Tarifnamenin diger özellikleri bilgi verici niteliktedir. Bu patent basvurusuyla ele alinan bulus, Fc varyanti içeren polipeptid üretmeye yönelik bir yöntemle ilgilidir. FC bölgesi içeren polipeptid veya antikorlar üretmek için sektörde mevcut teknikler kullanilarak hazirlanir. Bu bulusun tercih edilen yapisinda, bu parent polipeptid bir antikordurve antikorlari üretmeye yönelik örnek niteligindeki yöntemler takip eden bölümlerde daha detayli tarif edilmektedirler. Bununla birlikte, bu parent polipeptid bir FC bölgesi içeren herhangi baska bir polipeptid,örneginbir immünoadezin olabilir. Immünoadezinler üretmeye yönelik yöntemler, asagida daha detayli açiklanmaktadir. Bu bulusun alternatif bir yapisinda, bir varyant Fc bölgesi (FC varyanti) bu patent basvurusunda tarif edilen yöntemlere göre üretilebilir ve bu FC varyanti,istege bagli bir heterolog polipeptide, örnegin bir antikordegisken domainine ya da bir reseptörveya ligandin baglanma domainine füzyonlanabilir. Yabani tippolipeptidbir Fc bölgesi içerir. Genelde, yabani tip polipeptidin FC bölgesi, bir nativveya yabani tipsekansli Fc bölgesi ve tercihen, bir insannativ sekansli Fc bölgesi (insanFc bölgesi) içerecektir. Bununla birlikte, yabani tip polipeptidin FC bölgesi, bir veya daha fazla önceden var olan amino asit sekansi alterasyonuna ya da bir nativ sekansli Fc bölgesinden modifikasyonlara sahip olabilir. Örnegin, Fc bölgesinin C lq veya Fcy baglaiima aktivitesi daha önce alterasyona tâbi tutulmus olabilir (Fe bölgesi modifikasyonlarinin diger tipleri asagida daha detayli tarif edilmektedir). Bu bulusun baska bir yapisinda, parent polipeptidFc bölgesi"kavramsald1r" ve her ne kadar fiziksel olarak var olmasa da, antikormühendisi arzu edilen bir varyant FC bölgesi ainino asit sekansina karar verebilir ve o sekansi içeren bir polipeptid ya da arzu edilen varyant FC bölgesi amino asit sekansini kodlayan bir DNA olusturabilir. Bununla birlikte, bu bulusun tercih edilen bir yapisinda, bir yabani tip polipeptidin bir F c bölgesini kodlayan bir nükleik asit mevcuttur ve FC bölgesi varyantmi kodlayan bir varyant nükleik asit sekansi elde etmek için, bu iii'ikleik asitsekansi alterasyona tâbi tutulinaktadir. Baslangiç polipeptidinin bir amino asit sekansi varyantini kodlayan DNA, sektörde bilinen çesitli yöntemler kullaiiilarak hazirlanir. Bu yöntemler, bunlarla sinirli kalmaksizin, polipeptidi kodlayan, daha önce hazirlanmis DNAanin yer hedeHi (veya oligonükleotid aracili) mutajenez, PCR mutajenez ve kaset mutajenezi yoluyla hazirlanmasini içermektedir Yer hedeflimutajenez,si°ibstitüsyon varyantlari hazirlamak için tercih edilen bir yöntemdir. Bu teknik sektörde iyi bilinmektedir (örnegin Kunkel ve ark., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 488). Ozetle, yer hedefli DNA mutajenezini gerçeklestirirken, öncelikle, arzu edilen inutasyonu kodlayan bir oligonükleotidi bu tür bir baslangiç DNA"sinin tek bir iplikçigine hibridize etmek suretiyle baslangiç DNA°si, alterasyona tâbi tutulur. Hibridizasyondan sonra, hibridize oligonükleotidi bir primer olarak ve baslangiç DNA"smin tek bir iplikçigini bir sablon olarak kullanmak suretiyle bir tam ikinci iplikçik sentezlemek ainaciyla bir DNA polimerazi kullanilir. Dolayisiyla, arzu edilen mutasyonu kodlayan oligonükleotid, elde edilen iki iplikçikli DNA°nin bünyesine dâhil edilmis olur. Baslangiç polipeptidinin