；進行此操作4次。以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，添加2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙酸(669mg，2.25mmol)與HATU(856mg，2.25mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(582μL，4.50mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(15mL)並於室溫振盪30分鐘。過濾後，以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(20mL)並振盪5分鐘，過濾反應液；進行此操作4次。以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，添加(2R)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32g，2,25mmol)與HATU(856mg，2.25mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(582μL，4.50mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(15mL)並於室溫振盪30分鐘。過濾後，以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(20mL)並振盪5分鐘，過濾反應液；進行此操作4次。以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，添加2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙酸(669mg，2.25mmol)與HATU(856mg，2.25 mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(582μL，4.50mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(15mL)並於室溫振盪30分鐘。過濾後，以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(20mL)並振盪5分鐘，過濾反應液；進行此操作4次。以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，添加(2R)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32g，2,25mmol)與HATU(856mg，2.25mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(582μL，4.50mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(15mL)並於室溫振盪30分鐘。過濾後，以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(20mL)並振盪5分鐘，過濾反應液；進行此操作4次。以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，添加2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙酸(669mg，2.25mmol)與HATU(856mg，2.25mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(582μL，4.50mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(15mL)並於室溫振盪30分鐘。過濾後，以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(20mL)並振盪5分鐘，過濾反應液；進行此操作4次。以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，添加(2R)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32g，2,25mmol)與HATU(856mg，2.25mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(582μL，4.50mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(15mL)並於室溫振盪30分鐘。過濾後，以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(20mL)並振盪5分鐘，過濾反應液；進行此操作4次。以N,N-二甲 基甲醯胺洗淨4次，以二氯甲烷洗淨4次，以二乙醚洗淨4次。以真空幫浦乾燥，回收樹脂(1.83g)。將經回收的樹脂之一部分(360mg)置入固相合成用之管柱。添加乙酸(27mg，0.45mmol)與HATU(171mg，0.45mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(154μL，0.90mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(5mL)並於室溫振盪30分鐘。過濾後，將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，以二氯甲烷洗淨4次。添加1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(1mL)與二氯甲烷(3mL)之混合溶液，並於室溫振盪1.5小時。過濾而去除樹脂，減壓下濃縮濾液。藉由以二氯甲烷共沸3次，並以真空幫浦乾燥，獲得呈褐色固體(176mg)之目的物1-8A。
MALDI-TOF-MS：計算值C122H114N10O12S5：[M+Na]+ 2094，實測值2094.。
<實施例1-9>
(1-9A)2-[[(2S)-2,6-雙(三級丁氧基羰基胺基)己醯基]胺基]乙酸苄酯(化合物1-9A，下述式之化合物)之合成
於(2S)-2,6-雙(三級丁氧基羰基胺基)己酸(1.70g，5.00mmol)、2-胺基乙酸苄酯(1.00g，5.00mmol)及HATU(2.90g，7.50mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(25mL)中，添加N，N-二異丙基乙基胺(2.60mL，15.0 mmol)，並於室溫攪拌20小時。將反應溶液加到水中，以乙酸乙酯萃取有機物。將有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(己烷：乙酸乙酯=90：10-0：100，v/v)，獲得呈淡黃色油狀物(2.30g，產率93%)之目的物1-9A。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.40-7.33(5H,m),6.63(1H,s),5.18(2H,s),5.11(1H,s),4.63(1H,s),4.15-4.03(3H,m),3.16-3.06(2H,m),1.91-1.81(1H,m),1.70-1.59(1H,m),1.53-1.24(22H,m).
MS(ESI)：計算值C25H40N3O7：[M+H]+ 494，實測值494.
(1-9B)2-[[(2S)-2,6-雙(三級丁氧基羰基胺基)己醯基]胺基]乙酸苄酯(物質1-9B，下述式之化合物)之合成
將1-9A(250mg，0.507mmol)溶解於二氯甲烷(3.0ml)，添加三氟乙酸(1.0mL)，於室溫攪拌1小時。減壓餾除溶媒而獲得呈淡黃色油狀物(247mg，產率100%)之目的物1-9B。
1H-NMR(DMSO-d6)δ：8.95(1H,t,J=5.9Hz),8.18(2H,s),7.71(2H,s),7.42-7.34(5H,m),5.16(2H,d,J=12.5Hz),4.12-3.96(2H,m),3.87-3.78(1H,m),2.78-2.66 (2H,m),1.76-1.66(2H,m),1.54-1.47(2H,m),1.40-1.31(2H,m).
(1-9C)2-[[(2S)-2,6-雙[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙醯基]胺基]己醯基]胺基]乙酸苄酯(化合物1-9C，下述式之化合物)之合成
使用1-9B(93.0mg，0.190mmol)及1-2C(160mg，0.573mmol)，依據與(1-5B)同樣之方法，獲得呈無色泡狀物質(180mg，產率88%)之目的物1-9C。
1H-NMR(CD3OD)δ：7.39-7.29(5H,m),5.16(2H,s),4.94-4.84(2H,m),4.46-4.39(3H,m),4.33-4.27(2H,m),4.13-4.00(3H,m),3.94(1H,d,J=17.6Hz),3.91-3.84(2H,m),3.78-3.66(4H,m),3.50-3.42(2H,m),3.38-3.28(2H,m),3.22(2H,t,J=6.6Hz),2.03(3H,s),2.01(3H,s),1.88-1.81(1H,m),1.78-1.67(1H,m),1.58-1.50(2H,m),1.48-1.35(2H,m).
(1-9D)2-[[(2S)-2,6-雙[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙醯基]胺基]己醯基]胺基]乙酸(化合物1-9D，下述式之化合物)之合成
將1-9C(180mg，0.221mmol)溶解於甲醇(50ml)，添加10%鈀碳(180mg)，並於氫氣環境下於室溫攪拌2小時。以矽藻土過濾，減壓餾除溶媒而獲得呈淡黃色泡狀物質(160mg，產率100%)之目的物1-9D。
MS(ESI)：計算值C28H48N5O17：[M+H]+ 726，實測值726.。
<實施例1-10>
(1-10A)2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-乙醯胺-3-硫烷基丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-硫烷基丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-硫烷基丙醯基]胺基]乙酸(化合物1-10A，下述式之化合物)之合成
將1.20mmol/g之2-氯三苯甲基氯樹脂(208mg，0.25mmol)置入固相合成用之管柱，添加二氯甲烷(2.5mL)並振盪10分鐘。過濾後，添加2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙酸(149mg，0.5mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(219μL，1.25mmol)之二氯甲烷(2.5mL)溶液，並於室溫攪拌2小時。過濾後，以二氯甲烷混合溶液(二氯甲烷：甲醇：N,N-二異丙基乙基胺=85：10：5，v/v)洗淨3次、 以二氯甲烷洗淨3次、以N,N-二甲基甲醯胺洗淨3次。藉由將獲得的樹脂設置於AppliedBiosystems公司製之胜肽合成機433A Peptide Synthesizer，以合成機進行脫保護、縮合、脫保護、縮合、脫保護、縮合、脫保護、縮合、脫保護、縮合、脫保護、縮合，而將胜肽鏈伸長。於脫保護係使用哌啶與N-甲基吡咯啶酮，於縮合反應係使用HATU與N,N-二異丙基乙基胺與N-甲基吡咯啶酮與各種羧酸。羧酸係以(2R)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸、2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙酸、(2R)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸、2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙酸、(2R)-2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸、乙酸之順序使用於各縮合反應。將獲得的樹脂(900mg)之半量(450mg)置入固相合成用之管柱，添加三氟乙酸(2.64mL)與水(0.27mL)與苯酚(0.06g)與三異丙基矽烷(0.03mL)之混合溶液。於室溫振盪2小時，餾除三氟乙酸。反應液以水稀釋，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，獲得呈白色固體(11mg，產率16%)之目的物1-10A。
ESI-LC-MS：計算值C17H28N6O8S3：[M+H]+ 541，實測值541.
(1-10B)2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-乙醯胺-3-[1-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙基胺基]-3-側氧丙 基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]硫烷基丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-[1-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙基胺基]-3-側氧丙基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]硫烷基丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-[1-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙基胺基]-3-側氧丙基]-2,5-二側氧吡咯啶-3-基]硫烷基丙醯基]胺基]乙酸(化合物1-10B，下述式之化合物)之合成
將1-10B(11mg，0.0203mmol)與1-7B(33mg，0.0794mmol)溶解於乙腈(1mL)與0.2M pH=6.75之磷酸緩衝液(1mL)之混合溶液，於室溫攪拌2小時。反應液以水稀釋，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，獲得呈白色固體(27mg，產率74%)之目的物1-10B。
MALDI-TOF-MS：計算值C68H103N15O35S3：[M-H]+ 1784，實測值1784.。
<實施例1-11>
(1-11A)N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙基胺 三氟乙酸鹽(化合物1-11A，下述式之化合物)之合成
使1-7A(120mg)溶解於蒸餾水(6ml)後，添加三氟乙酸(48μl)，並冷凍乾燥。獲得的非晶質狀之固體1-11A係未純化來使用。
(1-11B)SG-NH2(化合物1-11B，由下述式而成的化合物)之合成
使唾液酸糖肽(60mg)溶解於0.2M磷酸緩衝溶液(pH6.25)(260μl)後，添加糖合成酶(Glycosynthase)(Endo-M-N175Q，東京化成工業(股)，1U/ml)水溶液(100μl)。再者，添加1-11A(28mg)之0.2M磷酸緩衝溶液(pH6.25)(160μl)，並於28℃使其反應72小時。於反應液中添加0.2%三氟乙酸水溶液(2480μl)並使反應停止，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液及0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-NH2(28.5mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C86H143N7O62：[M-H]-2264.8，實測值2264.8
(1-11C)SG-I(化合物1-11C，由下述式而成的化合物)之合成
將(1-11B)製造的SG-NH2(15.0mg)於43mM碳酸氫鈉水溶液(750μl)，冰冷下，添加30mM碘乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯-丙酮溶液(250μl)，並於室溫攪拌1小時。於反應液中添加乙酸(1.8μl)並使反應停止，減壓下，去除有機溶媒。藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-I(13.4mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C88H144IN7O63：[M+2H]2+ 1218.5(平均)，實測值1218.3。
<實施例1-12>
(1-12A)SG-Oxa(化合物1-12a，由下述式而成的化合物)之合成
將二唾液酸八糖(disialo octasaccharide)(東京化成工業(股)，26.0mg，12.8μmol)溶解於蒸餾水(210μl)，於室溫添加三乙基胺(80.7μl，579μmol)。於0℃添加2-氯-1,3-二甲基咪唑鎓氯(32.6mg，192μmol)之水溶液(52l)，並於0℃攪拌2小時。以Sephadex G15(0.03% NH3水溶液)純化，添加0.1N氫氧化鈉水溶液(100μl)並冷凍乾燥，獲得呈無色固體(24.6mg，95%)之目的物SG-Oxa。
NMR(於D2O)(第1圖之圖表)。
<實施例1-13>
(1-13A)SG-M(化合物1-13a，由下述式而成的化合物)之合成
使(1-11B)製造的SG-NH2(30.0mg)溶解於43mM碳酸氫鈉水溶液(1500ul)，冰冷下，添加13.9mM3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丁酸N-羥基琥珀醯亞胺酯-丙酮溶液(500ul)，並於室溫攪拌1小時。於反應液中添加乙酸(3.6ul)而使反應停止，減壓下，去除有機溶媒。藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-M(29mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C93H148N8O65：[M+2H]2+ 1209.4，實測值1209.4。
<實施例1-14>
(1-14A)2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙酸 銨鹽(化合物1-14A，下述式之化合物)之合成
使1-2C(200mg)溶解於蒸餾水(2ml)後，添加28-30%氨水(100μl)，並冷凍乾燥。獲得的非晶質狀之固體1-14A係未純化即使用。
(1-14B)SG-A(化合物1-14B，由下述式而成的化合物)之合成
使唾液酸糖肽(58mg)溶解於0.2M磷酸緩衝溶液(pH6.25)(254μl)後，添加糖合成酶(Endo-M-N175Q，東京化成工業(股)，1U/ml)水溶液(100μl)。再者，添加1-14A(24mg)之0.2M磷酸緩衝溶液(pH6.25)(152μl)，並於28℃使其反應72小時。於反應液中添加0.2%三氟乙 酸水溶液(3000μl)並使反應停止，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(資生堂，Proteonavi)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-A(19.5mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C86H140N6O64：[M+2H]2+ 1142.0(平均)，實測值1141.4
<實施例1-15>
(1-15A)(2S)-2-[3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙醯基胺基]戊烷二甲酸二(三級丁酯)(化合物1-15A，下述式之化合物)之合成
將(2S)-2-胺基戊烷二甲酸二(三級丁酯)鹽酸鹽(295mg，1.00mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(5.0mL)冷卻至0℃，依序添加N,N-二異丙基乙基胺(0.510mL，3.00mmol)及(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙酸酯(293mg，1.10mmol)，並於0℃攪拌1小時，再升溫至室溫，於室溫攪拌18小時。於反應溶液中添加乙酸乙酯，將有機層依序以1M鹽酸及飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(己烷：乙酸乙酯=95：5-0：100，v/v)，獲得呈淡黃色油狀物(400mg，產率98%)之目的物1-15A。
1H-NMR(CDCl3)δ：6.70(2H,s),6.22(1H,d,J=7.8Hz),4.48-4.42(1H,m),3.91-3.79(2H,m),2.60-2.52(2H,m),2.35-2.18(2H,m),2.13-2.04(1H,m),1.93-1.84(1H,m),1.46(9H,s),1.44(9H,s).
