[go: up one dir, main page]

TR201815863T4 - Sitotoksisiteyi indükleyen terapötik madde. - Google Patents

Sitotoksisiteyi indükleyen terapötik madde. Download PDF

Info

Publication number
TR201815863T4
TR201815863T4 TR2018/15863T TR201815863T TR201815863T4 TR 201815863 T4 TR201815863 T4 TR 201815863T4 TR 2018/15863 T TR2018/15863 T TR 2018/15863T TR 201815863 T TR201815863 T TR 201815863T TR 201815863 T4 TR201815863 T4 TR 201815863T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
gpc3
antibody
domain
cells
binding
Prior art date
Application number
TR2018/15863T
Other languages
English (en)
Inventor
Nezu Junichi
Ishiguro Takahiro
Narita Atsushi
Sakamoto Akihisa
Kawai Yumiko
Igawa Tomoyuki
Kuramochi Taichi
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46171913&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TR201815863(T4) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of TR201815863T4 publication Critical patent/TR201815863T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Antijen bağlama alanının değiştirilmesiyle, mevcut buluş sahipleri, BiTE'nin güçlü anti tümör aktivitesine oldukça iyi güvenlik özelliklerine sahip olmasının yanı sıra, kanda uzun bir yarı ömre sahip olan ve birçok farklı hedef hücreye zarar verebilen yeni polipeptit kompleksleri keşfetmişlerdir.

Description

TARIFNAME SITOTOKSISITEYI INDÜKLEYEN TERAPÖTIK MADDE Teknik Alan Mevcut bulus, hedef kanser hücrelerine yakI T hücrelerine sahip olmasIZi/e T hücrelerinin sitotoksisite aktivitesini hedef kanser hücrelerine karsElkulIanmasElile kanser tedavisini mümkün kllân polipeptit kompleksleri ile ilgilidir. Mevcut bulus ayrlîla, bir aktif içerik maddesi olarak hücresel sitotoksisitenin indüklenmesi için yukarlâh bahsedilen terapötik maddeyi içeren, çesitli kanserlerin tedavi edilmesi veya önlenmesine yönelik farmasötik bilesimler ile Önceki Teknik Bugüne kadar, oldukça iyi bir anti-tümör etkisine sahip birçok terapötik antikor, kanserin tedavi edilmesine yönelik farmasötikler olarak gelistirilmistir (Patent Olmayan Doküman 1). Bu terapötik antikorlarlEJ, kanser hücresinin büyümesi için gerekli sinyallerin Inhibe edilmesi, hücre ölümü sinyallerinin indüklenmesi, antikora baglÇlhücre arac[l]]3itotoksisite (ADCC) veya tamamlaylîlîda bagIiIElsitotoksisite (CDC) vasüslýla kanser hücreleri üzerinde anti-tümör etkisini uygulad[gil:lbilinmektedir (Patent Olmayan Doküman 2). ADCC, bir antikorun Fc bölgesi, efektör hücreler üzerindeki bir Fc reseptörüne baglandlgiütla, antikora bagIiIElhedef kanser hücrelerine karsElNK hücreleri gibi efektör hücreler ve makrofajlar tarafIan uygulanan bir sitotoksisitedir. Bu zaman zarfIda, bir tamamlaylEElkompleks, bir antikor yaplîEl içerisindeki tamamlaylîElbaglaylEElyere baglanmaktadlrîl CDC, kompleks içerisindeki bir tamamlaylîlîlbilesen, bir antikora bagllühücrenin hücre zarEliçerisinden bir gözenek olusturarak, hücrenin içerisine su veya iyon aklglElEl artlEiliglIa meydana gelen sitotoksisitedir. Koncansiyonel terapötik antikorlarI oldukça iyi aktiviteler sergilemesine ragmen, bugüne kadar, bu tür antikorlarI uygulanmasüyalnlîta umuldugu gibi olmayan çlthIra sebep olmustur. Dolaylîlýla, kansere karsEIdaha iyi bir hücre öldürme aktivitesi uygulayan terapötik antikorlarI gelistirilmesi arzu edilmektedir. NK hücrelerini veya makrofaklarEEfektör hücreler olarak temin ederek ADCC'yi anti-tümör mekanizmasüolarak benimseyen, yukar- bahsedilen antikorlara ilaveten, T hücrelerini efektör hücreler olarak temin ederek sitotoksisiteyi anti-tümör mekanizmaslîl olarak benimseyen, T hücresi temin eden antikorlar (TR antikorlarLIl 1980'lerden beri bilinmektedir (Patent Olmayan Dokümanlar 3 ila 5). Bir TR antikoru, T hücreleri üzerinde bir T-hücresi reseptör (TCR) kompleksi meydana getiren alt birimlerin herhangi birine karsEbir antikor, özellikle CD3 epsilon zincirine baglanan bir antikor ve hedef kanser hücreleri üzerindeki bir antijene baglanan bir antikora sahip bir bi-spesifik antikordur. TR antikoru aynlîamanda hem CD3 epsilon zincirine hem de kanser antijenine baglandlgiIa bir T hücresi bir kanser hücresine yaklasmaktadiEl ve bu, T hücresinin sitotoksisite aktivitesinden kaynaklEioIarak kanser hücresine karsEHJIr anti-tümör etkisine sebep olmaktadlü (Patent Olmayan Dokümanlar 6 ve 7). Üç islevli bir antikor, bir kolun bir kanser antijenine baglanan bir Fab içerdigi ve diger kolun ise CD3 epsilon zincirine baglanan bir Fab içerdigi bir tüm, IgG-türü bi-spesifik antikordur. Kötücül asitlere karsEterapötik etki, EpCAM'a karsEüç islevli bir antikor olan katumaksomabEi, EpCAM ekspresyonu pozitif olan kanser hücrelerine sahip, kötücül asitleri olan hastalar. peritoneal kavitelerine uygulanmasüvasißslýia gösterilmistir. KatumaksomabI kullanIi-üyukarki tedavi için EU'da onaylanmISIiEI DahasÇi"bi-spesifik T hücresi baglaylEigEQBiTEY' olarak adlandlEiIân bir TR antikorunun, güçlü bir anti-tümör etkisini inhibe ettigi yakI dönemde kesfedilmistir (Patent Olmayan Dokümanlar 8 ve 9). BiTE, bir kanser antijenine karsübir antikorun scFv'sinin, bir kü polipeptit baglaylîigiîlasßsiýia CD3 epsilon zincirine karsEibir antikorun scFv'sine baglandgiü bir moleküler forma sahip bir TR antikorudur. BiTE'nin, bilinen çesitli TR antikorlarEia klýbsla daha iyi bir anti-tümör aktivitesine sahip oldugu belirtilmistir (Patent Olmayan Dokümanlar 9 ve 10). Belirgin sekilde, diger TR antikorlar. klýiasla, BiTE, ciddi oranda düsük bir konsantrasyonda ve düsük efektör hücre/kanser hücresi oraniEUa (ET oranD] bile bir anti- tümör etkisi uygulamaktadlEi Ayriîh, etkinin, IL-2, bir CDZS agonistik antikorunun veya benzerinin hemen kullanilBiasEi/asitâslsîla efektör hücrelerinin aktive edilmesi gerekmeksizin uygulanabildigi gösterilmistir. CD19'a karsEbir BiTE olan blinatumomab (MT103), çok iyi bir klinik etki ürettigi bilinen Rituksan'a klýbsla in vitro kanser hücrelerine karsü;0k daha güçlü bir sitotoksik aktivite sergilemektedir. DahasÇi bIinatumomabiEl, yakI zamanda gerçeklestirilen evre I ve II klinik denemelerde fazlaca üstün bir anti-tümör etki gösterdigi belirtilmistir (Patent Olmayan Doküman 11). KatumaksomabiEl klinik ilaç etkisi sergileyen bir terapötik madde olarak onaylanmasEive blinatumomab da dahil olmak üzere birçok BiTE'nin güçlü bir anti-tümör etkisi uygulamasi: efektör hücreler olarak T hücrelerini temin eden TR antikorlarIlEl, faaliyet mekanizmasü olarak ADCC kullanan konvansiyonel antikorlara klîilasla bir anti tümör maddesi olarak büyük oranda daha yüksek bir potansitele sahip oldugunu göstermektedir. Ancak, bir üç islevli antikorun hem bir T hücresine hem de bir NK hücresi gibi bir hücreye veya aynüamanda kanser antijenine bagllEbir sekilde makrofaja baglandigiü/e bunun bir sonucu olarak, hücreler üzerinde eksprese edilen reseptörler çapraz baglanmaktadlüve çesitli sitokinlerin ekspresyonu, kanser antijenine bagIiIElbir sekilde indüklenmektedir. Üç islevli bir antikorun sistemik sekilde uygulanmasIlEl, sitokin ekspresyonunun bu sekilde indüklenmesinin bir sonucu olarak sitokin flIllEbsDbenzeri yan etkilere sebep oldugu düsünülmektedir. Asl a, evre I klinik denemesinde, küçük olmayan hücreli akciger kanserine sahip hastalara karumaksomabI sistemin uygulanmasEiçin 5 ug/vücutluk oldukça düsük bir dozun maksimum tolerans dozu oldugu ve daha yüksek bir dozun uygulanmasIIEl, çesitli ciddi yan etkilere sebep oldugu belirtilmistir (Patent Olmayan Doküman 12). Bu sekildeki bir düsük dozda uygulandlglia, katumaksomab asla etkili kan seviyesine erisememektedir. Yani, beklenen anti tümör etkisi, katumaksomab. bu denli düsük bir dozda uygulanmasMa elde edilememektedir. Bu zaman zarfIa, katumaksomabdan farklßekilde, BiTE'nin bir Fcy-reseptörü baglama yeri bulunmamaktadEve dolaylîlîla bu, kanser antijenine bagilEbir sekilde T hücreleri ve NK hücreleri gibi hücreler ve makrofajlar üzerinde eksprese edilen reseptörleri çapraz baglamamaktadE Dolaylêlýla, BiTE'nin, katumaksomab uygulandig'lEtla gözlemlenen kanser antijenine bagIiIElsitokin indüklemesine sebep 0Imad[gl:lgösterilmistir. Ancak, BiTE Fc bölgesine sahip olmayan modifiyeli düsük moleküler ag ama Übir antikor molekülü oldugundan dolayü problem sudur ki bir hastaya uygulanmaletlan sonra bunun kandaki yarlîlömrü, terapötik antikorlar olarak konvansiyonel sekilde kullanllân IgG-türü antikorlardan ciddi oranda daha klgdLEl AsIIa, i'n V/'vo sekilde uygulanan BiTE'nin kandaki yarElömrünün, yaklaslKl birkaç saat oldugu belirtilmistir (Patent Olmayan Dokümanlar 13 ve 14). BlinatumomabI klinik denemelerinde, bu, bir mini pompa kullanilârak kesintisiz intravenöz infüzyon vasitâslýla uygulanmaktadE Bu uygulama yöntemi, hastalar için fazlaca uygunsuz olmalelI yanEtlE, ayrlEb, cihazI arlîb çHZbrmasü/eya benzerinden kaynakIIJJIarak medikal kazalara yönelik bir risk potansiyeli tasIiaktadlB Dolaylglýla, bu tür bir uygulama yönteminin arzu edildigi söylenememektedir. Patent Olmayan Doküman 15, bispesifik antikorlar. gelisiminde, bunlarI verimini ve stabilitesini artübilen anahtar modifikasyonlarüçllîlamaktadE Patent Olmayan Doküman 16, peritoneal karsinomatoza sahip hastalardaki üç islevli antikorlar tarafldan anti tümör immünitesinin indüklenmesini açlKlamaktadlEl Patent Dokümanü, gelistirilmis antikor sabit bölgelerini açllîlamaktadlü Önceki Teknik Dokümanlari] Bulusun Klgla AçlEJamasEl Mevcut bulus, yukarIki durumlardan dolayürsivlenmistir. Mevcut bulusun bir amacühedef kanser hücrelerine yaklEl T hücrelerine sahip olmasEi'e T hücrelerinin sitotoksisite aktivitesini hedef kanser hücrelerine karsElkullanmasElile kanser tedavisini mümkün kIIân polipeptit komplekslerin saglanmasIlEl Mevcut bulusun bir baska amacElse, bir aktif içerik maddesi olarak hücresel sitotoksisitenin indüklenmesi için yukarlElla bahsedilen terapötik maddeyi içeren, çesitli kanserlerin tedavi edilmesi veya önlenmesine yönelik farmasötik bilesimlerin saglanmasIB Mevcut bulus sahipleri, BiTE'nin sahip oldugu güçlü anti tümör aktivitesini tutan ve kanda uzun bir yarlZlömrün yanlleü kanser antijenine bagIilElsitokin fIIsElveya benzerinin indüklenmemesi ile sonuçlanan oldukça iyi güvenlik niteliklerine sahip olan yeni polipeptit kompleksleri kesfetmislerdir. Mevcut bulus sahipleri, ayrEla, polipeptit komplekslerinin antijen baglama alanlarlîikame edildiginde polipeptit komplekslerinin çesitli hedef hücrelere zarar verebildigini bulmuslardlü Yukarlki bulgular temelindei mevcut bulus sahipleri, mevcut bulusun polipeptit komplekslerinin kanser hücrelerine zarar verdigini göstermislerdir. Mevcut bulus sahipleri, ayrEla, daha etkili hücresel sitotoksisitenin, CHl/CL arayüz birlesmesinin regüle edilmesi ve polipeptit komplekslerinin içerisine delik-içi-nob (KiH) modifikasyonlarII verilmesi vasitîlislîla elde edildigini ortaya çilZlarmlglardE Ilaveten, mevcut bulus sahipleri, aktif içerik maddesi olarak mevcut bulusun bir polipeptit kompleksini içeren, hücresel sitotoksisitenin indüklenmesine yönelik terapötik maddelerin kullanliîhaslsîla çesitli kanserlerin tedavi edilebildigini veya önlenebildigini göstermislerdir. Daha belirgin sekilde, mevcut bulus asaglâlakileri saglamaktadE (1) bir kanser antijen baglama alanlîl (2) Fc alanIlîlneydana getiren amino asitlerin mutasyona ugradigIJSEKANS KIMLIK NUMARALARI:23, 24, 25 ve 26'nI Fc alanlar-an herhangi biri, burada Fc alanEl mutantÇlSEKANS KIMLIK NUMARALARI:23, 24, 25 ve 26'dan seçilen aynEizotipin Fc alanIEiçeren kontrol polipeptit komleksine kliasla söz konusu mutasyon vasithslsîla Fcy reseptörü-baglama aktivitesini indirgemistir ve burada Fc alanlZl mutantÇl indirgenmis FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA, ve/veya FcyRIIIB'ye baglanma aktivitesine sahiptir; ve (3)bir CDB-baglama alanÇi burada antijen baglama alanEl/e CD3 baglama alariIiE] her ikisi de tek degerli bir Fab'dir, ve burada (i) antijen baglama alanIlIilneydana getiren bir tek degerli Fab'nin aglEzincirli Fv fragmenti, bir CH1 alanEi/aslfâsMa, Fc alanIEmeydana getiren polipeptitlerden birine baglanmaktadlîi ve Fab'nin hafif zincirli Fv fragmenti ise bir CL alan. baglanmaktadß ve CD3 baglama alanlElüneydana getiren Fab'nin agEzincirli Fv fragmenti bir CH1 alanEIvasitâslîla, Fc alanIlIimeydana getiren bir baska polipeptite baglanmaktadlElve Fab'nin hafif zincirli Fv fragmenti ise bir CL alan- baglanmaktadlü (ii) antijen baglama alanIlIrlneydana getiren bir tek degerli Fab'nin aglElzincirli Fv fragmenti, bir CH1 alanIIi/asltâislýla, Fc alanIElneydana getiren polipeptitlerden birine baglanmaktadE ve Fab'nin hafif zincirli Fv fragmenti ise bir CL alan. baglanmaktadlü ve CD3 baglama alanllîiineydana getiren Fab'nin hafif zincirli Fv fragmenti bir CH1 alanüvaslfâslîla, Fc alanIümeydana getiren bir baska polipeptite baglanmaktadlElve Fab'nin aglElzincirli Fv fragmenti ise bir CL alanlEla baglanmaktadlü (iii) antijen baglama alanlüneydana getiren bir tek degerli Fab'nin aglEizincirli Fv fragmenti, bir CH1 alanD/asiiâslýla, Fc alanIEineydana getiren polipeptitlerden birine baglanmaktadlB Fab'nin hafif zincirli Fv fragmenti ise bir CL alanEla baglanmaktadlü CD3 baglama alanIIZineydana getiren Fab'nin aglEzincirli Fv fragmenti bir CL alanüasißaüa, Fc alan [Elüineydana getiren bir baska polipeptite baglanmaktadE ve Fab'nin hafif zincirli Fv fragmenti ise bir CH1 alan- baglanmaktadiB (iv) CD3 baglama alanIElneydana getiren bir tek degerli Fab'nin aglElzincirli Fv fragmenti, bir CH1 alanEi/asliîiilea, Fc alanIEineydana getiren polipeptitlerden birine baglanmaktadlü Fab'nin bir hafif zincirli Fv fragmenti bir CL alan- baglanmaktadlB antijen baglama alanIÜneydana getiren Fab'nin hafif zincirli Fv fragmenti, bir CH1 alanüvaslûslýla, Fc alanIElmeydana getiren bir baska polipeptite baglanmaktadlü ve Fab'nin aglElzincirli Fv fragmenti ise bir CL alan. baglanmaktadlB (v) CD3 baglama alanIlZhieydana getiren bir tek degerli Fab'nin aglEizincirIi Fv fragmenti, bir CH1 alanEl/asitîiislîla, Fc alanIElneydana getiren polipeptitlerden birine baglanmaktadE Fab'nin hafif zincirli Fv fragmenti bir CL alanlEla baglanmaktadlü antijen baglama alanIlIineydana getiren Fab'nin aglElzincirli Fv fragmenti, bir CL alanülasßslýla, Fc alanlülneydana getiren bir baska polipeptite baglanmaktadß ve Fab'nin hafif zincirli Fv fragmenti ise bir CH1 alan. baglanmaktadlB birini içermektedir: pozisyonlar 118 ila 260'daki (EU numaralandlünastil amino asit sekansÇl SEKANS KIMLIK NUMARASI:24'te açllZlanan sekanstlîl veya pozisyonlar 261 ila 447'deki (EU numaralandlülnasD] amino asit sekansü SEKANS KIMLIK NUMARASI:26'da açllZlanan sekanstlg KIMLIK NUMARASI: 23'teki amino asitlerin bir mutasyonunu içermektedir ve burada Fc alanIElmeydana getiren amino asitler, asaglâlaki pozisyonlardan herhangi birinde bir 330, 331, ve 332 (EU numaralandlElnasD] 330, veya 331'deki EU numaralandlElnasmamino asitin, ilgili IgG2 veya IgG4 içindeki bir ilgili pozisyondaki (EU numaralandHnasmbir amino asit tarafndan bir ikamesini içeren bir Fc alanIEl veya ii) burada Fc alanÇlpozisyon 234, 235, ve/veya 297'deki (EU numaralandlîilnastîl bir amino asit mutasyonunu içermektedir; ve pozisyon 234, 235, ve/veya 297'deki amino asitler alanin ile ikame edilmektedir; iki polipeptitin sekanslarEbirbirinden farklIlEl ve burada pozisyon 349'daki amino asit sistein ile ikame edilmektedir ve pozisyon 366'daki (EU numaralandlûlnasDZlamino asit, Fc alanIÜneydana getiren iki polipeptitten birinin amino asit kallEtllârEiarasIan triptofan ile ikame edilmektedir; ve burada pozisyon 356'daki amino asit sistein ile ikame edilmektedir, pozisyon 366'daki amino asit serin ile ikame edilmektedir, pozisyon 368'deki amino asit alanin ile ikame edilmektedir ve pozisyon 407'deki (EU numaralandlElnasm amino asit ise, bir baska polipeptitin amino asit kalIEtllârElarasIan valin ile ikame edilmektedir; iki polipeptitin sekanslarlîl birbirinden farkIIlEl ve burada pozisyon 356'daki (EU numaralandlünasmamino asit, Fc alanlElüneydana getiren iki polipeptitten birinin amino asit kallEtllârlZJ arasIan Iisin ile ikame edilmektedir; pozisyon 439'daki (EU numaralandlElnasDJamino asit bir baska polipeptitteki glutamik asit ile ikame edilmektedir; ve pozisyon 435'teki (EU numaralandlElnasDîlamino asit, iki polipeptitten birinin amino asit kaIlEtllârljrasIan arjinin ile ikame edilmektedir. iki polipeptitin karboksik terminisinden silinmektedir; içeren, kanserin tedavi edilmesi ve önlenmesinde kullanIia yönelik bir terapötik madde; ve özellikle burada, kanser karaciger kanseri veya akciger kanseridir. Mevcut bulus, BiTE'nin sahip oldugu güçlü anti tümör aktivitesini tutan ve kanda uzun bir yarü ömrün yanlis& kanser antijenine baglilßitokin fEli-süieya benzerinin indüklenmemesi ile sonuçlanan oldukça iyi güvenlik niteliklerine sahip olan yeni polipeptit kompleksleri sunmaktadlEl Mevcut bulusun bir polipeptit kompleksinin antijen baglama alanElikame edildiginde, hücresel sitotoksisitenin indüklenmesine yönelik bir aktif içerik maddesi olarak polipeptit kompleksi içeren terapötik maddeler, kanser hücreleri de dahil olmak üzere çesitli hücreleri hedefleyebilmektedir ve bunlara zarar verebilmektedir. DolayElýla, birçok kanser tedavi edilebilmekte veya önlenebilmektedir. Bu, fazlaca güvenli ve uygun olan, arzu edilen tedavileri mümkün kllîhaktad lElve hastalara yönelik fiziksel yükü de azaltmaktadlEl Sekilleri K& Açllîlamaslîl Sekil 1, GPC3 ERY1 (GPC3 BiTE), GPC3 ERY2, ve bir IgG-tipi anti-GPC3 antikorunun sitotoksik aktivitelerinin karsllâstlîlliiasllîgösteren bir grafiktir. KapaIEkare (i), kapaIEI üçgen (A), ve açllZl kare (in), slîehsüla GPC3 ERY1 (GPC3 BiTE), GPC3 ERY2, IgG-tipi anti- GPC3 antikorunun sitotoksik aktivitelerini temsil etmektedir. Sekil 2, GPC3 BiTE ve GPC3 ERY5'in sitotoksik aktivitelerinin karsllâstlîlmiaslîgösteren bir grafiktir. KapalEkare (I) ve açlKl daire (0), slîehslýla GPC3 BiTE ve GPC3 ERY5'in sitotoksik aktivitelerini temsil etmektedir. Sekil 3, GPC3 BiTE ve GPC3 ERY6'nlEl sitotoksik aktivitelerinin karsllâstlülßiaslöllîgösteren bir grafiktir. KapalD sitotoksik aktivitelerini temsil etmektedir. Sekil 4, GPC3 BiTE ve GPC3 ERY7'nin sitotoksik aktivitelerinin karsllâstElEialelülgösteren bir grafiktir. KapaIEkare (I) ve kapalEéImas (o) sßaslýla GPC3 BiTE ve GPC3 ERY7'nin sitotoksik aktivitelerini temsil etmektedir. aktivitelerinin karsüâstlElBiasIügösteren bir grafiktir. KapalEkare (i), kapaIEl'içgen (A), açllîldaire (o) ve açlEl kare (u) slßslýla GPC3 GPC3 BiTE, GPC3 ERY8-2, GPC3 ERY9-1, ve GPC3 ERY10-1'in sitotoksik aktivitelerini temsil etmektedir. Sekil 6, PC-10 ön karlglEJi modelinde GPC3 ERY8-2'nin in VIVO anti-tümör etkisini gösteren bir grafiktir. AçlEJ kare (o) ve kapalEélmas (o), süsü-da GPC3 ERY7 uygulama gurubu ve kontrol (PBS uygulamasmgrubunun tümör hacmindeki degisimleri göstermektedir. Sekil 7, PC-10 ön karlglEJi modelinde GPC3 ERY10-1'in I'n Viva anti-tümör etkisini gösteren bir grafiktir. Aç[El kare (u) ve kapaIEélmas (o), slßsüa GPC3 ERY10-1 uygulama gurubu ve kontrol (PBS uygulamasmgrubunun tümör hacmindeki degisimleri göstermektedir. Sekil 8, PC-10 T hücresi transfer modelinde GPC3 ERY10-1'in in i/i'i/o anti-tümör etkisini gösteren bir grafiktir. AçlKl kare (m) ve kapalßlmas (o), slBaslîLla GPC3 ERY10-1 uygulama gurubu ve kontrol (PBS uygulamasi] grubunun tümör hacmindeki degisimleri göstermektedir. Sekil 9, GPC3'ü eksprese eden Ba/F3 hücreleri kullanilarak belirlenen, GPC3 ERY9-1 ve GPC3 ERY10-1 plazma konsantrasyonlarII süreçlerini gösteren bir grafiktir. Kapalßlmas (o) ve adli! kare (ci), sBislýla GPC3 ERY9-1 ve GPC3 ERY10-1 için plazma konsantrasyonu sürecini göstermektedir. Sekil 10, CD3'ü eksprese eden Ba/F3 hücreleri kullanilârak belirlenen, GPC3 ERY9-1 ve GPC3 ERY10-1 plazma konsantrasyonlarII süreçlerini gösteren bir grafiktir. Kapallllmas (o) ve aç[Ei kare (ci), leilea GPC3 ERY9-1 ve GPC3 ERY10-1 için plazma konsantrasyonu sürecini göstermektedir. kanser antijeninden bagnsm sekilde sitokinleri Indükleme yetilerine yönelik olarak degerlendirilmesini gösteren bir grafiktir. ERY18Sl'in in vitro sitotoksisitelerini gösteren bir grafiktir. KapalEiliçgen (A), kapalülaire (o), kapalEkare (i), açiKJ kare (m) ve açik] elmas (o), süsüia, GPC3 ERY18 L1, GPC3 temsil etmektedir. gösteren bir grafiktir. Kapalmaire (I) ve açlKl kare (i:i), slîasMa GPC3 ERY18 L3 ve GPC3 ERY10-1'in sitotoksik aktivitelerini temsil etmektedir. Sekil 14, GPC3 ERY19-3 ve GPC3 BiTE'nin in vitro sitotoksisitelerinin karsilâstlîllîhasllîl gösteren bir grafiktir. AçilZl kare (u) ve kapalljkare (i), süslýla, GPC3 ERY19-3 ve GPC3 BiTE'nin sitotoksik aktivitelerini temsil etmektedir. Sekil 15A, NTA1L/NTA1R/GC33-k0'I eksprese edildigi CM'nin boyut dlSlamaIIZI kromatografi analizinin sonuçlarIEl göstren bir kromatograde Sekil 15B, NTA2L/NTA2R/GC33-k0'I eksprese edildigi CM'nin boyut dlSIamalEikromatografi analizinin sonuçlarülügöstren bir kromatogramdiû Sekil 16, buradaki Örneklerde açliZlanan yandaki polipeptit komplekslerini meydana getiren alanlarEtemsil eden diyagramlarlîgöstermektedir: GPC3 BiTE, GPC3 ERY2, GPC3 ERY15, GPC3 ERY18, ve GPC3 ERY19-3. Çapraz çizgili hatlarI oldugu alan, anti-kanser antijeni (GPC3, EpCAM, EGFR) antikorunun H zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; diyagonal hatlarI oldugu alan, anti-kanser antijen (GPC3, EpCAM, EGFR) antikorunun L zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; noktaIElhatlarI oldugu alan, anti-CD3 antikorunun H zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; kapalElalan, anti-CD3 antikorunun L zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; açik] alan, antikor sabit bölgesini temsil etmektedir; çarpübir sessiz Fc mutasyonunu temsil etmektedir; ve yIE ise heteromerik Fc birlesmesini tesvik eden bir mutasyonu temsil etmektedir. ERY15 (J); GPC3 ERY18 (K); ve GPC3 ERY'nin diyagramlarlügiöstermektedir. Sekil 18, IgG1, IgG2, IgG3, ve IgG4'ün Fc alanlarIEImeydana getiren amino asit kaIlEtllârIElve bunlarI Kabat EU numaralandlülnasIEl(burada, ayrlEla "EU INDEKSI" olarak adland lülîhaktadlî) göstermektedir. Sekil 19, buradaki Örneklerde açllZIanan yandaki polipeptit komplekslerini meydana getiren alanlarEtemsiI eden diyagramlarlîgöstermektedir. GPC3 ERY17-2, GPC3 ERY17-3, EpCAM ERY17-2, ve EpCAM ERY17-3. Çapraz çizgili hatlarI oldugu alan, anti-kanser antijeni (GPC3, EpCAM, EGFR) antikorunun H zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; diyagonal hatlarI oldugu alan, anti-kanser antijen (GPC3, EpCAM, EGFR) antikorunun L zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; noktalElhatlarI oldugu alan, anti-CD3 antikorunun H zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; kapalüalan, anti-CD3 antikorunun L zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; açûg alan, antikor sabit bölgesini temsil etmektedir; çarpübir sessiz Fc mutasyonunu temsil etmektedir; ve yIE ise heteromerik Fc birlesmesini tesvik eden bir mutasyonu temsil etmektedir. aktivitelerinin karsliâstlîlllüiasllîgösteren bir grafiktir. KapaIEkare (i), kapaIEüçgen (A), GPC3 ERY10-1'in sitotoksik aktivitelerini temsil etmektedir. Sekil 21, PC-10 T hücresi transfer modelinde GPC3 ERY17-2'nin /n w'i/o anti-tümör etkisini gösteren bir grafiktir. AçlKl kare (i:i) ve kapallîlmas (o), süslîla GPC3 ERY17-2 uygulama gurubu ve kontrol (PBS uygulamasDîl grubunun tümör hacmindeki degisimleri göstermektedir. karsilâstlîllfhaslgösteren bir grafiktir. Kapallîiliçgen (A) ve açilg daire (0) sßslýla GPC3 ERY17-2 ve GPC3 ERY17-2-M20'nin sitotoksik aktivitelerini temsil etmektedir. Sekil 23, EpCAM ERY17-2 ve EpCAM ERY17-3'nin sitotoksik aktivitelerinin karsHâstlEllBiasIElgösteren bir grafiktir. Kapalüüçgen (A) ve açiE kare (m) sßsEla EpCAM ERY17-2 ve EpCAM ERY17-3'ün sitotoksik aktivitelerini temsil etmektedir. Sekil 24, buradaki Örneklerde açllZIanan yandaki polipeptit komplekslerini meydana getiren alanlarEltemsiI eden diyagramlarEIgöstermektedir: GM1, GM2, ve GMO. "A", CHl/CL arayüz birlesmesinin regüle edildigi ve Delik-içi-Nob (KiH) modifikasyonlarII verildigi bir polipeptit kompleksini göstermektedir. "B" ise, CH1/CL arayüz birlesmesinin veya KiH modifikasyonlarII verilmesinin gerçeklesmedigi bir polipeptit kompleksini göstermektedir. Çapraz çizgili hatlarI oldugu alan, anti-kanser antijeni (GPC3 veya EpCAM) antikorunun H zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; diyagonal hatlarI oldugu alan, anti-kanser antijen (GPC3 veya EpCAM) antikorunun L zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; n0ktalü1atlarI oldugu alan, anti-CD3 antikorunun H zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; kapalülan, anti-CD3 antikorunun L zinciri degisken bölgesini temsil etmektedir; açiEl alan, antikor sabit bölgesini temsil etmektedir; çarpübir sessiz Fc mutasyonunu temsil etmektedir; yIlîJ heteromerik Fc birlesmesini tesvik eden bir mutasyonu temsil etmektedir; ve halka seklindeki sembol ise CHl/CL arayüz interaksiyonunu regüle eden bir mutasyonu temsil etmektedir. Sekil 25, GM1, GM2, ve GMO'I sitotoksik aktivitelerinin karsllâstlîllüiasllîgösteren bir grafiktir. KapaIEiliçgen (A), aç[El kare (m) ve açllZJ daire (0) slüslîla GM1, GM2, ve GMO'I sitotoksik aktivitelerini temsil etmektedir. Sekil 26, EGFR ERY17-2'nin sitotoksik aktivitesini gösteren bir grafiktir. Kapallîüçgen (A) EGFR ERY17-2'nin sitotoksik aktivitesini temsil etmektedir. Bulusun Uvqulanmasühin Mod Asaglöhki tannlar, mevcut bulusun anlasmaslüla yardIi edilmesi için saglanmaktadiB Antikor Burada, "antikor", dogal bir immünoglobulin veya kismi veya bütün bir sentez vasltöslîla üretilen bir immünoglobuline isaret etmektedir. Antikorlar, dogal olarak meydana gelen plazma veya serum gibi dogal kaynakalrdan veya antikor üreten hibridomlarI kültür süpernatantlarldan izole edilebilmektedir. Alternatif olarak, antikorlar, genetik rekombinasyon gibi tekniklerin kullanilîhaslîla kismen veya tamamen sentezlenebilmektedir. Tercih edilen antikorlar, örnegin, immünoglobulin izotiginin veya buna ait bir alt sI- antikorlarIEltapsamaktadE Bilinen insan immünoglobulinleri, yandaki dokuz S.- (izotipler) antikorlarIleapsamaktadlE IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, ve IgM. Bu izotipler araleL'lan, mevcut bulusun antikorlarÇiIgGl, IgG2, IgG3, ve IgG4'ü kapsamaktadlü Arzu edilen baglama aktivitesine sahip bir antikorun üretilmesine yönelik yöntemler, teknikte uzman kisiler tarafian bilinmektedir. Asagi, GPI'ye tutulan reseptör ailesine ait olan, GPC3'e baglanan bir antikorun (anti-GPC3 antikoru) üretilmesine yönelik bir yöntemi antijene baglanan antikorlar da asagi açlKIanan örnege göre üretilebilmektedir. Anti-GPC3 antikorlar, bilinen yöntemlerin kullanllBiaslîLIa poliklonal veya monoklonal antikorlar olarak elde edilebilmektedir. Tercihen üretilen anti-GPC3 antikorlarÇlmemeIilerden elde edilen monoklonal antikorlardlEl Memelilerden elde edilen bu tür antikorlar, genetik mühendisligi teknikleri vasltâslýla, bir antikor geni taslîlan bir ekspresyon vektörü ile dönüstürülen hibdiromlar veya konak hücreler tarafükjan üretilen antikorlarütapsamaktadlü Monoklonal antikor üreten hibridomlar, örnegin asagi açlElandiglEüzere bilinen tekniklerin kullanllîhaslýla üretilebilmektedir. Spesifik olarak, memeliler, duyarlllâstlElna proteini olarak bir GPC3 proteininin kullanI[g]l:lk0nvansiyonel immünizasyon yöntemleri ile immünize edilmektedir. Elde edilen immün hücreler, konvansiyonel hücre füzyon yöntemleri vaslßslýla, bilinen parental hücreler ile füzyonlanmaktadlEI Ardian, bir anti-GPC3 antikorunu üreten hibridomlar, konvansiyonel tarama yöntemleri kullanllârak monoklonal antikor üretim hücreleri için taranarak seçilebilmektedir. Spesifik olarak, monoklonal antikorlar, asagi bahsedildigi üzere halelanmaktadlB Ilk olarak, NM_ nükleotit sekanslîaçilîlanan GPC3 geni, antikor preparasyonu için bir duyarlllâstlÜna sntijeni NUMARASI:2) gösterilen bir GPC3 geninin üretilmesi için eksprese edilebilmektedir. Yani, GPC3'ü kodlayan bir gen sekansÇIbilinen bir ekspresyon vektörünün içerisine eklenmektedir ve uygun konak hücreleri ise bu vektör ile dönüstürülmektedir. Arzu edilen insan GPC3 proteini, bilinen yöntemler vasltâslýla konak hücrelerden veya bunlari kültür süpernatantlarldan saflastlEllÜiaktadE Örnegin, kültür süpernatantlarldan çözünebilir GPC3'ün hazülanmaslîlamaclîla, GPC3'ün hücre zarlîüzerinde tutulmasüçin kullanllân GPI- tutma sekans- karslglîl gelen hidrofonik bölgeyi meydana getiren pozisyonlar 564 ila 580'deki amino asitler, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2'deki GPC3 polipeptit sekansIan silinmektedir ve ardiiian, elde edilen prorein ise SEKANS KIMLIK NUMARASI:2'deki GPC3 proteini yerine eksprese edilmektedir. Alternatif olarak, bir duyarlllâstüna antijeni olarak bir saflastlüßîgdogal GPC3 proteininin kullanllBwasljlnümkündür. Saflastlîllân GPC3 proteini, memelilerin immünizasyonu için bir duyarlllâstlElna antijeni olarak kullanllâbilmektedir. Bir kElnEl GPC3 peptiti de bir duyarlllâstlîilna antijeni olarak kullanllâbilmektedir. Bu durumda, insan GPC3'ün amino asit sekanlela dayalEkimyasal sentez vaslßslýla veya bir kismi GPC3 geninin ekspresyon için bir ekspresyon vektörünün içerisine eklenmesi vaslßislîla bir kismi peptit hazlEIlanabilmektedir. Alternatif olarak, bir kisim peptit, bir GPC3 proteininin bir proteaz ile indirgenmesi vaslüsMa meydana getirilebilmektedir. Klîlni GPC3 peptitinin uzunlugu ve bölgesi, belirli yapilândlElnalar ile sIlEllEdegildir. Tercih edilen bir bölge, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2'deki amino asit sekansIaki amino asit pozisyonlarE564 ila 580'de bulunan amino asit sekansIan rastgele seçilebilmektedir. Bir duyarlllâstlüna antijeni olarak kullanüâcak olan bir peptiti meydana getiren amino asitlerin sayEJtercihen en az bes veya daha fazla, altü/eya daha fazla veya yedi veya daha fazladlEI Daha belirgin sekilde, 8 ila 50 kallEtllârIlE, daha tercihen 10 ila 30 kallEtlErIlEl bir peptiti, bir duyarlllâstlîilna antijeni olarak kullanllâbilmektedir. DuyarlllâstlElna antijeni için, alternatif olarak, arzu edilen bir kismi polipeptitin veya GPC3 proteininin peptitinin farklEbir polipeptit ile füzyonlanmasEl/aslßsüla hazlEllanan bir füzyon proteininin kullanllÜiasEtnümkündür. Örnegin, antikor Fc fragmentleri ve peptit etiketleri, tercihen, duyarlllâstlElna antijenleri olarak kullanllâcak olan füzyon proteinlerinin üretilmesi için kullanilIhaktadlEl Bu tür füzyon proteinlerinin ekspresyonuna yönelik vektörler, arzu edilen iki veya daha fazla polipeptit fragmentini kodlayan çerçeve genlerinin içerisinde füzyonlama ve füzyon geninin yukari açlElandLglEilizere bir ekspresyon vektörünün içerisine eklenmesi vasltâslîla meydana getirilebilmektedir. Füzyon proteinlerinin üretilmesine yönelik yöntemler, Molecular Cloning 2'inci basklIQSambrook, J ve meslektaslarlÇlMolecular Cloning 2. duyarlilâstlülna antijeni olarak kullanilâcak olan GPC3'ün hazlîlianmasl yönelik yöntemler ve Duyarliiâstüna antijeni ile immünize edilecek olan memelilere dair belirli bir sIlEiiandlIiina mevcut degildir. Ancak, memelilerin, hücre füzyonu için kullanüâcak olan ana hücreler ile uyumu göz önüne aI-rak seçilmesi tercih edilmektedir. Genel olarak, fareler, slglanlar ve hamsterlar, fareler gibi kemirgenler ve maymunlar tercihen kullanilEiaktadlEl Yukarlöhki hayvanlar, bilinen yöntemlerle bir duyarlHâstlBlna antijeni ile immünize edilmektedir. Genel olarak gerçeklestirilen immünizasyon yöntemleri, örnegin, bir duyarlilâstiîiina antijeninin memelilere intraperitoneal veya subkütanöz enjeksiyonunu kapsamaktadlEl Spesifik olarak, bir duyarlilâstlEina antijeni, PBS (Fosfat-Tamponlu Salin), fizyolojik salin veya benzeri ile uygun bir sekilde seyreltilmektedir. Arzu edilmesi halinde, Freund'un bütün adjuvantEgibi bir konvansiyonel adjuvant, antijen ile karßtiîllüiaktadlîlve karlglüi emülsiyon haline getirilmektedir. ArdiEUan, duyarlilâstlülna antijeni, 4 ila 21 günlük arallElarIa birkaç kez bir memeliye uygulanmaktadlE] Uygun taslîlößr, duyarlilâstlîiina antijeni ile immünizasyonda kullaniiâbilmektedir. Özellikle, düsük moleküler aglElIilZlElbir kismi peptitin duyarlilâstlElna antijeni olarak kullanilüiaslîldurumunda, kimi zaman, immünizasyon için duyarlliâstlîiina antijeninin albümin veya anahtar deligi Iimpet hemosiyanin gibi bir taslsîIEZI proteine baglanmasßrzu edilmektedir. Alternatif olarak, arzu edilen bir antikoru üreten hibridomlar, asagi bahsedildigi üzere DNA immünizasyonu kullanilârak hazlîiianabilmektedir. DNA immünizasyonu, hayvandaki bir antijen proteini kodlama geninin ekspresyonunun mümkün klIJEtnasEiçin meydana getirilen bir vektör DNA'nI uygulanmasi. bir sonucu olarak immünize edilen bir hayvanda, bir duyarlilâstlEina antikeninin eksprese edilmesi vasißslýla immünostimülsyonu saglayan bir immünizasyon yöntemidir. Bir protein antijeninin immünize edilecek olan hayvanlara uygulandigilîkonvansiyonel immünizasyon yöntemlerine kElasla, DNA immünizasyonunun su bakIidan daha üstün olmaslîlbeklenmektedir: - GPC3 gibi bir zar proteininin yaplgiîtlutulurken immünostimülsayonun saglanabilmektedir; - immünizasyon Için antijenin saflastlEIllIhas- gerek yoktur. DNA immünizasyonu kullanlßrak mevcut bulusun bir monoklonal antikorunun hazlfllanmaslîl için, ilk olarak, GPC3 proteinini eksprese eden bir DNA immünize edilecek olan bir hayvana uygulanmaktadlB GPC3'ü kodlayan DNA, PCR gibi bilinen yöntemlerle sentezlenebilmektedir. Elde edilen DNA, uygun bir ekspresyon vektörünün içerisine eklenmektedir ve ardIan, bu, immünize edilecek olan bir hayvana uygulanmaktadlü Tercihen, kullanIn ekspresyon vektörleri, örnegin pcDNA3.1 gibi piyasada mevcut ekspresyon vektörlerini kapsamaktadlü Vektörler, konvansiyonel yöntemlerin kullanilmasMa bir organizmaya uygulanabilmektedir. Örnegin, DNA immünizasyonu, immünize edilecek olan bir hayvani vücuduna, ekspresyon vektörü ile kaplElaltI partiküllerinin uygulanmaslZliçin bir gen silahII kullanllüiaslîla doküman a açlEJanan yöntemleri vasltâslwa üretilebilmektedir. Bir memelinin yukar- açlKlanan sekilde immünize edilmesinden sonra, bir GPC3 baglama antikorunun titresindeki bir art& serum içerisinde dogrulanmaktadlE ArdlEUan, immün hücreleri memeliden aIlEmaktadIElve ard Idan hücre füzyonuna tabi kllülnaktadß Özellikle, splenositler immün hücreleri olarak kullanllîhaktadlEI Bir memeli myelomu, yukarlEIh bahsedilen immünosit ile füzyonlanacak olan bir hücre olarak kullanliîhaktadlü Myelom hücresi, tercihen, tarama için uygun bir seçim isaretçisi içermektedir. Bir seçim isaretçisi, spesifik bir kültür kosulu aItIa hücrelere, bunlarI hayatta kaIIiE(veya ölümü) için özellikler saglamaktadlü Hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaz eksikligi (buradan itibaren HGPRT eksikligi olarak klîlaltllBiaktadIE) ve timidin kinazlîleksikligi (buradan itibaren TK eksikligi olarak kEialtllüiaktadlE) seçim isaretçileri olarak bilinmektedir. HGPRT veya TK eksikligi olan hücreler, hipoksantim-aminopretin-timidin duyarlmîgllüb (buradan itibaren HAT duyarIUJEüblarak adlandßllüiaktadlî) sahiptir. HAT'ye duyarlEliücreIer, bir HAT seçim