ES2881306T3

ES2881306T3 - Método para la producción de heteromultímeros de polipéptidos

Info

Publication number: ES2881306T3
Application number: ES14847811T
Authority: ES
Inventors: Tomoyuki Igawa; Hitoshi Katada; Futa Mimoto
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2021-11-29
Anticipated expiration: 2034-09-26
Also published as: JP6534615B2; JPWO2015046467A1; AU2014325063B2; CA2925256C; SG10201803449VA; TW201936635A; JP2019167343A; SG11201602261VA; BR112016006197A2; RU2016116314A3; HK1221963A1; TWI700292B; TWI720531B; WO2015046467A1; BR112016006197B1; RU2016116314A; MX382731B; CA2925256A1; PT3050896T; CN105764922B

Abstract

Un método para producir un anticuerpo biespecífico, que comprende las etapas de: a) proporcionar una homovariante de los primeros polipéptidos asociados, comprendiendo cada polipéptido la secuencia de aminoácidos de una primera cadena pesada del anticuerpo, teniendo cada uno de los cuales una primera actividad de unión al antígeno y comprendiendo una región Fc; b) proporcionar una homovariante de segundos polipéptidos asociados, comprendiendo cada polipéptido la secuencia de aminoácidos de una segunda cadena pesada de anticuerpo, teniendo cada uno una segunda actividad de unión a antígeno diferente de la primera actividad de unión a antígeno y comprendiendo una región Fc; c) incubar conjuntamente la homovariante de los primeros polipéptidos y la homovariante de los segundos polipéptidos en una condición reductora que permita que las cisteínas en las regiones bisagra provoquen la isomerización del enlace disulfuro; y d) obtener un heteromultímero que comprende los polipéptidos primero y segundo, en el que de 1 a 3 conjuntos de residuos de aminoácidos seleccionados de los siguientes conjuntos de residuos de aminoácidos: (1) residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración de la UE 356 y 439, (2) residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración de la UE 357 y 370, y (3) residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración de la UE 399 y 409 en dicha primera región Fc de cadena pesada tienen el mismo tipo de carga, y los correspondientes 1 a 3 conjuntos en dicha segunda región Fc de cadena pesada tienen una carga opuesta a la de dichos residuos de aminoácidos que tienen el mismo tipo de carga en la primera región Fc de cadena pesada, en el que la región Fc de dichos polipéptidos primero y segundo es de tipo IgG1 o IgG4 humana.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la producción de heteromultímeros de polipéptidos

Campo técnico

Se divulgan métodos para producir un heteromultímero de polipéptidos y un heteromultímero de polipéptidos que tiene un aminoácido alterado en una región Fc para promover la heteromultimerización del polipéptido.

Técnica antecedente

Los anticuerpos han recibido atención como fármacos debido a que tienen una alta estabilidad en la sangre y pocas reacciones adversas (Bibliografía no de patentes 1 y 2). Entre estos anticuerpos, existen anticuerpos biespecíficos que pueden reconocer cada uno dos tipos de antígenos o epítopos al mismo tiempo. Cabe esperar que estos anticuerpos biespecíficos tengan una alta especificidad de diana y la función de inhibir múltiples rutas al mismo tiempo (Bibliografía no de patente 3). Por ejemplo, el catumaxomab, ya en el mercado, es un anticuerpo biespecífico que se une a un factor de adhesión de células endoteliales EpCAM y CD3 expresado en células T, y se utiliza como fármaco terapéutico para la ascitis maligna.

Algunos informes sobre la producción de anticuerpos biespecíficos de tipo IgG presentan hallazgos sobre la baja eficiencia de obtención de un anticuerpo biespecífico de interés o producción eficiente, aunque con un alto grado de dificultad debido a la difícil purificación (Bibliografía no de patente 3). En el caso de transfectar, por ejemplo, 4 tipos en total de genes — es decir, genes de cadenas H y cadenas L que constituyen la IgG que tienen dos tipos de regiones variables— a células y secretar estas cadenas por coexpresión, el enlace covalente entre los dos tipos de cadenas H o el enlace no covalente entre la cadena H y la cadena L ocurre al azar. Por lo tanto, la proporción del anticuerpo biespecífico de interés es sumamente baja con una eficiencia de producción notablemente reducida. Un planteamiento documentado para resolver este problema implica la aplicación de sustitución de aminoácidos a las regiones CH3 de las cadenas H de la IgG, por lo que puede secretarse preferentemente la IgG que tiene diferentes tipos de cadenas H en combinación (Bibliografía de patentes 1 y Bibliografía de no de patentes 4 y 5). Este planteamiento es un método que implica sustituir una cadena lateral de aminoácidos presente en la región CH3 de una cadena H con una cadena lateral más grande (botón), y sustituir su cadena lateral de aminoácidos equivalente presente en la región CH3 de otra cadena H con una cadena lateral más pequeña (ojal) de modo que el botón se inserte en el ojal para promover la heterodimerización de las cadenas H e inhibir la homodimerización de las cadenas H (Bibliografía no de patente 11). Además, se ha documentado un método para introducir diferentes cargas en las respectivas regiones CH3 de las cadenas H de la IgG (Bibliografía de patentes 2 y 6 y Bibliografía no de patentes 10). Específicamente, este método implica sustituir un aminoácido presente en la región CH3 de una cadena H por un aminoácido que tiene una carga positiva, y sustituir su aminoácido homólogo presente en la región CH3 de otra cadena H por un aminoácido que tiene una carga negativa para promover la heterodimerización de las cadenas H e inhibir la homodimerización de las cadenas H. Por otra parte, también se ha documentado una técnica para controlar el emparejamiento de cadenas H y L (Bibliografía no de patente 6). Este planteamiento aprovecha los anticuerpos preparados mediante el intercambio de una región constante de la cadena L (CL) y una región CH1 de la cadena H en un Fab para inducir eficazmente el emparejamiento de las cadenas L y H de interés. Además, también existe un planteamiento que utiliza cadenas L comunes en ambos Fab. En este caso, el uso de las cadenas L comunes permite que solo se introduzca un tipo de gen de la cadena L en las células y produce un anticuerpo biespecífico sin necesidad de tener en cuenta el emparejamiento de las cadenas H y L. Actualmente, los anticuerpos biespecíficos se pueden formar con alta eficacia combinando la técnica de heterodimerización de la cadena H y la técnica de control de emparejamiento de cadenas H-L. No obstante, es difícil controlar completamente el emparejamiento de las cadenas H y L, y se requiere un diseño molecular complicado. Otro problema es el alto grado de dificultad para mantener la alta afinidad de las cadenas L comunes para dos tipos de antígenos.

Por otra parte, en lugar de los métodos de recombinación de genes descritos anteriormente, se ha documentado un planteamiento denominado intercambio de brazos Fab como método para preparar un anticuerpo biespecífico utilizando anticuerpos monoclonales preparados por separado con antelación. Esta técnica se ha desarrollado sobre la base del hallazgo de que el intercambio in vivo de una semimolécula de IgG4 con una semimolécula de IgG4 endógena produce un anticuerpo biespecífico (BiAb) (Bibliografía no de patente 7). Según los informes, se mezclan dos tipos de anticuerpos IgG4 humanos naturales in vitro para producir un anticuerpo biespecífico (Bibliografía de patentes 3), y esta reacción se produce de forma más eficaz en condiciones reductoras (Bibliografía no de patentes 8). Se han identificado dos sitios característicos de IgG4, es decir, residuos de aminoácidos en la posición 228 en la región bisagra y en la posición 409 en la región CH3 como residuos de aminoácidos importantes para esta reacción. Se ha encontrado que incluso en la IgG1, la sustitución de estos dos sitios con aminoácidos de tipo IgG4 provoca la reacción con una eficacia equivalente a la de IgG4 (Bibliografía de Patentes 4). El intercambio de brazos Fab produce un anticuerpo biespecífico de interés simplemente mezclando in vitro anticuerpos monoclonales preparados mediante un método general y, por tanto, muy versátil. Sin embargo, la reacción de intercambio de semimoléculas se produce al azar. Por tanto, el anticuerpo biespecífico obtenido mezclando dos tipos de anticuerpos es teóricamente el 50% de la cantidad total de anticuerpos presentes en el sistema. Por tanto, se ha estudiado un método para mejorar la velocidad de formación de anticuerpos biespecíficos. Se ha documentado que la eficacia de la reacción puede mejorarse mediante la introducción de una alteración asimétrica de aminoácidos en dos tipos de anticuerpos — concretamente, la alteración de K409R en las cadenas H de un anticuerpo y la alteración de F405L en las cadenas H del otro anticuerpo— , pero sigue estando en aproximadamente el 95% (Bibliografía de patentes 5 y Bibliografía no de patentes 9). La producción eficiente y estable de anticuerpos biespecíficos requiere inevitablemente una purificación conveniente y una variación mínima entre lotes. Por lo tanto, ha existido una demanda para el desarrollo de un planteamiento excelente que logre una mayor eficiencia de reacción.

Lista de referencias

Bibliografía de patentes

Bibliografía de patentes 1: WO1996/027011

Bibliografía de patentes 2: WO2006/106905

Bibliografía de patentes 3: WO2005/062916

Bibliografía de patentes 4: WO2008/119353

Bibliografía de patentes 5: WO2011/131746

Bibliografía de patentes 6: WO2009/089004

Bibliografía no de patentes

Bibliografía no de patentes 1: Nat Biotechnol., 23, 1073-1078, 2005

Bibliografía no de patentes 2: Eur J Pharm Biopharm, 59 (3), 389-396, 2005

Bibliografía no de patentes 3: mAbs, 4, 653-663, 2012

Bibliografía no de patentes 4: Protein Engineering, 9, 617-621, 1996

Bibliografía no de patentes 5: Nature Biotechnol., 16, 677-681, 1998

Bibliografía no de patentes 6: Proc. Natl. Acad. Sci., 108, 11187-11192, 2011

Bibliografía no de patentes 7: Immunology, 97, 693-698, 1999

Bibliografía no de patentes 8: Science, 317, 1554-1557, 2007

Bibliografía no de patentes 9: Proc. Natl. Acad. Sci., 110, 5145-5150, 2013

Bibliografía no de patentes 10: J. Biol. Chem., 285, 19637-19646, 2010

Bibliografía no de patentes 11: Nature Biotechnol., 31,753-758, 2013

Compendio

Problema técnico

La presente invención se ha realizado en vista de estas circunstancias, y un objeto de la presente invención es proporcionar un planteamiento excelente para la producción eficiente y estable de un heteromultímero con alta eficiencia de reacción, mediante el cual el heteromultímero deseado se obtiene mediante la promoción de la heteromultimerización del polipéptido en condiciones reductoras.

Solución al problema

La invención se refiere a las realizaciones definidas en las reivindicaciones. En particular, la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo biespecífico, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una homovariante de los primeros polipéptidos asociados, comprendiendo cada polipéptido la secuencia de aminoácidos de una primera cadena pesada del anticuerpo, teniendo cada uno de los cuales una primera actividad de unión al antígeno y comprendiendo una región Fc;

b) proporcionar una homovariante de segundos polipéptidos asociados, comprendiendo cada polipéptido la secuencia de aminoácidos de una segunda cadena pesada de anticuerpo, teniendo cada uno una segunda actividad de unión a antígeno diferente de la primera actividad de unión a antígeno y comprendiendo una región Fc;

c) incubar conjuntamente la homovariante de los primeros polipéptidos y la homovariante de los segundos polipéptidos en una condición reductora que permita que las cisteínas en las regiones bisagra provoquen la isomerización del enlace disulfuro; y

d) obtener un heteromultímero que comprende los polipéptidos primero y segundo, en el que de 1 a 3 conjuntos de residuos de aminoácidos seleccionados de los siguientes conjuntos de residuos de aminoácidos:

(1) residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración de la UE 356 y 439,

(2) residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración de la UE 357 y 370, y

(3) residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración de la UE 399 y 409

en dicha primera región Fc de cadena pesada tienen el mismo tipo de carga, y los correspondientes 1 a 3 conjuntos en dicha segunda región Fc de cadena pesada tienen una carga opuesta a la de dichos residuos de aminoácidos que tienen el mismo tipo de carga en la primera región Fc de cadena pesada,

en el que la región Fc de dichos polipéptidos primero y segundo es de tipo IgG1 o IgG4 humana.

Los presentes inventores han realizado estudios diligentes sobre un método para controlar la disociación y la asociación de regiones Fc seleccionando polipéptidos que tienen regiones Fc como polipéptidos para ser incluidos en un heteromultímero. Como resultado, los presentes inventores han descubierto que: la promoción de la disociación de las regiones Fc y el control de la asociación de las mismas en una condición reductora se puede lograr mediante la sustitución de un aminoácido particular presente en una región CH3 de cadena pesada; y se forma eficazmente, con respecto a las técnicas convencionales, una molécula heteromérica deseada.

Según la presente invención, la promoción de la disociación de las regiones Fc y el control de la asociación de las mismas en condiciones reductoras se puede lograr mediante la sustitución de un aminoácido particular presente en una región CH3 de cadena pesada. Puede proporcionarse un método de producción para formar eficazmente, con respecto a las técnicas convencionales, una molécula heteromérica deseada.

Mediante el uso del método de la presente divulgación, se puede mejorar con respecto a las técnicas convencionales la conveniencia en la purificación de un anticuerpo biespecífico y se puede minimizar la variación entre lotes.

Una característica del método para producir un heteromultímero según la presente invención es alterar un residuo de aminoácido en una región CH3 de cadena pesada. La disociación y la asociación entre polipéptidos se promueven introduciendo la alteración del residuo de aminoácido de la presente invención en esta región. Como resultado, se puede obtener eficazmente, con respecto a las técnicas convencionales, un heteromultímero deseado.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La Figura 1 es un diagrama que muestra los resultados del análisis de un producto de reacción de intercambio de brazos Fab mediante cromatografía de intercambio iónico. En el diagrama, “BiAb” indica un anticuerpo biespecífico purificado; “H54 homo” indica un anticuerpo monoclonal que tiene regiones variables H54/L28; y “MRA homo” indica un anticuerpo monoclonal que tiene regiones variables MRAH/MRAL. Los valores numéricos indicados por porcentaje en el diagrama representan la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos y se calcularon dividiendo el área de un pico correspondiente al anticuerpo biespecífico por el área de todos los anticuerpos presentes en el sistema, seguido de la multiplicación por 100.

[Figura 2] La Figura 2 es un diagrama que muestra los resultados del análisis de un producto de reacción de intercambio de brazos Fab mediante cromatografía de intercambio iónico. Este diagrama muestra los resultados de la reacción bajo 3 tipos de condiciones reductoras usando MRAH-GldrPl/MRAL-kO y H54-G1drN1/L28-k0 como homovariantes. Los valores numéricos indicados por porcentaje en el diagrama representan la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos y se calcularon dividiendo el área de un pico correspondiente al anticuerpo biespecífico por el área de todos los anticuerpos presentes en el sistema, seguido de la multiplicación por 100.

[Figura 3] La Figura 3 es un diagrama que muestra la correlación entre la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos en el intercambio de brazos Fab usando GSH 5 mM como agente reductor y la estabilidad del CH3 de la homovariante usada. En el diagrama, la frase “Valor de la mayor Tm de CH3 en dos tipos de homovariantes” significa la Tm de CH3 en una homovariante que tiene la Tm más alta de CH3 — es decir, que tiene un CH3 más estable— entre dos homovariantes utilizadas en la reacción.

[Figura 4] La Figura 4 es un diagrama que muestra la conformación de la IgG1 humana (código PDB: 3DO3) en y alrededor de V397.

[Figura 5] La Figura 5 es un diagrama que muestra la correlación entre la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos en el intercambio de brazos Fab usando 2MEA 25 mM como agente reductor y la estabilidad del CH3 de la homovariante usada. En el diagrama, la frase “Valor de la mayor Tm de CH3 en dos tipos de homovariantes” significa la Tm de CH3 en una homovariante que tiene la Tm más alta de CH3 — es decir, que tiene un CH3 más estable— entre dos homovariantes utilizadas en la reacción.

[Figura 6] La Figura 6 es un diagrama que muestra los resultados del análisis de un producto de reacción de intercambio de brazos Fab mediante cromatografía de intercambio iónico. Este diagrama muestra los resultados de llevar a cabo la reacción para diferentes tiempos de reacción usando MRAH-G1dP17/MRAL-k0 y H54-G1dN17/L28-k0 como homovariantes. Los valores numéricos indicados por porcentaje en el diagrama representan la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos y se calcularon dividiendo el área de un pico correspondiente al anticuerpo biespecífico por el área de todos los anticuerpos presentes en el sistema, seguido de la multiplicación por 100.

[Figura 7] La Figura 7 es un diagrama que muestra los resultados del análisis de un producto de reacción de intercambio de brazos Fab mediante cromatografía de intercambio iónico. Este diagrama muestra los resultados de la reacción en un sobrenadante de cultivo celular usando MRAH-GlmrPl/MRAL-kO y H54-G1mrN1/L28-k0 como homovariantes. Los valores numéricos indicados por porcentaje en el diagrama representan la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos y se calcularon dividiendo el área de un pico correspondiente al anticuerpo biespecífico por el área de todos los anticuerpos presentes en el sistema, seguido de la multiplicación por 100.

[Figura 8] La Figura 8 es un diagrama que muestra la conformación de la IgG1 de ratón (código PDB: 11GY) en y alrededor de la interfaz de interacción entre los dominios CH3.

[Figura 9] La Figura 9 es un diagrama que muestra los resultados del análisis de un producto de reacción de intercambio de brazos Fab de tipo IgG de ratón mediante CE-IEF. Los valores numéricos indicados por porcentaje en el diagrama representan la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos y se calcularon dividiendo el área de un pico correspondiente al anticuerpo biespecífico por el área de todos los anticuerpos presentes en el sistema, seguido de la multiplicación por 100.

[Figura 10] La Figura 10 es un diagrama que muestra la comparación de la actividad citotóxica de un anticuerpo biespecífico anti-glipicano 3 humano/anti-CD3 humano. Un anticuerpo biespecífico preparado usando intercambio de brazos Fab de tipo IgG humano (Figura 10-1) o intercambio de brazos Fab de tipo IgG de ratón (Figura 10-2) se comparó con un anticuerpo biespecífico preparado por tecnología CrossMab.

[Figura 11] La Figura 11 es un diagrama que muestra el cambio en la concentración en sangre de un anticuerpo biespecífico anti-glipicano 3 humano/anti-CD3 humano preparado mediante intercambio de brazos Fab de tipo IgG humano y un anticuerpo biespecífico preparado mediante tecnología de “botones en ojales” en ratones normales.

[Figura 12] La Figura 12 es un diagrama que muestra el cambio en la concentración en sangre de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano preparado por intercambio de brazos Fab de tipo IgG de ratón y un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano que tiene la secuencia de la IgG 1 de ratón.

Descripción de realizaciones

La presente invención se refiere a un método para producir un heteromultímero deseado mediante la alteración de un residuo de aminoácido en una región CH3 de cadena pesada para promover la disociación en condiciones reductoras de las respectivas homovariantes de polipéptidos que tienen cada una una primera actividad de unión a antígeno polipéptidos que tienen cada uno una segunda actividad de unión a antígeno diferente de la primera actividad de unión a antígeno y para controlar la heteroasociación de los mismos en condiciones reductoras. Se describe además un método para seleccionar un heteromultímero deseado.

Definición de términos

En la presente divulgación, el “polipéptido” se refiere a un polipéptido (polipéptido que contiene la región Fc) o una proteína (proteína que contiene la región Fc) que comprende una región Fc de cadena pesada en la secuencia de aminoácidos. El polipéptido es habitualmente un polipéptido derivado de un organismo, aunque el polipéptido no está particularmente limitado al mismo. El polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido que consta de una secuencia diseñada artificialmente. Alternativamente, se puede usar un polipéptido natural, un polipéptido sintético, un polipéptido recombinante o similares. Además, los fragmentos de estos polipéptidos también se incluyen en el polipéptido divulgado en este documento.

En la presente memoria descriptiva, el “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina natural o una inmunoglobulina producida por síntesis parcial o completa. El anticuerpo puede aislarse de un recurso natural (por ejemplo, plasma o suero que contiene anticuerpos de origen natural) o el sobrenadante del cultivo de células de hibridoma productoras de anticuerpos o puede sintetizarse parcial o completamente mediante el uso de un planteamiento como la recombinación génica. Ejemplos preferidos del anticuerpo incluyen isotipos de inmunoglobulinas y subclases de estos isotipos. Se conocen nueve tipos de clases (isotipos) — concretamente, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM— como inmunoglobulinas humanas. Se conocen cuatro tipos de clases — concretamente, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3— como inmunoglobulinas de ratón. De estos isotipos, las inmunoglobulinas humanas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 y las inmunoglobulinas de ratón IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 pueden incluirse en el anticuerpo divulgado en este documento. Se prefiere IgG1 como inmunoglobulina de ratón. En Sequences of Proteins of Immunological Interest, Publicación NIH n° 91-3242, se describen múltiples secuencias de alotipos basadas en polimorfismo génico como regiones constantes de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana. Según la divulgación puede usarse cualquiera de estas secuencias. En particular, una secuencia de aminoácidos de las posiciones de numeración UE 356 a 358 en la secuencia de IgG1 humana puede ser DEL o puede ser EEM. En Sequences of proteins of immunological interest, Publicación NIH n° 91-3242, se describen múltiples secuencias de alotipos basadas en polimorfismo génico se describen como una región constante de la IgK (kappa) humana y una región constante de IgA (lambda) humana. Según la divulgación puede usarse cualquiera de estas secuencias.

La expresión “región Fc” se usa para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina e incluye una secuencia de región Fc natural y una región Fc variante. Aunque el límite de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina puede variar, la región Fc se refiere a una región que comprende bisagras o una porción de las mismas y dominios CH2 y CH3 en una molécula de anticuerpo. Habitualmente, se define que la región Fc de cadena pesada de la IgG humana se extiende desde el residuo de aminoácido Cys226 hasta el extremo carboxilo terminal de la región Fc, aunque la región Fc descrita en el presente documento no se limita a ello. La región Fc de inmunoglobulina contiene dos regiones constantes; concretamente, CH2 y CH3. El dominio “CH2” de la región Fc de IgG humana generalmente se extiende desde el aminoácido 231 hasta el aminoácido 340. El dominio “CH3” se extiende desde el extremo carboxilo terminal de la región Fc hasta antes de la región CH2; es decir, se extiende desde el aminoácido 341 hasta aproximadamente el aminoácido 447 de la IgG.

La región Fc se puede obtener preferiblemente mediante la digestión parcial de un anticuerpo monoclonal IgG o similar con una enzima proteolítica tal como pepsina seguida de la reelución de una fracción adsorbida en una columna de proteína A o proteína G. Dicha enzima proteolítica no está particularmente limitada, siempre que la enzima sea capaz de digerir un anticuerpo completo para formar restrictivamente Fab o F(ab')2 en condiciones de reacción establecidas apropiadamente (por ejemplo, pH) de la enzima. Los ejemplos de las mismas pueden incluir pepsina y papaína.

La posición de cada sitio de alteración se representa mediante el sistema de numeración de la UE (Kabat EA et al., 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH).

En la presente invención, la “asociación” de polipéptidos puede referirse, por ejemplo, a un estado en el que dos o más regiones polipeptídicas interactúan entre sí.

En la presente divulgación, la frase “asociación de control” se refiere al control para lograr un estado asociado deseado y más específicamente se refiere al control para evitar la asociación no deseada entre polipéptidos (preferiblemente, asociación entre polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos idénticas).