(1-15B)(2S)-2-[3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙醯基胺基]戊烷二甲酸(化合物1-15B，下述式之化合物)之合成
使用1-15A(400mg，0.976mmol)，依據與(1-9B)同樣之手法，獲得目的物1-15B(260mg，產率89%)。
MS(ESI)：計算值C12H15N2O7：[M+H]+ 299，實測值299.
(1-15C)SG-(SG-Gln*)-Mal(化合物1-15C，由下述式而成的化合物)之合成
將1-15B(30.0mg，0.101mmol)及N-羥基琥珀醯亞胺(58.0mg，0.504mmol)之二氯甲烷溶液(0.400mL)冷卻至0℃，依序添加吡啶(0.200mL，2.48mmol)及三氟乙酸酐(70.0μL，0.500mmol)，並於0℃攪拌10分鐘。升溫至室溫，於室溫再攪拌30分鐘。於反應溶液中添加二氯甲烷，將有機層以1M鹽酸洗淨後，以無水硫酸鈉乾 燥，過濾，減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(二氯甲烷：乙酸乙酯=25：75-0：100，v/v)，獲得淡黃色泡狀物質(25mg)。
接著，將獲得的生成物之一部分(2.00mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(200μL)，添加於(1-11B)所製造的SG-NH2(20.0mg，8.41μmol)及N,N-二異丙基乙基胺(15μL，88.0μmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(600μL)，並於室溫攪拌2小時。於反應溶液中添加0.2%三氟乙酸水溶液(2.0mL)，並藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-(SG-Gln*)-Mal(15.0mg，產率76%)。
ESI-TOF-MS：計算值C184H299N16O129：[M+3H]3+ 1599.7(平均)，實測值1599.6.
<實施例1-16>
(1-16A)(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙醯基胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基胺基]戊烷二甲酸二(三級丁酯)(化合物1-16A，下述式之化合物)之合成
將(2S)-2-胺基戊烷二甲酸二(三級丁酯)鹽酸鹽(58.0mg，0.196mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(1.0mL)冷卻至0℃，依序添加N,N-二異丙基乙基胺(0.100mL，0.588 mmol)及3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙醯基胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(2,5-二側氧吡咯啶-1-基酯)(100mg，0.195mmol)，於0℃攪拌1小時，再升溫至室溫，於室溫攪拌20小時。於反應溶液中添加乙酸乙酯，並將有機層依序以1M鹽酸及飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(二氯甲烷：甲醇=98：2-90：10，v/v)，獲得呈淡黃色油狀物(100mg，產率78%)之目的物1-16A。
1H-NMR(CDCl3)δ：6.84(1H,br s),6.70(2H,s),6.46(1H,br s),4.53-4.45(1H,m),3.85(2H,t,J=7.2Hz),3.80-3.71(2H,m),3.68-3.60(12H,m),3.54(2H,t,J=5.1Hz),3.42(2H,q,J=5.1Hz),2.54-2.49(4H,m),2.37-2.21(2H,m),2.16-2.07(1H,m),1.92-1.83(1H,m),1.46(9H,s),1.43(9H,s).
MS(ESI)：計算值C31H52N3O12：[M+H]+ 658，實測值658.
(1-16B)(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙醯基胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基胺基]戊二酸(化合物1-16B，下述式之化合物)之合成
使用1-16(100mg，0.152mmol)，依據與(1-9B)同樣之手法，獲得目的物1-16B(83mg，產率100%)。
MS(ESI)：計算值C23H36N3O12：[M+H]+ 546，實測值546.
(1-16C)SG-(SG-Gln*)-PEG(3)-Mal(化合物1-16C，下述式之化合物)之合成
將1-16B(32.0mg，58.7μmol)及N-羥基琥珀醯亞胺(34.0mg，0.295mmol)之二氯甲烷溶液(0.400mL)冷卻至0℃，依序添加吡啶(0.200mL，2.48mmol)及三氟乙酸酐(42.0μL，0.300mmol)，並於0℃攪拌30分鐘。升溫至室溫，於室溫再攪拌2小時。於反應溶液中添加二氯甲烷，將有機層以1M鹽酸洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓餾除溶媒而粗生成物(35mg)。
接著，將獲得的粗生成物之一部分(0.31mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(20μL)，添加於(1-11B)所製造的SG-NH2(2.0mg，0.88μmol)及N,N-二異丙基乙基胺(1.5μL，8.8μmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(30μL)中，並於室溫攪拌18小時。於反應溶液中添加0.2%三氟乙酸水溶液(2.0mL)，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-(SG-Gln*)-PEG(3)-Mal(0.60mg，產率28%)。
ESI-TOF-MS：計算值C195H320N17O134：[M+3H]3+ 1682.2(平均)，實測值1682.2.。
<實施例1-17>
(1-17A)AG(9)-P(化合物1-17A，下述式之化合物1)之合成
使唾液酸糖肽(200mg)溶解於0.2M乙酸緩衝液(pH5.0)(1000μl)後，添加神經胺糖酸酶([E.C.3.2.1.18]，Nacalai Tesque，1U/ml)水溶液(1000μl)，並於37℃使其反應17小時。反應結束後，添加0.2%三氟乙酸水溶液(2000μl)。將此反應收集2批分，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物AG(9)-P(307mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C90H155N13O54：[M+2H]2+ 1142.6(平均)，實測值1142.0
(1-17B)AG(7)-P(化合物1-17B，下述式之化合物)之合成
使(1-17A)所製造的AG(9)-P(100mg)、硫酸鎂(0.48mg)、β-D-半乳糖苷酶(WAKO,600U/mg)(2mg)溶解於0.2M磷酸緩衝液(pH7.0)(2000μl)，於37℃使其反應24小時。添加β-D-半乳糖苷酶(WAKO,600U/mg)(1mg)，再使其反應24小時。反應結束後，添加0.2%三氟乙酸水溶液(2000μl)。將此反應收集2批分，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物AG(7)-P(158mg)。
ESI-TOF-MS：計算值[M+H]+ C78H135N13O44 1959.0(平均)，實測值1958.9
(1-17C)AG(5)-P(化合物1-17C，下述式之化合物)之合成
使(1-17B)所製造的AG(7)-P(100mg)溶解於0.2M磷酸緩衝液(pH6.25)(3150μl)，添加100×BSA(New England Bio Labs)(43μl)、β-N-乙醯基胺基葡糖苷酶(New England Bio Labs,4000U/ml)(100μl)，並於37℃使其反應20小時。反應結束後，添加0.2%三氟乙酸水溶液(1000μl)。藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物AG(5)-P(73.8mg)。
ESI-TOF-MS：計算值[M+2H]2+ C62H109N11O34 777.3(平均)，實測值777.3。
<實施例1-18>
(1-18A)SG-N3(化合物1-18A，下述式之化合物)之合成
使唾液酸糖肽(76mg)溶解於0.2M磷酸緩衝溶液(pH6.25)(330μl)後，添加糖合成酶(Endo-M-N175Q，東京化成工業，1U/ml)水溶液(100μl)。再者，添加N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙基疊氮(23mg)之0.2M磷酸緩衝溶液(pH6.25)(230μl)，並於28℃使其反應96小時。於反應液中添加0.2%三氟乙酸水溶液(3000μl)並使反應停止，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(資生堂，Proteonavi)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得含目的物作為主成分的固體。接著，使獲得的固體溶解於蒸餾水(3000μl)，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-N3(34.4mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C86H141N9O62：[M+2H]2+ 1147.5，實測值1147.4。
<實施例1-19>
(1-19A)三級丁基N-[2-[2-[2-[2-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙基胺基]-3-側氧-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]胺基甲酸酯(化合物1-19A，下述式之化合物)之合成
使用3-[2-[2-[2-[2-(三級丁氧基羰基胺基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(100mg，0.274mmol)及1-7A(110mg，0.291mmol)，依據與(1-9A)同樣之方法，獲得呈淡黃色泡狀物質(150mg，產率90%)之目的物1-19A。
MS(ESI)：計算值C26H49N3O13：[M+H]+ 612，實測值612.
(1-19B)N-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙基]-3-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯胺(化合物1-19B，下述式之化合物)之合成
將1-19A(150mg，0.245mmol)溶解於二氯甲烷(2.0ml)，添加三氟乙酸(2.0mL)，並於室溫攪拌2小時。將減壓餾除溶媒而獲得的殘渣，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍 乾燥而獲得呈無色油狀物質之目的物1-19B(70mg，55%)。
MS(ESI)：計算值C21H41N3O11：[M+H]+ 512，實測值512.。
<實施例1-20>
(1-20A)3-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-2,6-雙(三級丁氧基羰基胺基)己醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-20A，下述式之化合物)之合成
於(2S)-2,6-雙(三級丁氧基羰基胺基)己酸(210mg，607μmol)及HATU(220mg，579μmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(2.0mL)中，添加N,N-二異丙基乙基胺(0.410mL，2.41mmol)，並於室溫攪拌2分鐘。將獲得的反應溶液，加到依據(1-5A)之手法所製造的3-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(150mg，497μmol)及N,N-二異丙基乙基胺(0.260mL，1.53mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.50mL)，並於室溫攪拌2小時。將減壓餾除溶媒而獲得的殘渣，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得呈淡黃色油狀物質之目的物1-20A(240mg，80%)。
MS(ESI)：計算值C27H52N3O11：[M+H]+ 594，實測值594.。
<實施例1-21>
(1-21A)2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-胺基-3-三級丁氧基-丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-三級丁氧基-丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-三級丁氧基-丙醯基]胺基]乙酸(化合物1-21A，下述式之化合物)之合成
將1.20mmol/g之2-氯三苯甲基氯樹脂(166mg，0.200mmol)置入固相合成用之管柱，添加二氯甲烷(3mL)並振盪10分鐘。過濾後，添加2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙酸(119mg，0.400mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(171μL，1.00mmol)之二氯甲烷(3mL)溶液，並於室溫攪拌2小時。過濾後，以二氯甲烷混合溶液(二氯甲烷：甲醇：N,N-二異丙基乙基胺=85：10：5，v/v)洗淨3次、以二氯甲烷洗淨3次、以N,N-二甲基甲醯胺洗淨3次。藉由將獲得的樹脂設置於AppliedBiosystems公司製之胜肽合成機433A Peptide Synthesizer，以合成機進行脫保護、縮合、脫保護、縮合、脫保護、縮合、脫保護、縮合、脫保護、縮合、脫保護，而將胜肽鏈伸長。於脫保護係使用哌啶與N-甲基吡咯啶酮，於縮合反應係使用HATU與N,N-二異丙基乙基胺與N-甲基吡咯啶酮與各種 羧酸。羧酸係以(2S)-3-三級丁氧基-2-(三級丁氧基羰基胺基)丙酸、2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙酸、(2S)-3-三級丁氧基-2-(三級丁氧基羰基胺基)丙酸、2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙酸、(2S)-3-三級丁氧基-2-(三級丁氧基羰基胺基)丙酸之順序使用於各縮合反應。將獲得的樹脂置入固相合成用之管柱，添加六氟異丙醇(1mL)與二氯甲烷(3mL)之混合溶液，並於室溫振盪2小時。過濾而去除樹脂，將獲得的濾液於減壓下濃縮。藉由以二氯甲烷共沸6次並以真空幫浦乾燥，獲得呈白色固體(120mg，產率97%)之目的物1-21A。
MALDI-TOF-MS：計算值C27H50N6O10：[M+H]+ 619.4，實測值619.4.
(1-21B)2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]胺基]-2-[[2-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]胺基]乙醯基]胺基]-4-側氧丁醯基]胺基]-3-三級丁氧基-丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-三級丁氧基-丙醯基]胺基]乙醯基]胺基]-3-三級丁氧基-丙醯基]胺基]乙酸(化合物1-21B，下述式之化合物)之合成
將依據J.Am.Chem.Soc.,1999,121,284-290.之手法所製造的(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]胺基]-2-(三級丁氧基羰基胺基)-4-側氧丁酸(84.5mg，0.194mmol)與HATU(73.8mg，0.194mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(5mL)，並添加N,N-二異丙基乙基胺(66μL，0.388mmol)，於室溫攪拌3分鐘。將此溶液添加於1-21A(100mg，0.162mmol)，於室溫攪拌0.5小時。將反應液以水稀釋，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化。於獲得的化合物中添加三氟乙酸(0.1mL)與水(0.9mL)之混合溶液，並攪拌整夜。將反應液以水稀釋，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，獲得呈白色固體(14.7mg，10%)之中間體。
將1-2C(5.91mg，0.0212mmol)與HATU(8.04mg，0.0212mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(1mL)，添加N,N-二異丙基乙基胺(9.05μL，0.0529mmol)，並於室溫攪拌3分鐘。將此溶液添加於獲得的中間體(16.5mg，0.0176mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(1mL)溶液，並於室溫攪拌0.5小時。將反應液以水稀釋，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，獲得呈白色固體(14.0mg，產率66%)之目的物1-21B。
MALDI-TOF-MS：計算值C49H85N11O23：[M+H]+ 1197.6，實測值1197.5.。
<實施例1-22>
(1-22A)(2S)-2,6-雙[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙醯基胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基胺基]己酸(化合物1-22A，下述式之化合物)之合成
將離胺酸(26.0mg，0.178mmol)溶解於0.10M磷酸緩衝液(pH 7.0)(0.40ml)，添加3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙醯基胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)(200mg，0.390mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.40mL)，並於室溫攪拌3小時。於反應溶液中添加0.2%三氟乙酸水溶液(2.0mL)，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得標題目的化合物1-22A(106mg，產率63%)。
MS(ESI)：計算值C42H65N6O18：[M-H]-941，實測值941.
