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KR20130130765A - 세포상해 유도 치료제 - Google Patents

세포상해 유도 치료제 Download PDF

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KR20130130765A
KR20130130765A KR1020137016886A KR20137016886A KR20130130765A KR 20130130765 A KR20130130765 A KR 20130130765A KR 1020137016886 A KR1020137016886 A KR 1020137016886A KR 20137016886 A KR20137016886 A KR 20137016886A KR 20130130765 A KR20130130765 A KR 20130130765A
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다카히로 이시구로
아츠시 나리타
아키히사 사카모토
유미코 가와이
도모유키 이가와
다이치 구라모치
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추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

BiTE가 갖는 강한 항종양 활성과, 안전성이 우수한 성질이 유지되고, 긴 혈중 반감기를 가지며, 또한 항원 결합 도메인을 치환함으로써 각종 세포를 표적으로 하여 세포상해를 일으키는 새로운 폴리펩티드 회합체를 발견하였다.

Description

세포상해 유도 치료제{Cytotoxicity-inducing therapeutic agent}
본 발명은 T 세포를 표적 암세포에 근접시켜 T 세포에 의한 표적 암세포에 대한 세포상해 활성을 통해서 암을 치료하는 것을 가능하게 하는 폴리펩티드 회합체, 당해 폴리펩티드 회합체의 제조방법, 및 당해 폴리펩티드 회합체를 유효성분으로서 포함하는 세포상해 유도 치료제에 관한 것이다. 또한 당해 세포상해 유도 치료제를 유효성분으로서 포함하는, 각종 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물 또는 당해 의약 조성물을 사용하는 치료방법에 관한 것이다.
이제까지 우수한 항종양 효과를 나타내는 복수의 치료용 항체가, 암 치료를 목적으로 하는 의약품으로서 개발되어 있다(비특허문헌 1). 이들 치료용 항체는, 암세포의 증식에 필요한 시그날의 저해, 세포사 시그날의 유발, 또는 ADCC(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity; 항체 의존성 세포상해), CDC(Complement Dependent Cytotoxicity; 보체 의존성 세포상해)에 의해, 암세포에 대한 항종양 효과를 발휘하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 2). 항체의 Fc 영역이 NK 세포나 대식세포(macrophage) 등의 이펙터 세포 상에 존재하는 Fc 수용체에 결합함으로써, 항체가 결합한 표적의 암세포에 대해서 이들 이펙터 세포가 발휘하는 세포상해가 ADCC이다. 항체의 구조 중에 존재하는 보체 결합 부위에는 보체 복합체가 결합한다. 항체가 결합한 세포의 세포막 상에 당해 복합체 중에 존재하는 보체 성분이 구멍을 형성함으로써, 물이나 이온의 세포 내로의 유입이 촉진되어 세포가 파괴되어 일어나는 세포상해가 CDC이다. 기존의 치료용 항체에는 우수한 작용이 확인되지만, 이러한 항체의 투여에 의해 얻어지는 치료 성적은 아직 만족할 수 있는 것이 아니다. 이에, 더욱 강력한 살세포 활성을 발휘하는 암에 대한 치료 항체의 개발이 요망되고 있다.
상기 NK 세포나 대식세포를 이펙터 세포로서 동원하는 ADCC를 그 항종양 효과의 메커니즘으로 하는 항체와는 별도로, T 세포를 이펙터 세포로서 동원하는 세포상해를 그 항종양 효과의 메커니즘으로 하는 항체인 T 세포 리크루트 항체(T cell recruiting 항체, TR 항체)도 1980년대 부터 알려져 있다(비특허문헌 3-5). TR 항체는, T 세포 상의 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 구성 서브유닛 중 어느 하나에 대한 항체, 특히 CD3 epsilon쇄에 결합하는 항체와, 표적인 암세포 상의 항원에 결합하는 항체를 포함하는 bi-specific(이중 특이성) 항체이다. TR 항체가 CD3 epsilon쇄와 암 항원에 동시에 결합함으로써, T 세포가 암세포에 접근한다. 그 결과, T 세포가 갖는 세포상해 작용에 의해 암세포에 대한 항종양 효과가 발휘된다고 생각되고 있다.
TR 항체 중 하나로써 trifunctional 항체라 불리는 항체도 알려져 있다(비특허문헌 6, 7). 이것은, 암 항원에 결합하는 Fab와 CD3 epsilon쇄에 결합하는 Fab가 각각 한쪽 팔에 포함되는 whole IgG형의 bi-specific 항체이다. EpCAM에 대한 trifunctional 항체인 catumaxomab를 EpCAM 발현 양성의 암세포를 갖는 악성 복수 환자의 복강 내에 대해서 투여함으로써 악성 복수증에 대한 치료의 효과가 나타내어져 있다. EU에 있어서 상기 치료를 목적으로 하는 catumaxomab의 사용이 승인되어 있다.
또한 최근 들어, BiTE(bispecific T-cell engager)라 불리는 TR 항체가 강한 항종양 작용을 나타내는 것이 알려지게 되었다(비특허문헌 8, 9). BiTE는 암 항원에 대한 항체의 scFv와 CD3 epsilon쇄에 대한 항체의 scFv가 짧은 폴리펩티드 링커를 매개로 연결된 분자형을 갖는 TR 항체이다. BiTE는 그때까지 알려져 있었던 각종 TR 항체에 비해서 우수한 항종양 작용을 갖는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 9, 10). 즉 BiTE는, 다른 TR 항체와 비교하여, 현저하게 낮은 농도, 및 낮은 이펙터 세포：암세포 비율(ET비) 하에서 항종양 효과를 발휘한다. 또한 이 효과의 발현에, 사전에 이펙터 세포를 IL-2나 CD28 아고니스트 항체 등에 의해 활성화시킬 필요가 없는 것도 나타내어져 있다. 임상적으로 우수한 효과가 있는 것이 알려져 있는 리툭산보다도 훨씬 강한 인 비트로(in vitro)에서의 암세포에 대한 상해 작용을 CD19에 대한 BiTE인 blinatumomab(MT103)가 나타내었다. 또한 최근 행해진 제1상 임상시험, 제2상 임상시험에 있어서 매우 우수한 항종양 효과를 나타낸 것이 보고되어 있다(비특허문헌 11).
catumaxomab가 임상에서 약효를 나타내어 치료약으로서 승인되어 있는 것, 및 blinatumomab를 비롯한 복수의 BiTE가 강한 항종양 효과를 발휘하는 것으로부터, T 세포를 이펙터 세포로서 동원하는 TR 항체에는, 통상의 ADCC를 그 작용 메커니즘으로 하는 항체에 비해서 매우 높은 항종양약으로서의 가능성이 있는 것이 시사되었다.
그러나, trifunctional 항체가 암 항원 비의존적으로 T 세포와 NK 세포나 대식세포 등의 세포와 동시에 결합하는 결과, 이들 세포에 발현하는 수용체가 가교됨으로써, 암 항원 비의존적인 각종 사이토카인의 발현을 유도하는 것이 알려져 있다. 이러한 사이토카인의 발현의 유도는, trifunctional 항체의 전신 투여에 의한 사이토카인 폭풍 유사 부작용의 발생으로 이어질 것으로 생각된다. 실제, 비소세포 폐암 환자에 대한 catumaxomab의 전신 투여에 의한 제1상 임상시험에 있어서는, 5 ㎍/body라고 하는 매우 낮은 용량이 최대 허용 투여량이고, 그 이상의 용량의 투여에 의해 각종 심각한 부작용이 일어나는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 12). 이러한 낮은 용량의 catumaxomab의 투여에 의해서는, 그 유효 혈중 농도에는 도저히 도달할 수 없다. 즉, 이러한 낮은 용량의 catumaxomab의 투여에 의해서는 기대되는 항종양 작용이 얻어지지 않는다.
한편, BiTE는 catumaxomab와는 달리 Fcγ 수용체에 대한 결합 부위를 갖지 않기 때문에, 암 항원 비의존적으로 T 세포와 NK 세포나 대식세포 등에 발현하는 수용체가 가교되는 경우는 없다. 그 때문에, catumaxomab가 투여된 경우에 관찰된 암 항원 비의존적인 사이토카인의 유도는 일어나지 않는 것이 나타내어져 있다. 그러나, BiTE는 Fc 영역이 빠진 저분자량형의 개변 항체 분자이기 때문에, 치료용 항체로서 통상 사용되는 IgG형의 항체와 비교해서, 환자에 투여된 BiTE의 혈중 반감기는 현저하게 짧다고 하는 문제점이 존재한다. 실제, 생체에 투여된 BiTE의 혈중 반감기는 수시간 정도인 것이 나타내어져 있어(비특허문헌 13, 14), blinatumomab의 임상시험에 있어서는 미니 펌프를 사용한 지속 정맥 내 투여에 의해 blinatumomab의 투여가 행해지고 있다. 이러한 투여는 환자에게 있어서 현저하게 편리성이 좋지 못한 투여법일 뿐 아니라, 기기의 고장 등에 의한 의료사고의 위험도 잠재하여, 바람직한 치료법이라고는 할 수 없다.
Clin Cancer Res. (2010) 16 (1), 11-20 Drug Des Devel Ther (2009) 3, 7-16 Nature (1985) 314 (6012), 628-31 Int J Cancer (1988) 41 (4), 609-15. Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83 (5), 1453-7 Cancer Treat Rev. (2010) 36 (6), 458-67 Expert Opin Biol Ther (2010) 10 (8), 1259-69 Proc Natl Acad Sci USA. (1995) 92 (15), 7021-5 Drug Discov Today (2005), 10 (18), 1237-44 Trends Biotechnol (2004) 22 (5), 238-44 Science (2008), 321 (5891), 974-7 Cancer Immunol Immunother. (2007) 56 (10), 1637-44 Cancer Immunol Immunother. (2006) 55(5), 503-14 Cancer Immunol Immunother. (2009) 58(1), 95-109
본 발명은 상기의 정황을 감안하여 이루어진 것으로서, T 세포를 표적 암세포에 근접시켜 T 세포에 의한 표적 암세포에 대한 세포상해 활성을 통해서 암을 치료하는 것을 가능하게 하는 폴리펩티드 회합체, 당해 폴리펩티드 회합체의 제조방법, 및 당해 폴리펩티드 회합체를 유효성분으로서 포함하는 세포상해 유도 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 당해 세포상해 유도 치료제를 유효성분으로서 포함하는, 각종 암을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물 또는 당해 의약 조성물을 사용하는 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, BiTE가 갖는 강한 항종양 활성과, 암 항원 비의존적으로 사이토카인 폭풍 등을 유도하지 않는다고 하는 안전성 상의 우수한 성질이 유지되고, 또한 긴 혈중 반감기를 갖는 새로운 폴리펩티드 회합체를 발견하였다. 또한, 폴리펩티드 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인을 치환함으로써, 당해 폴리펩티드 회합체가 각종 세포를 표적으로 하여 세포상해를 일으키는 것을 발견하였다. 본 발명자들은, 이러한 발견을 토대로 하여, 본 발명의 폴리펩티드 회합체가 암세포를 상해하는 것을 명확하게 하였다. 또한, 폴리펩티드 회합체에, CH1/CL 계면 회합 제어 도입 및 Knob into Hole(KiH) 개변을 도입함으로써, 더욱 효율적으로 세포상해를 일으키는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, 본 발명의 폴리펩티드 회합체를 유효성분으로 하는 세포상해 유도 치료제가, 각종 암을 치료 또는 예방하는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은 이하를 제공하는 것이다.
〔1〕 하기의 도메인;
(1) 항원 결합 도메인,
(2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역을 포함하는 도메인, 및
(3) T 세포 수용체 복합체 결합 도메인,
을 포함하는 폴리펩티드 회합체.
〔2〕 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T 세포 수용체 결합 도메인인, 〔1〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔3〕 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인, 〔1〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔4〕 항원 결합 도메인이 2가의 항원 결합 도메인인, 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔5〕 2가의 항원 결합 도메인이 F(ab')2의 구조를 갖는 도메인인, 〔4〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔6〕 F(ab')2의 구조를 갖는 도메인의 중쇄 정상영역(constant region)을 구성하는 2개의 폴리펩티드가 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 각각에 연결된, 〔5〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔7〕 CD3 결합 도메인이 Fc 영역을 구성하는 1개 또는 2개의 CH3에 연결된, 〔6〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔8〕 CD3 결합 도메인을 구성하는 중쇄 Fv 단편이 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 CH3에 연결되고, CD3 결합 도메인을 구성하는 경쇄 Fv 단편이 Fc 영역을 구성하는 다른 한쪽의 CH3에 연결된, 〔7〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔9〕 CD3 결합 도메인을 구성하는 중쇄 Fv 단편에 항체의 CH1 도메인, 및 경쇄 Fv 단편에 항체의 CL 도메인이 연결된, 〔8〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔10〕 CD3 결합 도메인이 F(ab')2를 구성하는 1개 또는 2개의 CL에 연결된, 〔6〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔11〕 CD3 결합 도메인이 F(ab')2를 구성하는 1개 또는 2개의 VH에 연결된, 〔6〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔12〕 CD3 결합 도메인이 F(ab')2를 구성하는 1개 또는 2개의 VL에 연결된, 〔6〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔13〕 CD3 결합 도메인이 Fv인, 〔1〕 내지 〔12〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔14〕 CD3 결합 도메인이 Fab인, 〔1〕 내지 〔7〕 및 〔10〕 내지 〔12〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔15〕 CD3 결합 도메인이 scFv인, 〔1〕 내지 〔7〕 및 〔10〕 내지 〔12〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔16〕 CD3 결합 도메인이 1가인, 〔1〕 내지 〔15〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔17〕 항원 결합 도메인이 1가의 scFv 및 1가의 Fab인, 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔18〕 1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 scFv를 매개로 Fc 영역을 구성하는 1개의 폴리펩티드에, 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 1개의 폴리펩티드에 각각 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된, 〔17〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔19〕 항원 결합 도메인이 2가의 scFv인, 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔20〕 1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 중쇄 Fv 단편을 매개로 Fc 영역을 구성하는 1개의 폴리펩티드에, 다른 쪽의 1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 경쇄 Fv 단편을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 1개의 폴리펩티드에 연결된, 〔19〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔21〕 1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 scFv를 매개로 Fc 영역을 구성하는 1개의 폴리펩티드에, 다른 쪽의 1가의 scFv가 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 1개의 폴리펩티드에 연결된, 〔19〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔22〕 항원 결합 도메인, 및 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 각각 1가의 Fab인, 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔23〕 항원 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된, 〔22〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔24〕 항원 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된, 〔22〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔25〕 항원 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역과 연결된, 〔22〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔26〕 T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, 항원 결합 도메인을 구성하는 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된, 〔22〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔27〕 T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, 항원 결합 도메인을 구성하는 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역과 연결된, 〔22〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔28〕 (1) 항원에 결합하는 1가의 Fab 구조의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 상기 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab 구조의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 항원 결합 도메인, 및
(2) T 세포 수용체 복합체에 결합하는 1가의 Fab 구조의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab 구조의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인,
을 포함하는 폴리펩티드 회합체로서, 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편과 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편 또는 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편과 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편이 회합하도록 CH1 영역과 CL 영역의 전하가 제어되어 있는, 〔22〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔29〕 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종(同種)의 전하를 갖는, 〔28〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔30〕 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖는, 〔28〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔31〕 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖고, 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖는, 〔28〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔32〕 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 이종(異種)의 전하를 갖는, 〔29〕 또는 〔31〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔33〕 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 모두 이종의 전하를 갖는, 〔30〕 또는 〔31〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔34〕 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T 세포 수용체 결합 도메인인, 〔22〕 내지 〔33〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔35〕 T 세포 수용체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인, 〔34〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔36〕 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 CL 영역의 아미노산 잔기가, 이하의 (a)~(f)에 나타내어지는 1조(組) 또는 2조 이상의 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군;
(a) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치의 아미노산 잔기,
(b) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 131번 위치의 아미노산 잔기
(c) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 164번 위치의 아미노산 잔기
(d) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 138번 위치의 아미노산 잔기
(e) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기
(f) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 175번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 160번 위치의 아미노산 잔기
으로부터 선택되며, CH1 영역의 아미노산 잔기와 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 이종의 전하를 갖는 아미노산 잔기인, 〔32〕 또는 〔33〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔37〕 추가로, 이하의 (g)에 나타내어지는 아미노산 잔기의 조를 포함하는 군으로부터 선택되는, 〔36〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
(g) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 213번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기
〔38〕 상기 이종의 전하를 갖는 아미노산 잔기가, 이하의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군;
(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D);
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H);
에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는, 〔36〕 또는 〔37〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔39〕 상기 이종의 전하를 갖는 아미노산 잔기가, CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 175번 위치의 아미노산 잔기가 Lys, CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 Glu인, 〔36〕 내지 〔38〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔40〕 상기 이종의 전하를 갖는 아미노산 잔기가, CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치 및 175번 위치의 아미노산 잔기가 Glu, CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 Lys인, 〔36〕 내지 〔38〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔41〕 추가로, CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 213번 위치의 아미노산 잔기가 Glu이고, CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기가 Lys인, 〔40〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔42〕 Fc 영역이 FcγI, FcγIIA, FcγIIB, FcγIIIA 및/또는 FcγIIIB 중 어느 하나의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역인, 〔1〕 내지 〔41〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔43〕 Fc 영역이, 서열번호：23에 기재된 Fc 영역, 서열번호：24에 기재된 Fc 영역, 서열번호：25에 기재된 Fc 영역, 또는 서열번호：26에 기재된 Fc 영역을 구성하는 아미노산이 변이되어 있는 Fc 영역인 것을 특징으로 하는, 〔1〕 내지 〔42〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔44〕 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산;
118번 위치부터 260번 위치의 아미노산 서열이 서열번호：24에 기재된 서열, 261번 위치부터 447번 위치의 아미노산 서열이 서열번호：26에 기재된 서열인, 〔43〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔45〕 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산;
220번 위치, 226번 위치, 229번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 325번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치,
이 변이되어 있는 Fc 영역인, 〔43〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔46〕 Fc 영역이 서열번호：23에 기재된 Fc 영역을 구성하는 아미노산이 변이되어 있는 Fc 영역인 것을 특징으로 하는, 〔45〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔47〕 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산;
233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 327번 위치, 330번 위치, 331번 위치
이 대응하는 IgG2 또는 IgG4에 있어서 그 EU 넘버링이 대응하는 아미노산으로 치환된 Fc 영역인, 〔46〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔48〕 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산;
234번 위치, 235번 위치, 297번 위치
이 변이되어 있는 Fc 영역인 것을 특징으로 하는, 〔46〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔49〕 234번 위치의 아미노산이 알라닌, 235번 위치의 아미노산이 알라닌, 및/또는, 297번 위치의 아미노산이 알라닌으로 변이되어 있는 것을 특징으로 하는, 〔48〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔50〕 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 서열이 서로 상이한 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 〔43〕 내지 〔49〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔51〕 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 349번 위치의 아미노산이 시스테인, 366번 위치의 아미노산이 트립토판으로, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 356번 위치의 아미노산이 시스테인, 366번 위치의 아미노산이 세린으로, 368번 위치의 아미노산이 알라닌으로, 407번 위치의 아미노산이 발린으로 변이되어 있는 것을 특징으로 하는, 〔1〕 내지 〔50〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔52〕 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 356번 위치의 아미노산이 리신으로, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 439번 위치의 아미노산이 글루타민산으로 변이되고, 어느 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 435번 위치의 아미노산이 아르기닌으로 변이되어 있는 것을 특징으로 하는, 〔1〕 내지 〔50〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔53〕 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 카르복시 말단에 존재하는 서열 GK가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는, 〔51〕 또는 〔52〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔54〕 항원 결합 도메인이 동일한 에피토프에 결합하는, 〔1〕 내지 〔53〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔55〕 동일한 에피토프가 서열번호：2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재하는, 〔54〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔56〕 동일한 에피토프가 서열번호：4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재하는, 〔54〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔57〕 항원 결합 도메인이 서로 상이한 에피토프에 결합하는, 〔1〕 내지 〔53〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔58〕 상이한 에피토프가 서열번호：2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재하는, 〔57〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔59〕 상이한 에피토프가 서열번호：4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재하는, 〔57〕에 기재된 폴리펩티드 회합체.
〔60〕 〔1〕 내지 〔59〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
〔61〕 〔60〕에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
〔62〕 〔61〕에 기재된 벡터를 보유하는 세포.
〔63〕 〔62〕에 기재된 세포를 배양하여 배양상청으로부터 폴리펩티드 회합체를 회수하는 것을 포함하는 폴리펩티드 회합체의 제조방법.
〔64〕 〔1〕 내지 〔59〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체를 유효성분으로서 포함하는 세포상해 유도 치료제.
〔65〕 세포상해 유도 치료제가 암 치료제인, 〔64〕에 기재된 치료제.
〔66〕 암이 간암 또는 폐암인, 〔65〕에 기재된 치료제.
〔67〕 〔1〕 내지 〔59〕 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 회합체를 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 암의 치료 또는 예방방법.
〔68〕 암이 간암 또는 폐암인, 〔67〕에 기재된 치료 또는 예방방법.
또한 본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드 회합체 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 폴리펩티드 회합체를 포함하는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드 회합체 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 폴리펩티드 회합체의, 세포상해 유도 치료제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 본 발명의 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 폴리펩티드 회합체 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 폴리펩티드 회합체에 관한 것이다.
본 발명에 의해서, BiTE가 갖는 강한 항종양 활성과, 암 항원 비의존적으로 사이토카인 폭풍 등을 유도하지 않는다고 하는 안전성 상의 우수한 성질이 유지되며, 또한 긴 혈중 반감기를 갖는 새로운 폴리펩티드 회합체가 제공되었다. 본 발명의 폴리펩티드 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인을 치환함으로써, 당해 폴리펩티드 회합체를 유효성분으로서 포함하는 세포상해 유도 치료제가 암세포를 포함하는 각종 세포를 표적으로 하여 세포상해를 일으켜서, 각종 암을 치료 또는 예방할 수 있다. 환자에게 있어서도, 안전성이 높을 뿐 아니라, 신체적 부담이 적어 편리성도 높다고 하는, 바람직한 치료가 가능해진다.
도 1은 GPC3 ERY1(GPC3 BiTE), GPC3 ERY2, IgG형 GPC3 항체의 세포상해 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 검은 사각(■)은 GPC3 ERY1(GPC3 BiTE), 검은 삼각(▲)은 GPC3 ERY2, 하얀 사각(□)은 IgG형 GPC3 항체의 세포상해 활성을 각각 나타낸다.
도 2는 GPC3 BiTE, GPC3 ERY5의 세포상해 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 검은 사각(■)은 GPC3 BiTE, 하얀 동그라미(○)는 GPC3 ERY5의 세포상해 활성을 각각 나타낸다.
도 3은 GPC3 BiTE, GPC3 ERY6의 세포상해 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 검은 사각(■)은 GPC3 BiTE, 검은 삼각(▲)은 GPC3 ERY6의 세포상해 활성을 각각 나타낸다.
도 4는 GPC3 BiTE, GPC3 ERY7의 세포상해 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 검은 사각(■)은 GPC3 BiTE, 검은 마름모(◆)는 GPC3 ERY7의 세포상해 활성을 각각 나타낸다.
도 5는 GPC3 BiTE, GPC3 ERY8-2, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1의 세포상해 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 검은 사각(■)은 GPC3 BiTE, 검은 삼각(▲)은 GPC3 ERY8-2, 하얀 동그라미(○)는 GPC3 ERY9-1, 하얀 사각(□)은 GPC3 ERY10-1의 세포상해 활성을 각각 나타낸다.
도 6은 PC-10 pre-mix 모델에 있어서의 GPC3 ERY8-2의 인 비보(in vivo) 항종양 효과를 나타내는 그래프이다. 하얀 사각(□)은 GPC3 ERY7 투여군의 종양 체적의 변화를 나타낸다. 검은 마름모(◆)는 대조군(PBS 투여)의 종양 체적의 변화를 나타낸다.
도 7은 PC-10 pre-mix 모델에 있어서의 GPC3 ERY10-1의 in vivo 항종양 효과를 나타내는 그래프이다. 하얀 사각(□)은 GPC3 ERY10-1 투여군의 종양 체적의 변화를 나타낸다. 검은 마름모(◆)는 대조군(PBS 투여)의 종양 체적의 변화를 나타낸다.
도 8은 PC-10 T 세포 이입 모델에 있어서의 GPC3 ERY10-1의 in vivo 항종양 효과를 나타내는 그래프이다. 하얀 사각(□)은 GPC3 ERY10-1 투여군의 종양 체적의 변화를 나타낸다. 검은 마름모(◆)는 대조군(PBS 투여)의 종양 체적의 변화를 나타낸다.
도 9는 GPC3 발현 Ba/F3 세포를 사용하여 측정한 GPC3 ERY9-1 및 GPC3 ERY10-1의 혈장중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 검은 마름모(◆)는 GPC3 ERY9-1, 하얀 사각(□)은 GPC3 ERY10-1의 혈장중 농도의 추이를 나타낸다.
도 10은 CD3 발현 Ba/F3 세포를 사용하여 측정한 GPC3 ERY9-1 및 GPC3 ERY10-1의 혈장중 농도의 추이를 나타내는 그래프이다. 검은 마름모(◆)는 GPC3 ERY9-1, 하얀 사각(□)은 GPC3 ERY10-1의 혈장중 농도의 추이를 나타낸다.
도 11은 GPC3 BiTE, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1, GPC3 ERY15-1, 및 catumaxomab에 의한 암 항원 비의존적인 사이토카인 유도능의 평가를 나타내는 그래프이다.
도 12는 GPC3 ERY18 L1, GPC3 ERY18L2, GPC3 ERY18L3, GPC3 ERY18L4, GPC3 ERY18S1의 인 비트로(in vitro) 세포상해 활성을 나타내는 그래프이다. 검은 삼각(▲)은 GPC3 ERY18 L1, 검은 동그라미(●)는 GPC3 ERY18 L2, 검은 사각(■)은 GPC3 ERY18 L3, 하얀 사각(□)은 GPC3 ERY18 L4, 하얀 마름모(◇)는 GPC3 ERY18 S1의 세포상해 활성을 나타낸다.
도 13은 GPC3 ERY18 L3와 GPC3 ERY10-1의 in vitro 세포상해 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 검은 사각(■)은 GPC3 ERY18 L3, 하얀 사각(□)은 GPC3 ERY10-1의 세포상해 활성을 나타낸다.
도 14는 GPC3 ERY19-3와 GPC3 BiTE의 in vitro 세포상해 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 하얀 사각(□)은 GPC3 ERY19-3, 검은 사각(■)은 GPC3 BiTE의 세포상해 활성을 나타낸다.
도 15는 A. NTA1L/NTA1R/GC33-k0를 발현시킨 CM의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석의 결과를 나타내는 크로마토그램이다. B. NTA2L/NTA2R/GC33-k0를 발현시킨 CM의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석의 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 16은 본원 명세서의 실시예에 기재되는 폴리펩티드 회합체인 GPC3 BiTE, GPC3 ERY2, GPC3 ERY5, GPC3 ERY6, GPC3 ERY7, GPC3 ERY8-2, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY 10-1, GPC3 ERY15, GPC3 ERY18, 및 GPC3 ERY19-3를 구성하는 각 도메인의 표시이다; 교차선으로 표시되는 도메인은 항암 항원(GPC3, EpCAM, EGFR) 항체 H쇄 가변영역, 사선으로 표시되는 도메인은 항암 항원(GPC3, EpCAM, EGFR) 항체 L쇄 가변영역, 점선으로 표시되는 도메인은 항CD3 항체 H쇄 가변영역, 검정 칠로 표시되는 도메인은 항CD3 항체 L쇄 가변영역, 흰 칠로 표시되는 도메인은 항체 정상영역, X자는 사일런트 Fc 변이(silent Fc mutation), 별 표시는 헤테로 Fc를 회합화시키는 변이를 각각 나타낸다.
도 17은 A：GPC3 BiTE의 모식도, B：GPC3 ERY 10의 모식도, C：GPC3 ERY2의 모식도, D：GPC3 ERY5의 모식도, E：GPC3 ERY6의 모식도, F：GPC3 ERY7의 모식도, G：GPC3 ERY8-2의 모식도, H：GPC3 ERY9-1의 모식도, I：GPC3 ERY10-1의 모식도, J：GPC3 ERY15의 모식도, K：GPC3 ERY18의 모식도, L：GPC3 ERY19-3의 모식도를 나타낸다.
도 18은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 잔기와, kabat의 EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU INDEX로도 불린다)의 관계를 나타낸다.
도 19는 본원 명세서의 실시예에 기재되는 폴리펩티드 회합체인 GPC3 ERY17-2, GPC3 ERY17-3, EpCAM ERY17-2, 및 EpCAM ERY17-3를 구성하는 각 도메인의 표시이다; 교차선으로 표시되는 도메인은 항암 항원(GPC3, EpCAM, EGFR) 항체 H쇄 가변영역, 사선으로 표시되는 도메인은 항암 항원(GPC3, EpCAM, EGFR) 항체 L쇄 가변영역, 점선으로 표시되는 도메인은 항CD3 항체 H쇄 가변영역, 검정 칠로 표시되는 도메인은 항CD3 항체 L쇄 가변영역, 흰 칠로 표시되는 도메인은 항체 정상영역, X자는 사일런트 Fc 변이, 별 표시는 헤테로 Fc를 회합화시키는 변이를 각각 나타낸다.