amino asit sekansi varyantlarini üretmek için PCR mutajeneziii kullanilmasi da uygundur. Bakiniz: Higuchi, in PCR malzemesi olarak küçük miktarlarda sablon DNA kullanildiginda, ancak ve sadece primerlerin sablondan farkli oldugu pozisyonlarda sablon sekanstan farkli olan spesifik bir DNA fragmanindan nispeten büyük miktarlarda üretmek için, bir sablon DNA"daki ilgili bölgeden sekans açisindan bir dereceye kadar farkli olan primerler kullanilabilir. Varyant üretmek için kullanilan baska bir yöntem olan referansinda tarif edilen teknige dayanmaktadir. Bu bulusun bir yapisi, bir antikorunFc bölgesine en az bir amino asit artigi adisyonu, sübstitüsyonu veya delesyonu içeren bir FC bölgesinden olusan ve dolayisiyla, en az bir PC reseptörü için azalmis veya tamamen ortadan kalmis afiniteyle sonuçlanan polipeptidleri de kapsamaktadir. Fc bölgesi, Fc Reseptörleri (örnegin FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA), kompleman proteini CIq ve protein A ve G gibi diger moleküller de dâhil, ancak buiilarla sinirli kalmaksizin, birçok reseptör veya ligandla etkilesime girinektedir. Bu etkilesimler, antikor bagimli hücre aracili sitotoksisite (ADCC), antikor bagimli selüler fagositoz (ADCP) ve koinpleman bagimli sitotoksisite (CDC) de dâhil, ancak bunlarla siiiirli kalmaksizin, çesitli efektör fonksiyonlar ve asagi akis sinyal olaylari için önemlidirler. Dolayisiyla, bu bulusun belirli bazi yapilarinda, bu bulusa konu olan varyantlar, bu bulusa konu olan bir Fe varyantini içeren ancak Fc bölgesine en az bir amino asit artigi adisyonu, sübstitüsyon veya delesyonu içermeyen polipeptidle (bu patent basvurusunda bir "yabani tip polipeptid" olarak da anilmaktadir) ayni ainino asit sekansiiia sahip bir polipeptide kiyasla, bir efektör fonksiyondan sorumlu Fc reseptörü için azalmis veya tamamen ortadan kalkmis afiniteye sahiptirler. Bu bulusun belirli bazi yapilarinda, bu bulusa konu olan bir Fe varyantiiii içeren polipeptidsayilan özelliklerden en az birini veya birkaçini içermektedir: efektör (ADCC ve/Veya CDC ve/veya ADCP) fonksiyonun azalmasi veya tamamen ortadan kalkmasi, Fc reseptörlerine baglanmanin azalmasi veya tamamen ortadan kalkmasi, C1q"e baglanmanin azalmasi veya tamamen ortadan kalkmasiya da toksisitelerin azalmasi veya tamamen ortadan kalkmasi. Daha spesifik ifade etmek gerekirse, bu bulusa konu olan yapilar, Fc reseptörleri (öniegin FcyRI, FcyRII, FcyRIIIA) ve/Veya Clq kompleman proteini için azalmis afiiiiteye sahipanti-CDZO (GAlOl veya GA ile ayni), anti-CD9 (TA ile ayni) ve anti-Selektin (pSel) antikorlari saglamaktadirlar. Bu bulusuii bir yapisinda, antikorlar, P329 pozisyonunda en az bir amino asit artigi adisyonu, sübstitüsyonu veya delesyonu içeren bir PC bölgesinden olusurlar; burada, sabit bölge "Kabat ve ark., NIH Springfield, VA" referansinda belirtilen AB indeksindeki numaralandirma sistemine göre numaralandirilir. Bu bulusun spesifik bir yapisinda, polipeptidler,bir yabani tip insan Fc polipeptidinin bir FC varyantini içerirler ve bahsi geçen varyant Pro329 pozisyonunda bir amino asit sübstitüsyonuna sahiptir; burada, nuinaralandirma sistemine göre numaralandirilir. Bu bulusun yine baska bir yapisinda, bahsi geçen varyant en az bir amino asit sübstitüsyonu daha içermektedir. Bu bulusun yine baska bir yapisinda, bir yabani tip insan FC polipeptidinin bir PC varyantini içeren polipeptid, bölgedeki