ortamEliçerisinde DNA'yElsentezIeyememektedir ve dolaylêlýla ölmektedir. Ancak, hücrelerin normal hücreler ile füzyonlanmasEtlurumunda, bunlar, normal hücrelerin salvaj yolaklarIElkullanarak DNA sentezine devam edememektedir ve dolaylîlîla bunlar, HAT seçim ortam a bile yetisebilmektedir. HGPRT'si eksik ve TK'si eksik hücreler, leislSLla 6-tiyoguanin, 8-azaguanin (buradan itibaren 8AG olarak klglaltllöîaktadur), veya 5'-brom0de0ksiüridin içeren bir ortam içerisinde seçilebilmektedir. Normal hücreler öldürülmektedir, zira bu pirimidin analoglarlEJEIkendi DNA'IarlEb katmaktadE Bu zaman zarflEUa, bu enzimler bak"an eksikligi olan hücreler seçim ortamIa hayatta kalabilmektedir, zira bunlar, bu pirimidin analoglarIEkendilerine katamamaktadE Ilaveten, neomisine dirençli gen tarafIan saglanan G418 direnci olarak adlandlEiilân bir seçim isaretçisi, 2-deoksistreptamin antibiyotiklerine (gentamisin analoglarDîl direnç saglamaktadlü Hücre infüzyonu için uygun olan çesitli myelom türleri bilinmektedir. Örnegin, asagidhki hücreleri içeren myelom hücreleri tercihen kullanüâbilmektedir: Immünositler ve myelom hücreleri arasIaki hücre füzyonlarüesasen, bilinen yöntemlerin, örnegin Kohler ve Milstein ve meslektaslarEi (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) referanletlaki yöntemin kullanilüiaslsîla gerçeklestirilmektedir. Daha belirgin sekilde, hücre füzyonu, örnegin, bir hüzre füzyonu destekleme maddesinin var oldugu bir konvansiyonel kültür ortamlEda gerçeklestirilebilmektedir. Füzyon destekleme maddeleri, örnegin polietilen glikol (PEG) ve Sendai virüsünü (HVJ) kapsamaktadlE Gerekmesi durumunda, dimetil sülfoksit gibi bir yarnd Ünadde de füzyon veriminin artiEllB1aslZl için ilave edilebilmektedir. Immünositlerin myelom hücrelerine orani: kisinin kendi takdirince belirlenebilmekte olup, örnegin her bir ila on imünosit bas. bir myelom hücresi seklinde olabilmektedir. Hücre füzyonlarElçin kullanüâcak olan kültür ortamlarlÇlörnegin, RPM11640 oramEi/e MEM ortamEl gibi myelom hücre hatlarII yetistirilmesi için uygun ortamlarEi/e bu tür hücre kültüründe kullanilân diger konvansiyonel kültür ortamlarIEkapsamaktadlîl Ilaveten, fetal sigilîiserumu (FCS) gibi serum takviyeleri, kültür ortamlEb tercihen ilave edilebilmektedir. Hücre füzyonu için, yukarlîliaki immün hücreleri ve myelom hücrelerinin önceden belirlenen miktarlarlÇlyukar-ki kültür ortamunda iyice karigtlElIBmktadlEi ArdIan, yaklaslEJ 37°C'ye önceden @filan bir PEG çözeltisi (örnegin ortalama moleküler agiEIiiiZl yaklas[iîi 1,000 ila 6,000'dlE), genellikle aglHiiiZJ/hacim cinsinden %30 ila %60 arasEibir konsantrasyonda buraya ilave edilmektedir. Arzu edilen füzyon hücrelerinin (hibridomlar) üretilmesi için bu hafifçe karlgtiEilßiaktadE ArdiEtlan, yukariöh bahsedilen uygun bir kültür ortamüücrelere asamaIEi sekilde ilave edilmektedir ve bu, süpernatantI giderilmesi için tekrar tekrar santrifüjlenmektedir. Dolaylgiîcla, hücre füzyon maddeleri ve hibridom yetistirilmesi bakliian istenmeyen diger maddeler giderilebilmektedir. Bu sekilde elde edilen hibridomlar, konsansiyonel bir seçici ortam, örnegin HAT ortami] (hipoksantin, aminopterin ve timidin Içeren bir kültür ortamlIl kullanilârak kültürleme vasiüislýla seçilebilmektedir. Arzu edilen hibridomlardan farklljblan hücreler (füzyonlanmamlgi hücreler), yeterli bir süre boyunca yukr-ki HAT ortamEiçerisinde devam eden kültürleme vasitîhsüia öldürülebilmektedir. Tipik olarak süre birkaç gün ila birkaç hafta arasIadlE ArdIan, arzu edilen antikoru üreten hibridomlar taranmaktadlEi ve konvansiyonel sIIEIiand EEIEeyreltme yöntemleri vasiüsiýla tek tek klonlanmaktadE Bu sekilde elde edilen hibridomlar, hücre füzyonu iin kullanliân myelomun sahip oldugu seçim isaretçisine dayanarak bir seçim ortam Ekullanllârak seçilebilmektedir. Örnegin, HGPRT- veya TK'si eksik hücreler, HAT ortamIZI(hipoksantin, aminopterin ve timidin Içeren bir ortam) kullanilârak kültürleme vasiüslýia seçilebilmektedir. Spesifik olarak, HAT'ye duyarlünyelom hücreleri hücre füzyonu için kullanIigiIa, normal hücreler ile basaril]]]bir sekilde füzyonlanan hücreler, HAT ortamiükja seçici bir sekilde çogaltHâbilmektedir. Arzu edilen hibridomlardan farkIEIoIan hücreler (füzyonlanmamlîl hücreler), yeterli bir süre boyunca yukr-ki HAT ortamüiçerisinde devam eden kültürleme vasißsiýia öldürülebilmektedir. Spesifik olarak, arzu edilen hibridomlar, genellikle birkaç gün ila birkaç hafta boyunca kültürleme vasifâsiýla seçilebilmektedir. Ardüdan, arzu edilen antikoru üreten hibridomlar taranmaktadlîi ve konvansiyonel sIiEliandlEiEEiseyreltme yöntemleri vasßslýia tek tek klonlanmaktadiü Arzu edilen antikorlar, tercihen, bilinen antijen/antikor reaksiyonuna dayanan tarama yöntemleri vasiüsiýla seçilebilmektedir ve tek tek klonlanabilmektedir. Örnegin, bir GPC3 baglama monoklonal antikoru, hücre yüzeyinde eksprese edilen GPC3'e baglanabilmektedir. Bu tür bir monoklonal antikor, aklgla aktive edilen hücre ölçümü (FACS) vasitâsiîila taranabilmektedir. FACS, lazer Elülükullanilârak bir floresan antikoru ile temas ettirilen hücrelerin analiz edilmesi ve bireysel hücreler tarafiEUan yayllân floresan. ölçülmesi vasiEisEia, bir antikorun bir hücre yüzeyine baglanmasllîdlegerlendiren bir sistemdir. FACS vasltâslýia, mevcut bulusun bir monoklonal antikorunu üreten hibridomlar. taranmaslZI için, ilk olarak GPC3 eksprese eden hücreler hazlElanmaktadlEl Tercihen tarama için kullanilân hücreler, GPC3'ün zorla eksprese edildigi memeli hücreleridir. Kontrol olarak, bir antikorun hücre yüzeyi GPC3'üne baglanma aktivitesi, konak hücreler olarak dönüstürülmemis memeli hücrelerinin kullanilîhaslsîla seçici bir sekilde tespit edilebilmektedir. Spesifik olarak, bir anti- GPC3 monoklonal aktivite üreten hibridomlar, konak hücrelerden ziyade GPC3'ü eksprese etmeye zorlanan hücrelere baglanan bir antikoru üreten hibridomlariEl seçikmesi vasßsüla izole edilebilmektedir. Alternatif olarak, bir antikorun, immobilize edilmis, GPC3 eksprese eden hücrelere baglanma aktivitesi, ELISA ilkesine dayanarak ifade edilebilmektedir. Örnegin, GPC3 eksprese eden hücreler, bir ELISA plakasII çukurcuklar- immobilize edilebilmektedir. HibridomlarI kültür süpernatantlarÇiçukurcuklarl içerisindeki immobilize edilmis hücreler ile temas ettirilmektedir ve immobilize edilmis hücrelere baglanan antikorlar tespit edilmektedir. Monoklonal antikorlar. fareden elde edilmesi durumunda, hücrelere baglanan antikorlar, bir anti-fare immünoglobulin antikorunun kullanilüiaslýla tespit edilebilmektedir. Antijen baglama yetisine sahip, arzu edilen bir antikoru üreten hibridomlar yukari tarama vasitâslýla seçilmektedir ve bir sIIEllandIEiEIEeyreltme yöntemi veya benzeri vasiüslîla klonlanabilmektedir. Bu sekilde hazlEIlanan, monoklonal antikor üreten hibridomlar, konvansiyonel bir kültür ortamIEUan geçirilebilmektedir ve uzun bir süre boyunca SMZI nitrojen içerisinde saklanabilmektedir. Yukarlki hibridomlar bir konvansiyonel yöntem vasitâislîla kültürlenmektedir ve arzu edilen monoklonal antikorlar ise kültür süpernatantlarEUan hazIEllanabilmektedir. Alternatif olarak, hibridomlar uygun memelilere uygulanmaktadlElve bunlarda büyütülmektedir ve monoklonal antikorlar asitlerden haziElianmaktadiEi Önceki yöntem, yüksek safliEtaki antikorlarlEi haziîlanmasüçin uygundur. YukarIki hibridomlar gibi antikor üreten hücrelerden klonlanan antikor genleri tarafIan kodlanan antikorlar da tercihen kullanilâbilmektedir. Klonlanmlg bir antikor geni uygun bir vektörün içerisine eklenmektedir ve bu, gen tarafIan kodlanan antikorun eksprese edilmesi için bir konak içerisine verilmektedir. AntikorlarI izole edilmesi, genlerin vektörlerin içerisine eklenmesi ve konak hücrelerin dönüstürülmesine yönelik yöntemler halihazüla örnegin kanlflbnmßtü Rekombinant antikorlarI üretilmesine yönelik yöntemler ayrlEla asag- açlEIand[gl3ekiIde bilinmektedir. Örnegin, bir anti-GPC3 antikorunun bir degisken bölgesini (V bölgesi) kodlayan bir cDNA, anti-GPC3 antikorunu eksprese eden hibridom hücrelerinden hazlîllanmaktadlrîl Bu amaçla, toplam RNA ilk olarak hibridomlardan özütlenmektedir. Hücrelerden mRNA'larI özütlenmesine yönelik yöntemler örnegin asag-kileri içermektedir: Özütlenen mRNA'lar, mRNA Saflastlîilna Kiti (GE Healthcare Bioscience) veya benzeri kullanllârak saflastlEllâbilmektedir. Alternatif olarak, toplam mRNA'nI dogrudan hücrelerden özütlenmesine yönelik kitler, örnegin QuickPrep mRNA SaflastlElna Kiti (GE Healthcare Bioscience) de piyasada mevcuttur. Bu tür kitler kullanllârak mRNA'lar hibridomlardan hazlîllanabilmektedir. Antikor V bölgesini kodlayan cDNA'lar, bir revers transkriptaz kullanllârak mRNA'lardan sentezlenebilmektedir. AMV Revers Transkriptaz Birinci-Zincirli cDNA Sentez Kiti (Seikagaku C0.) veya benzeri kullanilârak cDNA'Iar sentezlenebilmektedir. DahasÇl SMART RACE cDNA amplifikasyon kiti (Clontech) ve PCR bazlEB'-RACE yöntemi (Proc. Natl. cDNA'larI sentezlenmesi ve yükseltilmesi için kullanHâbilmektedir. Bu tür bir cDNA sentez prosesinde, asaglElh açllZIanan uygun restriksiyon enzimi yerleri, bir cDNA'nI her iki ucuna verilebilmektedir. Ilgili cDNA fragmenti, elde edilen PCR ürününden saflastElIBiaktadlEl ve ardlEUan, bu bir vektör DNA'ya Iigatlanmaktadß Bir rekombinant vektör bu sekilde meydana getirilmektedir ve Eco/i' veya benzerine verilebilmektedir. Koloni seçiminden sonra, ilgili rekombinant vektörü, koloni olusturan E. co//den hazlülanabilmektedir. ArdIan, rekombinant vektörün ilgili cDNA nükleotit sekans. sahip olup olmadgü dideoksi nükleotit zinciri terminasyon yöntemi gibi bilinen bir yöntem vasltâslîla test edilmektedir. Degisken bölge geninin yükseltilmesi için primerleri kullanan 5'-RACE yöntemi, degisken bölgeyi kodlayan genin izole edilmesi için uygun bir sekilde kullanllßîaktadü Ilk olarak, bir 5'- RACE cDNA kütüphanesi, bir kalLöl olarak hibridom hücrelerinden özütlenen RNA'IarI kullanllîhaslîzla cDNA sentezi valeisEla meydana getirilmektedir. SMART RACE cDNA amplifikasyon kiti gibi piyasada mevcut olan bir kit, 5'-RACE cDNA kütüphanesinin sentezlenmesi için uygun bir sekilde kullanHBiaktadlEl Antikor geni, bir kal& olarak 5'-RACE cDNA kütüphanesinin kullanllîhaslýla PCR vaslßaslýla yükseltilmektedir. Fare antikor geninin yükseltilmesine yönelik primerler, bilinen antikor geni sekanslarlEla dayanarak tasarlanabilmektedir. Primerlerin nükleotit sekanslarÇl immünoglobulin ait 5.- baglEblarak degisebilmektedir. DolaylgMa, alt SIEJEÜEL Iso Strip fare monoklonal antikor izotipleme kiti (Roche Diagnostics) gibi piyasada mecvut bir kitin kullanllfhaslýla önceden belirlenmektedir. -Spesifik olarak, örnegin, y1, y2a, y2b, ve y3 aglüzincirleri ve K ve A hafif Zincirlerini kodlayan genlerin yükseltilmesini mümkün kllân primerler, fare IgG kodlama genlerinin izole edilmesi için kullanlIIhaktadlEI Genel olarak, degisken bölgeye yakI olan bir sabit bölge yerine tavlanan bir primer, bir IgG degisken bölge geninin yükseltilmesi için 3'taraflîprimeri olarak kullanllîhaktadß Bu zaman zarfIa, bir 5' RACE cDNA kütüphane yap_ tutturulan bir primer, bir 5'taraflîil›rimeri olarak kullanllîhaktadlü Bu sekilde yükseltilen PCR ürünleri, aglElve hafif zincirlerin bir kombinasyonundan olusan immünoglobulinlerin yeniden sekillendirilmesi için kullanllüiaktadlîl Arzu edilen bir antikor, bir belirteç olarak, yeniden sekillendirilen bir immünoglobulinin GPC3 baglama aktivitesinin kullanIIIhasIQa seçilebilmektedir. Örnegin, amaç GPC3'e karsEbir antikorun izole edilmesi oldugunda, antikorun GPC3'e baglanmasi. spesifik olmasEtercih edilmektedir. Bir GPC3 baglama antikoru, asag .ki adlar vaslüslýla taranabilmektedir: (1) bir GPC3 eksprese eden hücrenin, bir hibridomdan izole edilen bir cDNA tarafEldan kodlanan V bölgesini içeren bir antikor ile temas ettirilmesi; (2) antikorun GPC3 eksprese eden hücreye baglanlglEI tespit edilmesi; ve (3) GPC3 eksprese eden hücreye baglanan bir antikorun seçilmesi. Bir antikorun, GPC3 eksprese eden hücrelere baglanlglElI tespit eidlmesine yönelik yöntemler bilinmektedir. Spesifik olarak, bir antikorun GPC3 eksprese eden hücrelere baglanlglIJFACS gibi, yukari açllZlanan teknikler vaslfâslýla tespit edilebilmektedir. GPC3 eksprese eden hücrelerin immobilize edilmis numuneleri, bir antikorun baglama aktivitesinin degerlendirilmesi Için uygun sekilde kullanlIB1aktadlEl Baglama aktivitesinin bir belirteç olarak kullanI[gll,__ltercih edilen antikor tarama yöntemleri, ayrlEia, faj vektörlerinin kullanliglükaydlîilna yöntemlerini de kapsamaktadlE Faj vektörlerinin kullanIlglEllarama yöntemleri, antikor genlerinin, bir poliklonal antikoru eksprese eden hücre popülasyonundaki aglEl zincirli ve hafif zincirli alt sI[Ü kütüphanelerinden izole edilmesi duruunda avantajlßlmaktadß AgIElzincirIi ve hafif zincirli degisken bölgeleri kodlayan genler, bir tek zincirli Fv'nin (scFv) meydana getirilmesi için uygun bir baglayIEEisekansEi/asßslîla baglanabilmektedir. Yüzeylerinde scFv sergileyen fajlar, scFv kodlayan bir genin bir faj vektörü içerisinde eklenmesi vasllîlaslýla üretilebilmektedir. Fajlar, ilgili bir antijene temas ettirilmektedir. Ardian, ilgili baglama aktivitesine sahip olan, scFv kodlayan bir DNA, antijene baglanan fajlarI toplanmaslýla izole edilebilmektedir. Bu proses, ilgili baglama aktivitesine sahip scFv'nin zenginlestirilmesi için gerekli oldugunda tekrarlanabilmektedir. Ilgili anti-GPC3 antikorunun V bölgesini kodlayan cDNA'nIEl izolasyonundan sonra, cDNA'nI her iki ucuna verilen restriksiyon bölgelerini tanlýbn restriksiyon enzimleri ile cDNA sindirilmektedir. Tercih edilen restriksiyon enzimleri, düsük bir frekansta antikorun nükleotit sekansIa meydana gelen bir nükleotit sekansIIiEltanakta ve bölmektedir. Dahasü yaplgkan bir ucu üreten bir enzime yönelik bir restriksiyon yeri, tercihen, tek kopyalEbir sindirilmis fragmentin dogru yönelimde eklenmesi için bir vektörün içerisine verilmektedir. Anti-GPC3 antikorunun V bölgesini kodlayan cDNA yukar- açilZlandiglü sekilde sindirilmektedir ve bu, bir antikor ekspresyon vektörünün meydana getirilmesi için uygun bit ekspresyon vektörünün içerisine eklenmektedir. Bu durumda, antikor sabit bölgesini (C bölgesi) kodlayan bir genin ve yukariEIhki V bölgesini kodlayan bir genin çerçeve içerisinde füzyonlanmaslîdurumunda, bir kimerik antikor elde edilmektedir. Burada, "kimerik antikor", sabit bölgenin kaynagII degisken bölgenin kaynag Idan farkllîcblmasüinlamlüb gelmektedir. Dolaylîlýla, fare/insan heterokimerik antikorlar- ilaveten, insan/insan allokimerik antikorlarü mevcut bulusun kimerik antikorlarlEla dahil edilmektedir. Bir kimerik antikor ekspresyon vektörü, yukarlki V bölgesinin, halihazElia sabit bölgeye sahip olan bir ekspresyon vektörünün içerisine eklenmesi vasifâsMa meydana getirilebilmektedir. Spesifik olarak, örnegin, yukarülaki V bölgesi genini eksize eden bir restriksiyon enzimine yönelik bir tanIiasekansÇlarzu edilen bir antikor sabit bölgesini (C bölgesi) kodlayan bir DNA'yEliaslýlan bir ekspresyon vektörünün 5' tarafIa uygun bir sekilde konumlandlEllâbilmektedir. Bir kimerik antikor ekspresyon vektörü, aynErestriksiyon enzimi kombinasyonu ile sindirilen iki genin çerçeve içerisinde füzyonlanmasülaslßsüla meydana getirilmektedir. Bir anti-GPC3 monoklonal antikorun meydana getirilmesi amaclýla, antikor genleri bir ekspresyon vektörü içerisine eklenmektedir, böylelikle genler, bir ekspresyon düzenleyici bölgenin kontrolü altlEUa eksprese edilmektedir. Antikor ekspresyonuna yönelik ekspresyon düzenleyici bölge, örnegin artlEEllârÜ/e baslatlalârllapsamaktadlü Dahasüuygun bir sinyal sekansllmino terminusa tutturulabilmektedir, böylelikle eksprese edilen antikor, hücrelerin dEIEla salgllânabilmektedir. Yukarlîlb açllZlanan Örnekler'de, MGWSCIILFLVATATGVHS (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 72) amino asit sekanleb sahip bir peptit bir sinyal sekansü olarak kullanIIBiaktadIE Bu zaman zarfIa, uygun olan diger sinyal sekanslarü da tutturulabilmektedir. Eksprese edilen polipeptit, yukarIki sekansI karboksil terminusunda bölünmektedir ve elde edilen polipeptit ise bir olgun polipeptit olarak hücrelerin dElEla salgllânmaktadß ArdIan, uygun konak hücreleri ekspresyon vektörü ile dönüstürülmektedir ve anti-GPC3 antikoru kodlayan DNA'yEl eksprese eden rekombinant hücreler elde edilmektedir. Antikor agEzincirini (H zinciri) ve hafif zincirini (L zinciri) kodlayan DNA'Iar, antikor geninin eksprese edilmesi için farkllîdekspresyon vektörlerine eklenmektedir. H ve L zincirlerine sahip bir antikor molekülü, aynEkonak hücrenin, içerisine H zinciri ve L zinciri genlerinin süslsîla eklendigi vektörler ile birlikte transfekte edilebilmektedir. Alternatif olarak, konak hücreleri, içerisine H ve L Zincirlerini kodlayan DNA'IarI eklendigi bir tek ekspresyon vektörü ile dönüstürülebilmektedir (bakIlîlWO 94/11523). Izole edilmis antikor genlerinin uygun konaklara verilmesi vasEislSLla antikor preparasyonuna yönelik bilinen çesitli konak hücre/ekspresyon vektörü kombinasyonlarlîlmevcuttur. Bu ekspresyon sistemlerinin hepsi, mevcut bulusun antijen baglama alanlarlEllEl ve CD3 baglama alanlarlEllEl izolasyonu için uygulanabilmektedir. Uygun ökaryotik hücreler, hayvan hücreleri, bitki hücreleri ve fungal hücreler de dahil olmak üzere konak hücreler olarak kullanlEhaktadE Spesifik olarak, hayvan hücreleri örnegin asaglêlhki hücreleri kapsamaktadE (1) memeli hücreleri: CHO, COS, myelom, yavru hamster böbregi (BHK), HeLa, Vero, veya benzeri; (2) amfibi hücreler: Ksenopus oositleri veya benzeri; ve (3) böcek hücreleri: sf9, sf21, Tn5, veya benzeri. Ilaveten, bir bitki hücresi olarak, Meat/'ana tabacum gibi bir Meat/'ana genusundan elde edilen hücrelerin kullan-[glElbir antikor geni ekspresyon sistemi bilinmektedir. Kallus kültürlü hücreler, bitki hücrelerinin dönüstürülmesi için uygun sekilde kullanüâbilmektedir. DahasÇlasag-ki hücreler fungal hücreleri olarak kullan ilâbilmektedir: mayala r: Saccharomyces cerev/si'ae gibi Saccharomyces cinsi ve P/Chia pastori's gibi P/ch/a ipliksi fu ngi: Asperg/l/us Niger gibi Asperg/I/us cinsi. DahasÇI prokaryotik hücrelerden faydalanan antikor geni ekspresyon sistemleri de bilinmektedir. Örnegin, bakteriye hücreler kullanIlgiia, E. ca/i' hücreleri, Bad/us subti//s hücreleri ve benzerinden, mevcut bulusta uygun sekilde faydalanüâbilmektedir. Ilgili antikor genlerini taslýhn ekspresyon vektörleri, transfeksiyon vaslßalýla bu hücrelere verilmektedir. Transfekte edilen hücreler in vitro sekilde kültürlenmektedir ve arzu edilen antikor, dönüstürülen hücrelerin kültürü ile hazlEllanabilmektedir. Yukarlilh açilZJanan konak hücrelerine ilaveten, bir rekombinant antikorun üretilmesi için transgenik hayvanlar da kullanilâbilmektedir. Yani, antikor, ilgili antikoru kodlayan genin verildigi bir hayvandan elde edilebilmektedir. Örnegin, antikor geni, özellikle süt içerisinde üretilen bir proteini kodlayan bir gen içerisine çerçeve içi sekilde eklenmesi vasiüslýla bir füzyon geni olarak meydana getirilebilmektedir. Keçi ß-kazein veya benzeri, örnegin, süt içerisinde salgilânan protein olarak kullanllâbilmektedir. Antikor geni ile birlikte eklenen füzyonlanmlg geni içeren DNA fragmentleri, bir keçi embriyosuna enjekte edilmektedir ve ardlEUan u embriyo, bir disi keçiye verilmektedir. Arzu edilen antikorlar, ambriyonun verildigi keçiden (veya bunun silsilesi) dogan transgenik keçi araciIJgilîla üretilen sütten alin süt proteini ile füzyonlananan bir protein olarak elde edilebilmektedir. Ilaveten, transgenik keçi aracUJgllýla üretilen, arzu edilen antikoru içeren sütün hacminin artlElIIhasEiçin, hormonlar gerekli sekilde transgenik keçiye verilebilmektedir (Ebert, K. M. ve meslektaslarlÇl Burada açlElanan bir polipeptit kompleksinin bir insana uygulanmaslîcllurumunda, insana karsEI heterolog antijenisitenin indirgenmesi için yapay olarak modifiye edilmis olan genetik olarak rekombinant bir antikordan elde edilen bir antijen baglama alan ükompleksin antijen baglama alanEblarak uygun bir sekilde kullanllâbilmektedir. Genetik olarak rekombinant olan bu tür antikorlar, örnegin insansllâstlîllßîEantikorlarükapsamaktadlü Bu modifiye edilmis antikorlar, bilinen yöntemler ile uygun sekilde üretilmektedir. Burada açllZlanan bir polipeptit kompleksinin antijen baglama alanII üretilmesi için kullanilân bir antijen degisken bölgesi, genellikle, dört çatElböIgesi (FR'Ier) vasftâslsîla ayrllân tamamlaylEJJJglEbelirleyen üç bölge (CDR'Ier) vasltâslîla meydana getirilmektedir. CDR, bir antikorun baglama spesifitesini büyük oranda belirleyen bir bölgedir. CDR'Ierin amino asit sekanslarüfazlaca çesitlidir. Diger yandan, FR'yi meydana getiren amino asit sekanslarÇl sllZJHZlar, farklEbaglama spesifitelerine sahip antikorlar arasIa bile yüksek bir özdeslige sahiptir. DolaylgEa, genel olarak, belirli bir antikorun baglama spesifitesi, CDR aslßma vasiEislýla bir baska antikora verilebilmektedir. InsansllâstlEllBrE bir antikor, ayrlEla, yeniden sekillendirilmis bir Insan antikoru olarak adlandlElllEhaktadlEl Spesifik olarak, bir fare antikoru gibi insan olmayan bir hayvan antikorunun CDR'sinin bir insan antikoru ve benzerine asüânmasüvasüslîla hazlîllanan insansllâstlElBrlSlantikorlar bilinmektedir. Insansllâstlîlüglantikorlarl elde edilmesine yönelik yayg genetik teknikler de bilinmektedir. Spesifik olarak, örnegin, kesisme uzantEElPCR'sinin, bir fare antikoru CDR'sinin bir insan FR'sine allglanmaslüb yönelik bir yöntem olarak bilinmektedir. Kesisme uzantlîElPCR'sinde, asüânacak olan bir fare antikoru CDR'sini kodlayan bir nükleotit sekansl:l bir insan antikoru FR'sinin sentezlenmesi için primerlere ilave edilmektedir. Primerler, dört FR'den her biri için hazlEllainmaktadlEl Bir fare CDR'sinin bir insan FR'sine asllânmasljlurumunda, bir fare FR'sine yüksek derecede özdes olan bir insan FR'sinin seçilmesinin, genellikle, CDR islevinin korunmasEiçin avantajlßldugu düsünülmektedir. YanÇl genellikle, asüânacak olan fare CDR'sine bitisik olan FR'nin amino asit sekans- yüksek derecede özdes olan bir amino asit sekansIlIIçeren bir insan FR'sinin kullanllüiaslîtercih edilmektedir. Ligatlanacak olan nükleotit sekansllârübirbirlerine çerçeve içerisinde baglanacaklarESekilde tasarlanmaktadlîl Insan FR'Ieri, ilgili primerlerin kullanllüraslýla bireysel olarak sentezlenmektedir. Sonuç olarak, insan CDR'sini kodlayan DNA'nlEl, bireysel FR'yi kodlayan DNA'Iara tutturuldugu Ürünler elde edilmektedir. Her bir ürünün fare CDR'sini koslayan nükleotit sekanslarü bunlar. birbiriyle kesisecegi sekilde tasarlanmaktadß ArdIan, tamamlaylîßarman sentezi reaksiyonu, kallßl olarak bir insan antikoru geninin kullanüîhasüla sentezlenen ürünlerin kesisen CDR bölgelerinin tavlanmasEiçin gerçeklestirilmektedir. Insan FR'leri, bu reaksiyon yoluyla fare CDR'si vaslüsüa IigatlanmaktadlE Üç CDR'nin ve dört FR'nin nihai olarak Iigatland[g]l,`_ltam uzunluktaki V bölgesi geni, uygun restriksiyon enzimi tanIia sekanslarEliIe birlikte ilave edilen, bunun 5' veya 3' ucunda tavlanan primerlerin kullanllîhaslýla yükseltilmektedir. Insanlastßlöîg antikora yönelik bir ekspresyon vektörü, yukarlElla açlElandlglEsekilde elde edilen DNA'nI ve bir insan antikoru C bölgesini kodlayan bir DNA'nI bir ekspresyon vektörüne eklenmesi vasltâlea üretilebilmektedir, böylelikle bunlar çerçeve içerisinde Iigatlanacaktß Rekombinant hücrelerin meydana getirikmesi için rekombinant vektörün bir konaga transfekte edilmesinden sonra, rekombinant hücreler kültürlenmektedir ve insansllâstlîllüilgantikoru kodlayan DNA, hücre kültürü içerisinde insansUâstlElBuglantikorun üretilmesi için eksprese edilmektedir (bakIlZl EP Yukar- açlklanan sekilde üretilen insansllâstlüllüilgantikorun antijen baglama aktivitesinin niteliksel ve niceliksel olarak ölçülmesi ve degerlendirilmesi vasßslýla, CDR'Ier vaslßslýla ligatlandlgllEUa faydalElbir antijen baglama yerinin olusturulmasIElmümkün kllân insan antikoru FR'Ieri uygun bir sekilde seçilebilmektedir. FR'IerIn içerisindeki amino asit kallEtllârEl gerekli oldugunda ikame edilebilmektedir, böylelikle yeniden sekillendirilmis bir insan antikorunun CDR'leri, uygun bir antijen baglama yeri olusturmaktadE Örnegin, amino asit sekansÜnutasyonlarü bir fare CDR'dinin bir insan FR'sine asüânmasl için kullanllân PCR yönteminin uygulanmaslsîla FR'Iere verilebilmektedir. Daha spesifik olarak, klîini nükleotit sekanslZlmutasyonIarD FR'Iere tavlanan primerlere verilebilmektedir. Nükleotit sekansIZI mutasyonlarÇl bu tür primerlerin kullanllîhasüla sentezlenen FR'lere verilebilmektedir. Arzu edilen özelliklere sahip mutant FR sekanslarüyukarldh açllîlanan yöntem vaslßslýla antijene baglanmalela yönelik olarak amino asit ikameli mutant antikorunun aktivitesinin ölçülmesi ve degerlendirilmesiyle seçilebilmektedir (Sato, K. ve meslektaslarlZlCancer Res. (1993) 53: 851- 856). Alternatif olarak, arzu edilen insan antikorlarÇlDNA Immünizasyonu vaslßslîla, insan antikoru numaralüiatent dokümanlarDZlimmünize edilmesi ile elde edilebilmektedir. DahasÇl Insan antikoru kütüphanelerinin kullanlßiaslýda kaydüna vasltâslýla insan antikorlarII hazlElanamas- yönelik teknikler de bilinmektedir. Örnegin, bir insan antikorunun V bölgesi, faz görüntüleme yöntemi vaslüslîla faz yüzeyi üzerinde bir tek Zincirli antikor (scFv) olarak eksprese edilmektedir. Antijene baglanan bir scFv'yi eksprese eden fajlar seçilebilmektedir. Insan antikoru V bölgesini kodlayan DNA sekansÇlseçilen fajlarI genlerinin analiz edilmesi vasiüslýla belirlenebilmektedir. Antijene baglanan scFv'nin DNA sekansEbeIirlenmektedir. Arzu edilen bir insan antikorunun C bölgesi sekansElle birlikte V bölgesi sekanlellEl çerçeve içerisinde füzyonlanmasÜ/e bunun, uygun bi ekspresyon vektörü içerisine eklenmesi vasßslýla bir ekspresyon vektörü hazlEIlanabiImektedir. Ekspresyon vektörü, yukariEIla açiKIananlar gibi, ekspresyon için uygun olan hücrelere verilebilmektedir. Insan antikoru, insan antikorunu kodlayan genin hücrelerin içerisine eksprese edilmesiyle Antjen baglama alanEI Burada "antijen baglama alanE] bir antijenin tamami veya bir kElnlEla sapesîfik olarak baglanan veya bunun tamamlaylEEElolan bir bölge Içeren bir antikor kElnlEla Isaret etmektedir. Bir antijenin moleküler aglîll[g]II büyük olmasüdurumunda, bir antikor, aantijenin yalnlîta belirli bir klîin. baglanabilmektedir. Bu belirli k-i "epitop" olarak adlandlElllIhaktadlE Bir antijen baglama alanübir veya daha fazla antikor degisken alanIan elde edilebilmektedir. Tercihen, antijen baglama alanlarÇlhem antikor hafif zincirli degisken bölgesini (VL) hem de antikor ag lElzincirIi degisken bölgesini (VH) içermektedir. Tercih edilen bu tür antijen baglama alanlarÇlörnegin "tek zincirli Fv (scFv)", "tek zincirli antikor" "Fv", "tek zincirli Fv2 (scFv2)", "Fab" ve "F (ab')2"yi kapsamaktadlü Mevcut bulusun polipeptit komplekslerinina ntijen baglama alanlarlZI aynü epitopa baglanabilmektedir. Epitop, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2 veya 4'teki amino asit sekansIlZI içeren bir protein içerisinde bulunabilmektedir. Alternatif olarak, mevcut bulusun polipeptitinin antijen baglama alanlarÇIfarkIEbpitoplara bireysel olarak baglanabilmektedir. Epitop, SEKANS KIMLIK NUMARASI:2 veya 4'teki amino asit sekansIlZlçeren bir protein içerisinde bulunabilmektedir. Spesifite molekülün, partnerler dlSlEUaki moleküllere ciddi bir baglanma sergilememesi anlam. gelmektedir. Dahasü"spesiûk" ifadesi ayrlîla, bir antijen baglama alanIlEl, bir antijen içerisinde bulunan birçok epitopun belirli bir epitopuna spesink olmasiîldurumunda kullanllüiaktadlü Bir antijen baglama alanEtarafIan baglanan bir epitopun birçok farkli] antijen içerisinde bulunmasEldurumunda, antijen baglama alanIEIiçeren bir polipeptit kompleksi, epitopa sahip birçok antijene baglanabilmektedir. Antijen Burada, antijen üzerinde belirli bir klgt] bulunmamaktadlîl ve CD3 dSIEUaki herhangi bir antijenin kullanllüwasljnümkündür. Bu tür antijenler, örnegin reseptörler, kanser antijenleri, MHC antijenleri ve farklilâsma antijenlerini kapsamaktadB Reseptörler, örnegin, hematopoietik büyüme faktörü reseptörü ailesi, sitokin reseptörü ailesi, tirozin kinazlIl reseptörü ailesi, serin/treonin kinazüeseptörü ailesi, TNF reseptörü ailesi, G proteini ile birlestirilen reseptör ailesi, GPI tarafIan tutulan reseptör ailesi, tirozin fosfataz reseptörü ailesi, yaplgma faktörü ailesi ve hormon reseptörü ailesine ait olanlarEkapsamaktadIE Bu reseptör ailelerine ait olan reseptörler ve bunlar. özellikleri, çesitli dokümanlarda, örnegin Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehensive Biochemistry Vol. 18B SAIBO KOGAKU (Cell Technology) Supplementary Volume Handbook Series "Secchaku Inshi Handbook (Handbook for Adhesion factors)" M. Miyasaka Ed. (1994) Shujunsha, Tokyo, Spesifik olarak, yukariEllaki reseptör ailelerine ait olan reseptörler, tercihen, örnegin insan ve insan ve fare granülosit klonisini stimüle eden faktör (G-CSF) reseptörleri (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (, insan ve fare reseptörleri (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (-d ve -[3 reseptörleri, insan ve fare büyüme hormonu (GH) reseptörleri, insan ve fare interlökin (IL)- reseptörleri, insan ve fare insulin-benzeri büyüme faktörü (IGF)-I reseptörleri, insan ve fare lösemisi inhibitör faktörü (LIF) reseptörleri ve Insan ve fare siliyer nörotrofik faktör (CNTF) reseptörlerini kapsamaktadlîl Kanser antijenleri, hücreler kötü huylu olmaya basladlElsa eksprese edilen antijenlerdir ve ayrlEla "tümör spesifik antijenler" olarak da adlandlEllB1aktadlB DahasÇlhücreler kanserli hale geldiginde hücre yüzeyi veya protein molekülleri üzerinde eksprese edilen anormal seker zincirleri de kanser antijenleridir ve "kanser ile iliskili karbohidrat antijeni" olarak sialil SSEA-l'i (SLX) kapsamaktadlEl GPC3, yukari bajsedilen GPI tarafIan tutulan reseptör ailesine aittir ve karaciger kanseri de daihl olmak üzere çesitli kanser türlerinde eksprese edilmektedir. EpCAM akciger kanseri de dahil olmak üzere çesitli kanser türlerinde eksprese edilmektedir ve bunun polinükleotit ve polipeptit sekansllârÇlsülea, NM_002354.2 erisim numaraIE(SEKANS KIMLIK NUMARASI:3) ve NP_002345.2 erisim numarall:[SEKANS KIMLIK NUMARASI:4) RefSeq'te açlKlanmaktadlE Genel olarak, MHC antijenleri, MHC sIlEl I ve sIilîi II antijenleri olarak kategorize edilmektedir. MHC sIEElI antijenleri HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, ve -H'yi kapsarken, MHC sIlElII antijenleri HLA-DR, -DQ, ve -DP'yi kapsamaktadlü CD122, CD126, ve CDw130'u kapsamaktadE açlEIanan bir polipeptit kompleksinin antijen baglama alanII baglandlgilîbir antijen yerine Isaret etmektedir. Dolaylâlsîla, örnegin, epitop, bunun yap_ göre tanIilanabilmektedir. Alternatif olarak, epitop, epitopu tanlýan bir polipeptit kompleksinin antijen baglama aktivitesine göre tanIilanabilmektedir. Antijenin bir peptit veya polipeptit olmasülurumunda, epitop, epitopu meydana getiren amino asit kallîitüârlîltarafian belirlenebilmektedir. Alternatif olarak, epitopun bir seker zinciri olmasEdurumunda, epitop, kendi spesifik seker zinciri yapEEtlarafIan belirlenebilmektedir. Bir lineer epitop, birincil amino asit sekansII tanIEtllglElbir epitop içeren bir epitoptur. Tipik olarak bu tür bir lineer epitop, spesifik sekansIia, en az üç ve en yayglEl sekilde en az bes, örnegin yaklasilZlS ila 10 veya 6 ila 20 amino asit içermektedir. Lineer epitopun aksine, "uyusumsal epitop", epitopu içeren birincil amino asit sekansIE, tan-n epitopun tek belirleyicisi olmadlglEbir epitoptur (örnegin, bir uyusumsal epitopun birincil amino asit sekanslÇI bir epitop belirleyici antikor tarafIan tanlErnasEl gerekmemektedir). Uyusumsal epitoplar, lineer epitoplara göre daha fazla amino asit say- sahip olabilmektedir. Bir uyusumsal epitopu tanülan antikor, bir peptit veya proteinin üç boyutlu yap-!Ellanaktadlîl Örnegin, bir protein molekülünün katlanmasüle üç boyutlu bir yapElolusturmasEldurumunda, bir uyusumsal epitogu olusturan amino asitler ve/veya polipeptit ana zincirleri hizaIEhale gelmektedir ve epitop, antikor tarafian tanIlEl hale getirilmektedir. Epitop uyusumlarII belirlenmesine yönelik yöntemler, örnegin X @HIZI kristalografisi, iki boyutlu nükleer manyetik rezonans, yere özgü spin isaretleme ve elektron paramanyetik rezonansIEkapsamaktadiîl ancak bunlarla sIlEllEldegildir. Bakliîl örnegin, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Cilt 66, Morris (ed.) referansü Bir GPC3 antijen baglama alanEliçeren bir test polipeptit kompleksi tarafIan epitop baglanmasi. degerlendirilmesine yönelik bir yöntemi örnekleri asaglâia açlEIanmaktadE Asaglâlaki örneklere göre, GPC3'ten baika bir antijen için bir antijen baglama alanljlçeren bir test polipeptit kompleksi tarafIan epitop baplanmasII degerlendirilmesine yönelik yöntemler de uygun bir sekilde gerçeklestirilebilmektedir. Örnegin, bir GPC3 antijen baglama alan. sahip bir test polipeptit kompleksinin GPC3 molekülündeki bir lineer epitopu tanlîlîii tanIiadlglü örnegin asag- bahsedildigi sekilde dogrulanabilmektedir. GPC3'ün hücre dlglllanllîblusturan bir amino asit sekansEiçeren bir lineer peptit, yukaridaki amaç dogrultusunda sentezlenmektedir. Peptit kimyasal olarak sentezlenebilmektedir veya bir GPC3 cDNA'sIaki hücre dlgüalana karsiElEl gelen amino asit sekansIlZi kodlayan bir bölgenin kullanigEl genetik mühendisligi teknikleri ile elde edilebilmektedir. ArdIan, bir GPC3 antijen baglama alanEliçeren bir test polipeptit kompleksi, hücre dlgElalanEblusturan amino asit sekansIIZlçeren bir lineer peptite yönelik baglama aktivitesi bakIilEUan degerlendirilmektedir. Örnegin, immobilize edilmis bir lineer peptit, peptine yönelik olarak polipeptit kompleksinin baglama aktivitesinin degerlendirilmesi için ELISA vaslßslýla bir antijen olarak kullanllâbilmektedir. Alternatif olarak, bir lineer peptite yönelik baglama aktivitesi, lineer peptitin, GPC3 eksprese eden hücrelere polipeptit kompleksinin baglanmalelEilnhibe etme seviyesine bagIEsekiIde degerlendirilebilmektedir. Bu testler, polipeptit kompleksinin lineer peptite yönelik baglama aktivitesini göstermektedir. Bir GPC3 antijen baglama alanEla sahip bir test polipeptit kompleksinin bir uyusumsal epitopu tanlýlü tanIiad[g]Elasag-ki gibi degerlendiriIebilmektedir. GPC3 eksprese eden hücreler, yukar-ki amaç için hazIEiianmaktadE Bir GPC3 antijen baglama alanIZIiçeren bir test polipeptit kompleksi, bir uyusumsal epitopun temas üzerine GPC3 eksprese eden hücrelere güçlü sekilde baglanmasüancak GPC3'ün hücre dmlanllîilusturan bir amino asit sekansEI içeren, immobilize edilmis bir lineer polipeptite büyük oranda baglanmamasülurumunda, bu uyusumsal epitopun tanlEmasüçin belirlenebilmektedir. Burada "büyük oranda baglanmama" ifadesi, insan GPC3 eksprese eden hücrelere yönelik baglama aktivitesine klýlasla, baglama aktivitesinin %80 veya daha az, genel olarak %50 veya daha az, tercihen %30 veya daha az ve özellikle tercihen %15 veya daha az oldugu anlam. gelmektedir. GPC3 eksprese eden