도 20은 GPC3 BiTE, GPC3 ERY17-2, GPC3 ERY17-3, GPC3 ERY10-1의 세포상해 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 검은 사각(■)은 GPC3 BiTE, 검은 삼각(▲)은 GPC3 ERY17-2, 하얀 동그라미(○)는 GPC3 ERY17-3, 하얀 사각(□)은 GPC3 ERY10-1의 세포상해 활성을 각각 나타낸다.
도 21은 PC-10 T 세포 이입 모델에 있어서의 GPC3 ERY17-2의 in vivo 항종양 효과를 나타내는 그래프이다. 하얀 사각(□)은 GPC3 ERY17-2 투여군의 종양 체적의 변화를 나타낸다. 검은 마름모(◆)는 대조군(PBS 투여)의 종양 체적의 변화를 나타낸다.
도 22는 GPC3 ERY17-2, GPC3 ERY17-2-M20의 세포상해 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 검은 삼각(▲)은 GPC3 ERY17-2, 하얀 동그라미(○)는 GPC3 ERY17-2-M20의 세포상해 활성을 각각 나타낸다.
도 23은 EpCAM ERY17-2, EpCAM ERY17-3의 세포상해 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 검은 삼각(▲)은 EpCAM ERY17-2, 하얀 사각(□)은 EpCAM ERY17-3의 세포상해 활성을 각각 나타낸다.
도 24는 본원 명세서의 실시예에 기재되는 폴리펩티드 회합체인 GM1 또는 GM2, 및 GM0를 구성하는 각 도메인의 표시이다. CH1/CL 계면 회합 제어가 도입되고, 또한 Knob into Hole(KiH)의 개변이 도입된 폴리펩티드 회합체를 A, CH1/CL 계면 회합 제어도 KiH도 도입되어 있지 않은 폴리펩티드 회합체를 B로 나타내었다; 교차선으로 표시되는 도메인은 항암 항원(GPC3, EpCAM) 항체 H쇄 가변영역, 사선으로 표시되는 도메인은 항암 항원(GPC3, EpCAM) 항체 L쇄 가변영역, 점선으로 표시되는 도메인은 항CD3 항체 H쇄 가변영역, 검정 칠로 표시되는 도메인은 항CD3 항체 L쇄 가변영역, 흰 칠로 표시되는 도메인은 항체 정상영역, X자는 사일런트 Fc 변이, 별 표시는 헤테로 Fc를 회합화시키는 변이, 도넛 모양은 CH1/CL 계면 회합 제어가 도입된 변이를 각각 나타낸다.
도 25는 GM1, GM2, GM0의 세포상해 활성의 비교를 나타내는 그래프이다. 검은 삼각(▲)은 GM1, 하얀 사각(□)은 GM2, 하얀 동그라미(○)는 GM0의 세포상해 활성을 각각 나타낸다.
도 26은 EGFR ERY17-2의 세포상해 활성을 나타내는 그래프이다. 검은 삼각(▲)은 EGFR ERY17-2의 세포상해 활성을 나타낸다.
이하의 정의는, 본 명세서에 있어서 설명하는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해서 제공된다.
항체
본 명세서에 있어서 항체란, 천연의 것이거나 또는 부분적 또는 완전 합성에 의해 제조된 면역 글로불린을 말한다. 항체는 그것이 천연으로 존재하는 혈장이나 혈청 등의 천연 자원이나 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 배양상청으로부터 단리될 수 있고, 또는 유전자 재조합 등의 수법을 사용함으로써 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 항체의 예로서는 면역 글로불린의 아이소타입 및 그들 아이소타입의 서브클래스를 바람직하게 들 수 있다. 인간의 면역 글로불린으로서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM의 9종류의 클래스(아이소타입)가 알려져 있다. 본 발명의 항체에는, 이들 아이소타입 중 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가 포함될 수 있다.
목적하는 결합 활성을 갖는 항체를 제작하는 방법은 당업자에 있어서 공지이다. 이하에, GPI 앵커형 수용체 패밀리에 속하는, GPC3(Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65)에 결합하는 항체(항GPC3 항체)를 제작하는 방법이 예시된다. GPC3 이외의 항원에 결합하는 항체도 하기의 예시에 준하여 적당히 제작될 수 있다.
항GPC3 항체는, 공지의 수단을 사용하여 다중클론 또는 단일클론 항체로서 취득될 수 있다. 항GPC3 항체로서는, 포유동물 유래의 단일클론 항체가 바람직하게 제작될 수 있다. 포유동물 유래의 단일클론 항체에는, 하이브리도마에 의해 생산되는 것, 및 유전자 공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환한 숙주세포에 의해 생산되는 것 등이 포함된다.
단일클론 항체 생산 하이브리도마는, 공지 기술을 사용함으로써, 예를 들면 이하와 같이 제작될 수 있다. 즉, GPC3 단백질을 감작 항원으로서 사용하여, 통상의 면역방법에 따라서 포유동물이 면역된다. 얻어지는 면역세포가 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합된다. 다음으로, 통상의 스크리닝법에 의해, 단일클론 항체 생산 세포를 스크리닝함으로써 항GPC3 항체를 생산하는 하이브리도마가 선택될 수 있다.
구체적으로는, 단일클론 항체의 제작은 예를 들면 이하에 나타내는 바와 같이 행해진다. 먼저, RefSeq 등록번호 NM_001164617.1(서열번호：1)에 그의 뉴클레오티드 서열이 개시된 GPC3 유전자를 발현함으로써, 항체 취득의 감작 항원으로서 사용되는 RefSeq 등록번호 NP_001158089.1(서열번호：2)로 표시되는 GPC3 단백질이 취득될 수 있다. 즉, GPC3를 코드하는 유전자 서열을 공지의 발현 벡터에 삽입함으로써 적당한 숙주세포가 형질전환된다. 당해 숙주세포 중 또는 배양상청 중으로부터 목적하는 인간 GPC3 단백질이 공지의 방법으로 정제된다. 배양상청 중으로부터 가용형의 GPC3를 취득하기 위해서는, 예를 들면, 서열번호：2로 표시되는 GPC3 폴리펩티드 서열 중, GPC3가 세포막 상에 계류되기 위해 사용되는 GPI 앵커 서열에 상당하는 소수성 영역을 구성하는 564-580 아미노산을 결실한 단백질이 서열번호：2로 표시되는 GPC3 단백질 대신에 발현된다. 또한, 정제한 천연의 GPC3 단백질도 또한 동일하게 감작 항원으로서 사용될 수 있다.
포유동물에 대한 면역에 사용하는 감작 항원으로서 당해 정제 GPC3 단백질을 사용할 수 있다. GPC3의 부분 펩티드 또한 감작 항원으로서 사용할 수 있다. 이때, 그 부분 펩티드는 인간 GPC3의 아미노산 서열로부터 화학합성으로도 취득될 수 있다. 또한, GPC3 유전자의 일부를 발현 벡터에 삽입하여 발현시킴으로써도 취득될 수 있다. 더 나아가서는 단백질 분해효소를 사용하여 GPC3 단백질을 분해함으로써도 취득될 수 있으나, 부분 펩티드로서 사용하는 GPC3 펩티드의 영역 및 크기는 특별한 태양에 한정되지 않는다. 바람직한 영역은 서열번호：2의 아미노산 서열에 있어서 564-580 아미노산에 상당하는 아미노산 서열로부터 임의의 서열이 선택될 수 있다. 감작 항원으로 하는 펩티드를 구성하는 아미노산의 수는 적어도 5 이상, 예를 들면 6 이상, 또는 7 이상인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는 8~50, 바람직하게는 10~30 잔기의 펩티드가 감작 항원으로서 사용될 수 있다.
또한, GPC3 단백질의 목적하는 부분 폴리펩티드나 펩티드를 상이한 폴리펩티드와 융합한 융합 단백질이 감작 항원으로서 이용될 수 있다. 감작 항원으로서 사용되는 융합 단백질을 제조하기 위해, 예를 들면, 항체의 Fc 단편이나 펩티드 태그 등이 바람직하게 이용될 수 있다. 융합 단백질을 발현하는 벡터는, 목적하는 2종류 또는 그 이상의 폴리펩티드 단편을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되고, 당해 융합 유전자가 상기와 같이 발현 벡터에 삽입됨으로써 제작될 수 있다. 융합 단백질의 제작방법은 Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab. press)에 기재되어 있다. 감작 항원으로서 사용되는 GPC3의 취득방법 및 그것을 사용한 면역방법은, WO2003/000883, WO2004/022754, WO2006/006693 등에도 구체적으로 기재되어 있다.
그 감작 항원으로 면역되는 포유동물로서는, 특정 동물에 한정되는 것은 아니나, 세포융합에 사용되는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다. 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터, 또는 토끼, 원숭이 등이 바람직하게 사용된다.
공지의 방법에 따라 상기 동물이 감작 항원에 의해 면역된다. 예를 들면, 일반적인 방법으로서, 감작 항원이 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사에 의해 투여됨으로써 면역이 실시된다. 구체적으로는, PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당한 희석배율로 희석된 감작 항원이, 목적하는 바에 따라 통상의 애쥬번트, 예를 들면 프로인트 완전 애쥬번트와 혼합되어, 유화된 후에, 그 감작 항원이 포유동물에 4~21일마다 수회 투여된다. 또한, 감작 항원의 면역시에는 적당한 담체가 사용될 수 있다. 특히 분자량이 작은 부분 펩티드가 감작 항원으로서 사용되는 경우에는, 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 등의 담체 단백질과 결합한 그 감작 항원 펩티드를 면역하는 것이 바람직한 경우도 있다.
또한, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는, DNA 면역을 사용하여, 이하와 같이 해서도 제작될 수 있다. DNA 면역이란, 면역동물 중에서 항원 단백질을 코드하는 유전자가 발현될 수 있는 태양으로 구축된 벡터 DNA가 투여된 당해 면역동물 중에서, 감작 항원이 당해 면역동물의 생체내에서 발현됨으로써, 면역 자극이 부여되는 면역방법이다. 단백질 항원이 면역동물에 투여되는 일반적인 면역방법과 비교하여, DNA 면역에는, 다음과 같은 우위성이 기대된다.
-GPC3와 같은 막 단백질의 구조를 유지하고 면역 자극이 부여될 수 있다
-면역 항원을 정제할 필요가 없다
DNA 면역에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 얻기 위해, 먼저, GPC3 단백질을 발현하는 DNA가 면역동물에 투여된다. GPC3를 코드하는 DNA는, PCR 등의 공지의 방법에 의해 합성될 수 있다. 얻어진 DNA가 적당한 발현 벡터에 삽입되어, 면역동물에 투여된다. 발현 벡터로서는, 예를 들면 pcDNA3.1 등의 시판의 발현 벡터가 바람직하게 이용될 수 있다. 벡터를 생체에 투여하는 방법으로서, 일반적으로 사용되고 있는 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터가 흡착된 금 입자가, gene gun으로 면역동물 개체의 세포 내에 도입됨으로써 DNA 면역이 행해진다. 또한, GPC3를 인식하는 항체의 제작은 국제공개 WO2003/104453에 기재된 방법을 사용해도 제작될 수 있다.
이와 같이 포유동물이 면역되고, 혈청 중에 있어서의 GPC3에 결합하는 항체 역가의 상승이 확인된 후에, 포유동물로부터 면역세포가 채취되어, 세포융합에 제공된다. 바람직한 면역세포로서는, 특히 비장세포가 사용될 수 있다.
상기 면역세포와 융합되는 세포로서, 포유동물의 골수종 세포가 사용된다. 골수종 세포는, 스크리닝을 위한 적당한 선택 마커를 구비하고 있는 것이 바람직하다. 선택 마커란, 특정 배양 조건하에서 생존할 수 있는(또는 할 수 없는) 형질을 가리킨다. 선택 마커에는, 히포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스페라아제 결손(이하 HGPRT 결손으로 생략한다), 또는 티미딘키나아제 결손(이하 TK 결손으로 생략한다) 등이 공지이다. HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, 히포크산틴-아미노프테린-티미딘 감수성(이하 HAT 감수성으로 생략한다)을 갖는다. HAT 감수성의 세포는 HAT 선택 배지 중에서 DNA 합성을 행할 수 없어 사멸되지만, 정상의 세포와 융합하면 정상 세포의 샐비지 회로를 이용하여 DNA의 합성을 계속할 수 있기 때문에 HAT 선택 배지 중에서도 증식되게 된다.
HGPRT 결손이나 TK 결손의 세포는, 각각 6 티오구아닌, 8 아자구아닌(이하 8AG로 생략한다), 또는 5'-브로모데옥시우리딘을 포함하는 배지에서 선택될 수 있다. 이들 피리미딘 아날로그를 DNA 중에 삽입하는 정상의 세포는 사멸된다. 한편, 이들의 피리미딘 아날로그를 삽입할 수 없는 이들의 효소를 결손한 세포는, 선택 배지 중에서 생존할 수 있다. 이 밖에 G418 내성으로 불리는 선택 마커는, 네오마이신 내성 유전자에 의해 2-데옥시스트렙타민계 항생물질(겐타마이신 유사체)에 대한 내성을 부여한다. 세포융합에 적합한 각종의 골수종 세포가 공지이다.
이러한 골수종 세포로서, 예를 들면, P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979) 123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81, 1-7), NS-1(C. Eur. J. Immunol.(1976) 6 (7), 511-519), MPC-11(Cell(1976) 8 (3), 405-415), SP2/0(Nature(1978) 276 (5685), 269-270), FO(J. Immunol. Methods(1980) 35 (1-2), 1-21), S194/5.XX0.BU.1(J. Exp. Med.(1978) 148 (1), 313-323), R210(Nature(1979) 277 (5692), 131-133) 등이 바람직하게 사용될 수 있다.
기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면, 쾰러와 밀스테인등의 방법(Methods Enzymol.(1981)73, 3-46) 등에 준하여, 상기 면역세포와 골수종 세포의 세포융합이 행해진다.
보다 구체적으로는, 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양배양액 중에서, 상기 세포융합이 실시될 수 있다. 융합 촉진제로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 추가로 융합효율을 높이기 위해 목적하는 바에 따라 디메틸설폭시드 등의 보조제가 첨가되어 사용된다.
면역세포와 골수종 세포의 사용비율은 임의로 설정될 수 있다. 예를 들면, 골수종 세포에 대해서 면역세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면, 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이 종의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용되고, 또한, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액이 적합하게 첨가될 수 있다.
세포융합은, 상기 면역세포와 골수종 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하여, 사전에 37℃ 정도로 가온된 PEG 용액(예를 들면 평균 분자량 1000~6000 정도)이 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가된다. 혼합액이 완만하게 혼합됨으로써 목적하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 이어서, 상기에 예로 든 적당한 배양액이 축차 첨가되고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등이 제거될 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간(통상, 이러한 충분한 시간은 수일 내지 수 주간이다) 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속될 수 있다. 이어서, 통상의 한계희석법에 의해, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시된다.
이와 같이 하여 얻어지는 하이브리도마는, 세포융합에 사용된 골수종이 갖는 선택 마커에 따른 선택 배양액을 이용함으로써 선택될 수 있다. 예를 들면 HGPRT나 TK의 결손을 갖는 세포는, HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)으로 배양함으로써 선택될 수 있다. 즉, HAT 감수성의 골수종 세포를 세포융합에 사용한 경우, HAT 배양액 중에서, 정상 세포와의 세포융합에 성공한 세포가 선택적으로 증식될 수 있다. 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸되기에 충분한 시간, 상기 HAT 배양액을 사용한 배양이 계속된다. 구체적으로는, 일반적으로, 수일 내지 수 주간의 배양에 의해, 목적하는 하이브리도마가 선택될 수 있다. 이어서, 통상의 한계희석법에 의해, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝이 실시될 수 있다.
목적하는 항체의 스크리닝 및 단일 클로닝이, 공지의 항원 항체 반응에 기초하는 스크리닝방법에 의해 바람직하게 실시될 수 있다. 예를 들면, GPC3에 결합하는 단일클론 항체는, 세포 표면에 발현된 GPC3에 결합할 수 있다. 이러한 단일클론 항체는, 예를 들면, FACS(fluorescence activated cell sorting)에 의해 스크리닝될 수 있다. FACS는, 형광 항체와 접촉시킨 세포를 레이저광으로 해석하여, 개개의 세포가 발하는 형광을 측정함으로써 세포 표면에 대한 항체의 결합을 측정하는 것을 가능하게 하는 시스템이다.
FACS에 의해 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해서는, 먼저 GPC3를 발현하는 세포를 조제한다. 스크리닝하기 위한 바람직한 세포는, GPC3를 강제 발현시킨 포유동물세포이다. 숙주세포로서 사용한 형질전환되어 있지 않은 포유동물세포를 대조로서 사용함으로써, 세포 표면의 GPC3에 대한 항체의 결합 활성이 선택적으로 검출될 수 있다. 즉, 숙주세포에 결합하지 않고, GPC3 강제 발현 세포에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택함으로써, GPC3 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마가 취득될 수 있다.
또는 고정화한 GPC3 발현 세포에 대한 항체의 결합 활성이 ELISA의 원리를 토대로 평가될 수 있다. 예를 들면, ELISA 플레이트의 웰에 GPC3 발현 세포가 고정화된다. 하이브리도마의 배양상청을 웰 내의 고정화 세포에 접촉시켜, 고정화 세포에 결합하는 항체가 검출된다. 단일클론 항체가 마우스 유래인 경우, 세포에 결합한 항체는, 항마우스 이뮤노 글로불린 항체에 의해 검출될 수 있다. 이들의 스크리닝에 의해 선택된, 항원에 대한 결합능을 갖는 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마는, 한계희석법 등에 의해 클로닝될 수 있다.
이와 같이 하여 제작되는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양될 수 있다. 또한, 그 하이브리도마는 액체질소 중에서 장기에 걸쳐 보존될 수 있다.
당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양상청으로부터 목적하는 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시키고, 그의 복수로부터 단일클론 항체가 취득될 수 있다. 전자의 방법은, 고순도의 항체를 얻기에 적합한 것이다.
당해 하이브리도마 등의 항체 생산 세포로부터 클로닝되는 항체 유전자에 의해 코드되는 항체도 바람직하게 이용될 수 있다. 클로닝한 항체 유전자를 적당한 벡터에 삽입하여 숙주에 도입함으로써, 당해 유전자에 의해 코드되는 항체가 발현된다. 항체 유전자의 단리와, 벡터로의 도입, 그리고 숙주세포의 형질전환을 위한 방법은 예를 들면, Vandamme 등에 의해 이미 확립되어 있다(Eur.J. Biochem.(1990)192 (3), 767-775). 하기에 기술하는 바와 같이 재조합 항체의 제조방법도 또한 공지이다.
예를 들면, 항GPC3 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터, 항GPC3 항체의 가변영역(V 영역)을 코드하는 cDNA가 취득된다. 그 때문에, 통상, 먼저 하이브리도마로부터 전체 RNA가 추출된다. 세포로부터 mRNA를 추출하기 위한 방법으로서, 예를 들면 다음과 같은 방법을 이용할 수 있다.
-구아니딘 초원심법(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
-AGPC법(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
추출된 mRNA는, mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등을 사용하여 정제될 수 있다. 또는, QuickPrep mRNA Purification Kit(GE 헬스케어 바이오사이언스 제조) 등과 같이, 세포로부터 직접 전체 mRNA를 추출하기 위한 키트도 시판되고 있다. 이러한 키트를 사용하여, 하이브리도마로부터 mRNA가 취득될 수 있다. 얻어진 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체 V 영역을 코드하는 cDNA가 합성될 수 있다. cDNA는 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학 공업사 제조) 등에 의해 합성될 수 있다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 위해, SMART RACE cDNA 증폭 키트(Clontech 제조) 및 PCR을 사용한 5'-RACE법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002, Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932)이 적당히 이용될 수 있다. 또한 이러한 cDNA의 합성과정에 있어서 cDNA의 양말단에 후술하는 적절한 제한효소 사이트가 도입될 수 있다.
얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 cDNA 단편이 정제되고, 이어서 벡터 DNA와 연결된다. 이와 같이 재조합 벡터가 제작되고, 대장균 등에 도입되어 콜로니가 선택된 후에, 그 콜로니를 형성한 대장균으로부터 목적하는 재조합 벡터가 조제될 수 있다. 그리고, 그 재조합 벡터가 목적으로 하는 cDNA의 염기서열을 가지고 있는지 여부에 대해서, 공지의 방법, 예를 들면, 디데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션법 등에 의해 확인된다.
가변영역을 코드하는 유전자를 취득하기 위해서는, 가변영역 유전자 증폭용 프라이머를 사용한 5'-RACE법을 이용하는 것이 간편하다. 먼저 하이브리도마 세포로부터 추출된 RNA를 주형으로 하여 cDNA가 합성되고, 5'-RACE cDNA 라이브러리가 얻어진다. 5'-RACE cDNA 라이브러리의 합성에는 SMART RACE cDNA 증폭 키트 등 시판의 키트가 적당히 사용된다.
얻어진 5'-RACE cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, PCR법에 의해 항체 유전자가 증폭된다. 공지의 항체 유전자 서열을 토대로 마우스 항체 유전자 증폭용 프라이머가 디자인될 수 있다. 이들 프라이머는, 이뮤노 글로불린의 서브클래스별로 상이한 염기서열이다. 따라서, 서브클래스는 사전에 Iso Strip 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트(로슈 다이어그노스틱스) 등의 시판 키트를 사용하여 결정해 두는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 예를 들면 마우스 IgG를 코드하는 유전자의 취득을 목적으로 할 때는, 중쇄로서 γ1, γ2a, γ2b, γ3, 경쇄로서 κ쇄와 λ쇄를 코드하는 유전자의 증폭이 가능한 프라이머가 이용될 수 있다. IgG의 가변영역 유전자를 증폭하기 위해서는, 일반적으로 3'측의 프라이머에는 가변영역에 가까운 정상영역에 상당하는 부분에 어닐링하는 프라이머가 이용된다. 한편 5'측의 프라이머에는, 5' RACE cDNA 라이브러리 제작 키트에 부속되는 프라이머가 이용된다.
이렇게 하여 증폭된 PCR 산물을 이용하여, 중쇄와 경쇄의 조합으로 이루어지는 면역 글로불린이 재구성될 수 있다. 재구성된 이뮤노 글로불린의, GPC3에 대한 결합 활성을 지표로 하여, 목적하는 항체가 스크리닝될 수 있다. 예를 들면 GPC3에 대한 항체의 취득을 목적으로 할 때, 항체의 GPC3에 대한 결합은, 특이적인 것이 더욱 바람직하다. GPC3에 결합하는 항체는, 예를 들면 다음과 같이 하여 스크리닝될 수 있다;
(1) 하이브리도마로부터 얻어진 cDNA에 의해 코드되는 V 영역을 포함하는 항체를 GPC3 발현 세포에 접촉시키는 공정,
(2) GPC3 발현 세포와 항체의 결합을 검출하는 공정, 및
(3) GPC3 발현 세포에 결합하는 항체를 선택하는 공정.
항체와 GPC3 발현 세포의 결합을 검출하는 방법은 공지이다. 구체적으로는, 앞서 기술한 FACS 등의 수법에 의해, 항체와 GPC3 발현 세포의 결합이 검출될 수 있다. 항체의 결합 활성을 평가하기 위해 GPC3 발현 세포의 고정 표본이 적당히 이용될 수 있다.
결합 활성을 지표로 하는 항체의 스크리닝방법으로서, 파지 벡터를 이용한 패닝법도 바람직하게 사용된다. 다중클론 항체 발현 세포군으로부터 항체 유전자를 중쇄와 경쇄의 서브클래스의 라이브러리로서 취득한 경우에는, 파지 벡터를 이용한 스크리닝방법이 유리하다. 중쇄와 경쇄의 가변영역을 코드하는 유전자는, 적당한 링커 서열로 연결함으로써 싱글 체인 Fv(scFv)를 형성할 수 있다. scFv를 코드하는 유전자를 파지 벡터에 삽입함으로써, scFv를 표면에 발현하는 파지가 취득될 수 있다. 이 파지와 목적하는 항원의 접촉 후에, 항원에 결합한 파지를 회수함으로써, 목적의 결합 활성을 갖는 scFv를 코드하는 DNA가 회수될 수 있다. 이 조작을 필요에 따라 반복함으로써, 목적하는 결합 활성을 갖는 scFv가 농축될 수 있다.
목적으로 하는 항GPC3 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA가 얻어진 후에, 당해 cDNA의 양말단에 삽입한 제한효소 사이트를 인식하는 제한효소에 의해 그 cDNA가 소화된다. 바람직한 제한효소는, 항체 유전자를 구성하는 염기서열에 출현하는 빈도가 낮은 염기서열을 인식하여 소화한다. 또한 1 카피의 소화 단편을 벡터에 바른 방향으로 삽입하기 위해서는, 부착 말단을 부여하는 제한효소의 삽입이 바람직하다. 상기와 같이 소화된 항GPC3 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA를 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써, 항체 발현 벡터가 취득될 수 있다. 이때, 항체 정상영역(C 영역)을 코드하는 유전자와, 상기 V 영역을 코드하는 유전자가 인프레임으로 융합되면, 키메라 항체가 취득된다. 여기서, 키메라 항체란, 정상영역과 가변영역의 유래가 상이한 것을 말한다. 따라서, 마우스-인간 등의 이종(異種) 키메라 항체에 더하여, 인간-인간 동종(同種) 키메라 항체도, 본 발명에 있어서의 키메라 항체에 포함된다. 사전에 정상영역을 갖는 발현 벡터에, 상기 V 영역 유전자를 삽입함으로써, 키메라 항체 발현 벡터가 구축될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 목적하는 항체 정상영역(C 영역)을 코드하는 DNA를 보유한 발현 벡터의 5'측에, 상기 V 영역 유전자를 소화하는 제한효소의 제한효소 인식서열이 적당히 배치될 수 있다. 동일한 조합의 제한효소로 소화된 양자가 인프레임으로 융합됨으로써, 키메라 항체 발현 벡터가 구축된다.
항GPC3 단일클론 항체를 제조하기 위해서, 항체 유전자가 발현 제어영역에 의한 제어하에서 발현되도록 발현 벡터에 삽입된다. 항체를 발현하기 위한 발현 제어영역이란, 예를 들면, 인핸서나 프로모터를 포함한다. 또한, 발현된 항체가 세포외로 분비되도록, 적절한 시그날 서열이 아미노 말단에 부가될 수 있다. 뒤에 기재되는 실시예에서는 시그날 서열로서, 아미노산 서열 MGWSCIILFLVATATGVHS(서열번호：72)를 갖는 펩티드가 사용되고 있는데, 이것 이외에도 적합한 시그날 서열이 부가된다. 발현된 폴리펩티드는 상기 서열의 카르복실 말단 부분에서 절단되고, 절단된 폴리펩티드가 성숙 폴리펩티드로서 세포외로 분비될 수 있다. 이어서, 이 발현 벡터에 의해 적당한 숙주세포가 형질전환됨으로써, 항GPC3 항체를 코드하는 DNA를 발현하는 재조합 세포가 취득될 수 있다.
항체 유전자 발현을 위해, 항체 중쇄(H쇄) 및 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA는, 각각 다른 발현 벡터에 삽입된다. H쇄와 L쇄가 삽입된 벡터에 의해, 동일 숙주세포에 동시에 형질전환(co-transfect)됨으로써, H쇄와 L쇄를 구비한 항체 분자가 발현될 수 있다. 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA가 단일의 발현 벡터에 삽입됨으로써 숙주세포가 형질전환될 수 있다(국제공개 WO 94/11523을 참조할 것).
단리된 항체 유전자를 적당한 숙주에 도입함으로써 항체를 제작하기 위한 숙주세포와 발현 벡터의 많은 조합이 공지이다. 이들의 발현계는, 모두 본 발명의 항원 결합 도메인이나 CD3 결합 도메인을 단리하는 데에 응용될 수 있다. 진핵세포가 숙주세포로서 사용되는 경우, 동물세포, 식물세포, 또는 진균세포가 적당히 사용될 수 있다. 구체적으로는, 동물세포로서는, 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.
(1) 포유류세포：CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), Hela, Vero 등
(2) 양서류세포：아프리카 발톱개구리 난모세포 등
(3) 곤충세포：sf9, sf21, Tn5 등
또는 식물세포로서는, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아나(Nicotiana)속 유래의 세포에 의한 항체 유전자의 발현계가 공지이다. 식물세포의 형질전환에는, 캘러스 배양한 세포가 적당히 이용될 수 있다.
또한 진균세포로서는, 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다.
-효모：사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces serevisiae) 등의 사카로미세스(Saccharomyces)속, 메탄올 자화 효모(Pichia pastoris) 등의 Pichia속
-사상균：아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스(Aspergillus)속
또한, 원핵세포를 이용한 항체 유전자의 발현계도 공지이다. 예를 들면, 세균세포를 사용하는 경우, 대장균(E. coli), 고초균 등의 세균세포가 적당히 이용될 수 있다. 이들 세포 중에, 목적으로 하는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터가 형질전환에 의해 도입된다. 형질전환된 세포를 in vitro에서 배양함으로써, 당해 형질전환 세포의 배양물로부터 목적하는 항체가 취득될 수 있다.
재조합 항체의 생산에는, 상기 숙주세포에 더하여, 형질전환 동물도 이용될 수 있다. 즉 목적하는 항체를 코드하는 유전자가 도입된 동물로부터, 당해 항체를 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체 유전자는, 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 내부에 인프레임으로 삽입함으로써 융합 유전자로서 구축될 수 있다. 유즙 중에 분비되는 단백질로서, 예를 들면, 염소 β카제인 등을 이용할 수 있다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편은 염소의 배(embryo)로 주입되고, 당해 주입된 배가 암컷의 염소로 도입된다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소(또는 그의 자손)이 생산하는 유즙으로부터는, 목적하는 항체가 유즙 단백질과의 융합 단백질로서 취득될 수 있다. 또한, 형질전환 염소로부터 생산되는 목적하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해, 호르몬이 형질전환 염소에 대해서 투여될 수 있다(Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702).