ve/veya FC polipeptidi arayüzündeki prolin sandviç fonksiyonunu Fc Gamma reseptörüyle yok eden veya azaltan bir ainino asit sübstitüsyonu, delesyonu veya adisyonuna sahiptir. Bu bulusun baska bir yapisinda, Pr0329,prolinden daha küçük veya daha büyük olan bir amino asitle sübstit'ue edilir. Bu bulusun yine baska bir yapisinda, sübstitüe edilmis amino asit Gly, Ala veya Arg"dir. Bu bulusta, Fc polipeptidinin Pr0329°uglisinle sübstitüe Bu bulusun yine baska bir yapisinda, bir PC varyantini içeren bu polipeptid,en az bir amino asit sübstitüsyonu, adisyonu veya delesyonuna daha sahiptir. Bu bulusun yine baska bir yapisinda, bahsi geçen varyantlar, bir insan FC reseptörüne (FcyR) ve/Veyabir insankompleman reseptör'une karsi yabani tip FC polipeptidini içeren polipeptide kiyasla azalmis afinite gösterirler. Bu bulusun baska bir yapisinda,bir FC varyantini içeren bu polipeptid, bir insan Fe reseptörüne (FcyR) ve/Veyabir insankompleman reseptör'ûne karsi yabani tip insan FC bölgesi içeren polipeptide kiyasla azalmis bir afinite gösterir. Bu bulusun baska bir yapisinda,FcyRI, FcyRII, FcyRIlIA reseptörlerinin en az birine karsi afiniteazaltilir; bu bulusun yine baska bir yapisinda, FcyRI ve FcyRIIIA reseptörlerine karsi afiniteazaltilir ve bu bulusun yine baska bir yapisinda, FcyRI, FcyRII ve F cyRIIIA reseptörlerine karsi afinite azaltilir; bu bulusun yine baska bir özelliginde, FcyR] reseptörüne, FcyRIIIA reseptör'ûne ve Clq reseptöri'ine karsi afinite azaltilir ve bu bulusun yine baska bir özelliginde, FcyRI, FcleI, FcyRIIIA ve Clq reseptörlerine karsi afinite azaltilir. Bu bulusun daha baska bir yapisinda,bir Fc varyantiniiçeren bu polipeptidin ind'ûkledigi ADCC azaltilmistir ve bu bulusun tercih edilen bir yapisinda, ADCC, yabani tip FC polipeptidi içeren polipeptidin indükledigi ADCC°nin en az %20'sine kadar azaltilir. Bu bulusun yine baska bir özelliginde, yabani tip FC polipeptidi içeren polipeptidin ind'ûkledigi ADCC ve CDC azaltilir veya tamamen ortadan kaldirilir ve bu bulusun yine baska bir özelliginde, yukarida tarif edilen bir FC varyantini içeren polipeptid, yabani tip FC polipeptidi içeren polipeptide kiyasla, azalmis bir ADCC, CDC ve ADCP gösterir. Bu bulusun bir yapisinda, FC varyanti içeren polipeptidde bulunan en az bir ilave ainino asit sübstitüsyonusu gruptan seçilir: 5228P, E233P, L234A ve L235A sübstitüsyonlari da dâhil edilmektedir. Bu bulusun belirli bir özelliginde,bir Fc varyantini içeren polipeptid,bir antikor içerir. Bu bulusun yine baska bir özelliginde,bir Fc varyantini içeren polipeptid, bir insan IgGl FC bölgesi içerir. Bu bulusun yine baska bir özelliginde, bu varyantlar IgGl antikorlaridir. Bu bulusun baska bir yapisinda, bir Pr0329 FC varyanti varyantlari içeren polipeptidler, ilave olarak, FC bölgesinde bulunan ve antikor stabilitesinin artmasiyla iliskilendirilen en az bir amino asit artigi adisyonu, sübstitüsyonu veya delesyonu da içerirler. Bu bulusun yine baska bir özelliginde, yukarida tarif edilen bir FC varyantini içeren polipeptidin Fcn reseptörüne karsi afinitesi yalnizca bir dereceye kadar veörneginyabani tip FC polipeptidi içeren polipeptidin afinitesinin maksimum %10-20"si kadar alterasyona tâbi tutulmustur. Bu bulusun bir yapisinda, bir FC varyantini içeren polipeptidde gerçeklesen bir amino asit artigi adisyonu, sübstit'ûsyonu veya delesyonu Fc bölgesinin 228.ve/veya 