hücrelere yönelik olak bir GPC3 antijen baglama alan. sahip bir test polipeptit kompleksinin baglama aktivitesinin denenmesine yönelik yöntemler, örnegin, Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory degerlendirme, antijen olarak GPC3 eksprese eden hücrelerin kullanIigiEELISA veya floresan aktiveli hücre ölçümünün (FACS) ilkelerine dayanarak gerçeklestirilebilmektedir. ELISA formatIia, GPC3 eksprese eden hücrelere yönelik olarak bir GPC3 antijen baglama alanüçeren bir test polipeptit kompleksinin baglama aktivitesi, enzimatik reaksiyon tarafIan üretilen sinyal seviyelerinin karsilâstlîllüiaslýla niceliksel olarak degerlendirilebilmektedir. Spesifik olarak, bir test polipeptit kompleksi, üzerinde GPC3 eksprese eden hücrelerin immobilize ediligi bir ELISA plakas. ilave edilmektedir. ArdIan, hücreye baglanan test polipeptit kompleksi, test polipeptit kompleksini tanülan bir enzim isaretli antikor kullanilârak tespit edilmektedir. Alternatif olarak, FACS kullanllüiaslîldurumunda, bir test polipeptit kompleksinin bir seyrelti serisi haziEIbnmaktadlEl ve GPC3 eksprese eden hücrelere yönelik antikor baglama titresi, GPC3 eksprese eden hücrelere yönelik olarak test polipeptit kompleksinin baglama aktivitesinin karsHâstIEllBwaslîÇIn belirlenebilmektedir. Tampon veya benzeri içerisinde asklýla alin hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen bir antijene bir test polipeptit kompleksinin baglanmasübir aklgl sitometresi kullanilârak tespit edilebilmektedir. Bilinen aklgsitometreleri, örnegin asag-ki cihazlarERapsamaktadB FACSCantoTM II FACSAriaT'V' FACSArrayTM FACSArrayTM FACSCaIiburTM (tümü BD Biosciences' ticari markalarIlE) EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (tümü Beckman Coulter'in ticari markalarIlE) Bir antijene yönelik olraak bir GPC3 antijen baglama alanIEla sahip bir test polipeptit kompleksinin baglama aktivitesinin denenmesine yönelik tercih edilen yöntemler, örnegin, asag-ki yöntemi kapsamaktadE Ilk olarak, GPC3 eksprese eden hücreler bir test polipeptit kompleksi ile reaksiyona aIlErnaktadlEve ardlrîban, polipeptit kompleksini tanlýlan bir FITC- isaretli ikincil antikor ile bu Iekelenmektedir. Test polipeptit kompleksi, kompleksin arzu edilen bir konsantrasyonda hazlEllanmasEliçin uygun bir tampon ile seyreltilmektedir. Örnegin, kompleks, 10 pg/ml ila 10 ng/ml araligllüldaki bir konsantrasyonda kullanllâbilmektedir. ArdlEUan, floresan yogunlugu ve hücre sayEÇIFACSCaIibur (BD) kullanilarak belirlenmektedir. CELL QUEST Software (BD), yani Geometrik Ortalama deger kullanilârak analiz gerçeklestirilmesi vasßslsîla elde edilen floresan yogunlugu, hücrelere baglanan antikorun miktarIEh/ansünaktadß Yani, test polipeptit kompleks bagII miktartharafIan temsil edilen bir test polipeptit kompleksinin baglama aktivitesi, Geometrik Ortalama degerinin ölçülmesiyle belirlenebilmekedir. Bir GPC3 antijen baglama alan. sahip bir test polipeptit kompleksinin bir baska polipeptit kompleksi ile ortak bir epitopu paylaslîil paylasmadlgiü aynElepitopa yönelik iki kompleks araleUaki yarlgla dayanarak degerlendirilebilmektedir. Polipeptit kompleksleri arasIaki yarlgl çapraz bloklama denemesi veya benzeri ile belirlenebilmektedir. Örnegin, kompetitif ELISA denemesi, tercih edilen bir çapraz bloklama denemesidir. Spesifik olarak, çapraz bloklama denemesinde, bir mikrotitre plakalasiEliEi çukurcuklar- immobilize edilen GPC3 proteini, bir aday kompetitif polipeptit kompleksinin varl[ghda veya yoklugunda önceden inkübe edilmektedir ve ardIan bir test polipeptit kompleksi buraya Ilave edilmektedir. Çukurcuklardaki GPC3 proteininine baglanan test polipeptit kompleksinin miktarü aynDepitopa baglanma için yarlglan bir aday rekabetçi polipeptit kompleksinin baglama yetisi ile dolaylEloIarak iliskilidir. Yani, aynElepitop için rekabetçi polipeptit kompleksinin afinitesi arttiKça, GPC3 proteini ile kaplanmlgçukurcuklara yönelik olarak test polipeptit kompleksinin baglama aktivitesi azalmaktadlü GPC3 proteini vasitâsiýla çukurcuklara baglanan test polipeptit kompleksinin miktarÇi polipeptit kompleksinin önceden isaretlenmesi ile kolayca belirlenebilmektedir. Örnegin, bir biyotin ile isaretlenmis polipeptit kompleksi, bir avidin/peroksidaz konjugatu ve uygun substratI kullanilüiasüla ölçülmektedir. Özellikle, peroksidaz gibi enzim isaretlerini kullanan çarpaz blokalma denemesi, "kompetitif ELISA denemesi" olarak adlandIEilmaktadE Polipeptit kompleksi aynüamanda, tespiti ve ölçümü mümkün kilân diger isaretleme maddeleri ile de isaretlenebilmektedir. Spesifik olarak, radyoaktif isaretler, floresan isaretleri ve benzeri bilinmektedir. Rekabetçi polipeptit kompleksinin yoklugunda gerçeklestirilen bir kontrol deneyindeki baglama aktivitesine kübsla, aday rekabetçi polipeptit kompleksinin, bir GPC3 antijen baglama alanIEilçeren bir test polipeptit kompleksinin baglanmasllln az %20, tercihen en az %20 ila 50 arasIa bIokIamasEldurumunda, test polipeptit kompleksinin, rekabetçi polipeptit kompleksi tarafIdan baglanan epitopa büyük oranda bagland[gil]eya aynülzpitopa baglanmak için yarlSHgiEIbelirlenmektedir. Bir GPC3 antijen baglama alanEiçeren bir test polipeptit kompleksi tarafIan balanan bir epitopun yap-I halihazEla tanIilanmlgi olmasEldurumunda, test ve kontrol polipeptit komplekslerinin ortak bir epitopu paylaslül paylasmamasüamino asit mutasyonlarII epitopu olusturan peptite verilmesi vasitâsüa haziîiianan bir peptite yönelik olarak iki polipeptit kompleksinin baglanmaslîikvititelerinin karsilâstlElIIhaslýia belirlenebilmektedir. Yukarldiaki baglama aktivitelerinin ölçülmesi için, örnegin, bir mutasyoun verildigi bir lineer peptite yönelik olarak test ve kontrol polipeptit komplekslerinin baglanma aktiviteleri, yukarlki ELISA format-a kiýlaslanmaktadiîi ELISA yöntemlerinin dlgiüha, bir kolona baglanan mutant peptite yönelik baglama aktivitesi, test ve kontrol polipeptit komplekslerinin kolon içerisine akllilihaslîlve ardlEUan, elüsyon çözeltisi içerisinde ayrlStlEllân polipeptit kompleksinin nicellestirilmesi vaslûislýla belirlenebilmektedir. Bir mutant peptitinin, örnegin bir GST füzyon peptiti formunda bir kolona adsorbe edilmesine yönelik yöntemler bilinmektedir. Alternatif olarak, tanIilanan epitopun bir uyusumsal epitop olmasEldurumunda, test ve kontrol polipeptit komlekslerinin ortak bir epitopu paylaslöl paylasmadllîlarü asaglki yöntemle belirlenebilmektedir. Ilk olarak, GPC3 eksprese eden hücreler ve epitop içerisine verilen bir mutasyon ile GPC3 eksprese eden hücreler hazEllanmaktadE Test ve kontrol polipeptit kompleksleri, bu hücrelerin PBS gibi uygun bir tampon içerisinde ask. tutulmaslj vasißslýla hazlîllanan bir hücre süspansiyonuna ilave edilmektedir. ArdIan, hücre süspansiyonlarlî.] bir tampon ile uygun sekilde yllZbnmaktadlE ve test ve kontrol polipeptit komplekslerini tanlýlan bir FITC Isaretli antikor buraya ilave edilmektedir. Floresan yogunlugu ve isaretli antikor ila Iekelenen hücre saylgîlFACSCalibur (BD) kullanllflak belirlenmektedir. Test ve kontrol polipeptit kompleksleri, uygun bir tampon kullanllârak uygun sekilde seyreltilmektedir ve arzu edilen konsantrasyonlarda kullanüßîaktadlü Örnegin, bunlar, 10 ug/ml ila 10 ng/ml aralgßdaki bir konsantrasyonda kullanilâbilmektedir. CELL QUEST Software (BD), yani Geometrik Ortalama deger kullanüârak analiz gerçeklestirilmesi vasltâslsîla elde edilen floresan yogunlugu, hücrelere baglanan isaretli antikorun miktarlElü yansltîlnaktadß Yani, isaretli antikor baglanmasEltaraflEhan temsil edilen test ve kontrol polipeptit komplekslerinin baglama aktiviteleri, Geometrik Ortalama degerin ölçülmesiyle belirlenebilmekedir. Yukarlâlaki yöntemde, bir polipeptit kompleksinin "mutant GPC3 eksprese eden hücrelere büyük oranda" baglanlöl baglanmadlgilîbrnegin asaglElhki yöntemle belirlenebilmektedir. Ilk olarak, mutant GPC3 eksprese eden hücrelere baglanan test ve kontrol polipeptit kompleksleri bir isaretli antikor ile Iekelenmektedir. ArdIan, hücrelerin floresan yogunlugu belirlenmektedir. Aklgl sitometresi vaslüslîla FACSCaIibur floresan. tespit edilmesi için kullan.[glIa, belirlenen floresan yogunlugu, CELL QUEST Software kullanüârak analiz edilebilmektedir. Polipeptit kompleksinin varllgiüve yoklugundaki Geometrik Ortalama degerlerden, polipeptit kompleksi tarafIdan baglanmanI bir sonucu olarak floresan yogunlugundaki artlSIEI oranII belirlenmesi için asagüiaki formüle göre karsllâstüina degeri (AGeo-Ort) hesaplanabilmektedir. AGeo-Ort = Geo-Ort (polipeptit kompleksinin varllgiia)/Ge0-Ort (polipeptit kompleksinin yoklugunda) Mutant GPC3 eksprese eden hücrelere baglanan bir test polipeptit kompleksinin miktarIEl yanstân, yukarlEllaki analizle belirlenen Geometrik Ortalama karsllâstülna degeri (AGeo-Ort deger, mutant GPC3 molekülü için), GPC3 eksprese eden hücrelere baglanan test polipeptit kompleksinin miktarIElyansltân AGeo-Ort karsuâstlüna degeri ile karsllâstlElBraktadlü Bu durumda, GPC3 eksprese eden hücreler ve mutant GPC3 eksprese eden hücrelere yönelik AGeo-Ort karsllâstlîrlna degerlerinin belirlenmesi için kullanllân test polipeptit kompleksinin konsantrasyonlarü özellikle tercihen, esit veya büyük oranda esit olacak sekilde ayarlanmaktadlü GPC3'te bir epitopu tanlgEdogrulanmlS olan bir polipeptit kompleksi, bir kontrol polipeptit kompleksi olarak kullanlliiaktadlü Mutant GPC3 eksprese eden hücrelere yönelik bir test polipeptit kompleksinin AGeo-Ort karsllâstülna degerinin, GPC3 eksprese eden hücrelere yönelik test polipeptit kompleksinin AGeo-Ort karsllâstlülna degerinden en az %80, tercihen %50, daha tercihen %30 ve özellikle tercihen %15 oranIa daha az olmasüjurumunda, test polipeptit kompleksi "mutant GPC3 eksprese eden hücrelere büyük oranda baglanmaaktadlE'l. Geo-Ort (Geometrik Ortalama) degerinin belirlenmesine yönelik formül, CELL QUEST Software User's Guide (BD biosciences) referansIa açlKlanmaktadlB Karsllâstlîilnanlül, karsllâstülna degerlerinin büyük oranda esit oldugunu göstermesi durumunda, test ve kontrol polipeptit komplekslerine yönelik epitop da ayri Ehlacak sekilde belirlenebilmektedir. Degisken fragment (Fv) Burada, "degisken fragment (Fv)" terimi, bir çift antikor hafif zincirli degisken bölge (VL) ve antikor agIElzincirli degisken bölgeden (VH) olusan bir antikor türevli antijen baglama alanII minimum birimine isaret etmektedir. 1988'de, Skerra ve Pluckthun, homojen ve aktif antikorlarlEl, bir antikor geninin bir bakteriyel sinyal sekansII akEasag-a eklenmesi ve genin E. 60"' içerisinde indüklenmesi vasßslîla E. co/i periplazma fraksiyonu ile ile hazlEllanan Fv'de, bir antijene baglanacagßekilde VH, VL ile iliskilenmektedir. Burada, Fv tercihen, örnegin asaglöhkileri içeren bir polipeptit kompleksi veya benzeri olan bir çift Fv'ye sahiptir: (1)iki degerlikli bir scFv olan iki degerlikli bir antijen baglama alanüburada iki degerlikli scFv'nIn tek degerlikli bir scFv'si, bir CDB baglama alanIEqusturan agEzincirIik bir Fv fragmenti vasEtâlea bir Fc alanIüolusturan bir polipeptite baglanmaktadlEl ve tek degerlikli diger scFv, bir CD3 baglama alanIEblusturan hafif zincirli bir Fv fragmenti vasitâslîla bir Fc alan ßlusturan diger polipeptite baglanmaktadlîi (2) hiçbir Fcy reseptörü baglama aktivitesine sahip olmayan ve IgGl, IgGZa, 1963, veya (3) tek degerlikli en az bir CD3 baglama alanü burada hafif zincirli ve aglEIzincirIi Fv fragmentleri, CD3 antijenine baglanacaglîlsekilde bir CD3 baglama alanII meydana getirilmesi için birbiriyle iliskilenmektedir. scFv, tek zincirli antikor ve sc(Fv)2 Burada, "scFv", "tek zincirli antikor" ve "sc(Fv)2" terimlerinin tamamÇlsabit bölgeden ziyade, hafif ve agEzincirIerden elde edilen degisken bölgeler içeren bir tek polipeptit zincirinin bir antikor fragmentine isaret etmektedir. Genel oarak, bir tek zincirli antikor ayrlîla, VH ve VL alanlarürasia bir polipeptit baglaylîlgîiçermekte olup, bu, antijen baglanmalelÜnümkün kIIgllîlüsünülen, arzu edilen bir yapi. olusumunu mümkün kllBiaktadlEl Tek zincirli antikor, Pluckthun tarafIan, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Cilt 113, Rosenburg ve zincirli antikor bispesifik ve/veya insansllâstlîlliilglolabilmektedir. scFv, Fv'yi olusturan VH ve VL'nin bir peptit baglayEIîlîiIIaslßslýla birbirine baglantilând-[glîl VL, peptit baglaylEIgEiiarafIan yakIa tutulabilmektedir. sc(Fv)2, iki VL ve iki VH'nin dört degisken bölgesinin bir tek zincirin olusturulmasEilçin peptit baglaylîliâr gibi baglaylîllâr vasißislýla baglantllând-[glübir tek zincirli antikorudur (J antikorlarIan elde edilebilmektedir. Bu tür bir sc(Fv)2, örnegin tercihen, Journal of Içerisinde mevcut olan iki epitopu tanlýhn bir bispesifik sc(Fv)2'yi kapsamaktadlEl sc(Fv)2, teknikte uzman kisiler tarafIan bilinen yöntemlerle üretilebilmektedir. Örnegin, sc(Fv)2, bir peptit baglaylEEIgibi bir baglaylîüvaslßslýla scFv'nin baglantüândmasüvasltâslýla üretilebilmektedir. Burada, bir sc(Fv)2'yi olusturan bir antijen baglama alanII formu, iki VH birimi ve iki VL biriminin, bir tek zincirli polipeptitin N terminusundan baslayarak VH, VL, VH, ve VL ([VH]- baglayEEIlVL]-baglaylEüVH]-baglaylüBjVLD sßsia düzenlendigi bir antikoru kapsamaktadlü Iki VH birimi ve iki VL biriminin slüsEyukar-ki form ile sIlBllZdegildir ve herhangi bir slüda düzenlenebilmektedir. Formun örnek bir süsüsag- Iistelenmektedir. açlElanmaktadlÜ Bu tarifnamelere göre, teknikte uzman kisiler, burada açllZlanan polipeptit komplekslerinin üretilmesi için arzu edilen sc(Fv)2'yi uygun bir sekilde hazlIllayabilmektedir. DahasÇI mevcut bulusun polipeptit kompleksleri, PEG gibi bir tasElEElpolimer veya bir antikanser maddesi gibi bir organik bilesik ile konjugatlanabilmektedir. Alternatif olarak, bir seker zinciri ilave sekansütercihen, seker zincirinin arzu edilen bir etkiyi saglayacaglISekilde polipeptit komplekslerine eklenmektedir. Bir antikorun degisken bölgelerinin baglantüândElliias- yönelik baglaylîllâr, genetik mühendisligi ile üretilebilen yapay peptit baglaylîHârÇbentetik baglaylîllârlîl'e örnegin Protein peptit baglaylEllârElmevcut bulusta tercih edilmektedir. Peptit baglaylEllârII uzunlugu özellikle sIEllandlülßîamaktadlE ve amaca baglElolarak teknikte uzman kisiler tarafIan uygun sekilde seçilebilmektedir. Uzunluk tercihen bes amino asit veya daha fazla (belirli bir lellElhndlEilna olmakslîlü, üst limit genellikle 30 amino asit veya daha azÇltercihen 20 amino asit veya daha aleE) ve özellikle tercihen 15 amino asittir. sc(Fv)2 üç peptit baglaylîlg] içerdiginde, bunlarI uzunlugu aynüleya farklIJJIabilmektedir. Örnegin bu tür peptit baglaylEllârEalsagIkileri kapsamaktadlîi GIy-Ser GIy-Gly-Ser Ser-Gly-Gly GIy-GIy-GIy-Ser (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) SerGIyGlyGly (SEKANS KIMLIK NUMARASI:6) GlyGlyGIyGlySer (SEKANS KIMLIK NUMARASI:7) SerGlyGlyGlyGly (SEKANS KIMLIK NUMARASI:8) GlyGlyGIyGlyGIySer (SEKANS KIMLIK NUMARASI:9) SerGlyGlyGlyGlyGly (SEKANS KIMLIK NUMARASI:10) GlyGlyGIyGlyGlyGlySer (SEKANS KIMLIK NUMARASI:11) SerGlyGlyGlyGlyGlyGly (SEKANS KIMLIK NUMARASI:12) (GlyGlyGIyGlySer (SEKANS KIMLIK NUMARASI:7))n (SerGlyGlyGlyGly (SEKANS KIMLIK NUMARASI:8))n burada n, 1 veya daha büyük olan bir tamsayIlü Peptit baglaylElârII uzunlugu veya sekanslarlTJ amaca baglEIoIarak teknikte uzman kisiler taraflEtlan uygun bir sekilde seçilebilmektedir. Sentetik baglayElIâr (kimyasal çapraz baglama maddeleri) peptitlerin ve örnegin asaglElhkilerin çapraz baglanmaslîtin rutin sekilde kullanilBIaktadB N-hidroksi süksinimid (NHS), disüksinimidil süberat (DSS), bis(sülfosüksinimidil) süberat (853), ditiyobis(süksinimidil propiyonat) (DSP), ditiyobis(sülfosüksinimidil propiyonat) (DTSSP), etilen glikol bis(süksinimidil süksinat) (EGS), etilen glikol bis(sülfosüksinimidil süksinat) (sülfo-EGS), disüksinimidil tartrat (DST), disülfosüksinimidil tartrat (sülfo-DST), bis[2-(süksinimidoksikarbonil0ksi)etil] sülfon (BSOCOES), ve bis[2-(sülfosüksinimidoksikarboniloksi)etiI] sülfon (sülfo-BSOCOES). Bu çapraz baglama maddeleri piyasada mevcuttur. Genel olarak, bu baglaylîllârlöl, dört antikor degisken bölgesini birbirine baglamasEl gerekmektedir. Kullan Hâcak olan baglayiîllâr, ayn Eilürde veya farkIEüürde olabilmektedir. olusmaktadlB Fab molekülünün aglEIzinciri, bir baska aglüzincirli molekül ile disülfür baglarEl olusturamamaktadE proteaz ile islenmesi vasltâslýla üretilmektedir ve iki H zincirinden her birindeki reze bölgeleri arasIa mevcut olan disülfür baglarII yakIIa bir immünoglobulinin (monoklonal antikor) sindirilmesi vasltâsüa meydana getirilen bir antikora isaret etmektedir. Örnegin, iki homoloh antikor fragmentinin meydana getirilmesi için papain, ki H zincirinden her birinin reze bölgeleri aras'a mevcut olan disülfür baglarII akIîsZl yukar-a IgG'yi bölmektedir, burada VL (L zinciri degisken bölgesi) ve CL ( L zinciri sabit bölgesi ) içeren bir L zinciri, bunlarIC terminal bölgelerindeki bir disülfür bagülasßslüa, VH (H zinciri degisken bölgesi) ve CHyl (bir H zinciri sabit bölgesindeki y1 bölgesi) içeren bir H zinciri fragmentine baglantllândlîllmaktadlîl Bu iki homolog antikor fragmentinden her biri Fab' olarak adlandülîhaktadE alanlarlEllEl bir klîinIan olusmaktadlü böylelikle disülfür baglarüiki aglEl zincir arasIa olusturulmaktadlü Burada açilZlanan bir polipeptit kompleksini olusturan F(ab')2, tercihen asagübki sekilde üretilebilmektedir. Arzu edilen antijen baglama alanIEiçeren bir bütün monoklonal antikor veya benzeri, pepsin gibi bir proteaz ile klg'nen sindirilmektedir; ve Fc fragmentleri, bir Protein A kolonuna adsorbe edilmesi vasitâslýla giderilmektedir. pH gibi uygun bir kurulum enzim reaksiyonu aItIda F(ab')2'nin Üretilmesi için seçici bir sekilde bütün antikoru bölebildigi sürece, proteaz özellikle sIlEllandEIIBiamaktadE Bu tür proteazlar, örnegin pepsin ve fisini kapsamaktadIEl Fc alanEl Burada açllZlanan bir polipeptit kompleksini olusturan bir Fc alanEtercihen asag-ki sekilde üretilebilmektedir. Bir monoklonal antikor gibi bir antikor, pepsin gibi bir proteaz ile klginen sindirilmektedir. Arcl Idan, elde edilen fragment bir Protein A veya Protein G kolonu üzerine absorbe edilmektedir ve uygun bir elüsyon tamponu ile ayrigtlElliBiaktadlE pH gibi uygun bir kurulum enzim reaksiyonu aItIEUa monoklonal antikorlar gibi antikorlarEböIebildigi sürece, proteaz özellikle sIlEiIand iEiiIhamaktadlEi Bu tür proteazlar, örnegin pepsin ve fisini kapsamaktadß Burada açlk`lanan polipeptit kompleksleri, IgG1, IgG2, IgG3, veya IgG4'ün Fc alanIEl olusturan amino asitler içeren, indirgenmis Fcy reseptörü baglama aktivitesine sahip bir Fc alan üçerebilmektedir. Antikor izotipi, sabit bölgenin yap_ göre belirlenmektedir. IgG1, IgG2, IgG3, ve IgG4 izotiplerinin sabit bölgeleri, süslýla Cvl, Cy2, Cy3, ve Cv4 olarak adlandiEilBwaktadlü Insan Cyl, Cy2, Cy3, ve Cy4'ü olusturan Fc alanEboIipeptitlerinin amino asit sekanslarlÇislBisEIa SEKANS KIMLIK NUMARASI: 23, 24, 25 ve 26'da örneklendirilmektedir. Her bir amino asit sekansIiZqusturan amino asit kaliEtHârEhrasIdaki iliski ve Kabat'I EU numaralandlElnasEl (burada ayriîb EU INDEKSI olarak adlandiîllmaktadlî) Sekil 18'de gösterilmektedir. Fc alanü bir CH1 alanIü/e CH1 ve CH2 alanlarIlEla arasiîidaki bir bölgeyi Içeren sabit bölgenin bir klgmIEiçeren iki hafif zincir ve iki agiElzincir içeren, F(ab')2 dlSiEtlaki bölgeye isaret etmektedir, böylelikle disülfür baglarüiki agIEizincir arasIa olusturulmaktadB Burada açüîlanan bir polipeptit kompleksini olusturan Fc alanEi tercihen asaglöiaki sekilde üretilebilmektedir. Bir monoklonal IgG1, IgG2, IgG3, veya IgG4 antikoru veya benzeri, pepsin gibi bir proteaz ile kEinen sindirilmektedir, ardIan bir Protein A kolonu üzerinde adsorbe edilen fraksyon ayrlgtlîimiaktadlü pH gibi uygun bir kurulum enzim reaksiyonu alt-a F(ab')2'nin üretilmesi için seçici bir sekilde bütün antikoru bölebildigi sürece, proteaz özellikle sIiEiiandiEllüiamaktadB Bu tür proteazlar, örnegin pepsin ve fisini kapsamaktadiEi Fcy reseptörü Fcy reseptörü, monoklonal IgG1, IgG2, IgG3, veya IgG4 antikorlarII Fc alanlEia baglanabilen bir reseptöre isaret etmektedir ve büyük oranda bir Fcy reseptör geni taraf-an kodlanan protein ailesine ait tüm üyeleri kapsamaktadiB Insanda, aile FcyRIa, FcyRIb ve FcyRIc izoformlarIZIdahil FcyRI (CD64); FcyRIIa (allotip H131 ve R131 dahil), FcyRIIb (FcyRIIb-l ve FcyRIIb-2 dahil), ve FcyRIIc izoformlarlîiahil FcyRII (CD32); FcyRIIIa (allotip V izoformlarEl dahil FcyRIII (CD16); ve ayrlîa tanIilanmamEl tüm insan FcyR'ler, FcvR izoformlarlZlve bunlarI allotiplerini kapsamaktadlû Ancak, Fcy reseptörü bu örnekler ile sIIEIlEldegildir. Bunlarla sIlEllandlBanakslZlE, FcyR, insanlar, fareler, slglanlar, tavsanlar ve maymunlardan elde edilenleri kapsamaktadm FcvR, herhangi bir organizmadan elde edilebilmektedir. Fare FcyR'si, bunlarla sIlEllandlElilBiakslîlîil, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16), ve FcyRIII-Z'nin (CD16-2) yanElsÜ, tanIilanmamlgl tüm fare FcyR'leri, FcyR izoformlarIZIve bunlarI allotiplerini kapsamaktadLEl Tercih edilen bu tür Fcy reseptörleri, örnegin, insan FcyI kapsamaktadiîl FcvI'nI polinükleotit sekansüie amino asit sekansßüislýia SEKANS KIMLIK polinükleotit sekansElve amino asit sekansüslüslýla SEKANS KIMLIK NUMARASI:15 (BC gösterilmektedir; FcvIIB'nin polinükleotit sekansIZl/e (AAI46679.1) gösterilmektedir; FcvIIIA'nI polinükleotit sekanslîlve amino asit sekanslII sßslýla SEKANS KIMLIK NUMARASI:19 (BC gösterilmektedir; FcyIIIB'nin polinükleotit sekansEl/e amino asit sekansElleislîla SEKANS numarasEher parantez içinde gösterilmektedir). Bir Fcv reseptörünün, bir monoklonal IgGl, taramaslîlYükseltilmis ParlakI[El Proksimitesi Homojen Denemesi), yüzey plazmon rezonansEl (SPR) temelli BIACORE yöntemi ve digerlerinin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010) yanlII SÜ yukarlêlh açlKIanan FACS ve ELISA formatlarEI vasltßisûla degerlendirilebilmektedir. Bu zaman zarflEUa, "Fc ligandlîiveya "efektör IigandIZ] bir antikor Fc alan. baglanarak bir Fc/Fc Iigand kompleksini olusturan bir moleküle ve tercihen bir polipeptite isaret etmektedir. Molekül herhangi bir organizmadan elde edilebilmektedir. Fc ligandIlEl Fc'ye baglanmasü tercihen bir veya daha fazla efektör islevine sahiptir. Bu tür Fc Iigandlarü bunlarla lellEllEl olmamak üzere, Fc reseptörleri, FcvR, FcoR, FcsR, FcRn, cm ve C3, mannan baglama lektini, mannoz reseptörü, Staphy/ococcus Protein A, Staphy/ococcus Protein G, ve viral FcyR'leri kapsamaktadlB Fc ligandlarüayrü, FcyR'ye estürel olan Fc reseptörlerinin bir ailesi olan Fc reseptörü homologlarIEaFcRH) (Davis ve meslektaslarü(2002) Immunological Reviews 190, 123-136) kapsamaktadlE Fc Iigandlarüyrlîla, Fc'ye baglanan, tanlanmamlg molekülleri de kapsamaktadlEi Fcy reseptörü baglama aktivitesi Fc alanII Fcy reseptörleri FcyI, FcyIIA, FcyIIB, FcyIIIA, ve/veya FcyIIIB'den herhangi birine yönelik bozuk baglanmaslZIyukarI açlElanan FACS ve ELISA formatlarII yanlîsüi, ALPHA taramasEQYükseItiImis ParlaklllaProksimitesi Homojen Denemesi) ve yüzey plazmon rezonansEl vaslliislsîle degerlendirilebilmektedir. ALPHA taramasÇl asaglâla açllZlanan ilkeye dayaIEl olarak ALPHA teknolojisi ile gerçeklestirilmekte olup, iki tür boncuk kullanüBiaktadlB donör ve allEElboncuklarlZlBir parlak sinyal, yalnlîta, donör boncuklarüile baglantllândlEllân moleküllerin, allEDboncuklarElile baglantllândlîllân molekülleri ile biyolojik olarak etkilesime girmesi ve iki boncugun yakI sekilde konumlanmasülurumunda tespit edilmektedir. Lazer ElElEllarafIan kesilmis olan, bir donör boncugndaki fotosensitizör, boncugun öevresindeki oksijeni kesilmis tekli oksijene dönüstürmektedir. Tekli oksijen donör boncugu çevresinde yayIIglIa ve yakIa konumlandlEllân allEElboncuklar- eristiginde, aIlEElboncuklarEliçerisindeki bir kimyasal parlakllla reaksiyonu indüklenmektedir. Bu reaksiyon, nihai olarak, lglKl yayll]]îlil3ile sonuçlanmaktadE Donör boncuklarljle baglantllândlîllân moleküllerin, aIIEIZboncuklarEiIe baglantllândlîllân moleküller ile etkilesime girmemesi durumunda, donör boncuklarlZl tarafIan üretilen tekli oksijen, allîüboncuklarl erismemektedir ve kimyasal parlakllE] reaksiyonu ise meydana gelmemektedir. Örnegin, bir biyotin ile isaretlenmis polipeptit kompleksi donör boncuklar. immobilize edilmektedir ve glutatiyonin S-transferazEl(GST) etiketli Fcy reseptörü allEElboncuklar- immobilize edilmektedir. Bir rekabetçi mutant Fc alanIElçeren bir polipeptit kompleksinin yoklugunda, Fcy reseptçrü, bir yaban tipi Fc alanlîçeren bir polipeptit kompleksi ile etkilesime girerek, sonuç olarak 520 ila 620 nm'Iik bir sinyali indüklemektedir. Etiketlenmemis bir mutant Fc alan. sahip polipeptit kompleksi, Fcy reseptörü ile etkilesim için bir yaban tipi Fc alanEiçeren polipeptit kompleksi ile yarglnaktadß Ilgili baglama afinitesi, yarlglEl sonucu olarak floresandaki azalmanI nicellestirilmesi ile belirlenebilmektedir. Antikorlar gibi polipeptit komplekslerinin, Sülfo-NHS-biyotin veya benzeri kullanilarak biyotinlenmesine yönelik yöntemler bilinmektedir. GST etiketinin bir Fcy reseptörüne eklenmesine yönelik uygun yöntemler, Fcy ve GST içeren polipeptitlerin çerçeve Içi füzyonlanmasüfüzyonlanan genin, geni taslýbn bir vektörün verildigi hücrelerin kullanlßîaslsîla eksprese edilmesi ve ard-an bir gluratiyonin kolonunun kullanllBiaslýla saflastlEllEiasIEl kapsamaktadlEI Indüklenen sinyal, tercihen örnegin, GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego) gibi bir yazil].iîii kullanilmk lineer olmayan regresyon analizine dayanarak, tek tarafli bir rekabet modeline yerlestirilmesi vasßslîda analiz edilebilmektedir. BunlarI etkilesiminin gözlemlenmesine yönelik maddelerden biri, bir Iigand olarak bir sensör çipinin altlEl ince tabakasEIjzerine immobilize edilmektedir. Toplam yansIianlEl, altlEI ince tabaka ve cam araleldaki arayüzde meydana gelmesi için lglEl sensör çipinin arka yüzeyi üzerine verildiginde, yansifllân Sigil yogunlugu, belirli bir yerde kismen indirgenmektedir (SPR sinyali). Bunlar. etkilesiminin gözlemlenmesine yönelik diger madde, sensör çipinin yüzeyi üzerine bir analit olarak enjekte edilmektedir. Immobilize edilmis molekülün kütlesi, analit Iiganda baglandlglIa artmaktadlEl Bu, sensör çipinin yüzeyi üzerinde, çözücünün k-Ii indeksini degistirmektedir. K-n indeksindeki bu degisim, SPR sinyalinin bir pozisyonel kaymaleia sebep olmaktadlEl (tam tersi sekilde, ayrlglna, sinyali orijinal pozisyonuna dogru tekrar kaydiElnaktadlE). Biacore sisteminde, yukarlöh açllZlanan kaymanI miktarE(yani, sensör çipi yüzeyindeki kütle degisimi), dik eksende çizilmistir ve dolaylglýla zamanla kütledeki degisim, ölçülen veri (gösterilmemistir) olarak gösterilmektedir. Kinetik parametreler (birlesme 0rani3abiti (ka) ve ayrigma oranlîsabiti (kd)), sensörgram egrisinden belirlenmektdir ve afinite (KD), bu iki sabit araleUaki orandan belirlenmektedir. Inhibisyon denemesi tercihen BIACORE yöntemlerinde kullanüBmktadlEl Bu tür inhibisyon denemelerinin Burada, "Fcy reseptörü baglama aktivitesi indirgenmektedir" ifadesi, örnegin, yukariElh açiKlanan analiz yöntemine dayanarak, bir test polipeptit kompleksinin kompetitif aktivitesiin, bir kontrol polipeptit kompleksinin kompetitif aktivitesine klýlasla, %50 veya daha az, tercihen daha az veya %15 veya daha az ve özellikle tercihen %10 veya daha az, %9 veya daha az, Bir monoklonal IgGl, IgG2, IgG3, veya IgG4 antikorunun Fc alanIEIiçeren polipeptit kompleksleri, kontrol polipeptit kompleksleri olarak uygun sekilde kullanliâbilmektedir. Fc alanEyapHârESEKANS KIMLIK NUMARASI:23 (A, RefSeq erisim numarasÜâAC82527.1 olan N terminusa eklenmektedir), 24, (A, RefSeq erisim numarasElAABS9393.1 olan N terminusa eklenmektedir, 25 (A, RefSeq erisim numaraslIAA27268.1 olan N terminusa eklenmektedir) ve 26'da (A, RefSeq erisim numarasElAABS9394.1 olan N terminusa eklenmektedir) gösterilmektedir. Dahasübelirli bir izotipin bir antikoruna ait bir Fc alanlîilnutantlülçeren bir polipeptit kompleksi bir test maddesi olarak kullanllfnaktadlü Fcy reseptörü baglama aktivitesi üzerindeki mutantlE] mutasyon etkisi, aynElzotipin Fc alanIElçeren bir polipeptit kompleksinin bir kontrol olarak kullanüÜiaslýla degerlendirilmektedir. Yukari açlEIandiglEl üzere, Fcy reseptörü baglama aktivitesinin azaldiglEtlüsünülen bir Fc alanEmutantEiçeren polipeptit kompleksleir uygun sekilde hazlHbnmaktadlB amino asitlerinin bir kopmasi. sahip mutantlar. yanElsü, mutantlar C226S, C229S, 1192) da kapsamaktadlEl Spesifik olarak, tercih edilen polipeptit kompleksleri, belirli bir izotipin bir antikoruna ait Fc PC alanIEliçerenIeri kapsamaktadlEl Fc alanII kökeni olan antikor izotipi özellikle sIlEliandlEilBîamaktadlîlve bir monoklonal IgGl, IgG2, IgG3, veya IgG4 antikorundan elde edilen uygun bir Fc alanII kullanllBiasElnümkündür. IgGl antikorlarldan elde edilen Fc alanlarlEllEl kullanilBwasEllercih edilmektedir. Tercih edilen polipeptit kompleksleri, örnegin, asagi gösterilen ikamelerden herhangi birine sahip bir Fc alanlüiçeren, IgGl antikorunun Fc alanIElolusturan amino asitlerde, pozisyonlarIlEl, EU numaralandüinas- (her bir numara, EU numaralandülnasliîüaki bir amino asit kallEt-I pozisyonunu temsil etmektedir; ve numaradan önceki tek harfli amino asit sembolü, ikameden önceki amino asit kaIlEt-Eltemsil etmektedir, aynlZlzamanda numaradan sonraki tek harfli amino asit sembolü ikameden önceki amino asit kallEt-EI temsil etmektedir) göre belirlendigi kompleksleri kapsamaktadlîi (c) C2268, C2295; veya aynüamanda, pozisyonlar 231 ila 238'deki amino asit sekansII bir kopmasi sahip bir Fc alani sahip olanlar. DahasÇitercih edilen polipeptit kompleksleri, ayrlîla, asagi gösterilen ikamelerden herhangi birine sahip bir Fc alanIEiçeren, IgG2 antikorunun Fc alanIEblusturan amino asitlerde, pozisyonlarIlEI, EU numaralandlîilnasi göre belirlendigi kompleksleri kapsamaktadlîi (h) V234A ve G237A; (i) A235E ve G237A; veya (j) V234A, A235E, ve G237A. Her bir numara, EU numaralandlElnasIdaki bir amino asit kalEt-I pozisyonunu temsil etmektedir; ve numaradan önceki tek harfli amino asit sembolü, ikameden önceki amino asit kaIlEt-Eltemsil etmektedir, aynüzamanda numaradan sonraki tek harfli amino asit sembolü ikameden önceki amino asit kaIlEt-El temsil etmektedir. DahasÇitercih edilen polipeptit kompleksleri, ayrlîia, asagi gösterilen ikamelerden herhangi birine sahip bir Fc alanIEiçeren, IgG3 antikorunun Fc alanIlZblusturan amino asitlerde, pozisyonlarlül, EU numaralandlünasi göre belirlendigi kompleksleri kapsamaktadlîi (l) 0265A; veya (m) V264A. Her bir numara, EU numaralandlîiinaleUaki bir amino asit kaIIEt-I pozisyonunu temsil etmektedir; ve numaradan önceki tek harfli amino asit sembolü, ikameden önceki amino asit kaIlEtlglüEltemsil etmektedir, aynlZlzamanda numaradan sonraki tek harfli amino asit sembolü ikameden önceki amino asit kaIlEt-Eltemsil etmektedir. DahasÇltercih edilen polipeptit kompleksleri, ayrlEla, asagi gösterilen ikamelerden herhangi birine sahip bir Fc alanIElçeren, IgG4 antikorunun Fc alanIEblusturan amino asitlerde, pozisyonlarIEl, EU numaralandlünasi göre belirlendigi kompleksleri kapsamaktadB (n) L235A, G237A, ve E318A; (0) L235E; veya (p) F234A ve L235A. Her bir numara, EU numaralandlElnasIaki bir amino asit kallEt-lEl pozisyonunu temsil etmektedir; ve numaradan önceki tek harfli amino asit sembolü, ikameden önceki amino asit kallEt-Eltemsil etmektedir, aynüzamanda numaradan sonraki tek harfli amino asit sembolü ikameden önceki amino asit kalüt-El temsil etmektedir. Tercih edilen diger polipeptit kompleksleri, örnegin, bir IgGl antikorunun Fc alanlüblusturan numaralandlElnasDIl herhangi bir amino asitin, ilgili IgG2 veya IgG4'te bulunan, EU numaralandlElnasIaki ilgili pozisyonun bir amino asiti ile ikame edildigi bir Fc alanID içerenleri kapsamaktadß Tercih edilen polipeptit kompleksleri, ayrlEla, örnegin, bir IgGl antikorunun Fc alanIü olusturan amino asitlerde pozisyon 234, 235, ve 297'deki (EU numaralandlElnasEIl bir veya daha fazla amino asitlerden herhangi birinin, diger amino asitler ile ikame edildigi bir Fc alanIEl içerenleri kapsamaktadlü Ikameden sonraki amino asit türü özellikle sIIEIlandElIBiamaktadB ancak, pozisyonlar 234, 235 ve 297'deki bir veya birden fazla ehrhangi bir amino asitin alanin ile ikame edildigi bir Fc alanlülçeren polipeptit kompleksleri Tercih edilen polipeptit kompleksleri, ayrlEb, örnegin, bir IgGl antikorunun Fc alanIEI olusturan amino asitlerde pozisyon 265'teki (EU numaralandiElnaSDJ bir amino asitin, bir baska amino asit ile ikame edildigi bir Fc alanIEilçerenleri kapsamaktadlEi Ikameden sonraki amino asit türü özellikle sIlEIlandElüîamaktadIEj ancak, pozisyonlar 265'teki bir amino asitin alanin ile ikame edildigi bir Fc alanIEIiçeren polipeptit kompleksleri özellikle tercih edilmektedir. Bispesifik antikordan elde edilen Fc alanEI Burada, bispesifik antikordan elde edilen uygun Fc alanlarÇlayrlEia, indirgenmis Fcy reseptörü baglama aktivitesine sahip olan bir PC alanljblarak kullanllBiaktadlEI Bir bispesifik antikor, iki farklßpesifiteye sahip bir antikordur. IgG türü bispesifik antikor, iki tür IgG antikoru üreten hibridomun füzyonlanmasElile üretilen hibrit hibridomdan (kuadrom) salgllânabilmektedir Alternatif olarak, IgG türü bispesifik antikor, ilgili IgG'nin iki türünü olusturan L zinciri ve H zinciri genleri olan toplamda dört genin, hücrelerin içerisinde verilmesi ve bunlar. birlikte eksprese edilmesi vasißslýla da salgiiânabilmektedir. Ancak, teoride, bu tür yöntemleri ile Üretilen on adet IgG H zinciri ve L zinciri kombinasyonu mevcuttur. On tür IgG'den H zinciri ve L zincirinin arzu edilen bir kombinasyonundan olusan IgG'nin aaflastlElIIhasElzordur. Ilaveten, teoride, arzu edilen bir kombinasyona sahip, salgUânmlSIgG'nin miktarlîdja önemli derecede azaltiiB1akta olup, bu, genis çaplEkültür gerektirmektedir. Bu üretim maaliyetini daha da artlElnaktadE Bu durumda, H zincirlerinin bir heterolog kombinasyonuna sahip IgG'nin tercih edildigi üzere salgilânmasülçin, uygun bir amino asit ikamesi, bir H zinciri Fc alanIlJJIusturan CH3 alan. verilebilmektedir. Spesifik olarak, bu yöntem, H zincirlerinden birinin CH3 alanIaki amino asite yönelik olarak daha büyük bir yan zincire (nob ("ç-üanlamlEUa» sahip bir amino asitin ikame edilmesi ve diger H zincirinin CH3 alanlEUaki bir amino asite yönelik olan daha küçük bir yan zincire (delik "bosluk" anlamIa)) sahip bir amino asitin ikame edilmesi, bötlelikle nobun delik içerisinde konumlandlEIlIhasElvaslüslýla gerçeklestirilmektedir. Bu, heteromerik H zincirini baslatmaktadlîl ve aynElzamanda homomerik H zinciri olusumunu 681). Diger yandan, L zincirine göre, L zinciri degisken bölgesi, H zinciri degisken bölgesinden daha az polimorfiktir, dolayElýla her iki H zincirine de baglanma yetisini saglayan ortak bir L zincirinin elde edilmesi beklenmektedir. Bir bispesifik IgG'nin etkili ekspresyonu, bu tür bir ortak L zincirinin ve iki H zincirinin genlerinin, IgG'nin eksprese edilmesi için hücrelere bu fikrin gerçeklestirilmesi zordur, zira