En la presente divulgación, la “interfaz” normalmente se refiere a la ubicación de asociación en la que los polipéptidos se asocian (interactúan) entre sí. Los residuos de aminoácidos que forman la interfaz son habitualmente uno o más residuos de aminoácidos contenidos en las regiones polipeptídicas sometidas a esta asociación y más preferiblemente son residuos de aminoácidos que se colocan cerca durante la asociación para participar en la interacción. La interacción incluye específicamente, por ejemplo, el caso en el que los residuos de aminoácidos que se colocan cerca durante la asociación forman un enlace de hidrógeno, una interacción electrostática o un puente salino entre ellos.

En la presente invención, la “homovariante” de polipéptidos se refiere a la forma asociada de polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos idénticas.

En la presente invención, el “heterómero” de polipéptidos se refiere a la forma asociada de un primer polipéptido y un segundo polipéptido que difieren en la secuencia de aminoácidos en al menos un residuo de aminoácidos del primer polipéptido.

En la presente invención, la “disociación” entre polipéptidos se refiere a un estado en el que la forma asociada de dos o más polipéptidos en el polipéptido homovariante se separa en polipéptidos individuales.

En la presente invención, “heteromultímero” se refiere a un multímero proteico que está constituido por varios tipos de polipéptidos capaces de asociarse entre sí. Más específicamente, el “heteromultímero” tiene al menos un primer polipéptido y un segundo polipéptido. En este contexto, el segundo polipéptido es una molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos en al menos un residuo de aminoácido con respecto al primer polipéptido. El heteromultímero preferiblemente tiene actividades de unión a antígenos contra al menos dos tipos diferentes de ligandos, antígenos, receptores o sustratos, etc., aunque el heteromultímero divulgado en este documento no está particularmente limitado a ello. El heteromultímero puede contener un tipo adicional de polipéptido además del “heterodímero” formado por los polipéptidos primero y segundo. Específicamente, el “heteromultímero” divulgado en el presente documento no se limita al heterodímero y también incluye, por ejemplo, un heterotrímero y un heterotetrámero.

En el multímero polipeptídico divulgado en el presente documento que comprende el primer polipéptido, el segundo polipéptido y uno o dos terceros polipéptidos, el primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden formar respectivamente multímeros (dímeros) con el tercer polipéptido. Además, los dímeros formados pueden formar un multímero (tetrámero) entre sí. Los dos terceros polipéptidos pueden tener secuencias de aminoácidos completamente idénticas (que pueden tener una actividad de unión contra el mismo antígeno). Alternativamente, los dos terceros polipéptidos pueden tener secuencias de aminoácidos idénticas, pero tener dos o más actividades (que pueden tener, por ejemplo, actividades de unión contra dos o más antígenos diferentes). En el caso de un tercer polipéptido, este tercer polipéptido puede formar un dímero con cualquiera del primer polipéptido y el segundo polipéptido para formar un multímero polipeptídico.

En el multímero polipeptídico divulgado en el presente documento, el primer polipéptido y el segundo polipéptido tienen preferiblemente actividades de unión contra diferentes antígenos. Por otro lado, el tercer polipéptido puede ser un polipéptido que tenga una actividad de unión contra el mismo antígeno que el del primer polipéptido o el segundo polipéptido, o ambos. Alternativamente, el tercer polipéptido puede ser un polipéptido que tenga una actividad de unión contra un antígeno diferente de la del primer polipéptido y el segundo polipéptido.

Alternativamente, el multímero polipeptídico divulgado en el presente documento puede ser un multímero polipeptídico que comprende el primer polipéptido, el segundo polipéptido, el tercer polipéptido y un cuarto polipéptido. En tal multímero polipeptídico, el primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden formar multímeros (dímeros) con el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido, respectivamente. Por ejemplo, se puede formar un enlace disulfuro entre el primer polipéptido y el tercer polipéptido y entre el segundo polipéptido y el cuarto polipéptido para formar dímeros.

En el multímero polipeptídico divulgado en el presente documento, el primer polipéptido y el segundo polipéptido tienen preferiblemente actividades de unión contra diferentes antígenos. Por otro lado, el tercer polipéptido puede ser un polipéptido que tenga una actividad de unión contra el mismo antígeno que el del primer polipéptido o el segundo polipéptido, o ambos. Alternativamente, el tercer polipéptido puede ser un polipéptido que tenga una actividad de unión contra un antígeno diferente de la del primer polipéptido y el segundo polipéptido. El cuarto polipéptido puede ser un polipéptido que tenga una actividad de unión contra el mismo antígeno que el del primer polipéptido o el segundo polipéptido, o ambos. Alternativamente, el cuarto polipéptido puede ser un polipéptido que tenga una actividad de unión contra un antígeno diferente de la del primer polipéptido y el segundo polipéptido.

El “heteromultímero” según la presente invención es un anticuerpo biespecífico. En este caso, el primer polipéptido y el segundo polipéptido pueden ser, por ejemplo, un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de anticuerpo contra el antígeno A y un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de anticuerpo contra el antígeno B, respectivamente. En este caso, el tercer polipéptido puede ser un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de anticuerpo contra el antígeno A, mientras que el cuarto polipéptido puede ser un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de anticuerpo contra el antígeno B.

Como se usa en este documento, el “polipéptido que tiene una actividad de unión a antígeno” se refiere a un péptido o una proteína de 5 o más aminoácidos de longitud que tiene un dominio (o región) capaz de unirse a una proteína o un péptido como un antígeno o un ligando, e incluye, por ejemplo, una región variable de cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo, un receptor, un péptido de fusión de un receptor y una región Fc, un supercóntigo y sus fragmentos. Específicamente, el polipéptido que tiene una actividad de unión a antígeno puede comprender la secuencia de aminoácidos de una región variable de anticuerpo, un receptor, un péptido de fusión de un receptor y una región Fc, un supercóntigo o cualquiera de sus fragmentos.

Puede usarse cualquier polipéptido como supercóntigo siempre que el polipéptido sea conformacionalmente estable y pueda unirse a al menos un antígeno. Ejemplos de tal polipéptido incluyen, sin limitación, fragmentos de regiones variables de anticuerpos, fibronectina, dominios de proteína A, dominios del receptor A de LDL y lipocalina, así como moléculas descritas en Nygren et al. (Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469 (1997); y Journal of Immunol Methods, 290: 3-28 (2004)), Binz et al. (Nature Biotech 23: 1257-1266 (2005)), y Hosse et al. (Protein Science 15: 14 27 (2006)).

Los expertos en la técnica conocen bien el método para obtener la región variable del anticuerpo, el receptor, el péptido de fusión de un receptor y una región Fc, el supercóntigo y sus fragmentos. También se puede usar un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de dicha región y la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera de anticuerpo.

En la presente invención, la “condición reductora” se refiere a una condición o un entorno en el que es más probable se reduzcan que se oxiden los residuos de cisteína que forman un enlace disulfuro entre cadenas pesadas en las regiones bisagra de la cadena pesada. La condición reductora se refiere preferiblemente a una condición o un entorno que permite que las cisteínas en las regiones bisagra provoquen la isomerización del enlace disulfuro entre las cadenas pesadas, y, de forma particularmente preferible, se refiere a una condición o un entorno que permite que las cisteínas en las regiones bisagra de la cadena pesada provoquen la isomerización del enlace disulfuro sin causar una isomerización significativa del enlace disulfuro de las cisteínas fuera de las regiones bisagra (es decir, mientras se conserva el enlace disulfuro entre la cadena pesada y la cadena ligera). El tiempo de incubación conjunta de la homovariante de los primeros polipéptidos que comprenden cada uno una región Fc y los segundos polipéptidos que comprenden cada uno una región Fc en condiciones reductoras puede ser establecido apropiadamente por los expertos en la técnica.

El “agente reductor” divulgado en el presente documento se refiere a un compuesto que reduce una molécula en el medio ambiente; es decir, un compuesto que cambia una molécula a un estado en el que la molécula se ha reducido más o se está reduciendo más en el medio ambiente. El agente reductor actúa donando un electrón, de modo que el propio agente reductor llega a tener un estado oxidado después de la reducción de un sustrato. Por tanto, el agente reductor es una sustancia activa que dona un electrón. Ejemplos del agente reductor incluyen ditiotreitol (DTT), mercaptoetanol, cisteína, ácido tioglicólico, cisteamina (2-mercaptoetilamina: 2-MEA), glutatión (GSH), TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina) y borohidruro de sodio.

La “isomerización del enlace disulfuro entre cadenas pesadas” divulgada en el presente documento se refiere al intercambio del enlace disulfuro, es decir, a la reorganización del enlace disulfuro, entre cisteínas contenidas en diferentes cadenas pesadas.

La “formación de enlaces disulfuro” se refiere al proceso de formación de un enlace covalente entre dos cisteínas presentes en uno o dos polipéptidos. Este vínculo está esquematizado por “-S--S-”.

La “reducción del enlace disulfuro” se refiere al proceso de escisión del enlace disulfuro en dos grupos tiol (grupos -SH).

El término “Fcy R” o “FcgR” divulgado en este documento se refiere a un receptor Fcy , que es un receptor capaz de unirse a la región Fc de un anticuerpo monoclonal IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, y significa cualquier miembro de la familia de proteínas sustancialmente codificado por genes del receptor Fcy . En los seres humanos, esta familia incluye, por ejemplo: Fcy RI (CD64), que incluye las isoformas FcYRIa, FcYRIb y Fcy RIc; Fcy RII (CD32), que incluye las isoformas FcYRIIa (que incluye los alotipos H131 (tipo H) y R131 (tipo R)), FcYRIIb (que incluye FcYRIIb-1 y FcYRIIb-2) y Fcy RIIc; y Fcy RII I (CD16), que incluye las isoformas FcYRIIIa (que incluyen los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (que incluyen los alotipos FcYRIIIb-NA1 y FcYRIIIb-NA2); y cualquier isoforma o alotipo de Fcy R o Fcy R humano aún por descubrir. El Fcy R incluye los derivados de seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. El Fcy R no se limita a estas moléculas y puede derivarse de cualquier organismo. Los Fcy R de ratón incluyen, por ejemplo, Fcy RI (CD64), Fcy RII (CD32), Fcy RIII (CD16) y Fcy RIII-2 (CD16-2), y Fcy RIV, y cualquier isoforma o alotipo de Fcy R o Fcy R de ratón aún por descubrir.

Método para producir un heteromultímero por alteración usando repulsión de carga de residuos de aminoácidos

Preferiblemente, el método divulgado en este documento es un método para producir un heterómero de polipéptidos deseados alterando los residuos de aminoácidos que forman la interfaz entre los polipéptidos con el fin de promover la disociación de las homovariantes de los polipéptidos primero y segundo para un heteromultímero capaz de formar dos o más tipos de multímeros y para controlar la asociación entre los polipéptidos que constituyen uno o más tipos de multímeros.

El polipéptido que tiene una primera actividad de unión a antígeno y el polipéptido que tiene una segunda actividad de unión a antígeno según la descripción pueden comprender cada uno la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada de anticuerpo o la secuencia de aminoácidos de una región Fc de anticuerpo. Ejemplos de la secuencia de aminoácidos de la región Fc del anticuerpo o la región constante de la cadena pesada del anticuerpo incluyen, sin limitación, las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de tipo IgG humana o regiones Fc. Las regiones constantes de tipo IgG o regiones Fc pueden ser cualquiera de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de origen natural. Alternativamente, se pueden usar sus formas alteradas. La lisina en la posición de numeración de la UE 447 y la glicina en la posición de numeración de la UE 446 en la región Fc pueden eliminarse mediante la manipulación de genes recombinantes de ácidos nucleicos que codifican estos aminoácidos.

El polipéptido que tiene una tercera actividad de unión a antígeno y el polipéptido que tiene una cuarta actividad de unión a antígeno según la divulgación pueden comprender cada uno la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena ligera de anticuerpo. Ejemplos de la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera del anticuerpo pueden incluir, sin limitación, las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de tipo kappa humana y lambda humana. Alternativamente, se pueden usar sus formas alteradas.

El polipéptido que tiene una actividad de unión a antígeno según la divulgación puede comprender la secuencia de aminoácidos de una región variable de anticuerpo (por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 y FR4).

Ejemplos del método para controlar la disociación y/o la asociación entre polipéptidos incluyen un método que implica introducir repulsión de carga en la interfaz entre las regiones constantes de cadenas pesadas para suprimir la asociación entre las cadenas pesadas. Ejemplos de los residuos de aminoácidos que entran en contacto entre sí en la interfaz entre las regiones constantes de la cadena pesada pueden incluir pares en las posiciones 356 y 439, en las posiciones 357 y 370, y en las posiciones 399 y 409 en las regiones CH3. Los sitios en las regiones constantes de la cadena pesada están representados por el sistema de numeración de la UE.

Como se muestra en los ejemplos mencionados más adelante, el método descrito en este documento se lleva a cabo mediante la alteración de estos residuos de aminoácidos para controlar la disociación y/o la asociación entre polipéptidos de cadena pesada. Como resultado, se puede obtener preferentemente el heteromultímero deseado. Según la divulgación, un polipéptido es preferiblemente un anticuerpo o una proteína que contiene la región Fc (por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgG, minicuerpo (Alt M et al., FEBS Letters 199, 9; 454: 90-94) e inmunoadhesina (Bibliografía no de patente 2)) que comprende dos o más tipos de regiones Fc de cadena pesada, en las que de 1 a 3 conjuntos de residuos de aminoácidos se seleccionan entre los siguientes conjuntos (1) a (3) de residuos de aminoácidos:

en una primera región Fc de cadena pesada tienen el mismo tipo de carga.

Se divulga además un polipéptido en el que de 1 a 3 conjuntos de residuos de aminoácidos seleccionados de los conjuntos (1) a (3) de residuos de aminoácidos en una segunda región Fc de cadena pesada diferente de la primera región Fc de cadena pesada tienen una carga opuesta a la de los residuos de aminoácidos equivalentes que tienen el mismo tipo de carga entre sí en el o los conjuntos correspondientes entre los conjuntos (1) a (3) de residuos de aminoácidos en la primera región Fc de la cadena pesada.

En el polipéptido, los “residuos de aminoácidos que tienen una carga” se seleccionan preferiblemente de, por ejemplo, residuos de aminoácidos incluidos en cualquiera de los siguientes grupos (a) y (b):

(a) ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D); y

(b) lisina (K), arginina (R) e histidina (H).

En el polipéptido, la frase “que tienen el mismo tipo de carga” significa que, por ejemplo, la totalidad de los dos o más residuos de aminoácidos son residuos de aminoácidos incluidos en cualquiera de los grupos (a) y (b). La frase “que tienen una carga opuesta” significa que, por ejemplo, cuando al menos un residuo de aminoácido entre dos o más residuos de aminoácido es un residuo de aminoácido incluido en cualquiera de los grupos (a) y (b), el o los restantes residuos de aminoácido son un residuo de aminoácido incluido en el otro grupo.

Preferiblemente, el polipéptido puede tener la reticulación entre la primera región CH3 de cadena pesada y la segunda región CH3 de cadena pesada a través de un enlace disulfuro.

Según la divulgación, ejemplos de la “alteración de control de la interfaz de asociación” incluyen las siguientes alteraciones:

(1) la alteración de Asp (D) en la posición de numeración de la UE 356 en la primera región Fc de cadena pesada a Lys (K), Arg (R) o His (H), y la alteración de Lys (K) en la posición de numeración de la UE 439 en la segunda región Fc de cadena pesada a Glu (E) o Asp (D);

(2) la alteración de Glu (E) en la posición de numeración de la UE 357 en la primera región Fc de cadena pesada a Lys (K), Arg (R) o His (H), y la alteración de Lys (K) en la posición de numeración de la UE 370 en la segunda región Fc de cadena pesada a Glu (E) o Asp (D); y

(3) la alteración de Asp (D) en la posición de numeración de la UE 399 en la primera región Fc de cadena pesada a Lys (K), Arg (R) o His (H), y la alteración de Lys (K) en la posición de numeración de la UE 409 en la segunda región Fc de cadena pesada a Glu (E) o Asp (D).

El método para controlar la disociación y/o la asociación entre polipéptidos puede asociarse con un método para producir un heteromultímero de ratón. Los ejemplos del método incluyen un método que implica introducir repulsión de carga en la interfaz entre las regiones constantes de las cadenas pesadas para suprimir la asociación entre las cadenas pesadas. En el método, los ejemplos de los residuos de aminoácidos que entran en contacto entre sí en la interfaz entre las regiones constantes de la cadena pesada pueden incluir pares en las posiciones 356 y 439, en las posiciones 360 y 371, y en las posiciones 399 y 409 en las regiones CH3. Los sitios en las regiones constantes de la cadena pesada están representados por el sistema de numeración de la UE.

Como se muestra en los Ejemplos mencionados más adelante, el método descrito en este documento puede llevarse a cabo mediante la alteración de estos residuos de aminoácidos en las regiones CH3 derivadas de ratón para controlar la disociación y/o la asociación entre polipéptidos de cadena pesada. Como resultado, se puede obtener preferentemente el heteromultímero deseado. Según la divulgación, un polipéptido es preferiblemente un anticuerpo o una proteína que contiene la región Fc (por ejemplo, un anticuerpo de tipo IgG, minicuerpo (Alt M et al., FEBS Letters 1999; 454: 90-94) e inmunoadhesina (Bibliografía no de patente 2)) que comprende dos o más tipos de regiones Fc de cadena pesada, en las que de 1 a 3 conjuntos de residuos de aminoácidos se seleccionan entre los siguientes conjuntos (1) a (3) de residuos de aminoácidos:

(1) residuos de aminoácidos

las posiciones de numeración de la UE 356 y 439,

(2) residuos de aminoácidos

las posiciones de numeración de la UE 360 y 371, y

(3) residuos de aminoácidos

las posiciones de numeración de la UE 399 y 409

en una primera región Fc de cadena pesada tienen el mismo tipo de carga.

(a) ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D); y

(b) lisina (K), arginina (R) e histidina (H).

El polipéptido puede tener la reticulación entre la primera región CH3 de la cadena pesada y la segunda región CH3 de la cadena pesada a través de un enlace disulfuro.

Ejemplos de la “alteración de control de la interfaz de asociación” incluyen las siguientes alteraciones:

(2) la alteración de Glu (E) en la posición de numeración de la UE 360 en la primera región Fc de cadena pesada a Lys (K), Arg (R) o His (H), y la alteración de Lys (K) en la posición de numeración de la UE 371 en la segunda región Fc de cadena pesada a Glu (E) o Asp (D); y

Los residuos de aminoácidos que se van a “alterar” según la divulgación no se limitan a los residuos de aminoácidos en las regiones constantes del polipéptido. Los expertos en la técnica pueden encontrar residuos de aminoácidos que forman la interfaz en una variante de polipéptido o un heteromultímero mediante modelado de homología o similar usando un soporte lógico disponible comercialmente, y pueden alterar residuos de aminoácidos en los sitios para controlar la asociación.

La “alteración” de los residuos de aminoácidos en el método descrito en este documento se refiere específicamente, por ejemplo, a la sustitución de los residuos de aminoácidos originales por otros residuos de aminoácidos, a la eliminación de los residuos de aminoácidos originales o a la adición de un nuevo residuo de aminoácido y preferiblemente se refiere a la sustitución de los residuos de aminoácidos originales por otros residuos de aminoácidos.

Método para producir un heteromultímero por alteración de aminoácidos en las posiciones 397 y/o 392

El método para controlar la disociación y/o la asociación entre polipéptidos es preferiblemente un método que comprende introducir una mutación de un residuo de aminoácido en una región Fc de cadena pesada para desestabilizar la estabilidad de la región CH3 de cadena pesada. Este método puede comprender además la etapa opcional de introducir la alteración de aminoácidos antes mencionada relacionada con el control de la interfaz usando repulsión de carga o similar.

En la presente divulgación, “desestabilización de la estabilidad de la región CH3” significa que un polipéptido homovariante con al menos uno o más residuos de aminoácidos alterados en la región Fc se vuelve más susceptible a la separación en los polipéptidos individuales que el polipéptido homovariante inalterado.

En la presente divulgación, “desestabilización de la estabilidad de la región CH3” significa preferiblemente que la temperatura intermedia de desnaturalización térmica (T m) de la región CH3 de la cadena pesada que tiene los residuos de aminoácidos alterados a pH 7,4 es 72,5°C o inferior, 72,0°C o inferior, 71,5°C o inferior, 71,0°C o inferior, o 70,5°C o inferior, más preferiblemente 70,4°C o inferior, 70,3°C o inferior, 70,2°C o inferior, 70,1°C o inferior, 70,0°C o inferior, 69,9°C o inferior, 69,8°C o inferior, 69,7°C o inferior, 69,6°C o inferior, 69,5°C o inferior, 69,0°C o inferior, 68,5°C o inferior, 68,0°C o inferior, o 67,5°C o inferior.

La Tm de la región CH3 de la cadena pesada puede medirse, por ejemplo, mediante un método descrito en el Ejemplo de referencia 3 de la presente memoria descriptiva. Puede seleccionarse apropiadamente una solución tampón o similar para usar en esta medición.

El método para controlar la disociación y/o la asociación entre polipéptidos es preferiblemente un método que comprende introducir una mutación en un residuo de aminoácido en las posiciones de numeración UE 397 y/o 392 en una región CH3 de cadena pesada. Este método puede comprender además la etapa opcional de introducir la alteración de aminoácidos antes mencionada relacionada con el control de la interfaz usando repulsión de carga o similar.

También se puede introducir una mutación en un residuo de aminoácido en las posiciones de numeración UE 397 y/o 392 en una región CH3 de cadena pesada en el método para controlar la disociación y/o la asociación entre polipéptidos derivados de ratón. Este método puede comprender además la etapa opcional de introducir la alteración de aminoácidos antes mencionada relacionada con el control de la interfaz usando repulsión de carga o similar.

El residuo de aminoácido para la introducción de una mutación en la posición 397 se modifica preferiblemente a un aminoácido que tiene una cadena lateral voluminosa o a un aminoácido que tiene una cadena lateral ramificada.

El residuo de aminoácido para la introducción de una mutación en la posición 392 se modifica preferiblemente a un aminoácido que tiene una carga negativa, a un aminoácido que tiene una cadena lateral voluminosa o a un aminoácido que tiene una cadena lateral ramificada.

Ejemplos de “aminoácido que tiene una cadena lateral voluminosa” incluyen Met (M), Phe (F), Tyr (Y), Val (V), Leu (L), Ile (I), T rp (W), Arg (R), His (H), Glu (E), Lys (K), Gln (Q), Asp (D), Asn (N), Cys (C) y Thr (T) y preferiblemente incluyen Met (M), Phe (F), Thr (T) y Tyr (Y).

Ejemplos de “aminoácido que tiene una cadena lateral ramificada” incluyen Val (V), Ile (I) y Leu (L) y preferiblemente incluyen Val (V) e Ile (I).

Ejemplos de “aminoácido que tiene una carga negativa” incluyen Asp (D) y Glu (E).

Ejemplos preferidos de “heteromultímero” pueden incluir anticuerpos multiespecíficos y proteínas de heterofusión.

En el presente documento se divulga la alteración de aminoácidos de un heteromultímero para mejorar la unión a FcyR. Ejemplos preferidos del sitio de alteración de aminoácidos incluyen, sin limitación, un aminoácido en la posición de numeración UE 397. El residuo de aminoácido para la introducción de una mutación en la posición 397 se altera preferiblemente a un aminoácido que tiene una cadena lateral voluminosa o a un aminoácido que tiene una cadena lateral ramificada.