본 명세서에 있어서 기재되는 폴리펩티드 회합체가 인간에 투여되는 경우, 당해 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인으로서, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체 유래의 항원 결합 도메인이 적당히 채용될 수 있다. 유전자 재조합형 항체에는, 예를 들면, 인간화(Humanized) 항체 등이 포함된다. 이들 개변 항체는, 공지의 방법을 사용하여 적당히 제조된다.
본 명세서에 있어서 기재되는 폴리펩티드 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인을 제조하기 위해서 사용되는 항체의 가변영역은, 통상, 4개의 프레임워크 영역(FR) 사이에 끼인 3개의 상보성 결정영역(complementarity-determining region; CDR)으로 구성되어 있다. CDR은 실질적으로 항체의 결합 특이성을 결정하고 있는 영역이다. CDR의 아미노산 서열은 다양성이 풍부하다. 한편 FR을 구성하는 아미노산 서열은, 상이한 결합 특이성을 갖는 항체 사이에서도 높은 동일성을 나타내는 것이 많다. 그 때문에, 일반적으로, CDR의 이식에 의해, 어떤 항체의 결합 특이성을, 다른 항체에 이식할 수 있는 것으로 되어 있다.
인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체라고도 칭해진다. 구체적으로는, 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는, 마우스의 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서, 예를 들면 Overlap Extension PCR이 공지이다. Overlap Extension PCR에 있어서는, 인간 항체의 FR을 합성하기 위한 프라이머에, 이식 대상 마우스 항체의 CDR을 코드하는 염기서열이 부가된다. 프라이머는 4개의 FR의 각각에 대해서 준비된다. 일반적으로, 마우스 CDR의 인간 FR에 대한 이식에 있어서는, 마우스의 FR과 동일성이 높은 인간 FR을 선택하는 것이, CDR의 기능 유지에 있어서 유리하다고 되어 있다. 즉, 일반적으로, 이식 대상 마우스 CDR에 인접해 있는 FR의 아미노산 서열과 동일성이 높은 아미노산 서열로 이루어지는 인간 FR을 이용하는 것이 바람직하다.
또한 연결되는 염기서열은, 서로 인프레임으로 접속되도록 디자인된다. 각각의 프라이머에 의해 인간 FR이 개별적으로 합성된다. 그 결과, 각 FR에 마우스 CDR을 코드하는 DNA가 부가된 산물이 얻어진다. 각 산물의 마우스 CDR을 코드하는 염기서열은, 서로 오버랩되도록 디자인되어 있다. 계속해서, 인간 항체 유전자를 주형으로 하여 합성된 산물의 오버랩된 CDR 부분을 서로 어닐링시켜 상보가닥 합성반응이 행해진다. 이 반응에 의해, 인간 FR이 마우스 CDR의 서열을 매개로 연결된다.
최종적으로 3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 V 영역 유전자는, 그 5'말단과 3'말단에 어닐링하여 적당한 제한효소 인식서열이 부가된 프라이머에 의해 그의 전장이 증폭된다. 상기와 같이 얻어진 DNA와 인간 항체 C 영역을 코드하는 DNA를 인프레임으로 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써, 인간형 항체 발현용 벡터를 제작할 수 있다. 그 삽입 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에, 그 재조합 세포를 배양하고, 그 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써, 그 인간화 항체가 그 배양세포의 배양물 중에 생산된다(유럽 특허공개 EP239400, 국제공개 WO1996/002576 참조).
상기와 같이 제작된 인간화 항체의 항원에 대한 결합 활성을 정성적 또는 정량적으로 측정하고, 평가함으로써, CDR을 매개로 연결되었을 때 그 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 인간 항체의 FR을 적합하게 선택할 수 있다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환하는 것도 가능하다. 예를 들면, 마우스 CDR의 인간 FR에 대한 이식에 사용한 PCR법을 응용하여, FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다. 구체적으로는, FR에 어닐링하는 프라이머에 부분적인 염기서열의 변이를 도입할 수 있다. 이러한 프라이머에 의해 합성된 FR에는, 염기서열의 변이가 도입된다. 아미노산을 치환한 변이형 항체의 항원에 대한 결합 활성을 상기 방법으로 측정하여 평가함으로써 목적하는 성질을 갖는 변이 FR 서열이 선택될 수 있다(Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856).
또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역동물로 하여, DNA 면역에 의해 목적하는 인간 항체가 취득될 수 있다.
또한, 인간 항체 라이브러리를 사용하여, 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 V 영역이 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 V 영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V 영역 서열을 목적하는 인간 항체 C 영역의 서열과 인프레임으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에서 예로 든 바와 같은 적합한 발현 세포 중에 도입하고, 그 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).
항원 결합 도메인
본 명세서에 있어서 「항원 결합 도메인」이란, 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 또한 상보적인 영역을 포함하여 이루어지는 항체의 부분을 말한다. 항원의 분자량이 큰 경우, 항체는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있다. 당해 특정 부분은 에피토프라 불린다. 항원 결합 도메인은 하나 또는 복수의 항체의 가변 도메인으로부터 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변영역(VL)과 항체 중쇄 가변영역(VH)을 포함한다. 이러한 항원 결합 도메인의 예로서는, 「scFv(single chain Fv)」, 「단일 사슬 항체(single chain antibody)」, 「Fv」, 「scFv2(single chain Fv 2)」, 「Fab」 또는 「F(ab')2」 등을 바람직하게 들 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인은, 동일 에피토프에 결합할 수 있다. 여기서 동일 에피토프는, 서열번호：2 또는 서열번호：4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다. 또는 본 발명의 폴리펩티드 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인은, 서로 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 여기서 상이한 에피토프는, 서열번호：2 또는 서열번호：4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재할 수 있다.
특이적
특이적이란, 특이적으로 결합하는 분자의 한쪽 분자가 그 하나 또는 복수의 결합하는 상대 쪽의 분자 이외의 분자에 대해서는 전혀 유의한 결합을 나타내지 않는 상태를 말한다. 또한, 항원 결합 도메인이, 어떤 항원 중에 포함되는 복수의 에피토프 중 특정 에피토프에 대해 특이적인 경우에도 사용된다. 또한, 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프가 복수의 상이한 항원에 포함되는 경우에는, 당해 항원 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 회합체는 당해 에피토프를 포함하는 각종 항원과 결합할 수 있다.
항원
본 명세서에 있어서 항원은 특별히 한정되지 않고, CD3를 제외하고 어떤 항원이어도 된다. 항원의 예로서는, 예를 들면, 수용체, 암 항원, MHC 항원, 분화 항원 등을 바람직하게 들 수 있다. 수용체의 예로서는, 예를 들면, 조혈인자 수용체 패밀리, 사이토카인 수용체 패밀리, 티로신키나아제형 수용체 패밀리, 세린/트레오닌키나아제형 수용체 패밀리, TNF 수용체 패밀리, G 단백질 공액형 수용체 패밀리, GPI 앵커형 수용체 패밀리, 티로신포스파타아제형 수용체 패밀리, 접착인자 패밀리, 호르몬 수용체 패밀리 등의 수용체 패밀리에 속하는 수용체 등을 들 수 있다. 이들 수용체 패밀리에 속하는 수용체, 및 그 특징에 관해서는, 다수의 문헌, 예를 들면, Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II" pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., 또는, 미야사카 마사유키 감수, 세포 공학 별책 핸드북 시리즈 「접착인자 핸드북」(1994) (슈준사, 도쿄, 일본) 등의 리뷰 외에, Patthy(Cell (1990) 61 (1), 13-14), Ullrich 등(Cell (1990) 61 (2), 203-212), Massague(e에는 어큐트 악센트기호가 붙는다)(Cell (1992) 69 (6), 1067-1070), Miyajima 등(Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331), Taga 등(FASEB J. (1992) 6, 3387-3396), Fantl 등(Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481), Smith 등(Cell (1994) 76 (6) 959-962), Flower DR. Biochim. Biophys. Acta, Flower(Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3) 207-234 등에 기재되어 있다.
상기 수용체 패밀리에 속하는 구체적인 수용체로서는, 예를 들면, 인간 또는 마우스 에리트로포이에틴(EPO) 수용체(Blood (1990) 76 (1), 31-35, Cell (1989) 57 (2), 277-285), 인간 또는 마우스 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706, ㎎-CSFR, Cell (1990) 61 (2), 341-350), 인간 또는 마우스 트롬보포이에틴(TPO) 수용체(Proc Natl Acad Sci USA. (1992) 89 (12), 5640-5644, EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53), 인간 또는 마우스 인슐린 수용체(Nature (1985) 313 (6005), 756-761), 인간 또는 마우스 Flt-3 리간드 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463), 인간 또는 마우스 혈소판 유래 증식인자(PDGF) 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439), 인간 또는 마우스 인터페론(IFN)-α, β 수용체(Cell (1990) 60 (2), 225-234. 및 Cell (1994) 77 (3), 391-400), 인간 또는 마우스 렙틴 수용체, 인간 또는 마우스 성장 호르몬(GH) 수용체, 인간 또는 마우스 인터류킨(IL)-10 수용체, 인간 또는 마우스 인슐린 유사 증식인자(IGF)-I 수용체, 인간 또는 마우스 백혈병 억제인자(LIF) 수용체, 인간 또는 마우스 모양체 신경 영양인자(CNTF) 수용체 등이 바람직하게 예시된다.
암 항원은 세포의 악성화에 수반하여 발현되는 항원으로, 종양 특이성 항원이라고도 불린다. 또한, 세포가 암화되었을 때에 세포 표면이나 단백질 분자 상에 나타나는 이상한 당쇄도 암 항원으로, 암 당쇄 항원이라고도 불린다. 암 항원의 예로서는, 예를 들면, 상기의 수용체로서 GPI 앵커형 수용체 패밀리에 속하지만 간암을 비롯한 몇 가지 암에 있어서 발현되고 있는 GPC3(Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65), 폐암을 비롯한 복수의 암에서 발현되는 EpCAM(Proc Natl Acad Sci USA. (1989) 86 (1), 27-31)(그의 폴리뉴클레오티드 서열은 RefSeq 등록번호 NM_002354.2(서열번호：3)에, 폴리펩티드 서열은 RefSeq 등록번호 NP_002345.2(서열번호：4)에 각각 기재되어 있다.), EGFR, CA19-9, CA15-3, 시알릴 SSEA-1(SLX) 등을 바람직하게 들 수 있다.
MHC 항원은, 주로 MHC class I 항원과 MHC class II 항원으로 분류되고, MHC class I 항원에는, HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, -H가 포함되고, MHC class II 항원에는, HLA-DR, -DQ, -DP가 포함된다.
분화 항원에는, CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, CDw130이 포함될 수 있다.
에피토프
항원 중에 존재하는 항원 결정기를 의미하는 에피토프는, 본 명세서에 있어서 개시되는 폴리펩티드 회합체 중의 항원 결합 도메인이 결합하는 항원 상의 부위를 의미한다. 따라서, 예를 들면, 에피토프는 그 구조에 의해 정의될 수 있다. 또한, 당해 에피토프를 인식하는 폴리펩티드 회합체 중의 항원에 대한 결합 활성에 따라서도 당해 에피토프가 정의될 수 있다. 항원이 펩티드 또는 폴리펩티드인 경우에는, 에피토프를 구성하는 아미노산 잔기에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다. 또한, 에피토프가 당쇄인 경우에는, 특정의 당쇄 구조에 의해 에피토프를 특정하는 것도 가능하다.
직선상 에피토프는 아미노산 1차 서열이 인식된 에피토프를 포함하는 에피토프이다. 직선상 에피토프는 전형적으로는, 3개 이상 및 가장 보통으로는 5개 이상, 예를 들면 약 8 내지 약 10개, 6 내지 20개의 아미노산이 고유의 서열에 있어서 포함된다.
입체구조 에피토프는, 직선상 에피토프와는 대조적으로, 에피토프를 포함하는 아미노산의 1차 서열이, 인식된 에피토프의 단일 규정 성분이 아닌 에피토프(예를 들면, 아미노산의 1차 서열이, 반드시 에피토프를 규정하는 항체에 의해 인식되는 것은 아닌 에피토프)이다. 입체구조 에피토프는, 직선상 에피토프에 대해서 증대된 수의 아미노산을 포함할지도 모른다. 입체구조 에피토프의 인식에 관하여, 항체는, 펩티드 또는 단백질의 3차원 구조를 인식한다. 예를 들면, 단백질 분자가 폴딩되어 3차원 구조를 형성하는 경우에는, 입체구조 에피토프를 형성하는 어떤 아미노산 및/또는 폴리펩티드 주쇄는 병렬로 되어, 항체가 에피토프를 인식하는 것을 가능하게 한다. 에피토프의 입체구조를 결정하는 방법에는, 예를 들면 X선 결정학, 2차원 핵자기공명 분광학 및 부위 특이적인 스핀 표지 및 전자 상자성 공명 분광학이 포함되는데, 이들에는 한정되지 않는다. 예를 들면, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), 제66권, Morris(편)를 참조.
하기에 GPC3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체에 의한 에피토프로에 대한 결합의 확인방법이 예시되는데, GPC3 이외의 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체에 의한 에피토프에 대한 결합의 확인방법도 하기의 예시에 준하여 적절히 실시될 수 있다.
예를 들면, GPC3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체가, GPC3 분자 중에 존재하는 선상 에피토프를 인식하는 것은, 예를 들면 다음과 같이 하여 확인할 수 있다. 상기의 목적을 위해 GPC3의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상의 펩티드가 합성된다. 당해 펩티드는, 화학적으로 합성될 수 있다. 또는, GPC3의 cDNA 중의, 세포외 도메인에 상당하는 아미노산 서열을 코드하는 영역을 이용하여, 유전자 공학적 수법에 의해 얻어진다. 다음으로, 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드와, GPC3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체의 결합 활성이 평가된다. 예를 들면, 고정화된 선상 펩티드를 항원으로 하는 ELISA에 의해, 당해 펩티드에 대한 당해 폴리펩티드 회합체의 결합 활성이 평가될 수 있다. 또는, GPC3 발현 세포에 대한 당해 폴리펩티드 회합체의 결합에 있어서의, 선상 펩티드에 의한 저해의 레벨을 토대로, 선상 펩티드에 대한 결합 활성이 명확해질 수 있다. 이들 시험에 의해, 선상 펩티드에 대한 당해 폴리펩티드 회합체의 결합 활성이 명확해질 수 있다.
또한, GPC3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체가 입체구조 에피토프를 인식하는 것은, 다음과 같이 하여 확인될 수 있다. 상기 목적을 위해, GPC3를 발현하는 세포가 조제된다. GPC3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체가 GPC3 발현 세포에 접촉했을 때에 당해 세포에 강하게 결합하는 한편, 당해 폴리펩티드 회합체가 고정화된 GPC3의 세포외 도메인을 구성하는 아미노산 서열로 이루어지는 선상 펩티드에 대해 실질적으로 결합하지 않을 때 등을 들 수 있다. 여기서, 실질적으로 결합하지 않는다는 것은, 인간 GPC3 발현 세포에 대한 결합 활성의 80% 이하, 통상 50% 이하, 바람직하게는 30% 이하, 특히 바람직하게는 15% 이하의 결합 활성을 말한다.
GPC3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체의 GPC3 발현 세포에 대한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면, Antibodies A Laboratory Manual에 기재의 방법(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420)을 들 수 있다. 즉, GPC3 발현 세포를 항원으로 하는 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting)의 원리에 의해 평가될 수 있다.
ELISA 포맷에 있어서, GPC3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체의 GPC3 발현 세포에 대한 결합 활성은, 효소반응에 의해 생성되는 시그날 레벨을 비교함으로써 정량적으로 평가된다. 즉, GPC3 발현 세포를 고정화한 ELISA 플레이트에 피험 폴리펩티드 회합체를 첨가하여, 세포에 결합한 피험 폴리펩티드 회합체가, 피험 폴리펩티드 회합체를 인식하는 효소 표지 항체를 이용하여 검출된다. 또는 FACS에 있어서는, 피험 폴리펩티드 회합체의 희석계열을 제작하여, GPC3 발현 세포에 대한 항체 결합 역가(titer)를 결정함으로써, GPC3 발현 세포에 대한 피험 폴리펩티드 회합체의 결합 활성이 비교될 수 있다.
완충액 등에 현탁한 세포 표면 상에 발현되고 있는 항원에 대한 피험 폴리펩티드 회합체의 결합은, 플로우 사이토미터에 의해 검출할 수 있다. 플로우 사이토미터로서는, 예를 들면, 다음과 같은 장치가 알려져 있다.
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(모두 BD Biosciences사의 상품명)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(모두 Beckman Coulter사의 상품명)
예를 들면, GPC3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체의 항원에 대한 결합 활성의 바람직한 측정방법의 일례로서, 다음의 방법을 들 수 있다. 먼저, GPC3를 발현하는 세포와 반응시킨 피험 폴리펩티드 회합체를 인식하는 FITC 표지한 2차 항체로 염색한다. 피험 폴리펩티드 회합체를 적당히 적합한 완충액으로 희석함으로써, 당해 회합체가 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면, 10 ㎍/㎖부터 10 ng/㎖까지의 사이 중 어느 하나의 농도로 사용될 수 있다. 다음으로, FACSCalibur(BD사)에 의해 형광강도와 세포수가 측정된다. 당해 세포에 대한 항체의 결합량은, CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻음으로써, 피험 폴리펩티드 회합체의 결합량으로 표시되는 피험 폴리펩티드 회합체의 결합 활성이 측정될 수 있다.
GPC3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체가, 어떤 폴리펩티드 회합체와 에피토프를 공유하는 것은, 양자의 동일한 에피토프에 대한 경합에 의해 확인될 수 있다. 폴리펩티드 회합체 간의 경합은, 교차 블로킹 어세이 등에 의해 검출된다. 예를 들면 경합 ELISA 어세이는, 바람직한 교차 블로킹 어세이이다.
구체적으로는, 교차 블로킹 어세이에 있어서는, 마이크로타이터 플레이트의 웰 상에 코트한 GPC3 단백질이, 후보가 되는 경합 폴리펩티드 회합체의 존재하, 또는 비존재하에서 프리인큐베이트된 후에, 피험 폴리펩티드 회합체가 첨가된다. 웰 중의 GPC3 단백질에 결합한 피험 폴리펩티드 회합체의 양은, 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경합하는 후보가 되는 경합 폴리펩티드 회합체의 결합능에 간접적으로 상관하고 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 경합 폴리펩티드 회합체의 친화성이 커지면 커질수록, 피험 폴리펩티드 회합체의 GPC3 단백질을 코트한 웰에 대한 결합 활성은 저하된다.
GPC3 단백질을 매개로 웰에 결합한 피험 폴리펩티드 회합체의 양은, 사전에 폴리펩티드 회합체를 표지해 둠으로써, 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들면, 비오틴 표지된 폴리펩티드 회합체는, 아비딘페록시다아제 콘쥬게이트와 적절한 기질을 사용함으로써 측정된다. 페록시다아제 등의 효소 표지를 이용한 교차 블로킹 어세이는, 특히 경합 ELISA 어세이라 불린다. 폴리펩티드 회합체는, 검출 또는 측정이 가능한 다른 표지 물질로 표지될 수 있다. 구체적으로는, 방사 표지 또는 형광 표지 등이 공지이다.
후보의 경합 폴리펩티드 회합체의 비존재하에서 실시되는 대조 시험에 있어서 얻어지는 결합 활성과 비교하여, 경합 폴리펩티드 회합체가, GPC3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체의 결합을 20% 이상, 바람직하게는 20-50% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상 블록할 수 있다면, 당해 피험 폴리펩티드 회합체는 경합 폴리펩티드 회합체와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경합하는 폴리펩티드 회합체이다.
GPC3에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 피험 폴리펩티드 회합체가 결합하는 에피토프의 구조가 동정되어 있는 경우에는, 피험 폴리펩티드 회합체와 대조 폴리펩티드 회합체가 에피토프를 공유하는 것은, 당해 에피토프를 구성하는 펩티드에 아미노산 변이를 도입한 펩티드에 대한 양자의 폴리펩티드 회합체의 결합 활성을 비교함으로써 평가될 수 있다.
이러한 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면, 상기의 ELISA 포맷에 있어서 변이를 도입한 선상의 펩티드에 대한 피험 폴리펩티드 회합체 및 대조 폴리펩티드 회합체의 결합 활성을 비교함으로써 측정될 수 있다. ELISA 이외의 방법으로서는, 칼럼에 결합한 당해 변이 펩티드에 대한 결합 활성을, 당해 칼럼에 피험 폴리펩티드 회합체와 대조 폴리펩티드 회합체를 유하(流下)시킨 후에 용출액 중에 용출되는 폴리펩티드 회합체를 정량함으로써도 측정될 수 있다. 변이 펩티드를 예를 들면 GST와의 융합 펩티드로서 칼럼에 흡착시키는 방법은 공지이다.
또한, 동정된 에피토프가 입체 에피토프인 경우에는, 피험 폴리펩티드 회합체와 대조 폴리펩티드 회합체가 에피토프를 공유하는 것은, 다음의 방법으로 평가될 수 있다. 먼저, GPC3를 발현하는 세포와 에피토프에 변이가 도입된 GPC3를 발현하는 세포가 조제된다. 이들 세포가 PBS 등의 적당한 완충액에 현탁된 세포 현탁액에 대해 피험 폴리펩티드 회합체와 대조 폴리펩티드 회합체가 첨가된다. 이어서, 적당히 완충액으로 세정된 세포 현탁액에 대해, 피험 폴리펩티드 회합체와 대조 폴리펩티드 회합체를 인식할 수 있는 FITC 표지된 항체가 첨가된다. 표지 항체에 의해 염색된 세포의 형광강도와 세포수가 FACSCalibur(BD사)에 의해 측정된다. 피험 폴리펩티드 회합체와 대조 폴리펩티드 회합체의 농도는 적합한 완충액에 의해 적당히 희석함으로써 목적하는 농도로 조제하여 사용된다. 예를 들면, 10 ㎍/㎖부터 10 ng/㎖까지의 사이 중 어느 하나의 농도로 사용된다. 당해 세포에 대한 표지 항체의 결합량은, CELL QUEST Software(BD사)를 사용하여 해석함으로써 얻어진 형광강도, 즉 Geometric Mean의 값에 반영된다. 즉, 당해 Geometric Mean의 값을 얻음으로써, 표지 항체의 결합량으로 표시되는 피험 폴리펩티드 회합체와 대조 폴리펩티드 회합체의 결합 활성을 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 예를 들면 「변이 GPC3 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」다는 것은, 이하의 방법에 의해 판단할 수 있다. 먼저, 변이 GPC3를 발현하는 세포에 대해 결합한 피험 폴리펩티드 회합체와 대조 폴리펩티드 회합체를, 표지 항체로 염색한다. 이어서 세포의 형광강도를 검출한다. 형광 검출에 플로우 사이토메트리로서 FACSCalibur를 사용한 경우, 얻어진 형광강도는 CELL QUEST Software를 사용하여 해석될 수 있다. 폴리펩티드 회합체 존재하 및 비존재하에서의 Geometric Mean의 값으로부터, 이 비교값(ΔGeo-Mean)을 하기의 계산식을 토대로 산출함으로써, 폴리펩티드 회합체의 결합에 의한 형광강도의 증가비율을 구할 수 있다.
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(폴리펩티드 회합체 존재하)/Geo-Mean(폴리펩티드 회합체 비존재하)
해석에 의해 얻어지는 피험 폴리펩티드 회합체의 변이 GPC3 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 Geometric Mean 비교값(변이 GPC3 분자 ΔGeo-Mean값)을, 피험 폴리펩티드 회합체의 GPC3 발현 세포에 대한 결합량이 반영된 ΔGeo-Mean 비교값과 비교한다. 이 경우에 있어서, 변이 GPC3 발현 세포 및 GPC3 발현 세포에 대한 ΔGeo-Mean 비교값을 구할 때 사용하는 피험 폴리펩티드 회합체의 농도는 서로 동일 또는 실질적으로 동일 농도로 조정되는 것이 특히 바람직하다. 사전에 GPC3 중의 에피토프를 인식하고 있는 것이 확인된 폴리펩티드 회합체가, 대조 폴리펩티드 회합체로서 이용된다.
피험 폴리펩티드 회합체의 변이 GPC3 발현 세포에 대한 ΔGeo-Mean 비교값이, 피험 폴리펩티드 회합체의 GPC3 발현 세포에 대한 ΔGeo-Mean 비교값의, 80% 이상, 바람직하게는 50%, 더욱 바람직하게는 30%, 특히 바람직하게는 15%보다 작으면, 「변이 GPC3 발현 세포에 실질적으로 결합하지 않는」 것으로 한다. Geo-Mean값(Geometric Mean)을 구하는 계산식은, CELL QUEST Software User's Guide(BD biosciences사)에 기재되어 있다. 비교값을 비교함으로써 그것이 실질적으로 동일하다고 볼 수 있는 정도라면, 피험 폴리펩티드 회합체와 대조 폴리펩티드 회합체의 에피토프는 동일하다고 평가될 수 있다.
Fv( variable fragment )
본 명세서에 있어서, 「Fv(variable fragment)」라는 용어는, 항체의 경쇄 가변영역(VL(light chain variable region))과 항체의 중쇄 가변영역(VH(heavy chain variable region))의 페어로 이루어지는 항체 유래의 항원 결합 도메인의 최소 단위를 의미한다. 1988년에 Skerra와 Pluckthun은, 박테리아의 시그날 서열의 하류에 항체의 유전자를 삽입하여 대장균 중에서 당해 유전자의 발현을 유도함으로써, 균일하고 또한 활성을 유지한 상태에서 대장균의 페리플라즘 분획으로부터 조제되는 것을 발견하였다(Science (1988) 240 (4855), 1038-1041). 페리플라즘 분획으로부터 조제된 Fv는, 항원에 대한 결합을 갖는 태양으로 VH와 VL이 회합하고 있었다.
본 명세서에 있어서, Fv로서는, 예를 들면 이하의 폴리펩티드 회합체;
2가의 scFv 중 1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 중쇄 Fv 단편을 매개로 Fc 영역을 구성하는 1개의 폴리펩티드에, 다른 쪽의 1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 경쇄 Fv 단편을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 1개의 폴리펩티드에 연결된 2가의 항원 결합 도메인이 2가의 scFv인 (1) 2가의 항원 결합 도메인, (2) IgG1, IgG2a, IgG3 또는 IgG4의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성을 갖지 않는 Fc 영역을 포함하는 도메인, 및 (3) 1가 이상의 CD3 결합 도메인,
을 포함하는 폴리펩티드 회합체 등에 있어서 경쇄 Fv 단편 및 중쇄 Fv 단편이, 항원인 CD3에 대한 결합을 갖는 태양으로 회합하여 CD3 결합 도메인을 구성하는 1조의 Fv도 바람직하게 포함된다.
scFv , 단일 사슬 항체, 또는 sc ( Fv )2
본 명세서에 있어서, 「scFv」, 「단일 사슬 항체」, 또는 「sc(Fv)2」라는 용어는, 단일 폴리펩티드 사슬 내에, 중쇄 및 경쇄의 양쪽에 유래하는 가변영역을 포함하지만, 정상영역이 빠져 있는 항체 단편을 의미한다. 일반적으로, 단일 사슬 항체는, 항원 결합을 가능하게 한다고 생각되는 목적하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. 단일 사슬 항체는, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113권, Rosenburg, 및 Moore편, Springer-Verlag, New York, 269~315(1994)에 있어서 Pluckthun에 의해 상세하게 고찰되어 있다. 동일하게, 국제특허 출원공개 WO1988/001649 및 미국특허 제4,946,778호 및 미국특허 제5,260,203호를 참조. 특정 태양에 있어서, 단일 사슬 항체는 또한, 이중 특이성이거나, 또한/또는 인간화될 수 있다.
scFv는 Fv를 구성하는 VH와 VL이 펩티드 링커에 의해 연결된 항원 결합 도메인이다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883). 당해 펩티드 링커에 의해 VH와 VL이 근접한 상태로 유지될 수 있다.
sc(Fv)2는 2개의 VL과 2개의 VH의 4개의 가변영역이 펩티드 링커 등의 링커에 의해 연결되어 단일 사슬을 구성하는 단일 사슬 항체이다(J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189). 이 2개의 VH와 VL은 상이한 단일클론 항체로부터 유래하는 것도 있을 수 있다. 예를 들면, Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374에 개시되는 바와 같은 동일 항원 중에 존재하는 2종류의 에피토프를 인식하는 이중 특이성(bispecific sc(Fv)2)도 바람직하게 들 수 있다. sc(Fv)2는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제작될 수 있다. 예를 들면, scFv를 펩티드 링커 등의 링커로 연결함으로써 제작될 수 있다.
본 명세서에 있어서의 sc(Fv)2를 구성하는 항원 결합 도메인의 구성으로서는, 2개의 VH 및 2개의 VL이, 단일 사슬 폴리펩티드의 N 말단 측을 기점으로 하여 VH, VL, VH, VL([VH]링커[VL]링커[VH]링커[VL])의 순으로 나열되어 있는 것을 특징으로 하는 항체를 들 수 있지만, 2개의 VH와 2개의 VL의 순서는 특별히 상기 구성에 한정되지 않고, 어떤 순서로 나열되어 있어도 된다. 예를 들면 이하와 같은, 순서의 구성도 들 수 있다.