aynil zincirini içeren iki antikor türünün, rastlantgl sekilde seçilmesi olasUJgJEdüsüktür. DolayEîLIa, farkllîblan herhangi bir H zincirine güçlü bir baglanma yetisi gösteren bir ortak L zincirinin seçilmesine yönelik bir yöntem öne DahasÇI ayrlEla, polipeptit birlesmesinin veya polipeptitin olusturdugu heterometik multimerlerin, bir Fc alanIElolusturan iki polipeptit arasIaki birlesime birlestirilmesinin kontrol edilmesine yönelik yöntemleri uygulanmasüla bir bispesifik antikorun üretilmesine yönelik bilinen teknikler mevcuttur. Spesifik olarak, polipeptit birlesmesinin kontrol edilmesine yönelik yöntemler, bir bispesifik antikorun üretilmesinde kullanllâbilmektedir, burada Fc alanlüilusturan iki polipeptit araleUaki arayüzü olusturan amino asitler, aynlîtekansa sahip Fc alanlarEiarasIaki birlesmenin inhibe edilmesi ve farklElsekanslara sahip iki Fc alanEl taraflEidan olusturulan polipeptit komplekslerinin olusumunun mümkün kllih'inasüiçin degistirilmektedir. Bir bispesifik antikordan elde edilen bir Fc alanlüilusturan, yukari açllZlanan iki polipeptit, mevcut bulusun bir Fc alanIEkapsayan bir alan olarak uygun sekilde kullaniiâbilmektedir. Daha spesifik olarak, bir Fc alanIlIblusturan, tercih edilen bu iki polipeptit, bir polipeptitin amino asit sekansIaki pozisyonlar 349 ve 366'da (EU numaralandlElnaslB bulunan amino asitlerin süslýla sistein ve triptofan oldugu ve diger polipeptitin amino asit sekansIaki süislsîla sistein, serin, alanin ve valin oldugu polipeptitleri kapsamaktadB Bir baska yapllândlîilnada, mevcut bulusun bir Fc alanIEevreleyen, tercih edilen alanlar, bir PC alanIEiolusturan iki polipeptiti kapsamaktadlü burada bir polipeptitin amino asit sekanleUaki pozisyon 409'da (EU numaralandiûinasDîl bulunan amino asit aspartik asittir ve diger polipeptitin amino asit sekansIaki poziston 399'da (EU numaralandlîilnasm bulunan amino asit ise lisindir. Yukarlki yapiiândünada, pozisyon 409'da bulunan amino asit, aspartik asit yerine glutamik asit olabilmekteyken, pozisyon 399'da bulunan amino asit ise lisin yerine arjinin olabilmektedir. Dahasüpozisyon 360 veya 392'deki aspartik asit, ayrlEla, pozisyon 399'daki lisin ile terichen kombine edilebilmektedir. Bir baska yapllândlünada, mevcut bulusun bir Fc alanIEevreleyen, tercih edilen alanlar, bir PC alanIEiolusturan iki polipeptiti kapsamaktadlEl burada bir polipeptitin amino asit sekansIaki pozisyon 370'de (EU numaralandünasbjbulunan amino asit glutamik asittir ve diger polipeptitin amino asit sekansiaki poziston 357'de (EU numaralandlElnasDIl bulunan amino asit ise lisindir. Bir diger yapllândlElnada, mevcut bulusun bir Fc alanIEevreleyen, tercih edilen alanlar, bir PC alanIDolusturan iki polipeptiti kapsamaktadB burada bir polipeptitin amino asit sekanleUaki pozisyon 439'da (EU numaralandünasbîlbulunan amino asit glutamik asittir ve diger polipeptitin amino asit sekansIaki poziston 356'da (EU numaralandlElnasEl bulunan amino asit ise lisindir. Ilaveten, mevcut bulusun bir PC alanIElçevreleyen, tercih edilen alanlar, buradaki bir kombinasyona sahip yapilândlElnalarleapsamaktadlB bir Fc alanIEblusturan iki polipeptit, burada bir polipeptitin amino asit sekansIaki pozisyonlar 409 ve 370'de (EU numaralandlElnasDJbulunan amino asitler süsMa aspartik asit ve glutamik asittir ve diger polipeptitin amino asit sekansIaki pozisyonlar 399 ve 357'de (EU numaralandlElnasD] bulunan amino asitlerin her ikisi de Iisindir (bu yapllândlîilnada, pozisyon 370'deki glutamik asit aspartik asit ile degistirilebilmektedir ve pozisyon 370'deki glutamik asit, pozisyon 392'deki aspartik asit ile degistirilebilmektedir); bir Fc alanIEblusturan iki polipeptit, burada bir polipeptitin amino asit sekansIaki pozisyonlar 409 ve 439'da (EU numaralandlîilnasDîlbulunan amino asitler süslîla aspartik asit ve glutamik asittir ve diger polipeptitin amino asit sekansiaki pozisyonlar 399 ve 356'da (EU numaralandßnasm bulunan amino asitlerin her Ikisi de Iisindir (bu aspartik asit ile degistirilebilmektedir); bir Fc alanIlZblusturan iki polipeptit, burada bir polipeptitin amino asit sekanleUaki pozisyonlar 370 ve 439'da (EU numaralandlElnaslIl bulunan amino asitlerin her ikisi de glutamik asittir ve diger polipeptitin amino asit sekansIaki pozisyonlar 357 ve 356'da (EU numaralandlünasD] bulunan amino asitlerin her ikisi de Iisindir; ve bir Fc alanIIZblusturan iki polipeptit, burada bir polipeptitin amino asit sekanslrîhaki pozisyonlar 409, 370, ve 439'da (EU numaralandlEnasDîl bulunan amino asitler süsMa aspartik asit, glutamik asit ve glutamik asittir ve diger polipeptitin amino asit sekansIaki pozisyonlar 399, 357, ve 356'da (EU numaralandlîilnastîlbulunan amino asitlerin her ikisi de Iisindir (bu yapllândünada, pozisyon 370'deki amino asit glutamik asit ile degistirilebilmektedir; alternatif olarak, pozisyon 370'teki amino asitin glutamik asit ile ikame edilmesi yerinde, 439'daki glutamik asit aspartik asit ile degistirilebilmektedir veya pozisyon 439'daki glutamik asit, pozisyon 392'deki aspartik asit ile degistirilebilmektedir). Bir diger yapllândlElnada, mevcut bulusun bir PC alanIEevreleyen, tercih edilen alanlar, bir Fc alanIlIlolusturan iki polipeptiti kapsamaktadlîl burada bir polipeptitin amino asit sekansldaki pozisyon 356'da (EU numaralandlîiinaslll bulunan amino asit Iisindir ve diger polipeptitin amino asit sekanslüdaki pozisyonlar 435 ve 439'da (EU numaralandülnasDZl bulunan amino asitler slßslýla arjinin ve glutamik asittir. Bir bispesifik antikordan elde edilen bir Fc alanIElusturan, yukari açiEIanan iki polipeptit, mevcut bulusun bir PC alanIEiçevreleyen bir alan olarak kullanI[g]lElda, mevcut bulusun antijen baglama alanlariZlve/veya CD3 baglama alanlarElarzu edilen bir kombinasyonda düzenlenmektedir` Indirgenmis C terminali heterojenligine sahip Fc alanlZl Burada, yukar- açlKlanan özelliklere ilaveten, artElÜilglFc alanEC terminal heterojenligine sahip Fc alanlarüindirgenmis Fcy reseptörü baglama aktivitesine sahip Fc alanlarEblarak kullanllIhaktadB Daha spesifik olarak, mevcut bulus, IgG 1, IgG2, IgG3, veya IgG4'den elde edilen bir Fc alanIÜqusturan iki polipeptitin amino asit sekanslarIaki, slûslýla, pozisyonlar 446 ve 447'de (EU numaralandlElnaslIl bulunan glisin ve lisinin koparI[g]l:lFc alanlarEl saglamaktadlü T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanlari] Burada "T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanIZ] bir T hücresi reseptörü kompleksinin tamamlEla veya bir klglnlüla spesifik olarak baglanan veya bunun tamamlaylEEIßlan bir bölge içeren, bir T hücresi reseptörü kompleksi antikorunun bir kismi isaret etmektedir. Bu tür bir T hücresi reseptörü kompleksi, T hücresi reseptörünün kendisi olabilmektedir veya T hücresi reseptörü ile birlikte T hücresi reseptörü kompleksini olusturan bir adaptör molekül olabilmektedir. Tercih edilen bir adaptör CD3'tür. T hücresi reseptörü baglama alanEl Burada "T hücresi reseptörü baglama alanE] bir T hücresi reseptörünün tamamlEla veya bir klim- spesifik olarak baglanan veya bunun tamamlaylEEEblan bir bölge içeren, bir T hücresi reseptörü antikorunun bir klîtn. isaret etmektedir. Bir T hücresi reseptörünün degisken bölgesinin veya sabit bölgesinin kullanllfhasü mümkündür. Ancak, bir CD3 baglama alanII baglandIglEltercih edilen epitoplar, sabit bölgede bulunanlardiü Sabit bölge sekanslariZlörnegin, T hücresi reseptörü d zinciri (RefSeq erisim numaraslIAA, T hücresi reseptörü ß zinciri (RefSeq erisim numarasEC, T hücresi reseptörü y1 zinciri (RefSeq erisim numarasElA, T hücresi reseptörü y2 zinciri (RefSeq erisim numarasÜAAB, ve T hücresi reseptörü ö zinciri (RefSeq erisim numarasElAAA61033.1; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 71) olanlarükapsamaktadlü CD3 baglama alanü Burada "CD3 baglama alanlZJ bir CD3'ün tamam. veya bir kisin- sapesifik olarak baglanan veya bunun tamamlaylEEEblan bir bölge içeren, bir CD3 antikorunun bir klîin. isaret etmektedir. Bir CD3 baglama alanl,`_lbir veya daha fazla antikor degisken alanIan elde edilebilmektedir. Tercihen, CD3 baglama alanühem CD3 hafif zincirli degisken bölgesini (VL) hem de CD3 aglElzincirli degisken bölgesini (VH) içermektedir. Tercih edilen bu tür CD3 baglama baglama alanlarÇiörnegin "tek zincirli Fv (scFv)", "tek zincirli antikor" "Fv", "tek zincirli Fv2 (scFv2)", "Fab" ve "F(ab')2"yi kapsamaktadB Mevcut bulusun CD3 baglama alanÇlepitop insan CD3'ü olusturan y zinciri, ö zinciri veya 8 zinciri sekanslîlçerisinde konumland-[glîlsürece herhangi bir epitopa baglanabilmektedir. Mevcut bulusta, tercih edilen CD3 baglama alanlarÇlbir CD3 antikoru hafif zincirli degisken bölge (VL) ve bir CD3 antikoru aglElzincirli degisken bölge (VH) içerenleri kapsamakta olup, bu, bir insan CD3 kompleksinin e zincirinin hücre dlglllaniaki bir epitopa baglanmaktadlEI Tercih edilen bu tür CD3 baglama alanlarÇlbir bir OKT3 antikorunun (Proc. Natl. Acad. Sci. zincirli degisken bölge (VL) ve bir CD3 antikoru aglEzincirli degisken bölge (VH) içerenleri kapsamaktadlü Dahasüuygun olan bu tür CD3 baglama alanlarüarzu edilen özelliklere sahip olan bir CD3 antikorundan elde edilenleri kapsamakta olup, bunlar, yukar- açliZIanan yöntemelr vasllîislýla, arzu edilen bir hayvanli-Ji, insan CD3'ünü olusturan y zinciri, ö zinciri veya 8 zinciri ile immünize edilmesiyle elde edilmektedir. Bir CD3 baglama alanII elde edildigi uygun anti-CD3 antikorlarÇlinsan antikorlarIElve yukar- açlklandlgllîgibi uygun sekilde insansüâstlîllân antikorlarlîkapsamaktadlü CD3'ü olusturan y zinciri, ö zinciri ve E sekanslarljilarak gösterilmektedir (RefSeq erisim numarasüiarantezlerde gösterilmektedir. Polipeptit kompleksi Mevcut bulusun bir polipeptit kompleksinin yapElZlistemler taraflEUan tanIilanmaktadlElve genel olarak asagidakileri içermektedir (1) bir kanser antjeni baglama alanlîl (2) tanIilandiglEüzere indirgenmis Fcy reseptörü baglama aktivitesine sahip bir Fc alanEl içeren bir alan; ve (3) tanland[g]l:üzere bir CD3 baglama alanEblan bir T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanü Burada açllîlanan diger polipeptit kompleksleri, istenen bulusun arka plan.. ve alan.. tamamen anlasliüiaslîl/e gerekli olmasEdurumunda teknikte uzman kisi için yönlendirmenin saglanmasüislevi görmektedir. YukarIEIh açllZlanan alanlardan her biri peptit bagEI vasißslýla dogrudan baglantllândlEllâbilmektedir. Örnegin, (1) F(ab')2 antijen baglama alanlîl olarak kullanHBwaktadlElve (2) indirgenmis Fcy reseptörü baglama aktivitesine sahip bir Fc alanEilse indirgenmis Fcy reseptörü baglama aktivitesine sahip bir Fc alanüiçeren alan olarak kullanilBraktadlEl Bu durumda, antijen baglama alanEQl), bir peptit baglîil'aslüislýla (2)'nin Fc alanIülçeren alana baglandlgllda, baglanan polipeptit bir antikor yaplglîcblusturmaktadlîl Bu tür bir antikor, yukari aç[lZ]anan hibridomun kültür ortamII saflastlElllB1asEi/eya antikor olusturan polinükleotiti koslayan polinükleotiti stabil sekilde taslýan, arzu edilen konak hücrelerin kültür ortamII asflastlEIlB'iaslsîla hazlEIianabilmektedir. Genel olarak, (3)'ün CDB baglama alanII antikor yap- baglanmasEUurumunda, CD3 baglama alanl,__l peptit bagEIvaleislýla antikor yap-I sabit bölgesine ait C terminusa baglanabilmektedir. Bir baska yapllândlîilnada, CD3 baglama alanÇl antikor yap-I hafif zincirli degisken bölgesinin veya aglEIzincirli degisken bölgesinin N terminusuna peptit bagEl vasßsüa baglanmaktadlEl Diger yapllândIElnada, CD3 baglama alanÇlantikor yap-I hafif zincirli sabit bölgesnin C terminusuna peptit bagülasltâslýla baglanmaktadlB Baglanacak olan CD3 baglama alanüarzu edilen herhangi bir yaplýh sahip olabilmektedir, ancak, uygun olan bu tür bir CD3 baglama alanütercihen Fv ve daha terc scFv içermektedir. Antikor yap- baglanan CD3 baglama alanIlEl degerligi lellEllandlEllE1amaktadlü Bir iki degerlikli CD3 baglama alanII antikor yap_ baglanmasübin, CD3 baglama alanüpeptit bagülaslßislîla, antikor yap-I sabit bölgesini olusturan iki Fc alanII ilgili C terminisine baglanabilmektedir. Alternatif olarak, bir iki degerlikli CD3 baglama alanII antikor yap- baglanmasüçin, bir iki degerlikli scFv (yani sc(Fv)2), iki Fc alanII C terminusuna peprtit bagEl/asfriislîda baglanabilmektedir. Bu durumda, bir iki degerlikli scFv'nin (yani sc(Fv)2), antikor yaplîlßllîa] sabit bölgesini olusturan iki Fc alanIan yalnlîta birinin C terminusuna baglandlglEpolipeptit kompleksi, bir bispesifik antikordan elde edilen, yukar- açlKlanan bir PC alanII kullanllüîaslîla etkili sekilde üretilebilmektedir. Alternatif olarak, bir tek degerlikli CD3 baglama alanII antikor yap_ baglanmasEilçin, bir tek degerlikli scFv, iki Fc alanII C terminusuna peprtit bagEl/asltâsMa baglanabilmektedir. Bu durumda, bir tek degerlikli scFv'nin, antikor yap-I sabit bölgesini olusturan iki Fc alanIdan yalnlîta birinin C terminusuna baglandlgllîbolipeptit kompleksi, bir bispesifik antikordan elde edilen, yukarüla açllZlanan bir Fc alanII kullanllîhaslsîla etkili sekilde üretilebilmektedir. DahaslÇI (3)'ün CD3 baglama alanIII peptit bagElvaleislîila, antikor yap-I sabit bölgesinin C terminusuna baglanmasüdurumunda, uygun polipeptit kompleksleri, CD3 baglama alanlüilusturan agEzincirli Fv fragmentinin, Fc alanlüilusturan bir sabit bölgenin (CH3 alanDJC terminusuna baglandlglEl/e CD3 baglama alanIEblusturan hafif zincirli Fv fragmentinin, Fc alanIElolusturan sabir bölgenin (CH3 alanDîlC terminusuna baglandlgllîl kompleksleri kapsamaktadlü Bu durumda, GIy-GIy-GIy-Gly-Ser (SEKANS KIMLIK NUMARASI:7) gibi uygun bir baglaylEÇlhafif zincirli veya agElzincirli Fv fragmentinin, sabit bölgenin (CH3 alanmc terminusuna baglanmasüçin eklenmektedir. BaglaylîEiçerisindeki tekrar saylgßllîllandlîlli'iamaktadü ancak, 1 ila 10, tercihen 2 ila 8 veya daha tercihen 2 ila 6'dan seçilmektedir. Spesifik olarak, [GIy-GIy-GIy-GIy-Ser] (SEKANS KIMLIK NUMARASI:7) mümkündür. Alternatif olarak, CD3 baglama alanIIZblusturan aglElzincirli Fv fragmentinin, Fc alanIEl olusturan bir sabit bölgenin (CH3 alanDîlC terminusuna baglandiglEl/e CD3 baglama alanIEl olusturan hafif zincirli Fv fragmentinin, Fc alanIEblusturan sabit bölgenin (CH3 alanLIlC terminusuna baglandlglEbir polipeptit kompleksi üretildiginde, agEzincirli Fv fragmenti ve hafif zincirli Fv fragmenti araleUaki disülfür baglari& olusumunu mümkün kllân amino asit kallEtHârII uygun degisimleri, aglEl zincirli Fv fragmenti ve haûf zincirli Fv fragmenti aralehaki birlesmenin genisletilmesinde kullanllâbilmektedir. Bir baska yapllândlElnada, CD3 baglama alanIlZblusturan agElzincirli Fv fragmentinin, Fc alanIlZblusturan bir sabit bölgenin (CH3 alanmC terminusuna baglandlglüie CD3 baglama alanIlîrblusturan hafif zincirli Fv fragmentinin, Fc alanIlîcblusturan sabit bölgenin (CH3 alanm C terminusuna baglandigiEbir polipeptit kompleksi üretildiginde, aglElzincirli Fv fragmenti ve hafif zincirli Fv fragmenti arasIaki birlesmenin genisletilmesi için antikor CH1 ve CL alanlari: aglEIzincirli Fv fragmenti ve hafif zincirli Fv fragmeninden her birine baglanabilmektdir. Bir baska yapüândlîilnada, bir iki degerlikli CD3 baglama alanII antikor yap_ baglanmasü için, bir tek degerlikli CD3 baglama alanüpeptit bag Üasßsüa, iki hafif zincirli sabit bölgenin ilgili C terminisine veyaantikor yap-I hafif zincirli degisken bölgelerinin ilgili N terminisine baglanabilmektedir. Alternatif olarak, bir iki degerlikli CD3 baglama alanII antikor yap- baglanmasüçin, bir iki degerlikli scFv (yani sc(Fv)2), peptit bagÜ/asißsüla, iki hafif zincirli sabit bölgenin ilgili C terminisine veya hafif zincirli degisken bölgelerin ilgili N terminisine baglanabilmektedir. Bu durumda, bir iki degerlikli scFv'nin (yani sc(Fv)2), antikor yap-I iki hafif zincirli degisken bölgelerinden birinin C veya N terminusuna baglandogüpolipeptit kompleksleri, bir bispesifik antikordan elde edilen, yukari açiElanan bir Fc alanII kullanllîhasüla etkili sekilde üretilebilmektedir. Alternatif olarak, bir tek degerlikli CD3 baglama alanII antikor yap_ baglanmasüçin, bir tek degerlikli scFv, iki hafif zincirli degisken bölgeden birinin C veya N terminusuna peptit bagü/asitîhslýla baglanabilmektedir. Bu durumda, bir tek degerlikli scFv'nin, antikor yap-IE] iki hafif zincirli degisken bölgelerinden bir hafif zinvirli degisken bölgesinin C veya N terminusuna baglandglgmevcut bulusun polipeptit kompleksleri, bir bispesifik antikordan elde edilen, yukarlîilb açilZIanan bir Fc alanII kullanilmaslsîla etkili sekilde üretilebilmektedir. Bir baska yapilândßnada, bir iki degerlikli CD3 baglama alanII antikor yap_ baglanmaslîl için, bir tek degerlikli CD3 baglama alanüpeptit bagEl/asitjislsîla, iki agEzincirli degisken bölgenin ilgili N terminisine baglanabilmektedir. Alternatif olarak, bir iki degerlikli CD3 baglama alanII antikor yap_ baglanmasüçin, bir iki degerlikli scFv (yani sc(Fv)2), iki agEl zincirli degisken alandan birinin N terminusuna peptit bagIZI vasfâhslýla baglanabilmektedir. Bu durumda, bir iki degerlikli scFv'nin (yani sc(Fv)2), antikor yap-I iki aülElzincirli degisken bölgelerinden birinin N terminusuna baglandlgilîpolipeptit kompleksleri, bispesifik antikordan elde edilen, yukari açiEIanan bir Fc alanII kullanHBnasMa etkili sekilde üretilebilmektedir. Alternatif olarak, bir tek degerlikli CD3 baglama alanII antikor yap_ baglanmasüçin, bir tek degerlikli scFv, iki agIEzincirli degisken bölgeden birinin N terminusuna peptit bagüvasüslýla baglanabilmektedir. Bu durumda, bir tek degerlikli scFv'nin, antikor yap-I iki agIE zincirli degisken bölgelerinden birinin N terminusuna baglandigiü mevcut bulusun polipeptit kompleksleri, bir bispesifik antikordan elde edilen, yukar- açlEIanan bir Fc alanII kullanlEnasEla etkili sekilde üretilebilmektedir. DahasÇlyukarI açlKlanan bir polipeptit kompleksi, her bir alan. peptit bagEl/asltâslîla baglanmasEl/eya bir peptit baglaylEEi/asüâslýla peptit baglamasElle üretilebilmektedir. Bu durumda, kullanllâcak olan baglaym bir örnek olarak yukarldh açlKlanan baglaylEIîLDve örnegin His-etiketi, HA-etiketi, myc-etiketi, veya FLAG-etiketi gibi bir peptit etiketine sahip uygun baglaylîllârlîkapsamaktadß Ilaveten, hidrojen baglamasüdisülfür baglantlgükovalent bag veya iyonik etkiletsim veya bunlari bir kombinasyonuna dayanarak, ortak baglama özelliginin kullanHBwasEltercih edilmektedir. Örnegin, CH1 ve CL arasIaki afinitenin kullanilîhasümümkündür ve bir bispesifik antikordan elde edilen, yukar- açiElanan Fc alanlarÇIFc alanlarII hetermomerik birlesmesi için kullan Hâbilmektedir. DahasÇIalanIar arasEl disülfür baglarütercihen Örnekler'de açlEIand @Emzere kullan Hâbilmektedir. Polipeptit kompleksinin bir baska yap-a, örnegin, bir tek degerlikli Fv ve bir tek degerlikli Fab, (1) antijen baglama alanlîblaral tercihen kullanllüiaktadE Bu durumda, asag-ki yapü kullanilB1aktadlE Tek degerlikli Fv'nin aglEIzincirli Fv fragmenti (VH) veya hafif zincirli Fv fragmenti (VL), aglîlzincirli CH1 alan. peptit bagEi/asltaslîla baglanmaktadB AgIElzincirIi CH1 alanü mevcut bulusun polipeptit kompleksini olusturan, indirgenmis Fcy reseptörü baglama aktivitesine sahip olan iki Fc alanIan (2) birine, peptit bagüvasltâslýla baglanmaktadlEI Tek degerlikli Fv'nin diger VL veya VH fragmenti ise, disülfür bagüasfûslýla aglEl zincirli CH1 alan. baglanan hafif zincirli CH alan. peptit bagüvaslßslýla baglanmaktadlEI Dolaylîlîila, süslîla aglElzincirli CH1 alan. ve hafif zincirli CL alan- baglanan VH ve VL, bir antikor baglama alanEblusturmaktadB Hem (1) antikor baglama alanIEhem de (3) CD3 baglama alanlülusturan sc(Fv)2, yukarlEIh açllZIanan ikisinin diger Fc aIanII N terminusuna, peptit bagENasEislýla baglanabilmektedir. Bu durumda, agEl zincirli CH1 alanIIEI, peptit baglîlasßslýla, polipeptit kompleksini olusturulan iki Fc alan-an birine baglandlIIlÜ/e sc(Fv)2'nin diger Fc alan. peptit bagEi/asliiislýla bagland[gl|:lbir yaplýla sahip olan bir polipeptit kompleksi, bir bispesifik antikordan elde edilen, yukarlîtlla açilZIanan Fc alanII kullanmaslîla üretilebilmektedir. Yukar- açlElanan polipeptit kompleksi, her bir alani peptit bagüasßslýla baglanmasül'eya bir peptit baglaymaslüslýla peptit baglamasEl ile Üretilebilmektedir. Bu durumda, kullanilâcak olan baglayEZI bir örnek olarak yukarEIia açllZIanan baglayIEMBl/e örnegin His-etiketi, HA-etiketi, myc-etiketi, veya FLAG-etiketi gibi bir peptit etiketine sahip uygun baglaylElErEkapsamaktadlE Polipeptit kompleksinin tercih edilen bir baska yap-a, örnegin, bir iki degerlikli scFv de (1) antijen baglama alanEbIarak kullan[lIJ'1aktad|EI YapII bir yapüândlîmasia, iki degerlikli scFv'lerden birinin, indirgenmis Fcy reseptörü aktivitesine sahip iki (2) Fc alanIan birine, peptit bagllracümilýla, (3) CD3 baglama alanIüJIusturan VH vasißslýla baglandigiüle diger iki degerlikli scFv'nin ise, indirgenmis Fcy reseptörü baglama aktivitesine sahip iki (2) Fc alanlEhlan birine, peptit bagEbracIDgIEa, (3) CD3 baglama alanIEblusturan VL vasßslîla baglantiglllir polipeptit kompleksinin üretilmesi de mümkündür. Bu durumda, bir bispesifik antikordan elde edilen, yukari açklanan Fc alanII kullanilBiasünümkündür. Yukarlah açlklanan polipeptit kompleksi, her bir alanlEJ peptit bagEi/asitâslîla baglanmasEl veya bir peptit baglaylîljvasltâslîla peptit baglamasEile üretilebilmektedir. Bu durumda, kullanilâcak olan baglayiELîlbir örnek olarak yukari açiElanan baglaylîlýÜ/e örnegin His- etiketi, HA-etiketi, myc-etiketi, veya FLAG-etiketi gibi bir peptit etiketine sahip uygun baglaylEllârEkapsamaktadB Bir iki degerlikli scFv'nin (1) antijen baglama alanEblarak kullan[gü yap bir baska yapilândlîrlnaslütla, iki degerlikli scFv'lerden birinin, indirgenmis Fcy reseptörü aktivitesine sahip iki (2) Fc alanEUan birine, (3) CD3 baglama alanIEIqusturan peptit bagEIscFv vasßslýla baglandigiÜ/e diger iki degerlikli scFv'nin ise, indirgenmis Fcv reseptörü baglama aktivitesine sahip iki (2) Fc alanIan digerine, diger peptit bagEi/asißislîla baglandigilîbir polipeptit kompleksinin üretilmesi mümkündür. Bu durumda, antijen baglama alanIEl olusturan scFv'nin, polipeptit kompleksini olusturan iki Fc alanlütlan birine, CD3 baglama alanlßlusturan scFv vasißslýla peptit bagüracUJgilîla baglandlglül/e antijen baglama alanIEI olusturan scFv'nin, diger Fc alan. peptit bag Dasiüslîla bagland [giElbir polipeptit kompleksi, bir bispesifik antikordan elde edilen, yukarlî'lh açilîlanan bir Fc alanII kullanllüiaslîla üretilebilmektedir. YukarlEIh açiElanan polipeptit kompleksi, her bir alan. peptit bagEI vasitâslýla baglanmasi: veya bir peptit baglaylEEI vasltâslýla peptit baglamasEl ile üretilebilmektedir. Bu durumda, kullanilâcak olan baglaylîü bir örnek olarak yukar- açilZIanan baglaylîlîüe örnegin His-etiketi, HA-etiketi, myc-etiketi, veya FLAG-etiketi gibi bir peptit etiketine sahip uygun baglaylîllârEkapsamaktadlE Mevcut bulusun polipeptit kompleksine göre, hem antijen baglama alanljiem de T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanü tek degerlikli Fab yap-E YapEI bir yapilând Elnasia, antijen baglama alanlüneydana getiren bir tek degerlikli Fab'nin bir aglîl zincirli Fv fragmentinin, bir Fc alanIlIrIneydana getiren bir polipeptite bir CH1 alanüiasüislîda baglant[gll:l/e Fab'nin bir hafif zincirli Fv fragmenti bir CL alanlEia baglanlHken, T hücresi reseptörü baglama alanIEIqusturan Fab'nin bir aglEl zincirli Fv fragmentinin, Fc alanIü olusturan diger polipeptite bir CH1 alanÜ/asißslýla baglandigiü/e Fab'nin bir hafif zincirli Fv fragmentinin bir CL alan. baglandlgiEliiir polipeptit kompleksinin üretilmesi mümkündür. YaplEllEl bir baska yapllândlElnaletla, antijen baglama alanlElElmeydana getiren bir tek degerlikli Fab'nin bir aglE zincirli Fv fragmentinin, bir PC alanIDmeydana getiren bir polipeptite bir CH1 alanEl/aslßslýla baglandlglü/e Fab'nin bir hafif zincirli Fv'si bir CL alan. baglanlEiken, T hücresi reseptörü baglama alanIEIolusturan Fab'nin bir hafif zincirli Fv fragmentinin, Fc alanIIZblusturan diger polipeptite bir CH1 alanüiaslûsüa baglandfgEl/e Fab'nin bir aglElzincirli Fv fragmentinin bir CL alan. baglandlglüiir polipeptit kompleksinin üretilmesi de mümkündür. Alternatif olarak, T hücresi reseptörü baglama alanIEmeydana getiren bir tek degerlikli Fab'nin bir aglElzincirli Fv fragmentinin, bir Fc alanIElneydana getiren bir polipeptite bir CH1 alanEl/asßsMa baglandlg'lEl/e Fab'nin bir hafif zincirli Fv fragmenti bir CL alan. baglanlElken, antijen baglama alanIEblusturan Fab'nin bir hafif zincirli Fv fragmentinin, Fc alanIIZlolusturan diger polipeptite bir CH1 alanüvaslßslýla baglandlglÜ/e Fab'nin bir aglElzincirli Fv fragmentinin bir CL alan. baglandlglübir polipeptit kompleksinin üretilmesi de mümkündür. YaplElI bir baska yapllândlîilnasia, antijen baglama alanlElümeydana getiren bir tek degerlikli Fab'nin bir aglü zincirli Fv fragmentinin, bir Fc alanIElmeydana getiren bir polipeptite bir CH1 alanü/aslßslýla baglandlglü/e Fab'nin bir hafif zincirli Fv fragmenti bir CL alan. baglanlEken, T hücresi reseptörü baglama alanIlIrl)lusturan Fab'nin bir aglEzincirli Fv fragmentinin, Fc alanIEblusturan diger polipeptite bir CL alanEl/asßslîcla baglandlgllîlie Fab'nin bir hafif zincirli Fv fragmentinin bir CH1 alan. baglandlglübir polipeptit kompleksinin üretilmesi de mümkündür. Alternatif olarak, T hücresi reseptörü baglama alanIEmeydana getiren bir tek degerlikli Fab'nin bir aglîlzincirli Fv fragmentinin, bir Fc alanIErneydana getiren bir polipeptite bir CH1 alanEli/asßslîla baglandlglEl/e Fab'nin bir hafif zincirli Fv fragmenti bir CL alan. baglanElken, antijen baglama alanIIIcblusturan Fab'nin bir agEzincirli Fv fragmentinin, bir Fc alanlßlusturan diger polipeptite bir CL alanlîxl'aslüslýla bagland @Ele Fab'nin bir haüf zincirli Fv fragmentinin bir CH1 alan. baglandl'gllîlbir polipeptit kompleksinin üretilmesi de mümkündür. Ayrüa, hem antijen baglama alanlJiem de T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanIlEl, tek degerlikli Fab'nin bir yaplglîbldugu ve tercih edilen polipeptitlerin, asaglöhkilere sahip olanlarllapsadgllîiliolipeptit kompleksinin bir baska yaplîlîclla burada açlEanmaktadlE (1) bir antijene baglanan bir tek degerlikli Fab yap-[El bir aglElzincirli Fv fragmentinin, bir Fc alanljblusturan, yukar- açiklanan polipeptitlerden birine bir CH1 alanü/aslßslýla baglandlgüie Fab yap-I bir hafif zincirli Fv fragmentinin ise bir CL alan. baglandlglEl bir antijen baglama alanElve (2) bir T hücresi reseptörü kompleksine baglanan bir tek degerlikli Fab yapElüllEl bir hafif zincirli Fv fragmentinin bir Fc alanIüblusturan diger polipeptite bir CH1 alanüiasllîiislîla baglandlglElIe Fab yap-I bir hafif zincirli Fv fragmentinin ise bir CL alan. bagland[gll:l bir T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanlî.] ve burada, CH1 ve CL alanlarI elektrik yükleri kontrol edilmektedir, böylelikle antijen baglama alanlElI aglElzincirli Fv fragmenti, antijen baglama alanII hafif zincirli Fv fragmenti Ile birlestirilmektedir veya T hücresi reseptörü baglama alanII aglEzincirli Fv fragmenti, T hücresi reseptörü baglama alanIlfil hafif zincirli Fv fragmenti ile birlestirilmektedir. Bu yapllândlîilnada, CH1 ve CL alanlarII elektrik yükleri kontrol edildigi, böylelikle antijen baglama alanII aglElzincirli Fv fragmentinin, antijen baglama alanII hafif zincirli Fv fragmenti ile birlestirildigi veya T hücresi reseptörü baglama alanII agE zincirli Fv fragmentinin, T hücresi reseptörü baglama alanII hafif zincirli Fv fragmenti ile birlestirildigi sürece, polipeptit kompleksinin yapEleontrollü birlesime sahip yapLIJ belirli bir yapEile sIlEllandlElIEnamaktadlEl Kontrollü birlesime sahip yapII bir yapllândlElnasIa, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII aglElzincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kaIlEtllârIIEl, antijen baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanII amino asit kalEtllârElile aynEIelektrik yüklerine sahip oldugu bir polipeptit kompleksinin üretilmesi mümkündür. Kontrollü birlesime sahip yapII bir yapllând lEinaleUa, antijen baglama aIanII agEzincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtllârIlEl, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanIlEl amino asit kallEtllârElle aynlîlektrik yüklerine sahip oldugu bir polipeptit kompleksinin üretilmesi mümkündür. Kontrollü birlesime sahip yapII bir yapilândlElnasIa, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII aglElzincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtUârIlEl, antijen baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanII amino asit kalütllârüle aynlllektrik yüklerine sahip oldugu ve antijen baglama alanII agEzincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtllârlEllEl, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII haüf zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanIlEl amino asit kallEtllârElle ayri Elektrik yüklerine sahip oldugu bir polipeptit kompleksinin üretilmesi mümkündür. Kontrollü birlesime sahip yaplElI bir baska yapllândlünaslüba, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII aglîlzincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtllârIlEl, antijen baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanII amino asit kallEtHârEile aynlîêlektrik yüklerine sahip oldugu ve T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII aglEzincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtHârIlEl, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanII amino asit kallEtllâr- zlîl elektrik yüklerine sahip oldugu bir polipeptit kompleksinin üretilmesi mümkündür. Kontrollü birlesime sahip yapII bir diger yapllând lîilnasIa, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII aglElzincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallîitllârIlEl, antijen baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanII amino asit kallEtllârElle aynElelektrik yüklerine sahip oldugu; antijen baglama alanII aglElzincirIi Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtllârIE, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanIlEl amino asit kalIEtllârEiIe aynßlektrik yüklerine sahip oldugu; ve T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII aglEl zincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtIErIlEl, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanlEllEl hafif zincirli Fv fragmentine bagsanan CL alanII amino asit kallîitllâr- z[t] olan elektrik yüklerine sahip oldugu bir polipeptit kompleksinin üretilmesi mümkündür. Kontrollü birlesime sahip yapIlEl bir baska yapllândlîilnasIa, antijen baglama alanII aglEl zincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallîitllârIIEl, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanII amino asit kallEtllârEile aynEéIektrik yüklerine sahip oldugu veantijen baglama alanlElI aglElzincirIi Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtllârIlEl, antijen baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanII amino asit kalütllârl zlfîlelektrik yüklerine sahip oldugu bir polipeptit kompleksinin üretilmesi mümkündür. Kontrollü birlesime sahip yapII bir alternatif yapHândlElnasIa, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII aglElzincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtllârIE, antijen baglama alanlEllEl hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanII amino asit kallEtHârEile aynlZlalektrik yüklerine sahip oldugu; antijen baglama alanIlEI aglEl zincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtllârIlEl, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanII amino asit kallEtilârEille aynlîêalektrik yüklerine sahip oldugu; ve antijen baglama alanII aglEzincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallûtllârllûl, antijen baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine bagsanan CL alanII amino asit kallEtilâr- ziEloIan elektrik yüklerine sahip oldugu bir polipeptit kompleksinin üretilmesi mümkündür. Kontrollü birlesime sahip yapII bir diger yapllând lîilnasIa, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII agIElzincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kalEtilârIIEl, antijen baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanII amino asit kallEtllârElle aynEblektrik yüklerine sahip oldugu; antijen baglama alanII aglElzincirIi Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtiiârIlEl, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanIIEl amino asit kallEtllârElIe aynEblektrik yüklerine sahip oldugu; T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanII agB zincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kallEtlErIlEl, T hücresi reseptörü kompleksi baglama alanlElI hafif zincirli Fv fragmentine bagsanan CL alanII amino asit kaliîitllâr. ziElolan elektrik yüklerine sahip oldugu; ve antijen baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CH1 alanII amino asit kaliEtilârIlEl, antijen baglama alanII hafif zincirli Fv fragmentine baglanan CL alanII amino asit kallEtilârI zllîlolan elektrik yüklerine sahip oldugu bir polipeptit kompleksinin üretilmesi mümkündür. CH1 ve CL alanlarII elektrik yüklerinin kontrolü T hücresi reseptörü baglama alanII aglîlve hafif zincirleri vasfglislýla T hücresi reseptörü baglama alan.. bir epitopunu tanlýlan bir bispesifik polipeptit kompleksinin ve antijen baglama alanII hafif ve aglîlzincirleri vasüslýla bir antijenin bir epitopunun elde edilmesi için, teorik olarak, polipeptit kompleksi üretilirken dört zincirden her birinin eksprese edilmesi durumunda, on tip polipeptit kompleksi molekülü üretilmektedir. Bununla birlikte, örnegin, T hücresi reseptörü baglama alanII aglEl zinciri ve antijen baglama alanlEJE] hafif zinciri araleblaki birlesmenin ve/veya antijen baglama alanII aglEl zinciri ve T hücresi reseptörü baglama alanlElEl hafif zinciri arasIaki birlesmenin inhibe edilmesi için alanlarI kontrol edilmesi vasißislýla, arzu edilen polipeptit kompleksi tercihen elde edilebilmektedir. Örnekler; T hücresi reseptörü baglama alanII ag Ezincirli CH1'i ve antijen baglama alanII hafif zincirli CL'si arasIaki bir arayüzü olusturan amino asit kallEtiIârIlEJ, pozitif olarak yüklenmis amino asit kallEtHârlIrblarak degistirilmesini ve antijen baglama alanII aglElzincirIi CH1'i ve T hücresi reseptörü baglama alanII hafif zincirli CL'si arasIiaki bir arayüzü olusturan amino asit kalßtüârlßl, negatif olarak yüklenmis amino asit kalütllârüolarak degistirilmesini kapsamaktadlEl Bu tür degisimlerin bir sonucu olarak, T hücresi reseptörü baglama alanlElI aglEzincirli CH1'i ve antijen baglama alanII haûf zincirli CL'si arasIaki istenmeyen bir birlesme önlenmektedir, zira, amino asit kallEtllârII elektrik yüklerinin ikisi de pozitiftir ve antijen baglama alanlElI aglEIzincirli CH1'i ve T hücresi reseptörü baglama alanII hafif zincirli CL'si arasIaki istenmeyen birlesme de önlenmektedir, zira arayüzü olusturan amino asit kallEtllârIlEl ikisi de negatiftir. Mevcut bulusun arzu edilen polipeptit kompleksi, T hücresi reseptörü baglama alanII aglElzincirIi CH1'i ve T hücresi reseptörü baglama alanII hafif zincirli