235.pozisy0nunda bulunur; burada, sabit bölge, Kabat ve arkadaslarina ait referansta belirtilen AB indeksinin numaralandirma sistemine göre numaralandirilir. Bu bulusun spesifik bir yapisinda,bir Fc varyantini içeren bu polipeptidde 228. pozisyonda bulunan serinve/veya 235. pozisyonda bulunan lösin, baska bir ainino asitle sübstit'ue edilir. Bu bulusun spesifik bir yapisinda, bir FC varyantini içeren polipeptidler, 228. pozisyonunda bir amino asit sübstitüsyonu bulunan bir Fe bölgesiiçerirler; burada, serinartigi prolinle sübstitüe edilir. Bu bulusun spesifik bir yapisinda, bir PC varyantini içeren polipeptidler,235. pozisyonunda bir amino asit sübstitüsyonu bulunan bir Fe bölgesiiçerirler; burada, lösinartigi glutamik asitle sübstitüe Bu bulusun Spesifik bir yapisinda, the bir PC varyantini içeren polipeptidde bir üçlü mutasyon bulunur: P329, pozisyonda biramino asit sübstitüsyonu, bir . Bu bulusun bir yapisinda, bir amino asit artigi adisyonu, sübstitüsyonu veya delesyonu, FC bölgesinin 234. ve/Veya 235. pozisyonunda bulunmaktadir; burada, sabit bölge, Kabat ve arkadaslarina ait referansta belirtilen AB indeksinin numaralandirma sistemine göre numaralandirilir. Bir yabani tip insan FC polipeptidininbir FC varyantini içeren polipeptid, bir üçlü mutasyona sahiptir: Pr0329. pozisyonda bir amino asit sübstitüsyonu, bir L234A ve bir L235A mutasyonu (P329 / Yukarida bahsedilen polipeptidlerbir insan IgGl bölgesi içerirler. Her ne kadar bir FcyR reseptörüne baglanmanin alterasyona tâbi tutulmasi tercih edilse de, bu patent basvurusunda, neonatal reseptör (FcRn) için alterasyona tâbi tutulmus baglanma afinitesine sahip FC bölgesivaryantlari da düsünülmektedir. FcRn için iyilestirilmis afiniteye sahip Fe bölgesivaryantlarinin daha uzun serum yarilanma ömürlerine sahip olduklari tahmin edilmektedir ve bu tür moleküller, örnegin kronik bir hastalik veya rahatsizligi tedavi etmek için uygulanan polipeptidin uzun bir yarilanma ömrüne sahip olmasinin arzu edildigi, memelileri tedavi etmeye yönelik yöntemlerde faydali uygulama sekillerine sahip olacaklardir. Öte yandan, FcRn baglanma afinitesi azaltilmis FC bölgesi varyantlarinin daha kisa yarilanina ömürlerine sahip oldugu tahmin edilmektedir vebu tür moleküller, örnegin in vivo diyagnostik görüntüleme için ya da uzatilinis süreler boyunca kan dolasiminda kaldiginda toksik yan etkilere sahip olan polipeptidler ve benzeri durumlar nedeniyle, örnegin polipeptidin dolasimda kaldigi sürenin kisaltilmasinin avantajli olabilecegi durumlarda bir memeliye uygulanabilirler. FcRn baglanma afinitesi azaltilinis Fc bölgesivaryantlarinin plasentadan geçme ihtimalinin daha düsük oldugu tahinin edilmektedir ve dolayisiyla, bu varyantlar hamile kadinlarda görülen hastalik veya rahatsizliklarin tedavisinde kullanilabilirler. FcRn°ye baglanma afinitesi alterasyoiia tâbi tutulmus FC bölgesi amino asit pozisyonlarinin herhangi biri veya birkaçinda bir Fc bölgesi amino asit modifikasyonu bulunan varyantlari içermektedir. Genelde, FcRn"ye baglanma özelliklerinde azalma görülen veya birkaçinda bir F c bölgesi amino asit modifikasyonu bulunacaktir ve ayrica, FcRn"ye baglanma özelliklerinde artma görülen pozisyonlarindan herhangi biri veya birkaçinda bir Fe bölgesiamino asit modifikasyonu bulunacaktir. Fc ligandlarina baglanma özelliginin azalmasi Sektörde bilgi ve beceri sahibi olan bir kisi, hem