[VL]링커[VH]링커[VH]링커[VL]
[VH]링커[VL]링커[VL]링커[VH]
[VH]링커[VH]링커[VL]링커[VL]
[VL]링커[VL]링커[VH]링커[VH]
[VL]링커[VH]링커[VL]링커[VH]
sc(Fv)2의 분자형태에 대해서는 WO2006/132352에 있어서도 상세하게 기재되어 있어, 당업자라면 이들 기재를 토대로, 본 명세서에서 개시되는 폴리펩티드 회합체의 제작을 위해서 적당히 목적하는 sc(Fv)2를 제작하는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 폴리펩티드 회합체는, PEG 등의 캐리어 고분자나 항암제 등의 유기 화합물을 콘쥬게이트해도 된다. 또한 당쇄 부가 서열을 삽입하고, 당쇄가 목적하는 효과를 얻는 것을 목적으로 하여 적합하게 부가될 수 있다.
항체의 가변영역을 결합하는 링커로서는, 유전자 공학에 의해 도입할 수 있는 임의의 펩티드 링커, 또는 합성 화합물 링커(예를 들면, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996 참조)에 개시되는 링커 등을 사용할 수 있지만, 본 발명에 있어서는 펩티드 링커가 바람직하다. 펩티드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하지만, 바람직한 길이는 5 아미노산 이상(상한은 특별히 한정되지 않지만, 통상, 30 아미노산 이하, 바람직하게는 20 아미노산 이하)이고, 특히 바람직하게는 15 아미노산이다. sc(Fv)2에 3개의 펩티드 링커가 포함되는 경우에는, 전부 동일한 길이의 펩티드 링커를 사용해도 되고, 상이한 길이의 펩티드 링커를 사용해도 된다.
예를 들면, 펩티드 링커의 경우：
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：5)
Ser·Gly·Gly·Gly(서열번호：6)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：7)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：8)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：9)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：10)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：11)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：12)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：7))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(서열번호：8))n
[n은 1 이상의 정수이다] 등을 들 수 있다. 단, 펩티드 링커의 길이나 서열은 목적에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
합성 화합물 링커(화학 가교제)는, 펩티드의 가교에 통상 사용되고 있는 가교제, 예를 들면 N-히드록시숙신이미드(NHS), 디숙신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(설포숙신이미딜) 수베레이트(BS3), 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)(DSP), 디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트)(DTSSP), 에틸렌글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌글리콜비스(설포숙신이미딜숙시네이트)(설포-EGS), 디숙신이미딜 타르타르산염(DST), 디설포숙신이미딜 타르타르산염(설포-DST), 비스[2-(숙신이미독시카르보닐옥시)에틸]설폰(BSOCOES), 비스[2-(설포숙신이미독시카르보닐옥시)에틸]설폰(설포-BSOCOES) 등이고, 이들 가교제는 시판되고 있다.
4개의 항체 가변영역을 결합하는 경우에는, 통상, 3개의 링커가 필요해지나, 전부 동일한 링커를 사용해도 되고, 상이한 링커를 사용해도 된다.
Fab , F( ab' )2, 또는 Fab'
「Fab」는, 단일 경쇄, 및 단일 중쇄의 CH1 영역 및 가변영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는, 다른 중쇄 분자와의 디설피드 결합을 형성할 수 없다.
「F(ab')2」 및 「Fab'」란, 이뮤노 글로불린(단일클론 항체)을 단백질 분해효소인 펩신 또는 파파인 등으로 처리함으로써 제조되고, 힌지영역 중의 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디설피드 결합의 전후에서 소화되어 생성되는 항체 프래그먼트를 의미한다. 예를 들면, IgG를 파파인으로 처리함으로써, 힌지영역 중의 2개의 H쇄 사이에 존재하는 디설피드 결합의 상류에서 절단되어 VL(L쇄 가변영역)과 CL(L쇄 정상영역)로 이루어지는 L쇄, 및 VH(H쇄 가변영역)와 CHγ1(H쇄 정상영역 중의 γ1 영역)로 이루어지는 H쇄 프래그먼트가 C 말단영역에서 디설피드 결합에 의해 결합한 상동인 2개의 항체 프래그먼트가 제조될 수 있다. 이들 2개의 상동인 항체 프래그먼트는 각각 Fab'라 불린다.
「F(ab')2」는, 2개의 경쇄, 및 사슬 간의 디설피드 결합이 2개의 중쇄 간에 형성되도록 CH1 도메인 및 CH2 도메인의 일부분의 정상영역을 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다. 본 명세서에 있어서 개시되는 폴리펩티드 회합체를 구성하는 F(ab')2는, 목적하는 항원 결합 도메인을 갖는 전장 단일클론 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에, Fc 단편을 프로테인 A 칼럼에 흡착시켜 제거함으로써, 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절하게 설정함으로써 제한적으로 F(ab')2를 생성하도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이라면 특단의 한정은 되지 않고, 예를 들면, 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
Fc 영역
본 명세서에 있어서 개시되는 폴리펩티드 회합체를 구성하는 Fc 영역은 단일클론 항체 등의 항체를 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에, 단편을 프로테인 A 칼럼, 또는 프로테인 G 칼럼에 흡착시킨 후에, 적절한 용출 버퍼 등에 의해 용출시킴으로써 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절하게 설정함으로써 단일클론 항체 등의 항체를 소화할 수 있는 것이라면 특단의 한정은 되지 않고, 예를 들면, 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
본 명세서에 기재되는 폴리펩티드 회합체에는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역이 포함된다.
항체의 아이소타입은 정상영역의 구조에 의해 결정된다. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 각 아이소타입의 정상영역은, 각각, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4라 불리고 있다. 인간 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4의 Fc 영역을 구성하는 폴리펩티드의 아미노산 서열이, 서열번호：23, 24, 25, 26에 예시된다. 각 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 잔기와, kabat의 EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU INDEX라고도 불린다)의 관계는 도 18에 나타내어져 있다.
Fc 영역은, 2개의 경쇄, 및 사슬 간의 디설피드 결합이 2개의 중쇄 사이에서 형성되도록 CH1 도메인 및 CH2 도메인 간의 정상영역의 일부분을 포함하는 2개의 중쇄를 포함하는 F(ab')2를 제외한 영역을 말한다. 본 명세서에 있어서 개시되는 폴리펩티드 회합체를 구성하는 Fc 영역은, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에, 프로테인 A 칼럼에 흡착된 분획을 재용출함으로써 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백질 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절하게 설정함으로써 제한적으로 F(ab')2를 생성하도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이라면 특단의 한정은 되지 않고, 예를 들면, 펩신이나 피신 등을 예시할 수 있다.
Fc γ 수용체
Fcγ 수용체란, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체의 Fc 영역에 결합할 수 있는 수용체를 말하고, 실질적으로 Fcγ 수용체 유전자에 코드되는 단백질의 패밀리의 모든 멤버를 의미한다. 인간의 경우는, 이 패밀리에는, 이소형(isoform) FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 이소형 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함한다), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함한다) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 이소형 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함한다)를 포함하는 FcγRIII(CD16), 및 어떠한 미발견의 인간 FcγR류 또는 FcγR 이소형 또는 알로타입도 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. FcγR은, 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이를 포함하지만, 이들에 한정되는 것이 아닌, 어떠한 생물 유래여도 된다. 마우스 FcγR류에는, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및 어떠한 미발견의 마우스 FcγR류 또는 FcγR 이소형 또는 알로타입도 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 Fcγ 수용체의 적합한 예로서는 인간 FcγI(CD64), FcγIIA(CD32), FcγIIB(CD32), FcγIIIA(CD16) 및/또는 FcγIIIB(CD16)를 들 수 있다. FcγI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：13(NM_000566.3) 및 14(NP_000557.1)에, FcγIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：15(BC020823.1) 및 16(AAH20823.1)에, FcγIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：17(BC146678.1) 및 18(AAI46679.1)에, FcγIIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：19(BC033678.1) 및 20(AAH33678.1)에, 및 FcγIIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은, 각각 서열번호：21(BC128562.1) 및 22(AAI28563.1)에 기재되어 있다(괄호 안은 RefSeq 등록번호를 나타낸다). Fcγ 수용체가, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체의 Fc 영역에 결합 활성을 갖는지 여부는, 상기에 기재되는 FACS나 ELISA 포맷 외에, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라스몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등에 의해 확인될 수 있다(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
또한, 「Fc 리간드」 또는 「이펙터 리간드」는, 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는, 임의의 생물에 유래하는 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 리간드의 Fc에 대한 결합은, 바람직하게는, 1개 또는 그것 이상의 이펙터 기능을 유기한다. Fc 리간드에는, Fc 수용체, FcγR, FcαR, FcεR, FcRn, C1q, C3, 만난 결합 렉틴, 만노오스 수용체, 스타필로코커스의 프로테인 A, 스타필로코커스의 단백질 G 및 바이러스의 FcγR이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. Fc 리간드에는, FcγR에 상동인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 상동체(FcRH)(Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136)도 포함된다. Fc 리간드에는, Fc에 결합하는 미발견의 분자도 포함될 수 있다.
Fc γ 수용체에 대한 결합 활성
Fc 영역이 FcγI, FcγIIA, FcγIIB, FcγIIIA 및/또는 FcγIIIB 중 어느 하나의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 것은, 상기에 기재되는 FACS나 ELISA 포맷 외에, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라스몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등에 의해 확인할 수 있다(Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은, 도너와 액셉터의 2개의 비드를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기의 원리를 토대로 실시된다. 도너 비드에 결합한 분자가, 액셉터 비드에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하고, 2개의 비드가 근접한 상태일 때만, 발광 시그날이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비드 내의 감광제(photosensitizer)는, 주변의 산소를 여기 상태의 일중항산소로 변환한다. 일중항산소는 도너 비드 주변에 확산되어, 근접하고 있는 액셉터 비드에 도달하면 비드 내의 화학 발광 반응을 일으켜, 최종적으로 빛이 방출된다. 도너 비드에 결합한 분자와 액셉터 비드에 결합한 분자가 상호작용하지 않을 때는, 도너 비드가 생산하는 일중항산소가 액셉터 비드에 도달하지 않기 때문에, 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들면, 도너 비드에 비오틴 표지된 폴리펩티드 회합체가 결합되고, 액셉터 비드에는 글루타티온 S 트랜스페라아제(GST)로 태그화된 Fcγ 수용체가 결합된다. 경합하는 변이 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체의 비존재하에서는, 야생형 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체와 Fcγ 수용체는 상호작용하여 520-620 ㎚의 시그날을 발생시킨다. 태그화되어 있지 않은 변이 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체는, 야생형 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체와 Fcγ 수용체 간의 상호작용과 경합한다. 경합의 결과 나타나는 형광의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합 친화성이 결정될 수 있다. 항체 등의 폴리펩티드 회합체를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 사용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. Fcγ 수용체를 GST로 태그화하는 방법으로서는, Fcγ 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합한 융합 유전자를 발현 가능한 벡터에 보유한 세포 등에 있어서 발현하고, 글루타티온 칼럼을 사용하여 정제하는 방법 등이 적당히 채용될 수 있다. 얻어진 시그날은 예를 들면 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀 해석을 이용하는 1부위 경합(one-site competition) 모델에 적합시킴으로써 적합하게 해석된다.
상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서칩의 금박막 상에 고정하고, 센서칩의 뒤쪽으로부터 금박막과 유리의 경계면에서 전반사하도록 빛을 조사하면, 반사광의 일부에 반사강도가 저하된 부분(SPR 시그날)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 다른 쪽(애널라이트)을 센서칩의 표면에 흐르게 하여 리간드와 애널라이트가 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질량이 증가하고, 센서칩 표면의 용매의 굴절률이 변화한다. 이 굴절률의 변화에 의해, SPR 시그날의 위치가 시프트된다(반대로 결합이 해리되면 시그날의 위치는 되돌아간다). Biacore 시스템은 상기의 시프트되는 양, 즉 센서칩 표면에서의 질량 변화를 세로축에 취하고, 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램의 커브로부터 키네틱스：결합속도상수(ka)와 해리속도상수(kd)가, 당해 상수의 비로부터 친화성(KD)이 구해진다. BIACORE법에서는 저해 측정법도 적합하게 사용된다. 저해 측정법의 예는 Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 있어서 기재되어 있다.
본 명세서에 있어서, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있다는 것은, 예를 들면, 상기의 해석방법을 토대로, 대조로 하는 폴리펩티드 회합체의 경합 활성과 비교하여 피험 폴리펩티드 회합체의 경합 활성이, 50% 이하, 바람직하게는 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 결합 활성을 나타내는 것을 말한다.
대조로 하는 폴리펩티드 회합체로서는, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 단일클론 항체의 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체가 적절히 사용될 수 있다. 당해 Fc 영역의 구조는, 서열번호：23(RefSeq 등록번호 AAC82527.1의 N 말단에 A 부가), 24(RefSeq 등록번호 AAB59393.1의 N 말단에 A 부가), 25(RefSeq 등록번호 CAA27268.1의 N 말단에 A 부가), 26(RefSeq 등록번호 AAB59394.1의 N 말단에 A 부가)에 기재되어 있다. 또한, 어떤 특정 아이소타입의 항체의 Fc 영역의 변이체를 갖는 폴리펩티드 회합체를 피험 물질로서 사용하는 경우에는, 당해 특정 아이소타입의 항체의 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체를 대조로서 사용함으로써, 당해 변이체가 갖는 변이에 의한 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성에 대한 효과가 검증된다. 상기와 같이 하여, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 것이 검증된 Fc 영역의 변이체를 갖는 폴리펩티드 회합체가 적절히 제작된다.
이러한 변이체의 예로서는, EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산인 231A-238S의 결실(WO 2009/011941), C226S, C229S, P238S, (C220S)(J.Rheumatol (2007) 34, 11), C226S, C229S(Hum.Antibod.Hybridomas (1990) 1(1), 47-54), C226S, C229S, E233P, L234V, L235A(Blood (2007) 109, 1185-1192) 등의 변이체가 공지이다.
즉, 특정 아이소타입의 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산; 220번 위치, 226번 위치, 229번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 325번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치가 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체를 바람직하게 들 수 있다. Fc 영역의 기원인 항체의 아이소타입으로서는 특별히 한정되지 않고, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 단일클론 항체를 기원으로 하는 Fc 영역이 적절히 이용될 수 있지만, IgG1 항체를 기원으로 하는 Fc 영역이 적합하게 이용된다.
예를 들면, IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자의 앞에 위치하는 한 글자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자의 뒤에 위치하는 한 글자의 아미노산 기호가 치환 후의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다);
(a) L234F, L235E, P331S,
(b) C226S, C229S, P238S,
(c) C226S, C229S,
(d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A
이 실시되어 있는 Fc 영역, 또는, 231번 위치부터 238번 위치의 아미노산 서열이 결실된 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체도 적절히 사용될 수 있다.
또한, IgG2 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자의 앞에 위치하는 한 글자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자의 뒤에 위치하는 한 글자의 아미노산 기호가 치환 후의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다);
(e) H268Q, V309L, A330S, P331S
(f) V234A
(g) G237A
(h) V234A, G237A
(i) A235E, G237A
(j) V234A, A235E, G237A
이 실시되어 있는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체도 적절히 사용될 수 있다.
또한, IgG3 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자의 앞에 위치하는 한 글자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자의 뒤에 위치하는 한 글자의 아미노산 기호가 치환 후의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다);
(k) F241A
(l) D265A
(m) V264A
이 실시되어 있는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체도 적절히 사용될 수 있다.
또한, IgG4 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 치환(숫자가 EU 넘버링에 따라 특정되는 아미노산 잔기의 위치, 숫자의 앞에 위치하는 한 글자의 아미노산 기호가 치환 전의 아미노산 잔기, 숫자의 뒤에 위치하는 한 글자의 아미노산 기호가 치환 후의 아미노산 잔기를 각각 나타낸다);
(n) L235A, G237A, E318A
(o) L235E
(p) F234A, L235A
이 실시되어 있는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체도 적절히 사용될 수 있다.
그밖의 바람직한 예로서는, IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산; 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 327번 위치, 330번 위치, 331번 위치가, 대응하는 IgG2 또는 IgG4에 있어서 그 EU 넘버링이 대응하는 아미노산으로 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체를 들 수 있다.
그 밖의 바람직한 예로서는, IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나 또는 그것 이상의 아미노산; 234번 위치, 235번 위치, 297번 위치가 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체를 적합하게 들 수 있다. 치환 후에 존재하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 234번 위치, 235번 위치, 297번 위치 중 어느 하나 또는 그것 이상의 아미노산이 알라닌으로 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체가 특히 바람직하다.
그 밖의 바람직한 예로서는, IgG1 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산; 265번 위치가 다른 아미노산에 의해 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체를 적합하게 들 수 있다. 치환 후에 존재하는 아미노산의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 265번 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환되어 있는 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 회합체가 특히 바람직하다.
이중 특이성 항체 를 기원으로 하는 Fc 영역
본 명세서에 있어서, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역으로서는, 이중 특이성 항체(bispecific 항체)를 기원으로 하는 Fc 영역도 적절히 사용된다. 이중 특이성 항체란, 2개의 상이한 특이성을 갖는 항체이다. IgG형의 이중 특이성 항체는 IgG 항체를 생산하는 하이브리도마 2종을 융합함으로써 생성되는 hybrid hybridoma(quadroma)에 의해 분비시킬 수 있다(Milstein C et al.Nature (1983) 305, 537-540).
또한, IgG형의 이중 특이성 항체는 목적하는 2종의 IgG를 구성하는 L쇄 및 H쇄의 유전자, 합계 4종의 유전자를 세포에 도입하고 그들을 공발현시킴으로써 분비된다. 그러나, 이들 방법으로 생산되는 IgG의 H쇄와 L쇄의 조합은 이론상 10 가지나 된다. 10종류의 IgG로부터 목적하는 조합의 H쇄 L쇄로 이루어지는 IgG를 정제하는 것은 곤란하다. 또한 목적하는 조합인 것의 분비량도 이론상 현저하게 저하되기 때문에, 큰 배양 규모가 필요해져, 제조상의 비용은 더욱 증대된다.
이때 H쇄의 Fc 영역을 구성하는 CH3 영역에 적당한 아미노산 치환을 실시함으로써 H쇄에 대해서 헤테로 조합의 IgG가 우선적으로 분비될 수 있다. 구체적으로는, 한쪽의 H쇄의 CH3 영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob(「돌기」라는 뜻))로 치환하고, 다른 한쪽의 H쇄의 CH3 영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole(「공극」이라는 뜻))로 치환함으로써 돌기가 공극 내에 배치될 수 있도록 하여 이종 H쇄 형성의 촉진 및 동종 H쇄 형성의 저해를 일으키는 방법이다(WO1996/027011, Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).
또한, L쇄에 관해서는, H쇄 가변영역에 비해서 L쇄 가변영역의 다양성이 낮은 것으로부터, 양 H쇄에 결합능을 부여할 수 있는 공통의 L쇄가 얻어지는 것이 기대된다. 이 공통 L쇄와 양 H쇄 유전자를 세포에 도입함으로써 IgG를 발현시킴으로써 효율적인 이중 특이성 IgG의 발현이 가능해진다(Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681). 그러나 임의로 2종의 항체를 선택한 경우, 동일한 L쇄를 포함할 가능성은 낮아 상기의 아이디어를 실행하는 것은 곤란하여, 임의의 상이한 H쇄에 대응하여 높은 결합능을 나타내는 공통 L쇄를 선택하는 방법도 제안되어 있다(WO2004/065611).
또한, 폴리펩티드의 회합, 또는 폴리펩티드에 의해 구성되는 이종 다량체의 회합의 제어방법을, Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 회합에 이용함으로써 이중 특이성 항체를 제작하는 기술도 알려져 있다. 즉, Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드 내의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변함으로써, 동일 서열을 갖는 Fc 영역을 구성하는 폴리펩티드의 회합이 저해되고, 서열이 상이한 2개의 Fc 영역을 구성하는 폴리펩티드 회합체가 형성되도록 제어하는 방법이 이중 특이성 항체의 제작에 채용될 수 있다(WO2006/106905).
본 발명의 Fc 영역을 포함하는 도메인으로서는, 상기의 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드가 적절히 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 349번 위치의 아미노산이 시스테인, 366번 위치의 아미노산이 트립토판이고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 356번 위치의 아미노산이 시스테인, 366번 위치의 아미노산이 세린, 368번 위치의 아미노산이 알라닌, 407번 위치의 아미노산이 발린인 것을 특징으로 하는, 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.
다른 한 태양에 있어서, 본 발명의 Fc 영역을 포함하는 도메인으로서는, Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 409번 위치의 아미노산이 아스파라긴산이고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 399번 위치의 아미노산이 리신인 것을 특징으로 하는, 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다. 상기 태양에서는, 409번 위치의 아미노산은 아스파라긴산 대신 글루타민산, 399번 위치의 아미노산은 리신 대신 아르기닌이어도 된다. 또한, 399번 위치의 리신에 더하여 360번 위치의 아스파라긴산 또는 392번 위치의 아스파라긴산도 적합하게 추가될 수 있다.
다른 태양에 있어서, 본 발명의 Fc 영역을 포함하는 도메인으로서는, Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 370번 위치의 아미노산이 글루타민산이고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 357번 위치의 아미노산이 리신인 것을 특징으로 하는, 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.
또 다른 태양에 있어서, 본 발명의 Fc 영역을 포함하는 도메인으로서는, Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 439번 위치의 아미노산이 글루타민산이고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 356번 위치의 아미노산이 리신인 것을 특징으로 하는, 2개의 폴리펩티드가 적합하게 사용된다.
더 나아가서는 본 발명의 Fc 영역을 포함하는 도메인으로서는, 이들이 조합된 태양;
Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 409번 위치의 아미노산이 아스파라긴산, 370번 위치의 아미노산이 글루타민산이고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 399번 위치의 아미노산이 리신, 357번 위치의 아미노산이 리신인 것을 특징으로 하는, 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는, 370번 위치의 글루타민산 대신 아스파라긴산이어도 되고, 370번 위치의 글루타민산 대신 392번 위치의 아스파라긴산이어도 된다),
Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 409번 위치의 아미노산이 아스파라긴산, 439번 위치의 아미노산이 글루타민산이고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 399번 위치의 아미노산이 리신, 356번 위치의 아미노산이 리신인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는, 439번 위치의 글루타민산 대신 360번 위치의 아스파라긴산, 392번 위치의 아스파라긴산 또는 439번 위치의 아스파라긴산이어도 된다),
Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 370번 위치의 아미노산이 글루타민산, 439번 위치의 아미노산이 글루타민산이고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 357번 위치의 아미노산이 리신, 356번 위치의 아미노산이 리신인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드, 또는,
Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 409번 위치의 아미노산이 아스파라긴산, 370번 위치의 아미노산이 글루타민산, 439번 위치의 아미노산이 글루타민산이고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 399번 위치의 아미노산이 리신, 357번 위치의 아미노산이 리신, 356번 위치의 아미노산이 리신인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드(본 태양에서는, 370번 위치의 아미노산을 글루타민산으로 치환하지 않아도 되고, 또한, 370번 위치의 아미노산을 글루타민산으로 치환하지 않고, 439번 위치의 글루타민산 대신 아스파라긴산 또는 439번 위치의 글루타민산 대신 392번 위치의 아스파라긴산이어도 된다),
가 적합하게 사용된다.
또한, 다른 태양에 있어서, 본 발명의 Fc 영역을 포함하는 도메인으로서는, Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드로서, 그 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 356번 위치의 아미노산이 리신이고, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 435번 위치의 아미노산이 아르기닌, 439번 위치의 아미노산이 글루타민산인 것을 특징으로 하는 2개의 폴리펩티드도 적합하게 사용된다.
본 발명의 Fc 영역을 포함하는 도메인으로서 상기의 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드를 사용함으로써, 본 발명의 항원 결합 도메인 및/또는 CD3 결합 도메인을 목적하는 조합으로 배치하는 것이 가능해진다.
C 말단의 이질성( heterogeneity )이 개선된 Fc 영역
본 명세서에 있어서, Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역으로서, 상기의 특징에 더하여 Fc 영역의 C 말단의 이질성이 개선된 Fc 영역이 적절히 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 기원으로 하는 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 446번 위치의 글리신, 및 447번 위치의 리신이 결실된 Fc 영역이 제공된다.
T 세포 수용체 복합체 결합 도메인
본 명세서에 있어서, 「T 세포 수용체 복합체 결합 도메인」이란, T 세포 수용체 복합체의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 또한 상보적인 영역을 포함하여 이루어지는 T 세포 수용체 복합체 항체의 부분을 말한다. T 세포 수용체 복합체는, T 세포 수용체 자신이어도 되고, T 세포 수용체와 함께 T 세포 수용체 복합체를 구성하는 어댑터 분자여도 된다. 어댑터로서 적합한 것은 CD3이다.
T 세포 수용체 결합 도메인
본 명세서에 있어서, 「T 세포 수용체 결합 도메인」이란, T 세포 수용체의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 또한 상보적인 영역을 포함해서 이루어지는 T 세포 수용체 항체의 부분을 말한다.
T 세포 수용체로서는, 가변영역이어도 되고, 정상영역이어도 되지만, 바람직한 CD3 결합 도메인이 결합하는 에피토프는 정상영역에 존재하는 에피토프이다. 정상영역의 서열로서, 예를 들면 RefSeq 등록번호 CAA26636.1의 T 세포 수용체 α쇄(서열번호：67), RefSeq 등록번호 C25777의 T 세포 수용체 β쇄(서열번호：68), RefSeq 등록번호 A26659의 T 세포 수용체 γ1쇄(서열번호：69), RefSeq 등록번호 AAB63312.1의 T 세포 수용체 γ2쇄(서열번호：70), RefSeq 등록번호 AAA61033.1의 T 세포 수용체 δ쇄(서열번호：71)의 서열을 들 수 있다.
CD3 결합 도메인
본 명세서에 있어서 「CD3 결합 도메인」이란, CD3의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 또한 상보적인 영역을 포함하여 이루어지는 CD3 항체의 부분을 말한다. CD3 결합 도메인은 하나 또는 복수의 항체의 가변 도메인으로부터 제공될 수 있다. 바람직하게는, CD3 결합 도메인은 CD3 항체의 경쇄 가변영역(VL)과 CD3 항체의 중쇄 가변영역(VH)을 포함한다. 이러한 CD3 결합 도메인의 예로서는, 「scFv(single chain Fv)」, 「단일 사슬 항체(single chain antibody)」, 「Fv」, 「scFv2(single chain Fv 2)」, 「Fab」 또는 「F(ab')2」 등을 바람직하게 들 수 있다.
본 발명의 CD3 결합 도메인은, 인간 CD3를 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄 서열에 존재하는 에피토프라면 어떤 에피토프에 결합하는 것이어도 된다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 인간 CD3 복합체의 ε쇄의 세포외 영역에 존재하는 에피토프에 결합하는 CD3 항체의 경쇄 가변영역(VL)과 CD3 항체의 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 CD3 결합 도메인이 적합하게 사용된다. 이러한 CD3 결합 도메인으로서는, OKT3 항체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4914-4917)나 각종 공지의 CD3 항체의 경쇄 가변영역(VL)과 CD3 항체의 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 CD3 결합 도메인이 적합하게 사용된다. 또한, 인간 CD3를 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄를 상기의 방법에 의해 목적하는 동물에 면역함으로써 취득된 목적하는 성질을 갖는 CD3 항체를 기원으로 하는 CD3 결합 도메인이 적절히 사용될 수 있다. CD3 결합 도메인의 기원이 되는 CD3 항체는 상기와 같이 적절히 인간화된 항체나 인간 항체가 적절히 사용된다. CD3를 구성하는 γ쇄, δ쇄 또는 ε쇄의 구조는, 그의 폴리뉴클레오티드 서열이, 서열번호：27(NM_000073.2), 29(NM_000732.4) 및 31(NM_000733.3)에, 그의 폴리펩티드 서열이, 서열번호：28(NP_000064.1), 30(NP_000723.1) 및 32(NP_000724.1)에 기재되어 있다(괄호 안은 RefSeq 등록번호를 나타낸다).
폴리펩티드 회합체
본 발명의 폴리펩티드 회합체는 상기의,
(1) 항원 결합 도메인,
(2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역을 포함하는 도메인, 및
(3) T 세포 수용체 복합체 결합 도메인,
을 포함하는 것이면 되고, 그 구조는 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서는, T 세포 수용체 복합체 결합 도메인은, 바람직하게는 T 세포 수용체 결합 도메인 또는 CD3 결합 도메인이다. 상기의 각 도메인은 펩티드 결합으로 직접 연결할 수 있다. 예를 들면, (1) 항원 결합 도메인으로서 F(ab')2를 사용하고, (2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역을 포함하는 도메인으로서 이들 Fc 영역을 사용한 경우에 (1)에 기재된 항원 결합 도메인과 (2)에 기재된 Fc 영역을 포함하는 도메인을 펩티드 결합으로 연결했을 때는, 연결된 폴리펩티드는 항체의 구조를 형성한다. 그러한 항체를 제작하기 위해서는 전술한 하이브리도마의 배양액으로부터 정제하는 외에, 당해 항체를 구성하는 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 안정하게 보유된 목적하는 숙주세포의 배양액으로부터 당해 항체를 정제하는 것도 가능하다.