CL'si arasIaki arzu edilen birlesmenin yanüslü, antijen baglama alanII aglElzincirli CH1'i ve antijen baglama alanII hafif zincirli CL'si araleUaki arzu edilen birlesmenin bir sonucu olarak etkili bir sekilde üretilebilmektedir. DahaslÇlT hücresi reseptörü baglama aIanII aglîlve hafif zincirleri arasIaki arzu edilen birlesme, tercihen desteklenmektedir, zira arayüzü olusturan amino asit kallEtlIârEbirbirinden farklü elektrik yüklerine sahiptir. Antijen baglama alanII aglEI ve hafif zincirleri araletlaki arzu edilen birlesme de tercihen desteklenmektedir, zira arayüzü olusturan amino asit kallEtllârlîl birbirinden farklEblektrik yüklerine sahiptir. Bu, mevcut bulusun bir polipeptit kompleksinin, arzu edilen birlesme ile etkili sekilde üretilmesini mümkün küüîaktadlü DahasÇlmevcut bulustaki birlesmenin kontrolü, ayrlEa, CHI'Ier (T hücresi reseptörü baglama alanü/e antijen baglama alanIlEl aglElzincirleri) araletIaki veya CL'Ier (T hücresi reseptörü baglama alanIZi/e antijen baglama alanII hafif zincirleri) arasEUaki birlesmenin önlenmesi için de kullanllâbilmektedir. Teknikte uzman kisiler, mevcut bulusa göre birlesmesinin kontrol edildigi arzu edilen polipeptit komplekslerinde, birlesme üzerinde CH1/CL arayüzünde birbirine yakI sekilde konumlandlîllân amino asit türlerini uygun bir sekilde bulabilmektedir. DahasÇIhalka adla veri tabanlari. veya benzerinin kullanllüîaslîda, teknikte uzman kisiler, Insan, maymun, fare veya tavsan gibi bir organizmadaki kullanllâbilen antikor CH1 ve CL'yi uygun bir sekilde bulabilmektedir. Daha spesifik olarak, CH1 ve CL'nin amino asit sekanslZl bilgisi, asag. Örnekler'de açlKlanan yöntemleri vaslüislwa elde edilebilmektedir. Spesifik olarak, asagthki açlKlanan Örnekler'de gösterildigi üzere, T hücresi reseptörü baglama alanljl'eya antijen baglama alanlßlusturan VH ve VL'ye süsüla baglanan CH1 ve CL arasIaki birlesme üzerine CH1/CL arayüzünde birbirine yakI sekilde (birbirine bakan veya temas eden) konumlandlîllân amino asit kallEtllârII kombinasyonlari. spesifik örnekleri asag-kileri ka psamaktadlü - CHl'deki (örnegin, SEKANS KIMLIK NUMARASlzl'deki amino asit sekansiiia bulunan pozisyon 147) pozisyon 147'de (EU numaralandlElnasDîl bulunan lisin (K) ve buna bakan (temas eden) CL'deki pozisyon 180'de (EU numaraland lElnasmbulunan treonin (T); - CHl'deki pozisyon 147'de (EU numaralandlünaslllbulunan lisin (K) ve buna bakan (temas eden) CL'deki pozisyon 131'de (EU numaralandlîilnasmbulunan serin (5); - CH1'deki pozisyon 147'de (EU numaralandlElnasmbulunan lisin (K) ve buna bakan (temas eden) CL'deki pozisyon 164'te (EU numaralandlElnasmbulunan treonin (T); - CH1'dekI pozisyon 147'de (EU numaralandlElnasEIl bulunan lisin (K) ve birbirine bakan (temas eden), CL'deki pozisyon 138'de (EU numaralandlElnasDJbulunan asparajin (N); - CH1'deki pozisyon 147'de (EU numaralandlElnasDIlbulunan lisin (K) ve buna bakan (temas eden) CL'deki pozisyon 123'te (EU numaralandlElnasEIlbulunan glutamik asit (E); - CHl'deki pozisyon 175'te (EU numaralandlülnasD] bulunan glutamin (Q) ve buna bakan (temas eden) CL'deki pozisyon 160'ta (EU numaralandlElnasLIlbulunan glutamin (Q); - CH1'deki pozisyon 213'te (EU numaralandlîilnasmbulunan Iisin (K) ve buna bakan (temas eden) CL'deki pozisyon 123'te (EU numaralandlEinasmbulunan glutamik asit (E); Bu pozisyonlar, Kabat i/e mes/ektas/arÜKabat EA ve meslektaslarlÇI 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH) referanledaki dokümana göre numaralandlElllBiaktadlEl Burada, EU numaralandlîllüiaslîlile gösterilen numaralar, EU numaralandlElnas- göre atanmaktadEI(Sequences of proteins of immunological interest, NIH YayI No:91-3242). Mevcut bulusta, "pozisyon X'teki (EU numaralandlElnasD] amino asit kallEtElZl ve "pozisyon X'teki (EU numaralandlîilnasLIl amino asit" (burada X rastgele bir numaradlE) ifadeleri, numaralandülnasDZlkarslüß gelen amino asit" ile degisimli sekilde kullanilBiaktadB Asaglki Örnekler'de açlEIandigllZlüzere, arzu edilen bir polipeptit kompleksi, amino asit kallEtilârII degistirilmesi ve mevcut bulusun yöntemlerinin uygulanmaslýla tercihen elde edilebilmektedir. Yukari açllZIanan amino asit kallütllârIlEl, insan ve maymunda fazlaca bulundugu polipeptit komplekslerinden farkIEloIan mevcut bulusun bir polipeptit kompleksinin sabit bölgesindeki CH1 ve CL arasIdaki birlesme, ayrlEla, yukari açllîlanan amino asit kallEtllârI karslIiIZl gelen amino asit kallEtüârII degistirilmesiyle de kontrol edilebilmektedir. Spesifik olarak, aglElzincirIi ve hafif zincirli arasIaki kontrollü birlesmeye sahip polipeptit kompleksleri açlElanmakta olup, burada asag-ki (a) ila (f)'de açllZIanan amino asit kallütllârEl çiflerinden seçilen biri, ikisi veya daha fazlasüiynßlektrik yüklerine sahiptir: (a) CHl'deki pozisyon 147'deki (EU numaralandlElnasDZl amino asit kallEtlîElve CL'deki pozisyon 180'deki (EU numaralandlîilnasDglamino asit kallîîtlîlü (b) CH1'deki pozisyon 147'deki (EU numaralandlElnastIl amino asit kaIlEtlgElve CL'deki pozisyon 131'deki (EU numaralandlûnasmamino asit kallEtEE (c)CH1'deki pozisyon 147'deki (EU numaralandlEinasDJ amino asit kallEtIîElve CL'deki pozisyon 164'deki (EU numaralandlîilnasiîlamino asit kallEtlglîl (d)CH1'deki pozisyon 147'deki (EU numaralandünasiîl amino asit kallEtlEDve CL'deki pozisyon 138'deki (EU numaralandlülnasmamino asit kaIlEtElîl (e) CHl'deki pozisyon 147'deki (EU numaralandlEnasDîl amino asit kallEtlîElve CL'deki pozisyon 123'deki (EU numaralandlîilnasmamino asit kaIlEtEE (f) CHl'deki pozisyon 175'deki (EU numaralandlElnasD] amino asit kallEtlgElve CL'deki pozisyon 160'daki (EU numaralandlîilnasmamino asit kallEtEü DahasÇl bir baska yapilândünada antikorlar açlk`]anmakta olup, burada asagIki (g)'de açlElanan amino asit kallEtlEEÇiftindeki amino asit kallEtUârüsununla aynElelektrik yüküne sahiptir: (9) CHl'deki pozisyon 213'teki (EU numaralandlElnasDZlamino asit kallEtlîIJe CL'deki pozisyon 123'teki (EU numaralandlElnasDJamino asit kaIlEtlgD Yukari açlElanan çiftlerden her birindeki amino asit kallEtUârÇl asag-ki Örnekler'de açllZIandlgEüzere birlesme üzerine birbirine yaklEl sekilde konumlandlEIIBiaktadE Homoloji modellemesi veya piyasada mevcut olan yazHJEiI kullan-[glîtliger yöntemleri vasltâslgla, teknikte uzman kisiler, yukar-ki (a) ila (g)'de aç[Elanan amino asit kallEtilârI karslHEJ gelen, arzu edilen bir CH1 veya CL'de amino asit pozisyonlarIEIbulabilmektedir ve uygun bir sekilde, bu pozisyonlardaki amino asit kallEtilârllîcliegistirebilmektedir. Yukari açiIZianan antikordaki b u tür bir "elektrik yüklü amino asit kaIlEtlîiZiörnegin, asagi açilZlanan (X) veya (Y) grubuna ait olan amino asit kaliEtiiârIan seçilebilmektedir: (X) glutamik asit (E) ve aspartik asit (D); ve (Y) ise lisin (K), arjinin (R) ve hidtidin (H). Yukarlöh açiiZlanan poiipeptit komplekslerinde, "aynlîlelektrik yüküne sahip" ifadesi, örnegin, iki veya daha fazla amino asit kallEt-I yukar- açiKJanan gruplar (X) veya (Y)'den birine ait oldugu anlam. gelmektedir. Diger yandan, "ziEeIektrik yüküne sahip" ifadesi, örnegin, iki veya daha fazla amino asit kaIlEtiEü/ukariâa açiiZIanan gruplar (X) veya (Y)'den birine ait olan amino asit kaliEtilârlEia sahip iken, diger amino asit kaliEtilârIlEi, diger gruba ait olan amino asit kaliEtHârlEb sahip oldugu anlamIa gelmektedir. kaliEtiiârElile sIlEIlEldegildir. Homoloji modellemesi veya piyasada mevcut olan yaziIJEII kullanI[gil:tliger yöntemleri vasißslýla, teknikte uzman kisiler, bir mutant poiipeptit veya heterometik multimerde bir arayüz olusturan amino asit kallütilâriüiüuygun bir sekilde tanIiIayabiImektedir ve birlesmenin kontrol edilmesi için bu pozisyonlardaki amino asit kalEtilârIlîiliygun bir sekilde degistirebilmektedir. Hafif zincirli ve aglElzincirli degisken bölgeleri arasIdaki arayüze yük itmesinin verilmesi vasßslýia, ag lEIzincir ve hafif zincir araslîida arzu edilmeyen birlesmenin önlenmesine yönelik tekniklerde, aglîizincirli degisken bölge (VH) ve hafif zincirli degisken bölgesi (VL) araletlaki arayüzde birbiriyle temas halindeki amino asit kaliEtiiârÇl örnegin, agiEi zincirli degisken SEKANS KIMLIK NUMARASIzö'da bulunan amino asit sekansia pozisyon 39) bulunan glutamin (Q) ve buna bakan (temas eden) hafif zincirli degisken bölgede (FR2) pozisyon NUMARASI:8'de bulunan amino asit sekansIda pozisyon 44) bulunan glutamin (Q) içermektedir. Bu tür tercih edilen amino asit kalliîtiiârüayriîia, örnegin, aglEzincirli degisken SEKANS KIMLIK NUMARASIzö'da bulunan amino asit sekansIda pozisyon 45) bulunan lösin (L) ve buna bakan hafif zincirli degisken bölgede (FR2) pozisyon 44'de (örnegin WO asit sekanslBUa pozisyon 44) bulunan prolin (P) içermektedir. Bu pozisyonlar, Kabat ve mes/ektas/arQKabat EA ve meslektaslarEI1991. Sequence of Proteins of Immunological Yukari açlElanan amino asit kallEtHârIlEJ, insan ve maymunda fazlaca bulundugu polipeptit komplekslerinden farkllîblan antikor degisken bölgelerindeki VH ve VL araleUaki birlesme, ayrEla, yukar- açllZIanan amino asit kalEtElârlEla karsEIJKI gelen amino asit kallEtllârII degistirilmesiyle de kontrol edilebilmektedir. Daha spesifik olarak, aglBzincirli ve hafif zincirli degisken bölgelere sahip bu tür antikorlar, asagüla açilZlanan (1) ve (2), veya (3) ve (4)'deki amino asit kalEtllârII aynElelektrik yüklerine sahip oldugu antikorlarükapsamaktadE (1) aglBzincirli degisken bölgedeki pozisyon 39'a (EU numaralandlEnasDZl karsÜIKl gelen amino asit kallEtiîü (2) hafif zincirli degisken bölgedeki pozisyon 38'e (EU numaralandlElnasm kars[l]]ZJ gelen amino asit kallütßîl (3) agBzincirli degisken bölgedeki pozisyon 45'e (EU numaralandiElnasEl karsüllg gelen amino asit kallEtEII (4) hafif zincirli degisken bölgedeki pozisyon 45'e (EU numaralandiîilnasm kars[l]]Zl gelen amino asit kaIlEtlîlîl Yukarlâb açllZlanan (1) ve (2), veya (3) ve (4)'deki amino asit kaliEtllârÇIbirlesme üzerine birbirine yakI sekilde konumlandlüilBwaktadlEl Homoloji modellemesi veya piyasada mevcut olan yaz[[liîliI kullanIlglEdiger yöntemleri vaslüsüa, teknikte uzman kisiler, yukar-ki (1) ila (4)'te açllZJanan amino asit kallEtliâr- karsiIJKlgelen, arzu edilen bir agEzincirli veya hafif zincirli degisken bölgeyi uygun bir sekilde tanIiIayabiImektedir ve uygun bir sekilde, bu pozisyonlardaki amino asit kallEtllârIlîllegistirebilmektedir. Yukarüia açüîlanan antikorda, tercihen, "elektrik yüklü amino asit kallmörnegin, asaglîlia açlKlanan (X) veya (Y) grubuna ait olan amino asit kallEtHârIan seçilebilmektedir: (X) glutamik asit (E) ve aspartik asit (D); ve (Y) ise Iisin (K), arjinin (R) ve histidin (H). Genel olarak insan ve farede, yukari açlKIanan (1) ila (4)'ün amino asit kallEtllârßunlardlîi (1) glutamin (Q); (2) glutamin (Q); (3) Iösin (L); ve (4) prolin (P), slßslýla. Tercih edilen bir yapilândlülnada, yukar- açllZlanan amino asit kallilârEdegistirilmektedir (örnegin, yüklü bir amino asit grubuyla ikame). Yukari açllZlanan amino asit kallEtilârEU) ila (4) türleri, yukar- açllZlananlar ile sIlElllîrllegildir. Bu amino asitler, yukarElh açlKIananlara karsllîlEl gelen herhangi bir baska amino asit olabilmektedir. Örnegin, insan olmasEI durumunda, hafif zincirli degisken bölgedeki pozisyon 38'de (EU numaralandlElnasD] bulunan amino aside karslülîl gelen amino asit histidin (H) olabilmektedir. YayIanan dokümanlara teknikte uzman kisiler, hafif zincirde rastgele bir pozisyona karsllîllîl gelen amino asit kallEtEEI türünü bulabilmektedir ve dolayisiyla amino asit kallEt-ljliygun sekilde degistirebilmektedir (örnegin, yüklü bir amino asit ile ikame). AglEl zincirli ve hafif zincirli degisken bölgelerin araletlaki arayüzde hidrofobik merkezi olusturan amino asit kallEtllârElçin elektriksel olarak yüklü amino asitlerin ikame edilmesi vaslliisüla, agEzincir ve hafif zincir arasIaki istenmeyen birlesmenin önlenmesine yönelik tekniklerde, aglElzincirli degisken bölge (VH) ve hafif zincirli degisken bölge (VL) arasüdaki arayüzde hidrofobik merkezi olusturabilen, tercih edilen amino asit kallEtüârÇlörnegin, aglEl zincirli degisken bölgede pozisyon 45'teki Iösin (L) ve hafif zincirli degisken bölgede pozisyon 44'deki prolini (P) kapsamaktadlEI Genel olarak, bir "hidrofobik merkez" hidrofobik amino asitlerin yari zincirlerinin iliskili polipeptit içerisinde bir araya geldigi bir klgma isaret etmektedir. Hidrofobik amino asitler, örnegin alanin, izolösin, Iösin, metiyonin, fenilalanin, prolin, triptofan ve valini kapsamaktadlü Bu zaman zarflEUa, hidrofobik amino asitlerden (örnegin tirozin) farklElolan amino asit kallEtllârÇl ayrlEla, hidrofobik merkezin meydana getirilmesine de dahil edilebilmektedir. Hidrofilik amino asitlerin yan zincirlerinin dlgbrlýla maruz büklmnasian elde edilen hidrofilik yüzey ile birlikte, hidrofobik merkez, suda çözünen polipeptitlerin birlesmesinin baslatiiîhaslîl için bir itici güç olarak islev görmektedir. Iki farkllîialanl hidrofonik amino asitlerinin moleküler yüzeyde mevcut olmasül'e su moleküllerine maruz biEakHB1aslZd1urumunda, entropi artmakta olup, bu, serbest enerjideki bir artlgi ile sonuçlanmaktadlEi Dolayiglýla, iki alan, stabilizasyon için serbest eneijinin azaltilüiaslîbmacisîla birbiriyle birlesmektedir. Yüzeydeki hidrofobik amit asitler, bir hidrofobik merkezin olusturulmasEliçin molekülün içerisine gömülmektedir. Polipeptit birlesmesinde bir hidrofobik merkezi olusturan hidrofobik amino asitlerin, elektrik yüküne sahip polar amino asitler olarak degistirilmesi durumunda, hidrofobik merkezin meydana gelmesinin önlendigi düsünülmektedir. Bu, polipeptit birlesmesinin önlenmesi ile sonuçlanmaktad lü Bilinen diger teknolojiler de mevcut bulusun polipeptit komplekslerine uygulanabilmektedir. Örnegin, mevcut bulusun "degisimlerine" ilaveten, birinci VH (VH1) ve birinci VL (VL1) ve/veya ikinci VH (VH2) ve ikinci VL'nin (VL2) birlesmesinin baslatüîhasüiçin, H zinciri degisken bölgelerinden birinde bulunan amino asitler, daha genis bir yan zincire (nob; ç-D] sahip olanlar ile ikame edilmektedir ve diger H zinciri degisken bölgedeki amino asitler ise daha küçük bir yan zincire (delik; bosluk) sahip olanlar ile ikame edilmektedir, böylelikle nob deligin içerisinde konumlandülîhaktadü Bu, VH1 ve VL1 ve/veya VH2 veya VL2'nin birlesmesini baslatarak, VH1 ve VL2 arasEUaki ve/veya VH2 ve VL1 arasiEkjaki birlesmenin Yukarlâb açiiZJanan bir polipeptit kompleksinin üretiminde, her bir alan peptit bagÜ/asitîlisiýia veya bir peptit baglayßglîvasitîlisiýla peptit baglanmasEile baglanabilmektedir. Bu durumda, kullaniiâcak olan baglayiEJJbir örnek olarak yukar. açiKianan baglaylEJîEi/e örnegin His- etiketi, HA-etiketi, myc-etiketi, veya FLAG-etiketi gibi bir peptit etiketine sahip uygun baglaylîllârü veya bunlari bir kombinasyonuna dayanarak ortak baglanma özelliginin kullanilBiasEtercih edilmektedir. Örnegin, CH1 ve CL arasIdaki afinitenin kullanllfnasiîlmümkündür veya yukariîlia açiElanan, bir bîspesifik antikordan elde edilen Fc alanlarüFc alanlarII heteromerik birlesmesi için kullanliâbilmektedir. DahasÇl alanlar arasEl disülfür baglarü tercihen ÖRNEKLER'de açiiZlandiglEiDzere kullanilâbilmektedir. Mevcut bulusun polipeptit kompleksleri, örnegin, Sekiller 17, 19 ve 24'te gösterilen yapllândlElnalarERapsamaktadlE Mevcut bulusun polipeptit kompleksleri, rekombinant antikorlar. üretilmesine yönelik yukar- açlKlanan yöntemler ile aynlJöntemler vasltâslüa üretilebilmektedir. DahasÇI mevcut bulus, mevcut bulusun polipeptit kompleksini kodlayan polinükleotitler ile ilgilidir. Mevcut bulusun bir polipeptit kompleksi, herhangi bir ekspresyon vektörüne eklenebilmektedir. Uygun bir konak, polipeptit kompleksini eksprese eden hücrelerin elde edilmesi için ekspresyon vektör ile dönüstürülmektedir. Polinükleotit taraf-an kodlanan polipeptit kompleksi, polipeptit kompleksini eksprese eden hücrelerin kültürlenmesi ve kültür süpernatantldan ekspresyon ürününün toplanmasü'asltâslîla elde edilebilmektedir. Spesifik olarak, mevcut tarifname, mevcut bulusun polipeptit kompleksini kodlayan bir polinükleotit taslýlan vektörler, vektörleri içeren hücreler ve mevcut bulusun polipeptit kompleksinin üretilmesine yönelik yöntemler ile ilgilidir, burada hücreler kültürlenmektedir ve polipeptit kompleksi kültür süpernatantIan toplanmaktadlü Yukarlâla açllîlananlar, rekombinant antikorlar için yukarlöla açllîlanan teknolojiler vasltâslsîla elde edilmektedir. Farmasötik bilesim Mevcut bulus ayrIEla, kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesinde kullanIia yönelik terapötik maddeler ile ilgili olup, bir aktif içerik maddesi olarak mevcut bulusun polipeptit kompleksini içermektedir ve mevcut bulusun terapötik maddeleri tercihen kanser olan veya kanserin tekrar etmesi olaslllglII oldugu sujelere uygulanmaktadE Burada "bir aktif içerik maddesi olarak içermektedir" ifadesi, bir ana aktif içerik maddesi olarak polipeptit kompleksini içerme anlam- gelmektedir; ancak polipeptit kompleksinin içerik oran Blîllülegildir. Mevcut bulusa göre kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesinde kullanllâm yönelik bir terapötik madde, gerekli olmasEldurumunda farklEbolipeptit kompleksi türleri ile formüle edilebilmektedir. Örnegin, bir antijeni eksprese eden hücrelere karsßitotoksik faaliyet, aynEl antijene baglanan mevcut bulusun çoklu polipeptit komplekslerinin bir kokteyli vasltBisMa gelistirilebilmektedir. Alternatif olarak, terapötik etki farklElbir antijene karsElbir antijen baglama alanEliçeren diger polipeptit komplekslerî ile kombinasyon halinde bir kanser antijenine baglanan bir antijen baglama alanüiçeren mevcut bulusun bir polipeptit kompleksinin formüle edilmesi vasißslýla artlülâbilmektedir. Gerekli olmaslîl durumunda, mevcut bulusun polipeptit komplekslerî, mikrokapsüllerin (hidroksimetilselüloz, jelatin, poli[metilmetaktilat] ve benzerinden meydana getirilen mikrokapsüller) içerisinde kapsüllenebilmektedir ve kolloidal ilaç tasIia sistemlerinin bilesenleri (Iipozomlar, albümin mikrosferleri, mikroemülsiyonlar, nano-partiküller ve nano- kapsüller) haline getirilebilmektedir (örnegin, bakIlîl Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)). Dahasü yavas saIIiIEImaddeIer olarak maddelerin haziEIbnmas- yönelik yöntemler bilinmektedir ve bunlar, mevcut bulusun polipeptit Mevcut bulusa göre kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesinde kullanIia yönelik antikanser maddeler, hastalara oral yoldan veya parenteral olarak uygulanabilmektedir. Parental uygulama tercih edilmektedir. Spesifik olarak, bu tür uygulama yöntemleri enjeksiyon, nazal uygulama, transpulmoner uygulama ve perkütanöz uygulamayElkapsamaktadlEI Enjeksiyonlar örnegin, intravenöz enjeksiyonlar, intramüsküler enjeksiyonlar, intraperitoneal enjeksiyonlar ve subkütanöz enjeksiyonlarERapsamaktadB Örnegin, mevcut bulusa göre kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesinde kullanIia yönelik maddeler, enjeksiyon yoluyla lokal veya sistemik olarak uygulanabilmektedir. DahasÇiuygun uygulama yöntemleri hastanI yas. ve semptomlara göre seçilebilmektedir. Uygulanan doz, örnegin her bir uygulama için vücut aglEliigiEkg bas. 0.0001 mg ila 1,000 mg aral[gllrîk:lan seçilebilmektedir. Alternatif seçilebilmektedir. Ancak, mevcut bulusa göre kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesinde kullanla yönelik bir terapötik madde bu dozlar ile sIlHiiIrliegildir. Mevcut bulusa göre kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesinde kullanIia yönelik terapötik madde konvansiyonel yöntemlere göre formüle edilebilmektedir (örnegin Remington's Pharmaceutical Science, son baskiZl Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.) ve ayrlîia, farmasötik olarak kabul edilebilir taslsîIEEr ve katkEmaddeleri içerebilmektedir. Örnekler, bunlarla sIiEIIIJJImamak üzere, yüzey etkin maddeleri, eksipiyanlar, renklendirme maddeleri, tatlandiEIEEmaddeler, koruyucular, stabilizörler, tamponlar, süspansiyon maddeleri, izotonik maddeler, baglaylîEimaddeler, daglEiEilâr, kaydlEiEliâr, aklgkanlllîi artlElna maddeleri ve korrigentleri kapsamaktadr ve yaygI olarak kullaniiân diger taslEEIlâr da uygun bir sekilde kullaniiâbilmektedir. TasMEBrI spesifik örnekleri, hafif anhidröz silisik asit, Iaktoz, kristalin selüllîl mannital, nisasta, karmelloz kalsiyum, karmelloz sodyum, hidroksipropil selüloz, hidroksipropil metil selüloz, polivinilasetal dietilaminoasetat, polivinilpirrolidon, jelatin, orta zincirli trigliserit, polioksietilen sertlestirilmis kastor yagEßO, sakkaroz, karboksimetil selüloz, migîlnisastasüinorganik tuz ve benzerini kapsamaktadE Mevcut bulus, ayrlîti, bir kanser antijeninin eksprese edilmesi için hücrelere zarar verilmesine yönelik ve kanser antijenini eksprese eden hücrelerin, kanser antijenine baglanan mevcut bulusun bir polipeptit kompleksi ile temas ettirilmesi vaslßslýla hücre büyümesinin basküânmas. yönelik yöntemler saglamaktadlîi Kanser antijenine baglanan monoklonal antikorlar, mevcut bulusun bir kanser antijeni baglama polipeptiti kompleksi olarak yukar. aç[EIanmakta olup, bu, kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesinde kullanIia yönelik terapötik maddelerin içerisine dahil edilmektedir. Mevcut bulusun bir kanser antijeni baglama polipeptiti kompleksinin baglandglîihücreler, kanser antijenini eksprese ettikleri sürece sIlEllandlElIEnamaktadlEl Spesifik olarak, tercih edilen kanser antijenini eksprese eden hücreler, yumurtaIIEl kanseri hücreleri, prostat kanseri hücreleri, meme kanseri hücreleri, rahim kanseri hücreleri, karaciger kanseri hücreleri, akciger kanseri hücreleri, pankreatik kanser hücreleri, mide kanseri hücreleri, idrar torbasEkanseri hücreleri ve kolon kanseri hücrelerini kapsamaktadlEi Kanser antijeninin GPC3 olmasüdurumunda, hücreleri, GPC3 eksprese eden kanser hücreleri oldugu sürece sIiEIbndEiiBwamaktadlEi Ancak, tercih edilen kanser hücreleri, hepatokarsinom hücreleri, akciger kanseri hücreleri ve yumurtalllîl kanseri hücrelerini kapsamaktadlB vitro sekilde kültürlenen kanser antijenini eksprese eden hücrelerin kültür ortam. ilave edilmesi vasüâslýla gerçeklestiriIebilmektedir. Bu durumda, ilave edilecek olan bir polipeptit kompleksi, Iiyofilizasyon veya benzeri vasißisüla hazlîilanan bir çözelti veya bir katügiibi uygun bir formda kullanilâbilmektedir. Mevcut bulusun polipeptit kompleksinin bir sulu çözelti olarak ilave edilmesi durumunda, yalnlîca polipeptit kompleksini içeren bir saf sulu çözelti veya örnegin yukari açlElanan yüzey etkin maddesi, eksipiyan, renklendirme maddesi, tatland [Bina maddesi, koruyucu, stabilizör, tampon maddesi, asklîlla bßkma maddesi, Izotonize edici madde, baglayiîüinadde, parçalayiîlgikaydlümakigkanl[EiartiEiEüeya korrigent içeren bir çözelti olabilmektedir. Ilave edilen konsantrasyon özellikle sIiHiandlElE1amaktadiîi ancak, bir kültür ortamIiaki bir nihai konsantrasyon, 1 pg/ml ila 1 g/ml, daha tercihen 1 ng/ml ila 1 mg/ml ve daha tercihen 1 ug/ml ila 1 mg/ml arallgllEtladlEl yapIlglEinsan olmayan hayvanlara veya endojen olarak kanser antijenini eksprese eden kanser hücrelerine sahip hayvanlara uygulama vasllîlisMa gerçeklestirilebilmektedir. Uygulama yöntemi oral veya parenteral olabilmektedir. Parenteral uygulama özellike tercih edilmektedir. Spesifik olarak, parenteral uygulama yöntemi enjeksiyon, nazal uygulama, transpulmoner uygulama ve perkütanöz uygulamaylîkapsamaktadü Enjeksiyonlar örnegin, intravenöz enjeksiyonlar, intramüsküler enjeksiyonlar, intraperitoneal enjeksiyonlar ve subkütanöz enjeksiyonlarElkapsamaktadlEl Örnegin, mevcut bulusa göre kanserin tedavi edilmesi veya önlenmesinde kullanma yönelik maddeler, enjeksiyon yoluyla lokal veya sistemik olarak uygulanabilmektedir. Dahasü uygun bir uygulama yöntemi, bir hayvan sujenin yaslîila veya semptomlarIEla göre seçilebilmektedir. Polipeptit kompleksinin bir sulu çözelti olarak uygulanmasmurumunda, çözelti, yalnlîta polipeptit kompleksini içeren bir saf sulu çözelti veya örnegin yukari aç[lZlanan yüzey etkin maddesi, eksipiyan, renklendirme maddesi, tatlandlElna maddesi, koruyucu, stabilizör, tampon maddesi, asklâla bEakma maddesi, izotonize edici madde, baglaylîülnadde, parçalaylEÇIkaydlElEÇIaklgkanlllZJartIElEÜeya korrigent içeren bir çözelti olabilmektedir. Uygulanan doz, örnegin her bir uygulama için vücut aglîlilglükg'si baslEb 0.0001 ila 1,000 mg arallglIan seçilebilmektedir. Alternatif olarak mevcut bulusun bir polipeptit kompleksinin dozu bu örnekler ile sIEllBlegildir. Asag- açlElanan yöntemler, tercihen, mevcut bulusun bir polipeptit kompleksinin, mevcut bulusun polipeptit kompleksini olusturan antijen baglama alanII baglandlglÇl antijen eksprese eden hücreler ile temas ettirilmesinden dolayEl meydana gelen hücresel sitotoksisitenin degerlendirilmesi veya belirlenmesi için bir yöntem olarak kullanllBîaktadlEl Sitotoksik aktivitenin in vitro sekilde degerlendirilmesi veya belirlenmesine yönelik yöntemler, sitotoksik T hücrelerin veya benzerinin aktivitesinin belirlenmesine yönelik yöntemleri kapsamaktadlEl Mevcut bulusun bir polipeptit kompleksinin T hücresi arac[[l]]hücresel sitotoksisiteyi indükleme aktivitesine sahip olup olmadlglü bilinen yöntemlerle belirlenebilmektedir (bakIlZJ örnegin, Current protocols in Immunology, Chapter 7. kompleksinin antijen baglama alantharafIan tanlndan farklljblan bir antijene baglandlgIEl ve hücrelerin içerisinde eksprese edilmeyen bir polipeptit kompleksi, bir kontrol polipeptit kompleksi olarak kullanilIhaktadlE Kontrol polipeptit kompleksi, aynu sekilde denenmektedir. Ardian, aktivite, mevcut bulusun bir polipeptit kompleksinin, bir kontrol polipeptit kompleksine klýlasla daha güçlü bir sitotoksik aktivite sergileyip sergilemediginin test edilmesi vasltâslýla degerlendirilmektedir. Bu zaman zarfIia, in w'vo sitotoksik aktivite, örnegin asaglâbki prosedür vasßslîla degerlendirilmekte veya belirlenmektedir. Mevcut bulusun bir polipeptit kompleksini olusturan antijen baglama alanII bagland[gll:lantijeni eksprese eden hücrelerin, insan olmayan bir hayvan sujeye Intrakütanöz veya subkütanöz sekilde transplasyonu gerçeklestirilmektedir. Ard-an, transplayon gününden itibaren veya bundan sonra, bir test polipeptit kompleksi, her gün veya birkaç gün aralllZlarla damara veya peritonel kaviteye uygulanmaktadE Tümör boyutu zamanla ölçülmektedir. Tümör boyutundaki degisimdeki farklll]k`1 sitotoksik aktivite olarak tanIilanabilmektedir. Bir in vitro denemede oldugu gibi, bir kontrol polipeptit kompleksi uygulanmaktadlEl Kontrol polipeptit kompleksinin uyguland[gll:lgruba klýhsla, mevcut bulusun polipeptit kompleksinin uygulandlgllîgrupta tümör boyutunun daha küçük olmasülurumunda, mevcut bulusun polipeptit kompleksinin sitotoksik aktiviteye sahip oldugu düsü nülebilmektedir. Izotop ile isaretlenmis timidinin hücrelere tutulumumun ölçülmesi ve bir MTT yöntemi, tercihen, polipeptit kompleksini olusturan antijen baglama alanII baglandlglEbir antijeni eksprese eden hücrelerin büyümesinin baskllânmaslîliçin mevcut bulusun bir polipeptit kompleksi ile temalel etkisinin degerlendirilmesi veya belirlenmesi için kullanllhiaktadlEI Bu zaman zarfIda, in w'i/o sitotoksik aktivitenin degerlendirilmesi veya belirlenmesine yönelik yukarüia açlKlanan yöntemler, tercihen, hücre büyümesinin i'n i/i'vo sekilde baskliânmas- yönelik aktivitenin degerlendirilmesi veya belirlenmesi için kullanüâbilmektedir. Mevcut tarifname ayrlEla, mevcut bulusun bir polipeptit kompleksini içeren kitleri de açlEIamaktadB Kitler, farmasötik olarak kabul edilebilen ilave bir tasIILIED/eya ortam, veya kitlerin kullanIiIBçlKlayan bir kullanma talimatüle benzeri ile birlikte paketlenebilmektedir. Buradan itibaren, mevcut bulus, Örnekler'e referansla spesifik sekilde açllZlanmaktadlîl ancak bunlarla sIlEIllIdJIdugu düsünülmemelidir. (1) Taslak In V/VO sekilde uygulanan bir proteinin kandaki yarEömrünün uzatUBias- yönelik iyi bilinen bir yöntem mevcuttur, bu yöntem, bir antikor Fc alanlEb konjugatlanan bir ilgili protein kullanilârak FcRn-aracEIJJZlgeri dönüstürmeye dayanmaktadlü Ancak, bir dogal tip Fc'nin BiTE'ye konjugatlanmasÇlçesitli sitokinlerin indüklenmesine yol açabilmektedir, zira bir tek molekül, BITE klginII anti-CD3 scFv'si vasüslýla bir T hücresine ve es zamanIEblarak örnegin bir NK hücresi veya makrofajI hücresel zarEüzerinde, Fc alanEl/asltîiisIEa Fch'ye (Fcy reseptörü) baglanabilmektedir ve elde edilen çapraz baglama, bir kanser antijenine bagIiIElsekiIde bu hücreleri aktive edebilmektedir. Dolaylglsîla, bir BiTE'nin, bir polipeptit baglaylEü/asiüslgla, indirgenis Fcy reseptörü baglama aktivitesine (sessiz Fc) sahip olan bir Fc alan. baglandigilZI ERY2 olarak adlandlîllân bir molekül hazlîlhnmlgtlîl ve ERY2'nin aktivitesi, bunun BiTE'nin aktivitesi ile karsllâstlEllBiasEl/asßslîla degerlendirilmektedir. Bir anti-CD3 epsilon antikorunun scFv'si, bir kisa peptit baglaylîlîü/asißslýla, Glipikan 3'e (G) karsüiiir antikorun scFv'sine baglanmlglolup, bu, GPC3'e karslIQGPC3 BITE) BiTE'nin üretilmesi için karaciger kanseri hücrelerinde yüksek bir seviyede eksprese ediligi bilinen, GPI'ya tutunmus bir proteindir (Sekil 17A). ArdIdan bu, GPC3'e (GPC3 ERY2) karsEbir ERY2'nin üretilmesi için bir sessiz Fc'ye baglanmigtlEI(SekiI 17C). Dahasübir normal IgG tipi anti-GPC3 antikoru karsilâstlElna için meydana getirilmistir. IgG tipi anti-GPC3 antikoru, seker zinciri klginIa indirgenmis fukoz içerigine sahip olan bir antikor, yani artlEIlBilgI bir ADCC aktivitesine sahip oldugu bilinen bir düsük fukoz antikoru olarak hazlEllanmlStlü (2) GPC3 BiTE'nin meydana getirilmesi Bir kallöl olarak bir anti-GPC3 antikoru için bir ekspresyon vektörünün kullanI[gll:|PCR amplifikasyonu vasltiislýla, her birinin bir H zinciri degisken bölgesini (anti GPC3 VH) veya bir L zinciri degisken bölgesini (anti-GPC3 VL) kodladigEtDNA'Iar elde edilmistir. Anti-GPC3 VH ve anti-GPC3 VL'nin, bir baglaylîljvasßslîla GIy-GIy-GIy-GIy-Ser'nin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7) üç tekrarEile birbirine baglandigiEbir amino asit sekans. sahip bir anti-GPC3 scFv'yi kodlayan bir cDNA fragmentinin meydana getirilmesi için kalülar olarak, uygun ilave sekanslarEi'beren primerlerin ve yukarlöhki cDNA'IarI kullan UBiaslýla PCR gerçeklestirilmistir. DahasÇlbir oligonükleotit serisi hazlîllanmlglolup, bunlardan her biri, bir anti-CD3 antikorunun (M12) H zinciri degisken bölgesinin (M12 VH) veya L zinciri degisken bölgesinin (M12 VL) bir klîlni sekansIEkodlayan bir nükleotit sekanlela sahipti ve uçlarda tamamlaylEDsekanslara sahipti. Oligonükleotitler; H zinciri degisken bölgesine (M12 VH) ve L zinciri degisken bölgesine (M12 VL) karsllIEl gelen bir polinükleotitin sentezlenmesi için polimeraz reaksiyonu vaslliisüla, tamamlayEElsekans kilarlîlaraclüglîla birbirine baglanabilecekleri sekilde tasarlanmaktadlEl Oligonükleotitler karßtmßtlîlve ardIan, ilgili degisken bölgelerin amino asit sekanslarIEl kodlayan iki cDNA'nI elde edilmesi için PCR vasiûslýla bir araya toplanmlStE M12 VL ve M12 VH'nin, Gly-Gly-Gly-GIy-Ser'nin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7) üç tekrarlEb sahip bir baglaylîüiasltâsüla birbirine baglandfglîlhir amino asit sekans- sahip bir M12 scFv'yi kodlayan bir cDNA fragmentinin meydana getirilmesi için kallüar olarak, uygun ilave sekanslarEliçeren primerlerin ve yukarlki cDNA'larI kullanilüîaslîla PCR gerçeklestirilmistir. ArdIan, kallülar olarak her birinin anti-GPC3 scFv veya M12 scFv'yi kodladiglEchNA fragmentleri ve uygun ilave sekanslarEilçeren primerlerin kullanIlgllîlPCR vaslmsüla bir cDNA fragmenti meydana getirilmis olup, bu, anti-GPC3 scFv ve M12 scFv'nin GIy-Gly-GIy-Gly- Ser'den (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7) olusan bir baglayEEl/aslüslîla birbirine baglandlgllîl bir amino asit sekansIEkodlamEtlEve bunun C terminusu, bir His etiketine sahip olmustur (sekiz histidin) (amino terminal 19 amino asidi olmakslîlEl, SEKANS KIMLIK NUMARASI:33'ün sekansDJ Uygun ilave sekanslarlZliçeren primerlerin ve amino terminal 19 amino asidi eksik olan SEKANS KIMLIK NUMARASI:33'ün amino asit sekansIElkodlayan cDNA fragmentinin bir kallül olarak kullanllüîaslýla, bir EcaRI bölünme sekansIEl, kozak sekansII ve bir salgllâma sinyali sekansIElkodlayan bir nükleotit sekansIlEI, yukarlEIhki cDNA fragmentinin 5' ucuna tutturuldugu ve bir Nod sekanlellEl ise 3' ucuna tutturuldupu bir cDNA fragmentinin üretilmesi için PCR gerçeklestirilmistir. Elde edilen cDNA fragmenti EcoRI ve Nod ile bölünmüstür ve GPC3 BITE için bir ekspresyon vektörünün elde edilmesi için bir memeli hücresi ekspreson ventörünün içine eklenmistir (SEKANS KIMLIK NUMARASI:33; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüilarak islev görmektedir). Vektör, elektroporasyon vaslßslîla CHO DG44 hücrelerine verilmistir. Seyreltinin sIlEIlandlEllB1asIan sonra, ilaca dirençli hücre hatlarII izole edilmesi için hücreler 1 mg/ml Genetisinin varl[g]Ia kültürlenmistir. Elde edilen hücre hatlarII kültür süpernatantüGPC3 BiTE eksprese eden bir hücre hattII seçilmesi için bir anti-His etiketi antikorunun kullan-@El Western blot ile analiz edilmistir. Yukarlîlla açüZianan hücre hattII genis çapIEhücre kültürü vaslßslýla elde edilen hücre süpernatantübir SP Sepharose FF kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Kolon ylElandHZtan sonra, GPC3 BiTE içeren bir fraksiyon bir NaCI konsantrasyonu gradyanEile ayrlgtlîlllBiligtlEl Fraksiyon, bir HisTrap HP kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Kolon yHZlandHZtan sonra, GPC3 BiTE içeren bir fraksiyon bir imidazol konsantrasyonu gradyanEile ayrlSIlEllBIIStE Fraksiyon ultrafiltrasyon vaslßsgla konsantre edilmistir ve konsantre, bir Superdex 200 kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Yalnlîta bir monomerik GPC3 BiTE fraksiyonu, saflastlEllEilglGPC3 BiTE'nin elde edilmesi için toplanmlStE (3) GPC3 ERY2'nin meydana getirilmesi Yukar- açllZlanan yöntemde oldugu gibi uygun ilave sekanslarEIlçeren primerlerin kullan-[gl] PCR ve QuikChange Bölge Yönelimli Mutajenez Kitinin (Stratagene) kullanIiglEbir yöntem gibi teknikte uzman kisilerce iyi bilinen bir yöntem, GPC3 ERY2_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 34; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîblarak islev görmektedir) veya GPC3 ERY2_Hh'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 35; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslllarak islev görmektedir) kodlayan bir polinükleotitin eklendigi ekspresyon vektörlerinin üretilmesi için gerçeklestirilmistir. Bu ekspresyon vektörleri, GPC3 ERY2'nin etkili bir sekilde eksprese edilmesi için FreeSter293-F hücrelerine (Invitrogen) birlikte verilmistir. Elde edilen kültür süpernatantÇlbir Anti FLAG M2 kolonu (Sigma) üzerine yüklenmistir. YlEiamadan sonra, kolon 0.1 mg/ml FLAG peptiti (Sigma) ile ayrlgtlülmlgtlîl GPC3 ERY2 içeren bir fraksiyon, bir HisTrap HP kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. YlElamadan sonra, kolon, bir imidazol konsantrasyon gradyanEliIe ayrlStlEllIhlStE GPC3 ERY2 içeren bir fraksiyon ultrafiltrasyon vasltâslýla konsantre edilmistir