(1-22B)SG-Lys*-[PEG(3)-Mal]2(化合物1-22B，下述式之化合物)之合成
於如上述製造的化合物1-22A(10.0mg，10.6μmol)、(1-11B)所製造的SG-NH2(19.4mg，8.13μmol)及HATU(4.00mg，10.6μmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(1.0mL)中，添加N,N-二異丙基乙基胺(8.80μL，51.7μmol)，並於室溫攪拌1小時。將反應溶液加到0.5%三氟乙酸水溶液(6.0mL)，並藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得標題目的化合物SG-Lys*-[PEG(3)-Mal]2(10.0mg，產率25%)。
ESI-TOF-MS：計算值C128H205N13O79：[M-2H]2-1595.0(平均)，實測值1595.0.。
<實施例1-23>
(1-23A)(2S)-2,6-雙[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙醯基胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙醯基胺基]己酸(化合物1-23A，下述式之化合物)之合成
使用離胺酸(7.70mg，52.7μmol)及(2,5-二側氧吡咯啶-1-基)3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙醯基胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯(100mg，115μmol)，依據與(1-22A)同樣之方法，獲得呈無色油狀物(36.0mg，產率41%)之標題目的化合物1-23A。
MS(ESI)：計算值C74H129N6O34：[M-H]-1645，實測值1645.
(1-23B)SG-Lys*-[PEG(11)-Mal]2(化合物1-23B，下述式之化合物)之合成
使用化合物1-23A(19.0mg，11.5μmol)及(1-11B)所製造的SG-NH2(25.0mg，10.5μmol)，依據與(1-22B)同樣之方法，獲得呈無色油狀物(14.0mg，產率34%)之標題目的化合物SG-Lys*-[PEG(11)-Mal]2。
ESI-TOF-MS：計算值C180H269N13O95：[M-2H]2-1947.4(平均)，實測值1947.3.。
<實施例1-24> (1-24A)
2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙酸]胺基]乙酸苄酯(化合物1-24A，下述式之反應產物)之合成
使已知化合物2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙酸(Tetrahedron Asymmetry,2008,19,1919-1933)(670mg)溶解於DMF(6ml)，添加HATU(630mg)與DIPEA(0.57ml)，並於室溫攪拌4分鐘後，添加甘胺酸苄基酯鹽酸鹽(370mg)，並於室溫攪拌1小時。將反應液以乙酸乙酯稀釋，以10%食鹽水洗淨2次、以1N鹽酸洗淨1次。以無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓餾除溶媒而獲得粗生成物。將其以矽膠管柱層析純化(己烷：乙酸乙酯=60：40-20：80，v/v)，獲得呈非晶質之目的化合物1-24A(840mg，產率62%)。
1H-NMR(CDCl3)δ：7.38-7.35(5H,m),6.99-6.98(1H,br m),5.23-5.21(3H,m),5.11-5.04(2H,m),4.56(1H,d,J=7.8Hz),4.34(1H,d,J=15.1Hz),4.20-4.09(5H,m),3.73-3.71(1H,m),2.08(3H,s),2.07(3H,s),2.04(3H,s),2.03(3H,s).
ESI-LC-MS：計算值C25H31NO13：[M+H]+ 554，實測值554.
(1-24B)2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙酸]胺基]乙酸(化合物1-24B，下述式之反應產物)之合成
使用化合物1-24A(840mg)，依據與(1-2B)同樣之手法，獲得呈非晶質之目的化合物1-24B(700mg，產率定量)。
ESI-LC-MS：計算值C18H25NO13：[M-H]-462，實測值462.
1H-NMR(CDCl3)δ：7.05-7.04(1H,br m),5.24(1H,t,J=9.5Hz),5.12-5.05(2H,m),4.58(1H,d,J=7.8Hz),4.35(1H,d,J=15.6Hz),4.27-4.05(6H,m),3.76-3.75(1H,m),2.08-2.04(12H,m).
(1-24C)2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙酸]胺基]乙酸(化合物1-24C，下述式之反應產物)之合成
使用化合物1-24B(450mg)，依據與(1-2C)同樣之手法，獲得呈非晶質之目的化合物1-24C(286mg，產率定量)。將其直接使用於下一反應。
1H-NMR(D2O,TMSP)δ：4.54(1H,d,J=7.8Hz),4.43(1H,d,J=15.6Hz),4.31(1H,d,J=15.6Hz), 3.91-3.89(3H,m),3.73(1H,dd,J=12.2,5.4Hz),3.53-3.37(4H,m).
ESI-LC-MS：計算值C10H17NO9：[M-H]-294，實測值294.
(1-24D)2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙酸]胺基]乙酸 銨鹽(化合物1-24D，下述式之化合物)之合成
使用化合物1-24C(286mg)，依據與(1-14A)同樣之手法，獲得呈非晶質之目的化合物1-24D(325mg)。未純化而使用。
(1-24E)SG(Glc)-Gly-A(化合物1-24E，由下述式而成的化合物，化合物1-24E)之合成
使唾液酸糖肽(191mg)溶解於0.2M磷酸緩衝溶液(pH6.25)(1000μl)後，添加糖合成酶(Endo-M-N175Q，東京化成工業(股)，1U/ml)水溶液(300μl)。再者，添加1-24D(125mg)之0.2M磷酸緩衝溶液(pH6.25)(370μl)，並於28℃使其反應72小時。於反應液中，添加0.2%三 氟乙酸水溶液(3000μl)並使反應停止，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(Inertsil ODS-3，GL Science)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG(Glc)-Gly-A(88mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C86H140N6O65：[M+4H]4+ 1149.4(平均)，實測值1149.4
又，參考實施例1-24之反應，可合成將化合物1-24D之糖構造取代為Glc以外之糖(例如，Man、Gal等)的化合物，將此等採用作為被轉移化合物，藉由進行與(1-24E)同樣之糖轉移反應，可合成SG(Man)-Gly、SG(Gal)-Gly等之還原末端改質糖鏈。
再者，於實施例1-11、1-12、1-13及1-14之方法，參考實施例1-24之反應，藉由將起始物質(被轉移化合物)之糖構造，返還為適宜、所欲者來使用，可適宜合成SG-NH2、SG-I、SG-oxa、SG-A等的還原末端改質糖鏈。
[實施例2]
於以下，構造式中僅表示為「hANP」的情形，表示修飾胜肽中之hANP胜肽為hANP(1-28)。
<實施例2-1>SG-hANP(1-28)(化合物2-1)之合成
(2-1A)hANP-TFA鹽(三氟乙酸鹽)之調製
以下之反應中，使用的hANP-TFA鹽係依據下述之順序來調製。
調製法1
使卡培立肽乙酸鹽(hANP(1-28)乙酸鹽)(100mg)溶解於蒸餾水(4000μl)，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物(89.6mg)。
調製法2
使卡培立肽乙酸鹽(hANP(1-28)乙酸鹽)(250mg)溶解於蒸餾水(30ml)，添加三氟乙酸(600μl)，並冷凍乾燥，其未再純化而直接使用。
(2-1B)SG-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-1)之合成
(2-1B-1 SG-hANP(1-28)(化合物2-1)TFA鹽之合成
於(1-14B)合成的SG-A(97.7mg)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(1000μl)中，添加HATU(16.3mg)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(1000μl)後，添加二異丙基乙基胺(30μl)，並於室溫攪拌5分鐘，快速地使用於下一反應。
使依據(2-1A)之順序調製的hANP-TFA鹽(100mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(1200μl)、蒸餾水(320μl)，添加二異丙基乙基胺(22.5μl)。對此溶液，添加事前調製的含活性酯的N,N-二甲基甲醯胺溶液(2000μl)，並攪拌1小時。反應結束後，冰冷下，加到0.2%三氟乙酸水溶液(20ml)。添加乙酸(2ml)，使不溶物溶解，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-hANP(1-28)(化合物2-1)-TFA鹽(91.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C213H341N51O102S3：[M+H]+ 5342.2，實測值5342.2
(2-1B-2)SG-hANP(1-28)(化合物2-1)乙酸鹽之合成
於(1-14B)合成的SG-A(790mg)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(18ml)中，添加TSTU(O-(N-琥珀醯亞胺)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸鹽(tetramethyluronium tetrafluoroborate))(104mg)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(2ml)後，添加二異丙基乙基胺(241μl)，並於室溫攪拌60分鐘，使用於下一反應。
使卡培立肽乙酸鹽(hANP(1-28)乙酸鹽)(1000mg)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(12ml)、蒸餾水(3.2ml)，並添加二異丙基乙基胺(241μl)。對此溶液，添加事前調製的含活性酯的N,N-二甲基甲醯胺溶液(20ml)，並攪拌1小時。反應結束後，添加乙腈(32ml)，並濾取沉澱物。以N,N-二甲基甲醯胺/乙腈(1/1)(30ml)、及乙腈(100ml)洗淨後，減壓乾燥獲得的固形物。使此固形物溶解於蒸餾水，藉由以0.1%乙酸水溶液與0.1%乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-hANP(1-28)(化合物2-1)-乙酸鹽(1056mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C213H341N51O102S3：[M+4H]4+ 1337.1(平均)，實測值1337.0
如此，因應作為起始物質使用的hANP胜肽之鹽之種類，作成亦對應目的物修飾胜肽的鹽而被合成。以下之實施例中，除了特別有指定的情形外，就hANP胜肽 而言採用TFA鹽，目的物修飾胜肽可作成TFA鹽而獲得，此情形，鹽之種類則未特別明示。又，藉由依據(2-1B-2)來合成，可將全部的目的物作成乙酸鹽來合成。
<實施例2-2>hANP(1-28)-SG(化合物2-2)之合成
(2-2A)Boc-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
將hANP(1-28)-乙酸鹽(62.5mg)溶解於蒸餾水(1.3ml)，於室溫添加二碳酸二-三級丁酯(0.9mg，324.6μmol)之三級丁基醇溶液(400μl)後，添加三乙基胺(13.6μl)之水溶液(200μl)，並於室溫攪拌3小時。添加蒸餾水(6ml)、乙腈(2ml)、乙酸(1ml)而使不溶物溶解，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物Boc-hANP(1-28)(59.9mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C132H211N45O41S3：[M+H]+ 3179.5，實測值3179.7
(2-2B)Boc-hANP(1-28)-GlcNAc(下述式之化合物)之合成
將(2-2A)所製造的Boc-hANP(1-28)(59.9mg)與化合物1-7A(59.7mg)溶解於蒸餾水(0.2ml)，於室溫添加HATU(35.8mg)之二甲基甲醯胺溶液(2.0ml)與三乙基胺(15.8μl)，於室溫攪拌2小時。於冰冷的三氟乙酸(8.7μl) 之水溶液(5ml)中添加反應液，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物Boc-hANP(1-28)-GlcNAc(38.7mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C142H229N47O46S3：[M+H]+ 3425.6，實測值3426.0
(2-2C)hANP(1-28)-GlcNAc(下述式之化合物)之合成
將(2-2B)所製造的Boc-hANP(1-28)-GlcNAc(38.7mg)溶解於20%三氟乙酸水溶液(5ml)與乙酸(1ml)，於室溫靜置7小時。添加蒸餾水(10ml)而冷凍乾燥。將粗純化物藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物hANP(1-28)-GlcNAc(21.8mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C137H221N47O44S3：[M+H]+ 3325.6，實測值3425.5
(2-2D)hNAP(1-28)-SG(下述式之化合物，化合物2-2)之合成
(1-12A)所製造的SG-Oxa之0.2M磷酸緩衝溶液(60mM，120μl)中，於室溫添加糖合成酶(Endo-M-N175Q，東京化成工業(股)，1U/ml，48μl)後，於室溫將(2-2C)所製造的hANP(1-28)-GlcNAc(6.0mg，1.8μmol)之二甲 亞碸溶液(72μl)分2次間隔15分鐘添加，並於25℃振盪2小時。於室溫添加0.2%三氟乙酸水溶液(1.5ml)而使反應停止，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物hNAP(1-28)-SG(化合物2-2)(6.2mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C213H334N52O100S3：[M+H]+ 5327.3，實測值5326.7。
<實施例2-3>(SG-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-3)之合成
(2-3A)Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用依據J.Am.Chem.Soc.,1999,121,284-290之記載合成的(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]胺基]-2-(三級丁氧基羰基胺基)-4-側氧丁酸(42.4mg，0.0976mmol)，與以(2-1A)之調整法2之方法由hANP(1-28)-乙酸鹽(31.3mg)調整的hANP(1-28)-TFA鹽，依據與(2-1B)同樣之手法，獲得目的物Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(13.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C144H230N48O48S3：[M+H]+ 3495.6，實測值3496.5
(2-3B)(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-3A)所製造的Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(13.0mg)，依據與(2-2C)同樣之手法，獲得目的物(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(5.83mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C139H222N48O46S3：[M+H]+ 3396.6，實測值3396.6
(2-3C)(SG-)Asn-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-3)之合成
由(2-3B)所製造的(GlcNAc2)-Asn-hANP(1-28)(4.90mg)，依據與(2-2D)同樣之手法，獲得目的物(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-3)(2.17mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C215H345N53O102S3：[M+H]+ 5398.3，實測值5398.4。
<實施例2-4>(SG-)Asn-hANP(2-28)(化合物2-4)之合成(2-4A)hANP(2-28)之調製
將hANP(1-28)-乙酸鹽(100mg)溶於1.5%二甲基烯丙基胺-60%吡啶-38.5%水之混合溶液(10.4mL)中，於室溫添加異硫氰酸苯酯(1.04mL)，並於50℃攪拌30分鐘。冷卻至室溫，並添加水、乙酸。以苯洗淨3次， 冷凍乾燥水層。添加三氟乙酸(2.6mL)，並於50℃攪拌30分鐘後，餾除三氟乙酸。添加水、乙酸，並以苯洗淨3次，冷凍乾燥水層。溶於水、乙酸，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，獲得呈白色固體(50mg)之目的物ANP(2-28)。
MALDI-TOF-MS：計算值C124H198N44O37S3：[M+H]+ 2992.4，實測值2992.0
(2-4B)Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28)(下述式之化合物)之合成
使用(2-4A)所製造的hANP(2-28)(25.0mg)替代hANP(1-28)，依據與(2-3A)同樣之手法，獲得目的物Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28)(13.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C141H225N47O46S3：[M+H]+ 3409.6，實測值3409.5
(2-4C)(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-4B)所製造的Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28)(13.0mg)，依據與(2-2C)同樣之手法，獲得目的物(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28)(6.86mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C136H217N47O44S3：[M+H]+ 3309.5，實測值3309.5
(2-4D)(SG-)Asn-hANP(2-28)(下述式之化合物，化合物2-4)之合成
由(2-4C)所製造的(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28)(5.75mg)，依據與(2-2D)同樣之手法，獲得目的物(SG-)Asn-hANP(2-28)(化合物2-4)(3.80mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C212H340N52O100S3：[M+H]+ 5313.4(平均)，實測值5314.7。
<實施例2-5>(SG-)Ser-hANP(2-28)(化合物2-5)之合成
(2-5A)Boc-(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28)(下述式之化合物)之合成
使用化合物1-1D(40.8mg)與(2-4A)所製造的hANP(2-28)(25.0mg)，依據與(2-3A)同樣之手法，獲得目的物Boc-(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28)(13.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C140H224N46O46S3：[M+H]+ 3382.6，實測值3382.7
(2-5B)(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28)(下述式之化合物)之合成