bulus konusu antikorlarin (modifiye edilmemis bir antikora göre) alterasyona tâbi tutulmus FcyR ve/veya C lq baglanma özelliklerine (baglanma özelliklerine verilebilecek örnekler, bunlarla sinirli kalmaksizin, baglanma spesifisitesini, denge ayristirma sabitini (KD), ayrisma ve birlesme oranlarini (sirasiyla, koff ve kon),baglanma afinitesini ve/Veya aviditeyi içerir) sahip olabileceklerini, hem de belirli bazi alterasyonlarin daha çok veya daha az arzu edilebilir nitelikte olduklarini anlayacaktir. Denge ayristirma sabitinin (KD)koff/k0n olarak taiiimlandigi sektörde bilinmektedir. Sektörde bilgi ve beceri sahibi kisi, belirli bir antikor uygulamasi için en önemli kinetik parametrenin hangi parametre oldugunu tespit edebilir. Örnegin, bir veya daha fazla pozitif regülatöre baglanmayi azaltan (örnegin FclellA) ve/Veya bir inhibitör FC reseptörüne baglanmayi artiran (örnegin FcyRIIB) bir modifikasyon, ADCC aktivitesini düsürmek için uygun olabilir. Dolayisiyla, baglanma afinitelerinin orani (ömegindenge ayristirma sabitleri (KD)), bulus konusu bir antikorun ADCC aktivitesinin azaltildigini mi yoksa artirildigini mi gösterecektir. Buna ek olarak, CDC aktivitesini azaltmak veya ortadan kaldirmak için C1q°ya baglanma özelligini azaltan bir modifikasyon uygundur. Bir Fe bölgesinin kendi ligandina iliskin afiniteleri ve baglanma özellikleri, Fc-FcyR etkilesimlerini, yani bir FC bölgesinin bir FcyR"ye spesifik baglanma özelligini tespit etmek için sektörde bilinen, dengeleme yöntemleri (örnegin, enzim-bagli immünosorbent esey (ELISA) veya radyoimmünoesey (RIA)) veya kinetik ölçümleri (örnegin BIACORE® analizleri) ve dolayli baglanma eseyleri, kompetitif inhibisyon eseyleri, floresans rezonans enerji transferi (FRET), jel elektroforez ve kromatografi (örnegin jel filtrasyon) gibi diger yöntemlerde dâhil, ancak bunlarla siiiirli kalmaksizin, çesitli in vitro esey yöntemleri (biyokimyasal veya immünolojik bazli eseyler) kullanilarak tespit edilebilirler. Bunlar ve diger yöntemler incelenecek bilesenlerden biri veya birkaçi üzerindeki bir etiketten faydalaiiabilirler ve/veyakromojenik, floresaii, lüminesan veya izotopiketiketler de dâhil, ancak bunlarla sinirli kalmaksizin, çesitli tespit yöntemleri kullanabilirler. Baglanma afiniteleri ve kinetik özelliklere iliskin daha detayli bir açiklama için "Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)" referansina bakabilirsiniz. Bu bulusun bir özelliginde, istemlerde de belirtildigi üzere, bir yabani tip insan FC bölgesinin bir FC varyantini içeren polipeptid,bir insan FC reseptöri'ine (FcyR) ve/Veyabir insankompleman reseptörüne karsi,yabani tip Fc polipeptidi içeren polipeptide kiyasla azalmis bir afinite gösterir. Bu bulusun bir özelliginde, bulus konusu bir Fc varyantini içeren polipeptidler, bir Fc reseptörü için, bir yabani tip Fc polipeptidiiiden en az 2 kat ya da en az 3 kat ya da en az 5 kat ya da en kat daha az afiniteler gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde, bulus konusu bir PC varyantini içeren polipeptidler, FcyRIA izoformlari da dâhil FcyRI (CD64), FcyRII ve FcyRIII (FcyRIIIA izoforinlari da dâhil, CD 16) reseptörleri de dâhil, ancak bunlarla sinirli kalmaksizin, bir veya birden fazla FC reseptörû için, modifiye edilmemis bir antikora kiyasla azalmis baglanma afinitesi gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde, bulus konusu