당해 항체구조에 (3) CD3 결합 도메인을 결합하는 경우, 당해 CD3 결합 도메인이 당해 항체구조의 정상영역의 C 말단에 펩티드 결합을 매개로 결합될 수 있다. 다른 태양으로서는, 당해 CD3 결합 도메인은, 당해 항체구조의 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 N 말단에 펩티드 결합을 매개로 결합될 수 있다. 그 밖의 태양으로서는, 당해 CD3 결합 도메인은, 당해 항체구조의 경쇄 정상영역의 C 말단에 펩티드 결합을 매개로 결합될 수 있다. 결합하는 CD3 결합 도메인은 목적하는 구조를 갖는 CD3 결합 도메인이 채용될 수 있지만, 바람직하게는 Fv, 보다 바람직하게는 scFv가 적절히 사용된다. 당해 항체구조에 결합하는 CD3 결합 도메인의 가수는 한정되지 않는다. 당해 항체구조에 2가의 CD3 결합 도메인을 결합하기 위해서는, 당해 항체구조의 정상영역을 구성하는 2개의 Fc 영역의 각 C 말단에 펩티드 결합을 매개로 각각 1가의 CD3 결합 도메인이 결합될 수 있다. 또한, 당해 항체구조에 2가의 CD3 결합 도메인을 결합하기 위해서는, 2개의 Fc 영역 중 1개의 Fc 영역의 C 말단에 펩티드 결합을 매개로 2가의 scFv 즉 sc(Fv)2가 결합될 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기의 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역을 사용함으로써, 당해 항체구조의 정상영역을 구성하는 2개의 Fc 영역 중 1개의 Fc 영역의 C 말단에만 2가의 scFv 즉 sc(Fv)2가 결합하는 폴리펩티드 회합체가 효율적으로 취득된다. 또한, 당해 항체구조에 1가의 CD3 결합 도메인을 결합하기 위해서는, 2개의 Fc 영역 중 1개의 Fc 영역의 C 말단에 펩티드 결합을 매개로 1가의 scFv가 결합될 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기의 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역을 사용함으로써, 당해 항체구조의 정상영역을 구성하는 2개의 Fc 영역 중 1개의 Fc 영역의 C 말단에만 1가의 scFv가 결합하는 본 발명의 폴리펩티드 회합체가 효율적으로 취득된다.
또한, (3) CD3 결합 도메인이 당해 항체구조의 정상영역의 C 말단에 펩티드 결합을 매개로 결합될 수 있는 경우에, CD3 결합 도메인을 구성하는 중쇄 Fv 단편이 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 정상영역의 C 말단(CH3 도메인)에 연결되고, CD3 결합 도메인을 구성하는 경쇄 Fv 단편이 Fc 영역을 구성하는 다른 한쪽의 정상영역의 C 말단(CH3 도메인)에 연결된 폴리펩티드 회합체도 적절히 사용된다. 이 경우에 있어서, 중쇄 Fv 단편 또는 경쇄 Fv 단편을 정상영역의 C 말단(CH3 도메인)에 연결할 때 Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：7) 등의 링커가 적절히 삽입된다. 링커의 반복 수는 한정되지 않고, 1~10, 바람직하게는 2~8, 더 나아가서는 2~6의 수로부터 선택되는, 즉 1，2，3，4，5，6，7，8，9 또는 10의 반복으로 이루어지는 Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：7) 등의 링커가 적절히 삽입될 수 있다.
또한, CD3 결합 도메인을 구성하는 중쇄 Fv 단편이 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 정상영역의 C 말단(CH3 도메인)에 연결되고, CD3 결합 도메인을 구성하는 경쇄 Fv 단편이 Fc 영역을 구성하는 다른 한쪽의 정상영역의 C 말단(CH3 도메인)에 연결된 폴리펩티드 회합체가 제작되는 경우에는, 당해 중쇄 Fv 단편과 경쇄 Fv 단편의 회합을 강화하기 위해 당해 중쇄 Fv 단편과 경쇄 Fv 단편 간에 디설피드 결합을 형성시키는 아미노산 잔기의 개변도 적절히 실시될 수 있다.
다른 태양에 있어서, CD3 결합 도메인을 구성하는 중쇄 Fv 단편이 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 정상영역의 C 말단(CH3 도메인)에 연결되고, CD3 결합 도메인을 구성하는 경쇄 Fv 단편이 Fc 영역을 구성하는 다른 한쪽의 정상영역의 C 말단(CH3 도메인)에 연결된 폴리펩티드 회합체가 제작되는 경우에는, 당해 중쇄 Fv 단편과 경쇄 Fv 단편의 회합을 강화하기 위해 당해 중쇄 Fv 단편과 경쇄 Fv 단편의 각각에 항체의 CH1 도메인 및 CL 도메인이 연결될 수 있다.
또 다른 태양에 있어서, 당해 항체구조에 2가의 CD3 결합 도메인을 결합하기 위해서는, 당해 항체구조의 2개의 경쇄 정상영역의 각 C 말단 또는 경쇄 가변영역의 각 N 말단에 펩티드 결합을 매개로 각각 1가의 CD3 결합 도메인이 결합될 수 있다. 또한, 당해 항체구조에 2가의 CD3 결합 도메인을 결합하기 위해서는, 2개의 경쇄 정상영역의 각 C 말단 또는 경쇄 가변영역의 각 N 말단에 펩티드 결합을 매개로 2가의 scFv 즉 sc(Fv)2가 결합될 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기의 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역을 사용함으로써, 당해 항체구조의 2개의 경쇄 가변영역 중 1개의 경쇄 가변영역의 C 말단 또는 N 말단에 2가의 scFv 즉 sc(Fv)2가 결합하는 폴리펩티드 회합체가 효율적으로 취득된다. 또한, 당해 항체구조에 1가의 CD3 결합 도메인을 결합하기 위해서는, 2개의 경쇄 가변영역 중 1개의 경쇄 가변영역의 C 말단 또는 N 말단에 펩티드 결합을 매개로 1가의 scFv가 결합될 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기의 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역을 사용함으로써, 당해 항체구조의 2개의 경쇄 가변영역 중 1개의 경쇄 가변영역의 N 말단 또는 C 말단에 1가의 scFv가 결합하는 본 발명의 폴리펩티드 회합체가 효율적으로 취득된다.
다른 태양에 있어서, 당해 항체구조에 2가의 CD3 결합 도메인을 결합하기 위해서는, 당해 항체구조의 2개의 중쇄 가변영역의 각 N 말단에 펩티드 결합을 매개로 각각 1가의 CD3 결합 도메인이 결합될 수 있다. 또한, 당해 항체구조에 2가의 CD3 결합 도메인을 결합하기 위해서는, 2개의 중쇄 가변영역 중 1개의 중쇄 가변영역의 N 말단에 펩티드 결합을 매개로 2가의 scFv 즉 sc(Fv)2가 결합될 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기의 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역을 사용함으로써, 당해 항체구조의 2개의 중쇄 가변영역 중 1개의 중쇄 가변영역의 N 말단에만 2가의 scFv 즉 sc(Fv)2가 결합하는 폴리펩티드 회합체가 효율적으로 취득된다. 또한, 당해 항체구조에 1가의 CD3 결합 도메인을 결합하기 위해서는, 2개의 중쇄 가변영역 중 1개의 중쇄 가변영역의 N 말단에 펩티드 결합을 매개로 1가의 scFv가 결합될 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기의 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역을 사용함으로써, 당해 항체구조의 2개의 중쇄 가변영역 중 1개의 중쇄 가변영역의 N 말단에 1가의 scFv가 결합하는 본 발명의 폴리펩티드 회합체가 효율적으로 취득된다.
또한, 상기의 폴리펩티드 회합체를 제작할 때, 각 도메인은 직접 펩티드 결합으로 결합되는 외에, 각 도메인은 펩티드 링커를 매개로 한 펩티드 결합으로 결합될 수 있다. 이 경우에 있어서, 채용되는 링커로서는 상기 기재에서 예시되는 링커 외에, 예를 들면 His 태그, HA 태그, myc 태그, FLAG 태그 등의 펩티드 태그를 갖는 링커도 적절히 사용될 수 있다. 또한, 수소 결합, 디설피드 결합, 공유 결합, 이온성 상호작용 또는 이들 결합의 조합에 의해 서로 결합하는 성질도 또한 적합하게 이용될 수 있다. 예를 들면, 항체의 CH1과 CL 간의 친화성이 이용되거나, 헤테로 Fc 영역의 회합시에 전술한 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역이 사용된다. 또한, 실시예에서 기재되는 바와 같이, 도메인 간에 형성되는 디설피드 결합도 또한 적합하게 이용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 회합체의 다른 구조로서는, 예를 들면, (1) 항원 결합 도메인으로서 1가의 Fv 및 1가의 Fab인 구조도 또한 적합하게 사용된다. 이 경우에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드 회합체를 구성하는 (2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 2개의 Fc 영역 중 1개의 Fc 영역에 펩티드 결합을 매개로 연결된 중쇄 CH1 영역에 1가의 Fv 중 중쇄 Fv 단편(VH) 또는 경쇄 Fv 단편(VL)이 펩티드 결합을 매개로 연결하고, 당해 중쇄 CH1 영역에 디설피드 결합을 매개로 결합한 경쇄 CH 영역에 1가의 Fv 중 다른 한쪽의 VL 또는 VH 단편이 펩티드 결합을 매개로 연결함으로써, 중쇄 CH1 영역 및 경쇄 CL 영역의 말단에 결합한 VH 및 VL이 항체 결합 도메인을 형성하는 구조가 사용된다. 2개의 Fc 영역 중 상기의 상이한 다른 한쪽의 Fc 영역의 N 말단에는 (1) 항체 결합 도메인, 및 (3) CD3 결합 도메인을 형성하는 sc(Fv)2가 펩티드 결합을 매개로 연결될 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기의 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역을 사용함으로써, 당해 폴리펩티드 회합체를 구성하는 2개의 Fc 영역 중 한쪽의 Fc 영역에 중쇄 CH1 영역이, 다른 한쪽의 Fc 영역에 sc(Fv)2가 각각 펩티드 결합을 매개로 연결한 구조를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다. 상기의 폴리펩티드 회합체를 제작할 때, 각 도메인은 직접 펩티드 결합으로 결합되는 외에, 각 도메인은 펩티드 링커를 매개로 한 펩티드 결합으로 결합될 수 있다. 이 경우에 있어서, 채용되는 링커로서는 상기 기재에서 예시되는 링커 외에, 예를 들면 His 태그, HA 태그, myc 태그, FLAG 태그 등의 펩티드 태그를 갖는 링커도 적절히 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 회합체의 다른 구조로서는, 예를 들면, (1) 항원 결합 도메인으로서 2가의 scFv인 구조도 또한 적합하게 사용된다. 이러한 구조의 태양으로서, 2가의 scFv 중 한쪽이 (3) CD3 결합 도메인을 구성하는 VH를 매개로 (2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 2개의 Fc 영역 중 1개의 Fc 영역에 펩티드 결합에 의해 연결되고, 2가의 scFv 중 다른 한쪽이 (3) CD3 결합 도메인을 구성하는 VL을 매개로 (2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 2개의 Fc 영역 중 다른 한쪽의 Fc 영역에 펩티드 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기의 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역을 사용하는 것도 가능하다. 상기의 폴리펩티드 회합체를 제작할 때, 각 도메인은 직접 펩티드 결합으로 결합되는 외에, 각 도메인은 펩티드 링커를 매개로 한 펩티드 결합으로 결합될 수 있다. 이 경우에 있어서, 채용되는 링커로서는 상기 기재에서 예시되는 링커 외에, 예를 들면 His 태그, HA 태그, myc 태그, FLAG 태그 등의 펩티드 태그를 갖는 링커도 적절히 사용될 수 있다.
(1) 항원 결합 도메인으로서 2가의 scFv가 사용되는 구조의 다른 하나의 태양으로서, 2가의 scFv 중 한쪽이 (3) CD3 결합 도메인을 구성하는 scFv를 매개로 (2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 2개의 Fc 영역 중 1개의 Fc 영역에 펩티드 결합에 의해 연결되고, 2가의 scFv 중 다른 한쪽이 (2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 2개의 Fc 영역 중 다른 한쪽의 Fc 영역에 펩티드 결합에 의해 연결된 구조를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다. 이 경우에 있어서, 상기의 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역을 사용함으로써, 당해 폴리펩티드 회합체를 구성하는 2개의 Fc 영역 중 한쪽의 Fc 영역에 CD3 결합 도메인을 구성하는 scFv를 매개로 항원 결합 도메인을 구성하는 scFv가, 다른 한쪽의 Fc 영역에 항원 결합 도메인을 구성하는 scFv가 각각 펩티드 결합을 매개로 연결한 구조를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다. 상기의 폴리펩티드 회합체를 제작할 때, 각 도메인은 직접 펩티드 결합으로 결합되는 외에, 각 도메인은 펩티드 링커를 매개로 한 펩티드 결합으로 결합될 수 있다. 이 경우에 있어서, 채용되는 링커로서는 상기에서 예시되는 링커 외에, 예를 들면 His 태그, HA 태그, myc 태그, FLAG 태그 등의 펩티드 태그를 갖는 링커도 적절히 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 회합체의 다른 구조로서는, 예를 들면, 항원 결합 도메인 및 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 각각 1가의 Fab인 구조도, 또한 적합하게 사용된다. 이러한 구조의 태양으로서, 항원 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 구조를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다.
이러한 구조의 다른 태양으로서, 항원 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 구조를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다. 또한, T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, 항원 결합 도메인을 구성하는 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 구조를 갖는 폴리펩티드 회합체도 또한 제작될 수 있다.
또한 이러한 구조의 다른 태양으로서, 항원 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역과 연결된 구조를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다. 또한, T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, 항원 결합 도메인을 구성하는 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역과 연결된 구조를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 회합체의 다른 구조인, 항원 결합 도메인 및 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 각각 1가의 Fab인 구조의 일태양으로서,
(1) 항원에 결합하는 1가의 Fab 구조의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 상기 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab 구조의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 항원 결합 도메인, 및
(2) T 세포 수용체 복합체에 결합하는 1가의 Fab 구조의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab 구조의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인,
을 포함하고, 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편과 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편 또는 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편과 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편이 회합하도록 CH1 영역과 CL 영역의 전하가 제어되어 있는 폴리펩티드를 적합하게 들 수 있다. 본 태양에 있어서는, 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편과 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편 또는 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편과 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편이 회합하도록 CH1 영역과 CL 영역의 전하가 제어되어 있으면 되고, 그 폴리펩티드 회합체의 구조(회합 제어 구조)는 특정의 한 구조에 한정되지 않는다.
당해 회합 제어 구조의 일태양으로서, 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다.
당해 회합 제어 구조의 다른 일태양으로서, 당해 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다.
당해 회합 제어 구조의 추가적인 일태양으로서, 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖고, 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다.
또한, 당해 회합 제어 구조의 일태양으로서, 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 가지며, 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 이종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다.
또한, 당해 회합 제어 구조의 다른 일태양으로서, 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 가지며, 당해 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 가지며, 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 이종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다.
또한, 당해 회합 제어 구조의 일태양으로서, 당해 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 가지며, 당해 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 모두 이종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다.
또한, 당해 회합 제어 구조의 다른 일태양으로서, 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 가지며, 당해 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 가지며, 당해 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 모두 이종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다.
이에 더하여, 당해 회합 제어 구조의 상이한 일태양으로서, 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 가지며, 당해 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖고, 당해 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 당해 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 이종의 전하를 갖고, 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 이종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체가 제작될 수 있다.
CH1 영역과 CL 영역의 전하의 제어
T 세포 수용체 결합 도메인의 중쇄와 경쇄에 의해 T 세포 수용체 결합 도메인의 에피토프를 인식하고, 또한, 항원 결합 도메인의 중쇄와 경쇄에 의해 항원의 에피토프를 인식하는 이중 특이성 폴리펩티드 회합체를 취득하고자 하는 경우, 당해 폴리펩티드 회합체의 생산시에 4종의 각각의 사슬을 발현시키면 이론상 10종류의 폴리펩티드 회합체 분자가 생산될 가능성이 있다.
이 경우, 예를 들면, T 세포 수용체 결합 도메인의 중쇄와 항원 결합 도메인의 경쇄 및/또는 항원 결합 도메인의 중쇄와 T 세포 수용체 결합 도메인의 경쇄 간의 회합을 저해하도록 제어하면, 목적하는 폴리펩티드 회합체 분자를 우선적으로 취득하는 것이 가능하다.
예를 들면, T 세포 수용체 결합 도메인의 중쇄 CH1과 항원 결합 도메인의 경쇄 CL 간의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 양의 전하를 갖는 아미노산 잔기로 개변하고, 항원 결합 도메인의 중쇄 CH1과 T 세포 수용체 결합 도메인의 경쇄 CL 간의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 음의 전하를 갖는 아미노산 잔기로 개변하는 예를 들 수 있다. 이 개변에 의해, 목적하지 않은 T 세포 수용체 결합 도메인의 중쇄 CH1과 항원 결합 도메인의 경쇄 CL의 회합은 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 어느 쪽도 양전하이기 때문에 저해되고, 목적하지 않은 항원 결합 도메인의 중쇄 CH1과 T 세포 수용체 결합 도메인의 경쇄 CL의 회합은 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 어느 쪽도 음전하이기 때문에 저해된다. 그 결과, 목적으로 하는 T 세포 수용체 결합 도메인의 중쇄 CH1과 T 세포 수용체 결합 도메인의 경쇄 CL의 회합 및 목적으로 하는 항원 결합 도메인의 중쇄 CH1과 항원 결합 도메인의 경쇄 CL의 회합이 생성된 본 발명의 폴리펩티드 회합체가 효율적으로 취득될 수 있다. 또한, 적합하게는, 목적으로 하는 T 세포 수용체 결합 도메인의 중쇄와 T 세포 수용체 결합 도메인의 경쇄의 회합은, 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 이종의 전하를 갖기 때문에 촉진되고, 목적으로 하는 항원 결합 도메인의 중쇄와 항원 결합 도메인의 경쇄의 회합도 계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 이종의 전하를 갖기 때문에 촉진된다. 그 결과, 목적으로 하는 회합이 생성된 본 발명의 폴리펩티드 회합체가 효율적으로 취득될 수 있다.
또한, 본 발명의 회합 제어를 이용함으로써, CH1끼리(T 세포 수용체 결합 도메인의 중쇄와 항원 결합 도메인의 중쇄), 또는, CL끼리(T 세포 수용체 결합 도메인의 경쇄와 항원 결합 도메인의 경쇄)의 회합을 억제하는 것도 가능하다.
당업자라면, 본 발명에 의해 회합을 제어하고자 하는 목적하는 폴리펩티드 회합체에 대해서, 회합했을 때의 CH1과 CL의 계면에 있어서 접근하는 아미노산 잔기의 종류를 적당히 아는 것이 가능하다.
또한, 인간, 원숭이, 마우스 및 토끼 등의 생물에 있어서, 항체의 CH1 또는 CL로서 이용 가능한 서열을, 당업자는, 공공의 데이터 베이스 등을 이용하여 적절히 취득할 수 있다. 보다 구체적으로는, 후술하는 실시예에 기재된 수단으로, CH1 또는 CL의 아미노산 서열 정보가 취득될 수 있다.
예를 들면, 후술하는 실시예에서 나타내어지는 바와 같이, T 세포 수용체 결합 도메인 또는 항원 결합 도메인을 구성하는 VH 및 VL에 각각 연결하는 CH1과 CL이 회합할 때의 CH1과 CL의 계면에 있어서 접근(상대 또는 접촉)하는 아미노산 잔기의 구체예로서, 이하의 조합을 들 수 있다.
·CH1의 EU 넘버링 147번 위치(예를 들면, 서열번호：1에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 147번 위치)의 리신(K)과, 상대(접촉)하는 CL의 EU 넘버링 180번 위치의 트레오닌(T)
·CH1의 EU 넘버링 147번 위치의 리신(K)과, 상대(접촉)하는 CL의 EU 넘버링 131번 위치의 세린(S)
·CH1의 EU 넘버링 147번 위치의 리신(K)과, 상대(접촉)하는 CL의 EU 넘버링 164번 위치의 트레오닌(T)
·CH1의 EU 넘버링 147번 위치의 리신(K)과, 상대(접촉)하는 CL의 EU 넘버링 138번 위치의 아스파라긴(N)
·CH1의 EU 넘버링 147번 위치의 리신(K)과, 상대(접촉)하는 CL의 EU 넘버링 123번 위치의 글루타민산(E)
·CH1의 EU 넘버링 175번 위치의 글루타민(Q)과, 상대(접촉)하는 CL의 EU 넘버링 160번 위치의 글루타민(Q)
·CH1의 EU 넘버링 213번 위치의 리신(K)과, 상대(접촉)하는 CL의 EU 넘버링 123번 위치의 글루타민산(E)
또한, 이들 부위의 넘버링에 대해서는, Kabat 등의 문헌(Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)을 참고로 하고 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 EU 넘버링으로서 기재된 번호는, EU numbering(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242)에 따라서 기재한 것이다. 또한 본 발명에 있어서, 「EU 넘버링 X번 위치의 아미노산 잔기」, 「EU 넘버링 X번 위치의 아미노산」(X는 임의의 수)은, 「EU 넘버링 X번 위치에 상당하는 아미노산 잔기」, 「EU 넘버링 X번 위치에 상당하는 아미노산」으로 바꿔 읽는 것도 가능하다.
후술하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 이들 아미노산 잔기를 개변하여, 본 발명의 방법을 실시함으로써, 목적하는 폴리펩티드 회합체가 우선적으로 취득될 수 있다.
이들 아미노산 잔기는, 인간 및 마우스에 있어서 고도로 보존되어 있는 것이 알려져 있는(J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120) 것으로부터, 실시예에 나타내는 폴리펩티드 회합체 이외의 CH1과 CL의 회합에 대해서도, 상기 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기를 개변함으로써, 본 발명의 폴리펩티드 회합체의 정상영역의 회합이 제어될 수 있다.
즉, 본 발명은, 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 폴리펩티드 회합체로서, 이하의 (a)~(f)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군으로부터 선택되는 1조 또는 2조 이상의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체를 제공한다;
(a) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치의 아미노산 잔기,
(b) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 131번 위치의 아미노산 잔기,
(c) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 164번 위치의 아미노산 잔기,
(d) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 138번 위치의 아미노산 잔기,
(e) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기,
(f) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 175번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 160번 위치의 아미노산 잔기.
본 발명의 다른 태양으로서, 추가로, 이하의 (g)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 동종의 전하인 항체를 제공한다;
(g) CH1에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 213번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL에 포함되는 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기.
상기 조합에 기재된 각각의 아미노산 잔기는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 회합했을 때 서로 접근해 있다. 당업자는, 목적하는 CH1 또는 CL에 대해서, 시판의 소프트웨어를 사용한 상동성(homology) 모델링 등에 의해, 상기 (a)~(g)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 발견할 수 있어, 적절히, 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
상기 항체에 있어서, 「전하를 갖는 아미노산 잔기」는, 예를 들면, 이하의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다;
(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
상기 폴리펩티드 회합체에 있어서, 「동종의 전하를 갖는다」는 것은, 예를 들면, 2개 이상의 아미노산 잔기 모두가, 상기 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 「반대의 전하를 갖는다」는 것은, 예를 들면, 2개 이상의 아미노산 잔기 중 1개 이상의 아미노산 잔기가, 상기 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 경우에, 나머지 아미노산 잔기가 상이한 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.
또한, 전술한 폴리펩티드 회합체의 제조방법, 및 상기 (a)~(g)에 나타내는 아미노산 잔기의 조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 아미노산 잔기가 되도록 개변하는 본 발명의 회합 제어방법도 또한, 본 발명의 바람직한 태양이다.
본 발명에 있어서 「개변」에 제공하는 아미노산 잔기로서는, 전술한 정상영역의 아미노산 잔기에 한정되지 않는다. 당업자라면, 폴리펩티드 변이체 또는 이종 다량체에 대해서, 시판의 소프트웨어를 사용한 상동성 모델링 등에 의해, 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 발견할 수 있어, 회합을 제어하도록, 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 목적하지 않는 중쇄와 경쇄의 회합을 억제시키는 기술에 있어서, 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면, 중쇄 가변영역 FR2의 39번 위치(예를 들면, WO2006/106905에 있어서 서열번호：6으로서 기재된 아미노산 서열에 있어서의 39번째)의 글루타민(Q)과, 상대(접촉)하는 경쇄 가변영역 FR2의 38번 위치(예를 들면, WO2006/106905에 있어서 서열번호：8로서 기재된 아미노산 서열에 있어서의 44번째)의 글루타민(Q)을 들 수 있다. 또한, 중쇄 가변영역 FR2의 45번 위치(예를 들면, WO2006/106905에 있어서 서열번호：6으로서 기재된 아미노산 서열에 있어서의 45번째)의 류신(L)과, 상대하는 경쇄 가변영역 FR2의 44번 위치(예를 들면, WO2006/106905에 있어서 서열번호：8에 기재된 아미노산 서열에 있어서의 50번째)의 프롤린(P)이 적합하게 예시될 수 있다. 또한, 이들 부위의 넘버링에 대해서는, Kabat 등의 문헌(Kabat EA et al. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH)을 참고로 하고 있다.
이들 아미노산 잔기는, 인간 및 마우스에 있어서 고도로 보존되어 있는 것이 알려져 있는(J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120) 것으로부터, 실시예에 나타내는 폴리펩티드 회합체 이외의 VH와 VL의 회합에 대해서도, 상기 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기를 개변함으로써, 항체의 가변영역의 회합이 제어될 수 있다.
보다 구체적으로는, 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 항체에 있어서는, 이하의 (1)과 (2), 또는, (3)과 (4)의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 아미노산 잔기인 항체로 하는 것을 들 수 있다;
(1) 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 39번 위치에 상당하는 아미노산 잔기,
(2) 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 38번 위치에 상당하는 아미노산 잔기,
(3) 중쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 45번 위치에 상당하는 아미노산 잔기,
(4) 경쇄 가변영역에 포함되는 아미노산 잔기로서, EU 넘버링 44번 위치에 상당하는 아미노산 잔기.
상기 (1)과 (2), (3)과 (4)에 기재된 각각의 아미노산 잔기는, 회합했을 때 서로 접근해 있다. 당업자는, 목적하는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역에 대해서, 시판의 소프트웨어를 사용한 상동성 모델링 등에 의해, 상기 (1)~(4)에 기재된 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 발견할 수 있어, 적절히, 그 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
상기 항체에 있어서, 「전하를 갖는 아미노산 잔기」는, 예를 들면, 이하의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다;
(X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D),
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
상기 (1)~(4)에 기재된 아미노산 잔기는, 통상, 인간 및 마우스에 있어서는 각각
(1) 글루타민(Q),
(2) 글루타민(Q),
(3) 류신(L),
(4) 프롤린(P)
이다. 따라서 본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 이들 아미노산 잔기가 개변(예를 들면, 전하 아미노산으로의 치환)에 제공된다. 또한, 상기 (1)~(4)의 아미노산 잔기의 종류는, 반드시 상기의 아미노산 잔기에 한정되는 것은 아니며, 그 아미노산에 상당하는 다른 아미노산이어도 된다. 예를 들면, 경쇄 가변영역 상의 EU 넘버링 38번 위치에 상당하는 아미노산으로서, 인간의 경우, 예를 들면, 히스티딘(H)이어도 된다. 당업자는, 공지 문헌 등(예를 들면, J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113-120)을 참조함으로써, 경쇄의 임의의 위치에 대해서, 그 위치에 상당하는 아미노산 잔기의 종류를 아는 것이 가능하여, 적절히, 당해 아미노산 잔기에 대해서 개변(예를 들면, 전하 아미노산으로 치환)할 수 있다.
중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 계면에 존재하는 소수성 코어를 형성하는 아미노산 잔기를 전하를 갖는 극성 아미노산으로 개변하여, 목적하지 않는 중쇄와 경쇄의 회합을 억제하는 기술에 있어서, 중쇄 가변영역(VH)과 경쇄 가변영역(VL)의 계면에서 소수성 코어를 형성할 수 있는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면, 중쇄 가변영역 상의 45번 위치의 류신(L)과, 상대하는 경쇄 가변영역 상의 44번 위치의 프롤린(P)을 적합하게 예시할 수 있다.
일반적으로, 「소수성 코어(hydrophobic core)」란, 회합한 폴리펩티드의 내측에 소수성 아미노산의 측쇄가 집합하여 형성하는 부분을 가리킨다. 소수성 아미노산에는, 예를 들면 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린 등이 포함된다. 또한, 소수 코어의 형성에는, 소수성 아미노산 이외의 아미노산 잔기(예를 들면 티로신)가 관여하는 경우도 있다. 이 소수성 코어는, 친수성 아미노산의 측쇄가 외측에 노출되는 친수성 표면과 함께, 수용성 폴리펩티드의 회합을 진행하는 구동력이 된다. 상이한 2개의 도메인의 소수성 아미노산이 분자 표면에 존재하여, 물분자에 폭로되면 엔트로피가 증대되어 자유 에너지가 증대되어 버린다. 따라서, 2개의 도메인은 자유 에너지를 감소시켜, 안정화되기 때문에, 서로 회합하고, 계면의 소수성 아미노산은 분자 내부에 묻혀, 소수 코어를 형성하게 된다.
폴리펩티드의 회합이 일어날 때에, 소수성 코어를 형성하는 소수성 아미노산으로부터 전하를 갖는 극성 아미노산으로 개변함으로써, 소수성 코어의 형성이 저해되고, 그 결과, 폴리펩티드의 회합이 저해되는 것으로 생각된다.