Ejemplos más preferidos de anticuerpo multiespecífico incluyen el tipo IgG, scFv-IgG, el Tándem scFv-Fc, DVD-Ig, Diacuerpo-Fc, Diacuerpo-Fc monocatenario, IgG-scFv, sVD-IgG, Tandemab, fusión C-terminal del scFv de cadena ligera, fusión C-terminal triespecífica, fusión N-terminal triespecífica e IgG-Fab (anticuerpos biespecíficos, Roland E. Kontermann, 2011, WO2010034441 y WO2010145792).

El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y variantes de anticuerpos (anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de bajo peso molecular (que también incluyen fragmentos de anticuerpos), anticuerpos multiespecíficos, etc.) siempre que el anticuerpo presente una actividad biológica deseada. Según la divulgación, el “anticuerpo” puede ser un polipéptido o puede ser un heteromultímero. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo de bajo peso molecular tal como un fragmento de anticuerpo. El método para controlar la disociación y/o la asociación puede usarse preferiblemente para obtener (preparar) estos anticuerpos.

Ejemplos preferidos del polipéptido o heteromultímero sometidos al método descrito en este documento pueden incluir un polipéptido o un heteromultímero que tiene una región variable de cadena pesada de anticuerpo y una región variable de cadena ligera. Se describe además un método para controlar la disociación y/o la asociación del polipéptido o el heteromultímero según la divulgación que comprende dos o más tipos de regiones variables de cadena pesada y dos o más tipos de regiones variables de cadena ligera.

El polipéptido que tiene una actividad de unión a antígeno según la divulgación puede comprender la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de anticuerpo o la secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de anticuerpo. Más específicamente, el polipéptido que tiene una primera actividad de unión a antígeno y el polipéptido que tiene una segunda actividad de unión a antígeno pueden comprender cada uno la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de anticuerpo. El polipéptido que tiene una tercera actividad de unión a antígeno y el polipéptido que tiene una cuarta actividad de unión a antígeno pueden comprender cada uno la secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de anticuerpo.

Cuando el multímero polipeptídico de interés es un tetrámero que es un multímero formado por un dímero formado entre el primer polipéptido y el tercer polipéptido y un dímero formado entre el segundo polipéptido y el cuarto polipéptido, también puede usarse como multímero polipeptídico según la divulgación, por ejemplo, un multímero polipeptídico en el que los polipéptidos tienen la primera y segunda actividades de unión a antígeno son polipéptidos que comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de anticuerpo, mientras que los polipéptidos que tienen la tercera y cuarta actividades de unión a antígeno son polipéptidos que comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de una cadena ligera de anticuerpo.

Otros ejemplos preferidos del anticuerpo multiespecífico que se da a conocer en este documento pueden incluir anticuerpos biespecíficos.

En un aspecto preferido de la presente invención, la presente invención se refiere, por ejemplo, a un método para controlar la disociación y/o la asociación de un anticuerpo biespecífico que comprende dos tipos de cadenas pesadas (el primer polipéptido y el segundo polipéptido en el multímero polipeptídico según la presente invención) y dos tipos de cadenas ligeras (el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido en el multímero polipeptídico según la divulgación).

Se describirá con más detalle un “anticuerpo biespecífico” preferido. El “primer polipéptido y el segundo polipéptido” se refieren a una (primera cadena H) de dos cadenas pesadas (cadenas H) que constituyen el anticuerpo y la otra cadena H (segunda cadena H) diferente de la primera cadena H. En resumen, una cualquiera de las dos cadenas H se puede seleccionar arbitrariamente como primera cadena H, y la otra cadena H puede constituir la segunda cadena H. Asimismo, el “tercer polipéptido y el cuarto polipéptido” se refieren a una (primera cadena L) de dos cadenas ligeras (cadenas L) que constituyen el anticuerpo biespecífico y la otra cadena L (segunda cadena L) diferente de la primera cadena L. Una cualquiera de las dos cadenas L se puede seleccionar arbitrariamente como primera cadena L, y la otra cadena H puede constituir la segunda cadena L. Por lo general, la primera cadena L y la primera cadena H se derivan del mismo anticuerpo que reconoce un determinado antígeno (o epítopo). La segunda cadena L y la segunda cadena H también se derivan del mismo anticuerpo que reconoce un determinado antígeno (o epítopo). En este contexto, un par de cadenas L-H formado por la primera cadena H y la cadena L se denomina primer par (o primera molécula HL). Un par de cadenas L-H formado por la segunda cadena H y la cadena L se denomina segundo par (o segunda molécula HL). El primer par y el segundo par pueden reconocer el mismo antígeno y reconocer preferiblemente diferentes epítopos. En este caso, las cadenas H o las cadenas L en el primer par y el segundo par tienen preferiblemente secuencias de aminoácidos diferentes entre sí. Cuando el primer par y el segundo par reconocen diferentes epítopos, el primer par puede reconocer un antígeno totalmente diferente al del segundo par, o el primer par y el segundo par pueden reconocer diferentes sitios (diferentes epítopos) en el mismo antígeno (por ejemplo, cuando el antígeno es un receptor heteromérico, el anticuerpo multiespecífico reconoce diferentes dominios que constituyen el receptor heteromérico; o cuando el antígeno es un monómero, el anticuerpo multiespecífico reconoce varios sitios en el antígeno monomérico). Dicha molécula generalmente se une a dos antígenos, pero puede tener especificidades para dos o más (por ejemplo, 3 tipos de) antígenos. Alternativamente, uno de los pares puede reconocer un antígeno como una proteína, un péptido, un gen o un azúcar, y el otro par puede reconocer, por ejemplo, una sustancia citotóxica como una sustancia radiactiva, un agente quimioterapéutico o un toxina derivada de células. En caso de preparar un anticuerpo deseado que tenga pares formados por cadenas H y cadenas L particulares en combinación, pueden determinarse arbitrariamente cadenas H y cadenas L particulares como primer par y segundo par.

Según la divulgación, la “proteína de fusión” se refiere a una proteína en la que dos o más moléculas de proteína idénticas o sustancialmente análogas se unen mediante un conector de secuencias de aminoácidos de la región bisagra de Ig. El prefijo “hetero-” se utiliza para describir una proteína de fusión que contiene más de un tipo de proteínas. La “proteína de hetero-fusión” contiene, por ejemplo, dos o más proteínas que son una o más proteínas residuales y una o más proteínas diferentes unidas entre sí.

El “anticuerpo” divulgado en este documento incluye aquellos obtenidos alterando adicionalmente la secuencia de aminoácidos del anticuerpo mencionado anteriormente mediante sustitución, deleción, adición y/o inserción de aminoácidos, o quimerización, humanización, etc. La alteración de una secuencia de aminoácidos por sustitución, deleción, adición y/o inserción de aminoácidos, o la humanización, la quimerización, etc., se pueden poner en práctica mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica. Asimismo, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo y las regiones constantes para usar en la preparación del anticuerpo según la divulgación como un anticuerpo recombinante pueden alterarse mediante sustitución, deleción, adición y/o inserción de aminoácidos, o quimerización, humanización, etc.

El anticuerpo aquí divulgado puede ser un anticuerpo derivado de cualquier animal, tal como un anticuerpo de ratón, un anticuerpo humano, un anticuerpo de rata, un anticuerpo de conejo, un anticuerpo de cabra o un anticuerpo de camello. El anticuerpo puede ser un anticuerpo alterado preparado mediante la sustitución de la secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, un anticuerpo quimérico, particularmente, un anticuerpo humanizado. Alternativamente, se puede usar cualquier anticuerpo, tal como un anticuerpo modificado conjugado con varias moléculas, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de bajo peso molecular.

El “anticuerpo quimérico” es un anticuerpo preparado a partir de una combinación de secuencias derivadas de diferentes animales. Los ejemplos del mismo pueden incluir un anticuerpo compuesto por regiones variables (V) de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo de ratón y regiones constantes (C) de cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo humano. La preparación del anticuerpo quimérico es conocida en la técnica. El anticuerpo quimérico se puede obtener, por ejemplo, mediante: ligación de ADN que codifican las regiones V del anticuerpo con ADN que codifica las regiones C del anticuerpo humano; incorporar los productos de ligación resultantes en vectores de expresión; y transferir los vectores a anfitriones para la producción de anticuerpos.

El “anticuerpo humanizado”, también llamado anticuerpo humano reformado, se obtiene injertando regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano — por ejemplo, un anticuerpo de ratón— a CDR de un anticuerpo humano. Se conoce en la técnica un método para identificar CDR (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Maryland; y Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). También se conoce en la técnica un planteamiento general de recombinación de genes (véanse la publicación de solicitud de patente europea n° EP 125023 y el documento WO 96/02576). Por consiguiente, por ejemplo, las CDR de anticuerpos de ratón se determinan mediante un método conocido en la técnica. Se obtiene un ADN que codifica un anticuerpo que tiene estas CDR unidas a regiones marco de anticuerpos humanos (FR). El anticuerpo humanizado se puede producir en un sistema usando vectores de expresión habituales. Dicho ADN se puede sintetizar mediante PCR usando varios cebadores oligonucleotídicos preparados para tener una porción que se superponga a las regiones terminales tanto de CDR como de FR (véase un método descrito en el documento WO98/13388). Las FR de anticuerpos humanos conectadas a través de las CDR se seleccionan de manera que las CDR formen un sitio favorable de unión al antígeno. Si es necesario, los aminoácidos en las FR de las regiones variables del anticuerpo pueden alterarse de modo que las CDR del anticuerpo humano remodelado resultante formen un sitio apropiado de unión al antígeno (Sato et al., Cancer Res. (1993) 53: 851-6). Los residuos de aminoácidos en las FR que se pueden alterar incluyen restos que se unen directamente a un antígeno a través de un enlace no covalente (Amit et al., Science (1986) 233: 747-53), restos que influyen o actúan sobre las estructuras CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901 -17) y restos relacionados con la interacción VH-VL (EP239400).

Cuando el anticuerpo divulgado es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, las regiones constantes derivadas del anticuerpo humano se usan preferiblemente como regiones C del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden usar Cy 1, Cy2, Cy3 o Cy4 para una cadena H, y se pueden usar Ck o CA para una cadena L. Además, las regiones C del anticuerpo humano pueden modificarse, si es necesario, para mejorar el anticuerpo o la estabilidad de su producción. El anticuerpo quimérico comprende preferiblemente regiones variables de un anticuerpo derivado de mamífero no humano y regiones constantes derivadas de un anticuerpo humano. Por otro lado, el anticuerpo humanizado comprende preferiblemente CDR de un anticuerpo derivado de mamífero no humano y regiones FR y C derivadas de un anticuerpo humano. Las regiones constantes derivadas de un anticuerpo humano tienen secuencias de aminoácidos específicas para cada isotipo, como IgG (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgM, IgA, IgD o IgE. Las regiones constantes utilizadas en el anticuerpo humanizado descrito pueden ser regiones constantes de un anticuerpo que pertenece a cualquier isotipo. Preferiblemente, se utilizan regiones constantes de IgG humana, aunque las regiones constantes no se limitan a las mismas. Las FR derivadas de un anticuerpo humano usado en el anticuerpo humanizado no están particularmente limitadas y pueden derivarse de un anticuerpo que pertenezca a cualquier isotipo.

Las regiones variables y las regiones constantes del anticuerpo quimérico o del anticuerpo humanizado pueden alterarse por deleción, sustitución, inserción y/o adición, etc., siempre que el anticuerpo resultante muestre la especificidad de unión del anticuerpo original.

El anticuerpo quimérico o el anticuerpo humanizado que contiene una secuencia de origen humano exhibe una antigenicidad reducida en un cuerpo humano y, por lo tanto, se considera útil cuando se administra a seres humanos con un propósito terapéutico o similar.

Combinación con la técnica de alternancia de puntos isoeléctricos, etc.

Se puede introducir una mutación de aminoácido que altera el punto isoeléctrico (valor pl) de un polipéptido en el polipéptido descrito en este documento para purificar o producir el multímero polipeptídico que tiene del primero al cuarto polipéptido de interés con mayor pureza y mayor eficiencia (WO2007114325 y US20130171095). Por ejemplo, pueden usarse un método para heteroasociar polipéptidos que comprenden dos tipos de regiones constantes de cadena pesada mediante la alteración de los dominios CH3 de las regiones constantes de cadena pesada (que se describe, por ejemplo, en Protein Eng. julio de 1996; 9 (7): 617-21; Protein Eng Des Sel., abril de 2010; 23 (4): 195 202; J Biol Chem., 18 de junio de 2010; 285 (25): 19637-46; WO2009080254; y US20130195849) y un método para promover la asociación de una cadena pesada y una cadena ligera en una combinación particular (que se describe, por ejemplo, en los documentos WO2009080251, WO2009080252, y WO2009080253) para la mutación de aminoácidos que se introduce para promover la asociación entre polipéptidos.

Combinación con la técnica relacionada con la molécula de unión al antígeno específica a un tejido diana

El método divulgado se puede combinar con una técnica de anticuerpos para la disociación o la unión a un antígeno de una manera dependiente de la concentración de una molécula presente específicamente para un tejido diana (WO2013/180200).

Combinación con otras técnicas de alteración de regiones constantes y/o regiones variables

El método descrito se puede combinar con una técnica de alteración de regiones constantes con el objetivo de mejorar la unión a FcyR (WO2013047752).

Ejemplos de la combinación del método descrito con otras técnicas de alteración de la región constante incluyen su combinación con una técnica de control de la unión a un complemento. Cualquier componente del complemento puede usarse como complemento siempre que el complemento sea un polipéptido que forme una cascada de complemento. Ejemplos preferidos del complemento incluyen los componentes de complemento C1q, C1r y C1s implicados en la unión de opsonina. Una región Fc que tiene una actividad de unión más alta contra un complemento que la de una región Fc de origen natural contra el complemento puede prepararse mediante la alteración de aminoácidos de la región Fc de origen natural. En este contexto, región Fc de origen natural se refiere a una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. Si la región Fc tiene o no una mayor actividad de unión contra un complemento que la de una región Fc de origen natural contra el complemento puede confirmarse debidamente mediante el uso de un método inmunológico conocido en la técnica, tal como FACS o ELISA. La expresión “alteración de aminoácido(s)” de la región Fc incluye la alteración de la secuencia de aminoácidos de una región Fc de partida a una secuencia de aminoácidos diferente. Puede usarse cualquier región Fc como dominio de partida siempre que la forma modificada o alterada resultante de la región Fc de partida pueda unirse al complemento en una región de pH neutro. También se puede usar preferiblemente como región Fc según la divulgación una región Fc preparada mediante la alteración adicional de una región Fc ya alterada como región Fc de partida. La región Fc de partida puede significar el polipéptido en sí mismo, una composición que contiene la región Fc de partida o una secuencia de aminoácidos que codifica la región Fc de partida. La región Fc de partida puede incluir una región Fc de anticuerpo IgG conocida en la técnica, que se produce mediante la recombinación resumida en la sección sobre el anticuerpo. El origen de la región Fc de partida no está limitado y la región Fc de partida puede obtenerse de un organismo arbitrario de un animal no humano o de un ser humano. Ejemplos preferidos del organismo arbitrario incluyen organismos seleccionados de ratones, ratas, cobayas, hámsteres, jerbos, gatos, conejos, perros, cabras, ovejas, vacas, caballos, camellos y primates no humanos. La región Fc de partida puede obtenerse de un macaco cangrejero, un tití, un mono Rhesus, un chimpancé o un ser humano. Preferiblemente, la región Fc de partida se puede obtener a partir de IgG1 humana, pero no está limitada por la clase particular de IgG. Esto significa que puede usarse apropiadamente como región Fc de partida una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. Esto también significa que en la presente memoria descriptiva se puede usar preferiblemente como región Fc de partida una región Fc de cualquier clase o subclase de IgG del organismo arbitrario. En la bibliografía públicamente conocida (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202; y los documentos WO2009086320, WO2008092117, WO2007041635, y WO2006105338) se describen ejemplos de variantes o modelos diseñados de IgG de origen natural, aunque la región Fc no se limita a ello.

Se puede alterar un aminoácido en cualquier posición siempre que la alteración del aminoácido pueda conferir la actividad de unión contra el complemento o pueda potenciar la actividad de unión para la unión al complemento. La molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc de IgG 1 humana como región Fc humana contiene preferiblemente la alteración para provocar el efecto de potenciar su actividad de unión contra el complemento sobre la actividad de unión de la región Fc de partida de IgG1 humana. Ejemplos del aminoácido para alterar la actividad de unión contra el complemento incluyen aminoácidos en la región Fc con actividad de unión alterada contra C1q documentados, por ejemplo, en Duncan et al. (Nature (1988) 332, 738-740), Tao et al. (J. Exp. Med. (1993) 178, 661 667), Brekke et al. (Eur. J. Immunol. (1994) 24, 2542-2547), Xu et al. (Immunol. (1993) 150, 152A), WO1994029351, WO2000042072, y WO2011091078.

Ejemplos de un aminoácido de este tipo que permite la alteración para mejorar la actividad de unión contra C1q incluyen al menos uno o más aminoácidos seleccionados de las posiciones de numeración UE 231 a 238 y las posiciones 318 a 337. Un ejemplo no limitante del aminoácido incluye al menos uno o más aminoácidos seleccionados del grupo constituido por las posiciones 235, 237, 267, 268, 276, 318, 320, 322, 324, 327, 331 y 333. La alteración de estos aminoácidos mejora la unión de una región Fc de inmunoglobulina de tipo IgG al complemento.

Ejemplos particularmente preferidos de la alteración incluyen la alteración de

un aminoácido en la posición de numeración de la UE 267 a Glu,

un aminoácido en la posición de numeración de la UE 268 a cualquiera de Phe y Tyr,

un aminoácido en la posición de numeración de la UE 276 a Arg,

un aminoácido en la posición de numeración de la UE 324 a Thr,

un aminoácido en la posición de numeración de la UE 327 a Gly,

un aminoácido en la posición de numeración de la UE 331 a Pro, o

un aminoácido en la posición de numeración de la UE 333 a cualquiera de Ala, Asp, Gly, Ser y Val en la región Fc

El número de aminoácidos que han de alterarse no está particularmente limitado. Se puede alterar un aminoácido en

un solo sitio, o se pueden alterar los aminoácidos en dos o más sitios en una combinación arbitraria seleccionada de las descritas anteriormente.

Ejemplos de la combinación del método divulgado con otras técnicas de alteración de la región constante incluyen su combinación con técnicas de alteración de anticuerpos tales como una técnica de alteración de Fc para mejorar la unión a FcRn a pH ácido (WO2002060919, WO2004035752, y WO2000042072), una técnica de alteración de Fc para mejorar la unión a FcRn a pH neutro (WO2011122011 y WO2012133782), una técnica para mejorar la unión selectiva a los receptores inhibidores de Fcy (WO2012115241 y WO2013125667), una técnica para mejorar la unión selectiva a los receptores Fcy activos (técnica de mejora de la actividad de ADCC) (WO2013002362), y una técnica para reducir la actividad de unión contra factores reumatoides (WO2013046704).

Ejemplos de la combinación del método divulgado con una técnica de alteración de la región variable incluyen su combinación con técnicas de alteración tales como un anticuerpo dependiente del pH (WO2009125825) y un anticuerpo dependiente de calcio (WO2012073992).

Biblioteca de anticuerpos, inmunización y preparación de hibridomas

Puede usarse una secuencia conocida como gen que codifica la cadena H o la cadena L del anticuerpo antes de la introducción de una mutación en el método descrito. Alternativamente, el gen puede obtenerse mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el gen puede obtenerse de una biblioteca de anticuerpos o puede obtenerse mediante la clonación de un gen que codifica un anticuerpo a partir de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales.

En la técnica ya se conocen muchas bibliotecas de anticuerpos como una biblioteca de anticuerpos de ese tipo.

Además, se conocen en la técnica métodos para preparar la biblioteca de anticuerpos. Por tanto, los expertos en la técnica pueden obtener debidamente la biblioteca de anticuerpos. Para una biblioteca de fagos de anticuerpos, por ejemplo, consúltese bibliografía como Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8., Marks et al., J. Mol. Biol. 1991,222:

581 -97, Waterhouse et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6, Griffiths et al., Em BO J. 1994, 13: 3245-60, Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14, y la publicación nacional de la solicitud de patente internacional n° 2008 504970. Además, puede usarse un método conocido en la técnica, tal como un método para preparar una biblioteca usando células eucariotas (WO95/15393) o un método de visualización de ribosomas. Además, también se conoce una técnica para obtener un anticuerpo humano mediante adsorción usando una biblioteca de anticuerpos humanos.

Por ejemplo, las regiones variables de anticuerpos humanos se expresan como un anticuerpo monocatenario (scFv) en la superficie de los fagos mediante un método de presentación en fagos. Puede seleccionarse un fago que exprese la unión de scFv al antígeno. El gen del fago seleccionado se puede analizar para determinar las secuencias de ADN

que codifican las regiones variables del anticuerpo humano que se une al antígeno. Si se puede determinar la secuencia de ADN del scFv que se une al antígeno, se pueden preparar vectores de expresión apropiados sobre la base de esta secuencia y usarlos para obtener el anticuerpo humano. Estos métodos ya son bien conocidos. Véanse los documentos WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, y WO95/15388.

Básicamente, se usa una técnica conocida en la técnica en un método para obtener el gen que codifica el anticuerpo a partir de hibridomas. Un antígeno deseado o células que expresan el antígeno deseado se utilizan como antígeno sensibilizante. Los animales se inmunizan con este antígeno sensibilizante según un método de inmunización habitual.

Los inmunocitos así obtenidos se fusionan con células parentales conocidas en la técnica mediante un método de fusión celular habitual. Las células productoras de anticuerpos monoclonales (hibridomas) se criban mediante un método de cribado habitual. A partir de los ARNm de los hibridomas obtenidos, se pueden sintetizar los ADNc de las regiones variables (regiones V) del anticuerpo usando transcriptasa inversa y ligarse con ADN que codifican las regiones constantes (regiones C) del anticuerpo deseadas para obtener el gen que codifica el anticuerpo.

Más específicamente, aunque la presente divulgación no está limitada por los ejemplos siguientes, el antígeno sensibilizador para obtener los genes que codifican la cadena H y la cadena L del anticuerpo incluye tanto un antígeno completo que tiene inmunogenicidad como un antígeno incompleto (que incluye hapteno, etc.) que no exhibe inmunogenicidad alguna. Por ejemplo, se puede usar una proteína de longitud completa o un péptido parcial de la proteína de interés. Además, es sabido que sirve de antígeno una sustancia constituida por un polisacárido, un ácido nucleico, un lípido o similares. El antígeno para el anticuerpo divulgado en este documento no está particularmente limitado. El antígeno se puede preparar mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica y se puede obtener, por ejemplo, según un método que utiliza baculovirus (por ejemplo, WO98/46777). Los hibridomas

se pueden preparar, por ejemplo, según el método de Milstein et al. (G. Kohler y C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46). Cuando el antígeno tiene baja inmunogenicidad, este antígeno puede unirse a una macromolécula inmunogénica como la albúmina para la inmunización. Si es necesario, el antígeno puede unirse a otra molécula para formar un antígeno soluble. En caso de usar como antígeno una molécula transmembranal tal como un receptor, una porción de la región extracelular del receptor puede usarse como un fragmento, o las células que expresan la molécula transmembranal en su superficie pueden usarse como inmunógeno.