ve konsantre, bir Superdex 200 kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Yalnlîta bir monomerik GPC3 ERY2 fraksiyonu, saflastßllîhlgl GPC3 ERY2'nin elde edilmesi için eluattan toplanmlgtß (4) Düsük fukozlu anti-GPC3 antikorunun meydana getirilmesi antikoru olarak adlandlEllIhaktadIB yönelik bir ekspresyon vektörü, elektroporasyon verilmistir. Seyreltinin sIlEllandEllIhasIan sonra, ilaca dirençli hatlarI seçilmesi için hücreler 0.5 mg/ml Genetisinin varllglia kültürlenmistir ve bir düsük fukozlu anti-GPC3 antikorunu eksprese eden bir hücre hattlîelde edilmistir. Bu hücrelerin kültürlenmesiyle edle edilen kültür süpernatantIan, Hitrap® Protein A (Pharmacia) kullanilârak konvansiyonel afinite sflastlElnasEl/aslüslýla bir antikor fraksiyonu hazEllanmlgtE ArdIan, Superdex 2 kullanüârak antikor fraksiyonu jel filtrasyonu saflastlEnasEb maruz blßklliilgtlîl Bir monomer fraksiyonu, bir düsük fukozlu anti-GPC3 antikorunun elde edilmesi için eluattan toplanmlgtß (5) Insan periferal kan mononükleer hücrelerinin kullan-@Sitotoksisite denemesi ( süspansiyonunun haziElbnmasEl SaglllZJEgönüllülerden (yetiskin) önceden 100 pl 1,000 birim/ml heparin çözeltisinin (Novo- Heparin 5000 birimleri, enjeksiyon için; Novo Nordisk) Ilave edildigi slElElgalarI kullanllîhaslgla 50 ml periferal kan toplanmlgtlEI Periferal kan PBS(-) ile iki kat seyreltilmistir, dört esit alikota ayrllßîlgtEl ve 15 ml FicolI-Paque PLUS'I enjekte edildigi ve önceden santrifüjlenen Leucosep Ienfosit aylElna tüplerine (Kat. No: 227290; Greiner bio-one) ilave edilmistir. AylElna tüplerinin santrifüjlenmesinden (2,150 dds (rpm), 10 dakika, oda lelakIEgID] sonra, bir mononükleer hücre fraksiyonu tabakasEltoplanmlstlB Mononükleer hücre fraksiyonu içerisindeki hücreler %10 FBS (buradan itibaren %10FBS/D-MEM olarak adlandEllân) içeren Dulbecco'nun Modifiye edilmis Eagle OrtamEI(SIGMA) ile bir kez yllZlanmlStlElve ardIan hücre yogunlugu %10FBS/D-MEM kullanüârak 4 x 106 hücre/ml'ye ayarlanmlStlEI Bu sekilde elde edilen hücre süspansiyonu, sonraki deneylerden bir insan PBMC süspansiyonu olarak kullanilmlStB (5-2) Sitotoksik aktivite denemesi Sitotoksik aktivite, xCELLigence gerçek zamanlElanalizör (Roche Diagnostics) kullanilarak belirlenen hücre büyümesi inhibisyon oran. dayanarak degerlendirilmistir. Kullanilân hedef hücre, insan GPC3'ün SK-HEP-l hücre hattlîlçerisinde zorla eksprese edilmesiyle meydana getirilen SK-pca13a hücre hattlsîdlîlSK-pca13a hücreleri, kaplardan ayrilBilgtlEl ve 1 x 104 hücre/çukurcuktaki ( plakasEüzerinde tohumlanmlStlE ArdIan yasayabilir hücre denemesi, xCELLigence gerçek zamanlEhücre analizörünün kullanilBiaslýla baslatllBilStlEl Sonraki gün, plaka xCELLigence gerçek zamanlEl hazEllanan her bir antikordan 50 ul, plakaya ilave edilmistir. Oda slîlakllgiia 15 dakikalllâ reaksiyondan sonra, (5-1)'de hazlElanan 50 pl insan PBMC süspansiyonu (2 x 105 hücre/çukurcuk) ilave edilmistir. Plaka, yasayabilir hücre denemesinin baslatllßîasülçin tekrar xCELLigence gerçek zamanlühücre analizörünün içerisine koyulmustur. Reaksiyon, 37°C'deki insan PBMC'Ierinin ilave edilmesinden 72 saat sonra Hücre Indeksi degeri kullanllârak, asagi gösterilen formüle göre belirlenmistir. Hesaplamada kullanilan Hücre Indeksi degeri, antikorun ilave edilmesinden hemen önce Hücre Indeksi degerinin 1 olarak alicaglîsekilde normalize edilmistir. Hücre büyümesi inhibisyon oranEQS) = (A-B) x 100/(A-1) A, antikorsuz çukurcuk (yalnlîta hede hücre ve insan PBMC) için ortalama Hücre Indeks degerini göstermekteyken, B, her bir çukurcuk için ortalama Hücre Indeks degerini göstermektedir. Bu ölçüm üç kopya halinde gerçeklestirilmistir. GPC3 BiTE, GPC3 ERY2, ve IgG-tipi anti-GPC3 antikorunun sitotoksik aktivitesi, efektör hücreler olarak insan kanElle hazlEllanan PBMC'Ierin (periferal kari mononükleer hücreleri) kullanllüiaslsîla ölçülmüstür. GPC3 BiTE oldukça güçlü bir aktivite sergilemistir (Sekil 1). Bu aktivite, düsük fukozlu anti-GPC3 antikoruna klýlasla çok daha güçlüydü. Dolaylîlîda, GPC3 BiTE, IgG-tipi antikoru asan, oldukça iyi bir kanser terapmtik maddesi olarak islev görebilmektedir. Diger yandan, GPC3 ERY2'nin aktivitesi, GPC3 BiTE'ninki kadar güçlü degildi, ancak IgG tipi anti-GPC3 antikorundan daha fazlaydlZI Bu, yalnlîta Fc'nin BiTE'ye ilave edilmesinin, arzu edilen molekülün meydana getirilmesini saglamad [gllügöstermektedin degerlendirilmesi Ardian, spesifik aktivitenin aktarllIhasEiçin, kanser antijeni (GPC3) baglama alanükanser hücresi baglama aktivitesinin artlîllE'iasEbmaclýla iki degerlikli hale getirilmistir. Bir baska anti-GPC3 scFv, GPC3 ERY5'in meydana getirilmesi için GPC3 ERY2'ye ilave edilmistir (Sekil 170). DahasÇiscFv yerine, bir Fab-tipi GPC3 baglama alanüGPC3 ERY7'nin üretilmesi için ilave edilmistir (Sekil 17F). Ilaveten, GPC3 ERY6 (Sekil 17E) da meydana getirilmis olup, burada GPC3 ERY5'in anti-CD3 epsilon scFv'si iki kola ayrllßnlgtß Spesifik olarak, yukarlfiiaki yöntemde oldugu gibi uygun ilave sekanslarljçeren primerleirin kullanIEgElPCR gibi teknikte uzman kisilerce bilinen bir yöntem, GPC3 ERY5_Hh, GPC3 ERY6_Hk, GPC3 ERY6_Hh, GPC3 ERY7_Hh, veya GPC3 ERY7 L'yi kodlayan bir polinükleotitin eklendigi ekspresyon vektörlerinin bir serisinin üretilmesi için gerçeklestirilmistir. Ekspresyon vektörlerinin asaglahki kombinasyonlarütasarlanan her bir moleküsün klEla süreli olarak eksprese edilmesi için FreeSter293-F hücrelerine verilmistir. A. Tasarlanan molekül: GPC3 ERY5 Ekspresyon vektörlerinin içine eklenen polinükleotitler tarafIan kodlayanan polipeptitler: GPC3 ERY5 (SEKANS KIMLIK NUMARASI:36; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansßlarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY2_Hk B.Tasarlanan molekül: GPC3 ERY6 Ekspresyon vektörlerinin içine eklenen polinükleotitler taraflikjan kodlayanan polipeptitler: GPC3 ERY6_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI:37; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEblarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY6_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 38; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîilarak islev görmektedir) C.Tasarlanan molekül: GPC3 ERY7 Ekspresyon vektörlerinin içine eklenen polinükleotitler tarafüldan kodlayanan polipeptitler: GPC3 ERY7_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI:39; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslZloIarak islev görmektedir), GPC3 ERY7_L (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 40; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüblarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY2_Hk Elde edilen kültür süpernatantü bir Anti FLAG M2 kolonu (Sigma) üzerine yüklenmistir. YiiZlamadan sonra, kolon ile ayrEtlEllißîlgtlEl Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, bir HisTrap HP kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. YiElamadan sonra, kolon, bir imidazol konsantrasyon gradyanEiIe ayrigtlElIhlStlEl Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, ultrafiltrasyon vasiüslîla konsantre edilmistir. ArdIan, fraksiyon bir Superdex 200 kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Yalnlîta bir monomer fraksiyonu, tasarlanan, saflastlEllIhlSl her bir molekülün elde edilmesi için eluattan toplanmlgtlEl Bu polipeptit kompleksleri, sitotoksik aktivite bakIiIan GPC3 BITE ile karsHâstlEllBilStE Sonuç, bu polipeptit komplekslerinin sitotoksik aktivitesinin, GPC3 BiTE'ninki kadar fazla olmad[giIElgöstermektedir (Sekiller 2 ila 4). Bu bulgu, Fc'nin BITE yap_ veya bunun mimetik yap_ ilave edilmesinin ve bir kanser antijenine iki degerlikli baglanmayülnümkün kilân konfigüarsyonun, arzu edilen molekülün meydana getirilmesini saglamadigllü göstermektedir. degerlendirilmesi ArdEUan, hiçbir BITE yapisi& sahip olmayan, ancak arzu edilen aktiviteye sahip olan moleküller tasarlanmlgtE Bir anti kanser antijeni (GPC3) IgG, bir omurga olarak kullanilBilgEl ve bir anti-CD3 epsilonu scFv'nin bu omurgaya ilave edildigi bir molekül meydana getirilmistir. Bir omurga olarak kullanilân IgG Fc, yukari açüîlanan durumlarda oldugu gibi, indirgenmis Fch (Fcy reseptörü) baglama aktivitesine sahip olan bir sessiz Fc idi. GPC3 ERY meydana getirilmis olup, burada, anti-CD3 epsilonu scFv'si, süsüla, anti-GPC3 antikoru IgG'nin H zincirinin N terminusuna, H zincirinin C terminusuna ve L zincirinin C terminusuna tuttu rulmustur. Spesifik olarak, yukarlöla açHZlanan yöntemde oldugu gibi uygun ilave sekanslarEIiçeren primerlerin kullanIEgiüPCR gibi, teknikte uzman kisilerce bilinen bir yöntem vaiûislýla, ekspresyon vektörlerinin bir serisi meydana getirilmis olup, buraya, GPC3 ERY8-2_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 41; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEblarak islev görmektedir), GPC3 ERY8-2_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 42; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîblarak islev görmektedir), GPC3 ERY9-1_H (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 43; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîblarak islev görmektedir), GPC3 ERY9-1_L-His (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 44, olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEblarak Islev görmektedir), GPC3 ERY9-1_L-FLAG (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 45; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslZblarak islev görmektedir) veya GPC3 ERY10-1_Hh'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 46; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansljblarak islev görmektedir) kodlayan bir polinükleotit eklenmistir. Ekspresyon vektörlerinin asaglki kombinasyonlarütasarlanan her bir molekülün kisa süreli olarak eksprese edilmesi için FreeStyle293-F hücrelerine verilmistir. D.Tasarlanan molekül: GPC3 ERY8-2 Ekspresyon vektörlerinin içine eklenen polinükleotitler tarafIdan kodlayanan polipeptitler: GPC3 ERY8-2_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI:41; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEblarak islev görmektedir), GPC3 ERY8-2_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 42; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîcblarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY7_L E.Tasarlanan molekül: GPC3 ERY9-1 0249 Ekspresyon vektörlerinin içine eklenen polinükleotitler taraflîitlan kodlayanan polipeptitler: GPC3 ERY9-1_H (SEKANS KIMLIK NUMARASI:43; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEblarak islev görmektedir), GPC3 ERY9-1_L-His (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 44; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîolarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY9-1_L- FLAG (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 45; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîrlilarak islev görmektedir) F. Tasarlanan molekül: GPC3 ERYlO-l Ekspresyon vektörlerinin içine eklenen polinükleotitler tarafIdan kodlayanan polipeptitler: GPC3 ERY10-1_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI:46; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüilarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY8-2_Hk, GPC3 ERY7_L Elde edilen kültür süpernatantü bir Anti FLAG M2 kolonu (Sigma) üzerine yüklenmistir. Y[lZlamadan sonra, kolon ile ayrlgtlElllBilgtlB Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, bir HisTrap HP kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. YiElamadan sonra, kolon, bir imidazol konsantrasyon gradyanEile ayrlgtlîllHiIStEI Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, ultrafiltrasyon vaslßslýla konsantre edilmistir. ArdIan, fraksiyon bir Superdex 200 kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Yalnlîta bir monomer fraksiyonu, tasarlanan, saflastlEIlIhlS her bir molekülün elde edilmesi için eluattan toplanmlgtß Bu moleküller, in vitro sitotoksik aktiviteye yönelik olarak degerlendirilmistir. Sonuç, tüm moleküllerin, GPC3 BiTE ile karsilâstlEllâbilir olan veya bundan daha fazla olan bir sitotoksik aktiviteyi sergiledigini göstermektedir (Sekil 5). Özellikle, GPC3 ERY9-1 ve GPC3 ERY10-1'in, GPC3 BiTE'den açllZl sekilde daha fazla olan bir sitotoksik aktivite sergiledigi bulunmustur. Ilk kez mevcut bulus, bir anti-CD3 epsilon scFv'sinin, bir anti kanser antijeni IgG'ye ilave edilmesiyle olusturulan moleküllerin de BiTE'ninki ile karsllâstlîllâbilir olan veya bundan daha fazla olan bir sitotoksik aktiviteye sahip oldugunu göstermistir. Özellikle, GPC3 ERY9-1 ve GPC3 ERY10-1 gibi moleküllerin, bunlarlEJ kanser antijeni baglama alanEl/e CD3 epsilonu baglama alanElaraletla büyük bir uzakl[lZ| olmaleIa ragmen BiTE'den daha fazla olan bir sitotoksik aktivite sergilemesi sasi-IE! (2) GPC3 ERY8-2 ve GPC3 ERY10-1'in in Viva etkinliginin degerlendirilmesi (1)'de açilZlanan in vitro denemede GPC3 BiTE ile karsilâstlîllâbilir veya bundan daha fazla olan bir sitotoksik aktivite sergileyen GPC3 ERY8-2 ve GPC3 ERY10-1, in i/ii/o etkinlik için degerlendirilmistir. Insan akciger kanseri hücre hattEIPC-lO'u eksprese eden GPC3'ün hücreleri, insan PBMC'Ieri ile karStlEllB'iIStlEl ve ardIan bunun, NOD scid (ciddi kombine baglgEllKl yetmezligi) farelerine transplasyonu gerçeklestirilmistir. Fareler, GPC3 ERY8-2 veya GPC3 ERY10-1'nin (ön-karlglEii modeli olarak adlandmaktadlî) uygulanmasElile tedavi edilmistir. Spesiûk olarak, PC-10 ön karElEli modelinin kullanlJIhaslîla GPC3 ERY8-2 için etkinlik testi asaglîlhki gibi gerçeklestirilmistir. PBMC'ler, sagllElügönüllülerden alin kandan izole edilmistir. NK hücreleri, CD56 MicroBead'Ierin, insan (MCAS Miltenyi biotec), kullanllîhaslsîla PBMC'lerden giderilmistir. Insan akciger skuamöz karsinom hücre hattEPC-IO (Immuno- Biological Laboratories Co., Ltd.) (5 x 106 hücre), yani NK hücrelerinin olmadlgiüinsan PBMC'leri(4.5 x 106 hücre), ve Matrigel TabanlEZar Matrisi (BD) karlStEIlBügtElve ardIan, bunun, NOD scid farelerinin (CLEA Japonya Inc. ; disi, 7W) kaleJ bölgesine subkütanöz olarak transplasyonu gerçeklestirilmistir. Transplasyon günü, gün 0 olarak belirlenmistir. Transplasyondan önceki gün, bir anti-asiyalo GM1 antikoru (Wako Pure Chemical Industries), 0.2 mg/kafa miktarlEtla farelere intraperitoneal sekilde uygulanmlgtlE Transplasyondan 2 saat sonra, GPC ERY8-2, 30 iJg/kafa miktarIa intraperitoneal sekilde uygulanmlStlEl GPC ERY8-2, günler 0 ila 4 süresince toplamda bes kez uygulanmlgtlEl DahaslZIPC-lû ön karm modelinin kullanilIhasEla GPC3 ERY10-1 için etkinlik testi asag-ki gibi gerçeklestirilmistir. PBMC'ler, saglllZIEgönüllülerden allElan kandan izole edilmistir. NK hücreleri, CD56 MicroBead'Ierin, insan (MCAS Miltenyi biotec), kullanHÜiaslýla PBMC'lerden giderilmistir. Insan akciger skuamöz karsinom hücre hattlîl PC-10 (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.) (5 x 106 hücre), yani NK hücrelerinin olmadlglElnsan PBMC'leri (4.5 x 106 hücre), ve Matrigel TabanlEZar Matrisi (BD) karlStlElIBüStlElve ard Edan, bunun, NOD scid farelerinin (CLEA Japonya Inc.; disi, 7W) kasllZl bölgesine subkütanöz olarak transplasyonu gerçeklestirilmistir. Transplasyon günü, gün 0 olarak belirlenmistir. Transplasyondan önceki gün, bir anti-asiyalo GMl antikoru (Wako Pure Chemical Industries), 0.2 mg/kafa miktarlrîbla farelere intraperitoneal sekilde uygulanmlgtlîl Transplasyondan 2 saat sonra, GPC ERY10-1, ug/kafa miktarIa intraperitoneal sekilde uygulanmßtß GPC ERY10-1, günler 0 ila 4, günler 7 ila 11 ve günler 14 ila 16 süresince toplamda 13 kez uygulanmlgtlü Sonuçlar, GPC3 ERY uygulama gruplar. klýbsla, tümör büyümesinin açik] sekilde baskllând[g]I|:göstermektedir (Sekiller 6 ve 7). DahaslZl GPC3 ERY10-1 ayrlEla, alternatif bir model kullanllârak in Viva etkinlik için de degerlendirilmistir. Spesihk olarak, T hücreleri, insan PBMC'lerinin in vitro sekilde kültürlenmesi ile büyütülmüstür ve ardIan, transplasyonu gerçeklestirilen PC-10'dan dolayü tümör gelistiren NOD scid farelerine verilmistir. Fareler, GPC3 ERY10-1'in (T hücresi transfer olarak adlandlEllBiaktadlE) uygulanmasüle tedavi edilmistir. Spesifik olarak, PC-10 T hücresi transfer modelinin kullanllüiaslýla GPC3 ERY10-1 için etkinlik testi asaglöhki gibi gerçeklestirilmistir. T hücresi genisletme kültürü, T hücresi aktivasyon/genisletme kiti/insan (MACS Miltenyi biotec) ve sagllkllîlgönüllülerden aIIElan kandan izole edilen PBMC'Ierin kullanllüiasüla gerçeklestirilmistir. Insan akciger skuamöz karsinom hücre hattEPC-lO (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.) (1 x 107 hücre), Matrigel TabanIEZar Matrisi (BD) ile karlgtlElIhlStlEIve ardIan, bunun, NOD scid farelerinin (CLEA Japonya Inc.; disi, 7W) kasllZl bölgesine subkütanöz olarak transplasyonu gerçeklestirilmistir. Transplasyon günü, gün 0 olarak belirlenmistir. Transplasyondan önceki gün ve günler 6, 8, 12, 16 ve 20'de, bir anti-asiyalo GMl antikoru (Wako Pure Chemical Transplasyonun 6'lEicEl gününde, fareler tümör boyutu ve vücut aglEIl[gll:l bak"an gruplanmlgtlîl ve ardIdan, yukari açlElandiglEl üzere genisletme kültürü vasißslýla hazlîllanan T hücrelerinin, peritoneal kavite içerisine 1 x 107 hücre/kafa miktarIda transplasyonu saglanmlStEl Transplasyondan 2 saat sonra, GPC ERY10-1, 30 ug/kafa toplamda bes kez uygulanmlgtlîl Sonuç, bu modelin GPC3 ERY10-1 uygulama grubunun, çözücü uygulama grubuna klýbsla, açliîl bir anti-tümör etkisi sergiledigini göstermektedir (Sekil 8). Yukari açlElanan bulgu, bir anti-CD3 epsilonu antikorunun bir scFv'sinin, bir sessiz Fc'ye sahip bir IgG omurgas- ilave edildigi bir molekül serisinin, açlE bir in Viva anti-tümör etkisi sergiledigini göstermektedir. (3) Plazma tutulumunun degerlendirilmesi plazma içerisinde ciddi oranda daha uzun bir yarü ömre sahip olup olmad[glII degerlendirilmesi için, GPC3 ERY9-1 ve GPC3 ERY10-1, hiçbir kanser hücresinin transplasyonunun gerçeklestirilmedigi NOD scid farelerine 30 tig/kafa miktarIa uygulanmlgtiîlve bunlarI plazma konsantrasyonlarlîamanla ölçülmüstür. Spesifik olarak, PK analizi asaglki sekilde gerçeklestirilmistir. GPC3 ERY9-1 ve GPC3 ERY10- 1, NOD scid farelerine (CLEA Japonya Inc.; disi, 8W) 30 tig/kafa miktarlîilja intraperitoneal sekilde uygulanmlâtlEl Uygulamadan sonraki 15 dakika, iki saat, 1 gün, 2 gün ve 7 günde, hematokrit kIal damarlari kullanllüiaslýla (Terumo) farelerin agiz damarIan kan allEtnlgtlEl Plazma kandan hazlîllanmlgtlrîl ERY10-1'in GPC3/BaF ve CD3/BaF ile reaksiyona girmesinin mümkün kHJEmasElçin GPC3 eksprese eden Ba/F3 hücrelerine (GPC3/BaF) veya insan CD3 epsilonu eksprese eden Ba/F3 hücrelerine (CD3/BaF) ilave edilmistir. Bu hücrelerin ylEanmasIan sonra, bir FITC isaretli ikincil antikor ileri reaksiyon için ilave edilmistir. Hücrelerin y[lZlanmasIan sonra, her bir antikor için bir kalibrasyon egrisinin hazlEIlanmaslZlçin, hücreler üzerindeki etiketin floresan yogunlugu, Epics XL aklsîlsitometresi (Beckman coulter) kullanilârak ölçülmüstür. GPC3 ERY9-1 veya GPC3 ERY10-1'in verildigi farelerden zamanla kan aIlEmlgtlEl Plazma kandan hazlEIlanmlStIE] ve uygun sekilde seyreltilmistir. Yukari açiKIanan kalibrasyon egrilerinin hazlEllanmasüle aynDsekilde, her bir hücreye baglanan plazma GPC3 ERY9-1 ve GPC3 ERY10-1 miktarII belirlenmesi için plazma numuneleri GPC3/BaF veya CD3/BaF ile reaksiyona allümlgtlîl Her bir antikorun plazma konsantrasyonu, yukar- açlKlanan, belirlenmis degerler ve kalibrasyon egrileri kullanIrak hesaplanmlgtlü Sonuç, hem GPC3 ERY9-1 hem de GPC3 ERY10-1'in kan konsantrasyonunun, iki uygulama gününden sonra 10 nM'den fazla oldugunu göstermistir (Sekiller 9 ve 10). Bu bulgu, GPC3 ERY9-1 ve GPC3 ERY10-1 gibi moleküllerin, BiTE'ye klýbsla büyük oranda artmEl bir plazma yarEömrüne sahip oldugunu göstermektedir. (4) Sessiz Fc'nin, kanser antijenine baglilßitokin indüksiyonu üzerindeki etkisi (4-1) Fch baglama Fc'sine sahip GPC3 ERY15-1'in meydana getirilmesi ve GPC3 ERY10-1 gibi moleküllerin, kanser antijenine bagIiIEliiir sekilde sitokinleri indükleyip indüklemediginin test edilmesi için meydana getirilmistir. Spesiük olarak, yukar- açilZIanan yöntemde oldugu gibi uygun ilave sekanslarEliçeren primerlerin kullanIiglEPCR ve QuikChange Bölge Yönelimli Mutajenez Kitinin (Stratagene) kullanIiglElbir yöntem gibi teknikte uzman kisilerce iyi bilinen bir yöntem, GPC3 ERY15-1_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 47; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEblarak islev görmektedir) veya GPC3 ERY15-1_Hk'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 48; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansljblarak islev görmektedir) kodlayan bir polinükleotitin eklendigi ekspresyon vektörlerinin meydana getirilmesi için gerçeklestirilmistir. GPC3 ERY15-1_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI:47; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîblarak islev görmektedir), GPC3 ERY15-1_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 48; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüblarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY7_L'ye yönelik ekspresyon vektörleri, GPC3 ERY15-1'in kia süreli olarak eksprese edilmesi için FreeSter293-F hücrelerine birlikte verilmistir. Elde edilen kültür süpernatantÇl bir Anti FLAG M2 kolonu (Sigma) üzerine yüklenmistir. Y[Elamadan sonra, kolon ile ayrlgtlElllIhlgtlEl GPC3 ERY15-1 içeren bir fraksiyon, bir HisTrap HP kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. YllZamadan sonra, kolon, bir imidazol konsantrasyon gradyanElile ayriStlEIllIhlStlB GPC3 ERY15-1 içeren bir fraksiyon, ultrafiltrasyon vasltâslîla konsantre edilmistir. ArdEUan, fraksiyon bir Superdex 200 kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. YaInEta bir monomerik GPC3 ERY15-1 fraksiyonu, saflastlîllîhlgl GPC3 ERY15-1'in elde edilmesi için eluattan toplanmEtE (4-2) Kanser antijenden bag Iislîlsekilde sitokin indükleme yetisine yönelik deneme GPC3 ERY15-1'in kanser antijenin bagnslîisekilde sitokin indükleme yetisi, GPC3 BiTE, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1 ve katumaksomablEkiler ile karsllâstlîllßilgtü Yukar- açllZIanan yöntemler kullanilarak, PBMC'Ier, sagllkllîgönüllülerden aI-n kandan hazlEllanmlgtE 40 nM'ye ayarlanan her bir antikorun elli ml'si, 50 ul insan PBMS süspansiyonuna (2 x 105 hücre/çukurcuk) ilave edilmistir ve ardIan 100 pl %10FBS/D-MEM de buraya ilave edilmistir. Reaksiyon karmü37°0deki %5 karbon dioksit gazültlda inkübe edilmistir. 72 saatlik inkübasyondan sonra, kültür süpernatantlîl toplanmlStE ve kültür süpernatantlîl içerisinde salgllânan sitokinler, Insan Th1/Th2/Th17 Kiti (BD) kullanllârak Sitometrik Boncuk Denemesi (CBA) vaslüslîla nicellestirilmistir. Deneme, ekli protokole göre yöntem vasltâslýla üç kopya halinde gerçeklestirilmistir. Sonuç olarak, bir Fch baglama Fc'sine sahip GPC3 ERY15-1 ve katumaksomab, açÜZJ sitokin indüksiyonu sergilemistir. Bunun aksine, Fc'ye sahip olmayan GPC3 BITE ve bir sessiz Fc'ye sahip olan GPC3 ERY9-1 ve GPC3 ERY10-1 için sitokin indüksiyonu gözlemlenmemistir (Sekil moleküllerin, kanser antijenine bagIiIEbir sekilde sitokinleri indüklemeyen, fazlaca güvenilir moleküller oldugunu göstermektedir. scFv yap-dan farklEbir CD3-baglama alan. sahip moleküller degerlendirilmistir. GPC3 ERY18 (Sekil 17K) meydana getirilmis olup, burada bir anti CD3 antikorunun VH ve VL alanlarübir anti kanser antijeni (GPC3) IgG'sinin H zincirlerinin C terminisine baglanmlStlE] Bu yapi, birlesim yerinde bir ila dört baglayIEÜJIrimine (GIy-GIy-GIy-GIy-Ser) sahip bir molekül serisi (PC3 ERY18 L1, L2, L3, ve L4) üretilmistir. AynEtamanda, bir baska molekül (GPC3 ERY18 Sl) de meydana getirilmis olup, burada uygun pozisyonlardaki amino asitler, bir disülfür bagII verilmesine olanak saglanmaslîçin Cys ile ikame edilmistir. Spesifik olarak, yukari açilZianan yöntemde oldugu gibi uygun ilave sekanslarEliçeren primerlerin kullanI[g]i:lPCR gibi, teknikte uzman kisilerce bilinen bir yöntem vatÜisiîLla, ekspresyon vektörlerinin bir serisi meydana getirilmis olup, buraya, GPC3 ERY18 L1_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 49; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîblarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 L1_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 50; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîblarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 L2_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 51; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüblarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 L2_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 52, olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslZbIarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 L3_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 53; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüblarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 L3_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 54; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEbIarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 L4_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 55; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslZbIarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 L4_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 56; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansülarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 Sl_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 57; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüolarak islev görmektedir) veya GPC3 ERY18 Sl_Hk'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 58; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEiolarak islev görmektedir) kodlayan bir polinükleotit eklenmistir. Ekspresyon vektörlerinin asag-ki kombinasyonlarütasarlanan her bir molekülün kEtsi süreli olarak eksprese edilmesi için FreeStyle293-F hücrelerine verilmistir. G. Tasarlanan molekül: GPC3 ERY18 L1 Ekspresyon vektörleri: GPC3 ERY18 L1_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI:49; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi Içermemekte olup, bu bir sinyal sekansElolarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 L1_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 50; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüilarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY7 L H. Tasarlanan molekül: GPC3 ERY18 L2 Ekspresyon vektörleri: GPC3 ERY18 L2_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI:51; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEIolarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 L2_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 52; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüblarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY7 L Ekspresyon vektörleri: GPC3 ERY18 L3_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI:53; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEIolarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 L3_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 54; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîrblarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY7 L J. Tasarlanan molekül: GPC3 ERY18 L4 Ekspresyon vektörleri: GPC3 ERY18 L4_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI:55; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansElolarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 L4_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 56; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüblarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY7 L K. Tasarlanan molekül: GPC3 ERY18 51 Ekspresyon vektörleri: GPC3 ERY18 51_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI:57; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEiolarak islev görmektedir), GPC3 ERY18 Sl_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 58; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansßlarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY7 L Elde edilen kültür süpernatantü bir Anti FLAG M2 kolonu (Sigma) üzerine yüklenmistir. YllZlamadan sonra, kolon ile ayrlgtlElllIhiStB Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, bir HisTrap HP kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. YlIZlamadan sonra, kolon, bir imidazol konsantrasyon gradyanEiIe ayrlgtliilîhlgtiîl Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, ultrafiltrasyon vaslßslîla konsantre edilmistir. ArdIan, fraksiyon bir Superdex 200 kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Yalnlîta bir monomer fraksiyonu, tasarlanan, saflastlEllIhlgl her bir molekülün elde edilmesi için eluattan toplanmlgtlEl moleküllerinden her biri, in vitro sitotoksik aktivite için degerlendirilmistir (Sekiller 12 ve 13). Sonuç, GPC3 ERY18 L1 hariç tüm moleküllerin, GPC3 ERY10-1'inki ile klýhslanabilen bir aktiviteye sahip oldugunu göstermektedir. Bu sonuç, scFv olmayan bir yapüla sahip molekülleirn, klýbslanabilir bir sitotoksik aktiviteye sahip oldugunu göstermektedir. CD3 antikorunun VH ve VL alanlarIan her birinin, anti-kanser antijeni (GPC3) IgG'sinin H zincirlerinin C terminisine baglandigiElyapIIEI, mevcut bulusun polipeptit komplekslerinin stabilizasyonuna katkBaglamaslîliieklenmektedir. ArdIian, bir Fab-benzeri CD3 baglama alan. sahip moleküller degerlendirilmistir. GPC3 ERY19-3 (Sekil 17L) meydana getirilmis olup, burada bir anti CD3 antikorunun VH ve CH1 alanlarElve VL ve CL alanlari: bir anti kanser antijeni (GPC3) IgG'sinin H zincirlerinin C terminisine baglanmlgtlü Spesifik olarak, yukar-ki yöntemde oldugu gibi uygun ilave sekanslarEiçeren primerlerin kullanIIgiElPCR gibi teknikte uzman kisilerce bilinen bir yöntem vaslüslsîla ekspresyon vektörleri meydana getirilmis olup, buraya GPC3 ERY19-3_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI:59; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEblarak islev görmektedir) veya GPC3 ERY19-3_Hk'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 60; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansßlarak Islev görmektedir) kodlayan bir polinükleotit eklenmistir. GPC3 ERY19-3_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI:59; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîblarak islev görmektedir), GPC3 ERY19-3_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 60; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîblarak islev görmektedir) ve GPC3 ERY7_L'ye yönelik ekspresyon vektörleri, GPC3 ERY19-3'ün kisa süreli olarak eksprese edilmesi için FreeSter293-F hücrelerine birlikte verilmistir. Elde edilen kültür süpernatantÇlbir HiTrap rProtein A FF kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Y[Elamadan sonra, kolon, bir asit ile ayrlgtlBlBilgtlEl GPC3 ERY19-3 içeren bir fraksiyon ultrafiltrasyon vasltâeslýla konsantre edilmistir ve ardIan, bir Superdex 200 kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Yalnlîta bir monomerik GPC3 ERY19-3 fraksiyonu, saflastlEIlBrlglGPC3 ERY19-3'ün elde edilmesi için eluattan toplanmlgtlEl GPC3 ERY19-3 molekülü, in vitro sitotoksik aktiviteye yönelik olarak degerlendirilmistir. Sonuç, molekülün, GPC3 BiTE ile klýbslanabilen bir aktiviteye sahip oldugunu göstermektedir (Sekil 14). Fab-benzeri bir yaplîla sahip CD3 baglama alanIlEl, mevcut bulusun polipeptit kompleksi moleküllerinin stabilizasyonuna katkEêaglamasEibeklenmektedir. Protein A saflastlEna adIiERullanlIârak polipeptit komplekslerinin hazlEIlanmasD (1) Taslak Örnek 3'te hazEIlanan GPC3 ERY10-1'de, CH3, delik-içi-nob yap_ sahiptir. Iki H zincirinin heteromerik olarak birbiriyle birlestirildigi arzu edilen GPC3 ERY10-1 molekülü, her bir H zincirinin C terminusuna tutturulan His etiketi ve FLAG etiketi kullanllârak iki tür afinite saflastlElnasEi/aslüsMa saflastlElllB'ilgtE GPC3 ERY10-1 molekülünün bir farmasötik olarka üretilmesi durumunda, Polipeptit A kromatografisi ilk olarak, bir Fc alan. sahip bir polipeptit kompleksinin saflastlîllîhasljbin GPC3 ERY-10-1 eksprese eden hücrelerin kültür süpernatantEl üzerinde gerçeklestirilmektedir. Bu adllEJ, His etiketi afinite kromatografisi ve FLAG etiketi afinite kromatograûsinin kullanI[glDbir ilave kromatografik saflastlüria adHEliarafan takip edilmesi gerekmektedir. Bu, saflastlEna prosesinin maliyetinin artmasEile sonuçlanmaktadlE Dolaylîlýla, bu Örnek, bir His etiketi ve FLAG etiketi kullanllhiaks- yalnlîta Protein A kromatografisi vasßslýla, heteromerik olarak birlestirilen iki H zincirine sahip, arzu edilen GPC3 ERY10-1 molekülünün saflastlîlllîhaslßaglayan moleküler modifikasyonlarEihcelemistir. Spesifik olarak, iki H zincirinden birindeki Protein A baglanmalellEl elimine edilmesi için modifikasyonlar incelenmistir. Bu tür modifikasyonlarI bir sonucu olarak, Protein A baglaylEEI olmayan H zincirlerinin homomerik olarak birlestirilmesi durumunda, molekül Protein A'ya baglanamamaktadßve dolayEMa Protein A kromatografisinden geçmektedir. Diger yandan, Protein A baglaylEÜJImayan bir H zincirinin bir Protein A baglaylEZH-I zinciri ile birlestirildigi bir molekül ve Protein A baglaylîlZH zincirlerinin homomerik olarak birlestirildigi bir molekül, Protein A'ya yönelik afinite farkIÜJgil dayanarak, Protein A kromatografisi kullanilârak ayrlßbilmektedir. Ancak, antikor Fc alanIa, Protein A için baglama yeri, FcRn için baglama yeri ile kesismekte olup, bu, antikorun plazma tutulumu için gereklidir. DolaylgEa, FcRn- baglama aktivitesi korunurken, yalnlîta Protein A baglama aktivitesinin seçici sekilde indirgenmesi gerekmektedir. Bu sekildeki bir modifikasyon olarak, pozisyon 435'teki (EU numaralandlEinasEIl His'in Arg ile ikamesi kesfedilmistir. Iki H zincirinin heteromerik açilZIanan mutasyonlarI kombinasyonu (H zincirlerinden birindeki pozisyon 356'da (EU numaralandlElnasDJ bulunan Asp'nin Lys ile ikamesi, ve diger H zincirindeki pozisyon 439'da (EU numaralandülnasßgl bulunan Lys'nin Glu ile ikamesi), bunun, yalnlîta Protein A kromatografisi kullanilârak GPC3 ERY10-1 gibi polipeptit komplekslerinin saflastlEliIhasIlZl saglaylül saglamad [gll yönelik olarak test edilmistir. (2) Antikor geni ekspresyon vektörlerinin meydana getirilmesi ve ilgili antikorlarI ekspresyonu Antikor H zinciri degisken bölgesin için, GC33(2)H'yi (anti-insan GIipikan-3 antikoru H zinciri degisken bölgesi, SEKANS KIMLIK NUMARASI:61; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslZblarak islev görmektedir) kodlayan bir gen, teknikte uzman kisiler tarafldan bilinen bir yöntem ile meydana getirilmistir. Benzer sekilde, antikor L zinciri için, GC33-k0'l:|(anti-insan Glipikan-3 antikoru L zinciri, SEKANS KIMLIK NUMARASI:62; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslZioIarak islev görmektedir) kodlayan bir gen de teknikte uzman kisiler tarafIan bilinen bir yöntem ile meydana getirilmistir. Ard Idan, antikor H zinciri degisken bölgesi için, asagEIia açilîlanan genler, teknikte uzman kisiler taraflEldan bilinen bir yöntem ile meydana getirilmektedir. L. Tasarlanan molekül: LALA-Gld Pozisyonlar 234 ve 235'teki (EU numaralandlEinaslIlLeu'nun Ala ile ikame edildigi ve pozisyon 297'deki Asn'nin, Ala ile ikame edildigi ve C terminaldeki Ala ve Gly'nin IgGI sekansIa çÜZbrIIgiÇiLALA-Gld (SEKANS KIMLIK NUMARASI:63; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansljilarak islev görmektedir) M. Tasarlanan molekül: LALA-GId-CD3 Bir CF3 scFv'nin (anti-insan CD3 antikoru H bölgesi zinciri degisken bölgesi ve anti insan CD3 antikoru L zinciri degisken bölgesi bir polipeptit baglaymasltâsüla birbirine baglanmaktadlE) LALA-Gld'nin (SEKANS KIMLIK NUMARASI:63; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansÜJlarak islev görmektedir) C terminusuna baglandigiü LALA-Gld-CD3 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 64; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansßlarak islev görmektedir) N. Tasarlanan molekül: LALA-G3S3E-Gld LALA-Gld sekansIa (SEKANS KIMLIK NUMARASI:63; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEblarak islev görmektedir) posizyon 435'teki (EU numaralandlElnasD] His'nin Arg ile ikame edildigi ve pozisyon 439'daki (EU numaralandlElnasDgl Lys'nin Glu ile ikame edildigi LALA-G3S3E-Gld (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 65; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîblarak islev görmektedir) O. Tasarlanan molekül: LALA-S3K-GId-CD3 LALA-GId-CD3 sekansIa (SEKANS KIMLIK NUMARASI:64; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansElolarak islev görmektedir) pozisyon 356'daki (EU numaralandlElnasDJAsp'nin Lys ile ikame edildigi LALA-S3K-GId-CD3 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 66; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansßlarak islev görmektedir) Anti-insan GPC3 antikoru H zinciri genleri NTAlL ve NTA1R, GC33(2)H'nin aklg asagi-a süslîla LALA-GId-CD3 veya LALA-Gld'nin baglantilândlîiliiaslýla meydana getirilmistir. Bu zaman zarfIda, anti-insan GPC3 antikoru H zinciri genleri NTA2L ve NTAZR, GC33(2)H'nin aklgl asag-a leislîLIa LALA-S3K-GId-CD3 veya LALA-G3S3E-Gld'nin baglantüândlEllIhasMa meydana getirilmistir. NTA1L, NTA1R, NTA2L, NTA2R (H zincirleri), ve GC33-k0 (L zinciri) için ekspresyon vektörleri, her bir genin bir hayvan hücresi ekspresyon vektörü içerisine eklenmesiyle meydana getirilmistir. Bu vektörler asagi gösterildigi üzere kombine edilmistir ve asagi aç[Elanan polipeptit komplekslerinin kisa süreli olarak eksprese edilmesi için teknikte uzman kisiler tarafian bilinen bir yöntem vasliiislsîla FreeStyle293 hücrelerine (Invitrogen) verilmistir. Asaglîih gösterildigi üzere, polipeptit komplekslerine, [birinci H zinciri/ikinci H zinciri/L zinciri] sßsia kombine edilen, verilmis genlerin isimleri ile referans verilmektedir. NTA1L/NTA1R/GC33-k0 NTA2L/NTA2R/GC33-k0 (3) Eksprese edilen numunelerin saflastlîlilBwasEl ve heteromerik kompleks olusumu bakIiian degerlendirme Asagi gösterildigi üzere bir polipeptit kompleksi içeren FreeStyle293 hücrelerinin kültür süpernatantlîliburadan itibaren CM olarak adlandlEllIhaktadlE) bir numune olarak kullanilB1lStlEl NTA1L/NTA1R/GC33-k0 NTA2L/NTA2R/GC33-k0 CM, bir cpO.22-i.im filtreden geçirilmistir ve D-PBS ile dengelenen bir rProtein A Sepharose HlîllîAklSt] kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Yikama adilarlîll ve 2 ve elüsyon adIiEll, Tablo 1'de gösterilen tampon kullanüârak gerçeklestirilmistir. CM'nin yüklenme miktar|:l antikorun yüklenme miktari. 