본 발명의 폴리펩티드 회합체에는, 추가로 다른 공지 기술을 적용할 수 있다. 예를 들면, 제1 VH(VH1)와 제1 VL(VL1), 및/또는 제2 VH(VH2)와 제2 VL(VL2)의 회합이 촉진되도록, 본 발명의 「개변」에 더하여, 한쪽의 H쇄의 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob; 돌기)로 치환하고, 다른 한쪽의 H쇄의 상대하는 가변영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole; 공극)로 치환함으로써, 돌기가 공극에 배치될 수 있도록 하여 VH1과 VL1, 및/또는 VH2와 VL2의 회합을 촉진시켜, 결과적으로 VH1과 VL2, 및/또는 VH2와 VL1의 폴리펩티드 간의 회합을 더욱 억제하는 것이 가능하다(WO1996/027011, Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621, Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).
상기의 폴리펩티드 회합체를 제작할 때, 각 도메인은 직접 펩티드 결합으로 결합되는 외에, 각 도메인은 펩티드 링커를 매개로 한 펩티드 결합으로 결합될 수 있다. 이 경우에 있어서, 채용되는 링커로서는 상기에서 예시되는 링커 외에, 예를 들면 His 태그, HA 태그, myc 태그, FLAG 태그 등의 펩티드 태그를 갖는 링커도 적절히 사용될 수 있다. 또한, 수소 결합, 디설피드 결합, 공유 결합, 이온성 상호작용 또는 이들 결합의 조합에 의해 서로 결합하는 성질도 또한 적합하게 이용될 수 있다. 예를 들면, 항체의 CH1과 CL 간의 친화성이 이용되거나, 헤테로 Fc 영역의 회합시에 전술한 이중 특이성 항체를 기원으로 하는 Fc 영역이 사용된다. 또한, 실시예에 기재되는 바와 같이, 도메인 간에 형성되는 디설피드 결합도 또한 적합하게 이용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 회합체로서, 예를 들면 도 17, 도 19 및 도 24에 기재되는 태양을 들 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 회합체는 상기 재조합 항체의 제조방법과 동일한 수법에 의해 제작된다.
또한 본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드 회합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 회합체는, 임의의 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 발현 벡터로 적당한 숙주를 형질전환하여, 폴리펩티드 회합체의 발현 세포로 할 수 있다. 폴리펩티드 회합체의 발현 세포를 배양하고, 배양상청으로부터 발현 산물을 회수하면, 당해 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드 회합체를 취득할 수 있다. 즉 본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드 회합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 당해 벡터를 보유하는 세포, 및 당해 세포를 배양하여 배양상청으로부터 폴리펩티드 회합체를 회수하는 것을 포함하는 폴리펩티드 회합체의 제조방법에 관한 것이다. 이들은 예를 들면, 상기 재조합 항체와 동일한 수법에 의해 얻을 수 있다.
의약 조성물
다른 관점에 있어서는, 본 발명은, (1) 항원 결합 도메인, (2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역을 포함하는 도메인, 및 (3) CD3 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 회합체를 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 당해 회합체를 유효성분으로서 함유하는 세포상해를 유도하는 치료제(세포상해 유도 치료제), 세포증식 억제제 및 항암제에 관한 것이다. 본 발명의 의약 조성물은, 암 치료제 또는 암 예방제로서 사용하는 것도 가능하다. 본 발명의 세포상해 유도 치료제, 세포증식 억제제 및 항암제는, 암을 이환(罹患)하고 있는 대상 또는 재발할 가능성이 있는 대상에 투여되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 있어서,
(1) 항원 결합 도메인,
(2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역을 포함하는 도메인, 및
(3) CD3 결합 도메인,
을 포함하는 폴리펩티드 회합체를 유효성분으로서 함유하는, 세포상해 유도 치료제, 세포증식 억제제 및 항암제는, 당해 폴리펩티드 회합체를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법, 또는, 세포상해 유도 치료제, 세포증식 억제제 및 함암제의 제조에 있어서의 당해 폴리펩티드 회합체의 사용으로 표현하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 「(1) 항원 결합 도메인, (2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역을 포함하는 도메인, 및 (3) CD3 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 회합체를 유효성분으로서 함유한다」는 것은, 당해 폴리펩티드 회합체를 주요한 활성 성분으로서 포함한다고 하는 의미이고, 당해 폴리펩티드 회합체의 함유율을 제한하는 것은 아니다.
또한 본 발명에 있어서의 의약 조성물, 또는 세포상해 유도 치료제, 세포증식 억제제 및 항암제에는, 필요에 따라 복수 종류의 폴리펩티드 회합체가 배합될 수 있다. 예를 들면, 동일 항원에 결합하는 복수의 본 발명의 폴리펩티드 회합체의 칵테일로 함으로써, 당해 항원을 발현하는 세포에 대한 세포상해 작용을 강화할 수 있는 가능성이 있다. 또는, 1개의 항원에 대한 항원 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드 회합체에 더하여, 다른 암 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드 회합체를 배합함으로써, 치료 효과가 높여진다.
또한, 필요에 따라서 본 발명의 폴리펩티드 회합체는 마이크로캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로캡슐)로 봉입되어, 콜로이드 드러그 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 될 수 있다("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980) 등 참조). 또한, 약제를 서방성의 약제로 하는 방법도 공지로, 당해 방법은 본 발명의 폴리펩티드 회합체에 적용될 수 있다(J.Biomed.Mater.Res. (1981) 15, 267-277, Chemtech. (1982) 12, 98-105, 미국특허 제3773719호, 유럽특허 공개공보 EP58481호·EP133988호, Biopolymers (1983) 22, 547-556).
본 발명의 의약 조성물, 또는 세포증식 억제제 및 항암제는, 경구, 비경구 투여 중 어느 하나에 의해 환자에게 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여이다. 이러한 투여방법으로서는 구체적으로는, 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. 주사 투여로서는, 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등을 들 수 있다. 예를 들면 주사 투여에 의해 본 발명의 의약 조성물, 또는 세포상해 유도 치료제, 세포증식 억제제 및 항암제를 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한, 환자의 연령, 증상에 따라서 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 투여량으로서는, 예를 들면, 1회 투여에 대해 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1000 ㎎의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 또는, 예를 들면, 환자당 0.001 ㎎/body~100000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 의약 조성물은 이들 투여량으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물은, 통상의 방법에 따라서 제제화할 수 있어(예를 들면, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 포함하는 것이어도 된다. 예를 들면 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있다. 또한 이들에 제한되지 않고, 그 밖의 상용의 담체를 적절히 사용할 수 있다. 구체적으로는, 경질 무수 규산, 유당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로스 칼슘, 카르멜로스 나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세리드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기 염류 등을 담체로서 들 수 있다.
또한, 본 발명은, 어떤 암 항원을 발현 세포와 당해 암 항원에 결합하는 본 발명의 폴리펩티드 회합체를 접촉시킴으로써 당해 암 항원의 발현 세포에 상해를 일으키는 방법, 또는 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 당해 암 항원에 결합하는 단일클론 항체는, 본 발명의 세포상해 유도 치료제, 세포증식 억제제 및 항암제에 함유되는 당해 암 항원에 결합하는 본 발명의 폴리펩티드 회합체로서 전술한 바와 같다. 당해 암 항원에 결합하는 본 발명의 폴리펩티드 회합체가 결합하는 세포는, 당해 암 항원이 발현하고 있는 세포라면 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서의 바람직한 당해 암 항원의 발현 세포는, 구체적으로는, 난소암, 전립선암, 유방암, 자궁암, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 방광암, 및 대장암 세포 등을 적합하게 들 수 있다. 암 항원이 GPC3인 경우에는, GPC3를 발현하고 있는 암세포라면 한정은 되지 않지만, 간세포암, 폐암, 난소암 등을 적합한 암세포로서 들 수 있다.
본 발명에 있어서「접촉」은, 예를 들면, 시험관 내에서 배양하고 있는 암 항원 발현 세포의 배양액에, 당해 암 항원에 결합하는 본 발명의 폴리펩티드 회합체를 첨가함으로써 행해진다. 이 경우에 있어서, 첨가되는 폴리펩티드 회합체의 형상으로서는, 용액 또는 동결 건조 등에 의해 얻어지는 고체 등의 형상이 적절히 사용될 수 있다. 수용액으로서 첨가되는 경우에 있어서는 순수하게 본 발명의 폴리펩티드 회합체만을 함유하는 수용액일 수 있고, 예를 들면 상기 기재의 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함하는 용액일 수도 있다. 첨가하는 농도는 특별히 한정되지 않지만, 배양액 중의 최종 농도로서, 바람직하게는 1 pg/㎖~1 g/㎖의 범위이고, 보다 바람직하게는 1 ng/㎖~1 ㎎/㎖이며, 더욱 바람직하게는 1 ㎍/㎖~1 ㎎/㎖가 적합하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 있어서 「접촉」은 또한, 다른 태양에서는, 암 항원의 발현 세포를 체내에 이식한 비인간 동물이나, 내재적으로 당해 암 항원을 발현하는 암세포를 갖는 동물에 투여하는 것에 의해서도 행해진다. 투여방법은 경구, 비경구 투여 중 어느 하나에 의해 실시할 수 있다. 특히 바람직하게는 비경구 투여에 의한 투여방법이고, 이러한 투여방법으로서는 구체적으로는, 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다. 주사 투여로서는, 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등을 들 수 있다. 예를 들면 주사 투여에 의해 본 발명의 의약 조성물, 또는 세포상해 유도 치료제, 세포증식 저해제 및 항암제를 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다. 또한, 피험 동물의 연령, 증상에 따라서 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 수용액으로서 투여되는 경우에 있어서는 순수하게 본 발명의 폴리펩티드 회합체만을 함유하는 수용액이어도 되고, 예를 들면 상기 기재의 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함하는 용액이어도 된다. 투여량으로서는, 예를 들면, 1회 투여에 대해 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1000 ㎎의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 또는, 예를 들면, 환자당 0.001~100000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드 회합체 투여량은 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 폴리펩티드 회합체의 접촉에 의해 당해 폴리펩티드 회합체를 구성하는 항원 결합 도메인이 결합하는 항원을 발현하는 세포에 일어난 세포상해를 평가 또는 측정하는 방법으로서, 이하의 방법이 적합하게 사용된다. 시험관 내에 있어서 그 세포상해 활성을 평가 또는 측정하는 방법으로서는, 세포상해성 T 세포 활성 등의 측정법을 들 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 회합체가 T 세포성 상해 활성을 갖는지 여부를, 공지의 방법에 의해 측정할 수 있다(예를 들면, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993) 등). 활성의 측정시에는, 본 발명과는 그 항원 결합 도메인이 결합하는 항원이 상이한 항원으로서 시험에 사용하는 세포가 발현되고 있지 않은 항원에 결합하는 폴리펩티드 회합체를, 본 발명의 폴리펩티드 회합체와 동일하게 대조로서 사용하여, 본 발명의 폴리펩티드 회합체가 대조로서 사용된 폴리펩티드 회합체보다도 강한 세포상해 활성을 나타냄으로써 활성이 판정될 수 있다.
또한, 생체내에서 세포상해 활성을 평가 또는 측정하기 위해서, 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드 회합체를 구성하는 항원 결합 도메인이 결합하는 항원을 발현하는 세포를, 비인간 피험 동물의 피내 또는 피하에 이식 후, 당일 또는 다음날부터 매일 또는 수일 간격으로 피험 폴리펩티드 회합체를 정맥 또는 복강 내에 투여한다. 종양의 크기를 날짜 경과에 따라 측정함으로써 당해 종양의 크기의 변화의 차이가 세포상해 활성으로 규정될 수 있다. 시험관 내에서의 평가와 동일하게 대조가 되는 폴리펩티드 회합체가 투여되고, 본 발명의 폴리펩티드 회합체의 투여군에 있어서의 종양의 크기가 대조 폴리펩티드 회합체의 투여군에 있어서의 종양의 크기보다도 유의하게 작은 것이 세포상해 활성을 갖는다고 판정할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 회합체의 접촉에 의한 당해 폴리펩티드 회합체를 구성하는 항원 결합 도메인이 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식에 대한 억제 효과를 평가 또는 측정하는 방법으로서는, 아이소토프 라벨한 thymidine의 세포로의 흡수 측정이나 MTT법이 적합하게 사용된다. 또한, 생체내에서 세포증식 억제 활성을 평가 또는 측정하는 방법으로서, 상기 기재의 생체내에 있어서 세포상해 활성을 평가 또는 측정하는 방법과 동일한 방법을 적합하게 사용할 수 있다.
또한 본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드 회합체 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 폴리펩티드 회합체를 포함하는, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 그 키트에는, 기타, 의약적으로 허용되는 담체, 매체, 사용방법을 기재한 지시서 등을 팩키징해 둘 수 있다.
또한 본 발명은, 본 발명의 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 폴리펩티드 회합체 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 폴리펩티드 회합체에 관한 것이다.
또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
이하에 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
〔실시예 1〕 GPC3 ERY2의 제작과 검토
(1) 개요
생체내에 투여된 단백질의 혈중 반감기를 연장하는 방법으로서는, 목적 단백질에 항체의 Fc 도메인을 부가하고, FcRn을 매개로 한 리사이클링 기능을 이용하는 방법이 잘 알려져 있다. 그러나 이때, 천연형의 Fc를 BiTE에 부가하면, 1개의 분자가 BiTE 부분의 항CD3 scFv를 매개로 T 세포와 결합하는 동시에, Fc 부분을 매개로 NK 세포, 대식세포 등의 세포막 상의 FcgR(Fcγ 수용체)과 결합함으로써, 암 항원 비의존적으로 이들 세포를 가교함으로써 활성화시켜, 각종 사이토카인의 유도로 이어질 가능성이 있는 것으로 생각되었다. 이에, BiTE에 폴리펩티드 링커를 매개로 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역(사일런트형 Fc)을 연결시킨 분자, ERY2가 제작되고, 이 활성을 BiTE와 비교하는 검증이 행해졌다. 간장암 세포에 있어서 고발현하고 있는 것이 알려져 있는 GPI 앵커 단백인 Glypican 3(GPC3)에 대한 항체의 scFv와 CD3 epsilon에 대한 항체의 scFv를 짧은 펩티드 링커로 연결함으로써, GPC3에 대한 BiTE(GPC3 BiTE)가 제작되었다(도 17A). 이어서, 이것에 사일런트형 Fc를 연결한 GPC3에 대한 ERY2(GPC3 ERY2)가 제작되었다(도 17C). 또한, 비교로서 통상의 IgG형 항GPC3 항체가 제작되었다. 이때, IgG형 항GPC3 항체는, ADCC 활성이 보다 증강하는 것이 알려져 있는, 당쇄 부분에 있어서 푸코오스 함량을 저감시킨 항체, 즉 저푸코오스형 항체로서 조제되었다.
(2) GPC3 BiTE의 제작
항GPC3 항체의 발현 벡터를 주형으로서 사용함으로써, PCR법에 의해 증폭된 H쇄 가변영역(anti-GPC3 VH), L쇄 가변영역(anti-GPC3 VL)을 코드하는 cDNA가 각각 취득되었다. 적절한 서열을 부가한 프라이머 및 당해 cDNA를 주형으로서 사용한 PCR법에 의해, anti-GPC3 VH와 anti-GPC3 VL이 Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：7)을 3회 반복하는 서열로 이루어지는 링커에 의해 연결된 아미노산 서열을 갖는 anti-GPC3 scFv를 코드하는 cDNA 단편이 제작되었다.
또한, 항CD3 항체(M12)의 H쇄 가변영역(M12 VH), 및 L쇄 가변영역(M12 VL)의 부분 서열을 코드하는 염기서열을 가지며, 그 말단 서열이 상보적 서열을 갖는 일련의 올리고뉴클레오티드가 제작되었다. 폴리머라아제 반응에 의해 이들 일련의 올리고뉴클레오티드가 그 상보적 서열부분을 매개로 연결되어 당해 H쇄 가변영역(M12 VH), 및 L쇄 가변영역(M12 VL)에 상당하는 폴리뉴클레오티드가 합성되도록 설계되었다. 당해 올리고뉴클레오티드가 혼합된 후, PCR법에 의해 이들 올리고뉴클레오티드가 연결되어, 각 가변영역의 아미노산 서열을 코드하는 2개의 cDNA가 취득되었다. 적절한 서열을 부가한 프라이머 및 이들의 cDNA를 주형으로서 사용한 PCR법에 의해, M12 VL과 M12 VH가 Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(서열번호：7)을 3회 반복하는 서열로 이루어지는 링커에 의해 연결된 아미노산 서열을 갖는 M12 scFv를 코드하는 cDNA 단편이 제작되었다.
다음으로, 적절한 서열을 부가한 프라이머 및 anti-GPC3 scFv와 M12 scFv를 각각 코드하는 cDNA 단편을 주형으로서 사용한 PCR법에 의해, anti-GPC3 scFv와 M12 scFv가 Gly·Gly·Gly·Gly·Ser 서열(서열번호：7)로 이루어지는 링커에 의해 연결되고, 또한 그 C 말단에 His 태그(8개의 His)가 부가된(서열번호：33으로 기재되는 아미노 말단의 19 아미노산을 제외한다) 아미노산 서열을 코드하는 cDNA 단편이 제작되었다.
적절한 서열을 부가한 프라이머 및 서열번호：33으로 기재되는 아미노 말단의 19 아미노산을 제외한 아미노산 서열을 코드하는 cDNA 단편을 주형으로서 사용한 PCR법에 의해, 당해 cDNA 단편의 5'측에 EcoRI 절단 서열, kozac 서열, 및 분비 시그날 서열을 코드하는 염기서열이 부가되고, 또한 그 3'측에 Not I 절단 서열이 부가된 cDNA 단편이 제작되었다. 이 cDNA 단편을, EcoRI, Not I으로 절단하고, 포유동물세포용 발현 벡터에 삽입함으로써, GPC3 BiTE(서열번호：33, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)의 발현 벡터를 취득하였다.
당해 벡터가 전기천공법(electroporation)에 의해 CHO 세포 DG44주로 유전자 도입되었다. 한계희석 후에 1 ㎎/mL Geneticine 존재하에서 유전자 도입된 세포를 배양함으로써 약제내성 세포주가 단리되었다. His 태그에 대한 항체를 사용하여, 얻어진 세포주의 배양상청에 대한 웨스턴 블롯 해석을 행함으로써, GPC3 BiTE를 발현하는 세포주가 선택되었다.
상기 세포주를 대량으로 배양함으로써 얻어진 배양상청이 SP Sepharose FF 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되었다. 당해 칼럼을 세정 후, GPC3 BiTE를 포함하는 분획이 NaCl의 농도 구배에 의해 용출되었다. 또한 당해 분획이 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되었다. 당해 칼럼의 세정 후, GPC3 BiTE를 포함하는 분획이 이미다졸의 농도 구배에 의해 용출되었다. 당해 분획이 한외 여과막으로 농축된 후에, 농축액이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되었다. 단량체의 GPC3 BiTE 분획만을 회수함으로써 정제 GPC3 BiTE가 얻어졌다.
(3) GPC3 ERY2의 제작
상기한 방법과 동일한 적절한 서열이 부가된 프라이머를 사용한 PCR법, 및 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene사)를 사용한 방법 등의 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해, GPC3 ERY2_Hk(서열번호：34, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), 및 GPC3 ERY2_Hh(서열번호：35, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)를 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터가 제작되었다.
이들 발현 벡터가 FreeStyle293-F 세포(Invitrogen사)에 함께 도입되어, 일과성으로 GPC3 ERY2를 발현시켰다. 얻어진 배양상청이 Anti FLAG M2 칼럼(Sigma사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 0.1 ㎎/mL FLAG 펩티드(Sigma사)에 의한 용출이 실시되었다. GPC3 ERY2를 포함하는 분획이 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 이미다졸의 농도 구배에 의한 용출이 실시되었다. GPC3 ERY2를 포함하는 분획이 한외 여과막으로 농축된 후, 농축액이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 그 용출액의 단량체의 GPC3 ERY2 분획만을 회수함으로써 정제 GPC3 ERY2가 얻어졌다.
(4) 저푸코오스형 항GPC3 항체의 제작
항GPC3 항체(WO2006/006693에 있어서 인간화 GC33 항체로서 기재되어 있다)의 발현 벡터가 전기천공법에 의해 GDP 푸코오스 녹아웃 CHO 세포 DXB11주(Cancer Sci. (2010) 101(10), 2227-33)에 유전자 도입되었다. 한계희석 후에 0.5 ㎎/mL Geneticine 존재하에서 배양함으로써 약제내성 주가 선택되어, 저푸코오스형 항GPC3 항체 발현주가 얻어졌다. 이 세포를 배양하여 조제한 배양상청으로부터, Hitrap(R) ProteinA(Pharmacia사)를 사용한 통상의 친화성 정제에 의해 항체 분획이 조제되었다. 다음으로 당해 항체 분획이 Superdex 20026/60(Pharmacia사)을 사용한 겔 여과 정제에 제공되고, 용출액의 모노머 분획을 분취(分取)함으로써 저푸코오스형 GPC3 항체가 얻어졌다.
(5) 인간 말초혈 단핵구를 사용한 세포상해 활성의 측정
(5-1) 인간 말초혈 단핵구(PBMC) 용액의 조제
1,000 단위/mL의 헤파린 용액(노보·헤파린 주사 5천 단위，노보·노르디스크사)을 사전에 100 μL 주입한 주사기를 사용하여, 건강한 정상인 자원봉사자(성인)로부터 말초혈 50 mL가 채취되었다. PBS(-)로 2배 희석한 후에 4등분된 말초혈이, 15 mL의 Ficoll-Paque PLUS를 사전에 주입하여 원심 조작이 행해진 Leucosep 림프구 분리관(Cat. No. 227290, Greiner bio-one사)에 첨가되었다. 당해 분리관의 원심 분리(2,150 rpm, 10분간, 실온) 후, 단핵구 분획층이 분취되었다. 10% FBS를 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Sigma사, 이하 10% FBS/D-MEM)으로 1회 단핵구 분획의 세포가 세정된 후, 당해 세포는 10% FBS/D-MEM을 사용하여 그 세포밀도가 4×106/mL로 조제되었다. 이와 같이 조제된 세포 용액이 인간 PBMC 용액으로서 이후의 시험에 사용되었다.
(5-2) 세포상해 활성의 측정
세포상해 활성은 xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저(로슈 다이어그노스틱스사)를 사용한 세포증식 억제율로 평가되었다. 표적 세포에는 SK-HEP-1 세포주에 인간 GPC3를 강제 발현시켜서 수립한 SK-pca13a 세포주가 사용되었다. SK-pca13a를 디쉬로부터 박리하고, 1×104 cells/well이 되도록 E-Plate 96(로슈 다이어그노스틱스사) 플레이트에 100 μL/well로 파종하여, xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저를 사용해서 생세포의 측정이 개시되었다. 다음날 xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저로부터 플레이트를 꺼내어, 당해 플레이트에 각 농도(0.004, 0.04, 0.4, 4 ㎚)로 조제한 각 항체 50 μL가 첨가되었다. 실온에서 15분간 반응시킨 후에 (5-1)에서 조제된 인간 PBMC 용액 50 μL(2×105 cells/well)가 첨가되고, xCELLigence 리얼타임 셀 애널라이저에 당해 플레이트를 다시 세팅함으로써, 생세포의 측정이 개시되었다. 반응은 5% 탄산가스, 37℃ 조건하에서 행해지고, 인간 PBMC 첨가 72시간 후의 Cell Index값으로부터, 아래 식에 의해 세포증식 억제율(%)이 구해졌다. 또한 계산에 사용한 Cell Index값은, 항체 첨가 직전의 Cell Index값이 1이 되도록 정규화한 후의 수치가 사용되었다.
세포증식 억제율(%)＝(A-B)×100/(A-1)
A는 항체를 첨가하지 않은 웰에 있어서의 Cell Index값의 평균값(표적 세포와 인간 PBMC만), B는 각 웰에 있어서의 Cell Index값의 평균값을 나타낸다. 시험은 세 차례 행해졌다.
인간 혈액으로부터 조제한 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 이펙터 세포로서 GPC3 BiTE, GPC3 ERY2, 및 IgG형 GPC3 항체의 세포상해 활성을 측정한 바, GPC3 BiTE에는 매우 강한 활성이 확인되었다(도 1). 이 활성은 저푸코오스형 항GPC3 항체보다도 훨씬 강한 것으로, GPC3 BiTE는 IgG형 항체를 능가하는 우수한 암 치료약이 될 수 있을 것으로 생각되었다. 한편, GPC3 ERY2에는 IgG형 항GPC3 항체를 상회하는 활성이 보였지만, GPC3 BiTE의 활성에는 미치지 못하였다. 이 사실로부터, 단순히 Fc를 BiTE에 부가하는 것만으로는 목적으로 하는 분자를 창제할 수 없는 것으로 생각되었다.
〔실시예 2〕 GPC3 ERY5, GPC3 ERY6, GPC3 ERY7의 제작과 검토
다음으로, 암 항원(GPC3)에 대한 결합 도메인을 2가로 함으로써, 암세포에 대한 결합 활성을 보다 높임으로써 비활성을 향상시키는 것을 시도하였다. GPC3 ERY2에 추가로 GPC3에 대한 scFv를 1개 더 부가한 형태의 GPC3 ERY5(도 17D), 부가하는 GPC3에 대한 결합 도메인을 scFv가 아니라 Fab의 형태로 한 GPC3 ERY7(도 17F)이 각각 제작되었다. 또한, GPC3 ERY5의 CD3 epsilon에 대한 scFv를 양 팔로 분리한 형태의 GPC3 ERY6(도 17E)도 제작되었다.
즉, 상기한 방법과 동일한 적절한 서열이 부가된 프라이머를 사용한 PCR법 등의 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해, GPC3 ERY5_Hh, GPC3 ERY6_Hk, GPC3 ERY6_Hh, GPC3 ERY7_Hh, GPC3 ERY7_L을 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 일련의 발현 벡터가 제작되었다.
이하에 나타내는 조합의 발현 벡터가 FreeStyle293-F 세포에 도입되어, 각 목적 분자를 일과성으로 발현시켰다.
A. 목적 분자：GPC3 ERY5
발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：GPC3 ERY5_Hh(서열번호：36, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY2_Hk
B. 목적 분자：GPC3 ERY6
발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：GPC3 ERY6_Hk(서열번호：37, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY6_Hh(서열번호：38, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)
C. 목적 분자：GPC3 ERY7
발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：GPC3 ERY7_Hh(서열번호：39, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY7_L(서열번호：40, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY2_Hk
얻어진 배양상청이 Anti FLAG M2 칼럼(Sigma사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 0.1 ㎎/mL FLAG 펩티드(Sigma사)에 의한 용출이 행해졌다. 목적 분자를 포함하는 분획이 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 이미다졸의 농도 구배에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 한외 여과막으로 농축된 후, 당해 분획이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 용출액의 단량체 분획만을 회수함으로써 정제된 각 목적 분자가 얻어졌다.
이들 폴리펩티드 회합체와 GPC3 BiTE의 세포상해 활성의 비교가 행해졌다. 그 결과, 이들 폴리펩티드 회합체의 세포상해 활성은 모두 GPC3 BiTE의 활성에 미치지 못하는 것이 명확해졌다(도 2~4). 이 사실로부터, BiTE의 구조, 또는 그것을 모방한 구조에 Fc를 부가하고, 또한 암 항원에 대해서 2가로 결합하는 구성만으로는 목적으로 하는 분자를 창제할 수 없는 것으로 생각되었다.
〔실시예 3〕 GPC3 ERY8-2, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1의 제작과 검토
(1) GPC3 ERY8-2, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1의 제작
다음으로, BiTE의 구조를 가지지 않고 목적의 활성을 갖는 분자의 창제가 시도되었다. 암 항원(GPC3)에 대한 IgG를 기본 골격으로 하고, 이것에 CD3 epsilon에 대한 scFv를 부가한 형태의 분자가 제작되었다. 이때, 기본 골격으로 하는 IgG의 Fc로서는, 전술한 경우와 동일하게, FcgR(Fcγ 수용체)에 대한 결합성이 감쇠된 사일런트형 Fc가 사용되었다. CD3 epsilon에 대한 scFv가 항GPC3 항체 IgG의 H쇄의 N 말단에 부가된 GPC3 ERY8-2(도 17G), H쇄의 C 말단에 부가된 GPC3 ERY10-1(도 17I), L쇄의 C 말단에 부가된 GPC3 ERY9-1(도 17H)이 각각 제작되었다.
즉, 상기한 방법과 동일한 적절한 서열을 부가한 프라이머를 사용한 PCR법 등의 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해, GPC3 ERY8-2_Hk(서열번호：41, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY8-2_Hh(서열번호：42, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY9-1_H(서열번호：43, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY9-1_L-His(서열번호：44, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY9-1_L-FLAG(서열번호：45, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY10-1_Hh(서열번호：46, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)를 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 일련의 발현 벡터가 제작되었다.
이하에 나타내는 조합의 발현 벡터가 FreeStyle293-F 세포에 도입되어, 각 목적 분자를 일과성으로 발현시켰다.