Las células productoras de anticuerpos pueden obtenerse mediante la inmunización de animales con cualquiera de los antígenos sensibilizantes apropiados mencionados anteriormente. Alternativamente, se pueden inmunizar linfocitos capaces de producir anticuerpos in vitro y utilizarse como células productoras de anticuerpos. Se pueden usar diversos mamíferos como animales que han de ser inmunizados. Generalmente se utiliza un animal de los órdenes Rodentia, Lagomorpha o Primates. Ejemplos de los mismos pueden incluir: Rodentia: animales como ratones, ratas y hámsteres; Lagomorpha: animales como conejos; y Primates: animales como monos, incluidos macacos cangrejeros, monos Rhesus, babuinos hamadryas y chimpancés. Además, también se conocen animales transgénicos que tienen repertorios de genes de anticuerpos humanos, y dichos animales también pueden usarse para obtener el anticuerpo humano (véanse el documento WO96/34096; y Méndez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56). En lugar de utilizar tales animales transgénicos, por ejemplo, se sensibilizan linfocitos humanos in vitro con el antígeno deseado o las células que expresan el antígeno deseado, y los linfocitos sensibilizados se pueden fusionar con células de mieloma humano, por ejemplo, U266, para obtener el anticuerpo humano deseado que tenga actividad de unión contra el antígeno (véase la publicación de patente japonesa n° 1 -59878). Además, los animales transgénicos que tienen todos los repertorios de genes de anticuerpos humanos pueden inmunizarse con el antígeno deseado para obtener el anticuerpo humano deseado (véanse los documentos WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO96/34096, y WO96/33735).

Para la inmunización de estos animales, por ejemplo, el antígeno sensibilizante se diluye apropiadamente o se suspende en solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina o similar, se mezcla con un adyuvante, si es necesario, y se emulsiona. Luego, el antígeno sensibilizante resultante se inyecta a los animales por vía intraperitoneal o subcutánea. A continuación, se administra a los animales el antígeno sensibilizante, preferiblemente mezclado con un adyuvante incompleto de Freund, varias veces a intervalos de 4 a 21 días. La producción de anticuerpos puede confirmarse midiendo el título de anticuerpos de interés en el suero de los animales mediante un método utilizado habitualmente.

Los hibridomas se pueden preparar fusionando las células productoras de anticuerpos obtenidas de los animales o los linfocitos inmunizados con el antígeno deseado con células de mieloma usando un agente de fusión (por ejemplo, polietilenglicol) de uso rutinario (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59 103). Si es necesario, las células de hibridoma se cultivan para su crecimiento y la especificidad de unión de los anticuerpos producidos por los hibridomas se mide mediante un método de análisis conocido en la técnica como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés). A continuación, el hibridoma que produce el anticuerpo confirmado por la medición que tiene la especificidad, la afinidad o la actividad de interés también puede subclonarse, si es necesario, mediante un planteamiento tal como un método de dilución limitante.

Posteriormente, se puede clonar un gen que codifica el anticuerpo seleccionado a partir del hibridoma o de las células productoras de anticuerpos (linfocitos sensibilizados, etc.) usando una sonda (por ejemplo, un oligonucleótido complementario a una secuencia que codifica una región constante de anticuerpo) capaz de unirse específicamente al gen del anticuerpo. El gen también se puede clonar a partir de ARNm mediante RT-PCR. Las inmunoglobulinas se clasifican en cinco clases diferentes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Estas clases se dividen además en algunas subclases (isotipos) (por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; e IgA-1 e IgA-2). Según la divulgación, la cadena H y la cadena L utilizadas en la producción de anticuerpos pueden derivarse de un anticuerpo que pertenezca a cualquiera de estas clases y subclases. Tal anticuerpo no está particularmente limitado y, en particular, es preferiblemente IgG.

En este contexto, los genes que codifican la cadena H y la cadena L pueden alterarse mediante un planteamiento de ingeniería genética. Por ejemplo, un anticuerpo genéricamente recombinante — por ejemplo, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado— se puede preparar apropiadamente alterando artificialmente un anticuerpo tal como un anticuerpo de ratón, un anticuerpo de rata, un anticuerpo de conejo, un anticuerpo de hámster, un anticuerpo de oveja, o un anticuerpo de camello con el fin de, por ejemplo, reducir la heteroantigenicidad en seres humanos. El anticuerpo quimérico es un anticuerpo compuesto de regiones variables de cadena H y cadena L de un anticuerpo de mamífero no humano, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, y regiones constantes de cadena H y cadena L de un anticuerpo humano. El anticuerpo quimérico puede obtenerse: ligando los ADN que codifican las regiones variables del anticuerpo de ratón con ADN que codifican las regiones constantes del anticuerpo humano; incorporar los productos de ligación resultantes en vectores de expresión; y transferir los vectores a anfitriones para la producción de anticuerpos. El anticuerpo humanizado también se denomina anticuerpo humano reformado. Las secuencias de ADN diseñadas para conectar regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo de mamífero no humano — por ejemplo, un anticuerpo de ratón— se sintetizan mediante PCR a partir de varios oligonucleótidos preparados que tienen porciones terminales superpuestas. Los ADN obtenidos se ligan con ADN que codifican regiones constantes de anticuerpos humanos, y los productos de ligación resultantes se incorporan posteriormente a los vectores de expresión, que luego se transfieren a los anfitriones para la producción de anticuerpos (véanse los documentos EP239400; y WO96/02576). Las FR de anticuerpos humanos conectadas a través de las CDR se seleccionan de manera que las regiones determinantes de la complementariedad formen un sitio favorable de unión al antígeno. Si es necesario, los aminoácidos en las regiones marco de las regiones variables del anticuerpo pueden sustituirse de manera que las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo humano reformado resultante formen

un sitio apropiado de unión al antígeno (K. Sato et al., Cancer Res. 1993, 53: 851-856).

Además de la humanización antes mencionada, por ejemplo, también es posible la alteración para mejorar las propiedades biológicas del anticuerpo, como la actividad de unión contra el antígeno. Tal alteración se puede llevar a cabo mediante un método como la mutagénesis dirigida al sitio (véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488), mutagénesis por PCR o mutagénesis por casete. En general, tal variante de anticuerpo que tiene las propiedades biológicas mejoradas tiene 70% o más, más preferiblemente 80% o más, más preferiblemente 90% o más (por ejemplo, 95% o más, 97%, 98% o 99%) de homología de secuencia de aminoácidos y/o similitud con las secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo original. En la presente memoria descriptiva, la homología y/o la similitud de secuencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos homólogos (residuos de aminoácidos idénticos) o similares (residuos de aminoácidos clasificados en el mismo grupo sobre la base de las propiedades de la cadena lateral de aminoácidos generales) a los residuos del anticuerpo original después de la alineación de secuencias y la introducción de espacios según sea necesario para lograr el mayor valor de homología de secuencias. Normalmente, los residuos de aminoácidos naturales se clasifican basándose en las propiedades de sus cadenas laterales en (1) grupo hidrófobo: alanina, isoleucina, norleucina, valina, metionina y leucina; (2) grupo hidrófilo neutro: asparagina, glutamina, cisteína, treonina y serina; (3) grupo ácido: ácido aspártico y ácido glutámico; (4) grupo básico: arginina, histidina y lisina; (5) grupo de residuos que influyen en la orientación de la cadena: glicina y prolina; y (6) grupo aromático: tirosina, triptófano y fenilalanina.

Un total de seis regiones determinantes de complementariedad (dominios hipervariables; CDR) presentes en las regiones variables de la cadena H y la cadena L generalmente interactúan entre sí para formar un sitio de unión al antígeno en el anticuerpo. Se sabe que incluso una de estas regiones variables tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con menor afinidad que la de una molécula que contiene todo el sitio de unión. Por lo tanto, los genes que codifican la cadena H y la cadena L del anticuerpo divulgado pueden codificar fragmentos o fracciones que contienen los respectivos sitios de unión al antígeno de la cadena H y la cadena L siempre que los polipéptidos codificados por los genes mantengan la actividad de unión contra el antígeno deseado.

Actividad de polipéptido y ejemplos de antígeno

Por ejemplo, se puede preparar eficazmente un anticuerpo o un polipéptido que tiene una actividad mediante el uso del método para controlar la disociación y/o la asociación divulgado en el presente documento. Ejemplos de la actividad pueden incluir actividad de unión, actividad neutralizante, actividad citotóxica, actividad agonista, actividad antagonista y actividad enzimática. La actividad agonista es una actividad de transducción de señales intracelularmente; por ejemplo, mediante la unión de un anticuerpo a un antígeno tal como un receptor para inducir un cambio en alguna actividad fisiológica. Ejemplos de actividad fisiológica pueden incluir, sin limitación, actividad proliferativa, actividad de supervivencia, actividad de diferenciación, actividad transcripcional, actividad de transporte membranal, actividad de unión, actividad proteolítica, actividad de fosforilación/desfosforilación, actividad redox, actividad de transferencia, actividad nucleolítica, actividad de deshidratación, actividad inductora de muerte celular y actividad inductora de apoptosis.

Además, mediante el método divulgado en el presente documento, puede prepararse eficazmente un anticuerpo o un polipéptido que reconoce un antígeno deseado o se une a un receptor deseado.

En la presente memoria descriptiva, el antígeno no está particularmente limitado y se puede usar cualquier antígeno. Ejemplos preferidos del antígeno incluyen ligandos (citocinas, quimiocinas, etc.), receptores, antígenos de cáncer, antígenos de MHC, antígenos de diferenciación, inmunoglobulinas e inmunocomplejos que contienen parcialmente una inmunoglobulina.

Ejemplos de citocinas pueden incluir interleucinas 1 a 18, factores estimulantes de colonias (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, ^{etc.), interferones (IFN-a, IFN-p,}IFN-^y, ^{etc.), factores de crecimiento (EGF, FGF, IGF,}NgF, PDgF, ^TGF,HgF, ^etc.),factores de necrosis tumoral (TNF-a y TNF-p), linfotoxina, eritropoyetina, leptina, SCF, TPO, MCAF y BMP.

Ejemplos de quimiocinas pueden incluir quimiocinas CC tales como CCL1 a CCL28, quimiocinas CXC tales como CXCL1 a CXCL17, quimiocinas C tales como XCL1 a XCL2 y quimiocinas CX3C tales como CX3CL1.

Ejemplos de receptores pueden incluir receptores que pertenecen a familias de receptores tales como la familia de receptores del factor hematopoyético, la familia de receptores de citocinas, la familia de receptores de tirosina quinasa, la familia de receptores de serina/treonina quinasa, la familia de receptores de TNF, la familia de receptores acoplados a proteína G, la familia de receptores anclados a GPI, la familia de receptores de tirosina fosfatasa, la familia de factores de adhesión y la familia de receptores hormonales. Los receptores que pertenecen a estas familias de receptores y sus características se describen en muchas publicaciones; por ejemplo, Cooke BA., King RJB., Van der Molen HJ. ed. New Comprehensive Biochemistry vol. 18B “Hormones and their Actions Part II” pp. 1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., Patthy (Cell (1990) 61 (1), 13-14), Ullrich et al. (Cell (1990) 61 (2), 203-212), Massagué (Cell (1992) 69 (6), 1067-1070), Miyajima et al. (Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331), Taga et al. (FASEB J. (1992) 6, 3387-3396), Fantl et al. (Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481), Smith et al. (Cell (1994) 76 (6) 959-962), y Flower DR. (Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3) 207-234).

Ejemplos preferidos de receptores específicos que pertenecen a las familias de receptores incluyen el receptor de eritropoyetina (EPO) humano o de ratón (Blood (1990) 76 (1), 31-35; y Cell (1989) 57 (2), 277-285), el receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) humano o de ratón (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706; mG-CSFR; y Cell (1990) 61 (2), 341-350), el receptor de trombopoyetina (TPO) humano o de ratón (Proc Natl Acad Sci USA. (1992) 89 (12), 5640-5644; y Em Bo J. (1993) 12 (7), 2645-53), el receptor de insulina humano o de ratón (Nature (1985) 313 (6005), 756-761), el receptor del ligando Flt-3 humano o de ratón (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463), el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) humano o de ratón (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439), el receptor de interferón (IFN)-a/p humano o de ratón (Cell (1990) 60 (2), 225-234; y Cell (1994) 77 (3), 391-400), el receptor de leptina humano o de ratón, el receptor de hormona de crecimiento (GH) humano o de ratón, el receptor de interleucina (IL)-10 humano o de ratón, el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF)-I humano o de ratón, el factor inhibidor de la leucemia humano o de ratón (LIF) y el receptor del factor neurotrófico ciliar humano o de ratón (CNTF).

Los antígenos del cáncer son antígenos que se expresan con la transformación maligna de las células y también se denominan antígenos específicos a tumores. Las cadenas de azúcar anormales que aparecen en la superficie celular o en las moléculas de proteína cuando las células se vuelven cancerosas también se incluyen en los antígenos del cáncer y también se denominan antígenos de carbohidratos del cáncer. Ejemplos preferidos de los antígenos del cáncer incluyen GPC3, que pertenece a la familia de receptores anclados a GPI como los receptores mencionados anteriormente, pero se expresa en algunos cánceres, incluido el cáncer de hígado (Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455 65), EpCAM, que se expresa en varios cánceres, incluido el cáncer de pulmón (Proc Natl Acad Sci USA. (1989) 86 (1), 27-31), CA19-9, CA15-3 y Sialyl SSEA-1 (SLX).

Los antígenos de MHC se clasifican principalmente en antígenos de MHC de clase I y antígenos de MHC de clase II. Los antígenos del MHC de clase I incluyen HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G y -H. Los antígenos del MHC de clase II incluyen HLA-DR, -DQ y -DP.

Los antígenos de diferenciación pueden incluir CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126 y CDw130.

Las inmunoglobulinas incluyen IgA, IgM, IgD, IgG e IgE. Los inmunocomplejos contienen al menos cualquier componente de inmunoglobulinas.

Otros ejemplos del antígeno pueden incluir las siguientes moléculas: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1 a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, activina, activina A, activina AB, activina B, activina C, activina ^{RIA, activina RIA ALK-2, activina}RiB ^{ALK-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15,}ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adresina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alfa-1-antitripsina, antagonista alfa-V/beta-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, ABRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti-Id, ASPARTIC, factor natriurético auricular, integrina av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, factor estimulante de linfocitos B (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 (osteogenina), BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-^{1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF,}BoK, ^{bombesina, factor neurotrófico de origen óseo,}BpDe, BpDe-DNA, ^BTC,factor del complemento 3 (C3), C3a, C4, C10, CA125, CAD-8, calcitonina, cAMP, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno asociado al cáncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11 a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, ^{CD147, CDM8, CD152,}cD164, ^{CEA CAM5,}CFtR, cgMp, ^{CINC, toxina Clostridium botulinum, toxina Clostridium}perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno asociado al tumor citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, factor de aceleración de la desintegración, des(1-3)-IGF-I (IGF-1 cerebral), Dhh, digoxina, DNAM-1, Dnasa, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EdAr, ^{EGF, EGFR (ErbB-1),}eMa, ^{EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, encefalinasa, eNOS, Eot, eotaxina}1, EpCAM, efrina B2/EphB4, EpO, ERCC, E-selectina, ET-1, factor lia, factor VII, factor VlIIc, factor IX, proteína ^{activadora de fibroblastos}(^fA^p), ^{Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR,}F^gFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormona estimulante del folículo, fractalquina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), ^{GDNF, GDNF,}GfAp, ^{GFRa-1, GFR-alfa 1, GFR-alfa 2, GFR-alfa 3, GITR, glucagón, Glut4, glucoproteína IIb/IIIa}(GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, factor de liberación de la hormona del crecimiento, hapteno (NP-cap o NIP-cap), HB-EGF, HCC, glicoproteína de la envoltura gB del HCMV, glicoproteína de la envoltura gH de1HCMV, UL del HCMV, factor de crecimiento hematopoyético (HGF), Hep B gp120, heparanasa, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB del virus del herpes simple (VHS), glicoproteína gD del VHS, HGFA, antígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), VIH gp120, lazo VIH IIIB gp 120 V3, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, miosina del corazón humano, citomegalovirus humano (HCMV), hormona humana del crecimiento (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor de IgA, IgE, IGF, proteína de unión a IGF, IGF-1 R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1 R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferón (INF)-alfa, INF-beta, INF-gamma, inhibina, iNOS, cadena A de insulina, cadena B de insulina, factor de crecimiento similar a la insulina 1, integrina alfa 2, integrina alfa 3, integrina alfa 4, integrina alfa 4/beta 1, integrina alfa 4/beta 7, integrina alfa 5 (alfa V), integrina alfa 5/beta 1, integrina alfa 5/beta 3, integrina alfa 6, integrina beta 1, integrina beta 2, interferón gamma, IP-10, I-TAC, JE, calicreína 2, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, calicreína L2, calicreína L3, calicreína L4, KC, KDR, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), laminina 5, LAMP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 bp1 latente, LBP, LDGF, LECT2, lefty, antígeno Lewis-Y, antígeno relacionado con Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, surfactante pulmonar, hormona luteinizante, receptor de linfotoxina beta, Mac-1, MAdCAM, MAG, MaP2, ^MARC,McAM, MCaM, ^MCK-2,MCP, M-CSF, MDC, Mer, metaloproteasa, receptor MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina (Mucl), MUC18, factor inhibidor antimülleriano, Mug, MuSK, NAIP, ^{NAP, NCAD, N-cadherina, NCA 90,}NCaM, ^{NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4 o -6, neurturina, factor de crecimiento}nervioso (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, ^{OX40R, p150, p95, PADPr, hormona paratiroidea,}PaRc, ^{PARP, PBR, PBSF,}PcAD, ^{P-cadherina, PCNA, PDGF,}PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP), PlGF, PLP, PP14, proinsulina, prorrelaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno prostático específico de membrana (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, cadena A de relaxina, cadena B de ^{relaxina, renina, virus respiratorio sincitial (RSV) F,}RsV ^{Fgp, Ret, factor reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100,}SCF/KL, SDF-1, SERINA, albúmina sérica, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, ^{SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glucoproteína 72 asociada a tumores),}TaRC, ^{TCA-3, receptor}de células T (por ejemplo, receptor de células T alfa/beta), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatasa ^{alcalina tipo pLAP testicular, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta específico a Pan, TGF-beta RI}(AlK-5), ^TGF-beta RII, TGF-beta RIIb, TGF-beta RIII, TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, TGF-beta 4, TGF-beta 5, trombina, timo Ck-1, hormona estimulante de la tiroides, Tie, TIMP, TIQ, factor tisular, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfa/beta, TNF-beta 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG) OCIF, TR1, TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI),TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligando TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (ligando TRANCE/RANK ODF, ligando OPG), TNFSF12 (ligando TWEAK Apo-3, ligando DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligando LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (Ligando GITR ligando AITR, TL6), TNFSF1A (TNF-a conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 ligando gp34, TXGP1), TN FSF5 (ligando CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligando Fas ligando Apo-1, ligando APT1), TNFSF7 (CD27 ligando CD70), TNFSF8 (CD30 ligando CD153), TNFSF9 (ligando 4-1BB ligando CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno asociado a tumor CA125, antígeno asociado a tumor que exhibe carbohidratos relacionados con Lewis Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, uroquinasa, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-cadherina, VE-cadherina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno viral, VLA, VLA-1, VLA-4, integrina VNR, factor de von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Ap, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, LDL oxidada, PCSK9, precalicreína, RON, TMEM16F, SOD1, Cromogranina A, Cromogranina B, tau, VAP1, cininógeno de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdina, esclerostina, fibrinógeno, fibrina, protrombina, trombina, factor tisular, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminógeno, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA, SIP y receptores de hormonas y factores de crecimiento.

Según la divulgación, una especificidad del anticuerpo biespecífico puede dirigirse a un antígeno de cáncer, y la otra especificidad puede dirigirse a un antígeno expresado en CTL (linfocito T citotóxico), por ejemplo, CD3 o TNFRSF (superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral), aunque estas especificidades no se limitan a esta combinación. Ejemplos de TNFRSF incluyen TNFRSF9 (CD137), TNFRSF5 (CD40) y TNFRSF4 (OX40).

Alteración de ácidos nucleicos

El método de producción puede ser un método para producir un heteromultímero que tiene una mutación en los residuos de aminoácidos que forman la interfaz entre los polipéptidos (por ejemplo, residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración UE 356 y 439, las posiciones 357 y 370 y las posiciones 399 y 409), y/o un residuo de aminoácido en la posición de numeración UE 397 y/o 392 para controlar la disociación y/o la asociación entre los polipéptidos, el método de producción comprende las etapas de: (a) alterar los ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos que forman la interfaz entre polipéptidos, etc., con respecto a sus ácidos nucleicos originales para controlar la disociación y la asociación entre los polipéptidos; (b) cultivar una célula anfitriona que tiene los ácidos nucleicos para expresar los polipéptidos; (c) recuperar los polipéptidos de los cultivos de la célula anfitriona; y (d) incubar estos polipéptidos en condiciones reductoras para recuperar un heterómero de los polipéptidos deseados.

Preferiblemente, el método de producción también es un método que comprende la etapa de alterar los ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos que forman la interfaz entre los polipéptidos con respecto a sus ácidos nucleicos originales mediante el uso del método mencionado anteriormente para controlar la disociación y/o la asociación para inhibir la asociación entre los polipéptidos.

En el método divulgado, la frase “alteración de ácidos nucleicos” significa alterar los ácidos nucleicos para que se correspondan con los residuos de aminoácidos que se introducen mediante la “alteración” según la divulgación. Más específicamente, la frase “alteración de ácidos nucleicos” significa alterar los ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos originales (residuos de aminoácidos antes de la alteración) a ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos que son introducidos por la alteración. Habitualmente, esta frase significa llevar a cabo un tratamiento de manipulación o mutación génica para la inserción, la deleción o la sustitución de al menos una base en los ácidos nucleicos originales para que se conviertan en codones que codifiquen los residuos de aminoácidos de interés. Específicamente, los codones que codifican los residuos de aminoácidos originales se sustituyen por codones que codifican los residuos de aminoácidos que se introducen mediante la alteración. Tal alteración del ácido nucleico se puede llevar a cabo de manera apropiada usando una técnica generalmente conocida por los expertos en la técnica, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis por PCR.

Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento normalmente se transportan (o se insertan en) vectores apropiados y se transfieren a las células anfitrionas. Los vectores no están particularmente limitados, siempre que los vectores puedan retener de manera estable los ácidos nucleicos insertados. Por ejemplo, cuando se utiliza la E. coli como anfitriona, se prefieren los vectores pBluescript (fabricados por Stratagene Corp.) o similares como vectores para la clonación. Se pueden usar diversos vectores disponibles comercialmente. En caso de usar los vectores con el fin de producir el polipéptido divulgado en este documento, son particularmente útiles los vectores de expresión. Los vectores de expresión no están particularmente limitados, siempre que los vectores permitan la expresión del polipéptido in vitro, en E. coli, en células cultivadas o en organismos individuales. Los vectores de expresión son preferiblemente, por ejemplo, vectores pBEST (fabricados por Promega K.K.) para la expresión in vitro, vectores pET (fabricados por Invitrogen Corp.) para E. coli, vectores pME18S-FL3 (número de acceso de GenBank AB009864) para células cultivadas y vectores pME18S (Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988))) para organismos individuales. La inserción de los ADN divulgados en este documento en los vectores se puede llevar a cabo mediante un método rutinario, por ejemplo, reacción de ligasa usando sitios de restricción (Current protocols in Molecular Biology, editado por Ausubel et al. (1987) Editorial: John Wiley & Sons. Sección 11.4-11.11).