使用(2-5A)所製造的Boc-(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28)(13.0mg)，依據與(2-2C)同樣之手法，去除Boc，獲得目的物(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28)(6.36mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C135H216N46O44S3：[M+H]+ 3282.5，實測值3282.6
(2-5C)(SG-Ser)-hANP(2-28)(下述式之化合物，化合物2-5)之合成
使用(2-5B)所製造的(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28)(5.47mg)，依據與(2-2D)同樣之手法，獲得目的物(SG-)Ser-hANP(2-28)(化合物2-5)(4.40mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C211H339N51O100S3：[M+H]+ 5284.2，實測值5284.4。
<實施例2-6>hANP(1-27)-(SG-)Tyr(化合物2-6)之合成
(2-6A)hANP(1-27)-(GlcNAc-)Tyr(下述式之化合物)之合成
將化合物1-6D(30.6mg)溶解於二甲基甲醯胺(200μl)，於0℃添加N-溴琥珀醯亞胺(11.5mg)與吡啶(5.2μl)之二甲基甲醯胺溶液(125μl)並攪拌5分鐘。
將hANP(1-28)-乙酸鹽(50.0mg)溶解於0.1M磷酸緩衝液(pH 7.0、1ml)，於0℃添加事先調製的三唑二酮衍生物之二甲基甲醯胺溶液(325μl)。於室溫靜置5小時後，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物hANP(1-27)-(GlcNAc-)Tyr(9.8mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C145H225N49O47S3：[M+H]+ 3501.6，實測值3501.6
(2-6B)hANP(1-27)-(SG-)Tyr(下述式之化合物，化合物2-6)之合成
使用(2-6A)所製造的hANP(1-27)-(GlcNAc-)Tyr(8.3mg)，依據與(2-2D)同樣之手法，獲得目的物hANP(1-27)-(SG-)Tyr(化合物2-6)(6.3mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C221H348N54O103S3：[M+H]+ 5503.3，實測值5502.8。
<實施例2-7>SG-hANP(1-28)-SG(化合物2-7)之合成
(2-7A)GlcNAc-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
將化合物1-2C(25.0mg)溶解於二甲基甲醯胺(0.5ml)，於室溫添加三乙基胺(34ml)，冰冷下，添加二甲基硫膦醯氯(12.0mg)之二甲基甲醯胺溶液(0.5ml)後，於室溫攪拌1小時。另一方面，將hANP(1-28)-乙酸鹽(25mg)溶解於二甲基甲醯胺(1ml)、蒸餾水(0.32ml)，於室溫添加三乙基胺(25.3μl)，冰冷下，添加事先調製的活性酯之二甲基甲醯胺溶液(433μl)，於室溫攪拌2小時。於冰冷的0.5%三氟乙酸水溶液(5ml)中添加反應液，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析 液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物GlcNAc-hANP(1-28)(17.8mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C137H218N46O46S3：[M+H]+ 3340.5，實測值3340.5
(2-7B)GlcNAc-hANP(1-28)-GlcNAc(下述式之化合物)之合成
使用(2-7A)所製造的GlcNAc-hANP(1-28)(30.0mg)及化合物1-7A，依據與(2-2B)同樣之手法，獲得使GlcNAc連結於hANP之C末端的目的物GlcNAc-hANP(1-28)-GlcNAc(10.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C147H236N48O51S3：[M+H]+ 3586.7，實測值3586.7
(2-7C)SG-hANP(1-28)-SG(下述式之化合物，化合物2-7)之合成
使用(2-7B)所製造的GlcNAc-hANP(1-28)-GlcNAc(6.0mg)，依據與(2-2D)同樣之手法，獲得目的物SG-hANP(1-28)-SG(化合物2-7)(13.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C299H482N58O163S3：[M+H]+ 7590.0，實測值7589.0。
<實施例2-8>(SG-)Asn-hANP(3-28)(化合物2-8)之合成
(2-8A)(GlcNAc-)Asn-hANP(3-28)(下述式之化合物)之合成
再度以(2-4A)之方法，將(2-4A)所製造的hANP(2-28)(32.0mg)去除N末端之胺基酸，而獲得hANP(3-28)。使用獲得的hANP(3-28)替代hANP(2-28)，依據與實施例2-4同樣之手法，獲得目的物(GlcNAc-)Asn-hANP(3-28)(3.5mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C130H206N46O43S3：[M+H]+ 3196.5，實測值3196.7
(2-8B)(SG-)Asn-hANP(3-28)(下述式之化合物，化合物2-8)之合成
使用(2-8A)所製造的GlcNAc-Asn-hANP(3-28)(3.5mg)，依據與(2-2D)同樣之手法，獲得目的物(SG-)Asn-hANP(3-28)(化合物2-8)((2.5mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C206H329N51O99S3：[M+H]+ 5198.1，實測值5198.3。
<實施例2-9>SG-(SG-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-9)之合成
(2-9A)GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用(2-3B)所製造的(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(16.0mg)，依據與(1-5B)同樣之手法，使GlcNAc連結於Asp的胺基，獲得目的物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(6.15mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C149H237N49O53S3：[M+H]+ 3657.7，實測值3658.1
(2-9B)SG-(SG-)Asn-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-9)之合成
使用(1-12A)所製造的SG-Oxa之0.2M磷酸緩衝溶液(60mM，168μl)、糖合成酶(Endo-M-N175Q，東京化成工業(股)，1U/ml，67μl)、(2-9A)所製造的GlcNAc1-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(6.15mg)，以與2-2D同樣之手法，獲得目的物SG-(SG-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-9)(6.7mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C301H483N59O165S3：[M+H]+ 7661.0，實測值7660.7。
<實施例2-10>AG(9)-hANP(1-28)(化合物2-10)之合成
(2-10A)AG(9)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-10)之合成
使(2-1B)合成的SG1-hANP(1-28)(21mg)溶解於0.2M乙酸緩衝液(pH5.0)(1000μl)後，添加神經胺糖酸酶([E.C.3.2.1.18]，Nacalai Tesque，1U/ml)水溶液(1000μl)，於37度使其反應17小時。反應結束後，添加0.2%三氟乙酸水溶液(2000μl)。添加乙酸(200μl)，使不溶物溶解。將此反應收集2批分，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物AG(9)-hANP(1-28)(化合物2-10)(33.8mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C191H307N49O86S3：[M+H]+ 4760.0，實測值4760.4。
<實施例2-11>AG(7)-hANP(1-28)之合成
(2-11A)AG(7)-hANP(1-28)[下述式之化合物，化合物2-11]之合成
使(2-10A)合成的AG(9)1-hANP(1-28)(16mg)溶解於蒸餾水(1425μl)後，添加0.2M磷酸緩衝液(pH6.25)(1500μl)、β1-4半乳糖苷酶(NEW ENGLAND BioLabs，8000U/ml)水溶液(75μl)，於37度使其反應24小時。反應結束後， 添加0.2%三氟乙酸水溶液(3000ul)。添加乙酸(300μl)，使不溶物溶解，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物AG(7)-hANP(1-28)(化合物2-11)(11.7mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C179H287N49O76S3：[M+H]+ 4435.9，實測值4435.8。
<實施例2-12>SG-三唑-hANP(1-28)(化合物2-12)之合成
(2-12A)戊炔醯基-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用hANP(1-28)-乙酸鹽(50.0mg)及4-戊炔酸(10.0mg，101μmol)，依據與(2-7A)同樣之方法，獲得目的物戊炔醯基-hANP(1-28)(26.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C132H207N45O40S3：[M]+ 3158.4，實測值3158.0.
(2-12B)GlcNAC-三唑-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
於(2-12A)所製造的戊炔醯基-hANP(1-28)(22.0mg)，依序添加30mM N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-2-(2-疊氮乙 氧基)-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-3-基]乙醯胺水溶液(0.37mL，11.1μmol)、30mM抗壞血酸鈉水溶液(0.26mL，7.8μmol)、10mM硫酸銅水溶液(0.15mL，1.5μmol)及0.1M磷酸緩衝液(pH7.0)，於室溫攪拌4小時。於反應溶液中添加0.2%三氟乙酸水溶液(12mL)，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物GlcNAc-三唑-hANP(1-28)(15.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C142H225N49O46S3：[M+H]+ 3449.6，實測值3449.6.
(2-12C)SG-三唑-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-12)之合成
使用(2-12B)所製造的GlcNAc-三唑-hANP(1-28)(8.0mg)，依據與(2-2D)同樣之手法，獲得目的物SG-三唑-hANP(1-28)(化合物2-12)(9.3mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C218H348N54O102S3：[M+H]+ 5451.3，實測值5451.1.。
<實施例2-13>SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-13)之合成
(2-13A)GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由化合物1-5B(9mg)與以(2-1A)之調整法2之方法調整的hANP-TFA鹽(16.6mg)，依據與(2-1B)同樣之手法，獲得目的物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(12.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C160H258N50O58S3：[M+H]+ 3904.8，實測值3904.5
(2-13B)SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-13)之合成
使用(2-13A)所製造的GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(6.00mg)，依據與(2-9B)同樣之手法，獲得目的物SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-13)(6.40mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C312H504N60O170S3：[M+4H]4+ 1979.0(平均)，實測值1978.5。
<實施例2-14>SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28)(化合物2-14)之合成
(2-14A)GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-Gly-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用hANP(1-28)-乙酸鹽(50.0mg)及化合物1-9D(29.0mg，40.0μmol)，依據與(2-7A)同樣之方法，獲得目的物GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-Gly-hANP(1-28)(14.9mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C155H249N50O55S3：[M+H]+ 3786.7，實測值3786.8.
(2-14B)SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-14)之合成
使用(2-14A)所製造的GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-Gly-hANP(1-28)(6.0mg)，依據與(2-2D)同樣之手法，獲得目的物SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28)(化合物2-14)(7.6mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C307H498N60O167S3：[M+4H]4+ 1949.4(平均)，實測值1949.2.。
<實施例2-15>[(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28)(化合物2-15)之合成
(2-15A)[(GlcNAc-)Cys-Gly]3-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用化合物1-10B(27mg)，依據與(2-1B)同樣的手法，獲得目的物[(GlcNAc-)Cys-Gly]3-hANP(1-28)(18.4mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C195H304N60O73S6：[M+H]+ 4847.0，實測值4847.2
(2-15B)[(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-15)之合成
於(1-12A)所製造的SG-Oxa之0.2M磷酸緩衝溶液(60mM，118μl)中，使用糖合成酶(Endo-M-N175Q，東京化成工業(股)，1U/ml，47μl)、(2-15A)所製造的[(GlcNAc-)Cys-Gly]3-hANP(1-28)，以與2-2D同樣之手法獲得目的物[(SG-)Cys-Gly3-hANP(1-28)(化合物2-15)(5.23mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C423H673N75O241S6：[M+5H]5+ 2172.5(平均)，實測值2172.4。
<實施例2-16>SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-16)之合成
(2-16A)GlcNAc-PEG(3)-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-3B)所製造的GlcNAc-Asn-hANP(19.0mg)與化合物1-3A(8.8mg)，依據與(2-7A)同樣之手法，獲得目的物GlcNAc-PEG(3)-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(9.10mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C160H258N50O58S3：[M+H]+ 3904.8，實測值3904.4
(2-16B)SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-16)之合成
於室溫使用(2-16A)所製造的GlcNAc-PEG(3)-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28)(3.50mg)，依據與(2-9B)同樣之手法，獲得目的物SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-16)(3.10mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C312H504N60O170S3：[M+4H]4+ 1978.1(平均)，實測值1978.8。
<實施例2-17>[(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28)(化合物2-17)之合成
(2-17A)[Cys-Gly]5-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由化合物1-8A(50.6mg)與以(2-1A)之調整法2之方法自hANP-乙酸鹽(47.0mg)調整的hANP-TFA鹽，依據與(2-1B)同樣之手法，獲得中間體(13.0mg)。
於獲得的中間體(13.0mg)中，添加三氟乙酸(1.9mL)與水(0.05mL)與三異丙基矽烷(0.05mL)之混合溶液。於室溫振盪1小時。將反應液以水稀釋，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，獲得呈白色固體(3.2mg)之目的物[Cys-Gly]5-hANP(1-28)。
MALDI-TOF-MS：計算值C154H245N55O50S8：[M+H]+ 3921.6，實測值3921.9
(2-17B)(SG-)Cys-Gly))5-hANP(1-28)[(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-17)之合成
將(2-17A)所製造的[Cys-Gly]5-hANP(1-28)(3.00mg)與(1-13A)所製造的SG-M(9.94mg)溶解於乙腈(0.25mL)與0.2M pH=6.75之磷酸緩衝液(0.25mL)之混合溶液，於室溫攪拌2小時。將反應液以水稀釋，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，獲得目的物[(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28)(化合物2-17)(8.19mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C619H985N95O375S8：[M+6H]6+ 2670.1(平均)，實測值2670.1。
<實施例2-18>[(SG2-)(Cys-Gly]5-hANP(1-28)(化合物2-18)之合成
(2-18A)三級丁基N-[(1R)-1-(丙-2-炔基胺甲醯基)丁-3-炔基]胺基甲酸酯(下述式之化合物)之合成
使用(2R)-2-(三級丁氧基羰基胺基)-4-戊炔酸(430mg，2.02mmol)及炔丙基胺(140mg，2.54mmol)，依據 與(1-9A)同樣之方法，獲得呈淡黃色固體(480mg，產率96%)之目的物。
MS(ESI)：計算值C13H19N2O3：[M+H]+ 251，實測值251.