D. 목적 분자：GPC3 ERY8-2
발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：GPC3 ERY8-2_Hk(서열번호：41, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY8-2_Hh(서열번호：42, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY7_L
E. 목적 분자：GPC3 ERY9-1
발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：GPC3 ERY9-1_H(서열번호：43, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY9-1_L-His(서열번호：44, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY9-1_L-FLAG(서열번호：45, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)
F. 목적 분자：GPC3 ERY10-1
발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：GPC3 ERY10-1_Hh(서열번호：46, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY8-2_Hk, GPC3 ERY7_L
얻어진 배양상청이 Anti FLAG M2 칼럼(Sigma사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 0.1 ㎎/mL FLAG 펩티드(Sigma사)에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 이미다졸의 농도 구배에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 한외 여과에 의해 농축된 후, 당해 분획이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 용출액의 단량체 분획만을 회수함으로써 정제된 각 목적 분자가 얻어졌다.
이들 분자에 대해서 in vitro의 세포상해 활성을 조사한 바, 어느 분자도 GPC3 BiTE와 동등 이상의 세포상해 활성을 나타내는 것이 명확해졌다(도 5). 특히, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1은, 명확하게 GPC3 BiTE를 상회하는 세포상해 활성이 확인되었다. 본 발명에 있어서, 암 항원에 대한 IgG에 CD3 epsilon에 대한 scFv를 부가하는 분자에 있어서도 BiTE와 동등 이상의 세포상해 활성을 갖는 것이 처음으로 명확해졌다. 특히, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1과 같이 암 항원에 대한 결합 도메인과 CD3 epsilon에 대한 결합 도메인의 거리가 큰 분자에 있어서, BiTE보다도 명확하게 강한 세포상해 활성이 보인 것은 예상외의 결과였다.
(2) GPC3 ERY8-2, 및 GPC3 ERY10-1의 in vivo 약효의 평가：
(1)에서 기재된 in vitro의 어세이에서 GPC3 BiTE와 동등 이상의 세포상해 활성이 확인된 GPC3 ERY8-2, 및 GPC3 ERY10-1의 in vivo의 약효의 평가가 행해졌다. GPC3를 발현하는 인간 폐암 세포주인 PC-10이 인간 PBMC와 혼합되어 NOD scid 마우스에 이식되었다. 당해 마우스에 대해서 GPC3 ERY8-2, 또는 GPC3 ERY10-1의 투여에 의한 치료가 행해졌다(pre-mix 모델이라 지칭된다).
즉, GPC3 ERY8-2의 PC-10 pre-mix 모델에 의한 약효 시험에 있어서는, 하기와 같은 시험이 실시되었다. 건강한 정상인 자원봉사자로부터 채취한 혈액으로부터 분리된 PBMC로부터, CD56 MicroBeads, human(MCAS Miltenyi biotec사)을 사용하여 NK 세포가 제거되었다. 인간 폐 편평상피암 세포주 PC-10(면역 생물연구소) 5×106 세포와, NK 세포가 제거된 인간 PBMC 4.5×106 세포, 및 마트리겔 기저막 매트릭스(BD사)가 혼화되어, NOD scid 마우스(일본 클레아, 암컷, 7W)의 서혜부 피하에 이식되었다. 이식한 날을 day 0로 하였다. 마우스에는 이식 전날에 항아시알로 GM1 항체(와코 순약)가 0.2 ㎎/마리로 복강 내에 투여되었다. 이식 2시간 후에 GPC ERY8-2가 30 ㎍/마리로 복강 내 투여되었다. GPC ERY8-2의 투여가 day 0~4까지의 사이, 합계 5회 행해졌다.
또한, GPC3 ERY10-1의 PC-10 pre-mix 모델에 의한 약효 시험에 있어서는, 하기와 같은 시험이 실시되었다. 건강한 정상인 자원봉사자로부터 채취한 혈액으로부터 분리된 PBMC로부터, CD56 MicroBeads, human(MACS Miltenyi biotec사)을 사용하여 NK 세포가 제거되었다. 인간 폐 편평상피암 세포주 PC-10(면역 생물연구소) 5×106 세포와, NK 세포가 제거된 인간 PBMC 4.5×106 세포, 및 마트리겔 기저막 매트릭스(BD사)가 혼화되어, NOD scid 마우스(일본 클레아, 암컷, 7W)의 서혜부 피하에 이식되었다. 이식한 날을 day 0로 하였다. 마우스에는 이식 전날에 항아시알로 GM1 항체(와코 순약)가 0.2 ㎎/마리로 복강 내에 투여되었다. 이식 2시간 후에 GPC ERY10-1이 30 ㎍/마리로 복강 내 투여되었다. GPC ERY10-1의 투여가 day 0~4, day 7~11, day 14~16의 사이, 합계 13회 행해졌다.
그 결과, GPC3 ERY8-2, 또는 GPC3 ERY10-1 투여군에 있어서는, 대조인 용매(PBS) 투여군에 비해서 분명히 종양의 증식이 억제되는 것이 명확해졌다(도 6 및 7).
또한, 다른 모델에 있어서도 GPC3 ERY10-1에 의한 in vivo 약효의 평가가 행해졌다. 즉, 이식된 PC-10에 의한 종양의 형성이 확인된 NOD scid 마우스에, in vitro에서 인간 PBMC를 배양함으로써 증식시킨 T 세포가 이입되었다. 당해 마우스에 대해서 GPC3 ERY10-1을 투여하는 것에 의한 치료가 행해졌다(T 세포 이입 모델이라 지칭된다).
즉, GPC3 ERY10-1의 PC-10 T 세포 이입 모델에 의한 약효 시험에 있어서는, 하기와 같은 시험이 행해졌다. 건강한 정상인 자원봉사자로부터 채취한 혈액으로부터 분리된 PBMC 및 T cell activation/ expansion kit/ human(MACS Miltenyi biotec사)을 사용하여 T 세포의 확대 배양이 행해졌다. 인간 폐 편평상피암 세포주 PC-10(면역 생물연구소) 1×107 세포와, 마트리겔 기저막 매트릭스(BD사)가 혼화되어, NOD scid 마우스(일본 클레아, 암컷, 7W)의 서혜부 피하에 이식되었다. 이식한 날을 day 0로 하였다. 마우스에는 이식 전날, 및 day 6, 8, 12, 16, 20에 항아시알로 GM1 항체(와코 순약)가 0.2 ㎎/마리로 복강 내에 투여되었다. 이식 후 6일째에 종양 사이즈와 체중에 따라서 군 분류가 행해진 후, 상기 확대 배양에 의해 얻어진 T 세포가 1×107 세포/마리로 복강 내에 이식되었다. 그 2시간 후부터, GPC ERY10-1이 30 ㎍/마리로 복강 내 투여되었다. GPC ERY10-1의 투여는 day 7, 8, 12, 16, 17에, 합계 5회 행해졌다.
그 결과, 이 모델에 있어서도, GPC3 ERY10-1 투여군에 있어서는 용매 투여군과 비교하여 명확한 항종양 작용이 확인되었다(도 8).
이상의 사실로부터, 사일런트형 Fc를 갖는 IgG를 기본 골격으로 하고, 이것에 CD3 epsilon에 대한 항체의 scFv를 1개 부가한 형태의 일련의 분자는 명확한 in vivo에 있어서의 항종양 효과를 나타내는 것이 나타내어졌다.
(3) 혈장중 체류성의 평가
GPC3 ERY8-2, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1 등의 일련의 분자가, GPC3 BiTE와 비교하여 현저하게 긴 혈장중 반감기를 갖는지 여부를 검증하기 위해서, 암세포가 이식되어 있지 않은 NOD scid 마우스에 대해서 30 ㎍/마리로 투여된, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1의 혈장중 농도가 시간의 경과에 따라 측정되었다.
즉, 하기와 같은 PK 해석 시험이 실시되었다. NOD scid 마우스(일본 클레아, 암컷, 8W)의 복강 내에 GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1이 30 ㎍/마리로 투여되었다. 투여 후, 15분, 2시간, 1일, 2일, 7일의 각 포인트에서 마우스의 볼 정맥(buccal vein)으로부터 헤마토크릿 모세관(테루모)을 사용하여 채혈이 행해지고, 그의 혈장이 조제되었다.
GPC3를 발현시킨 Ba/F3 세포(GPC3/BaF) 및 인간 CD3 epsilon을 발현시킨 Ba/F3 세포(CD3/BaF)에 적절히 희석한 GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1이 첨가되고, GPC3 ERY9-1, 또는, GPC3 ERY10-1과 GPC3/BaF 또는 CD3/BaF와 반응시켰다. 이들 세포의 세정 후, FITC 표지된 2차 항체가 첨가되고, 당해 2차 항체를 추가로 반응시켰다. 당해 세포의 세정 후, Epics XL 플로우 사이토미터(Beckman coulter사)에 의해 당해 세포에 표지된 형광강도가 측정되어, 각 항체에 대한 표준 곡선이 작성되었다.
GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1이 투여된 마우스로부터 시간의 경과에 따라 채취된 혈액으로부터 조제된 혈장이 적절히 희석되었다. 상기의 표준 곡선 작성의 경우와 동일하게 당해 혈장과 GPC3/BaF, CD3/BaF를 반응시켜, 혈장중에 존재하는 GPC3 ERY9-1 및 GPC3 ERY10-1의 각 세포에 대한 결합량이 측정되었다. 측정된 값과 상기의 표준 곡선을 사용하여, 혈장중의 각 항체 농도가 산출되었다.
그 결과, GPC3 ERY9-1 및 GPC3 ERY10-1은 모두, 투여 후 2일 후에 있어서 10 nM 이상의 혈중 농도를 유지하고 있는 것이 명확해졌다(도 9 및 10). 이 결과로부터, GPC3 ERY9-1 및 GPC3 ERY10-1 등의 일련의 분자의 혈장중 반감기는 BiTE에 비해서 현저하게 개선되어 있는 것이 나타내어졌다.
(4) 암 항원 비의존적 사이토카인 유도에 있어서의 사일런트 Fc의 효과
(4-1) FcgR 결합형 Fc를 갖는 GPC3 ERY15-1의 제작
GPC3 ERY8-2, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1 등의 일련의 분자가 암 항원 비의존적인 사이토카인의 유도를 일으키는지 여부를 검증하기 위해서, FcgR 결합형 Fc를 갖는 GPC3 ERY15-1(도 17J)을 제작하였다.
즉, 상기의 방법과 동일하게, 적절한 서열을 부가한 프라이머를 사용한 PCR법, 및 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene사)를 사용한 방법 등의 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해, GPC3 ERY15-1_Hh(서열번호：47, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY15-1_Hk(서열번호：48, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)를 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터가 제작되었다.
GPC3 ERY15-1_Hh(서열번호：47, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY15-1_Hk(서열번호：48, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), 및 GPC3 ERY7_L의 발현 벡터가 모두 FreeStyle293-F 세포에 도입되어, GPC3 ERY15-1을 일과성으로 발현시켰다. 얻어진 배양상청이 Anti FLAG M2 칼럼(Sigma사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 0.1 ㎎/mL FLAG 펩티드(Sigma사)에 의한 용출이 실시되었다. GPC3 ERY15-1을 포함하는 분획이 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 이미다졸의 농도 구배에 의한 용출이 실시되었다. GPC3 ERY15-1을 포함하는 분획이 한외 여과에 의해 농축된 후, 당해 분획이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 용출액의 단량체의 GPC3 ERY15-1 분획만을 회수함으로써 정제 GPC3 ERY15-1이 얻어졌다.
(4-2) 암 항원 비의존적인 사이토카인 유도능의 측정
GPC3 ERY15-1의 암 항원 비의존적인 사이토카인 유도능이, GPC3 BiTE, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1, 및 catumaxomab의 유도능과 비교되었다. 건강한 정상인 자원봉사자로부터 채취한 혈액으로부터 상기의 방법에 의해 PBMC가 조제되었다. 인간 PBMC 용액 50 μL(2×105 세포/웰)에, 40 nM으로 조제된 각 항체 50 μL가 첨가되고, 추가로 100 μL의 10% FBS/D-MEM이 첨가되었다. 반응액은 5% 탄산가스, 37℃ 조건하에서 배양되었다. 72시간의 배양 후에, 배양상청이 회수되고, Human Th1/Th2/Th17 Kit(BD사)를 사용한 Cytometric Beads Array(CBA)법으로 배양상청 중에 분비된 사이토카인이 정량되었다. 첨부 프로토콜에 따른 측정방법에 의한 시험은 세 차례 행해졌다.
그 결과, FcgR 결합형 Fc를 갖는 GPC3 ERY15-1, catumaxomab에는 명확한 사이토카인 유도가 확인된 것에 대해서, Fc를 갖지 않는 GPC3 BiTE, 및 사일런트형 Fc를 갖는 GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1에서는 사이토카인 유도가 확인되지 않았다(도 11). 따라서, 사일런트형 Fc를 갖는 GPC3 ERY8-2, GPC3 ERY9-1, GPC3 ERY10-1 등의 일련의 분자는 암 항원 비의존적인 사이토카인 유도를 일으키지 않고, 매우 높은 안전성을 갖는 분자인 것으로 생각되었다.
〔실시예 4〕 GPC3 ERY18 L1, L2, L3, L4, S1의 제작과 검토
scFv 구조와 상이한 CD3 결합 도메인을 갖는 분자의 검토가 행해졌다. 암 항원(GPC3)에 대한 IgG의 2개의 H쇄의 C 말단에 각각 CD3 항체의 VH 영역, VL 영역을 결합한 분자형인 GPC3 ERY18(도 17K)이 제작되었다. 이때, 사이의 링커(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)의 개수를 1개~4개로 바꾼 일련의 분자(GPC3 ERY18 L1~L4)가 제작되었다. 또한, 적절한 부위의 아미노산을 Cys로 치환하여 디설피드 결합을 도입하는 것을 가능하게 하는 분자(GPC3 ERY18 S1)도 동시에 제작되었다.
즉, 상기의 방법과 동일하게 적절한 서열을 부가한 프라이머를 사용한 PCR법 등의 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해, GPC3 ERY18 L1_Hh(서열번호：49, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 L1_Hk(서열번호：50, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 L2_Hh(서열번호：51, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 L2_Hk(서열번호：52, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 L3_Hh(서열번호：53, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 L3_Hk(서열번호：54, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 L4_Hh(서열번호：55, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 L4_Hk(서열번호：56, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 S1_Hh(서열번호：57, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 S1_Hk(서열번호：58, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)를 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 일련의 발현 벡터가 제작되었다.
이하에 나타내는 조합의 발현 벡터가 FreeStyle293-F 세포에 도입되어, 각 목적 분자를 일과성으로 발현시켰다.
G. 목적 분자：GPC3 ERY18 L1
발현 벡터：GPC3 ERY18 L1_Hh(서열번호：49, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 L1_Hk(서열번호：50, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), 및 GPC3 ERY7 L
H. 목적 분자：GPC3 ERY18 L2
발현 벡터：GPC3 ERY18 L2_Hh(서열번호：51, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 L2_Hk(서열번호：52, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), 및 GPC3 ERY7 L
I. 목적 분자：GPC3 ERY18 L3
발현 벡터：GPC3 ERY18 L3_Hh(서열번호：53, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 L3_Hk(서열번호：54, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), 및 GPC3 ERY7 L
J. 목적 분자：GPC3 ERY18 L4
발현 벡터：GPC3 ERY18 L4_Hh(서열번호：55, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 L4_Hk(서열번호：56, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), 및 GPC3 ERY7 L
K. 목적 분자：GPC3 ERY18 S1
발현 벡터：GPC3 ERY18 S1_Hh(서열번호：57, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY18 S1_Hk(서열번호：58, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), 및 GPC3 ERY7 L
얻어진 배양상청이 Anti FLAG M2 칼럼(Sigma사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 0.1 ㎎/mL FLAG 펩티드(Sigma사)에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 이미다졸의 농도 구배에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 한외 여과에 의해 농축된 후, 당해 분획이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 용출액의 단량체 분획만을 회수함으로써 정제된 각 목적 분자가 얻어졌다.
GPC3 ERY18 L1, GPC3 ERY18L2, GPC3 ERY18L3, GPC3 ERY18L4, GPC3 ERY18S1의 각 분자의 in vitro의 세포상해 활성이 평가되었다(도 12 및 13). 그 결과, GPC3 ERY18 L1을 제외한 어느 분자도 GPC3 ERY10-1과 동등한 활성을 갖는 것이 발견되었다. scFv가 아닌 구조를 갖는 분자가 동등한 세포상해 활성을 갖는 것이 나타내어졌다. 암 항원(GPC3)에 대한 IgG의 2개의 H쇄의 C 말단에 각각 CD3 항체의 VH 영역, VL 영역을 결합한 구조에 의한, 본원 발명의 폴리펩티드 회합체 분자의 안정화에 대한 공헌이 기대된다.
〔실시예 5〕 GPC3 ERY19-3의 제작과 검토
다음으로, CD3 결합 도메인이 Fab 유사 구조인 분자의 검토가 행해졌다. 암 항원(GPC3)에 대한 IgG 항체의 2개의 H쇄의 C 말단에 각각 CD3 항체의 VH 영역과 CH1 영역, 및 VL 영역과 CL 영역이 결합한 분자형인 GPC3 ERY19-3가 제작되었다(도 17L). 즉, 상기의 방법과 동일하게 적절한 서열을 부가한 프라이머를 사용한 PCR법 등의 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해, GPC3 ERY19-3_Hh(서열번호：59, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY19-3_Hk(서열번호：60, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)를 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터가 제작되었다.
GPC3 ERY19-3_Hh(서열번호：59, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), GPC3 ERY19-3_Hk(서열번호：60, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), 및 GPC3 ERY7_L의 발현 벡터가 함께 FreeStyle293-F 세포에 도입되어, 일과성으로 GPC3 ERY19-3를 발현시켰다. 얻어진 배양상청이 HiTrap rProtein A FF 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 산에 의한 용출이 실시되었다. GPC3 ERY19-3를 포함하는 분획이 한외 여과에 의해 농축된 후, 당해 분획이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 용출액의 단량체의 GPC3 ERY19-3 분획만을 회수함으로써 정제 GPC3 ERY19-3가 얻어졌다.
GPC3 ERY19-3 분자에 의한 in vitro의 세포상해 활성이 평가되었다. 그 결과, GPC3 BiTE와 동등한 활성을 갖는 것이 나타내어졌다(도 14). Fab 유사 구조를 갖는 CD3 결합 도메인에 의한, 본원 발명의 폴리펩티드 회합체 분자의 안정화에 대한 공헌이 기대된다.
〔실시예 6〕 GPC3 ERY 10-1의 CH3 도메인으로의 변이 도입에 의한 프로테인 A 정제 공정만을 사용한 폴리펩티드 회합체의 조제
(1) 개요
실시예 3에서 조제된 GPC3 ERY10-1에서는, CH3 도메인의 구조로서 knobs-into-hole이 사용되고 있다. 각각의 H쇄의 C 말단에는 His 태그와 FLAG 태그가 부가되어 있어, 이들 태그를 사용한 2종류의 친화성 정제를 행함으로써, 목적으로 하고 있는 2종류의 H쇄가 헤테로 회합화한 GPC3 ERY10-1 분자가 정제되었다. GPC3 ERY10-1 분자를 의약품으로서 제조하는 경우, GPC3 ERY10-1을 발현하는 세포의 배양상청으로부터 프로테인 A 크로마토그래피를 사용하여 Fc 도메인을 갖는 폴리펩티드 회합체가 먼저 정제된다. 추가로, His 태그 친화성 크로마토그래피와 FLAG 태그 친화성 크로마토그래피의 2종류의 크로마토그램을 사용한 정제 공정이 필요해져, 정제 공정의 비용이 높아진다고 하는 과제가 있다. 이에 본 실시예에서는, His 태그와 FLAG 태그를 사용하지 않고, 프로테인 A 크로마토그래피만을 사용함으로써 목적으로 하는 2종류의 H쇄가 헤테로 회합화한 GPC3 ERY10-1 분자를 정제하는 것을 가능하게 하는 분자 개변의 검토가 행해졌다.
구체적으로는, 2종류의 H쇄 중, 한쪽의 H쇄의 프로테인 A에 대한 결합을 없애는 개변의 검토가 행해졌다. 이 개변에 의해, 프로테인 A에 대한 결합을 없앤 H쇄가 호모 회합화한 분자는, 프로테인 A에 결합할 수 없기 때문에 프로테인 A 크로마토그래피를 패스한다. 한편, 프로테인 A에 대한 결합을 없앤 H쇄와 프로테인 A에 대한 결합을 유지하고 있는 H쇄가 헤테로 회합화한 분자와, 프로테인 A에 대한 결합을 유지하고 있는 H쇄가 호모 회합화한 분자의, 프로테인 A에 대한 결합성의 상이를 이용함으로써, 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 이들 분자의 분리가 가능하다고 생각되었다. 이때, 항체의 Fc 도메인에 있어서, 프로테인 A와 항체의 혈장중 체류성에 중요한 FcRn이 결합하는 개소는 중복되어 있는 것으로부터, FcRn에 대한 결합성을 유지한 채로, 프로테인 A에 대한 결합성만을 선택적으로 저감할 필요가 있다. 그러한 개변으로서, EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이가 발견되었다. 이 변이에 더하여, 2종류의 H쇄의 헤테로 회합화를 촉진하는 개변으로서 WO2006/106905에 기재된 변이(한쪽의 H쇄의 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하고, 다른 한쪽의 H쇄의 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환)를 조합시킴으로써, 프로테인 A 크로마토그래피만으로 GPC3 ERY10-1 등의 폴리펩티드 회합체 분자를 정제하는 것이 가능한지 여부가 검증되었다.
(2) 항체 유전자 발현 벡터의 제작과 각 항체의 발현
항체 H쇄 가변영역으로서, GC33(2)H(항인간 Glypican-3 항체 H쇄 가변영역, 서열번호：61, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)를 코드하는 유전자가 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해 제작되었다. 동일하게, 항체 L쇄로서, GC33-k0(항인간 Glypican-3 항체 L쇄, 서열번호：62, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)를 코드하는 유전자가 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해 제작되었다. 다음으로, 항체 H쇄 정상영역으로서, 이하에 나타내는 유전자가 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해 제작되었다.
L. 목적 분자：LALA-G1d
IgG1의 서열 중의 EU 넘버링 234번째 및 235번째의 Leu가 Ala로 치환되고, 297번째의 Asn이 Ala로 치환된 변이가 도입되며, C 말단의 Gly 및 Lys가 제거된 LALA-G1d(서열번호：63, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)
M. 목적 분자：LALA-G1d-CD3
LALA-G1d(서열번호：63, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)에 CD3의 scFv(항인간 CD3 항체 H쇄 가변영역 및 항인간 CD3 항체 L쇄 가변영역이 폴리펩티드 링커를 매개로 결합된 것)가 C 말단에 결합된 LALA-G1d-CD3(서열번호：64, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)
N. 목적 분자：LALA-G3S3E-G1d
LALA-G1d(서열번호：63, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)의 서열 중 EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이 및 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이가 도입된 LALA-G3S3E-G1d(서열번호：65, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)
O. 목적 분자：LALA-S3K-G1d-CD3
LALA-G1d-CD3(서열번호：64, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)의 서열 중 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하는 변이가 도입된 LALA-S3K-G1d-CD3(서열번호：66, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다).
GC33(2) H의 하류에 LALA-G1d-CD3 또는 LALA-G1d를 연결함으로써, 항인간 GPC3 항체 H쇄 유전자 NTA1L 또는 NTA1R이 제작되었다. GC33(2) H의 하류에 LALA-S3K-G1d-CD3 또는 LALA-G3S3E-G1d를 연결함으로써, 항인간 GPC3 항체 H쇄 유전자 NTA2L 또는 NTA2R이 제작되었다.
NTA1L, NTA1R, NTA2L, NTA2R(H쇄) 및 GC33-k0(L쇄)의 각 유전자를, 동물세포 발현 벡터에 삽입함으로써 당해 유전자의 발현 벡터가 제작되었다. 이하에 나타내는 조합에 의해, 이들 벡터가 당업자 공지의 방법으로 FreeStyle293 세포(Invitrogen사)에 도입됨으로써, 하기에 나타내는 각 폴리펩티드 회합체를 일과성으로 발현시켰다. 이하에 나타내는 바와 같이, 도입한 유전자의 조합을 제1 H쇄/제2 H쇄/L쇄의 순번으로 나타냄으로써 폴리펩티드 회합체의 이름으로서 표기되어 있다.
NTA1L/NTA1R/GC33-k0
NTA2L/NTA2R/GC33-k0
(3) 발현 샘플의 정제와 헤테로 회합체 형성의 평가
하기에 나타내는 폴리펩티드 회합체를 포함하는 FreeStyle293 세포의 배양상청(이하 CM으로 지칭된다)이 시료로서 사용되었다.
NTA1L/NTA1R/GC33-k0
NTA2L/NTA2R/GC33-k0
D-PBS로 평형화한 rProtein A Sepharose Fast Flow 칼럼(GE Healthcare)에 ø0.22 ㎛ 필터로 여과한 CM이 부하되고, 표 1에 나타내는 버퍼에 의해 세정 1, 2, 및 용출 1의 각 스텝이 실시되었다. 부하되는 항체량이 20 ㎎/mL resine이 되도록 CM의 부하량이 조절되었다. 분취된 용출 분획의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석에 의해, 용출 분획에 포함되어 있는 성분이 동정되었다.
Figure pct00001
각 용출 분획의 사이즈 배제 크로마토그래피 분석의 결과를 도 15 및 표 2에 나타내었다. 값은 용출 피크의 면적이 퍼센트로 표기되어 있다. NTA1L/NTA1R/GC33-k0 및 NTA2L/NTA2R/GC33-k0를 발현시킨 CM 중에는, 모두 CD3에 대한 호모 항체(NTA1L/GC33-k0, NTA2L/GC33-k0)가 거의 검출되지 않았다. GPC3에 대한 호모 항체(NTA2R/GC33-k0)에 관해서는, NTA1L/NTA1R/GC33-k0를 발현시킨 CM 중에서는 76% 정도 검출된 것에 대해서, NTA2L/NTA2R/GC33-k0를 발현시킨 CM 중에서는 2% 정도밖에 검출되지 않았다. 즉, EU 넘버링 435번째의 His를 Arg로 치환하는 변이에 더하여, 각 H쇄의 헤테로 분자를 효율적으로 형성시키기 위해서, 한쪽의 H쇄의 폴리펩티드 서열 중의 EU 넘버링 356번째의 Asp를 Lys로 치환하는 변이 및 다른 한쪽의 H쇄의 폴리펩티드 서열 중의 EU 넘버링 439번째의 Lys를 Glu로 치환하는 변이를 도입함으로써, 프로테인 A를 사용한 정제 공정만으로, 목적의 GPC3 ERY10-1과 동일한 분자형으로 이루어지는 헤테로로 회합하는 폴리펩티드 회합체를 98% 이상의 순도로 효율적으로 정제하는 것이 가능한 것이 명확해졌다.
Figure pct00002
〔실시예 7〕 GPC3 ERY 17-2 및 GPC3 ERY 17-3의 제작과 검토
(1) GPC3 ERY 17-2 및 GPC3 ERY 17-3의 제작
다음으로, 암 항원(GPC3)에 대한 IgG를 기본 골격으로 하고, 한쪽의 Fab를 CD3 epsilon에 대한 결합 도메인으로 치환한 형태의 분자가 제작되었다. 이때, 기본 골격으로 하는 IgG의 Fc로서는, 전술한 경우와 동일하게, FcgR(Fcγ 수용체)에 대한 결합성이 감쇠된 사일런트형 Fc가 사용되었다. CD3 epsilon에 대한 결합 도메인으로서, CD3 epsilon에 대한 Fab의 VH 도메인과 VL 도메인을 치환한 GPC3 ERY17-2(도 19A)와, CH1 도메인과 CL 도메인을 치환한 GPC3 ERY17-3(도 19B)가 각각 제작되었다.
즉, 상기한 방법과 동일한 적절한 서열을 부가한 프라이머를 사용한 PCR법 등의 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해, ERY17-2_Hh(서열번호：73, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), ERY17-2_L(서열번호：74, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), ERY17-3_Hh(서열번호：75, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), ERY17-3_L(서열번호：76, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)을 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 일련의 발현 벡터가 제작되었다.
이하에 나타내는 조합의 발현 벡터가 FreeStyle293-F 세포에 도입되어, 각 목적 분자를 일과성으로 발현시켰다.
P. 목적 분자：GPC3 ERY17-2
발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：GPC3 ERY8-2_Hk, GPC3 ERY7_L, ERY17-2_Hh(서열번호：73, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), ERY17-2_L(서열번호：74, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)
Q. 목적 분자：GPC3 ERY17-3
발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：GPC3 ERY8-2_Hk, GPC3 ERY7_L, ERY17-3_Hh(서열번호：75, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), ERY17-3_L(서열번호：76, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)
(2) GPC3 ERY 17-2 및 GPC3 ERY 17-3의 정제
얻어진 배양상청이 Anti FLAG M2 칼럼(Sigma사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 0.1 ㎎/mL FLAG 펩티드(Sigma사)에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 이미다졸의 농도 구배에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 한외 여과에 의해 농축된 후, 당해 분획이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 용출액의 단량체 분획만을 회수함으로써 정제된 각 목적 분자가 얻어졌다.
(3) GPC3 ERY 17-2 및 GPC3 ERY 17-3의 세포상해 활성
GPC3 ERY 17-2 및 GPC3 ERY 17-3에 대해서 in vitro의 세포상해 활성이 조사되었다(도 20). 그 결과, 어느 분자도 명확하게 GPC3 BiTE를 상회하는 세포상해 활성을 나타내는 것이 확인되었다. 본 발명에 있어서, 암 항원에 대한 IgG를 기본 골격으로 하고, 편측의 Fab를 CD3 epsilon에 대한 결합 도메인으로 치환한 분자도 BiTE와 동등 이상의 세포상해 활성을 나타내는 것이 처음으로 명확해졌다.