bir Fe varyantini içeren polipeptidler, FcyRI (CD64) FcyRIIA ve FcyRIIIA için, modifiye edilmemis bir antikora kiyasla azalmis bir baglanma afinitesi gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde,bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler, FcyRIIA ve FcyRIIIA için, modifiye edilmemis bir antikora kiyasla azalmis baglanma afinitesi gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde,bulusa konu olan bir FC varyantini içeren polipeptidler Fcle (CD64) ve FcyRIIlA için, modifiye edilmemis bir antikora kiyasla azalmis baglanma afinitesi gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde,bu bulusa konu olan bir PC varyantini içeren ve F0 reseptörleri için azalmis bir baglanma afinitesi gösteren polipeptidler, Clq reseptörü için de azalmis bir afinite gösterirler. Bu bulusun belirli bir özelliginde, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler, bir yabani tip polipeptide kiyasla, FclelB reseptörüne baglanmada konkomitan bir artis ihtiva etinezler. Bu bulusun belirli bazi özelliklerinde, bir FC varyantini içeren polipeptidler, FcyIIIAinsan reseptörünekarsi ve ayrica, FcyIIA, FcyIIIB ve Clq insan reseptörlerinden olusan grubun en az bir ilave reseptörüne karsi,yabani tip Fc polipeptidi içeren polipeptide kiyasla azalmis bir afiniteye sahiptirler. Bu bulusun bazi baska özelliklerinde, bir FC varyantini içeren polipeptidler, FcylllAinsan reseptörüne karsi ve ayrica, FcyIIA, FcyIIIB ve Clq insan reseptörlerinden olusan grubun en az iki ilave reseptörüne karsi, yabaiii tip Fc polipeptidi içeren polipeptide kiyasla azalmis bir afiniteye sahiptirler. Bu bulusun baska bir özelliginde, bir FC varyantini içeren polipeptidler; FcyRIA, FcylllA, FcyllA, FcyIlIB ve Clq insan reseptörlerine karsi, yabani tip FC polipeptidi içeren polipeptide kiyasla azalmis bir afiniteye sahiptirler. Bu bulusun yiiie baska bir özelliginde,bir FC varyantini içeren polipeptidler; FcleA, FcyIIIA, FcyIIA, FcyIIIB ve Clq insan reseptörlerine karsi, yabani tip FC polipeptidi içeren polipeptide kiyasla azalmis bir afiniteye sahiptirler. Bu bulusun bir özelliginde,bu1us konusu bir F c varyantini içerenpolipeptidler, FcyRI veya FcyRIIA reseptörlerine karsi, modifiye edilmemis bir antikora kiyasla azalmis afiniteler gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde, bir FC varyantini içeren polipeptidler, FcyRI veya F cyRIIA reseptörleri için, bir yabani tip polipeptidin afinitelerinden en az 2 kat ya da en az 3 kat ya da en az 5 kat ya da en kat daha az afiniteler gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde,bir FC varyanti içeren polipeptidler, Fcle veya FclelA reseptörleri için, bir yabani tip polipeptidin afinitelerinden en az %90, en az %80, en az Bu bulusun bir özelliginde,bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler, FcyRIIIA reseptör'i'i için,m0difiye edilmemis bir antikora göre azalmis afinite özelligi gösterirler. Bu bulusun bir özelligindebulus konusu bir PC varyantini içeren polipeptidler, FcleIlA reseptörü Için, bir yabani tip polipeptidin afinitelerindenen afiniteler gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde,bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler, FcyRIIlA reseptörü için, bir yabani tip polipeptidin afinitelerindenen az %90, en az %80, en az %70, en az %60, en az oranda daha az afiniteler gösterirler. FcyRIIIA reseptörünün Fl-58V allelik