(2-18B)(2R)-2-胺基-N-丙-2-炔基-戊-4-炔醯胺三氟乙酸鹽(下述式之化合物)之合成
使用(2-18A)獲得的目的物(250mg，1.00mmol)，依據與(1-9B)同樣之方法，獲得呈淡黃色油狀物(270mg，產率100%)之目的物。
1H-NMR(CD3OD)δ：4.11-3.96(3H,m),2.87-2.74(2H,m),2.68-2.65(2H,m).
(2-18C)(2R)-2-[3-(2,5-二側氧吡咯-1-基)丙醯基胺基]-N-丙-2-炔基-戊-4-炔醯胺(下述式之化合物)之合成
使用(2-18B)獲得的目的物(270mg，1.00mmol)，依據與(1-15A)同樣之方法，獲得呈淡黃色固體(220mg，產率73%)之目的物
MS(ESI)：計算值C15H14N3O4：[M-H]-300，實測值300.
(2-18D)[(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-18)之合成
將(1-18A)所製造的SG-N3(20.0mg，8.73μmol)溶解於0.10M磷酸緩衝液(pH 8.0)(0.840ml)，依序添加(2-18C)獲得的目的物之3.3mM三級丁醇溶液(1.06mL，3.50μmol)、50mM抗壞血酸鈉水溶液(0.420mL，21.0μmol)、及10mM硫酸銅水溶液(0.420mL，4.20μmol)，於室溫攪拌1小時30分鐘。於反應溶液中添加0.2%三氟乙酸水溶液(12mL)，並藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(SHISEIDO，Proteonavi)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得中間體(6.20mg，36%)。
由(2-17A)所製造的(Cys-Gly)5-hANP(1-28)(1.76mg)與合成的中間體(10.3mg)，依據與(2-17B)同樣之手法，獲得目的物[(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28)(化合物2-18)(8.42mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C1089H1730N160O690S8：[M-10H]10-2835.1(平均)，實測值2834.9。
<實施例2-19>SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-19))之合成
(2-19A)TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(3)(下述式之化合物)之合成
將1.20mmol/g之2-氯三苯甲基氯樹脂(250mg，0.300mmol)置入固相合成用之管柱，添加二氯甲烷(5mL)並振盪10分鐘。過濾後，添加3-[2[2[2[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(175mg，0.360mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(257μL，1.50mmol)之二氯甲烷(5mL)溶液，並於室溫攪拌2小時。過濾後，以二氯甲烷混合溶液(二氯甲烷：甲醇：N,N-二異丙基乙基胺=85：10：5，v/v)洗淨3次，以二氯甲烷洗淨3次，以N,N-二甲基甲醯胺洗淨3次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(10mL)並振盪5分鐘後過濾；進行此操作4次。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。於樹脂中添加(2S)-2,6-雙(9H-茀-9-基甲氧基羰基 胺基)己酸(532mg，0.900mmol)與HATU(342mg，0.900mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(308μL，1.80mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(10mL)，並於室溫振盪30分鐘。過濾後將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨3次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(10mL)並振盪5分鐘後過濾；進行此操作4次。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。於樹脂中添加(2S)-2,6-雙(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)己酸(1060mg，1.80mmol)與HATU(684mg，1.80mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(616μL，3.60mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(10mL)並於室溫振盪1小時。過濾後將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(10mL)並振盪5分鐘後過濾；進行此操作5次。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。將獲得的樹脂之1/3量(相當0.100mmol)置入固相合成用之管柱，添加3-三苯甲基硫烷基丙酸(418mg，1.20mmol)與HATU(456mg，1.20mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(411μL，2.40mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(10mL)並於室溫振盪1小時。過濾後，再次添加3-三苯甲基硫烷基丙酸(418mg，1.20mmol)與HATU(456mg，1.20mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(411μL，2.40mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(10mL)並於室溫振盪1小時。過濾後將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，以二氯甲烷洗淨3次。添加1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(2.5mL)與二氯甲烷(7.5mL)之混合溶液，並於室溫振盪1.5小時。過濾而去除樹脂，減壓下濃縮濾液。藉由以二氯甲烷共沸6 次，以真空幫浦乾燥，而獲得呈褐色固體(170mg)之目的物TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(3)。
(2-19B)HS-(HS-)Lys[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-19A)所製造的(66.1mg)，依據與(2-17A)同樣之手法，獲得中間體(40mg)。
由獲得的中間體(7.0mg)，依據與(2-17A)同樣之手法，獲得目的物HS-(HS-)Lys[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(2.3mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C168H276N52O51S7：[M+H]+ 4062.9，實測值4062.8
(2-19C)SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-19)之合成
由以(2-19B)之手法所製造的S4-Lys3-PEG3-hANP(1-28)(2.90mg)，依據與(2-17B)同樣之手法，獲得目的物[SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-19)(5.31mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C540H868N84O311S7：[M+7H]7+ 1963.4(平均)，實測值1963.4。
<實施例2-20>[SG2-(SG2-)Lys-[SG2-(SG2-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-20)之合成
(2-20A)SG2-(SG2-)Lys-[SG2-(SG2-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-20)之合成
由(2-19B)所製造的HS(HS-)-Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(2.20mg)與(1-15C)所製造的SG-(SG-)Gln*-Mal(12.1mg)，依據與(2-17B)同樣之手法，獲得目的物SG2-(SG2-)Lys-[SG2-(SG2-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-20)(4.79mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C904H1460N116O567S7：[M+8H]8+ 2907.3(平均)，實測值2907.。
<實施例2-21>AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-21)之合成
(2-21A)AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-21)之合成
使用(2-13B)合成的SG-(SG-Asn)-PEG-hANP(1-28)(16mg)，依據與(2-10A)同樣之手法，獲得目的物AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-21)(8.2mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C268H436N56O138S3：[M+4H]4+ 1687.7，實測值1687.4。
<實施例2-22>AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-22)之合成
(2-22A)AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-22)之合成
使用(2-21A)合成的AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(8mg)，依據與(2-11A)同樣之手法，獲得目的物AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-22)(6.6mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C244H396N56O118S3：[M+4H]4+ 1525.6，實測值1525.4。
<實施例2-23>SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-23)之合成
(2-23A)TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(11)-CO2H(下述式之化合物)之合成
由3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(202mg)，依據與(2-19A)同樣之手法，獲得目的物TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(11)-CO2H(135mg)。
(2-23B)HS-(HS-)Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-23A)所製造的TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(11)-CO2H(45.3mg)，依據與(2-17A)同樣之手法，獲得目的物HS-(HS-)Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28)(12.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C184H308N52O59S7：[M+H]+ 4415.1，實測值4416.1
(2-23C)SG4-Lys3-PEG11-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-23)之合成
由(2-23B)所製造的HS-(HS-)Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28)(3.16mg)，依據與(2-17B)同樣之手法，獲得目的物SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-23)(4.40mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C556H900N84O319S7：[M+6H]6+ 2349.3(平均)，實測值2349.2。
<實施例2-24>SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG(化合物2-24)之合成
(2-24A)GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用(2-1A)所製造的hANP(1-28)-TFA鹽(33.0mg)及化合物1-3A(13.0mg，24.7μmol)，依據與(2-7A)同樣之方法，獲得目的物GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)(25.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C148H240N47O51S3：[M+H]+ 3587.7，實測值3587.6.
(2-24B)GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-GlcNAc(下述式之化合物)之合成
使用(2-24A)所製造的GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)(21.0mg)及化合物1-19B(46mg，73.6μmol)，依據與(2-2B)同樣之方法，獲得目的物GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-GlcNAc(3.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C169H278N50O61S3：[M+H]+ 4080.9，實測值4080.9.
(2-24C)SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG(下述式之化合物，化合物2-24)之合成
使用(2-24B)所製造的GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-GlcNAc(4.0mg)，依據與(2-2D)同樣之手法，獲得目的物SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG(化合物2-24)(5.5mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C321H528N60O173S3：[M+4H]4+ 2023.0(平均)，實測值2022.8.。
<實施例2-25>SG-硫乙醯胺-hANP(1-28)(化合物2-25)之合成
(2-25A)TrS-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
將3-三苯甲基硫烷基丙酸(2.24mg，6.43μmol)溶解於二甲基甲醯胺(100μl)，於室溫添加三乙基胺(1.79μl，12.8μmol)，冰冷下，添加二甲基硫膦醯氯(0.83mg，6.46μmol)之二甲基甲醯胺溶液(60μl)後，於室溫攪拌1小時。另一方面，將hANP-三氟乙酸鹽(10mg)溶解於二甲基甲醯胺(200μl)、蒸餾水(60μl)，於室溫添加三乙基胺(4.2μl)，冰冷下，添加事先調製的活性酯之二甲基甲醯胺溶液(160μl)，於室溫攪拌5小時。於冰冷的0.5%三氟乙酸水溶液(2ml)中添加反應液，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物TrS-hANP(1-28)(5.77mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C149H221N45O40S4：[M+3H]3+ 1138.0(平均)，實測值1137.8
(2-25B)HS-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使(2-25A)合成的TrS-hANP(1-28)(5.77mg)溶解於三氟乙酸/蒸餾水/三異丙基矽烷(90/5/5)溶液，於室溫攪拌1小時。反應結束後，添加蒸餾水/乙酸(10/1)溶液(3ml)，使不溶物溶解，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物HS-hANP(1-28)(2.88mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C130H207N45O40S4：[M+H]+ 3167.4，實測值3167.7
(2-25C)SG-硫乙醯胺-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-25)之合成
使(2-25B)合成的HS-hANP(1-28)(2.88mg)、(1-11C)合成的SG-I(2.66mg)溶解於二甲基甲醯胺(300μl)，添加二異丙基乙基胺(0.77μl)，於室溫攪拌1小時。反應結束後，添加蒸餾水/乙酸(10/1)溶液(3ml)，使不溶物溶解，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-硫乙醯胺-hANP(1-28)(化合物2-25)(2.90mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C218H350N52O103S4：[M+4H]4+ 1369.9(平均)，實測值1369.6。
<實施例2-26>AG(5)-hANP(1-28)(化合物2-26)之合成
(2-26A)AG(5)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-26)之合成
將(2-7A)合成的GlcNAc-hANP之三氟乙酸鹽，使用離子交換樹脂(Dowex1 x 8)進行鹽交換，作成GlcNAc-hANP乙酸鹽用於下一反應。
使(1-17C)合成的AG(5)-P(18mg)溶解於0.2M磷酸緩衝溶液(pH6.75，160μl)後，添加糖合成酶(Endo-M-N175Q，東京化成工業，1U/ml，64μl)、(2-7A)合成的hANP-GlcNAc之乙酸鹽(8.0mg)之二甲亞碸溶液(96μl)，於25℃使其反應3小時。於室溫添加0.2%三氟乙酸水溶液(1.5ml)而使其反應停止，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物AG(5)-hANP(1-28)(化合物2-26)(5.6mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C163H261N47O66S3：[M+3H]3+ 1345.1(平均)，實測值1344.6。
<實施例2-27>SG-(SG-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-27)之合成
(2-27A)Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-CO2H(下述式之化合物)之合成
將依據J.Am.Chem.Soc.,1999,121,284-290之記載製造的(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]胺基]-2-(三級丁氧基羰基胺基)-4-側氧丁酸(187mg，0.43mmol)及HATU(163mg，0.43mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(3.0ml)，於室溫添加二異丙基乙基胺(150μl，0.86mmol)而攪拌3分鐘。將此反應液添加於(1-4A)所製造的3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(0.22g，0.36mmol)並於室溫攪拌3小時。將此反應混合物滴加至冰冷的蒸餾水(3ml)及乙酸(100μl)之混合溶媒而溶解，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物Boc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-CO2H(210mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C44H82N4O23：[M+K]+ 1073.6，實測值1073.5
(2-27B)Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
將(2-27A)所製造的Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-CO2H(7.3mg，7.1μmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(150μl)，冰冷下，添加三乙基胺(5.9μl，43μmol)及二甲基硫膦醯氯(1.7mg，21μmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(50μl)。將此反應液升溫至室溫同時攪拌1.5小時。將此反應液於冰冷下，依據(2-1A)之順序，加到將調製的hANP-TFA鹽(36mg，60w/w%，7.1μmol)及三乙基胺(14μl，99μmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(1500μl)及蒸餾水(300μl)之混合溶媒的溶液，升溫至室溫同時攪拌1日。將此反應液加到冰冷的0.2v/v%三氟乙酸水溶液(8.3ml)，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-OH(14.8mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C171H283N49O61S3：[M+2H]2+ 2049.8(平均)，實測值2049.5