(4) PC-10 T 세포 이입 모델을 사용한 GPC3 ERY17-2의 약효 시험
in vitro의 어세이에서 GPC3 BiTE와 동등 이상의 세포상해 활성이 확인된 GPC3 ERY17-2의 in vivo의 약효의 평가가 PC-10 T 세포 이입 모델을 사용하여 행해졌다. 즉, GPC3 ERY17-2의 PC-10 T 세포 이입 모델에 의한 약효 시험에 있어서는, 하기와 같은 시험이 행해졌다. 건강한 정상인 자원봉사자로부터 채취한 혈액으로부터 분리된 PBMC 및 T cell activation/ expansion kit/ human(MACS Miltenyi biotec사)을 사용하여 T 세포의 확대 배양이 행해졌다. 인간 폐 편평상피암 세포주 PC-10(면역 생물연구소) 1×107 세포와, 마트리겔 기저막 매트릭스(BD사)가 혼화되어, NOD scid 마우스(일본 클레아, 암컷, 7W)의 서혜부 피하에 이식되었다. 이식한 날을 day 0로 하였다. 마우스에는 이식 전날, 및 day 13, 17, 21, 25에 항아시알로 GM1 항체(와코 순약)가 0.2 ㎎/마리로 복강 내에 투여되었다. 이식 후 13일째에 종양 사이즈와 체중에 따라서 군 분류가 행해지고, 이식 후 14일째에 상기 확대 배양에 의해 얻어진 T 세포가 3×107 세포/마리로 복강 내에 이식되었다. 그 2시간 후부터, GPC ERY17-2가 30 ㎍/마리로 정맥 내 투여되었다. GPC ERY17-2의 투여는 day 14, 15, 16, 17, 18에, 합계 5회 행해졌다.
그 결과, 이 모델에 있어서도, GPC3 ERY17-2 투여군에 있어서는 용매 투여군과 비교하여 명확한 항종양 작용이 확인되었다(도 21).
이상의 사실로부터, 암 항원에 대한 IgG를 기본 골격으로 하고, 편측의 Fab를 CD3 epsilon에 대한 결합 도메인으로 치환한 분자는 명확한 in vivo에 있어서의 항종양 효과를 나타내는 것이 나타내어졌다.
〔실시예 8〕 GPC3 ERY17-2-M20의 제작과 검토
(1) GPC3 ERY17-2-M20의 제작
다음으로, CD3 epsilon에 대한 결합 도메인의 서열이 바뀌어도 목적의 활성을 갖는 분자의 창제가 시도되었다. GPC3 ERY17-2의 CD3 epsilon에 대한 결합 도메인의 서열을 바꾼 GPC3 ERY17-2-M20(도 19A)이 제작되었다. 즉, CD3 항체(M20)의 발현 벡터가 주형으로서 사용되고, 상기한 방법과 동일한 적절한 서열을 부가한 프라이머를 사용한 PCR법 등의 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해, ERY17-2-M20_Hh(서열번호：77, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), ERY17-2-M20_L(서열번호：78, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)을 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 일련의 발현 벡터가 제작되었다.
(2) GPC3 ERY17-2-M20의 정제
GPC3 ERY8-2_Hk, GPC3 ERY7_L, ERY17-2-M20_Hh(서열번호：77), 및 ERY17-2-M20_L(서열번호：78)의 발현 벡터가 함께 FreeStyle293-F 세포에 도입되어, 일과성으로 GPC3 ERY17-2-M20을 발현시켰다. 얻어진 배양상청이, ø0.22 ㎛ 필터로 여과된 후, 평형화된 rProtein A Sepharose Fast Flow 칼럼(GE Healthcare)에 부하되었다. 표 3에 나타내는 버퍼에 의해 세정 1, 2, 및 용출 1의 각 스텝이 실시됨으로써 정제 GPC3 ERY17-2-M20이 얻어졌다.
Figure pct00003
(3) GPC3 ERY17-2-M20의 세포상해 활성
GPC3 ERY17-2-M20의 in vitro의 세포상해 활성을 조사한 바, GPC3 ERY17-2와 거의 동등한 세포상해 활성이 확인되었다(도 22). 이 사실로부터 CD3 epsilon에 대한 결합 도메인의 서열이 바뀐 분자에 있어서도 동등한 세포상해 활성을 갖는 것이 명확해졌다.
〔실시예 9〕 EpCAM ERY17-2, EpCAM ERY17-3의 제작과 검토
(1) EpCAM ERY17-2, EpCAM ERY17-3의 제작
다음으로, 표적으로 하는 암 항원이 바뀌어도 목적의 활성을 갖는 분자의 창제가 시도되었다. GPC3 ERY17-2의 GPC3에 대한 Fab를 EpCAM에 대한 Fab로 바꾼 EpCAM ERY17-2(도 19A)와, GPC3 ERY17-3의 GPC3에 대한 Fab를 EpCAM에 대한 Fab로 바꾼 EpCAM ERY17-3(도 19B)가 각각 제작되었다. 즉, EpCAM 항체의 발현 벡터가 주형으로서 사용되고, 상기한 방법과 동일한 적절한 서열을 부가한 프라이머를 사용한 PCR법 등의 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해, EpCAM ERY17_Hk(서열번호：79, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), EpCAM ERY17_L(서열번호：80, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)를 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 일련의 발현 벡터가 제작되었다.
이하에 나타내는 조합의 발현 벡터가 FreeStyle293-F 세포에 도입되어, 각 목적 분자를 일과성으로 발현시켰다.
R. 목적 분자：EpCAM ERY17-2
발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：EpCAM ERY17_Hk(서열번호：79, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), EpCAM ERY17_L(서열번호：80, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), ERY17-2_Hh, ERY17-2_L
S. 목적 분자：EpCAM ERY17-3
발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：EpCAM ERY17_Hk, EpCAM ERY17_L, ERY17-3_Hh, ERY17-3_L
(2) EpCAM ERY17-2, EpCAM ERY17-3의 정제
얻어진 배양상청이 Anti FLAG M2 칼럼(Sigma사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 0.1 ㎎/mL FLAG 펩티드(Sigma사)에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 이미다졸의 농도 구배에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 한외 여과에 의해 농축된 후, 당해 분획이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 용출액의 단량체 분획만을 회수함으로써 정제된 각 목적 분자가 얻어졌다.
(3) EpCAM ERY17-2, EpCAM ERY17-3의 세포상해 활성
EpCAM ERY17-2, EpCAM ERY17-3의 in vitro의 세포상해 활성을 조사한 바, 어느 분자에 있어서도 강한 세포상해 활성이 확인되었다(도 23). 본 발명에 있어서, 암 항원에 대한 IgG를 기본 골격으로 하고, 편측의 Fab를 CD3 epsilon에 대한 결합 도메인으로 치환한 분자에 있어서, 암 항원의 종류를 바꾸어도 세포상해 활성을 갖는 것이 명확해졌다.
〔실시예 10〕 CH1/CL 계면 회합 제어가 도입된 이중 특이성 항체의 제작과 검토
(1) 이중 특이성 항체의 설계
이중 특이성 항체의 각각의 CH1과 CL 도메인에 변이를 도입하고, CH1/CL의 계면의 전하적인 반발을 이용하여, CH1/CL의 계면 회합을 제어함으로써, GPC3에 대한 H쇄와 L쇄만이 회합하고, CD3에 대한 H쇄와 L쇄만을 각각 특이적으로 회합시키는 것이 가능하다고 생각되었다. 전하적인 반발을 이용하여 CH1/CL 계면 회합의 제어를 행하기 위해서, H쇄의 CH1, 또는 L쇄의 CL 중의 아미노산 잔기가, 양전하인 Lys, 또는 음전하인 Glu로 치환되었다.
(2) 항체 유전자 발현 벡터의 제작과 각 항체의 발현
Anti-CD3 항체인 M12(H쇄, 서열번호：81 및 L쇄, 서열번호：82)와, Anti-GPC3 항체인 GC33(2)(H쇄, 서열번호：83 및 L쇄, 서열번호：84)에 CH1/CL 계면 회합 제어가 도입되고, 추가로 H쇄끼리의 회합을 피하기 위해, Knob into Hole(KiH)(WO1996/027011, Ridgway JB 등(Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant AM 등(Nat. Biotechnol. (1998) 16, 677-681))의 개변이 도입된 이중 특이성 항체가 제작되었다(도 24A). 대조로서, CH1/CL 계면 회합 제어도 Knob into Hole(KiH) 개변도 도입되어 있지 않은 이중 특이성 항체도 제작되었다(도 24B). 구체적으로는, M12의 H쇄(서열번호：81)의 CH1의 몇개의 아미노산이 Lys로 치환된 M12_TH2h(서열번호：85), L쇄(서열번호：82)의 CL의 몇개의 아미노산이 Glu로 치환된 M12_TL17(서열번호：86)를 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터가 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해 제작되었다. 동일하게, GC33(2)의 H쇄(서열번호：83)의 CH1의 몇개의 아미노산이 Glu로 치환된 GC33(2)_TH13k(서열번호：87), GC33(2)_TH15k(서열번호：88), L쇄(서열번호：84)의 CL의 몇개의 아미노산이 Lys로 치환된 GC33(2)_TL16(서열번호：89), GC33(2)_TL19(서열번호：90)를 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 벡터가 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해 제작되었다.
이하에 나타내는 서열을 코드하는 발현 벡터의 조합이 FreeStyle293-F 세포에 도입되어, 각 목적 분자를 일과성으로 발현시켰다.
T. 목적 분자：GM1
발현 벡터：M12_TH2h(서열번호：85), M12_TL17(서열번호：86), GC33(2)_TH13k(서열번호：87), 및 GC33(2)_TL16(서열번호：89)
U. 목적 분자：GM2
발현 벡터：M12_TH2h(서열번호：85), M12_TL17(서열번호：86), GC33(2)_TH15k(서열번호：88), 및 GC33(2)_TL19(서열번호：90)
V. 목적 분자：GM0
발현 벡터：M12의 H쇄(서열번호：81), M12의 L쇄(서열번호：82), GC33(2)의 H쇄(서열번호：83), 및 GC33(2)의 L쇄(서열번호：84)
얻어진 배양상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare사)를 사용한 당업자 공지의 방법으로, 항체가 정제되었다.
(3) GM1, GM2, GM0 세포상해 활성
GM1, GM2, GM0의 각 폴리펩티드 회합체의 in vitro의 세포상해 활성을 조사한 바, GM1 및 GM2는 동등한 세포상해 활성을 나타내는 것이 확인되고, 또한 그 활성은 명확하게 GM0의 활성을 상회하는 세포상해 활성이었다(도 25). 본 발명에 있어서, CH1/CL 계면 제어의 도입과 KiH의 개변을 조합시킴으로써 효율적으로 이중 특이성 항체가 제작되는 것이 명확해졌다.
〔실시예 11〕 EGFR ERY17-2의 제작과 검토
(1) EGFR ERY17-2의 제작
또한 다른 암 항원을 표적으로 한 목적의 활성을 갖는 분자의 창제가 시도되었다. GPC3 ERY17-2의 GPC3에 대한 Fab를 EGFR에 대한 Fab로 바꾼 EGFR ERY17-2(도 19A)가 제작되었다. 즉, EGFR 항체의 발현 벡터가 주형으로서 사용되고, 상기한 방법과 동일한 적절한 서열을 부가한 프라이머를 사용한 PCR법 등의 당업자에게 있어서 공지의 방법에 의해, EGFR ERY17_Hk(서열번호：91, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), EGFR ERY17_L(서열번호：92, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다)을 각각 코드하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 일련의 발현 벡터가 제작되었다.
이하에 나타내는 조합의 발현 벡터가 FreeStyle293-F 세포에 도입되어, 각 목적 분자를 일과성으로 발현시켰다.
W. 목적 분자：EGFR ERY17-2
발현 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 코드되는 폴리펩티드：EGFR ERY17_Hk(서열번호：91, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), EGFR ERY17_L(서열번호：92, 시그날 서열인 아미노 말단 19 아미노산은 성숙 서열에는 포함되지 않는다), ERY17-2_Hh, ERY17-2_L
(2) EGFR ERY17-2의 정제
얻어진 배양상청이 Anti FLAG M2 칼럼(Sigma사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 0.1 ㎎/mL FLAG 펩티드(Sigma사)에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 이미다졸의 농도 구배에 의한 용출이 실시되었다. 목적 분자를 포함하는 분획이 한외 여과에 의해 농축된 후, 당해 분획이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 용출액의 단량체 분획만을 회수함으로써 정제된 각 목적 분자가 얻어졌다.
(3) EGFR ERY17-2의 세포상해 활성
EGFR ERY17-2의 in vitro의 세포상해 활성을 조사한 바, 강한 세포상해 활성이 확인되었다(도 26). 본 발명에 있어서, 암 항원에 대한 IgG를 기본 골격으로 하고, 편측의 Fab를 CD3 epsilon에 대한 결합 도메인으로 치환한 분자에 있어서, GPC3, EpCAM 뿐 아니라, 암 항원의 종류를 추가로 바꾸어도 세포상해 활성을 갖는 것이 명확해졌다.
본 발명에 의해서, BiTE가 갖는 강한 항종양 활성과, 암 항원 비의존적으로 사이토카인 폭풍 등을 유도하지 않는다고 하는 안전성 상의 우수한 성질이 유지되고, 또한 긴 혈중 반감기를 갖는 새로운 폴리펩티드 회합체가 제공되었다. 본 발명의 폴리펩티드 회합체에 있어서의 항원 결합 도메인을 치환함으로써, 당해 폴리펩티드 회합체를 유효성분으로서 포함하는 세포상해 유도 치료제가 암세포를 포함하는 각종 세포를 표적으로 하여 세포상해를 일으켜서, 각종 암을 치료 또는 예방할 수 있다. 환자에게 있어서도, 안전성이 높을 뿐 아니라, 신체적 부담이 적고 편리성도 높다고 하는, 바람직한 치료가 가능해진다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> THERAPEUTIC AGENT THAT INDUCES CYTOTOXICITY <130> C1-A1010Y2P <150> JP 2010-266760 <151> 2010-11-30 <150> JP 2011-121771 <151> 2011-05-31 <150> JP 2011-238818 <151> 2011-10-31 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1812 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggccggga ccgtgcgcac cgcgtgcttg gtggtggcga tgctgctcag cttggacttc 60 ccgggacagg cgcagccccc gccgccgccg ccggacgcca cctgtcacca agtccgctcc 120 ttcttccaga gactgcagcc cggactcaag tgggtgccag aaactcccgt gccaggatca 180 gatttgcaag tatgtctccc taagggccca acatgctgct caagaaagat ggaagaaaaa 240 taccaactaa cagcacgatt gaacatggaa cagctgcttc agtctgcaag tatggagctc 300 aagttcttaa ttattcagaa tgctgcggtt ttccaagagg cctttgaaat tgttgttcgc 360 catgccaaga actacaccaa tgccatgttc aagaacaact acccaagcct gactccacaa 420 gcttttgagt ttgtgggtga atttttcaca gatgtgtctc tctacatctt gggttctgac 480 atcaatgtag atgacatggt caatgaattg tttgacagcc tgtttccagt catctatacc 540 cagctaatga acccaggcct gcctgattca 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Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln 100 105 110 Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala 115 120 125 Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe 130 135 140 Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp 145 150 155 160 Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro 165 170 175 Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu 180 185 190 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe 195 200 205 Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln 210 215 220 Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile 225 230 235 240 Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu 245 250 255 Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys 260 265 270 Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly 275 280 285 Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu 290 295 300 Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu 305 310 315 320 Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys 325 330 335 Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Glu Thr Glu Lys Lys Ile Trp His 340 345 350 Phe Lys Tyr Pro Ile Phe Phe Leu Cys Ile Gly Leu Asp Leu Gln Ile 355 360 365 Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr 370 375 380 Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His 385 390 395 400 Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln 405 410 415 Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile 420 425 430 Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly 435 440 445 Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met 450 455 460 Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro 465 470 475 480 Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu 485 490 495 Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp 500 505 510 Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys 515 520 525 Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg 530 535 540 Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly 545 550 555 560 Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His 565 570 575 Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala 580 585 590 Ile Ser Val Val Cys Phe Phe Phe Leu Val His 595 600 <210> 3 <211> 945 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggcgcccc cgcaggtcct cgcgttcggg cttctgcttg ccgcggcgac ggcgactttt 60 gccgcagctc aggaagaatg tgtctgtgaa aactacaagc tggccgtaaa ctgctttgtg 120 aataataatc gtcaatgcca gtgtacttca gttggtgcac aaaatactgt catttgctca 180 aagctggctg ccaaatgttt ggtgatgaag gcagaaatga atggctcaaa acttgggaga 240 agagcaaaac ctgaaggggc cctccagaac aatgatgggc tttatgatcc tgactgcgat 300 gagagcgggc tctttaaggc caagcagtgc aacggcacct ccatgtgctg gtgtgtgaac 360 actgctgggg tcagaagaac agacaaggac actgaaataa cctgctctga gcgagtgaga 420 acctactgga tcatcattga actaaaacac aaagcaagag aaaaacctta 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Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Lys Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Lys Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 90 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 90 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Lys 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Lys Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Lys Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Lys Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 91 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 91 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr 65 70 75 80 Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln 85 90 95 Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro His His His His His His His His 465 470 <210> 92 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> an artificially synthesized sequence <400> 92 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val 20 25 30 Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg 50 55 60 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser 85 90 95 Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn 100 105 110 Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230

Claims (68)

  1. 하기의 도메인;
    (1) 항원 결합 도메인,
    (2) Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역을 포함하는 도메인, 및
    (3) T 세포 수용체 복합체 결합 도메인,
    을 포함하는 폴리펩티드 회합체.
  2. 제1항에 있어서,
    T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T 세포 수용체 결합 도메인인 폴리펩티드 회합체.
  3. 제1항에 있어서,
    T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인 폴리펩티드 회합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 2가의 항원 결합 도메인인 폴리펩티드 회합체.
  5. 제4항에 있어서,
    2가의 항원 결합 도메인이 F(ab')2의 구조를 갖는 도메인인 폴리펩티드 회합체.
  6. 제5항에 있어서,
    F(ab')2의 구조를 갖는 도메인의 중쇄 정상영역(constant region)을 구성하는 2개의 폴리펩티드가 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 각각에 연결된 폴리펩티드 회합체.
  7. 제6항에 있어서,
    CD3 결합 도메인이 Fc 영역을 구성하는 1개 또는 2개의 CH3에 연결된 폴리펩티드 회합체.
  8. 제7항에 있어서,
    CD3 결합 도메인을 구성하는 중쇄 Fv 단편이 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 CH3에 연결되고, CD3 결합 도메인을 구성하는 경쇄 Fv 단편이 Fc 영역을 구성하는 다른 한쪽의 CH3에 연결된 폴리펩티드 회합체.
  9. 제8항에 있어서,
    CD3 결합 도메인을 구성하는 중쇄 Fv 단편에 항체의 CH1 도메인, 및 경쇄 Fv 단편에 항체의 CL 도메인이 연결된 폴리펩티드 회합체.
  10. 제6항에 있어서,
    CD3 결합 도메인이 F(ab')2를 구성하는 1개 또는 2개의 CL에 연결된 폴리펩티드 회합체.
  11. 제6항에 있어서,
    CD3 결합 도메인이 F(ab')2를 구성하는 1개 또는 2개의 VH에 연결된 폴리펩티드 회합체.
  12. 제6항에 있어서,
    CD3 결합 도메인이 F(ab')2를 구성하는 1개 또는 2개의 VL에 연결된 폴리펩티드 회합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3 결합 도메인이 Fv인 폴리펩티드 회합체.
  14. 제1항 내지 제7항 및 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3 결합 도메인이 Fab인 폴리펩티드 회합체.
  15. 제1항 내지 제7항 및 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3 결합 도메인이 scFv인 폴리펩티드 회합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD3 결합 도메인이 1가인 폴리펩티드 회합체.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 1가의 scFv 및 1가의 Fab인 폴리펩티드 회합체.
  18. 제17항에 있어서,
    1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 scFv를 매개로 Fc 영역을 구성하는 1개의 폴리펩티드에, 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 1개의 폴리펩티드에 각각 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 폴리펩티드 회합체.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 2가의 scFv인 폴리펩티드 회합체.
  20. 제19항에 있어서,
    1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 중쇄 Fv 단편을 매개로 Fc 영역을 구성하는 1개의 폴리펩티드에, 다른 쪽의 1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 경쇄 Fv 단편을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 1개의 폴리펩티드에 연결된 폴리펩티드 회합체.
  21. 제19항에 있어서,
    1가의 scFv가 CD3 결합 도메인을 구성하는 scFv를 매개로 Fc 영역을 구성하는 1개의 폴리펩티드에, 다른 쪽의 1가의 scFv가 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 1개의 폴리펩티드에 연결된 폴리펩티드 회합체.
  22. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인, 및 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 각각 1가의 Fab인 폴리펩티드 회합체.
  23. 제22항에 있어서,
    항원 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 폴리펩티드 회합체.
  24. 제22항에 있어서,
    항원 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 폴리펩티드 회합체.
  25. 제22항에 있어서,
    항원 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역과 연결된 폴리펩티드 회합체.
  26. 제22항에 있어서,
    T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, 항원 결합 도메인을 구성하는 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 폴리펩티드 회합체.
  27. 제22항에 있어서,
    T 세포 수용체 결합 도메인을 구성하는 1가의 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결되며, 항원 결합 도메인을 구성하는 Fab의 중쇄 Fv 단편이 CL 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab의 경쇄 Fv 단편이 CH1 영역과 연결된 폴리펩티드 회합체.
  28. 제22항에 있어서,
    (1) 항원에 결합하는 1가의 Fab 구조의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 상기 Fc 영역을 구성하는 한쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab 구조의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 항원 결합 도메인, 및
    (2) T 세포 수용체 복합체에 결합하는 1가의 Fab 구조의 중쇄 Fv 단편이 CH1 영역을 매개로 Fc 영역을 구성하는 다른 쪽의 폴리펩티드에 연결되고, 당해 Fab 구조의 경쇄 Fv 단편이 CL 영역과 연결된 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인,
    을 포함하는 폴리펩티드 회합체로서, 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편과 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편 또는 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편과 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편이 회합하도록 CH1 영역과 CL 영역의 전하가 제어되어 있는 폴리펩티드 회합체.
  29. 제28항에 있어서,
    T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체.
  30. 제28항에 있어서,
    항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체.
  31. 제28항에 있어서,
    T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖고, 항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 동종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체.
  32. 제29항 또는 제31항에 있어서,
    T 세포 수용체 복합체 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 T 세포 수용체 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 이종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체.
  33. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    항원 결합 도메인 중의 중쇄 Fv 단편에 연결된 CH1 영역의 아미노산 잔기 및 항원 결합 도메인 중의 경쇄 Fv 단편에 연결된 CL 영역의 아미노산 잔기가 모두 이종의 전하를 갖는 폴리펩티드 회합체.
  34. 제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포 수용체 복합체 결합 도메인이 T 세포 수용체 결합 도메인인 폴리펩티드 회합체.
  35. 제34항에 있어서,
    T 세포 수용체 결합 도메인이 CD3 결합 도메인인 폴리펩티드 회합체.
  36. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    CH1 영역의 아미노산 잔기 및 CL 영역의 아미노산 잔기가, 이하의 (a)~(f)에 나타내어지는 1조(組) 또는 2조 이상의 아미노산 잔기의 조로 이루어진 군;
    (a) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치의 아미노산 잔기,
    (b) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 131번 위치의 아미노산 잔기
    (c) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 164번 위치의 아미노산 잔기
    (d) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 138번 위치의 아미노산 잔기
    (e) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기
    (f) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 175번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 160번 위치의 아미노산 잔기
    으로부터 선택되며, CH1 영역의 아미노산 잔기와 CL 영역의 아미노산 잔기가 서로 이종의 전하를 갖는 아미노산 잔기인 폴리펩티드 회합체.
  37. 제36항에 있어서,
    추가로, 이하의 (g)에 나타내어지는 아미노산 잔기의 조를 포함하는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 회합체.
    (g) CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 213번 위치의 아미노산 잔기, 및 CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    상기 이종의 전하를 갖는 아미노산 잔기가, 이하의 (X) 또는 (Y) 중 어느 하나의 군;
    (X) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D);
    (Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H);
    에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 폴리펩티드 회합체.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종의 전하를 갖는 아미노산 잔기가, CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 175번 위치의 아미노산 잔기가 Lys, CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 Glu인 폴리펩티드 회합체.
  40. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이종의 전하를 갖는 아미노산 잔기가, CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 147번 위치 및 175번 위치의 아미노산 잔기가 Glu, CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 180번 위치, 131번 위치 및 160번 위치의 아미노산 잔기가 모두 Lys인 폴리펩티드 회합체.
  41. 제40항에 있어서,
    추가로, CH1 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 213번 위치의 아미노산 잔기가 Glu이고, CL 영역의 아미노산 잔기로서 EU 넘버링 123번 위치의 아미노산 잔기가 Lys인 폴리펩티드 회합체.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역이 FcγI, FcγIIA, FcγIIB, FcγIIIA 및/또는 FcγIIIB 중 어느 하나의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 저하되어 있는 Fc 영역인 폴리펩티드 회합체.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역이, 서열번호：23에 기재된 Fc 영역, 서열번호：24에 기재된 Fc 영역, 서열번호：25에 기재된 Fc 영역, 또는 서열번호：26에 기재된 Fc 영역을 구성하는 아미노산이 변이되어 있는 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 회합체.
  44. 제43항에 있어서,
    Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산;
    118번 위치부터 260번 위치의 아미노산 서열이 서열번호：24에 기재된 서열, 261번 위치부터 447번 위치의 아미노산 서열이 서열번호：26에 기재된 서열인 폴리펩티드 회합체.
  45. 제43항에 있어서,
    Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산;
    220번 위치, 226번 위치, 229번 위치, 231번 위치, 232번 위치, 233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 238번 위치, 239번 위치, 240번 위치, 264번 위치, 265번 위치, 266번 위치, 267번 위치, 269번 위치, 270번 위치, 295번 위치, 296번 위치, 297번 위치, 298번 위치, 299번 위치, 300번 위치, 325번 위치, 327번 위치, 328번 위치, 329번 위치, 330번 위치, 331번 위치, 332번 위치가 변이되어 있는 Fc 영역인 폴리펩티드 회합체.
  46. 제45항에 있어서,
    Fc 영역이 서열번호：23에 기재된 Fc 영역을 구성하는 아미노산이 변이되어 있는 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 회합체.
  47. 제46항에 있어서,
    Fc 영역을 구성하는 아미노산 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산;
    233번 위치, 234번 위치, 235번 위치, 236번 위치, 237번 위치, 327번 위치, 330번 위치, 331번 위치
    이 대응하는 IgG2 또는 IgG4에 있어서 그 EU 넘버링이 대응하는 아미노산으로 치환된 Fc 영역인 폴리펩티드 회합체.
  48. 제46항에 있어서,
    Fc 영역을 구성하는 아미노산 중, EU 넘버링에 따라 특정되는 하기 중 어느 하나의 아미노산;
    234번 위치, 235번 위치, 297번 위치
    이 변이되어 있는 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 회합체.
  49. 제48항에 있어서,
    234번 위치의 아미노산이 알라닌, 235번 위치의 아미노산이 알라닌, 및/또는, 297번 위치의 아미노산이 알라닌으로 변이되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 회합체.
  50. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 서열이 서로 상이한 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 회합체.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 349번 위치의 아미노산이 시스테인, 366번 위치의 아미노산이 트립토판으로, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 356번 위치의 아미노산이 시스테인, 366번 위치의 아미노산이 세린으로, 368번 위치의 아미노산이 알라닌으로, 407번 위치의 아미노산이 발린으로 변이되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 회합체.
  52. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 356번 위치의 아미노산이 리신으로, 다른 쪽의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 439번 위치의 아미노산이 글루타민산으로 변이되고, 어느 한쪽의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 중 EU 넘버링에 따라 특정되는 435번 위치의 아미노산이 아르기닌으로 변이되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 회합체.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서,
    Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 카르복시 말단에 존재하는 서열 GK가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 회합체.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 동일한 에피토프에 결합하는 폴리펩티드 회합체.
  55. 제54항에 있어서,
    동일한 에피토프가 서열번호：2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재하는 폴리펩티드 회합체.
  56. 제54항에 있어서,
    동일한 에피토프가 서열번호：4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재하는 폴리펩티드 회합체.
  57. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원 결합 도메인이 서로 상이한 에피토프에 결합하는 폴리펩티드 회합체.
  58. 제57항에 있어서,
    상이한 에피토프가 서열번호：2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재하는 폴리펩티드 회합체.
  59. 제57항에 있어서,
    상이한 에피토프가 서열번호：4에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 중에 존재하는 폴리펩티드 회합체.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 회합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  61. 제60항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  62. 제61항에 기재된 벡터를 보유하는 세포.
  63. 제62항에 기재된 세포를 배양하여 배양상청으로부터 폴리펩티드 회합체를 회수하는 것을 포함하는 폴리펩티드 회합체의 제조방법.
  64. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 회합체를 유효성분으로서 포함하는 세포상해 유도 치료제.
  65. 제64항에 있어서,
    세포상해 유도 치료제가 암 치료제인 치료제.
  66. 제65항에 있어서,
    암이 간암 또는 폐암인 치료제.
  67. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 회합체를 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 암의 치료 또는 예방방법.
  68. 제67항에 있어서,
    암이 간암 또는 폐암인 치료 또는 예방방법.
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