varyantinin antikorlara karsi alterasyona tâbi tutulmus baglanma özelliklerine sahip oldugu sektörde anlasilmaktadir. Bu bulusun bir yapisinda, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler, FcyRIIIA reseptörlerine,bir yabani tippolipeptide kiyasla azalmis afinitelerle baglanirlar. Bu bulusun bir özelliginde,bulus konusu bir PC varyantini içeren polipeptidler, FcleIlA (F1 58V) reseptörleri için, bir yabani tip polipeptidin afinitelerinden en az 2 kat ya da en az 3 kat ya da en az 5 kat ya da en kat daha az afiniteler gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler, Clq reseptörü için, modifiye edilmemis bir antikora göre azalmis afinite gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde,bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler, Clq reseptör'u için,bir yabani tip polipeptidin afinitelerinden en az 2 kat ya da en az 3 kat ya 100 kat ya da en az 200 kat daha az afiniteler gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde,bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler, Clq reseptörü için, bir yabani tip polipeptidin afinitelerinden en az %90, en az %80, en az %70, en az %60, en az oranda daha az afiniteler gösterirler. Bu bulusun bir özelliginde,bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler; FcyRI, FclelA, FcyRIIIA, FcyRIIIA (F1 58V) veya Clq insan reseptörleriiçin, bir yabani tip polipeptidinden en az %90, en az %20, en az %10 ya da en az %5 oranda daha az afiniteler gösterir] er. Bu bulusun baska bir özelliginde,bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler,sirasiyla FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, FcyRIIIA (F1 58V) ve/Veya Clq reseptörleri için, yaklasik 10 nM ilâ 100 nM, 10 nM ilâ l ;LM ya da yaklasik 100 nM ilâ yaklasik 1 ;LM ya da yaklasik 1 nM ilâ yaklasik 100 ;LM ya da yaklasik 10 nM ilâ yaklasik 100 ;LM ya da yaklasik 1 ;LM ilâ yaklasik 100 ;LM ya da yaklasik 10 ;LM ilâ yaklasik 100 ;LM araliginda afiniteler gösterirler. Bu bulusun belirli bazi yapilarinda, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler; Fcle, FoyRIIA, FclellA, FcyRIIIA (FI-58V) veya Clq reseptörleri için, 100 nM°den daha fazla, 500 nM"den daha fazla, 1 ;LM"den daha fazla, 5 ;iM'den daha fazla, 10 ;LM°den daha fazla, 25 ;LM"den daha fazla, 50 ;LM°den daha fazla ya da 100 ;LM°den daha fazla afiniteler gösterirler. Bu bulusun baska bir özelliginde,bu1us konusu bir PC varyantim içeren polipeptidler, FclelB reseptörü için, bir yabani tippolipeptide kiyasla artmis afiniteler gösterirler. Bulusun baska bir özelliginde, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler,FclelB reseptörü için, modifiye edilmemis bir antikorun afinitelerine kiyasla degistirilmemis artmis afiniteler gösterirler. Bu bulusun baska bir özelliginde, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler,FclelB reseptörü için, bir yabani tip polipeptide kiyasla en az %5, en az %10, en az %20, en az %90 ya da en az %95 oranda artmis afiniteler gösterirler. Bu bulusun baska bir özelliginde,bulus konusu varyantlar; FcyRI, FcyRIIA FcyRIIIA veya FcyRIIIA (Fl 58V) ya da Clq reseptörleri için, 100 uM"den daha az, 50 uM"den daha az, 10 uM"den daha az, 5 pM"den daha az, 2,5 uM,den daha az, 1 pM°den daha az ya da 100 nM'den daha az ya da 10 nM'den daha az afiniteler gösterirler. Azalmis Efekt'ör Fonksiyon Bu bulusun belirli bir özelliginde,bu bulusa konu olan bir