Las células anfitrionas no están particularmente limitadas y se utilizan diversas células anfitrionas según la finalidad. Ejemplos de células para la expresión de polipéptidos pueden incluir células bacterianas (por ejemplo, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis), células de hongos (por ejemplo, levaduras y Aspergillus), células de insectos (por ejemplo, Drosophila S2 y Spodoptera SF9), células animales (por ejemplo, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293 y células de melanoma de Bowes) y células vegetales. La transferencia de los vectores a las células anfitrionas se puede llevar a cabo mediante un método conocido en la técnica; por ejemplo, un método de precipitación con fosfato de calcio, un método de electroporación (Current protocols in Molecular Biology, editado por Ausubel et al. (1987) Editorial: John Wiley & Sons. Sección 9.1-9.9), un método de lipofectamina (fabricado por GIBCO-BRL/Life Technologies, Inc.) o un método de microinyección.

Puede incorporarse una señal secretora apropiada en el polipéptido de interés para secretar el polipéptido expresado en las células anfitrionas a la luz del retículo endoplasmático, al espacio periplasmático o a un entorno extracelular. La señal puede ser endógena al polipéptido de interés o puede ser una señal extraña.

Cuando el polipéptido divulgado se secreta en un medio, la recuperación del polipéptido en el método de producción se lleva a cabo mediante la recuperación del medio. Cuando el polipéptido divulgado se produce en células, las células se lisan primero y luego se recupera el polipéptido.

Se puede utilizar un método conocido en la técnica que incluye precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina para recuperar y purificar el polipéptido aquí divulgado a partir de los cultivos de células recombinantes.

Ejemplos del método de producción divulgado incluyen: un método que implica cultivar por separado líneas celulares que producen respectivamente las homovariantes de los polipéptidos primero y segundo, y purificar los sobrenadantes del cultivo, seguido de la reacción FAE (intercambio de brazos Fab, por sus siglas en inglés) usando los anticuerpos purificados; un método que implica cultivar líneas celulares por separado produciendo respectivamente las homovariantes de los polipéptidos primero y segundo, mezclando los sobrenadantes del cultivo sin purificación y provocando la reacción FAE en el sobrenadante del cultivo mixto, seguido de purificación; un método que implica mezclar una línea celular que produce la homovariante de los primeros polipéptidos con una línea celular que produce la homovariante de los segundos polipéptidos, cultivar la mezcla y purificar el sobrenadante del cultivo, seguido de reacción FAE usando los anticuerpos purificados; y un método que implica mezclar una línea celular que produce la homovariante de los primeros polipéptidos con una línea celular que produce la homovariante de los segundos polipéptidos, cultivar la mezcla y provocar la reacción FAE en el sobrenadante del cultivo, seguido de purificación.

Se divulga un método para producir un heteromultímero, que comprende las siguientes etapas a) a c):

a) mezclar una línea celular que produce la homovariante de los primeros polipéptidos con una línea celular que produce la homovariante de los segundos polipéptidos;

b) incubar juntas la homovariante de los primeros polipéptidos y la homovariante de los segundos polipéptidos para permitir que las cisteínas en las regiones bisagra provoquen la isomerización del enlace disulfuro en el sobrenadante del cultivo; y

c) obtener un heteromultímero que comprende los polipéptidos primeros y segundos.

a) cultivar por separado líneas celulares que produzcan respectivamente las homovariantes de los polipéptidos primeros y segundos;

b) mezclar los sobrenadantes de cultivo respectivos de las líneas celulares e incubar conjuntamente la homovariante de los primeros polipéptidos y la homovariante de los segundos polipéptidos para permitir que las cisteínas en las regiones bisagra provoquen la isomerización del enlace disulfuro; y

Método para seleccionar el heteromultímero deseado

Se divulga además un método para seleccionar un heteromultímero deseado. Preferiblemente, el método es un método para seleccionar un heteromultímero que tiene las propiedades deseadas, que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar un primer conjunto de polipéptidos y un segundo conjunto de polipéptidos, teniendo cada polipéptido que constituye el primer conjunto una especificidad diana diferente de la de cada polipéptido que constituye el segundo conjunto, y conteniendo cada polipéptido que constituye los conjuntos primero y segundo la alteración de aminoácidos relacionada con el control de la interfaz usando repulsión de carga y/o la alteración de aminoácidos para desestabilizar la estabilidad de una región CH3;

b) incubar cada polipéptido que constituye el primer conjunto junto con cada polipéptido que constituye el segundo conjunto en condiciones reductoras, preparando así una mezcla de varios tipos de heteromultímeros;

c) ensayar la mezcla resultante de varios tipos de heteromultímeros en busca de las propiedades deseadas predeterminadas; y

d) seleccionar un heteromultímero que tenga las propiedades deseadas.

Composición farmacéutica

También se divulga en el presente documento una composición (fármaco) que comprende el heteromultímero y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Composición farmacéutica generalmente se refiere a un fármaco para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o para pruebas o diagnóstico.

La composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede formularse mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede utilizar en forma de inyección parenteral de una solución o suspensión aséptica con agua o cualquier otra solución farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede formular con el heteromultímero mezclado en una forma posológica unitaria requerida para la práctica farmacéutica generalmente aceptada, en combinación apropiada con vehículos o medios farmacológicamente aceptables, específicamente agua esterilizada, solución salina fisiológica, aceite vegetal, un emulsionante, un agente de suspensión, tensioactivo, estabilizador, aromatizante, excipiente, vehículo, conservante, aglutinante, etc. La cantidad de ingrediente activo en estas preparaciones se establece para dar un volumen apropiado dentro de un intervalo recomendado.

Se puede formular una composición aséptica para inyección según la práctica farmacéutica convencional usando un vehículo tal como agua destilada inyectable.

Ejemplos de soluciones acuosas para inyección incluyen solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que contienen glucosa y otros adyuvantes (por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio). Estas soluciones pueden usarse en combinación con un solubilizante apropiado, por ejemplo, un alcohol (etanol, etc.) o un polialcohol (propilenglicol, polietilenglicol, etc.), o un tensioactivo no iónico (polisorbato 80(TM), HCO-50, etc.).

Ejemplos de soluciones oleosas incluyen aceite de ajonjolí y aceite de soja. Estas soluciones se pueden usar en combinación con benzoato bencílico y/o alcohol bencílico como solubilizante. Las soluciones se pueden mezclar adicionalmente con un tampón (por ejemplo, una solución de tampón fosfato y una solución de tampón acetato de sodio), un agente emoliente (por ejemplo, clorhidrato de procaína), un estabilizador (por ejemplo, alcohol bencílico y fenol) y un antioxidante. Las soluciones de inyección así preparadas se cargan normalmente en ampollas apropiadas.

La composición farmacéutica se administra preferiblemente por vía parenteral. La composición puede estar en la forma posológica de, por ejemplo, una inyección, un agente de administración nasal, un agente de administración transpulmonar o un agente de administración percutánea. La composición farmacéutica se puede administrar sistémica o localmente mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal o inyección subcutánea.

El método de administración puede seleccionarse debidamente dependiendo de la edad y los síntomas del paciente. La dosis de una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo o un polinucleótido que codifica el anticuerpo se puede establecer dentro de un intervalo de, por ejemplo, 0,0001 a 1000 mg/kg de peso corporal por dosis. Alternativamente, la dosis puede ser, por ejemplo, de 0,001 a 100000 mg por paciente, aunque la presente divulgación no está necesariamente limitada por estos valores numéricos. Aunque la dosis y el método de administración varían dependiendo del peso, la edad, los síntomas, etc., de un paciente, los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente una dosis y un método de administración apropiados teniendo en cuenta su estado.

El heteromultímero divulgado en el presente documento es útil como ingrediente activo para un agente terapéutico o preventivo para el cáncer. Ejemplos de cáncer incluyen, sin limitación: cáncer de pulmón (incluido el cáncer microcítico de pulmón, el cáncer no microcítico de pulmón, el adenocarcinoma de pulmón y el carcinoma de células escamosas de pulmón), cáncer de intestino grueso, cáncer de recto, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de glándula tiroides, cáncer de las vías biliares, cáncer peritoneal, mesotelioma, cáncer de células escamosas, cáncer de cuello uterino, cáncer de cuerpo uterino, cáncer de vejiga, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer nasofaríngeo, tumor de las glándulas salivales, timoma, cáncer de piel, tumor de células basales, melanoma maligno, cáncer de ano, cáncer de pene, cáncer de testículo, tumor de Wilms, leucemia mieloide aguda (incluida mieloleucemia aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda y leucemia monocítica aguda), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (Linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crónica, micosis fungoide, linfoma de células de manto, linfoma folicular, linfoma difuso de células grandes, linfoma de zona marginal, leucemia de células pilosas, plasmocitoma, linfoma periférico de células T y leucemia/linfoma de células T en adultos), histiocitosis de células de Langerhans, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, tumor cerebral (que incluye glioma, astroglioma, glioblastoma, meningioma y ependimoma), neuroblastoma, retinoblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, angiosarcoma y hemangiopericitoma.

Si es necesario, el polipéptido o el heteromultímero se pueden convertir en preparaciones en combinación con otros ingredientes farmacéuticos.

También se proporciona un equipo para usar en el método de tratamiento o método de prevención divulgado en este documento, que comprende al menos un heteromultímero producido por el método de producción o la composición farmacéutica divulgados en este documento. En el equipo, por ejemplo, también pueden incluirse, además, un portador farmacéuticamente aceptable, un vehículo o una instrucción que indique el uso. También se proporciona el uso del polipéptido o de un polipéptido producido por el método de producción divulgado en este documento para producir un agente terapéutico o preventivo para enfermedades inmunológicas e inflamatorias. Se divulga además el polipéptido descrito en este documento o un polipéptido producido por el método de producción descrito en este documento para su uso en el método de tratamiento o el método de prevención de la presente divulgación.

Los códigos de tres letras de los aminoácidos utilizados en este documento y sus códigos de una letra correspondientes son los siguientes:

Alanina: Ala: A

Arginina: Arg: R

Asparagina: Asn: N

Ácido aspártico: Asp: D

Cisteína: Cys: C

Glutamina: Gln: Q

Ácido glutámico: Glu: E

Glicina: Gly: G

Histidina: Su: H

Isoleucina: Ile: I

Leucina: Leu: L

Lisina: Lys: K

Metionina: Met: M

Fenilalanina: Phe: F

Prolina: Pro: P

Serina: Ser: S

Treonina: Thr: T

Triptófano: Trp: W

Tirosina: Tyr: Y

Valina: Val: V

Ejemplos

[Ejemplo 1] Estudio sobre la mejora de la eficiencia del intercambio de brazos Fab mediante la introducción de una alteración del anticuerpo que controla la interfaz de asociación

En el intercambio de brazos Fab, se mezclan dos tipos de anticuerpos homoméricos en presencia de un agente reductor, y los cuatro pares de cadenas HL resultantes de las moléculas de anticuerpo (denominadas semimoléculas o moléculas HL, cada una de las cuales es una molécula compuesta de una cadena pesada y una cadena ligera) se reasocian intercambiándose para producir anticuerpos biespecíficos. Dado que la reasociación de las moléculas de HL se produce de forma aleatoria, el anticuerpo biespecífico de interés se obtiene teóricamente solo al 50% de la cantidad total de anticuerpos presentes en el sistema. Siempre que se introduzcan diferentes cargas de antemano en dos tipos de anticuerpos homoméricos, se supone que la heterodimerización puede ocurrir preferentemente sobre la homodimerización durante la reasociación de las moléculas de HL resultantes para preparar un anticuerpo biespecífico con alta eficacia. En consecuencia, para probar si puede mejorar o no la eficacia de la reacción del intercambio de brazos Fab (tasa de formación de anticuerpos biespecíficos) se utilizó la alteración para controlar la interfaz de asociación entre las regiones CH3 del anticuerpo (alteración para la promoción de la heteroasociación de dos tipos de cadenas H mediante el uso de la interacción de carga y la repulsión entre sus regiones CH3) documentada en WO2006/106905.

Las regiones variables de la cadena H del anticuerpo utilizadas fueron las regiones variables de la cadena H WT (H) (SEQ ID NO: 1; en lo sucesivo, denominada MrAh ) y H54 (SEQ ID NO: 2) del anticuerpo contra el receptor de interleucina 6 humana divulgado en WO2009/125825. Usando las regiones variables de la cadena H, se prepararon MRAH-Gld (SEQ ID NO: 3) y H54-G1d (SEQ ID NO: 4), que tienen una región constante de la cadena H de anticuerpo G1d derivada de una región constante de la cadena H de la IgG 1 humana mediante la eliminación de la Gly y la Lys C-terminales, y MRAH-wtG4d (SEQ ID NO: 5) y H54-wtG4d (SEQ ID NO: 6) que tienen una región constante de la cadena H del anticuerpo wtG4d derivada de una región constante de la cadena H de la IgG4 humana mediante la eliminación de la Gly y la Lys C-terminales. A continuación, se introdujeron alteraciones de P228S y K409R en MRAH-Gld y H54-G1d para preparar MRAH-Gldsr (SEQ ID NO: 7) y H54-G1dsr (SEQ ID NO: 8), que tienen una secuencia de bisagra de tipo IgG4 y una secuencia de dominio CH3. Se introdujo además D356K como alteración de control de la interfaz de asociación de MRAH-Gldsr para preparar MRAH-G1dsrP1 (SEQ ID NO: 9). Se introdujo además K439E como una alteración de control de la interfaz de asociación de H54-G1dsr para preparar H54-G1dsrN1 (SEQ ID NO: 10). Se introdujo además E356K como alteración de control de la interfaz de asociación de MRAH-wtG4d para preparar MRAH-wtG4dP1 (SEQ ID NO: 11). Se introdujo además K439E como una alteración de control de la interfaz de asociación de H54-wtG4d para preparar H54-wtG4dN1 (SEQ ID NO: 12). Se usaron cadenas L de anticuerpo MRAL-k0 (SEQ ID NO: 13) y L28-k0 (SEQ ID NO: 14) para las regiones variables de la cadena H MRAH y H54, respectivamente. Se expresaron y purificaron MRAH-Gldsr/MRAL-kO, H54-G1dsr/L28-k0, MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0, H54-G1dsrN1/L28-k0, MRAH-wtG4d/MRAL-k0, H54-wtG4d/L28-k0, MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0 y H54-wtG4dN1/L28-k0 según el método del Ejemplo de referencia 1.

A continuación, se mezclaron dos tipos de las homovariantes así obtenidas en las combinaciones que se dan a continuación, y los productos de reacción se evaluaron según el método del Ejemplo de referencia 2.

(1) MRAH-wtG4d/MRAL-k0 y H54-wtG4d/L28-k0

(2) MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0 y H54-wtG4dN1/L28-k0

(3) MRAH-G1dsr/MRAL-k0 y H54-G1dsr/L28-k0

(4) MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0 y H54-G1dsrN1/L28-k0

Condiciones de reacción: en PBS (Sigma-Aldrich Corp., pH 7,4), [cada mAb] = 0,2 mg/ml, [GSH (Sigma-Aldrich Corp.)] = 0,5 mM, Tween 20 al 0,05% (Junsei Chemical Co., Ltd.), 37°C, 24 horas.

Los dos tipos de regiones variables de anticuerpos MRAH/MRAL y H54/L28 usados en este estudio difieren en gran medida en pI. Por lo tanto, los picos correspondientes a sus respectivas homovariantes y los anticuerpos biespecíficos resultantes se pueden separar fácilmente mediante cromatografía de intercambio iónico, y se puede evaluar la eficacia de la reacción. La Figura 1 muestra los resultados de evaluar los productos de reacción mediante cromatografía de intercambio iónico. El producto de reacción wtG4d producido a partir de MRAH-wtG4d/MRAL-k0 y H54-wtG4d/L28-k0 y el producto de reacción Gldsr producido a partir de MRAH-G1dsr/MRAL-k0 y H54-G1dsr/L28-k0 que no contenían ninguna alteración de control de la interfaz de asociación tenían tasas de 50,5% y 52,7%, respectivamente, de formación de anticuerpos biespecíficos. Por el contrario, el producto de reacción wtG4dP1/N1 producido a partir de MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0 y H54-wtG4dN1/L28-k0 que contenían la alteración que controla la interfaz de asociación tuvo una tasa del 99,0% de formación de anticuerpos biespecíficos, y el producto de reacción G1dsrP1/N1 producido a partir de MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0 y H54-G1dsrN1/L28-k0 que contenían la alteración de control de la interfaz de asociación tenían una tasa del 98,5% de formación de anticuerpos biespecíficos. Por tanto, se encontró que el anticuerpo biespecífico se formaba con una eficacia sumamente alta. Estos resultados demostraron que el anticuerpo biespecífico se puede preparar con una eficacia sumamente alta mezclando dos tipos de homovariantes que llevan la alteración de control de la interfaz de asociación descrita en WO2006/106905 en presencia de un agente reductor.

[Ejemplo 2] Intercambio de brazos Fab en homovariante que tiene secuencia de bisagra de IgG1 humana de origen natural

En el Ejemplo 1, el intercambio de brazos Fab se realizó mediante la introducción de la alteración de P228S en IgG1 con el fin de obtener una región bisagra que tiene una secuencia de tipo IgG4 humana de origen natural. Sin embargo, se documenta que la IgG4 de origen natural administrada en un organismo vivo provoca un intercambio de media molécula con IgG4 endógena. Esto se debe a que la Ser está en la posición 228 de numeración de la UE en la región bisagra. Se ha documentado que la sustitución de este aminoácido por Pro de tipo IgG1 mejora la estabilidad y previene el intercambio in vivo (Labrijn AF et al., Nat. Biotechnol. 2009, 27, 767-771). Por tanto, considerando la administración en un organismo vivo, la secuencia de bisagra del anticuerpo biespecífico preparado es idealmente 226C-227P-228P-229C. En consecuencia, este estudio se llevó a cabo para evaluar si se causa o no de manera eficiente el intercambio de brazos Fab mediante la introducción de una alteración que controla la interfaz de asociación, incluso utilizando la secuencia de bisagra de la IgG1 humana natural.

En primer lugar, se introdujeron K409R y D356K en MRAH-Gld para preparar MRAH-G1drP1 (SEQ ID NO: 15), y se introdujeron K409R y K439e en H54-G1d para preparar H54-G1drN1 (SEQ ID NO: 16). Para las regiones variables de la cadena H MRAh y H54, respectivamente, se utilizaron las cadenas L de anticuerpos MRAL-k0 y L28-k0. Se expresaron y purificaron MRAH-GldrPl/MRAL-kO y H54-G1drN1/L28-k0 según el método del Ejemplo de referencia 1. A continuación, se mezclaron dos tipos de homovariantes así obtenidas en las condiciones de reacción que se indican a continuación, y los productos de reacción se evaluaron según el método del Ejemplo de referencia 2.

Condiciones de reacción: en TBS (Takara Bio Inc., pH 7,6), [cada mAb] = 0,2 mg/ml, Tween 20 al 0,05% (Junsei Chemical Co., Ltd.), 37°C, 24 horas. El estudio se realizó en 3 condiciones de un agente reductor [GSH (Sigma-Aldrich Corp.)] = 0,5 mM o 5 mM o [2-MEA (Sigma-Aldrich Corp.)] = 25 mM.

La Figura 2 muestra los resultados del análisis de los productos de reacción según el método del Ejemplo de referencia 2. La tasa de formación de anticuerpos biespecíficos en las mismas condiciones que en el Ejemplo 1 (GSH = 0,5 mM) fue del 21,8%, que se redujo drásticamente en comparación con el eficiencia del caso en el que el residuo de aminoácido en la posición 228 de numeración de la UE era Ser. Por el contrario, la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos bajo la condición reductora de 2-MEA (25 mM) o GSH (5 mM) fue del 99% o más. Estos resultados demostraron que el anticuerpo biespecífico se puede preparar con alta eficacia introduciendo una alteración de control de la interfaz de asociación y usando una condición reductora apropiada aunque la secuencia de bisagra sea la secuencia de IgG1 humana de origen natural.

[Ejemplo 3] Intercambio de brazos Fab utilizando CH3 de IgG1 humana de origen natural

Los estudios anteriores demostraron que el anticuerpo biespecífico de interés se obtiene con una eficacia sumamente alta mediante el intercambio de brazos Fab a través de la introducción de la alteración de K409R (que da CH3 de tipo IgG4) a la IgG1 humana y la alteración de control de la interfaz de asociación (D356K y K439E).

Por otro lado, es sabido que si un residuo de aminoácido en la posición 409 es Arg, la estabilidad del anticuerpo se reduce en condiciones ácidas (WO/2009/041613). La producción de fármacos de anticuerpos requiere inevitablemente una etapa de inactivación del virus para exponer el anticuerpo en condición ácida. A este respecto, la estabilidad del anticuerpo en condiciones ácidas es idealmente alta para mantener la calidad del anticuerpo. Por consiguiente, es deseable que el residuo de aminoácido en la posición 409 no sea Arg. Por otro lado, se usó la alteración K409R como alteración que, según se documentó, podía causar de manera eficiente la reacción de intercambio de brazos Fab. En este caso, el residuo de aminoácido en la posición 409 es Arg, lo que probablemente conduce al problema de estabilidad en condiciones ácidas. En consecuencia, este estudio se realizó para evaluar si se induce o no el intercambio de brazos Fab introduciendo solo la alteración de control de la interfaz de asociación documentada en WO2006/106905 a un anticuerpo IgG1 humano completamente natural sin introducir la alteración de K409R.

En la Tabla 1 se muestran las combinaciones de alteraciones de control de la interfaz de asociación estudiadas.

[Tabla 1]

Para las regiones variables de la cadena H MRAH y H54, respectivamente, se utilizaron Las cadenas L de anticuerpos MRAL-k0 y L28-k0. Se expresaron y purificaron MRAH-GldPl/MRAL-kO, H54-G1dN1/L28-k0, MRAH-G1dP3/MRAL-k0, H54-G1dN3/L28-k0, MRAH-G1 dP4/MRAL-k0, H54-G1dN4/L28-k0, MRAH-G1dP5/MRAL-k0, H54-G1dN5/L28-k0, MRAH-G1dP6/MRAL-k0 y H54-G1dN6/L28-k0 según el método del Ejemplo de referencia 1.

A continuación, se mezclaron dos tipos de homovariantes así obtenidas en las combinaciones que se dan a continuación, y los productos de reacción se evaluaron según el método del Ejemplo de referencia 2.

(1) MRAH-G1dP1/MRAL-k0 y H54-G1dN1/L28-k0

(2) MRAH-G 1 dP3/MRAL-k0 y H54-G1dN3/L28-k0

(3) MRAH-G 1 dP4/MRAL-k0 y H54-G1dN4/L28-k0

(4) MRAH-G 1 dP5/MRAL-k0 y H54-G1dN5/L28-k0

(5) MRAH-G 1 dP6/MRAL-k0 y H54-G1dN6/L28-k0

Condición de reacción: en TBS (Takara Bio Inc., pH 7,6), [cada mAb] = 0,2 mg/ml, Tween 20 al 0,05% (Junsei Chemical Co., Ltd.), [GSH (Sigma-Aldrich Corp.)] = 5 mM, 37°C, 24 horas.

En la Tabla 2 se muestran Los resultados obtenidos.