20 mg/ml reçine olacaglîlsekilde ayarlanmlgtE Ayrigtlîllân fraksiyonlar toplanmlgtlîlve fraksiyonlardaki bilesenlerin tanIilanmasEiçin boyut dßlamallîllromatografi ile analiz edilmistir. DENGE D-PBS YIKAMA 1 lmM sodyum asetat, 150mM NaCI, pH6.5 YIKAMA 2 0. 3mM HCI, 150mM NaCI, pH3. 7 ELÜSYON 1 2mM HCl, pH2. 7 Her bir ayrlgtlEiiÜilglfraksiyonun boyut dlîslamallîkromatografi analizinin donucu Sekil 15 ve Tablo 2'de gösterilmektedir. Degerler, elüsyon tepe noktasII yüzde alanlgöstermektedir. NTAlL/NTAlR/GC33-k0 veya NTA2L/NTA2R/GC33-k0 eksprese edildiginde, anti-GPC3 homomerik antikor (NTAlL/GC33-k0 veya NTA2L/GC33-k0) CM içerisinde neredeyse tespit edilememistir. Bu zaman zarfIa, anti-GPC3 homomerik antikor (NTA2R/GC33-k0) NTA2L/NTA2R/GC33-k0'I eksprese edildigi CM içerisinde yalnlîta yaklaslKl %2 iken, NTAIL/NTAIR/GC33-k0'I eksprese edildigi CM içerisinde yaklaslKl°/o76 idi. Bu sonuç, pozisyon 435'teki (EU numaralandlEnasDJ His'nin Arg ile ikame edilmesi durumunda ve ilgili H zincirlerinin heteromerik molekülünün etkili olusumunun mümkün klIJEhiasEl için H zincirlerinden birinceki polipeptit sekanslda bulunan pozisyon 356'daki (EU numaralandlîinasDJAsp'nin Lys ile ikame edilmesi ve diger H zincirindeki polipeptit sekansia bulunan pozisyon 439'daki (EU numaralandlîilnasDîl Lys'nin ise Glu ile ikame edilmesi durumunda, GPC3 ERY10-1 ile aynEl moleküler forma sahip heteromerik polipeptit kompleksleri, yalnlîta, Protein A'nI kullanI[g]El;aflastlElna adnEl/asitiisüla %98'den daha fazla olan bir safllElile birlikte etkili bir sekilde saflastlElâbilmektedir. CD3 homomerik antikor Heteromerik antikor GPC3 homomerik antikor (1) GPC3 ERY 17-2 ve GPC3 ERY 17-3'ün meydana getirilmesi ArdlEtlan, bir omurga olarak bir anti kanser antijeninin (GPC3) kullanilBiasEla ve Fab'lerden birinin bir CD3 epsilon baglama alanElile ikame edilmesiyle bir molekül meydana getirilmektedir. Yukarlah aç[lZlanan durumlarda oldugu gibi, omurga IgG'nin Fc'si, indirgenmis bir Fch (Fcv reseptörü) baglama aktivitesine sahip olan bir sessiz Fc idi. CD3 epsilon baglama alanlarülçin, anti-CD3 epsilon Fab'nin VH ve VL alanlarüGPC3 ERY17-2 üretimi için degistirilmistir (Sekil 19A) ve CH1 ve CL alanlarülse GPC3 ERY17-3 üretimi için degistirilmistir Spesifik olarak, yukarlâb açlKlanan yöntemde oldugu gibi uygun ilave sekanslarEliçeren primerlerin kullanIlgiElPCR gibi, teknikte uzman kisilerce bilinen bir yöntem valüslîtla, ekspresyon vektörlerinin bir serisi meydana getirilmis olup, buraya, ERY17-2_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 73; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEblarak islev görmektedir), ERY17-2_L (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 74; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüblarak islev görmektedir), ERY17-3_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 75; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEblarak islev görmektedir), veya ERY17-3_L'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 76; olgun sekans amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüolarak islev görmektedir) kodlayan bir polinükleotit eklenmistir. Ekspresyon vektörlerinin asaglki kombinasyonlarütasarlanan her bir molekülün k& süreli olarak eksprese edilmesi için FreeSter293-F hücrelerine verilmistir. P. Tasarlanan molekül: GPC3 ERY17-2 Ekspresyon vektörlerinin içine eklenen polinükleotitler tarafldan kodlayanan polipeptitler: sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansElblarak islev görmektedir), ve ERY17-2_L (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 74; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslIcMarak islev görmektedir) Q. Tasarlanan molekül: GPC3 ERY17-3 Ekspresyon vektörlerinin içine eklenen polinükleotitler taraflikjan kodlayanan polipeptitler: sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîolarak islev görmektedir), ve ERY17-3_L (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 76; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansmlarak islev görmektedir) (2) GPC3 ERY 17-2 ve GPC3 ERY 17-3'ün saflastlîlßîaslîl Elde edilen kültür süpernatantü bir Anti FLAG M2 kolonu (Sigma) üzerine yüklenmistir. YlKlamadan sonra, kolon ile ayrStlEllB'iIStlE Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, bir HisTrap HP kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. YllZlamadan sonra, kolon, bir imidazol konsantrasyon gradyanEile ayrigtlEllIhlStlEl Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, ultrafiltrasyon vasIBisEIa konsantre edilmistir. ArdIan, fraksiyon bir Superdex 200 kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Yalnlîta bir monomer fraksiyonu, tasarlanan, saflastlEllhllgl her bir molekülün elde edilmesi için eluattan toplanmlStE (3) GPC3 ERY 17-2 ve GPC3 ERY 17-3'ün sitotoksik aktivitesi GPC3 ERY 17-2 ve GPC3 ERY 17-3, in vitro sitotoksik aktivite için degerlendirilmistir (Sekil ). Sonuç, her iki molekülün de GPC3 BiTE'den daha fazla olan bir sitotoksik aktivite sergiledigini göstermistir. DolaylîlEa, ilk kez mevcut bulus, bir anti-kanser antijeni IgG'sinin bir omurga olarak kullanIlglEve Fab'lerden birinin bir CD3 epsilonu baglama alanlEa ikame edildigi moleküllerin, BiTE'ninki ile karsllâstlîllâbilir olan veya bundan daha fazla olan bir sitotoksik aktivite sergiledigini göstermistir. (4) PC-10 T hücresi transfer modelinin kullan-[glüGPCB ERY17-2'ye yönelik etkinlik testi In vitro denemede GPC3 BITE ile karsllâstlîliiâbilir veya bundan daha fazla olan bir sitotoksik aktivite sergiledigi gösterlen GPC3 ERY17-2, PC-10 T hücresi transfer modeli kullanlßrak in w'i/o etkinlik için degerlendirilmistir. Spesifik olarak, PC-10 T hücresi transfer modelinin kullanllîhasüla GPC3 ERY17-2 için etkinlik testi asag-ki gibi gerçeklestirilmistir. T hücresi genisletme kültürü, T hücresi aktivasyon/genisletme kiti/insan (MACS Miltenyi biotec) ve saglllZlÜgJönüllülerden alin kandan izole edilen PBMC'Ierin kullanllîhaslîla gerçeklestirilmistir. Insan akciger skuamöz karsinom hücre hattEPC-IO (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.) (1 x ile karlStlElllBilstEve ardlfitlan, bunun, NOD scid farelerinin (CLEA Japonya Inc.; disi, 7W) kasllZl bölgesine subkütanöz olarak transplasyonu gerçeklestirilmistir. Transplasyon günü, gün 0 olarak belirlenmistir. Transplasyondan önceki günde ve günler 13, 17, 21 ve 25'te, bir anti-asiyalo GMl antikoru (Wako Pure Chemical Industries), 0.2 mg/kafa miktarlîida farelere intraperitoneal sekilde uygulanmlgtlü Transplasyondan sonraki gün 13'te, fareler tümör boyutu ve vücut aglHl[glEl bakIilEUan gruplanmlStlE Transplasyondan sonraki gün 14'te, yukar- açlElandEglEüzere genisletme kültürü vasiûslýla hazlîlbnan T hücrelerinin, peritoneal kavite içerisine 3 x 107 hücre/kafa miktarlEtia transplasyonu saglanmEtEl Transplasyondan iki saat sonra, GPC ERY17-2, 30 ug/kafa miktarIa intraperitoneal sekilde uygulanmStlE GPC ERY17-2, günler Sonuç, bu modelin GPC3 ERY17-2 uygulama grubunda, çözücü uygulama grubuna klibsla, açlKl bir anti-tümör etkisi gözlemlendigini göstermektedir (Sekil 21). Yukari açiEIanan bulgu, bir anti-kanser antijeni IgG'sinin bir omurga olarak kullanIIgiEl/e Fab'lerden birinin bir CD3 epsilonu baglama alanlEa ikame edildigi moleküller, I'n V/'Vo sekilde açllZJ bir anti-tümör etkisi ürettigini göstermektedir. (1) GPC3 ERY17-2-M20'nin meydana getirilmesi ArdIan, CD3 epsilonu baglama alanEhaIine dönük degisimlerden sonra bile arzu edilen aktiviteyi koruyan bir molekül meydana getirilmistir. GPC3 ERY17-2-M20 (Sekil 19A) meydana getirilmis olup, burada CD3 epsilonu baglama alanIlEi sekansEidegistiriImistir. Spesifik olarak, bir anti-CD3 antikoru (M20) için bir ekspresyon vektörünün bir kallîil olarak kullanliîhasüla, yukarlâhki yöntemde oldugu gibi uygun ilave sekanslarEiçeren primerlerin kullanIlg'lEPCR gibi teknikte uzman kisilerce bilinen bir yöntem, bir ekspresyon vektörü serisinin üretilmesi için gerçeklestirilmis olup, buraya ERY17-2-M20_Hh (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 77; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslZblarak islev görmektedir) veya ERY17-2-M20_L'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 78; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansÜJIarak islev görmektedir) kodlayan bir polinükleotit eklenmistir. (2) GPC3 ERY17-2-M20'nin saflastiEllIhaslZl GPC3 ERY ve ERY için ekspresyon vektörleri, GPC3 ERY17- 2-M20'nin klgia süreli olarak eksprese edilmesi için FreeSter293-F hücrelerine birlikte verilmistir. Elde edilen kültür süpernatant bir (p0.22-um filtresinden geçirilmistir ve arlEtlan dengelenmis bir rProtein A Sepharose Fast Flow kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. SaflastIEIIhlgl GPC3 ERY17-2-M20, Tablo 3'te gösterilen tamponlar kullanüârak yiEiama adIiIarlZI ve 2 ve elüsyon adIiEI vasitîisûla elde edilmistir. DENGE Serbest Stil 293 Ekspresyon OrtamIIQInvitrogen), %1 Pen Strep (Invitrogen) YIKAMA 1 1mM sodyum asetat, 150mM NaCI, pH6.5 YIKAMA 2 0. 3mM HCl, 150mM NaCI, pH3. 7 ELÜSYON 1 2mM HCl, pH2. 7 (3) GPC3 ERY17-2-M20'nin sitotoksik aktivitesi klýhslanabilir bir sitotoksik aktivite göstermistir (Sekil 22). Bu bulgu, CD3 epsilonu baglama alanIda degistirilmis bir sekansa sahip olan moleküllerin bile klýlaslanabilir bir sitotoksik aktiviteye sahip oldugunu göstermektedir. Ard-an, farklübir kanser antijenini hedef alan, ancak arzu eidlen aktiviteyi koruyan moleküller meydana getirilmistir. GPC3 ERY17-2 içindeki anti-GPC3 Fab'nin bir anti-EpCAM bir anti-EpCAM Fab ile degistirildigi EpCAM ERY17-3 (Sekil 19B) üretilmistir. Spesifik olarak, bir anti-EpCAM antikoru için bir ekspresyon vektörünün bir kaIlEl olarak kullanilîhalea, yukar-ki yöntemde oldugu gibi uygun ilave sekanslarEiçeren primerleirin kullanI[g]l:PCR gibi teknikte uzman kisilerce bilinen bir yöntem, bir ekspresyon vektörü serisinin üretilmesi için gerçeklestirilmis olup, buraya EpCAM ERY17_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 79; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanleJIarak islev görmektedir) veya EpCAM ERY17_L'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 80; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansEbIarak islev görmektedir) kodlayan bir polinükleotit eklenmistir. Ekspresyon vektörlerinin asag-ki kombinasyonlarÇltasarIanan her bir molekülün klgla süreli olarak eksprese edilmesi için FreeSter293-F hücrelerine verilmistir. R. Tasarlanan molekül: EpCAM ERY17-2 Ekspresyon vektörlerinin içine eklenen polinükleotitler tarafüldan kodlayanan polipeptitler: EpCAM ERY17_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI:79; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslZbIarak islev görmektedir), EpCAM ERY17_L (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 80; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansüblarak islev görmektedir) ERY17-2_Hh, ve ERY17-2_L S. Tasarlanan molekül: EpCAM ERY17-3 Ekspresyon vektörlerinin içine eklenen polinükleotitler tarafIan kodlayanan polipeptitler: (2) EpCAM ERY17-2 ve EpCAM ERY17-3'ün safiastiîimiasü Elde edilen kültür süpernatantü bir Anti FLAG M2 kolonu (Sigma) üzerine yüklenmistir. YlElamadan sonra, kolon ile ayrlgtlElIBîlStEl Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, bir HisTrap HP kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. YllZlamadan sonra, kolon, bir imidazol konsantrasyon gradyanljle ayrlStlEliilgtlEl Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, ultrafiltrasyon vasltâslýla konsantre edilmistir. Ard-an, fraksiyon bir Superdex 200 kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. YalnEta bir monomer fraksiyonu, tasarlanan, saflastlElliilgl her bir molekülün elde edilmesi için eluattan toplanmlStB (3) EpCAM ERY17-2 ve EpCAM ERY17-3'ün sitotoksik aktivitesi EpCAM ERY17-2 ve EpCAM ERY17-3 in vitro sitotoksik aktivite için test edilmistir ve her ikisi de güçlü bir sitotoksik aktivite göstermistir (Sekil 23). Dolaylgsîla, mevcut bulus, bir anti- kanser antijeni IgG'sinin bir omurga olarak kullanIiglül'e Fab'lerden birinin bir CD3 epsilonu baglama alanlîLla ikame edildigi moleküllerin, kanser antijeni türü degistirildiginde bile bir sitotoksik aktiviteye sahip oldugunu göstermistir. meydana getirilmesi ve degerlendirilmesi (1) Bispesifik antikorun tasarlanmaslîl Bir bispesifik antikorun CH1 ve CL alanlarlEUan her birine mutasyonlarl verilmesi ve böylelikle CH1/CL arayüzünde elektrik yükü itiminin kullanIlýla CH1/CL arayüzey birlesmesnin modüle edilmesi vasltâslsîla, spesifik birlesmenin, anti-GPC3 H zinciri ve L zinciri arasIa ve anti-CD3 H zinciri ve L zinciri arasIa meydana gelmesine olanak saglanabilmektedir. Elektrik yükü itiminin kullanIiEla CH1/CL arayüzey birlesmesinin modüle edilmesi içn, H zincirlerindeki CH1 veya L zincirlerindeki CL'deki amino asit kallEtllârlîpozitif yüklü Lys ile veya negatif yüklü Glu ile ikame edilmistir. (2) Antikor genlerine yönelik ekspresyon vektörlerinin meydana getirilmesi ve ilgili antikorlarI ekspresyonu Bir spesifik antikor (Sekil 24A), anti-CD3 antikoru M12 (H zinciri, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 81; L zinciri, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 82) ve anti-GPC3 antikoru GC33(2)'nin (H zinciri, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 83; L zinciri, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 84) CH 1/CL arayüzey birlesmesinin modüle edilmesi ve ayrlîia H zincirlerinin birbirleriyle birlesmesinin önlenmesi için delik-içi-nob (KiH) modifikasyonlarII bunlara verilmesi vasißslýla meydana getirilmistir birlesmesi modülasyonu veya delik-içi-nob (KiH) modifikasyonlarIan hiç birinin verilmedigi bir kontrol bispesifik antikoru (Sekil 24B) da meydana getirilmistir. Spesifik olarak, M12'nin H zincirinin CH1'i içerisindeki birkaç amino asitin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 81) Lys ile ikame edildigi M12_TH2h (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 85) veya L zincirinin VL'sindeki birkaç amino asitin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 82) Glu ile ikamed edildigi M12_TL17'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 86) kodlayan bir polinükleotite bir eklenti olarak sahip olan ekspresyon vektörleri, teknikte uzman kisiler taraflEtlan bilinen bir yöntem ile meydana getirilmistir. Benzer sekilde, GC33(2)'nin H zincirinin CHl'i içerisindeki birkaç amino asitin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 83) GIU ile ikame edildigi GC33(2)_TH13k (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 87) veya GC veya L zincirinin CL'sindeki birkaç amino asitin (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 84) Lys ile ikame edildigi GC33(2)_TL16 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 89) veya GC kodlayan bir polinükleotite bir eklenti olarak sahip olan ekspresyon vektörleri, teknikte uzman kisiler taraflEUan bilinen bir yöntem ile meydana getirilmistir. Ekspresyon vektörlerinin asag-ki kombinasyonlarütasarlanan her bir molekülün kEia süreli olarak eksprese edilmesi için FreeSter293-F hücrelerine verilmistir. T. Tasarlanan molekül: GM1 Ekspresyon vektörleri: M12_TH2h (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 85), M12_TL17 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 86), GC, ve U. Tasarlanan molekül: GM2 Ekspresyon vektörleri: M12_TH2h (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 85), M12_TL17 (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 86), GC, ve V. Tasarlanan molekül: GMO Ekspresyon vektörleri: M12'nin H zinciri (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 81), M12'nin L zinciri (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 82), GC, ve Elde edilen kültür süpernatantldan, rProtein A SepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare) kullanIlg'lÇI teknikte uzman kisiler taraflEUan bilinen bir yöntem vaslßslîla antikorlar saflastlElIBilgtlü (3) GM 1, GM2, ve GMO'I sitotoksik aktivitesi Polipeptit kompleksleri GM1, GM2, ve GMO, in vitro sitotoksik aktiviteye yönelik olarak degerlendirilmistir. Sonuç, GM1 ve GM2'nin, klýbslanabilir bir sitotoksik aktivite sergiledigini ve bu aktivitenin, GMO'IEkinden açüg sekilde daha fazla oldugunu göstermistir (Sekil 25). Dolayßýla, mevcut bulus, CHl/CL arayüzey birlesmesinin modülasyonunun ve KiH modifikasyonlarII kombinasyonunun, bispesifik antikorlar. etkili bir sekilde üretilmesini mümkün kIIlgllîgJöstermektedir. (1) EGFR ERY17-2'nin meydana getirilmesi DahaslZl bir baska kanser antijenini hedefleyen, arzu edilen aktiviteye sahip bir molekül Fab'si ile degistirilmesiyle meydana getirilmistir. Spesifik olarak, bir kallü olarak, bir anti-EGFR antikorunun bir ekspresyon vektörünün kullanllüiasüla, yukarlîlbki yöntemde oldugu gibi uygun Ilave sekanslarüberen primerleirin kullanIlglüPCR gibi teknikte uzman kisilerce bilinen bir yöntem, bir ekspresyon vektörü serisinin üretilmesi için gerçeklestirilmis olup, buraya EGFR ERY17_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 91; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi Içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîrblarak islev görmektedir) veya EGFR ERY17_L'yi (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 90; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansIJJIarak islev görmektedir) kodlayan bir polinükleotit eklenmistir. Ekspresyon vektörlerinin asag-ki kombinasyonlarütasarlanan her bir molekülün klgla süreli olarak eksprese edilmesi için FreeStyle293-F hücrelerine verilmistir. W. Tasarlanan molekül: EGFR ERY17-2 Ekspresyon vektörlerinin içine eklenen polinükleotitler tarafIian kodlayanan polipeptitler: EGFR ERY17_Hk (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 91; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekansElolarak islev görmektedir), EGFR ERY17_L (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 92; olgun sekans, amino terminal 19 amino asidi içermemekte olup, bu bir sinyal sekanslîcblarak islev görmektedir) ERY17-2_Hh, ve ERY17-2_L. (2) EGFR ERY17-2'nin saflastlEIlßîasEl Elde edilen kültür süpernatantlarÇlbir Anti FLAG M2 kolonu (Sigma) üzerine yüklenmistir. YllZlamadan sonra, kolon ile ayrlgtlEllBilstE Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, bir HisTrap HP kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. YllZlamadan sonra, kolon, bir imidazol konsantrasyon gradyanEile ayrStEllBîlgIE Tasarlanan molekülü içeren bir fraksiyon, ultrafiltrasyon vasltâslýla konsantre edilmistir. ArdIdan, fraksiyon bir Superdex 200 kolonu (GE Healthcare) üzerine yüklenmistir. Yalnlîta bir monomer fraksiyonu, tasarlanan, saflastmlgl her bir molekülün elde edilmesi için eluattan toplanmlgtm (3) EGFR ERY17-2'nin sitotoksik aktivitesi EGFR ERY17-2 in vitro sitotoksik aktivite Için test edilmistir ve her ikisi de güçlü bir sitotoksik aktivite göstermistir (Sekil 26). Dolaylgsîla, mevcut bulus, bir anti-kanser antijeni IgG'sinin bir omurga olarak kullanIl'g'lEl/e Fab'lerden birinin bir CD3 epsilonu baglama alanlEa ikame edildigi moleküllerin, kanser antijeni GPC3 veya EpCAM veya daha fa degistirilen bir kanser antijeni türü oldugunda bile bir sitotoksik aktiviteye sahip oldugunu göstermistir. Endüstriyel Uygulanabilirlik Mevcut bulus, BiTE'nin sahip oldugu güçlü anti tümör aktivitesini tutan ve kanda uzun bir yarD ömrün yanlis& kanser antijenine baglill3itokin flIü-sEveya benzerinin indüklenmemesi ile sonuçlanan oldukça iyi güvenlik niteliklerine sahip olan yeni polipeptit kompleksleri sunmaktadE Mevcut bulusun bir polipeptit kompleksinin antijen baglama alanElikame edildiginde, hücresel sitotoksisitenin indüklenmesine yönelik bir aktif içerik maddesi olarak polipeptit kompleksi içeren terapötik maddeler çesitli hücreleri hedefleyebilmektedir ve bunlara zarar verebilmektedir. Dolaylglîla, birçok kanser tedavi edilebilmekte veya önlenebilmektedir. Bu, fazlaca güvenli ve uygun olan, arzu edilen tedavileri mümkün kilîhaktad iElve hastalara yönelik fiziksel yükü de azaltmaktadlEI TR TR TR TR TR TR TR
TR2018/15863T 2010-11-30 2011-11-30 Sitotoksisiteyi indükleyen terapötik madde. TR201815863T4 (tr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010266760 2010-11-30
JP2011121771 2011-05-31
JP2011238818 2011-10-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201815863T4 true TR201815863T4 (tr) 2018-11-21

Family

ID=46171913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/15863T TR201815863T4 (tr) 2010-11-30 2011-11-30 Sitotoksisiteyi indükleyen terapötik madde.

Country Status (23)

Country Link
US (4) US11066483B2 (tr)
EP (7) EP3434767A1 (tr)
JP (9) JP6278598B2 (tr)
KR (5) KR20240025059A (tr)
CN (2) CN103429737B (tr)
AR (1) AR084053A1 (tr)
AU (3) AU2011337697B2 (tr)
BR (1) BR112013013311A2 (tr)
CA (1) CA2819530C (tr)
DK (1) DK2647707T3 (tr)
ES (1) ES2693232T3 (tr)
HK (1) HK1259128A1 (tr)
HR (1) HRP20181615T1 (tr)
LT (1) LT2647707T (tr)
MX (1) MX349057B (tr)
PL (1) PL2647707T3 (tr)
PT (1) PT2647707T (tr)
RU (1) RU2663123C2 (tr)
SG (2) SG190726A1 (tr)
SI (1) SI2647707T1 (tr)
TR (1) TR201815863T4 (tr)
TW (6) TWI807362B (tr)
WO (1) WO2012073985A1 (tr)

Families Citing this family (157)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
EP2009101B1 (en) 2006-03-31 2017-10-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
DK2006381T3 (en) 2006-03-31 2016-02-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROCEDURE FOR REGULATING ANTIBODIES BLOOD PHARMACOKINETICS
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
ES2687808T3 (es) 2007-09-26 2018-10-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
DK2417156T3 (en) 2009-04-07 2015-03-02 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US10053513B2 (en) * 2009-11-30 2018-08-21 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
LT2647707T (lt) * 2010-11-30 2018-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Citotoksiškumą indukuojantis terapinis agentas
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
JP5764677B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-19 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗原結合タンパク質
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
SG194510A1 (en) 2011-04-22 2013-12-30 Emergent Product Dev Seattle Prostate-specific membrane antigen binding proteins and related compositionsand methods
MX340498B (es) 2011-06-30 2016-07-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polipeptido heterodimerizado.
JP5925893B2 (ja) * 2011-08-23 2016-05-25 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性抗原結合分子
WO2013026839A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US11851476B2 (en) 2011-10-31 2023-12-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
US12384848B2 (en) 2011-12-19 2025-08-12 The Rockefeller University Anti-inflammatory polypeptides
CN104010659A (zh) 2011-12-19 2014-08-27 洛克菲勒大学 非唾液酸化的抗炎多肽
EP4310191A3 (en) 2012-06-14 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing modified fc region
RU2639287C2 (ru) 2012-06-27 2017-12-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ отбора и получения высокоселективных и мультиспецифичных нацеливающих групп с заданными свойствами, включающих по меньшей мере две различные связывающие группировки, и их применения
KR20150030744A (ko) 2012-06-27 2015-03-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 표적에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 단위를 포함하는 항체 Ｆｃ－영역 접합체의 제조 방법 및 그의 용도
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
JP6581505B2 (ja) 2012-10-03 2019-09-25 ザイムワークス，インコーポレイテッド 重鎖および軽鎖ポリペプチドの対を定量化する方法
JP6306596B2 (ja) 2012-10-04 2018-04-04 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション セリンプロテアーゼ分子および療法
RU2015117393A (ru) 2012-10-08 2016-12-10 Роше Гликарт Аг Лишенные fc антитела, содержащие два Fab-фрагмента, и способы их применения
CN120365432A (zh) * 2012-11-21 2025-07-25 武汉友芝友生物制药股份有限公司 双特异性抗体
KR102545617B1 (ko) * 2012-11-28 2023-06-20 자임워크스 비씨 인코포레이티드 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
CN105102618B (zh) 2012-12-27 2018-04-17 中外制药株式会社 异源二聚化多肽
HRP20191865T1 (hr) 2013-01-14 2020-01-10 Xencor, Inc. Novi heterodimerni proteini
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
EA201891502A1 (ru) 2013-02-26 2018-12-28 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
RU2015140915A (ru) * 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
ME03675B (me) 2013-07-05 2020-10-20 Genmab As Humanizovana ili himerna anтi-cd3 antiтela
ES2881306T3 (es) 2013-09-27 2021-11-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método para la producción de heteromultímeros de polipéptidos
RU2016115866A (ru) 2013-10-11 2017-11-16 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифические антитела с обменянными доменами и одинаковыми вариабельными доменами легкой цепи
MX389442B (es) * 2013-11-11 2025-03-20 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Región variable de anticuerpo modificada que contiene molécula de unión al antígeno.
KR102357961B1 (ko) 2013-12-17 2022-02-08 제넨테크, 인크. 항-cd3 항체 및 이의 사용 방법
TWI701042B (zh) 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
EP3126389B1 (en) 2014-04-02 2024-10-23 F. Hoffmann-La Roche AG Method for detecting multispecific antibody light chain mispairing
MX380176B (es) 2014-04-07 2025-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula ligada a antigeno inmunoactivada.
US11505605B2 (en) 2014-05-13 2022-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
EA201692476A1 (ru) * 2014-05-28 2017-07-31 Займворкс Инк. Модифицированные антигенсвязывающие полипептидные конструкции и их применение
US9884921B2 (en) 2014-07-01 2018-02-06 Pfizer Inc. Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
US9777073B2 (en) * 2014-07-21 2017-10-03 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Construction and application of bispecific antibody EpCAM×CD3
AR101262A1 (es) * 2014-07-26 2016-12-07 Regeneron Pharma Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos
WO2016016299A1 (en) * 2014-07-29 2016-02-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
KR102411972B1 (ko) * 2014-08-04 2022-06-23 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
EP2982692A1 (en) * 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
CA2958479A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3204415B1 (en) 2014-10-09 2020-06-17 EngMab Sàrl Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
WO2016076345A1 (ja) 2014-11-11 2016-05-19 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子のライブラリ
SI3221359T1 (sl) 2014-11-17 2020-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Metode zravljenja tumorja z uporabo bispecifičnega protitelesa CD3XCD20
RS60615B1 (sr) 2014-11-20 2020-08-31 Hoffmann La Roche Zajednički laki lanci i postupci upotrebe
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
LT3789402T (lt) 2014-11-20 2022-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Kompleksinė terapija, naudojant t ląsteles aktyvinančias bispecifines antigeną surišančias molekules ir pd-1 ašį surišančius antagonistus
CN107074955B (zh) 2014-11-20 2021-06-22 豪夫迈·罗氏有限公司 针对FolR1和CD3的T细胞活化性双特异性抗原结合分子
CN116333153A (zh) 2014-11-26 2023-06-27 森科股份有限公司 结合cd3和肿瘤抗原的异二聚体抗体
EP3223907A2 (en) 2014-11-26 2017-10-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
PL3227332T3 (pl) 2014-12-03 2020-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Wielospecyficzne przeciwciała
CN114478792A (zh) * 2015-01-08 2022-05-13 根马布股份公司 针对cd3和cd20的双特异性抗体
KR20240091253A (ko) * 2015-02-16 2024-06-21 론자 리미티드 Cl 및/또는 ch1 돌연변이된 약물 접합용 항체
EA202191471A1 (ru) 2015-03-04 2022-01-31 Зе Рокфеллер Юниверсити Противовоспалительные полипептиды
EP3277725B1 (en) 2015-03-30 2020-11-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
WO2016159213A1 (ja) * 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
US11400157B2 (en) 2015-05-13 2022-08-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multiple antigen binding molecular fusion, pharmaceutical composition, method for identifying linear epitope, and method for preparing multiple antigen binding molecular fusion
US10323094B2 (en) 2015-06-16 2019-06-18 Genentech, Inc. Humanized and affinity matured antibodies to FcRH5 and methods of use
JP6996983B2 (ja) 2015-06-16 2022-02-21 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｃｌｌ－１抗体及び使用方法
EA039859B1 (ru) 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
KR102440820B1 (ko) * 2015-09-08 2022-09-05 테리피온, 인크. ApoA-1 융합 폴리펩티드 및 관련 조성물 및 방법
WO2017053469A2 (en) 2015-09-21 2017-03-30 Aptevo Research And Development Llc Cd3 binding polypeptides
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
EP3356417A1 (en) * 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules binding mesothelin and cd3
CN107849137B (zh) 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ceaxcd3 t细胞活化性抗原结合分子
EP3150637A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
CA3000869A1 (en) 2015-10-08 2017-04-13 Zymeworks Inc. Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof
JP6920293B2 (ja) * 2015-10-30 2021-08-18 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ＩｇＧ軽鎖におけるＮ末端切断の防止
JP6931329B2 (ja) 2015-11-18 2021-09-01 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
EP3378488A4 (en) * 2015-11-18 2019-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR IMPROVING THE HUMORAL IMMUNE REACTION
KR20180085800A (ko) 2015-12-07 2018-07-27 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 psma에 결합하는 이종이합체성 항체
IL257696B2 (en) 2015-12-09 2024-11-01 Hoffmann La Roche Type ii anti-cd20 antibody for reducing formation of anti-drug antibodies
JP7219005B2 (ja) 2015-12-28 2023-02-07 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域含有ポリペプチドの精製を効率化するための方法
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
JP2019506158A (ja) 2016-01-22 2019-03-07 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｒｏｒ１抗体、ｒｏｒ１×ｃｄ３二重特異性抗体、及びそれらの使用法
LT3411404T (lt) 2016-02-03 2022-12-27 Amgen Research (Munich) Gmbh Psma ir cd3 bispecifiniai, t ląsteles aktyvuojantys antikūno konstruktai
PT3411402T (pt) 2016-02-03 2022-02-01 Amgen Inc Construtos de anticorpos biespecíficos engajadores de células t contra bcma e cd3
EP3431102A4 (en) 2016-03-14 2019-09-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CELL DAMAGING THERAPEUTIC MEDICAMENT FOR USE IN CANCER THERAPY
FI3433280T3 (fi) 2016-03-22 2023-06-06 Hoffmann La Roche Proteaasin aktivoimia t-solubispesifisiä molekyylejä
JP7320943B2 (ja) 2016-04-28 2023-08-04 中外製薬株式会社 抗体含有製剤
IL263542B2 (en) 2016-06-14 2024-10-01 Xencor Inc Bispecific antibodies inhibit immunological checkpoint
KR20190020341A (ko) 2016-06-28 2019-02-28 젠코어 인코포레이티드 소마토스타틴 수용체 2에 결합하는 이종이량체 항체
ES3000558T3 (en) 2016-08-10 2025-02-28 Univ Ajou Ind Academic Coop Found Heterodimeric fc-fused cytokine and pharmaceutical composition comprising the same
JP2019529499A (ja) * 2016-09-30 2019-10-17 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 組織指向性発現を用いた抗体ベースの遺伝子治療
WO2018060301A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against cd3
WO2018093821A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
ES2871146T3 (es) 2017-07-14 2021-10-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Molécula de polipéptido con especificidad dual mejorada
AU2018361430B2 (en) 2017-11-01 2025-08-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody variant and isoform with lowered biological activity
AU2018366199A1 (en) 2017-11-08 2020-05-28 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
TW201938194A (zh) 2017-12-05 2019-10-01 日商中外製藥股份有限公司 包含結合cd3及cd137的改變的抗體可變區之抗原結合分子
WO2019131988A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
MX2020008289A (es) 2018-02-08 2020-09-25 Genentech Inc Moleculas biespecificas de union al antigeno y metodos de uso.