(2-27C)GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
將(2-27B)所製造的Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28)(14.8mg)溶解於33v/v%三氟乙酸水溶液(1.0ml)，於室溫靜置3小時。將此反應液加到冰冷的蒸餾水(9.5ml)及乙酸(0.5ml)之混合溶媒，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得中間體(10.2mg)。
將(1-2C)所製造的2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]氧基乙酸(1.4mg，5.1μmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(150μl)，冰冷下，添加三乙基胺(2.1μl，15μmol)及二甲基硫膦醯氯(0.98mg，7.7μmol)。將此反應液升溫至室溫並同時攪拌1.5小時。將此反應液冰冷下加到將獲得的中間體(10mg，2.6μmol)及三乙基胺(5.0μl，36μmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(1500μl)及蒸餾水(300μl)之混合溶媒的溶液，一邊升溫至室溫一邊攪拌3日。將此反應液添加至冰冷的0.2v/v%三氟乙酸水溶液(8.5ml)，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28)(9.0mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C176H290N50O66S3：[M-2H]2-2128.3(平均)，實測值2128.0
(2-27D)SG-(SG-Asn)-PEG(11)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-27)之合成
於(1-12A)所製造的SG-Oxa之0.2M磷酸緩衝溶液(60mM，188μl)中，於室溫添加Endo-M-N175Q(1U/ml，100μl)後，將(2-27D)所製造的hANP-GlcNAc(8.0mg，1.9μmol)之二甲亞碸溶液(120μl)於室溫分2次間隔15分鐘添加，並於25℃振盪1日。於室溫添加0.2%三氟乙酸水溶液(4.5ml)及乙酸(0.5ml)之混合溶媒而使反應停止，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-(SG-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-27)(3.4mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C328H536N60O178S3：[M+5H]5+ 1653.8(平均)，實測值1653.7。
<實施例2-28>SG-(SG-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-28)之合成
(2-28A)Fmoc-PEG(11)-PEG(11)-CO2H(下述式之化合物)之合成
將3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(350mg，0.42mmol)及HATU(192mg，0.50mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(3.0ml)，於室溫添加二異丙基乙基胺(176μl，1.01mmol)而攪拌3分鐘。將此反應液添加於(1-4A)所製造的3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(259mg，0.42mmol)而於室溫攪拌3小時。將此反應混合物滴加到冰冷的蒸餾水(3ml)及乙酸(117μl)之混合溶媒而溶解，再以N,N-二甲基甲醯胺(3.0ml)及蒸餾水(15ml)之混合溶媒稀釋。將此溶液藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物Fmoc-PEG(11)-PEG(11)-CO2H(399mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C69H118N2O29：[M-H]-1437.8，實測值1437.8
(2-28B)H2N-PEG(11)-PEG(11)-CO2H(下述式之化合物)之合成
由(2-28A)所製造的Fmoc-PEG(11)-PEG(11)-CO2H(250mg)，依據與(1-4A)同樣之手法，獲得目的物H2N-PEG(11)-PEG(11)-CO2H(77mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C54H108N2O27：[M+H]+ 1217.7，實測值1217.9
(2-28C)Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-CO2H(下述式之化合物)之合成
由依據J.Am.Chem.Soc.,1999,121,284-290之記載而製造的(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙醯胺-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫哌喃-2-基]胺基]-2-(三級丁氧基羰基胺基)-4-側氧丁酸(32mg，74μmol)及(2-28B)所製造的H2N-PEG(11)-PEG(11)-CO2H(76mg)，依據與(2-27A)同樣之手法，獲得目的物Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-CO2H(58mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C71H135N5O36：[M+K]+ 1673.0，實測值1672.9
(2-28D)Boc-(GlcNAc)-Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用(2-28C)所製造的Boc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-COOH(29mg，18μmol)及(2-1A)所製造的hANP(1-28)-TFA鹽(50mg，60w/w%，9.7μmol)，依據與(2-27B)同樣之手法，獲得目的物Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28)(35mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C198H336N50O74S3：[M+H]+ 4695.3，實測值4697.5
(2-28E)GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-28D)所製造的Boc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28)(35mg，7.4μmol)，依據與(2-27C)同樣之手法，獲得目的物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28)(16mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C203H343N51O79S3：[M+H]+ 4859.4(平均)，實測值4858.4
-TOF-MS：計算值C203H343N51O79S3：[M+H]+ 4859.4(平均)，實測值4858.4
(2-28F)SG-(SG-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-28)之合成
由(1-12A)所製造的SG-Oxa之0.2M磷酸緩衝溶液(60mM，190μl)及(2-28F)所製造的GlcNAc-(GlcNAc)-Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28)(16mg，3.2μmol)，依據與(2-27D)同樣之手法，獲得目的物SG-(SG-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-28)(13mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C355H589N61O191S3：[M+4H]4+ 2217.0(平均)，實測值2216.9。
<實施例2-29>SG-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-29)之合成
(2-29A)SG-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-29)之合成
由(2-24A)所製造的GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)(15.0mg)，依據與(1-14B)同樣之手法，獲得目的物SG-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-29)(12.32mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C224H362N52O107S3：[M+4H]4+ 1399.0(平均)，實測值1398.3。
<實施例2-30>SG-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-30)之合成
(2-30A)GlcNAc-PEG(11)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用hANP(1-28)-TFA鹽(43.9mg)與化合物1-4B(15.0mg)，依據與(2-7A)同樣之手法，獲得目的物GlcNAc-PEG(11)-hANP(1-28)(33.7mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C164H271N47O59S3：[M+H]+ 3939.9，實測值3939.8
(2-30B)SG-PEG(11)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-30)之合成
使用(2-30A)所製造的GlcNAc-PEG(11)-hANP(1-28)(15.0mg)，依據與(1-14B)同樣之手法，獲得目的物SG-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-30)(11.52mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C240H394N52O115S3：[M+5H]5+ 1189.8(平均)，實測值1189.3。
<實施例2-31>SG-(SG-)Gln*-Mal-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-31)之合成
(2-31A)H2N-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用3-[2-[2-[2-[2-(三級丁氧基羰基胺基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(11.7mg)與以(2-1A)之調整法2之方法由hANP(1-28)-乙酸鹽(41.0mg)調整的hANP(1-28)-TFA鹽，依據與(2-1B)同樣之手法，獲得Boc-PEG(3)-hANP(1-28)(12.7mg)。
使用獲得的Boc-PEG(3)-hANP(1-28)(12.7mg)，依據與(2-2C)同樣之手法，獲得目的物H2N-PEG(3)-hANP(1-28)(12.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C138H224N46O44S3：[M+H]+ 3326.6，實測值3326.6
(2-31B)HS-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用(2-31A)所製造的H2N-PEG(3)-hANP(1-28)(12.0mg)，依據與(2-25A)、(2-25B)同樣之手法，獲得目的物HS-PEG(3)-hANP(1-28)(5.00mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C141H228N46O45S4：[M+H]+ 3414.6，實測值3414.7
(2-31C)SG-(SG-)Gln*-Mal-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物3-31)之合成
使用(2-31C)所製造的HS-PEG(3)-hANP(1-28)(4.00mg)與(1-15C)所製造的SG-(SG-)Gln*-Mal(7.43mg)，依據與(2-17B)同樣之手法，獲得目的物SG-(SG-)Gln*-Mal-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-31)(2.09mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C325H524N62O174S4：[M+5H]5+ 1643.4(平均)，實測值1643.2。
<實施例2-32>SG-(SG-)Gln*-PEG(3)-Mal-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-32)之合成
將(2-25B)所製造的HS-hANP(1-28)(2.3mg)及(1-16C)所製造的SG-(SG-)Gln*-PEG(3)-Mal(4.0mg)溶解於0.2M乙酸緩衝液(pH5.0)(0.10mL)與二甲亞碸(0.10mL)之混合溶媒，於室溫攪拌5小時。於反應溶液中添加0.2%三氟乙酸水溶液(2.0mL)，並藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得目的物SG-(SG-)Gln*-PEG(3)-Mal-hANP(1-28)(化合物2-32)(3.5mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C325H528N62O174S4：[M+4H]4+ 2054.0(平均)，實測值2053.8.。
<實施例2-33>SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-hANP(1-28)(化合物2-33)之合成
(2-33A)TrS-(TrS-)Lys-PEG(3)-CO2H(下述式之化合物、)之合成
將1.20mmol/g之2-氯三苯甲基氯樹脂(83mg，0.100mmol)置入固相合成用之管柱，添加二氯甲烷(2mL)並振盪10分鐘。過濾後，添加3-[2[2[2[2-(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(97.5mg，0.200mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(85.6μL，0.500mmol)之二氯甲烷(2mL)溶液，並於室溫振盪2小時。過濾後，以二氯甲烷混合溶液(二氯甲烷：甲醇：N,N-二異丙基乙基胺=85：10：5，v/v)洗淨3次，以二氯甲烷洗淨3次，以N,N-二甲基甲醯胺洗淨3次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(2mL)並5分振盪後過濾；進行此操作4次。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。於樹脂中添加(2S)-2,6-雙(9H-茀-9-基甲氧基羰基胺基)己酸(177mg，0.300mmol)與HATU(114mg，0.300mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(103μL，0.600mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(2mL)並於室溫振盪30分鐘。過濾後將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加20%哌啶/N,N-二甲基甲醯胺溶液(2mL)並振盪5分鐘後過濾；進行此操作4次。將樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次。添加3-三苯甲基硫烷基丙酸(209mg，0.600mmol)與HATU(228mg，0.600mmol)與N,N-二異丙基乙基胺(205μL，1.20mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(2mL)並於室溫振盪1小時。過濾後樹脂以N,N-二甲基甲醯胺洗淨4次，以二氯甲烷洗淨4次。添加1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(0.5mL)與二氯甲烷(1.5mL)之混合溶液，於室溫振盪2小時。過濾而去除樹脂，減壓下濃縮濾液。藉由以二氯 甲烷共沸6次，以真空幫浦加以乾燥，獲得呈褐色固體(105mg)之目的物TrS-(TrS-)Lys-PEG(3)-CO2H。
(2-33B)TrS-(TrS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-33A)所製造的TrS-(TrS-)Lys-PEG(3)-CO2H(27.4mg)，依據與(2-17A)同樣之手法，獲得目的物TrS-(TrS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(30mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C188H272N48O47S5：[M+H]+ 4114.9，實測值4115.1
(2-33C)HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-33B)所製造的TrS-(TrS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(30.0mg)，依據與(2-17B)同樣之手法，獲得目的物HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(15.3mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C150H244N48O47S5：[M+H]+ 3630.7，實測值3631.0
(2-33D)SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-33)之合成
由以(2-33C)之手法所製造的HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(5.00mg)，依據與(2-17C)同樣之手法，獲得目的物SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(化合物2-33)(8.55mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C336H540N64O177S5：[M+5H]5+ 1694.7(平均)，實測值1694.5。
<實施例2-34>SG-硫乙醯胺-(SG-硫乙醯胺-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(化合物2-34)之合成
(2-34A)SG-硫乙醯胺-(SG-硫乙醯胺-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用(2-33C)所製造的HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(4.14mg)與(1-19D)所製造的SG-I(7.40mg)，依據與(2-25C)同樣之手法，獲得目的物SG-硫乙醯胺-(SG-硫乙醯胺-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(化合物2-34)(4.74mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C326H530N62O173S5：[M+5H]5+ 1650.3(平均)，實測值1650.2。
<實施例2-35>SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-35)之合成
(2-35A)Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
於化合物1-20A(4.40mg，7.42μmol)及HATU(2.6mg，6.84μmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(94μL)中，添加N,N-二異丙基乙基胺(5.0μL，29.4μmol)，並於室溫攪拌3分鐘。將獲得的反應溶液添加於hANP三氟乙酸鹽(25mg)及N,N-二異丙基乙基胺(13μL，76.4μmol)之N,N-二甲基甲醯胺/水(5：1，v/v)混合溶液(0.60mL)，並於室溫攪拌2小時。於反應溶液中添加0.2%三氟乙酸水溶液(3mL)，藉由以0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液的逆相HPLC(GL Science，Inertsil ODS-3)進行分離純化，冷凍乾燥而獲得Boc-(Boc-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(18.0mg)。
使用獲得的Boc-(Boc-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(18.0mg)，依據與(2-2C)同樣之手法，獲得目的物Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(12.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C144H237N48O45S3：[M+H]+ 3454.7，實測值3454.7.