[Tabla 2]

En la tabla, “Abreviatura” indica la abreviatura de la combinación de homovariante usada en la reacción. Por ejemplo, la abreviatura G1dP1/N1 representa que reaccionaron MRAH-G1dP1/MRAL-k0 y H54-G1dN1/L28-k0. “Nombre de la región constante de la cadena H de MoAb1 usada” indica el nombre de la región constante del anticuerpo que tiene la región variable MRAH. “Nombre de la región constante de la cadena H de MoAb2 usada” denota el nombre de la región constante del anticuerpo que tiene la región variable H54. “Alteración introducida” denota la alteración introducida en MRAH-G1d o H54-G1d.

G1dP1/N1 con D356K introducido en una homovariante y K439E introducido en otra homovariante tenían una tasa del 1,7% de formación de anticuerpos biespecíficos. En la Figura 2, G1drP1/N1 con alteración de K409R y alteración de control de interfaz de asociación (D356K y K439E) tuvo una tasa del 99,3% de formación de anticuerpos biespecíficos en las mismas condiciones de reacción (GSH 5 mM), lo que muestra que la eficiencia de la reacción se redujo drásticamente en G1dP1/N1, que contenía, en vez de ello, Lys como residuo de aminoácido en la posición de numeración 409 de la UE. Por el contrario, G1dP3/N3 con la alteración de control de la interfaz de asociación D399K introducido en una homovariante y K409D introducido en otra homovariante, y G1dP5/N5 con D356K/D399K introducido en una homovariante y K409D/K439E introducido en otra homovariante exhibieron una tasa de formación de anticuerpos biespecíficos de hasta 93,4% y 98,1%, respectivamente. Estos resultados demostraron que el intercambio de brazos de Fab puede inducirse con alta eficacia introduciendo solo la alteración de control de la interfaz de asociación sin el uso de la alteración de K409R, que da un dominio CH3 de tipo IgG4.

A continuación, se comparó la eficacia de la reacción en 3 tipos de condiciones reductoras en cuanto a que G1dP3/N3 y G1dP5/N5 tengan una alta eficacia de reacción. En esta comparación, G1drP1/N1 usado en el Ejemplo 2 y una forma alterada que tiene la combinación de K409R introducida en un anticuerpo y F405L introducido en otra homovariante como documentaron Labrijn et al., ya que también se probaron como controles las alteraciones para la preparación eficaz de anticuerpos biespecíficos mediante intercambio de brazos Fab (Labrijn AF et al., Proc. Natl., Acad. Sci., 2013. 110. 5145-5150).

Se introdujo K409R en MRAH-Gld para preparar MRAH-Gldr (SEQ ID NO: 27), y F405L se introdujo en H54-G1d para preparar H54-G1dl (SEQ ID NO: 28). Las cadenas L de anticuerpos MRAL-k0 y L28-k0 se utilizaron para las regiones variables de la cadena H MRAH y H54, respectivamente. Se expresaron y purificaron MRAH-GldrPl/MRAL-kO, H54-G1drN1/L28-k0, MRAH-G1 dP3/MRAL-k0, H54-G1dN3/L28-k0, MRAH-G1 dP5/MRAL-k0, H54-G1dN5/L28-k0, MRAH-G1dr/MRAL-k0 y H54-G1dl/L28-k0 según el método del Ejemplo de referencia 1.

(1) MRAH-GldrPl/MRAL-kO y H54-G1drN1/L28-k0

(2) MRAH-G 1 dP3/MRAL-k0 y H54-G1dN3/L28-k0

(3) MRAH-G 1 dP5/MRAL-k0 y H54-G1dN5/L28-k0

(4) MRAH-G1dr/MRAL-k0 y H54-G1dl/L28-k0

En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos.

[Tabla 3]

En la tabla, “Abreviatura” indica la abreviatura de la combinación de homovariante usada en la reacción. Por ejemplo, la abreviatura G1dP1/N1 representa que reaccionaron MRAH-G1dP1/MRAL-k0 y H54-G1dN1/L28-k0. “Nombre de la región constante de la cadena H de MoAb1 usada” indica el nombre de la región constante del anticuerpo que tiene la región variable MRAH. “Nombre de la región constante de la cadena H de MoAb2 usada” denota el nombre de la región constante del anticuerpo que tiene la variable región H54. “Alteración introducida” denota la alteración introducida en MRAH-G1d o H54-G1d.

El G1dr/l que contenía la alteración existente para mejorar la eficiencia del intercambio de brazos Fab según lo documentado por Labrijn et al. tenía una tasa del 87,3% de formación de anticuerpos biespecíficos en la condición reductora de GSH 5 mM. En esta condición, G1dP3/N3 con D399K introducido en una homovariante y K409D introducido en otra homovariante tuvo una tasa de formación de anticuerpos biespecíficos del 85,2%, y G1dP5/N5 con D356K/D399K introducido en una homovariante y K409D/K439E introducido en otra homovariante tuvo una tasa del 99,1% de formación de anticuerpos biespecíficos. Además, G1drP1/N1 que tenía D356K en una homovariante y K439E en otra homovariante además de la alteración K409R de tipo IgG4 tuvo una tasa de formación de anticuerpos biespecíficos del 99,3%.

El G1dr/l que contenía la alteración existente para mejorar la eficiencia del intercambio de brazos Fab según lo documentado por Labrijn et al. tenía una tasa del 95,6% de formación de anticuerpos biespecíficos en la condición reductora de 2MEA 25 mM. En esta condición, G1dP3/N3 con D399K introducido en una homovariante y K409D introducido en otra homovariante tuvo una tasa del 92,8% de formación de anticuerpos biespecíficos, y G1dP5/N5 con D356K/D399K introducido en una homovariante y K409D/K439E introducido en otra homovariante tuvo una tasa del 100% de formación de anticuerpos biespecíficos. Además, G1drP1/N1 que tenía D356K en una homovariante y K439E en otra homovariante además de la alteración K409R de tipo IgG4 tuvo una tasa de formación de anticuerpos biespecíficos del 99,7%.

El G1dr/l que contenía la alteración existente para mejorar la eficiencia de intercambio de brazos Fab tenía una tasa de formación de anticuerpos biespecíficos del 9,5% en la condición reductora de GSH 0,5 mM. En esta condición, G1dP3/N3 con D399K introducido en una homovariante y K409D introducido en otra homovariante tuvo una tasa del 4,8% de formación de anticuerpos biespecíficos, y G1dP5/N5 con D356K/D399K introducido en una homovariante y K409D/K439E introducido en otra homovariante tuvo una tasa del 75,4% de formación de anticuerpos biespecíficos. Además, G1drP1/N1 que tenía D356K en una homovariante y K439E en otra homovariante además de la alteración K409R de tipo IgG4 tuvo una tasa de formación de anticuerpos biespecíficos del 21,8%. Esta condición reductora redujo drásticamente la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos en todas las muestras en comparación con las otras condiciones reductoras.

Estos resultados demostraron que G1dP5/N5 con D356K/D399K introducido en una homovariante y K409D/K439E introducido en otra homovariante exhibe una mayor tasa de formación de anticuerpos biespecíficos en todas las condiciones de reacción en comparación con la alteración existente para mejorar la eficiencia del intercambio de brazos Fab según lo documentado por Labrijn et al. La alta tasa de formación de anticuerpos biespecíficos es muy importante para la producción real de anticuerpos biespecíficos como fármacos. Por tanto, esta alteración se considera de gran utilidad en comparación con la alteración existente.

[Ejemplo 4] Desarrollo de intercambio de brazos Fab altamente eficiente utilizando una alteración para la desestabilización del dominio CH3

Los ejemplos anteriores demostraron que siempre que se introduzcan cargas diferentes en dos tipos de homovariantes por alteración de control de la interfaz de asociación, media molécula formada a partir de una homovariante en presencia de un agente reductor se asocia preferentemente con una media molécula derivada de la otra homovariante para formar un anticuerpo biespecífico con alta eficacia. Mientras tanto, en el proceso de formación de anticuerpos biespecíficos mediante el intercambio de brazos Fab, la disociación de los dominios CH3 que forman semimoléculas (moléculas HL) después de la escisión de dos tipos de homovariantes con un agente reductor, según se informa, se convierte en una etapa determinante de la tasa (Rispens T et al., J. Am. Chem. Soc., 2011. 133. 10302-10311). En resumen, si la disociación de los dominios CH3 puede promoverse mediante la desestabilización moderada de los dominios CH3 de cada homovariante, cabe esperar que el intercambio de brazos Fab se induzca de manera más eficiente. En consecuencia, la relación entre la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos y la estabilidad de los dominios CH3 de cada homovariante se evaluó primero en presencia de GSH 5 mM, que se muestra en las Tablas 2 y 3. La estabilidad de los dominios CH3 se determinó con una Tm (temperatura intermedia de desnaturalización térmica) medida según el método del Ejemplo de referencia 3 como índice.

La Figura 3 muestra la relación entre la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos y el valor de Tm superior de CH3 en dos tipos de homovariantes utilizadas. G1dP1/N1 o G1dP4/N4 que tienen una tasa baja de formación de anticuerpos biespecíficos tenían una Tm de CH3 de hasta 76°C o superior, mientras que G1dP5/N5, G1dP3/N3 y G1drP1/N1 que tenían una alta eficiencia de reacción tenían una Tm de la homovariante CH3 de 65,1°C, 69,6°C y 69,5°C, respectivamente. Estos resultados revelaron que la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos se correlaciona evidentemente con la estabilidad de CH3 de cada homovariante en el intercambio de brazos Fab. Para lograr una alta eficiencia de reacción, también se encontró preferible desestabilizar la estabilidad de las regiones de CH3 de una homovariante que tenga una CH3 más estable entre dos tipos de homovariantes utilizadas de manera que la Tm de esta CH3 se encuentre por debajo de 70°C, etc. En el contexto, la Tm de las regiones CH3 (que tienen la secuencia de IgG1 humana natural) de MRAH-G1d/MRAL-k0 medida en las mismas condiciones que antes era 83,6°C, lo que demuestra que para lograr una alta eficiencia de reacción en el intercambio de brazos Fab se requiere desestabilizar la estabilidad de las regiones CH3 para disminuir la Tm de las regiones CH3 en, por ejemplo, 13°C o más con respecto a la de la IgG1 humana de origen natural.

Por lo tanto, este estudio se realizó para evaluar si se mejora o no la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos disminuyendo la Tm de los dominios CH3 de las homovariantes utilizadas. Se utilizó la alteración V397M de tipo IgG2 como alteración para reducir la estabilidad de la CH3. La IgG2 contiene Met como residuo de aminoácido en la posición de numeración de la UE 397. Está documentado que la introducción de la alteración para sustituir este aminoácido por Val de tipo IgG1 mejora la estabilidad (Tm) de las regiones CH3 (WO2009/041613). Por tanto, cabía esperar que la introducción de la alteración de V397M a los dominios CH3 de tipo IgG1 desestabilizaría los dominios CH3 y facilitaría su disociación.

Por lo tanto, la alteración V397M se introdujo en ambas homovariantes de G1dP1/N1, G1dP4/N4 o G1dP6/N6 que tienen una tasa baja de formación de anticuerpos biespecíficos en la Tabla 2, y se estudiaron los G1dP8/N8, G1dP9/N9 y G1dP10/N10 resultantes. Específicamente, V397M se introdujo en MRAH-G1dP1, MRAH-G1dP4, MRAH-G1dP6, H54-G1dN1, H54-G1dN4 y H54-G1dN6 para preparar MRAH-G1dP8 (SEQ ID NO: 29), MRAH-G1dP9 (SEQ ID NO: 30), MRAH-G1dP10 (SEQ ID NO: 31), H54-G1dN8 (SEQ ID NO: 32), H54-G1dN9 (SEQ ID NO: 33) y H54-G1dN10. (SEQ ID NO: 34). Las cadenas L de anticuerpos MRAL-k0 y L28-k0 se utilizaron para las regiones variables de la cadena H MRAH y H54. Se expresaron y purificaron MRAH-G1dP8/MRAL-k0, H54-G1dN8/L28-k0, MRAH-G1dP9/MRAL-k0, H54-G1dN9/L28-k0, MRAH-G1dP10/MRAL-k0 y H54-G1dN10/L28-k0 según el método del Ejemplo de referencia 1. La Tm de los anticuerpos obtenidos se midió según el método del Ejemplo de referencia 3.

(1) M RAH-G1 dP8/M RAL-k0 y H54-G 1dN8/L28-k0

(2) MRAH-G 1 dP9/MRAL-k0 y H54-G1dN9/L28-k0

(3) MRAH-G1dP10/M RAL-k0 y H54-G1dN10/L28-k0

(4) MRAH-G1dr/MRAL-k0 y H54-G1dl/L28-k0

Condiciones de reacción: en TBS (Takara Bio Inc., pH 7,6), [cada mAb] = 0,2 mg/ml, Tween 20 al 0,05% (Junsei Chemical Co., Ltd.), [GSH (Sigma-Aldrich Corp.)] = 5 mM, 37°C, 24 horas.

En la Tabla 4 se muestran los resultados obtenidos.

[Tabla 4]

En la tabla, “Tm de CH3 de MoAb1” indica la Tm de CH3 de la homovariante que tiene la región variable MRAH. “Tm de CH3 de MoAb2” indica la Tm de CH3 de la homovariante que tiene la región variable H54.

En G1dP8/N8 con la alteración V397M introducida en ambas homovariantes de G1dP1/N1, la Tm de CH3 se redujo en 6,6°C hasta 70,1°C para MoAb1 y disminuyó en 4,2°C hasta 70,5°C para MoAb2, y la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos mejoró del 1,7% al 73,2%. En G1dP9/N9 con la alteración de V397M introducida en ambas homovariantes de G1dP4/N4, la Tm de CH3 se redujo en 1,5°C hasta 67°C para MoAb1 y disminuyó en 5,5°C hasta 71°C para MoAb2, y la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos mejoró del 4,4% al 67,3%. En G1dP10/N10 con la alteración de V397M introducida en ambas homovariantes de G1dP6/N6, la Tm de CH3 se redujo en 2,2°C hasta 63,8°C para MoAb1, aunque sin cambios en la Tm de MoAb2 CH3, y la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos mejoró del 29,3% al 96,9%. Estos resultados demostraron que la eficiencia de formación de anticuerpos biespecíficos en el intercambio de brazos Fab se mejora disminuyendo la Tm de la homovariante CH3 a través de la alteración de V397M. En esta prueba, el G1dr/l que lleva la alteración existente para mejorar la eficiencia de intercambio de brazos Fab tuvo una tasa de formación de anticuerpos biespecíficos del 88,1%. Por tanto, se encontró que G1dP10/N10 era superior al mismo en la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos.

Por lo tanto, este estudio se realizó para evaluar si se mejora o no la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos mediante la introducción de la alteración que se espera produzca un mayor efecto desestabilizador de CH3 en la vecindad de la posición de numeración 397 de la UE efectiva. La Figura 4 muestra la posición de numeración 397 de la UE de los dominios CH3 y sus inmediaciones utilizando los datos estructurales cristalográficos de rayos X informados (PDB: 3DO3) en IgG1.

En primer lugar, se considera que D399 en la cadena A interactúa electrostáticamente con K392 en la cadena B. Por lo tanto, es posible que la sustitución de K392 por Asp o Glu además de la alteración de V397M, pueda causar que la repulsión electrostática entre estas cadenas desestabilice aún más la interacción entre las cadenas. También cabe esperar que la sustitución de K392 por un aminoácido que tenga una cadena lateral ramificada pueda desestabilizar aún más la asociación entre estas cadenas a través de un impedimento estérico con M397. Además, también se esperaba la posibilidad de que la sustitución del residuo de aminoácido en la posición de numeración UE 397 por un aminoácido más voluminoso pudiera suprimir la asociación CH3-CH3 más que la alteración de V397M. Desde estos puntos de vista, se prepararon 7 tipos de genes de la cadena H del anticuerpo que se muestran en la Tabla 5 sobre la base de MRAH-G1dP1 y H54-G1dN1.

[Tabla 5]

Las cadenas L de anticuerpos MRAL-k0 y L28-k0 se utilizaron para las regiones variables de la cadena H MRAH y H54, respectivamente. Se expresaron y purificaron MRAH-G1dP14/MRAL-k0, H54-G1dN14/L28-k0, MRAH-G1dP15/MRAL-k0, H54-G1dN15/L28-k0, MRAH-G1dP16/MRAL-k0, H54-G1dN16/L28-k0, MRAH-G1dP17/MRAL-k0, H54-G1dN17/L28-k0, MRAH-G 1dP18/MRAL-k0, H54-G1dN18/L28-k0, MRAH-G 1dP19/MRAL-k0, H54-G1dN19/L28-k0, MRAH-G1d20/MRAL-k0 y H54-G1dN20/L28-k0 según el método del Ejemplo de referencia 1. La Tm de los anticuerpos obtenidos se midió según el método del Ejemplo de referencia 3.

(1) MRAH-G1dP14/M RAL-k0 y H54-G1dN14/L28-k0

(2) MRAH-G1dP15/M RAL-k0 y H54-G1dN15/L28-k0

(3) MRAH-G1dP16/M RAL-k0 y H54-G1dN16/L28-k0

(4) MRAH-G1dP17/M RAL-k0 y H54-G1dN17/L28-k0

(5) MRAH-G1dP18/M RAL-k0 y H54-G1dN18/L28-k0

(6) MRAH-G1dP19/M RAL-k0 y H54-G1dN19/L28-k0

(7) MRAH-G 1 dP20/MRAL-k0 y H54-G1dN20/L28-k0

(8) MRAH-G1dr/MRAL-k0 y H54-G1d1/L28-k0

(9) MRAH-GldPl/MRAL-kO y H54-G1dN1/L28-k0

(10) MRAH-G 1 dP8/MRAL-k0 y H54-G1dN8/L28-k0

Condiciones de reacción: en TBS (Takara Bio Inc., pH 7,6), [cada mAb] = 0,2 mg/ml, Tween 20 al 0,05% (Junsei Chemical Co., Ltd.), [2-MEA (Sigma-Aldrich Corp.) ] = 25 mM, 37°C, 24 horas.

En la Tabla 6 se muestran los resultados obtenidos.

[Tabla 6]

G1dP8/N8 con la alteración de V397M introducida en ambas homovariantes de G1dP1/N1 tuvo una tasa del 73,2% de formación de anticuerpos biespecíficos. Por el contrario, la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos mejoró en gran medida hasta 96,5% para G1dP14/N14 con K392D introducido en ambas cadenas de los mismos, 96,9% para G1dP15/N15 con K392E introducido y 98,9% para G1dP18/N18 con K392T introducido. Además, la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos mejoró hasta el 96,5% para G1dP16/N16 con V397F introducido en lugar de V397M a G1dP1/N1 y hasta el 98% para G1dP17/N17 con V397y introducida, en comparación con V397M. Esto probablemente se deba a que, como se ve por el hecho de que los dominios CH3 de MoAb1 y MoAb2 en G1dP8/N8 que contienen V397M tenían una Tm de 70,1°C y 70,5°C, respectivamente, mientras que la Tm de los dominios CH3 de MoAb1 y MoAb2 era 69,1°C y 69,7°C para G1dP16/N16 y 69,2°C y 69,8°C para G1dP17/N17, estas alteraciones en comparación con la alteración V397M debilitaron la interacción entre los dominios CH3 de cada homovariante y facilitaron su disociación como se pretendía. En esta prueba, el G1dr/l que contenía la alteración existente para mejorar la eficiencia de intercambio de brazos Fab tuvo una tasa del 91,7% de formación de anticuerpos biespecíficos. Por tanto, se encontró que G1dP14/N14, G1dP15/N15, G1dP16/N16, G1dP17/N17 y G1dP18/N18 eran superiores al mismo en la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos.

En consideración de la aplicabilidad a la producción de fármacos, G1dP16/N16 (D356K/V397F y V397F/K439E) y G1dP17/N17 (D356K/V397Y y V397Y/k439E) son muy útiles debido a sus tasas más altas de formación de anticuerpos biespecíficos y a menores cantidades de componentes heterogéneos en comparación con la alteración existente para mejorar la eficiencia del intercambio de brazos Fab.

La Figura 5 muestra la relación entre la estabilidad del CH3 de las formas alteradas estudiadas en las Tablas 3 y 6 y la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos usando 2MEA 25 mM como agente reductor. Como se muestra en la Figura 5, la estabilidad de CH3 de cada homovariante utilizada se correlaciona evidentemente con la eficiencia de intercambio de brazos Fab. La alta tasa de formación de anticuerpos biespecíficos se logra desestabilizando la estabilidad de las regiones CH3 de una homovariante que tiene un CH3 más estable entre dos tipos de homovariantes utilizadas de manera que la Tm de este CH3 se encuentre por debajo de 70°C, etc.

[Ejemplo 5] Estudio sobre el tiempo de reacción

La relación entre el tiempo de reacción y la eficacia de la reacción se estudió utilizando el G1dP17/N17 encontrado en el Ejemplo 4.

Condiciones de reacción: en TBS (Takara Bio Inc., pH 7,6), [cada mAb] = 1,0 mg/ml, [2-MEA (Sigma-Aldrich Corp.)] = 25 mM, 37°C, cantidad total = 50 pl.

Después de 90 minutos, 3 horas o 24 horas, se añadieron 450 pl de una solución tampón MES 25 mM (pH 5,0) enfriada a 4°C a la solución de reacción, que se almacenó además a 4°C para terminar la reacción. Luego, se evaluó la eficiencia de la reacción según el método del Ejemplo de referencia 2 (Figura 6).

Como se muestra en la Figura 6, la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos de G1dP17/N17 fue del 94,6% en 90 minutos, del 95,2% en 3 horas y del 97,4% en 24 horas en presencia de 2-MEA 25 mM. Por tanto, el tiempo de reacción de 90 minutos ofreció una tasa de aproximadamente el 95%. Estos resultados demostraron que esta forma alterada exhibe una eficacia de reacción suficientemente mayor que la velocidad de formación de anticuerpos biespecíficos (Tabla 6) de G1dr/l con la alteración de K409R introducida en una cadena y la alteración de F405L introducida en otra cadena.

[Ejemplo 6] Evaluación de la unión de la forma alterada que exhibe un intercambio de brazos Fab altamente eficiente al FcgR humano y al FcRn humano

Se evaluó la forma alterada G1dP17/N17 que exhibió una eficiencia de FAE altamente eficiente en el Ejemplo 4 para determinar su unión a FcgR humano y FcRn humano. Primero, se evaluaron MRAH-Gld/MRAL-kO que tiene la secuencia de IgG1 natural y la forma alterada MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0 después del intercambio de brazos Fab para determinar su unión al FcRn humano según el método del Ejemplo de referencia 5. Los resultados del análisis de la unión al FcRn humano se muestran en la Tabla 7.

[Tabla 7]

Los resultados mostrados en la Tabla 7 demostraron que la forma alterada MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0 preparada por intercambio de brazos Fab tiene una actividad de unión al FcRn humano equivalente a la de la IgG1 de origen natural.

A continuación, se evaluó la actividad de unión contra el FcgR humano según el método del Ejemplo de referencia 4. En este contexto, teniendo MRAH-Gld/MRAL-kO la secuencia de la IgG1 de origen natural, se evaluaron conjuntamente la forma alterada MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0 después del intercambio de brazos Fab, dos tipos de homovariantes antes de la reacción de intercambio de brazos Fab (MRAH-G1dP17/MRAL-k0 y H54-G1dN17/L28-k0) y dos tipos de homovariantes que carecen de la alteración V397Y para desestabilizar los dominios CH3 (MRAH-G1dP1/MRAL-k0 y H54-G1dN1/L28-k0). En la Tabla 8, pliegue KD hFcgRIa, pliegue KD hFcgRIIaR, pliegue KD hFcgRIIaH, pliegue KD hFcgRIIb y pliegue KD hFcgRIIIaV son valores que indican la actividad de unión relativa de cada forma alterada cuando KD de G1d para cada FcgR se define como 1.