JP7466442B2 (ja) 2018-02-14 2024-04-12 中外製薬株式会社 抗原結合分子および組合せ
CN112469477A (zh) 2018-04-04 2021-03-09 Xencor股份有限公司 与成纤维细胞活化蛋白结合的异源二聚体抗体
JPWO2019244973A1 (ja) 2018-06-20 2021-07-08 中外製薬株式会社 標的細胞に対する免疫反応を活性化する方法およびその組成物
MD3823665T2 (ro) 2018-07-19 2024-05-31 Regeneron Pharma Receptori antigenci chimerici cu specificitate BCMA și utilizările acestora
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
BR112021001693A2 (pt) 2018-08-03 2021-05-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha molécula de ligação ao antígeno contendo dois domínios de ligação ao antígeno q ligados entre si
RS66543B1 (sr) 2018-08-31 2025-03-31 Regeneron Pharma Strategija doziranja koja ublažava sindrom oslobađanja citokina za cd3/cd20 bispecifična antitela
CA3115680A1 (en) * 2018-10-23 2020-04-30 Magenta Therapeutics, Inc. Fc silenced antibody drug conjugates (adcs) and uses thereof
AU2019366956B2 (en) * 2018-10-23 2025-10-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Heterodimeric Fc-fused proteins
EP3870331B1 (en) * 2018-10-25 2025-07-23 F. Hoffmann-La Roche AG Modification of antibody fcrn binding
TW202033218A (zh) * 2018-12-07 2020-09-16 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 多特異性蛋白分子
EP3898681A2 (en) * 2018-12-17 2021-10-27 Alligator Bioscience AB Polypeptides
CN114007643A (zh) 2019-04-19 2022-02-01 中外制药株式会社 识别抗体改变部位的嵌合受体
JP7688584B2 (ja) * 2019-04-25 2025-06-04 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー ポリペプチド鎖の交換により活性化される治療用多重特異性ポリペプチド
AU2020291300A1 (en) 2019-06-10 2022-01-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-T cell antigen-binding molecule to be used in combination with cytokine inhibitor
AU2020292304B2 (en) 2019-06-11 2023-03-30 Bioatla, Inc. Conditionally active anti-EpCam antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
CN112111012B (zh) * 2019-06-20 2023-07-04 成都恩沐生物科技有限公司 共价多特异性抗体
CN114786720B (zh) * 2019-12-05 2025-08-22 艾贝乐医药科技有限公司 TriAx抗体的组合物及其制备和使用方法
BR112022011357A2 (pt) 2019-12-13 2022-08-23 Genentech Inc Anticorpos isolado, um ou mais ácidos nucleicos isolados, um ou mais vetores, uma ou mais células hospedeiras, composição, kit, uso do anticorpo, métodos para produzir o anticorpo e método para tratar ou retardar a progressão de um câncer ly6g6d positivo
AU2020408707A1 (en) * 2019-12-18 2022-08-11 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for in vivo biological targeting
TWI869528B (zh) 2020-01-13 2025-01-11 美商威特拉公司 C5ar1抗體分子及其用途
CN111333720B (zh) * 2020-03-16 2021-11-02 重庆理工大学 抗hpv16e7蛋白单抗79a11、杂交瘤细胞株及其制备方法和应用
EP4126970A4 (en) 2020-03-31 2024-05-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing multispecific antigen-binding molecules
PH12022500013A1 (en) 2020-03-31 2023-09-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Dll3-targeting multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
US20230147840A1 (en) 2020-03-31 2023-05-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Immune activating multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
US20230227570A1 (en) 2020-05-08 2023-07-20 Genmab A/S Bispecific antibodies against cd3 and cd20
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
GB2595299B (en) 2020-05-21 2022-08-03 Mabsolve Ltd Modified immunoglobulin FC regions
TWI852680B (zh) 2020-06-19 2024-08-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與 cd3 及 cd19 結合之抗體
AU2021292932A1 (en) 2020-06-19 2023-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-T cell antigen-binding molecule for use in combination with angiogenesis inhibitor
KR102607909B1 (ko) 2020-08-19 2023-12-01 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
CA3190349A1 (en) 2020-09-10 2022-03-17 Brian Elliott Bispecific antibodies against cd3 and cd20 for treating chronic lymphocytic leukemia
JP2023541860A (ja) 2020-09-10 2023-10-04 ジェンマブ エー／エス びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫を治療するための併用療法におけるｃｄ３及びｃｄ２０に対する二重特異性抗体
UY39467A (es) 2020-10-13 2022-04-29 Janssen Biotech Inc Inmunidad mediada por células t de bioingeniería, materiales y otros métodos para modular el grupo de diferenciación iv y / o viii
US12351643B2 (en) 2020-11-04 2025-07-08 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-CD20/anti-CD3 bispecific antibodies
TWI888665B (zh) 2020-11-04 2025-07-01 美商建南德克公司 抗cd20/抗cd3雙特異性抗體之皮下給藥
JP2024511319A (ja) 2021-03-09 2024-03-13 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｃｌｄｎ６に結合するヘテロ二量体抗体
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
MX2023012408A (es) 2021-04-30 2023-10-31 Hoffmann La Roche Dosis para tratamiento conjunto con anticuerpo biespecifico anti-cd20/anti-cd3 y conjugado anticuerpo farmaco anti-cd79b.
US12162940B2 (en) 2021-05-05 2024-12-10 Immatics Biotechnologies Gmbh BMA031 antigen binding polypeptides
US12291575B2 (en) 2021-05-14 2025-05-06 Genentech, Inc. Methods for treatment of CD20-positive proliferative disorder with mosunetuzumab and polatuzumab vedotin
WO2023087255A1 (zh) * 2021-11-19 2023-05-25 武汉友芝友生物制药股份有限公司 双特异性抗体及其应用

Family Cites Families (297)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2729949A (en) * 1954-11-19 1956-01-10 Rca Corp Cumulative cooling system
US3773719A (en) 1966-12-06 1973-11-20 Hoffmann La Roche 2-aminoxy-2'-acyl-acetanilide
US4658019A (en) 1979-04-26 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Complement-fixing monoclonal antibody to human T cells
JPS5912436B2 (ja) 1980-08-05 1984-03-23 ファナック株式会社 工業用ロボットの安全機構
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DE3785186T2 (de) 1986-09-02 1993-07-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
JP2546544B2 (ja) 1989-10-27 1996-10-23 アーチ ディベラップメント コーポレイション 免疫強化を促進するための方法と組成物
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
AU665190B2 (en) 1990-07-10 1995-12-21 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
JP3540315B2 (ja) 1991-09-23 2004-07-07 メディカル リサーチ カウンシル キメラ抗体の製造−組合せアプローチ
US5474771A (en) 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
US6027725A (en) 1991-11-25 2000-02-22 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
ATE408012T1 (de) 1991-12-02 2008-09-15 Medical Res Council Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9206422D0 (en) 1992-03-24 1992-05-06 Bolt Sarah L Antibody preparation
WO1993019172A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
UA40577C2 (uk) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
DE4419399C1 (de) 1994-06-03 1995-03-09 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US5945311A (en) 1994-06-03 1999-08-31 GSF--Forschungszentrumfur Umweltund Gesundheit Method for producing heterologous bi-specific antibodies
EP0770628B9 (en) 1994-07-13 2007-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
US6485943B2 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The University Of Chicago Method for altering antibody light chain interactions
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JP4312259B2 (ja) 1995-04-27 2009-08-12 アムジェン フレモント インク． 免疫したゼノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）に由来するヒト抗体
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US6805869B2 (en) 1996-06-12 2004-10-19 Shanghai Cp Guojian Pharmaceutical Co., Ltd. Cellular vaccines and immunotherapeutics and methods for their preparation
ATE210682T1 (de) * 1996-09-03 2001-12-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Zerstörung von kontaminierenden tumorzellen in stammzelltransplantaten mit bispezifischen antikörpern
EP0979281B1 (en) 1997-05-02 2005-07-20 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20030207346A1 (en) 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU4009899A (en) 1998-05-23 1999-12-13 Tanox, Inc. Molecules targeting cd40 and tumor cells
ATE251181T1 (de) 1998-07-28 2003-10-15 Micromet Ag Heterominikörper
US7029652B2 (en) 1998-09-16 2006-04-18 The Regents Of The University Of California Method of treating tumors
WO2000018806A1 (de) * 1998-09-25 2000-04-06 Horst Lindhofer Bispezifische und trispezifische antikörper, die spezifisch mit induzierbaren oberflächenantigenen als operationelle zielstrukturen reagieren
US20030035798A1 (en) 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
BR0008758A (pt) 1999-01-15 2001-12-04 Genentech Inc Variantes de polipeptìdeos parentais com funçãoefetora alterada, polipeptìdeos, composição ácidonucleico isolado, vetor, célula hospedeira,método para produzir uma variante depolipeptìdeo, método para o tratamento de umadesordem em mamìferos e método para produziruma região fc variante
WO2000053633A2 (de) 1999-03-11 2000-09-14 Micromet Ag Antikörper- und chemokinkonstrukte, die gegen ccr5 gerichtet sind, und ihre verwendung in der behandlung von autoimmunkrankheiten
EP2306495B1 (en) 1999-05-13 2017-04-19 The Trustees of Princeton University Very high efficiency organic light emitting devices based on electrophosphorescence
JP2004505609A (ja) 2000-04-03 2004-02-26 オックスフォード　グリコサイエンシズ（ユーケー）　リミテッド 核酸分子、ポリペプチド、ならびにアルツハイマー病の診断および処置を含むそれらの使用
WO2001090192A2 (en) * 2000-05-24 2001-11-29 Imclone Systems Incorporated Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
DE10034607A1 (de) 2000-07-20 2002-02-07 Gundram Jung Multispezifisches Reagenz zur selektiven Stimulierung von Zelloberflächenrezeptoren
PL366062A1 (en) 2000-09-08 2005-01-24 Micromet Ag Antibody and/or chemokine constructs and their use in immunological disorders
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
RU2179862C1 (ru) 2000-12-26 2002-02-27 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственный центр "МедБиоСпектр" Лекарственное средство для предотвращения отторжения трансплантата, моноклональное антитело к cd3-антигену т-лимфоцитов человека, гибридома и способ лечения больных, имеющих реакцию острого отторжения трансплантата после пересадки почки
CN1294148C (zh) * 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
EP2208784B1 (en) 2001-06-22 2013-01-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell proliferation inhibitors containing anti-glypican 3 antibody
ATE430580T1 (de) 2001-10-25 2009-05-15 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
US20030190705A1 (en) 2001-10-29 2003-10-09 Sunol Molecular Corporation Method of humanizing immune system molecules
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
US20040018557A1 (en) 2002-03-01 2004-01-29 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US20030216551A1 (en) 2002-03-08 2003-11-20 Diabetogen Biosciences Inc. Fully human anti-CD3 monoclonal antibodies
US20050130224A1 (en) 2002-05-31 2005-06-16 Celestar Lexico- Sciences, Inc. Interaction predicting device
AU2003242024A1 (en) 2002-06-05 2003-12-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of constructing antibody
DK1517921T3 (da) * 2002-06-28 2006-10-09 Domantis Ltd Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf
AU2002328429A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CONSTRUCTION OF ANTIBODY USING MRL/lpr MOUSE
US20060235208A1 (en) 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
CA2499816C (en) 2002-09-27 2013-07-30 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
GB0224082D0 (en) 2002-10-16 2002-11-27 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2004035607A2 (en) 2002-10-17 2004-04-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
CA2508264A1 (en) 2002-12-05 2004-06-24 Protein Design Labs, Inc. Methods of treatment of ulcerative colitis with anti-cd3 antibodies
EP1587540B1 (en) 2003-01-09 2021-09-15 MacroGenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
WO2004065611A1 (ja) 2003-01-21 2004-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の軽鎖スクリーニング方法
EP1591527B1 (en) 2003-01-23 2015-08-26 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to human pd-1
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
JP2004321100A (ja) 2003-04-25 2004-11-18 Rikogaku Shinkokai ＩｇＧのＦｃ領域を含むタンパク質の変異体
CA2766627C (en) 2003-05-02 2019-12-03 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
RS20150135A1 (sr) 2003-05-30 2015-08-31 Genentech Inc. Tretman sa anti-vegf antitelima
EP2395017A3 (en) 2003-05-30 2012-12-19 Merus B.V. Design and use of paired variable regions of specific binding molecules
NZ545776A (en) 2003-08-22 2009-05-31 Biogen Idec Inc Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
US20070148170A1 (en) 2005-10-03 2007-06-28 Desjarlais John R Fc Variants With Optimized Fc Receptor Binding Properties
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
KR101229731B1 (ko) 2003-10-16 2013-03-07 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 다중특이적 탈면역화된 ｃｄ3-바인더
ME01775B (me) 2003-11-05 2011-02-28 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antitijela sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
ZA200604620B (en) 2003-12-10 2007-10-31 Medarex Inc IP-10 antibodies and their uses
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
EP1756162A1 (en) 2004-03-23 2007-02-28 Biogen Idec MA Inc. Receptor coupling agents and therapeutic uses thereof
GB0409799D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Isis Innovation Method of generating improved immune response
ES2526343T3 (es) 2004-06-03 2015-01-09 Novimmune Sa Anticuerpos anti-CD3 y métodos de uso de los mismos
CN1984931B (zh) * 2004-06-03 2012-11-28 诺维莫尼公司 抗-cd3抗体及其使用方法
DE602005024502D1 (de) 2004-07-09 2010-12-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-glypican-3-antikörper
BRPI0510674A (pt) 2004-07-15 2007-12-26 Xencor Inc variantes fc otimizadas
BRPI0514068B8 (pt) 2004-08-04 2021-05-25 Applied Molecular Evolution Inc anticorpo anti-cd20, e, composição farmacêutica
CA2577082A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
JP4937132B2 (ja) 2004-12-09 2012-05-23 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 免疫原性の低下したｉｌ−７変種
WO2006065208A1 (en) 2004-12-14 2006-06-22 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Purification of immunoglobulins
FR2879204B1 (fr) 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
US8728828B2 (en) 2004-12-22 2014-05-20 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Purification of immunoglobulins
WO2006076594A2 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Xencor, Inc. Antibodies and fc fusion proteins with altered immunogenicity
WO2006105338A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
EP1876236B9 (en) 2005-04-08 2015-02-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody substituting for function of blood coagulation factor viii
US7737115B2 (en) 2005-04-15 2010-06-15 Genetech, Inc. HGF beta chain variants
CA2611726C (en) 2005-06-10 2017-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical compositions containing sc(fv)2
KR101360671B1 (ko) 2005-06-10 2014-02-07 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ｓｃ（Ｆｖ）２를 함유하는 의약조성물
WO2007002543A2 (en) 2005-06-23 2007-01-04 Medimmune, Inc. Antibody formulations having optimized aggregation and fragmentation profiles
JP2009500458A (ja) 2005-07-11 2009-01-08 マクロジェニクス，インコーポレーテッド ヒト化抗ｃｄ１６ａ抗体を用いる自己免疫疾患の治療方法
US20100209437A1 (en) * 2005-09-12 2010-08-19 Greg Elson Anti-CD3 Antibody Fromulations
WO2007053659A2 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method of screening for hepatocellular carcinoma
CA2628253A1 (en) * 2005-11-03 2007-08-30 Genentech, Inc. Therapeutic anti-her2 antibody fusion polypeptides
EP1820513A1 (en) 2006-02-15 2007-08-22 Trion Pharma Gmbh Destruction of tumor cells expressing low to medium levels of tumor associated target antigens by trifunctional bispecific antibodies
TW200745163A (en) 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
WO2007110205A2 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
DK2006381T3 (en) 2006-03-31 2016-02-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROCEDURE FOR REGULATING ANTIBODIES BLOOD PHARMACOKINETICS
EP2009101B1 (en) 2006-03-31 2017-10-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
GB0611116D0 (en) 2006-06-06 2006-07-19 Oxford Genome Sciences Uk Ltd Proteins
JP2009539841A (ja) 2006-06-06 2009-11-19 トラークス，インコーポレイテッド 自己免疫疾患の治療における抗ｃｄ３抗体の投与
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
EP2049151A4 (en) 2006-07-17 2010-03-24 Quintessence Biosciences Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER
ME01786B (me) * 2006-08-14 2014-09-20 Xencor Inc Optimizovana antitela usmerena na cd19
GB0620894D0 (en) 2006-10-20 2006-11-29 Univ Southampton Human immune therapies using a CD27 agonist alone or in combination with other immune modulators
BRPI0721062A2 (pt) * 2006-12-21 2019-09-24 Macrogenics Inc métodos para prevenir ou retardar o início e para prevenir a progressão de diabete autoimune latente, métodos para tratamento de diabete autoimune latente em adultos e para tratar ou prevenir diabete de tipo 1 de início na idade adulta ou para melhorar seus sintomas em um paciente sofrendo do mesmo, e, método para prevenir ou retardar requisição de insulina em um paciente.
US8398956B2 (en) 2007-01-11 2013-03-19 Immunomedics, Inc. In vivo copper-free click chemistry for delivery of therapeutic and/or diagnostic agents
WO2008090960A1 (ja) 2007-01-24 2008-07-31 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. ガングリオシドgm2に特異的に結合する遺伝子組換え抗体組成物
EP2132312B1 (en) 2007-03-27 2016-01-27 Sea Lane Biotechnologies,llc. Constructs and libraries comprising antibody surrogate light chain sequences
AU2008234248C1 (en) 2007-03-29 2015-01-22 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
KR101589759B1 (ko) 2007-04-03 2016-01-29 암젠 리서치 (뮌헨) 게엠베하 종간 특이적 ｃｄ３―입실론 결합 도메인
PT2155783E (pt) 2007-04-03 2013-11-07 Amgen Res Munich Gmbh Domínio de ligação específico inter-espécies
US8337854B2 (en) 2007-04-04 2012-12-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Monoclonal antibodies against dengue and other viruses with deletion in Fc region
CA2691618A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Schering Corporation Mdl-1 uses
RS54624B1 (sr) 2007-07-17 2016-08-31 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Monoklonska antitela protiv glipikana-3
ES2687808T3 (es) * 2007-09-26 2018-10-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Región constante de anticuerpo modificado
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
CN101809162B (zh) 2007-09-28 2013-06-05 中外制药株式会社 血浆中动力学被改善的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体
JO3076B1 (ar) * 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EP2203180B1 (en) 2007-10-22 2012-11-21 Merck Serono S.A. Single ifn-beta fused to a mutated igg fc fragment
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
SG187457A1 (en) 2008-01-11 2013-02-28 Univ Tokyo Anti-cldn6 antibody
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
EP3153526B1 (en) 2008-01-31 2020-09-23 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies against human cd39 and use thereof for inhibiting t regulatory cells activity
US8263073B2 (en) 2008-02-04 2012-09-11 Medarex, Inc. Anti-CTLA-4 antibodies with reduced blocking of binding of CTLA-4 to B7 and uses thereof
EP2604280A3 (en) * 2008-03-27 2013-10-16 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for inhibiting PDGFRBETA and VEGF-A
MX2010011145A (es) 2008-04-11 2011-04-11 Merrimack Pharmaceuticals Inc Enlazadores de la albumina de suero humana y conjugados de la misma.
EP2280997A2 (en) 2008-04-18 2011-02-09 Xencor, Inc. Human equivalent monoclonal antibodies engineered from nonhuman variable regions
CN102076355B (zh) * 2008-04-29 2014-05-07 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
DE102008032385B4 (de) * 2008-07-09 2018-03-29 Audi Ag Hochdruckeinspritzanordnung für eine direkteinspritzende Brennkraftmaschine
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
WO2010028797A1 (en) 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
CN102164960A (zh) 2008-09-26 2011-08-24 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗-egfr/抗-igf-1r抗体
US20110318380A1 (en) 2008-10-01 2011-12-29 Dako Denmark A/S MHC Multimers in Cancer Vaccines and Immune Monitoring
BRPI0919840B1 (pt) 2008-10-01 2023-02-28 Amgen Research (Munich) Gmbh Molécula de anticorpo de cadeia única biespecífica, seu uso, e composição farmacêutica que a compreende
BRPI0919841A2 (pt) 2008-10-01 2014-11-18 Micromet Ag Anticorpo de cadeia unica biespecifico de psmaxcd3, especifico de especies cruzadas
CN102292352A (zh) 2008-10-10 2011-12-21 新兴产品开发西雅图有限公司 Tcr复合物免疫治疗剂
CN102282168A (zh) 2008-11-18 2011-12-14 梅里麦克制药股份有限公司 人血清白蛋白接头以及其结合物
DE202008016028U1 (de) 2008-12-04 2010-04-15 Melitta Haushaltsprodukte Gmbh & Co. Kg Behälter zur Aufbewahrung von Gegenständen
SG171812A1 (en) * 2008-12-04 2011-07-28 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UA109633C2 (uk) * 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
CN102369021B (zh) * 2008-12-19 2016-09-07 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
JP2012515160A (ja) 2009-01-12 2012-07-05 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
AU2010206681A1 (en) 2009-01-23 2011-09-01 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized Fc polypeptides with reduced effector function and methods of use
HRP20230487T1 (hr) 2009-02-13 2023-07-21 Immunomedics, Inc. Imunokonjugati s unutarstaničnom vezom koja se može rascijepiti
PE20160653A1 (es) 2009-03-05 2016-07-24 Abbvie Inc Proteinas de union a il-17
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
AU2010229994B2 (en) 2009-03-25 2016-08-18 Genentech, Inc. Anti-FGFR3 antibodies and methods using same
SG174992A1 (en) 2009-04-01 2011-11-28 Genentech Inc Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
MX2011012136A (es) 2009-05-15 2012-04-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-axl.
JP5375323B2 (ja) 2009-05-15 2013-12-25 株式会社ニコン 移動体装置、露光装置、及び移動体制御方法
RU2570633C2 (ru) 2009-05-27 2015-12-10 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Три- или тетраспецифические антитела
MX368932B (es) 2009-06-26 2019-10-22 Regeneron Pharma Anticuerpos biespecificos facilmente aislados con formato de inmunoglobulina original.
PE20121647A1 (es) 2009-08-29 2012-12-31 Abbvie Inc Proteinas terapeuticas de union a dll4
KR101508043B1 (ko) 2009-09-29 2015-04-06 로슈 글리카트 아게 이중특이적 사멸 수용체 아고니스트성 항체
CA2778334A1 (en) 2009-10-20 2011-04-28 Charlotte Mckee Anti-cd3 antibody dosing in autoimmune disease
HUE035516T2 (en) 2009-11-11 2018-05-28 Ganymed Pharmaceuticals Gmbh Antibodies specific to Claulin-6 (CLDN6)
SI2506871T1 (sl) 2009-11-30 2016-12-30 Janssen Biotech, Inc. Mutanti Fc protitelesa z odstranjenimi efektorskimi funkcijami
US10053513B2 (en) 2009-11-30 2018-08-21 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
SI2522724T1 (sl) 2009-12-25 2020-07-31 Chuqai Seiyaku Kabushiki Kaisha Postopek za spremembo polipeptida za čiščenje polipetidnih multimerov
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
EP2543730B1 (en) 2010-03-04 2018-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
JP5998050B2 (ja) 2010-03-31 2016-09-28 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
TWI653333B (zh) 2010-04-01 2019-03-11 安進研究（慕尼黑）有限責任公司 跨物種專一性之ＰＳＭＡｘＣＤ３雙專一性單鏈抗體
CN110066339A (zh) 2010-04-20 2019-07-30 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
DK2560683T4 (da) 2010-04-23 2022-08-29 Hoffmann La Roche Fremstilling af heteromultimeriske proteiner
EP2569337A1 (en) 2010-05-14 2013-03-20 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
CA3051311A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
EP2404936A1 (en) 2010-07-06 2012-01-11 Ganymed Pharmaceuticals AG Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo
RU2604490C2 (ru) 2010-11-05 2016-12-10 Займворкс Инк. ДИЗАЙН УСТОЙЧИВОГО ГЕТЕРОДИМЕРНОГО АНТИТЕЛА С МУТАЦИЯМИ В Fc ДОМЕНЕ
TR201802772T4 (tr) * 2010-11-17 2018-03-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Kan pıhtılaşma faktörü VIII in işlevi için alternatif işleve sahip multi-spesifik antijen bağlayıcı molekül.
LT2647707T (lt) 2010-11-30 2018-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Citotoksiškumą indukuojantis terapinis agentas
WO2012088290A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Tri-variable domain binding proteins and uses thereof
PL2663580T3 (pl) 2011-01-10 2017-08-31 Ct Atlantic Ltd. Terapia skojarzona obejmująca przeciwciała wiążące antygen związany z nowotworem
CA2827170A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 David M. Hilbert Monovalent and multivalent multispecific complexes and uses thereof
EP3604330A1 (en) 2011-02-25 2020-02-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fcgammariib-specific fc antibody
SG10201602371VA (en) 2011-03-25 2016-04-28 Glenmark Pharmaceuticals Sa Hetero-dimeric immunoglobulins
DK2698431T3 (da) 2011-03-30 2020-11-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Opretholdelse af antigen-bindende molekyler i blodplasma og fremgangsmåde til modifikation af immunogenicitet
CA3019531A1 (en) 2011-04-19 2012-10-26 Pfizer Inc. Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
JP6276176B2 (ja) 2011-05-13 2018-02-07 ガニメド ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー 癌の治療のための抗体
EP2537864B1 (en) 2011-06-24 2019-08-07 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Fc variants with reduced effector functions
EP2726101B1 (en) 2011-06-30 2018-08-08 Genzyme Corporation Inhibitors of t-cell activation
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
JP5925893B2 (ja) 2011-08-23 2016-05-25 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性抗原結合分子
PT2748201T (pt) 2011-08-23 2018-02-08 Roche Glycart Ag Moléculas de ligação ao antigénio biespecíficas que ativam as células t
US11851476B2 (en) * 2011-10-31 2023-12-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
US20140322216A1 (en) 2011-11-08 2014-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
US9624310B2 (en) 2011-11-17 2017-04-18 Gundram Jung Methods of using bi-specific antibodies for treating B-cell-mediated autoimmune diseases or auto-reactive B-cells
DK2794658T3 (en) 2011-12-19 2017-06-19 Synimmune Gmbh BISPECIFIC ANTIBODY MOLECULE
EP2823683A1 (en) 2012-02-03 2015-01-14 Interdigital Patent Holdings, Inc. Method and apparatus for coexistence among wireless transmit/receive units (wtrus) operating in the same spectrum
AU2013234039B2 (en) 2012-03-13 2018-02-01 Novimmune S.A. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
US9751942B2 (en) * 2012-03-29 2017-09-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-LAMP5 antibody and utilization thereof
CN104487587A (zh) 2012-04-20 2015-04-01 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd3结合多肽
US20140154270A1 (en) 2012-05-21 2014-06-05 Chen Wang Purification of non-human antibodies using kosmotropic salt enhanced protein a affinity chromatography
KR102159773B1 (ko) 2012-06-01 2020-09-28 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 글리피칸-3에 대한 고친화력 단클론 항체 및 이의 용도
CN104736174B (zh) 2012-07-06 2019-06-14 根马布私人有限公司 具有三重突变的二聚体蛋白质
AU2013302696B9 (en) 2012-08-14 2018-08-09 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
EP2894171A4 (en) 2012-09-10 2016-05-25 Kaneka Corp ADSORPTION
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
US10358492B2 (en) 2012-09-27 2019-07-23 Merus N.V. Bispecific IgG antibodies as T cell engagers
WO2014075697A1 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
UA128182C2 (uk) 2012-11-13 2024-05-01 Біонтех Аґ Агенти для лікування експресуючих клаудин ракових захворювань
CN103833852A (zh) 2012-11-23 2014-06-04 上海市肿瘤研究所 针对磷脂酰肌醇蛋白多糖-3和t细胞抗原的双特异性抗体
DK2925350T3 (da) 2012-12-03 2019-05-13 Bristol Myers Squibb Co Øgning af virksomheden mod cancer af immunomodulatoriske fc- fusionsproteiner
EP2948475A2 (en) 2013-01-23 2015-12-02 AbbVie Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
JP6420776B2 (ja) 2013-03-05 2018-11-07 ベイラー カレッジ オブ メディスンＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 免疫療法のためのエンゲージャー細胞
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
CA3093606A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins for induction of t cells
MX368665B (es) 2013-03-15 2019-10-10 Abbvie Biotherapeutics Inc Variantes de fc.
WO2014165818A2 (en) 2013-04-05 2014-10-09 T Cell Therapeutics, Inc. Compositions and methods for preventing and treating prostate cancer
ME03675B (me) 2013-07-05 2020-10-20 Genmab As Humanizovana ili himerna anтi-cd3 antiтela
CA2918225C (en) 2013-07-17 2023-11-21 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating urothelial carcinomas
ES2881306T3 (es) 2013-09-27 2021-11-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método para la producción de heteromultímeros de polipéptidos
CN105765063B (zh) 2013-09-30 2021-05-07 中外制药株式会社 应用改变的辅助噬菌体制备抗原结合分子的方法
BR112016009919A2 (pt) 2013-11-04 2017-12-05 Glenmark Pharmaceuticals Sa imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma e método para produzir in vitro uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento da mesma
RU2016122041A (ru) 2013-11-06 2017-12-11 ЭББВИ СТЕМСЕНТРКС ЭлЭлСи Новые анти-клаудин антитела и способы их применения
KR102357961B1 (ko) 2013-12-17 2022-02-08 제넨테크, 인크. 항-cd3 항체 및 이의 사용 방법
CA2936244A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 Medimmune, Llc Compositions and methods for modulating and redirecting immune responses
EP3107552B1 (en) 2014-02-21 2018-03-28 Cellectis Method for in situ inhibition of regulatory t cells
EP3954713A3 (en) 2014-03-28 2022-03-30 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
MX380176B (es) 2014-04-07 2025-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula ligada a antigeno inmunoactivada.
JP2017518040A (ja) 2014-04-21 2017-07-06 アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー 新規の抗ｒｎｆ４３抗体および使用方法
US11505605B2 (en) 2014-05-13 2022-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha T cell-redirected antigen-binding molecule for cells having immunosuppression function
KR20160002132A (ko) 2014-06-30 2016-01-07 삼성전자주식회사 음장 효과를 제공하기 위한 전자 장치 및 방법
AR101262A1 (es) 2014-07-26 2016-12-07 Regeneron Pharma Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos
CN105444789A (zh) 2014-08-25 2016-03-30 同方威视技术股份有限公司 一种光纤光栅解调仪及其温度控制方法
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
JP6630036B2 (ja) 2014-09-30 2020-01-15 Jsr株式会社 標的物の精製方法、及び、ミックスモード用担体
CN107223163A (zh) 2014-12-24 2017-09-29 豪夫迈·罗氏有限公司 用于膀胱癌症的治疗，诊断和预后方法
CN114478792A (zh) * 2015-01-08 2022-05-13 根马布股份公司 针对cd3和cd20的双特异性抗体
HK1250997A1 (zh) 2015-05-01 2019-01-18 基因泰克公司 掩蔽抗cd3抗体和使用方法
JP6826529B2 (ja) 2015-06-05 2021-02-03 中外製薬株式会社 免疫活性化剤の併用
WO2017010423A1 (ja) 2015-07-10 2017-01-19 中外製薬株式会社 内因性ｃｄ３遺伝子をヒトｃｄ３遺伝子に置換した非ヒト動物
EP3359203B1 (en) 2015-10-05 2024-07-31 Metafora Biosystems Receptor-binding domains ligands for the detection, diagnosis and treatment of pancreatic cancer
EP3378488A4 (en) 2015-11-18 2019-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR IMPROVING THE HUMORAL IMMUNE REACTION
JP6931329B2 (ja) 2015-11-18 2021-09-01 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
JP7219005B2 (ja) 2015-12-28 2023-02-07 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域含有ポリペプチドの精製を効率化するための方法
PT3411402T (pt) * 2016-02-03 2022-02-01 Amgen Inc Construtos de anticorpos biespecíficos engajadores de células t contra bcma e cd3
EP3431102A4 (en) 2016-03-14 2019-09-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CELL DAMAGING THERAPEUTIC MEDICAMENT FOR USE IN CANCER THERAPY
JP6175590B1 (ja) * 2016-03-14 2017-08-02 中外製薬株式会社 癌の治療に用いるための細胞傷害誘導治療剤
CA3025162A1 (en) 2016-05-26 2017-11-30 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation Mixtures of antibodies
WO2018016881A1 (ko) 2016-07-19 2018-01-25 (주)아이벤트러스 이중 특이성 단백질 및 이의 제조 방법
WO2018054484A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
WO2018093821A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
JP7247091B2 (ja) * 2016-12-20 2023-03-28 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体と４－１ｂｂ（ｃｄ１３７）アゴニストの併用療法
MY200973A (en) 2017-04-11 2024-01-26 Inhibrx Inc Multispecific Polypeptide Constructs Having Constrained Cd3 Binding And Methods Of Using The Same
JP2020518584A (ja) 2017-05-02 2020-06-25 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
BR112019025583A2 (pt) 2017-06-05 2020-06-16 Janssen Biotech, Inc. Anticorpos multiespecíficos geneticamente modificados e outras proteínas multiméricas com mutações assimétricas na região ch2-ch3
UA128389C2 (uk) 2017-09-29 2024-07-03 Чугаі Сейяку Кабусікі Кайся Мультиспецифічна антигензв'язувальна молекула, яка має активність заміщувати кофакторну функцію фактора коагуляції крові viii (fviii), та фармацевтичний склад, який містить згадану молекулу як активний інгредієнт
WO2019131988A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
US20210054076A1 (en) 2018-01-05 2021-02-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
AU2019222666B2 (en) * 2018-02-15 2025-12-04 Macrogenics, Inc. Variant CD3-binding domains and their use in combination therapies for the treatment of disease
AU2019270624B2 (en) 2018-05-16 2024-05-02 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers and enhancing efficacy of T cell redirecting therapeutics
TWI869346B (zh) * 2018-05-30 2025-01-11 瑞士商諾華公司 Ｅｎｔｐｄ２抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法
US20220033516A1 (en) 2018-11-05 2022-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Her2 s310f specific antigen-binding molecules
AU2019402097A1 (en) 2018-12-17 2021-06-10 Revitope Limited Twin immune cell engager
CN113329770A (zh) 2019-01-24 2021-08-31 中外制药株式会社 新型癌抗原及所述抗原的抗体
AU2020291300A1 (en) 2019-06-10 2022-01-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-T cell antigen-binding molecule to be used in combination with cytokine inhibitor
CN113950485A (zh) 2019-07-10 2022-01-18 中外制药株式会社 密蛋白-6结合分子及其用途
CN114341187A (zh) 2019-07-12 2022-04-12 中外制药株式会社 抗突变型fgfr3抗体及其用途
US20220348651A1 (en) * 2019-09-18 2022-11-03 Novartis Ag Entpd2 antibodies, combination therapies, and methods of using the antibodies and combination therapies
US20230147840A1 (en) * 2020-03-31 2023-05-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Immune activating multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
AU2021292932A1 (en) 2020-06-19 2023-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-T cell antigen-binding molecule for use in combination with angiogenesis inhibitor

Also Published As

Publication number Publication date
PL2647707T3 (pl) 2019-02-28
LT2647707T (lt) 2018-11-12
JP2020078335A (ja) 2020-05-28
EP4279512A3 (en) 2024-02-28
ES2693232T3 (es) 2018-12-10
CN103429737A (zh) 2013-12-04
EP2647707A1 (en) 2013-10-09
JP2025092666A (ja) 2025-06-19
PT2647707T (pt) 2018-11-15
TWI709574B (zh) 2020-11-11
TW201249872A (en) 2012-12-16
MX349057B (es) 2017-07-07
AU2011337697A1 (en) 2013-07-04
JP6963665B2 (ja) 2021-11-10
JPWO2012073985A1 (ja) 2014-05-19
BR112013013311A2 (pt) 2017-09-19
US20140112914A1 (en) 2014-04-24
RU2013129694A (ru) 2015-01-10
KR20190028811A (ko) 2019-03-19
AU2017200999B2 (en) 2019-04-18
US20220041756A1 (en) 2022-02-10
US20240262933A1 (en) 2024-08-08
TW202140566A (zh) 2021-11-01
CA2819530C (en) 2023-01-10
US11066483B2 (en) 2021-07-20
TW202323302A (zh) 2023-06-16
EP4303236A3 (en) 2024-03-20
EP4279513A3 (en) 2024-02-28
EP4279511A2 (en) 2023-11-22
JP7686362B1 (ja) 2025-06-02
CN109160951A (zh) 2019-01-08
KR102447595B1 (ko) 2022-09-26
JP2025120308A (ja) 2025-08-15
EP2647707B1 (en) 2018-09-12
SG10201506840QA (en) 2015-10-29
TWI736437B (zh) 2021-08-11
JP2022023133A (ja) 2022-02-07
TW201716443A (zh) 2017-05-16
JP6278598B2 (ja) 2018-02-14
TW201940517A (zh) 2019-10-16
EP4303237A3 (en) 2024-03-27
EP4279512A2 (en) 2023-11-22
JP2023115329A (ja) 2023-08-18
CN103429737B (zh) 2020-07-14
TW202106717A (zh) 2021-02-16
RU2018126811A (ru) 2019-03-13
JP2018093879A (ja) 2018-06-21
HRP20181615T1 (hr) 2018-12-14
KR101960109B1 (ko) 2019-03-20
EP3434767A1 (en) 2019-01-30
JP6773929B2 (ja) 2020-10-21
EP4303236A2 (en) 2024-01-10
HK1259128A1 (zh) 2019-11-22
EP4303237A2 (en) 2024-01-10
CA2819530A1 (en) 2012-06-07
EP4279511A3 (en) 2024-01-24
US20240294672A1 (en) 2024-09-05
WO2012073985A1 (ja) 2012-06-07
AR084053A1 (es) 2013-04-17
KR20240025059A (ko) 2024-02-26
KR102244173B1 (ko) 2021-04-26
TWI685503B (zh) 2020-02-21
MX2013006100A (es) 2013-07-15
EP2647707A4 (en) 2014-04-30
AU2011337697B2 (en) 2016-10-27
RU2018126811A3 (tr) 2019-05-07
DK2647707T3 (en) 2018-11-19
JP2025065332A (ja) 2025-04-17
KR20130130765A (ko) 2013-12-02
KR20220082104A (ko) 2022-06-16
TWI638833B (zh) 2018-10-21
JP2020202879A (ja) 2020-12-24
SI2647707T1 (sl) 2018-12-31
SG190726A1 (en) 2013-07-31
JP6719488B2 (ja) 2020-07-08
AU2017200565A1 (en) 2017-02-23
US12479929B2 (en) 2025-11-25
KR20210037755A (ko) 2021-04-06
AU2017200999A1 (en) 2017-03-09
RU2663123C2 (ru) 2018-08-01
EP4279513A2 (en) 2023-11-22
JP7717435B1 (ja) 2025-08-04
TWI807362B (zh) 2023-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7717435B1 (ja) 細胞傷害誘導治療剤
RU2824285C2 (ru) Индуцирующий цитотоксичность терапевтический агент
RU2774414C2 (ru) Индуцирующий цитотоксичность терапевтический агент
HK1188254B (zh) 细胞毒诱导治疗剂
HK1188254A (en) Cytotoxicity-inducing therapeutic agent