(2-35C)SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-35)之合成
使用(2-35B)所製造的Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(6.0mg)，依據與(2-1B)同樣之手法，獲得目的物SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-35)(6.4mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C316H507N60O171S3：[M-5H]5-1595.7(平均)，實測值1595.6.。
<實施例2-36>SG-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28)(化合物2-36)之合成
(2-36A)GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-(tBuSer-Gly)3-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
使用化合物1-21B(13.8mg)與以(2-1A)之調整法2之方法由hANP-乙酸鹽(37.1mg)調整的hANP(1-28)-TFA鹽，依據與(2-1B)同樣之手法，獲得目的物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-(tBuSer-Gly)3-hANP(1-28)(27.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C176H286N56O61S3：[M+H]+ 4258.0，實測值4257.8
(2-36B)GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-(Ser-Gly)3-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-36A)所製造的GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-(tBuSer-Gly)3-hANP(1-28)(27.0mg)，依據與(2-17A)同樣之手法，獲得目的物GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-(Ser-Gly)3-hANP(1-28)(4.66mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C164H262N56O61S3：[M+H]+ 4089.8，實測值4090.1
(2-36C)SG-(SG-Asn)-(Ser-Gly)3-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-36)之合成
由(2-36B)所製造的GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28)(3.50mg)，依據與(2-2D)同樣之手法，獲得目的物SGc-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28)(化合物2-36)(3.24mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C316H508N66O173S3：[M+4H]4+ 2025.0(平均)，實測值2025.0。
<實施例2-37>SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28)(化合物2-37)之合成
(2-37A)Gly3-hANP(1-28)(下述式之化合物之合成)
使用2-[[2-[[2-(三級丁氧基羰基胺基)乙醯基]胺基]乙醯基]胺基]乙酸(27.7mg)與以(2-1A)之調整法2之方法由hANP-乙酸鹽(246mg)調整的hANP-TFA鹽，依據與(2-1B)同樣之手法，獲得Boc-Gly3-hANP(1-28)(196mg)。由獲得的Boc-Gly3-hANP(1-28)(196mg)，依據與(2-2C)同樣之手法，獲得目的物Gly3-hANP(1-28)(190mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C133H212N48O42S3：[M+H]+ 3250.5，實測值3250.6
(2-37B)Gly6-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-37A)所製造的Gly3-hANP(1-28)(190mg)與2-[[2-[[2-(三級丁氧基羰基胺基)乙醯基]胺基]乙醯基]胺基]乙酸(13.4mg)，依據與(2-1B)同樣之手法，獲得Boc-Gly6-hANP(1-28)(115mg)。
由獲得的Boc-Gly6-hANP(1-28)(115mg)，依據與(2-2C)同樣之手法，獲得目的物Gly6-hANP(1-28)(115mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C139H221N51O45S3：[M+H]+ 3421.6，實測值3421.5
(2-37C)Boc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-37B)所製造的Gly6-hANP(1-28)(60.0mg)，依據與(1-5A)同樣之手法，獲得目的物Boc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28)(23.0mg)。
MALDI-TOF-MS：計算值C156H248N54O54S3：[M+H]+ 3838.7，實測值3839.0
(2-37D)GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28)(下述式之化合物)之合成
由(2-37C)所製造的Boc-(GlcNAc-Asn)-Gly6-hANP(1-28)(23.0mg)，依據與(1-5B)同樣之手法，獲得呈白色固體(6.77mg)之目的物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28)。
MALDI-TOF-MS：計算值C161H255N55O59S3：[M+H]+ 3999.8，實測值4000.1
(2-37E)SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28)(下述式之化合物，化合物2-37)之合成
由(2-37D)所製造的GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28)(3.40mg)，依據與(2-2D)同樣之手法，獲得目的物SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28)(化合物2-37)(4.32mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C313H501N65O171S3：[M+4H]4+ 2002.7(平均)，實測值2002.5。
<實施例2-38>SG-Lys*-[PEG(3)-Mal-hANP(1-28)]2(化合物2-38，下述式之化合物)之合成
使用(1-22B)所製造的SG-Lys-[PEG(3)-Mal]2(3.0mg，0.94μmol)，依據與(2-32A)同樣之方法，獲得標題目的化合物SG-Lys*-[PEG(3)-Mal-hANP(1-28)]2(化合物2-38)(7.0mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C388H616N103O159S8：[M-5H]5-1904.8(平均)，實測值1904.8.。
<實施例2-39>SG-Lys*-[PEG(11)-Mal-hANP(1-28)]2(化合物2-39，下述式之化合物)之合成
使用(1-23B)所製造的SG-Lys*-[PEG(11)-Mal]2(3.7mg，0.95μmol)，依據與(2-32A)同樣之方法，獲得標題目的化合物SG-Lys*-[PEG(11)-Mal-hANP(1-28)]2(化合物2-39)(7.0mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C420H680N103O175S8：[M-5H]5-2045.8(平均)，實測值2045.8.。
<實施例2-40>SG(Glc)-Gly-A-hANP(1-28)(化合物2-40，下述式之化合物)之合成
使用(1-24E)合成的SG(Glc)-Gly-A(30mg)，依據與(2-1B)同樣之手法，獲得目的化合物SG(Glc)-Gly-A-hANP(1-28)(化合物2-40)(34.2mg)。
ESI-TOF-MS：計算值C213H341N51O103S3：[M+4H]4+1341.1(平均)，實測值1341.0
又，於實施例2之各種修飾hANP之製造，藉由使用以依據實施例1-11、1-12，1-13或1-14、及實施例1-24的方法所合成的各種之還原末端改質糖鏈，而可適宜製造採用還原末端改質糖鏈作為糖鏈的修飾hANP。
[試驗例] <試驗例1>糖鏈修飾胜肽之cGMP上升活性試驗
藉由以下之方法，測定實施例2所製作的各修飾胜肽之cGMP上升活性。於CHO細胞中恆定地表現人類GC-A的CHO/人類GC-A細胞，使其以2×105個細胞/ml懸浮於α-MEM，10%FBS，1%盤尼西林-鏈黴素，以20μl/孔接種於384孔盤(Corning，3826)(4×103個細胞/孔)，於CO2培養箱內培養一晚。翌日，由此盤去除培養基後，以10μl/孔添加1.6mM IBMX/KRB緩衝液，以平盤振盪器攪拌後，於室溫培育10分鐘。其次，使其溶解於水，各添加5μl/孔之調製為最終濃度之3倍濃度的被驗物質(各修飾胜肽及天然型hANP(1-28)(胜肽研究所)，以成為最終濃度濃度範圍為0.01、0.1、1、10、100Nm的方式調製稀釋系列)，以平盤振盪器攪拌後，於CO2培養箱內培育15分鐘。之後，添加5μl之溶解緩衝液(Lysis buffer)(50mM磷酸鹽緩衝液，pH7.0，1%Triton X-100)，以平盤振盪器攪拌10分鐘，使細胞溶解。接著，使用cGMP套組(CISBIO製)測定此細胞溶解液中之cGMP量。即，於384孔盤(Greiner，784076)中添加5μl/孔之套組所附的稀釋液、5μl/孔之細胞溶解液、5μl/孔之cGMP-d2、5μl/孔之抗cGMP-穴狀化合物(Cryptate)，以平盤振盪器攪拌後，遮光下於4℃培育一晚後，以RubyStar(BMG LABTECH製)測定均相時間分辨螢光(homogeneous time-resolved fluorescence)。各濃度中的被驗物質之活性值(T/C)係將僅添加溶媒的孔之活性值 作為0，添加1nM ANP的孔之活性值作為1而算出。將各濃度中的T/C作圖，由獲得的S型曲線將T/C=0.5之值作為EC50，將測定濃度範圍中的最大T/C值作為Emax(表1)。
由表1之結果，全部之修飾胜肽顯示hANP之50%以上的cGMP上升活性(Emax>0.5)，且顯示保持cGMP上升活性。化合物2-17、2-18、2-20雖有Emax為0.6~0.7左右稍低的傾向，但其以外之修飾胜肽其Emax為0.95以上，保持與天然型hANP同等之cGMP上升作用。
<試驗例2>修飾胜肽之NEP分解試驗
藉由以下之方法，調查實施例2製作的各修飾胜肽對於中性內肽酶(一般名：腦啡肽酶(Neprilysin))所導致的分解之耐性。
於被驗物質(各種糖鏈修飾ANP及天然型hANP(1-28))之溶液中以使其成為1ug/ml的方式添加腦啡肽酶(R&D systems)，於37℃作30分鐘前處理。使用該腦啡肽酶處理液而以試驗例1之方法調查被驗物質之cGMP上升活性。
其結果，天然型hANP係藉由NEP處理而活性會消失，但本發明之修飾胜肽即使於NEP處理後亦保持與試驗例1同程度之cGMP上升活性，顯示難以受到NEP所導致的分解。
動物之血中的天然型ANP快速消失的主要機制被認為係NEP所導致的分解。因本發明之修飾胜肽於NEP處理後亦維持cGMP上升活性，於動物體內亦難以受到NEP所導致的分解，顯示若投予有效量則投予後歷經長時間可發揮cGMP上升活性。
<試驗例3>修飾胜肽之大鼠血中持續性試驗
藉由以下之方法，調查實施例2所製作的各修飾胜肽之大鼠血中的持續性(血中cGMP之持續的上升作用及被驗物質之自血中的檢測時間)。
(1)血漿樣品的調製
異氟烷(isoflurane)：日本藥典異氟烷
採血用針及注射器：Terumo注射器25G x 1 SR結核菌素(tuberculin)用
採血用管：Capiject微量採血管EDTA-2Na 500μL
樣品保管用管：MTARIX4170樣品保存管0.75mL
對8週齡之雄性Slc：SD大鼠進行異氟烷吸入麻醉((將Escain吸入麻醉液維持以1-2%之濃度來吸入)。將溶解於水之調製為100uM之濃度的被驗物質(各修飾胜肽及天然型hANP(1-28)(胜肽研究所))之溶液，經由頸靜脈，以100nmol/kg之用量(1mL/kg)急速地靜脈注射。於投予前、投予後15、30、60、90、120、180及240分鐘之時間點，進行由頸靜脈之經時採血(200μL/次)，將血液樣品快速地置於冰上。
採取的血液樣品使用離心機(Sigma 4K15，轉子：Nr12130-H)，以5000rpm、5min、4℃進行離心分離，分離的血漿樣品分成PK測定用及cGMP測定用2根而保存於-80℃至測定為止。
(2)血漿中cGMP濃度之測定
血漿中之cGMP濃度係使用Amersham cGMP Enzymeimmunoassay BiotrakTM(EIA)System(雙重範圍)，依據所附說明來測定。其結果，縱軸以cGMP濃度、橫軸以投予後之經過時間(分鐘)作圖，算出0分鐘~240分鐘為止之AUC(AUC0-240)與投予後60-240分鐘之AUC(AUC60-240)。(表2)。
(3)血漿樣品中之被驗物質之檢測
於(1)調整的大鼠血漿樣品50μL中添加內部標準物質(hANP之安定同位素500nM，20μL)及乙酸混合溶媒(AcOH/蒸餾水/DMSO=5/3/2，v/v/v)後混合，移到Amicon Ultra-0.5 50K(Millipore Corp.,MA)而以15℃、14000rpm離心分離30分鐘。將獲得的濾液移到Amicon Ultra-0.5 3K(Millipore Corp.,MA)，以前述條件再次離心分離。取出於過濾器上殘留的液體，移到96深孔盤(96-deep well plate)，以LC-MS/MS(LC：Shimadzu LC-10ADVP(島津製作所)，MS/MS：API4000QTrap(AB SCIEX))，測定被驗物質之含量，算出血漿中之濃度。被驗物質最後被檢測出的時間示於表2右側第一欄。
*)將Pre值(0分之值)作為基線，加總對於曲線全部的點與基線的差值的AUC值。曲線成為基線下的點作為負值來計算。
**)將Pre值(0分之值)作為基線，僅加總曲線於基線上的點與基線差值的AUC值。無視於曲線成為基線下的點來計算。
於天然型hANP，藉由投予，cGMP會暫時性地急遽上升，但由於投予30分鐘後，會降至接近投予開始前的程度，60分鐘以後cGMP之上升會完全地消失，故確認AUC60-240係0以下，並無血中持續性。又，關於血漿中之被驗物質之檢測，於投予15分鐘後之血漿樣品亦未檢測出天然型hANP。
相對於此，於實施例2之修飾胜肽，於AUC60-240亦呈現高值，經由被驗物質之投予而上升的血漿中cGMP濃度於投予後60分鐘以後(化合物2-1、2-10為180分鐘後，化合物2-12、2-13、2-14、2-16為120分鐘後，化合物2-11、2-15、2-19為60分鐘後)，亦維持較投予前更高的值。又，被驗物質本身於投予1.5小時後自血漿樣品亦被檢驗出，顯示於體內歷經長時間未被代謝，而停留於血中。
由此結果，本發明之修飾胜肽顯示血中之持續時間被延長，且於該持續時間中保持cGMP上升活性。
<110> 第一三共股份有限公司
<120> 含利尿納肽之激動劑的糖鏈修飾心房利尿鈉肽
<130> FP1401
<150> JP2013-010612
<151> 2013-01-23
<160> 1
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 28
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<223> 發明人：Iwamoto,Mitsuhiro；Yamaguchi,Takahiro；Mori,Yutaka；Saito,Keiji；Honda,Takeshi；Nagayama,Takahiro
<400> 1
<2

Claims (53)

  1. 一種修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其係至少一個之糖物質直接藉由醣苷鍵連結、或藉由連結構造(linker structure)，而與至少一個之hANP胜肽連結的修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽。
  2. 如請求項1之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係於hANP胜肽之N末端、C末端、及構成胜肽之至少一個之胺基酸的側鏈之至少一處，直接藉由醣苷鍵連結、或藉由連結構造而連結。
  3. 如請求項1之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中hANP胜肽係hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)。
  4. 如請求項1之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽，其中糖物質係選自至少一種類之單糖類、雙糖類、三糖類、及4個以上之單糖類作醣苷鍵結而成的糖鏈，且一分子中含有複數個糖物質的情形，彼等可為相同，亦可為彼此相異。
  5. 如請求項1之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中糖物質係4個以上之單糖類作醣苷鍵結而成的糖鏈。
  6. 如請求項5之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中糖物質係來自糖蛋白質之N鍵結型糖鏈、O鍵結型糖鏈、或彼等之改質糖鏈。
  7. 如請求項6之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中糖物質包含下式所表示的糖鏈構造的N鍵結型糖鏈或其還原末端改質糖鏈， (式中，Gxx係GlcNAc、Glc或Man(包含上述構造的糖鏈，以下，因應GXX的種類而各自稱為「AG(5)」、「AG(5-Glc)」、及「AG(5-Man)」)，『O/N-L』表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵與連結構造或hANP胜肽鍵結)。
  8. 如請求項7之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中糖物質係含下式所表示的糖鏈構造的糖鏈， (式中，Gxx係GlcNAc、Glc或Man(包含上述構造的糖鏈，以下，因應GXX的種類而各自稱為「AG(7)」、「AG(7-Glc)」、及「AG(7-Man)」)，『O/N-L』係表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵而與連結構造或hANP胜肽鍵結)。
  9. 如請求項8之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中糖物質係含下式所表示的糖鏈構造的糖鏈， (式中，Gxx係GlcNAc、Glc或Man(包含上述構造的糖鏈，以下，因應GXX的種類而各自稱為「AG(9)」、「AG(9-Glc)」、及「AG(9-Man)」)，『O/N-L』表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵而與連結構造或hANP胜肽鍵結)。
  10. 如請求項9之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中糖物質係含下式所表示的糖鏈構造的糖鏈， (式中，Gxx係GlcNAc、Glc或Man(包含上述構造的糖鏈，以下，因應GXX的種類而各自稱為「SG」、「SG(Glc)」、及「SG(Man)」)，『O/N-L』係表示藉由O醣苷鍵或N醣苷鍵而與連結構造或hANP胜肽鍵結)。
  11. 請求項7~10中任一項之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中於糖物質，Gxx係GlcNAc。
  12. 如請求項11之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中糖物質係SG。
  13. 如請求項1之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中對於1個hANP胜肽，連結10個以下之糖物質。
  14. 如請求項1之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中對於1個hANP胜肽，連結1個、2個、或3個之糖物質。
  15. 如請求項1之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其於1分子中含有2價以上之hANP胜肽。
  16. 如請求項3之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中hANP胜肽與糖物質係藉由連結構造而連結，而連結構造係具有3個原子以上之連結鏈，於至少一處，與糖物質之還原末端作醣苷鍵結，且於至少一處，與hANP胜肽鍵結的化學構造。
  17. 如請求項16之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中糖物質係於hANP胜肽之N末端、C末端之任一者、或其兩者，藉由連結構造而連結。
  18. 如請求項17之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中連結構造係具有15個原子以下之連結鏈的構造。