[Tabla 8]

La unión de la forma alterada G1dP17/N17 después del intercambio de brazos Fab en comparación con el anticuerpo natural se incrementó 1,1 veces para hFcgRIa, 2,7 veces para hFcgRIIaR, 2,3 veces para hFcgRIIaH, 2,5 veces para hFcgRIIb y 2,5 veces para hFcgRIIIaV. En este contexto, las homovariantes G1dP1 y G1dN1 antes de la introducción de la V397Y desestabilizadora del dominio CH3 se unieron a cada FcgR con una actividad equivalente a la del anticuerpo natural. Además, las homovariantes derivadas de las mismas mediante la introducción de V397Y (G1dP17 y G1dN17) mostraron una unión mejorada a cada FcgR. Por lo tanto, se encontró que la alteración V397Y potenciaba la unión a hFcgR.

Estos resultados demostraron que el G1dP17/N17 que logra una alta eficiencia de intercambio de brazos Fab no altera la unión al FcRn humano ni al FcgR humano en comparación con el anticuerpo natural.

[Ejemplo 7] Estudio sobre intercambio de brazos Fab en sobrenadante de cultivo

Para la producción de anticuerpos biespecíficos mediante intercambio de brazos Fab, se parte de la premisa de que se cultivan y purifican por separado dos tipos de homovariantes, seguido por el intercambio de brazos Fab. Si la reacción puede ocurrir en un sobrenadante de cultivo, se puede omitir la etapa de purificación de la homovariante. Por tanto, este planteamiento es muy ventajoso. Por consiguiente, este estudio se llevó a cabo para evaluar si se provoca o no el intercambio de brazos Fab con alta eficiencia mezclando dos tipos de homovariantes con un agente reductor en un sobrenadante de cultivo.

En primer lugar, un residuo de aminoácido en la posición 356 en MRAH-Gld y H54-G1d se sustituyó por E, y un residuo de aminoácido en la posición 358 del mismo se sustituyó por M para preparar MRAH-G1m (SEQ ID NO: 49), H54-G1 m (SEQ ID NO: 50), respectivamente. A continuación, se introdujeron E356K y K409R en MRAH-Glm para preparar MRAH-G1mrP1 (SEQ ID NO: 51). Se introdujeron K439E y K409R en H54-G1m para preparar H54-G1mrN1 (SEQ ID NO: 52). Las cadenas L de anticuerpos MRAL-k0 y L28-k0 se utilizaron para las regiones variables de la cadena H MRAH y H54, respectivamente. Se expresaron y purificaron MRAH-GlmrPl/MRAL-kO y H54-G1 mrN1/L28-k0 según el método del Ejemplo de referencia 1.

Se cultivaron células FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) en medio de expresión FreeStyle 293 y luego se centrifugaron para recuperar un sobrenadante, que luego se filtró a través de una membrana de filtración de 0,22 pm y se usó como Mock CM en el intercambio de brazos Fab.

Condiciones de reacción: en Mock CM (pH 7,6), [cada mAb] = 1,0 mg/ml, [2-MEA (Sigma-Aldrich Corp.)] = 25 mM, 37°C, 90 minutos.

Después de la reacción, se añadió rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Japan Corp.) a la solución de reacción para su purificación. Luego, se evaluó la eficacia de la reacción según el método del Ejemplo de referencia 2 (Figura 7).

Como se muestra en la Figura 7, se demostró que el anticuerpo biespecífico se formó con una eficacia de reacción del 98% o superior a través de la reacción a 37°C durante 90 minutos en presencia de 2-MEA 25 mM incluso en el sobrenadante del cultivo.

[Ejemplo 8] Desarrollo del intercambio de brazos Fab en la IgG1 de ratón

Los ejemplos anteriores mostraron que el intercambio de brazos Fab se induce eficazmente en IgG1 humana o IgG4 humana. Este estudio se realizó para evaluar si se forma o no de manera similar un anticuerpo biespecífico mediante intercambio de brazos Fab en la IgG1 de ratón.

Por la estructura cristalográfica documentada (Harris LJ et al., J. Mol. Biol., 1998. 275. 861 -872), se suponía que D en la posición de numeración de la UE 399 y K en la posición de numeración de la UE 409 contribuían a la interacción entre cadenas entre los dominios CH3 (Figura 8). En consecuencia, este estudio se llevó a cabo para evaluar si se induce o no el intercambio de brazos Fab mediante la introducción de cargas para promover la heterodimerización en estos sitios, como en la IgG1 humana.

Las regiones variables de la cadena H del anticuerpo utilizadas fueron las regiones variables de la cadena H WT (H) (SEQ ID NO: 1; en lo sucesivo, denominada MrAh ) y H54 (SEQ ID NO: 2) del anticuerpo contra el receptor de interleucina 6 humana divulgado en WO2009/125825. Se prepararon MRAH-mIgG1 (SEQ ID NO: 53) y H54-mIgG1 (SEQ ID NO: 54) que tenían una región constante de la cadena H de la IgG1 de ratón como región constante de la cadena H del anticuerpo usando las regiones variables de la cadena H. Además, se introdujo D399K como alteración de control de interfaz de asociación a MRAH-mIgG1 para preparar MRAH-mIgG1mP3 (SEQ ID NO: 55). Se introdujo D399R como alteración de control de la interfaz de asociación a MRAH-mIgG1 para preparar MRAH-mIgG1mP4 (SEQ ID NO: 56). Se introdujo K409D como alteración de control de la interfaz de asociación a H54-mIgG1 para preparar H54-mIgG1mN3 (SEQ ID NO: 57). Se introdujo K409E como alteración de control de la interfaz de asociación a H54-mIgG1 para preparar H54-mIgG1 mN4 (SEQ ID NO: 58). Se prepararon MRAL-mk1 (SEQ ID NO: 59) y L28-mk1 (SEQ ID NO: 60) que tenían la secuencia de una región constante de cadena k de ratón como cadenas L. Las cadenas L del anticuerpo MRAL-mk1 y L28-mk1 se utilizaron para las regiones variables de la cadena H MRAH y H54, respectivamente. Se expresaron y purificaron MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1, MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1, H54-mIgG1 mN3/L28-mk1 y H54-mIgG1 mN4/L28-mk1 según el método del Ejemplo de referencia 1.

A continuación, se llevó a cabo el intercambio de brazos Fab utilizando las siguientes combinaciones:

(1) MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1 y H54-mIgG1mN3/L28-mk1

(2) MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1 y H54-mIgG1mN4/L28-mk1

Condiciones de reacción: en TBS (Takara Bio Inc., pH 7,6), [cada mAb] = 2 mg/ml, [2-MEA (Sigma-Aldrich Corp.)] = 25 mM, 37°C, 19 horas.

Después de la reacción, se determinó la eficacia de la reacción mediante CE-IEF según el método del Ejemplo de referencia 5 (Figura 9).

Como resultado, se confirmó que el anticuerpo biespecífico se formaba con una eficiencia de hasta el 89,2% por la reacción de MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1 y H54-mIgG1mN3/L28-mk1 y del 89,9% por la reacción de MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1 y H54-mIgG1mN4/L28-mk1. Esta eficacia de reacción fue ligeramente inferior a la del intercambio de brazos Fab utilizando IgG1 humana o IgG4 humana. Esto se debe presumiblemente a que la IgG1 de ratón tiene 3 enlaces disulfuro en las regiones bisagra, lo que resulta en una unión más fuerte entre dos cadenas pesadas que en las bisagras de IgG1 humana o IgG4 humana (Harris LJ et al., J. Mol. Biol., 1998. 275. 861 -872).

[Ejemplo 9] Evaluación de la actividad de unión del anticuerpo biespecífico preparado por intercambio de brazos Fab de IgG1 de ratón contra FcgR de ratón y FcRn de ratón

Los dos tipos de anticuerpos biespecíficos (MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1//H54-mIgG1mN3/L28-mk1 y MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1//H54-mIgG1mN4/L28-mk1) preparados por intercambio de brazos de IgG de ratón se evaluaron para determinar su unión a FcgR de ratón y FcRn de ratón según el Ejemplo de referencia 4-3. Además, se preparó MRAH-mIgG1/MRAL-mk1 según el Ejemplo de referencia 1 y se ensayó como control. En la Tabla 9 se muestran los resultados del ensayo.

[Tabla 9]

Ambos tipos de anticuerpos biespecíficos preparados exhibieron un perfil de unión similar al del mIgG1 natural. Específicamente, estos anticuerpos biespecíficos exhibieron 1,2 veces la actividad de unión de mIgG1 natural contra mFcgRII y mFcgRIII, sin unirse a mFcgRI y mFcgRIV.

A continuación, se evaluó la unión a mFcRn según el Ejemplo de referencia 4-4. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

[Tabla 10]

Se encontró que los dos tipos de anticuerpos biespecíficos preparados mantenían la unión de mFcRn equivalente a la de mIgG1 de origen natural.

[Ejemplo 10] Medición de la actividad citotóxica

Se evaluó si cada anticuerpo biespecífico de tipo IgG humana y cada anticuerpo biespecífico de tipo IgG de ratón preparado por intercambio de brazos Fab mantendría funciones equivalentes a las de un anticuerpo biespecífico preparado mediante un planteamiento existente midiendo la actividad citotóxica de un anticuerpo biespecífico antiglipicano 3 humano y anti-CD3 humano. En primer lugar, se preparó un anticuerpo biespecífico anti-GPC3 humano/anti-CD3 humano que tiene regiones constantes de IgG4 humana como control mediante la tecnología CrossMab documentada por Schaefer et al. (Proc. Natl Acad Sci, 2011, 108, 11187-11192). Esta molécula preparada por la tecnología CrossMab era una molécula en la que el dominio VH y el dominio VL se intercambiaban dentro de Fab contra el GPC3 humano como se describe en el documento WO2012/073985. La tecnología de “botones en ojales” se utilizó en una región constante de la cadena H de un anticuerpo para promover la heteroasociación. La tecnología de “botones en ojales” es una técnica que consiste en sustituir una cadena lateral de aminoácidos presente en la región CH3 de una cadena H con una cadena lateral más grande (botón) y sustituir su cadena lateral de aminoácidos equivalente presente en la región CH3 de otra cadena H con una cadena lateral más pequeña (ojal), de modo que el botón se inserte en el ojal para promover la heterodimerización de las cadenas H, por lo que se puede obtener de manera eficiente el anticuerpo heterodimerizado de interés (Nature, 1994, 372, 379-383). La alteración descrita en el documento WO2011/108714 se utilizó como alteración para atenuar la unión a FcgR. Específicamente, esta alteración se introdujo para sustituir residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración UE 234, 235 y 297 con Ala. Se eliminaron de los extremos C de las cadenas H del anticuerpo Gly en la posición de numeración UE 446 y Lys en la posición de numeración UE 447. Para facilitar la purificación después de la expresión del anticuerpo, se añadió además una etiqueta de histidina al extremo C de la cadena H anti-GPC3 humana, y se añadió además una etiqueta FLAG al extremo C de la cadena H anti-CD3 humana. Se preparó GC33(2)H-G4dKnHS (SEQ ID NO: 61) como cadena H anti-GPC3 humana así alterada. Además, se preparó rCE115H-G4dH1FS (SEQ ID NO: 62) como cadena H anti-CD3 humana. Se usaron cadenas L de anticuerpo GC33(2)L-k0 (SEQ ID NO: 63) y rCE115L-k0 (SEQ ID NO: 64) en el lado anti-GPC3 humano y en el lado anti-CD3 humano, respectivamente. El anticuerpo resultante se expresó mediante expresión transitoria en células FreeStyle 293 según el Ejemplo de referencia 1. El sobrenadante del cultivo obtenido se añadió a la columna MabSelect SuRe (GE Healthcare Japan Corp.) y la columna se lavó, seguido de elución con ácido acético 50 mM. La fracción que contenía el anticuerpo se añadió a la columna HisTrap HP (GE Healthcare Japan Corp.) o a la columna Ni Sepharose FF (GE Healthcare Japan Corp.) y la columna se lavó, seguido de elución con imidazol. La fracción que contenía el anticuerpo se concentró a través de una membrana de ultrafiltración. Luego, se añadió el concentrado a la columna Superdex 200 (GE Healthcare Japan Corp.). Solo se recuperó un anticuerpo monomérico en el eluato, obteniendo un anticuerpo purificado GPC3 ERY22-rCE115.

A continuación, cada anticuerpo biespecífico que tiene regiones constantes de tipo IgG1 humana, tipo IgG4 humana o tipo IgG1 de ratón y regiones variables anti-GPC3 humano/anti-CD3 humano se preparó mediante intercambio de brazos Fab. Para las regiones constantes de la cadena H de tipo IgG1 humana y de tipo IgG4 humana, la alteración para sustituir un residuo de aminoácido en la posición de numeración 235 de la UE con Arg y un residuo de aminoácido en la posición de numeración de la UE 239 con Lys se introdujo como alteración de la reducción de la unión de FcgR a G1dP17, G1dN17, G1drP1, G1drN1, G4dP1 y G4dN1 que contiene la alteración para el intercambio de brazos Fab para preparar F760P17, F760N17, F760G1drP1, F760G1drN1, F760G4dP1 y F760G4dN1, respectivamente. Para la región constante de la cadena H de tipo IgG1 de ratón, la alteración para sustituir residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración UE 235 y 239 con Lys se introdujo como alteración reductora de la unión de FcgR a mIgG1mP4 y mIgG1mN4 usados en el Ejemplo 8 para preparar mF18mP4 y mF18mN4, respectivamente. La secuencia anti-GPC3 humana descrita en el documento WO2012/073985 se utilizó como región variable para preparar H0000-F760N17 (SEQ ID NO: 65), H0000-F760G1drN1 (SEQ ID NO: 66), H0000-F760G4dN1 (SEQ ID NO: 67) y H0000-mF18mN4 (SEQ ID NO: 68). Por otro lado, se prepararon rCE115H-F760P17 (SEQ ID NO: 69), rCE115H-F760G1drP1 (SEQ ID NO: 70), rCE115H-F760G4dP1 (SEQ ID NO: 71) y rCE115H-mF18mP4 (SEQ ID NO: 72) como cadenas H laterales de CD3 humanas. Se usaron comúnmente GL4-k0 (SEQ ID NO: 79) en el lado anti-GPC3 humano y rCE115L-k0 (SEQ ID NO: 64) en el lado anti-CD3 humano como cadenas L de anticuerpo de tipo IgG 1 humano y de tipo IgG4 humano. Se usaron GL4-mk1 (SEQ ID NO: 80) en el lado anti-GPC3 humano y rCE115L-mk1 (SEQ ID NO: 81) en el lado anti-CD3 humano como cadenas L de anticuerpos de tipo IgG 1 de ratón. Estas homovariantes se expresaron y purificaron según el método del Ejemplo de referencia 1 para obtener rCE115H-F760P17/rCE115L-k0, H0000-F760N17/GL4-k0, rCE115H-F760G1drP1/rCE115L-k0, H0000-F760G1drN1/GL4-k0, rCE115H-F760G4dP1/rCE115L-k0, H0000-F760G4dN1/GL4-k0, rCE115H-mF18mP4/rCE115L-mk1 y H0000-mF1 8mP4/GL4-mk1.

A continuación, se mezclaron dos tipos de las homovariantes así obtenidas en las combinaciones dadas a continuación para provocar la reacción de FAE.

(1) rCE115H-F760P17/rCE115L-k0 y H0000-F760N17/GL4-k0

(2) rCE115H-F760G1drP1/rCE115L-k0 y H0000-F760G1drN1/GL4-k0

(3) rCE115H-F760G4dP1/rCE115L-k0 y H0000-F760G4dN1/GL4-k0

(4) rCE115H-mF18mP4/rCE115L-mk1 y H0000-mF18mP4/GL4-mk1

Condiciones de reacción: en TBS (Takara Bio Inc., pH 7,6), [cada mAb] = 0,36 mg/ml, [2-MEA (Sigma-Aldrich Corp.)] = 25 mM, 37°C, 18 horas.

Después de la reacción, los productos se dializaron contra PBS y se usaron en la evaluación de la actividad citotóxica.

La evaluación de la actividad citotóxica se llevó a cabo mediante el método descrito en el Ejemplo de referencia 6. Los resultados se muestran en las Figuras 10-1 y 10-2.

Como se muestra en la Figura 10-1, todos los anticuerpos biespecíficos preparados por el intercambio de brazos Fab de tipo IgG 1 humano y de tipo IgG4 humano exhibieron una actividad citotóxica equivalente a la del anticuerpo de control (GPC3 ERY22-rCE115) preparado por la técnica existente de preparación de anticuerpos biespecíficos. Como se muestra en la Figura 10-2, el anticuerpo biespecífico preparado por intercambio de brazos Fab de tipo IgG de ratón también exhibió una actividad citotóxica equivalente a la del anticuerpo de control (GPC3 ERY22-rCE115) preparado mediante la técnica de preparación existente de anticuerpos biespecíficos.

[Ejemplo 11] Prueba de PK normal en ratón

(11-1) Prueba in v iv o usando un ratón normal

La prueba in vivo se llevó a cabo usando un ratón normal para evaluar si los anticuerpos preparados mediante el intercambio de brazos Fab de tipo IgG humana y de tipo IgG de ratón exhibirían cambios en la concentración en sangre al mismo nivel que en un anticuerpo preparado mediante el planteamiento existente.

Se prepararon tres tipos de anticuerpos biespecíficos anti-glipicano 3 humano/anti-CD3 humano TR-G1drP1/N1, TR-G1dP17/N17 y TR-G4dP1/N1 como anticuerpos de tipo IgG humana mediante intercambio de brazos Fab de tipo IgG humana. Además, se prepararon anticuerpos biespecíficos TR-G1dKiH y TR-G4dKiH que tenían las mismas regiones variables anti-glipicano 3 humano/anti-CD3 humano que antes, utilizando regiones constantes preparadas mediante la introducción de la alteración de “botones en ojales” (Nature, 1994, 372, 379-383) a una región constante G1d que comienza en Ala en la posición de numeración UE 118 en MRAH-Gld (SEQ ID NO: 3) o una región constante G4d (región constante wtG4d que comienza en Ala en la posición de numeración UE 118 en MRAH-wtG4d (SEQ ID NO: 5) y que además contiene una bisagra de tipo IgG1 resultante de la sustitución de un residuo de aminoácido Ser en la posición 228 por Pro), y se usan como anticuerpos de control. En este contexto, los nombres de región constante G1dKiH y G4dKiH denotan regiones constantes expresadas como una cadena botón y una cadena ojal en combinación usando una cadena botón, introduciéndose la alteración del botón (alteración para sustituir un residuo de aminoácido en la posición 349 por Cys y un residuo de aminoácido en la posición 366 por Trp) en la región constante G1d o G4d, y una cadena ojal, introduciéndose la alteración de ojal (alteración para sustituir un residuo de aminoácido en la posición 356 por Cys, un residuo de aminoácido en la posición 366 por Ser, un residuo de aminoácido en la posición 368 por Ala y un residuo de aminoácido en la posición 407 por Val) en la región constante G1d o G4d.

Por otro lado, se prepararon H237-mIgG1mP3 (SEQ ID NO: 74), H237-mIgG1 mN3 (SEQ ID NO: 75), H237-mIgG1 mP4 (SEQ ID NO: 76) y H237-mIgG1 mN4 (SEQ ID No : 77) como anticuerpos de tipo IgG de ratón mediante la introducción de la alteración para el intercambio de brazos Fab a H237-mIgG1 (SEQ ID NO: 73) que tiene la secuencia de una región variable de la cadena H H237 del anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano descrito en el documento WO2009/125825 y la secuencia de una región constante de mIgGI de origen natural. Como cadena L de anticuerpo se usó L104-mk1 (SEQ ID NO: 78), que consiste en la secuencia de una región variable de cadena L anti-receptor de IL-6 humano L104 y una región constante de cadena k de ratón mk1. Estas homovariantes se expresaron según el método del Ejemplo de referencia 1 para obtener H237-mIgG1mP3/L104-mk1, H237-mIgG1mN3/L104-mk1, H237-mIgG1mP4/L104-mk1 y H237-mIgG1mN4/L104-mk1. El intercambio de brazos Fab se llevó a cabo utilizando las homovariantes obtenidas para obtener SA-mIgG1mP3/mN3 (H237-mIgG1mP3/L104-mk1 y H237-mIgG1mN3/L104-mk1 en combinación) y SA-mIgG1mP4/mN4 (H237-mIgG1mP4/L104-mk1 y H237-mIgG1mn4/L104-mk1 en combinación). Como anticuerpo de control se usó SA-mIgG1, expresado usando H237-mIgG1 y L104-mk1.

El intercambio de brazos Fab se llevó a cabo en las condiciones de reacción que se indican a continuación en todos los casos. Después de la reacción, los productos se dializaron contra PBS y se usaron en la prueba in vivo.

Condiciones de reacción: en TBS (Takara Bio Inc., pH 7,6), [cada mAb] = 0,225 mg/ml, [2-MEA (Sigma-Aldrich Corp.)] = 25 mM, 37°C, 17 horas.

Se administró a un ratón normal (ratón C57BL/6J, Charles River Laboratories Japan, Inc.) cada anticuerpo biespecífico anti-glipicano 3 humano/anti-CD3 humano de tipo IgG humana (TR-G1dKiH, TR-G1 drP1/N1, TR-G1dP17/N17, TR-G4dKiH y TR-G4dP1/N1) o cada anticuerpo murino anti-receptor de IL-6 humano (SA-mIgG1, SA-mIgG1mP3/mN3 y SA-mIgG1mP4/mN4). Luego, cada anticuerpo fue evaluado por su cinética in vivo. El anticuerpo se ajustó a 0,1 mg/ml y se administró a 10 ml/kg en la vena caudal. Después de un lapso de 5 minutos, 2 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 7 días, 14 días, 21 días y 28 días después de la administración del anticuerpo, se extrajo sangre del ratón. La sangre recogida se centrifugó inmediatamente a 15.000 rpm a 4°C durante 15 minutos para obtener plasma. El plasma separado se almacenó en un congelador regulado a -20°C o menos hasta el inicio del ensayo.

(11-2) Medición de la concentración de anticuerpos biespecíficos en plasma mediante ECLIA

La concentración de anticuerpos biespecíficos en el plasma de ratón se midió mediante ECLIA. En primer lugar, se distribuyó glipicano 3 humano soluble en pocillos de placa MULTI-ARRAY (Meso Scale Discovery) de 96 pocillos y se dejó reposar durante la noche a 4°C para preparar una placa inmovilizada con glipicano 3 humano soluble. Se prepararon muestras de calibración que contenían cada anticuerpo biespecífico a 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 o 3,125 ng/ml como concentración plasmática y muestras de ensayo de plasma de ratón diluidas 100 veces o más. Estas muestras de calibración y muestras de ensayo de plasma se distribuyeron a razón de 100 pl/pocillo en la placa inmovilizada con glipicano 3 humano soluble y se agitaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, se agitó un anticuerpo idiotípico de conejo contra un anticuerpo anti-CD3 humano en la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se hizo que el mismo anticuerpo reaccionara con anti-IgG-Sulfotag de conejo (Meso Scale Discovery) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la adición de Read Buffer T (Meso Scale Discovery), se midió la emisión de luz usando un SECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery). La concentración de anticuerpos en el plasma de ratón se calculó a partir de señales de emisión en la curva de calibración utilizando el soporte lógico de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Los resultados se muestran en la Figura 11. Los parámetros PK se muestran en la Tabla 11. Los resultados mostrados en la Figura 11 y la Tabla 11 demostraron que todos los anticuerpos biespecíficos preparados por intercambio de brazos Fab de tipo IgG humano exhiben cambios en la concentración en sangre al mismo nivel que en el anticuerpo de control preparado utilizando la tecnología de “botones en ojales” como técnica existente de preparación de anticuerpos biespecíficos.

[Tabla 11]

(11 -3) Medición de la concentración de anticuerpos de ratón anti-receptor de IL-6 humana en plasma mediante ELISA

La concentración de anticuerpos de ratón anti-receptor de IL-6 humana en el plasma de ratón se midió mediante ELISA. En primer lugar, se distribuyó el receptor de IL-6 humano soluble en pocillos de Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge Nunc International Corp.) y se dejó reposar durante la noche a 4°C para preparar una placa inmovilizada con receptor de IL-6 humano soluble. Se prepararon muestras de calibración que contenían cada anticuerpo de ratón anti receptor de IL-6 humano a 2,50, 1,25, 0,625, 0,313, 0,156, 0,078 o 0,039 pg/ml como concentración plasmática y muestras de ensayo de plasma de ratón diluidas 100 veces o más. Estas muestras de calibración y muestras de ensayo de plasma se distribuyeron a razón de 100 pl/pocillo a la placa inmovilizada con el receptor de IL-6 humano soluble y se agitaron a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, se hizo que el mismo anticuerpo reaccionara con anti-IgG-peroxidasa de ratón (Sigma-Aldrich Corp.) a temperatura ambiente durante 2 horas, y se llevó a cabo la reacción de color de la solución de reacción usando el sustrato TMB One Component HRP Microwell (BioFX Laboratories, Inc.) como sustrato. La reacción se terminó mediante la adición de ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical Industry Co., Ltd.). La absorbancia de la solución de reacción en cada pocillo se midió a 450 nm usando un lector de microplacas. La concentración de anticuerpos en el plasma de ratón se calculó a partir de la absorbancia en la curva de calibración utilizando el soporte lógico de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Los resultados se muestran en la Figura 12. Los parámetros de anticuerpos se muestran en la Tabla 12. Los resultados mostrados en la Figura 12 y la Tabla 12 demostraron que los anticuerpos preparados por intercambio de brazos Fab de tipo IgG de ratón exhiben cambios en la concentración en sangre al mismo nivel que en el anticuerpo de control que tiene la secuencia de mIgG1 de origen natural.

[Tabla 12]

[Ejemplo de referencia 1] Preparación del vector de expresión del anticuerpo y expresión y purificación del anticuerpo

Los genes de longitud completa que tienen secuencias de nucleótidos que codifican la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo se sintetizaron usando PCR de ensamblaje o similar y se prepararon mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica. La sustitución de aminoácidos se introdujo mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica usando PCR o similar. Los fragmentos de plásmido obtenidos se insertaron en vectores de expresión para células animales para preparar vectores de expresión de la cadena H y vectores de expresión de la cadena L. Las secuencias de nucleótidos de los vectores de expresión obtenidos se determinaron mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica. Los plásmidos preparados se transfirieron transitoriamente a una línea HEK293H derivada de células de cáncer de riñón embrionario humano (Invitrogen Corp.) o células FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) para la expresión de anticuerpos. El sobrenadante de cultivo obtenido se recuperó y luego se pasó a través de un filtro MILLEX®-GV de 0,22 pm (Millipore Corp.) o un filtro MILLEX®-GV de 0,45 pm (Millipore Corp.) para obtener un sobrenadante de cultivo. El anticuerpo se purificó a partir del sobrenadante de cultivo obtenido mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica usando rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Japan Corp.) o Protein G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Japan Corp.). En cuanto a la concentración del anticuerpo purificado, la absorbancia se midió a 280 nm utilizando un espectrofotómetro, y la concentración de anticuerpo se calculó mediante el uso de un coeficiente de extinción calculado a partir del valor obtenido por un método como PACE (Protein Science 1995; 4: 2411 -2423).

[Ejemplo de referencia 2] Evaluación de la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos mediante cromatografía de intercambio iónico

La separación de cada muestra se evaluó mediante el método de purificación por cromatografía de intercambio iónico utilizando Prominence UFLC (Shimadzu Corp.). El anticuerpo biespecífico se separó mediante el método de gradiente mixto de dos soluciones utilizando una solución tampón MES 25 mM (pH 5,0) y una solución tampón MES 25 mM (pH 5,0) que contenía cloruro sódico 500 mM como fases móviles y ProPac WCX-10 (Thermo Fisher Scientific KK) como columna. Los datos se obtuvieron a una longitud de onda de 215 nm. Los resultados de la elución se evaluaron utilizando Empower 2 (Waters Corp.).

Se usó un valor determinado dividiendo el valor de área del anticuerpo biespecífico por el valor de área de todos los anticuerpos presentes en el sistema, seguido de multiplicación por 100 como la tasa de formación de anticuerpos biespecíficos (%). Si una de las homovariantes tenía una tasa de recuperación deficiente, el valor del área de la otra homovariante se duplicaba y se sumaba con el valor del área del anticuerpo biespecífico, y el valor resultante se usaba como el valor del área de todos los anticuerpos para el cálculo.

[Ejemplo de referencia 3] Medición de Tm

La Tm de los dominios CH3 se midió mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica usando Rotor-gene Q (Qiagen N.V.). Se calentó una muestra que contenía una mezcla de cada anticuerpo a una concentración de 0,1 mg/ml y SYPRO naranja a una concentración de concentrado 10 X de 30°C a 99°C. La intensidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación: 470 nm, longitud de onda de fluorescencia: 555 nm) se midió sobre la base de 0,4°C. Esta medida se realizó en PBS (Sigma-Aldrich Corp., pH 7,4). El análisis se realizó utilizando el soporte lógico Rotor-gene Q series. El punto de inflexión determinado por la primera derivación de la intensidad de fluorescencia se definió como Tm. La Tm de los dominios CH3 se calculó mediante el uso de Tm de MRAH CH2 alrededor de 70°C, Tm de MRAH Fab alrededor de 95°C, Tm de H54 CH2 alrededor de 70°C y Tm de H54 Fab alrededor de 90°C.

[Ejemplo de referencia 4] Análisis de interacción por SPR

(4-1) Método para preparar FcyR y método para analizar la interacción entre el anticuerpo alterado y FcyR

El dominio extracelular de cada FcyR se preparó mediante el siguiente método: en primer lugar, el gen del dominio extracelular FcyR se sintetizó mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica. Para esta síntesis, se preparó la secuencia de cada FcyR en función de la información registrada en NCBI. Específicamente, FcyRI se preparó sobre la base de la secuencia del número de acceso NCBI NM_000566.3; se preparó FcyRIIa sobre la base de la secuencia del número de acceso NCBI NM_001136219.1; se preparó FcyRIIb sobre la base de la secuencia del número de acceso NCBI NM_004001.3; se preparó FcYRIIIa sobre la base de la secuencia del número de acceso NCBI NM_001127593.1; y se preparó FcyRIIIb sobre la base de la secuencia del número de acceso NCBI NM_000570.3. Estas secuencias se marcaron C-terminalmente con una secuencia de etiqueta His. Además, se conoce polimorfismo sobre FcyRIIa, FcYRIIIa y FcyRIIIb. Los sitios polimórficos se prepararon con referencia a J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25 para FcyRIIa, J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070 para FcYRIIIa, y J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691 para FcyRIIIb.

Cada fragmento de gen obtenido se insertó en vectores de expresión de células animales para preparar vectores de expresión. Los vectores de expresión preparados se transfirieron transitoriamente a células FreeStyle 293 derivadas de células de cáncer de riñón embrionario humano (Invitrogen Corp.) para expresar la proteína de interés. Después del cultivo, se recuperó el sobrenadante de cultivo obtenido y luego se pasó a través de un filtro de 0,22 pm para obtener un sobrenadante de cultivo. El sobrenadante del cultivo obtenido se purificó, por regla general, mediante las siguientes 4 etapas: cromatografía en columna de intercambio catiónico (SP Sepharose FF) como etapa 1, cromatografía en columna de afinidad para la etiqueta His (HisTrap HP) como etapa 2, cromatografía en columna de filtración en gel (Superdex 200) como etapa 3, y filtración estéril como etapa 4. Sin embargo, para FcyRI, la cromatografía en columna de intercambio aniónico se llevó a cabo en la etapa 1 usando Q Sepharose FF. La absorbancia se midió para cada proteína purificada a 280 nm usando un espectrofotómetro, y la concentración de la proteína purificada se calculó mediante el uso de un coeficiente de extinción calculado a partir del valor obtenido por un método como PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).

Cada anticuerpo alterado se analizó para determinar su interacción con cada receptor Fcy así preparado usando Biacore T100 (GE Healthcare Japan Corp.), Biacore T200 (GE Healthcare Japan Corp.), Biacore A100 o Biacore 4000. El tampón de electroforesis utilizado fue HBS-EP+ (GE Healthcare Japan Corp.). La temperatura del ensayo se fijó en 25°C. Los chips sensores utilizados fueron chips preparados inmovilizando el péptido antigénico, proteína A (Thermo Fisher Scientific KK), proteína A/G (Thermo Fisher Scientific KK) o proteína L (ACTIGEN o BioVision) en el chip sensor CM5 serie S (GE Healthcare Japan Corp.) o el chip sensor CM4 serie S (GE Healthcare Japan Corp.) mediante el método de acoplamiento de amina, o inmovilizando el péptido antigénico biotinilado de antemano en el chip sensor SA serie S (certificado) (GE Healthcare Japan Corp.) mediante interacción.

El anticuerpo de interés se capturó en estos chips sensores y se dejó interactuar con el receptor Fcy diluido con un tampón de electroforesis. Se midió la cantidad de unión al anticuerpo y se comparó entre los anticuerpos. Dado que la cantidad de unión del receptor Fcy depende de la cantidad de anticuerpo capturado, en la comparación se utilizó un valor de corrección determinado dividiendo la cantidad de unión del receptor Fcy por la cantidad de cada anticuerpo capturado. El anticuerpo capturado en el chip sensor se eliminó mediante la reacción de glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) para regenerar el chip sensor, que se utilizó reiteradamente.

Para calcular el valor KD de cada anticuerpo alterado para FcyR, se realizó un análisis cinético según el siguiente método: primero, el anticuerpo de interés se capturó en estos chips y se dejó interactuar con el receptor Fcy diluido con un tampón de electroforesis. Para el sensograma obtenido, los resultados del ensayo se ajustaron globalmente al modelo de unión de Langmuir 1:1 utilizando el soporte lógico de evaluación Biacore para calcular una constante de velocidad de asociación ka (l/mol/s) y una constante de velocidad de disociación kd (1/s). A partir de estos valores, se calculó la constante de disociación Kd (mol/l).

(4-2) Método para preparar FcRn y método para analizar la interacción entre el anticuerpo alterado y FcRn

El FcRn es un complejo de FcRn y microglobulina p2. Se prepararon cebadores de oligo ADN sobre la base de la secuencia genética publicada de FcRn humano (J Exp Med. 1 de diciembre de 1994; 180 (6): 2377-81). El fragmento de ADN que contiene el gen completo que codifica el FcRn se preparó mediante PCR utilizando los cebadores preparados y ADNc humano (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech Laboratories, Inc.) como plantilla. Se amplificó mediante PCR un fragmento de ADN que codifica el dominio extracelular que contiene una región señal (Met1 a Leu290) utilizando el fragmento de ADN obtenido como plantilla y se lo insertó en vectores de expresión para células de mamífero. Asimismo, se prepararon cebadores de oligo a Dn sobre la base de la secuencia genética publicada de la microglobulina p2 humana (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002)). El fragmento de ADN que contiene el gen completo que codifica la microglobulina p2se preparó mediante PCR utilizando los cebadores preparados y ADNc humano (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech Laboratories, Inc.) como plantilla. Se amplificó mediante PCR un fragmento de ADN que codifica la proteína completa que contiene una región señal (Met1 a Met119) usando el fragmento de ADN obtenido como plantilla y se lo insertó en vectores de expresión para células de mamífero.

El FcRn humano soluble se expresó mediante los siguientes procedimientos: se transfirieron los plásmidos construidos para expresar FcRn humano (SEQ ID NO: 30) y microglobulina p2 (SEQ ID NO: 31) a células de una línea celular derivada de células de cáncer de riñón embrionario humano HEK293H (Invitrogen Corp.) por lipofección usando PEI (Polysciences, Inc.). El sobrenadante de cultivo obtenido se recuperó y se purificó usando IgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences Corp.). Luego, el FcRn se purificó aún más usando HiTrap Q HP (GE Healthcare Japan Corp.) (j Immunol. 1 de noviembre de 2002; 169 (9): 5171 -80).

Un sistema que utiliza un anticuerpo inmovilizado en el chip sensor descrito en J Immunol. 2009; 182 (12): 7663-71 y FcRn humano como analito ha sido documentado como un sistema de ensayo para evaluar la interacción entre el anticuerpo y FcRn usando Biacore. Con este fin, se preparó FcRn humano como se describe en el Ejemplo de referencia 4. Este sistema se usó para evaluar la actividad de unión (constante de disociación KD) de Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-v1 y Fv4-IgG1-v2 contra FcRn humano en pH 6,0 y pH 7,4. Cada anticuerpo como sustancia de prueba se inmovilizó directamente en el chip sensor CM5 serie S y se sometió a la prueba. La inmovilización del anticuerpo al chip sensor se llevó a cabo usando 50 mmol/l de fosfato de sodio, 150 mmol/l de NaCl y 0,05% (v/v%) de tensioactivo P20 (pH 6,0) como tampón de electroforesis y un equipo de acoplamiento de amina según el manual del fabricante con el fin de alcanzar 500 RU como la cantidad diana del anticuerpo inmovilizado.

El ensayo se realizó mediante el uso del chip sensor preparado usando 50 mmol/l de fosfato de sodio/150 mmol/l de NaCl y 0,05% de tensioactivo P20 (pH 6,0) o 50 mmol/l de fosfato de sodio, 150 mmol/l de NaCl y 0,05% de tensioactivo P20 (pH 7,4) como tampón de electroforesis. El ensayo se realizó a 25°C para todas las muestras. Se inyectó en el mismo la solución diluida del FcRn humano o un tampón de electroforesis (como solución de control) a un caudal de 5 pl/min durante 10 minutos, de modo que se permitió que el FcRn humano interactuara con el anticuerpo en el chip sensor. Luego, se le inyectó un tampón de electroforesis a un caudal de 5 pl/min durante 1 minuto. Después de observar la disociación de FcRn, se inyectaron 20 mmol/l de Tris-HCl/150 mmol/l de NaCl (pH 8,1) a un caudal de 30 pl/min durante 15 segundos, y esta operación se repitió dos veces para regenerar el chip sensor.

Para calcular el valor KD de cada anticuerpo alterado para FcRn, se realizó un análisis cinético según el siguiente método: primero, el anticuerpo de interés se capturó en estos chips y se dejó interactuar con FcRn diluido con un tampón de electroforesis. Para el sensograma obtenido, los resultados del ensayo se ajustaron globalmente al modelo de unión de Langmuir 1:1 utilizando el soporte lógico de evaluación Biacore para calcular una constante de velocidad de asociación ka (l/mol/s) y una constante de velocidad de disociación kd (1/s). A partir de estos valores, se calculó la constante de disociación Kd (mol/l).

(4-3) Método para preparar mFcyR y método para analizar la interacción entre el anticuerpo alterado y mFcyR

El dominio extracelular de cada FcyR de ratón se preparó mediante el siguiente método: en primer lugar, el gen del dominio extracelular de FcyR se sintetizó mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica. Para esta síntesis, se preparó la secuencia de cada FcyR en función de la información registrada en NCBI. Específicamente, mFcyRI se preparó sobre la base de la secuencia de la secuencia de referencia NCBI: NP_034316.1; El mFcyRII se preparó sobre la base de la secuencia de la secuencia de referencia NCBI: NP_034317.1; mFcyRIII se preparó sobre la base de la secuencia de la secuencia de referencia NCBI: NP_034318.2; y mFcyRIV se preparó sobre la base de la secuencia de la secuencia de referencia NCBI: NP_653142.2. Estas secuencias se marcaron con una secuencia de etiqueta His en el terminal C.

Cada fragmento de gen obtenido se insertó en vectores de expresión de células animales para preparar vectores de expresión. Los vectores de expresión preparados se transfirieron transitoriamente a células FreeStyle 293 derivadas de células de cáncer de riñón embrionario humano (Invitrogen Corp.) para expresar la proteína de interés. El sobrenadante de cultivo obtenido se recuperó y luego se pasó a través de un filtro de 0,22 gm para obtener un sobrenadante de cultivo. El sobrenadante de cultivo obtenido se purificó, por regla general, mediante las 4 etapas siguientes: cromatografía en columna de intercambio iónico como etapa 1, cromatografía en columna de afinidad para la etiqueta His (HisTrap HP) como etapa 2, cromatografía en columna de filtración en gel (Superdex 200) como etapa 3, y filtración estéril como etapa 4. La cromatografía en columna de intercambio iónico de la etapa 1 se llevó a cabo usando Q Sepharose HP para mFcyRI, SP Sepharose FF para mFcyRII y mFcyRIV, y SP Sepharose HP para mFcyRIII. Se usó D-PBS(-) como disolvente en la etapa 3 o posterior, mientras que para mFcyRIII se usó D-PBS(-) que contenía arginina 0,1 M. La absorbancia se midió para cada proteína purificada a 280 nm usando un espectrofotómetro, y la concentración de la proteína purificada se calculó mediante el uso de un coeficiente de extinción calculado a partir del valor obtenido por un método como PACE (Protein Science 1995; 4: 2411 -2423).

El anticuerpo de interés se capturó en estos chips sensores y se dejó interactuar con mFcyR diluido con un tampón de electroforesis. Se midió la cantidad de unión al anticuerpo y se comparó entre los anticuerpos. Dado que la cantidad de unión de mFcyR depende de la cantidad de anticuerpo capturado, en la comparación se utilizó un valor de corrección determinado dividiendo la cantidad de unión de mFcyR por la cantidad de cada anticuerpo capturado. El anticuerpo capturado en el chip sensor se eliminó mediante la reacción de glicina-HCl 10 mM (pH 1,5) para regenerar el chip sensor, que se utilizó reiteradamente.

(4-4) Método para preparar mFcRn y método para analizar la interacción entre el anticuerpo alterado y mFcRn

El análisis cinético se realizó en FcRn de ratón y cada anticuerpo usando Biacore T100, Biacore T200, Biacore A100 y Biacore 4000 (GE Healthcare Japan Corp.). Se inmovilizó una cantidad apropiada de proteína L (ACTIGEN) en el chip sensor CM4 (GE Healthcare Japan Corp.) mediante el método de acoplamiento de amina. El anticuerpo de interés se capturó en el chip. A continuación, se le inyectó una solución diluida de FcRn o un tampón de electroforesis (como solución de control), de modo que se permitió que el FcRn de ratón interactuara con el anticuerpo capturado en el chip sensor.

El tampón de electroforesis utilizado fue fosfato de sodio 50 mmol/l, NaCl 150 mmol/l y Tween 20 al 0,05% (p/v) (pH 6,0), y cada tampón también se utilizó para diluir FcRn. Se utilizó glicina-HCl 10 mmol/l (pH 1,5) para regenerar el chip. El ensayo se realizó a 25°C para todas las muestras. Del sensograma obtenido por el ensayo, se calcularon como parámetros cinéticos una constante de tasa de asociación ka (1/Ms) y una constante de tasa de disociación k^d(1/s). La KD (M) de cada anticuerpo para FcRn de ratón se calculó sobre la base de los parámetros. Se utilizó el soporte lógico de evaluación Biacore (GE Healthcare Japan Corp.) en el cálculo de cada parámetro.

[Ejemplo de referencia 5] CE-IEF

La medición de CE-IEF se llevó a cabo mediante un método generalmente conocido por los expertos en la técnica usando PA800 Plus (Beckman Coulter Inc.). Se mezclaron en cantidades iguales Pharmalyte con un amplio intervalo de 5 a 8 y Pharmalyte con un amplio intervalo de 8 a 10,5 y se analizaron en un intervalo de pI de 5 a 10,5. El análisis se realizó utilizando una solución de anticuerpos de 4 mg/ml y los resultados se analizaron utilizando el soporte lógico

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un anticuerpo biespecífico, que comprende las etapas de:

d) obtener un heteromultímero que comprende los polipéptidos primero y segundo, en el que de 1 a 3 conjuntos de residuos de aminoácidos seleccionados de los siguientes conjuntos de residuos de aminoácidos: (1) residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración de la UE 356 y 439,

2. El método según la reivindicación 1 en donde la etapa a) de la reivindicación 1 comprende la etapa de proporcionar un tercer polipéptido que forma un multímero con el primer polipéptido, y la etapa b) comprende la etapa de proporcionar un cuarto polipéptido que forma un multímero con el segundo polipéptido.

3. El método según la reivindicación 1 o 2 en donde los residuos de aminoácidos que tienen el mismo tipo de carga se seleccionan entre uno o más residuos de aminoácidos incluidos en cualquiera de los siguientes grupos (A) y (B):

(A) ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D); y

(B) lisina (K), arginina (R) e histidina (H).

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el o los conjuntos de residuos de aminoácidos que tienen mutuamente el mismo tipo de carga en cada uno de los polipéptidos primero y segundo es cualquiera de los siguientes conjuntos (1) a (4) de residuos de aminoácidos:

(2) residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración de la UE 357 y 370,

(3) residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración de la UE 399 y 409, y

(4)

(i) residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración de la UE 399 y 409 y

(ii) residuos de aminoácidos en las posiciones de numeración de la UE 356 y 439.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde en los polipéptidos primero y/o segundo se altera un aminoácido para trastocar la estabilidad de la región CH3 de los polipéptidos primero y/o segundo.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde en los polipéptidos primero y/o segundo se altera un aminoácido en la posición de numeración UE 397 y/o 392.

7. El método según la reivindicación 6 en donde en los polipéptidos primero y/o segundo,

el aminoácido en la posición de numeración de la UE 397 se modifica a Met (M), Phe (F) o Tyr (Y), y/o el aminoácido en la posición de numeración de la UE 392 se modifica a Asp (D), Glu (E), Thr (T), Val (V) o Ile (I).

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde, en el primer polipéptido, el aminoácido en la posición de numeración UE 356 se cambia a Lys (K), y el aminoácido en la posición de numeración UE 397 se cambia a Phe (F) o Tyr (Y); y, en el segundo polipéptido, el aminoácido en la posición de numeración UE 397 se modifica a Phe (F) o Tyr (Y), y el aminoácido en la posición de numeración UE 439 se modifica a Glu (E).

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde las etapas a) y b) se llevan a cabo mezclando una línea celular que produce la homovariante de los primeros polipéptidos con una línea celular que produce la homovariante de los segundos polipéptidos, y la etapa c) se lleva a cabo en el sobrenadante del cultivo.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la etapa c) descrita en la reivindicación 1 implica el contacto con un agente reductor, preferiblemente una sustancia activa seleccionada del grupo constituido por glutatión, L-cisteína, ditiotreitol, p-mercapto-etanol, TCEP y 2-MEA.