  19. 如請求項18之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其係SG-hANP(1-28)(化合物2-1)、hANP(1-28)-SG(化合物2-2)、SG-hANP(1-28)-SG(化合物2-7)、AG(9)-hANP(1-28)(化合物2-10)、SG-三唑-hANP(1-28)(化合物2-12)、SG-硫乙醯胺-hANP(1-28)(化合物2-25)、AG(5)-hANP(1-28)(化合物2-26)、或於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)者。
  20. 如請求項16之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中連結構造含有聚氧伸烷基鏈、胺基酸、及包含2個以上之胺基酸的寡肽鏈中的至少一個之構造。
  21. 如請求項20之修飾胜肽，其中含於連結構造的聚氧伸烷基鏈、胺基酸及/或寡肽鏈係與hANP胜肽之N末端及/或C末端作醯胺鍵結。
  22. 如請求項21之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中聚氧伸烷基鏈係PEG。
  23. 如請求項21之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其係SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-16)、AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-21)、AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-22)、SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG(化合物2-24)、SG-(SG-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-27)、SG-(SG-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-28)、SG-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-29)、SG-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-30)、SG-*(SG-)Gln-Mal-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-31)SG-(SG-)Gln-PEG(3)-Mal-hANP(1-28)(化合物2-32)、SG-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28)(化合物2-36)SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28)(化合物2-37)、或於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man),、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)。
  24. 如請求項20之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中連結構造含胺基側鏈胺基酸、SH側鏈胺基酸、羧基側鏈胺基酸、羥基側鏈胺基酸或苯酚側鏈胺基酸之至少一個之官能基側鏈胺基酸，且於該官能基側鏈胺基酸之側鏈，與糖物質或hANP胜肽連結。
  25. 如請求項24之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中連結構造含至少一個之胺基側鏈胺基酸，且糖物質連結於該胺基側鏈胺基酸之側鏈，且具有以下通式 (C)之構造， (式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上；GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY；N-(AA)係表示來自胺基側鏈胺基酸之側鏈之胺基的氮原子)。
  26. 如請求項25之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中胺基側鏈胺基酸之側鏈胺基及α胺基係與其他胺基酸之α羧基形成醯胺鍵。
  27. 如請求項25或26之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中胺基側鏈胺基酸係Lys。
  28. 如請求項27之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其係SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28)(化合物2-14)、[(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28)(化合物2-15)、SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-19)、[SG2-Mal-(SG2-Mal-)Lys-[SG2-Mal-(SG2-Mal-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-20)、SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-hANP(1-28)(化合物2-33)、SG-硫乙醯胺-(SG-硫乙醯胺-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28)(化合物2-34)、SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-35)、 或於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)者。
  29. 如請求項24之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中連結構造含至少一個之SH基側鏈胺基酸，且糖物質係連結於該胺基側鏈胺基酸之側鏈，並具有以下通 式之構造， (式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上；GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY；S表示來自SH基側鏈胺基酸之側鏈SH基的硫原子)。
  30. 如請求項29之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中SH基側鏈胺基酸係Cys。
  31. 如請求項30之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其係[(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28)(化合物2-17)、[(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28)(化合物2-18)、SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28)(化合物2-23)、 或於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)者。
  32. 如請求項24之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中連結構造含至少一個之羧基側鏈胺基酸，且糖物質係連結於該羧酸側鏈胺基酸之側鏈，並具有以下通式之構造， (式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上；GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY；CO表示來自羧酸側鏈胺基酸之側鏈的CO)。
  33. 如請求項32之修飾胜肽，其中糖物質係於羧基側鏈胺基酸之側鏈羧基及α羧基的兩者上作N醣苷鍵，藉由α胺基與其他連結構造或hANP胜肽鍵結。
  34. 如請求項32或33之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中羧酸基側鏈胺基酸係Glu、Gln、ASp或Asn。
  35. 如請求項34之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其係(SG-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-3)、(SG-)Asn-hANP(2-28)(化合物2-4)、(SG-)Asn-hANP(3-28) (化合物2-8)、SG-(SG-)Asn-hANP(1-28)(化合物2-9)、SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28)(化合物2-13)或者，於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)者。
  36. 如請求項24之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中連結構造含至少一個之苯酚側鏈胺基酸，且糖物質係連結於該苯酚側鏈胺基酸之側鏈，並具有以下通式之構造， (式中，GLY表示糖物質，Lg表示連結構造中之糖鏈側構造，可為直鏈或分枝為2個以上；GLY與L係以O-或N-醣苷鍵鍵結，Lg為分枝的情形，可連結分枝末端與同數目之GLY；苯酚基表示來自苯酚基側鏈胺基酸之側鏈的苯酚基)。
  37. 如請求項36之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中苯酚基側鏈胺基酸係Tyr。
  38. 如請求項37之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其係hANP(1-27)-(SG-)Tyr(化合物2-6)或者，於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、 AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)者。
  39. 如請求項24之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中連結構造含有至少一個之羥基側鏈胺基酸，糖物質係於該羥基側鏈胺基酸之側鏈作O-醣苷鍵結，具有以下通式之構造， (式中，GLY表示糖物質，O表示來自羥基側鏈胺基酸之側鏈羥基的氧原子)。
  40. 如請求項39之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中羥基側鏈胺基酸係Ser。
  41. 如請求項40之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其係(SG-)Ser-hANP(2-28)(化合物2-5)或者，於此等之修飾胜肽，糖物質被取代為SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或者GlcNAc，及/或hANP胜肽被取代為hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或者hANP(3-27)。
  42. 如請求項16~41中任一項之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，作為糖物質，具有1或2個之SG，作為hANP胜肽，具有1個之hANP(1-28)(序列識別號1)，SG係 於hANP(1-28)之N末端，藉由具有10個原子以下之連結鏈的連結構造來連結。
  43. 如請求項1之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其包含下述之化合物2-1、2-3、2-10、2-11、2-12、2-13、2-14、2-15，2-16，2-25，2-26、2-27、2-29、或2-30之式所表示的構造， (於上述式，hANP係包含序列識別號1之胺基酸序列的hANP(1-28)，於該胺基酸序列之N末端，與連結構造作醯胺鍵結)。
  44. 如請求項42或43之修飾胜肽之鹽，其中藥學上可容許的鹽係三氟乙酸鹽、或者乙酸鹽。
  45. 如請求項3之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其中糖物質係連結於hANP胜肽之胺基酸側鏈，該經連結的胺基酸係含於hANP胜肽的序列識別號1之胺基酸編號7~23的胺基酸以外的胺基酸。
  46. 如請求項1之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其與未經修飾的hANP(1-28)比較，顯示經延長的血中持續時間，且保持cGMP上升活性。
  47. 如請求項1之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其係對中性內肽酶(endopeptidase)所致的hANP胜肽的分解具有抵抗性。
  48. 如請求項1之修飾胜肽或其藥理學上可容許的鹽，其與未經修飾的hANP(1-28)比較，顯示3倍以上之水溶性。
  49. 一種醫藥，其含有如請求項1~48中任一項之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽。
  50. 如請求項48之醫藥，其係循環器官疾病之治療劑或減輕劑。
  51. 一種治療或減輕循環器官疾病之方法，其包含投予有效量之如請求項1~48中任一項之修飾胜肽或其藥學上可容許的鹽。
  52. 一種如請求項1~48中任一項之修飾胜肽之製造方法，其包含連結hANP胜肽、糖物質、及因應必要的連結分子、被轉移化合物的步驟。
  53. 如請求項52之方法，其包含使用Endo-M或其變異酵素，而使糖鏈轉移至GlcNAc化合物、Glc化合物或Man化合物的步驟。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109462989A (zh) * 2016-07-01 2019-03-12 第三共株式会社 Hanp-含fc分子缀合物
US20180128545A1 (en) 2016-11-08 2018-05-10 Berry Metal Company Modular furnace cooling wall
US20210171598A1 (en) * 2017-12-01 2021-06-10 University Of Copenhagen Peptide hormone with one or more o-glycans
US11396497B2 (en) 2018-05-04 2022-07-26 New Mexico Tech University Research Park Corporation Proteasome inhibitors
CN115605491A (zh) * 2019-04-05 2023-01-13 刘扶东（Us） 抗唾液酸酶的糖类、其制造方法及用途
CN119613549A (zh) 2019-06-12 2025-03-14 诺华股份有限公司 利钠肽受体1抗体及使用方法
CN110278941B (zh) * 2019-07-11 2021-05-28 西安国际医学中心有限公司 一种含有钠尿肽的离体心脏保护液
US20230128032A1 (en) 2020-03-31 2023-04-27 Curtails Llc Early Drug Interventions to Reduce COVID-19 Related Respiratory Distress, Need for Respirator Assist and Death
CA3182526A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Academia Sinica Chimeric influenza vaccines
IL305816A (en) * 2021-03-12 2023-11-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Glycan and a method for preparing a medicine containing it
AU2022257113B2 (en) 2021-04-12 2024-07-18 Academia Sinica Improved coronavirus vaccine
TW202334429A (zh) 2021-10-01 2023-09-01 中央研究院 Sars-cov-2棘蛋白特異性抗體及其用途
KR20240155298A (ko) 2022-03-02 2024-10-28 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 Fc 함유 분자의 제조 방법
JPWO2024053574A1 (zh) * 2022-09-09 2024-03-14
WO2024086680A2 (en) 2022-10-21 2024-04-25 Eli Lilly And Company Long-acting natriuretic peptides and uses thereof
JP2025536873A (ja) 2023-04-08 2025-11-12 ロック・バイオメディカル・インコーポレイテッド ポリマーソームによる標的化送達のための方法及び組成物

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5272070A (en) 1991-03-08 1993-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for the preparation of cell lines producing Man3 GlcNac 2 asparagine-linked gylcans and cell lines produced thereby
JP3532593B2 (ja) * 1993-08-24 2004-05-31 麒麟麦酒株式会社 糖質又は複合糖質の製造方法
CA2233725A1 (en) * 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
US20030036181A1 (en) * 2000-06-30 2003-02-20 Okkels Jens Sigurd Peptide extended glycosylated polypeptides
CN101942019A (zh) * 2002-04-30 2011-01-12 拜耳医药保健有限公司 凝血因子VII或VIIa多肽变体
ATE459370T1 (de) 2002-11-26 2010-03-15 Biocon Ltd Modifizierte natriuretic verbindungen, konjugate und ihre verwendungen
US20080300173A1 (en) * 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
US20080207505A1 (en) * 2005-01-12 2008-08-28 James Kenneth D Bna Conjugates and Methods of Use
WO2006094810A2 (en) * 2005-03-11 2006-09-14 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Production of bioactive glycoproteins from inactive starting material by conjugation with hydroxyalkylstarch
EP1951277A2 (en) * 2005-10-14 2008-08-06 Biorexis Pharmaceutical Corporation Natriuretic peptide modified transferrin fusion proteins
CA2648053A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-11 Centocor, Inc. Binding partners with immunoglobulin domains modified to have extended half-life
US20100310561A1 (en) 2007-06-06 2010-12-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Natriuretic fusion proteins
CN102026653B (zh) * 2007-10-15 2014-06-18 北卡罗来纳-查佩尔山大学 半衰期延长的人因子ⅸ变体
EP2250189A4 (en) 2008-02-26 2012-07-04 Univ California GYLCOPEPTIDES AND METHOD FOR THEIR PREPARATION AND USE
CN101809029B (zh) 2008-05-23 2016-06-15 第一三共株式会社 具有延长目标肽的血浆半衰期作用的肽
US20110118183A1 (en) * 2008-06-27 2011-05-19 Novo Nordisk Health Care Ag N-glycosylated human growth hormone with prolonged circulatory half-life
US7858735B2 (en) 2009-05-29 2010-12-28 Exxonmobil Chemical Patents Inc. Method and apparatus for elastomer finishing
JP6091892B2 (ja) * 2009-06-16 2017-03-08 グライセラ・リミテッド グリコシル化に関連する物質および方法
WO2011027868A1 (ja) 2009-09-03 2011-03-10 公益財団法人野口研究所 １１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの製造方法

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