FC varyantini içeren polipeptidler, yabani tip Fc polipeptidi içeren polipeptide kiyasla, bir efektör fonksiyonmodüle ederler. Bu bulusun yine baska bir özelliginde,bu modülasyon, bir ADCC ve/Veya ADCP ve/veya CDC modülasyonudur. Bu bulusun baska bir özelliginde, bu modülasyon, asagi modülasyon veya düsüs formunda gerçeklesir. Bu bulusun yine baska bir özelligindebu modülasyon bir ADCC modülasyonudur ve bu bulusun yine baska bir özelliginde,bu modülasyon bir ADCC asagi modülasyonudur. Bu bulusun yine baska bir özelliginde, bu modülasyon bir ADCC ve CDC asagi modülasyonudur ve bu bulusun yine baska bir yapisinda,yalnizca bir ADCC asagi modülasyonudur;bu bulusun yine baska bir yapisinda, bu modülasyon, bir ADCC ve CDC ve/veya ADCP asagi modülasyonudur. Bu bulusun yine baska bir özelliginde,bu bulusa konu olan bir FC varyantini içeren polipeptidler, ADCC / CDC°yive ADCP°yi asagi inodüle eder veya düsürür. Bu bulusun baska bir özelliginde, FC varyantini içeren polipeptidin indükledigi ADCC veya CDC veya ADCP düsüsü veya asagi modülasyonu, yabani tip FC bölgesini içeren polipeptidin indükledigi ADCC veya CDC veya ADCP için gözlemlenen degerin, sirasiyla, Bu bulusun yine baska bir özelliginde, bu bulusa konu olan bir FC varyantini içeren polipeptidlerin indükledigi ADCC modülasyonu, potenste gerçeklesen ve bahsi geçen FC varyantinin EC50 degerinin yabani tip FC polipeptidi içeren polipeptide kiyasla yaklasik 10 kat düstügü bir azalmadir. Bu bulusun yine baska bir özelliginde, bu bulusa uygun varyant, insan efektör hücreleri nievcudiyetinde, yabani tip FC polipeptidini içeren polipeptide kiyasla, öneinli düzeyde herhangi bir ADCC ve/veya CDC ve/veya ADCP aktivitesinden yoksundur. Bu bulusun yine baska bir özelliginde, bulus konusu bir Fe varyantini içeren polipeptidler azaltilinis, örnegin en az %20 oraninda ya da kuvvetli sekilde azaltilmis, ömegin en az %50 oraninda azaltilmis bir efektör fonksiyonu gösterirler ve bu azalma ADCC (asagi modülasyon), CDC ve/veya ADCP fonksiyonlarinda gerçeklesebilir. Azalmis ADCC Aktivitesi In vitro ve/veya in vivo sitotoksisite eseyleri, CDC ve/veya ADCC aktivitelerinin düsüsünü/deplesyonuiiu dogrulainak için yürütülebilirler. Örnegin, FC reseptörü (FCR) baglanma eseyleri, antikorun FcyR baglanma özelligine sahip olmadigini (dolayisiyla, muhtemelen ADCC aktivitesi de bulunmadigini), ancak FcRn baglanma becerisini korudugunu saglama almak için yürütülebilirler. ADCC aktivitesine aracilik eden primer hücreler, yani NK hücreleriyalnizca FcyRIII eksprese ederken, monositler FcyRI, RII ve RIII eksprese ederler. Hematopoietik hücreler üzerindeki FcR ekSpresyonu, "Ravetch, and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) Bir ilgili molekülün ADCC aktivitesini degerlendirmek için yapilan in vitro eseylere verilebilecek sinirlayici olmayan 'Örnekler, .500.362 sayili ABD Patentinde (örnegin, bakiniz: Hellstrom, I. ve .821.337 sayili ABD Patentinde (bakiniz: Bruggemann, M. ve ark., J. olarak, radyoaktif olmayan esey yöntemleri de kullanilabilir (örnegin, bakiniz: akis sitometrisi için ACTITM radyoaktif olmayan sitotoksisite eseyi (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA ve CytoTox 96® radyoaktif olmayan sitotoksisite eseyi (Promega, Madison, WI). Bu tür eseyler için faydali efekt'or hücreler periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) ve Dogal Katil (NK) hücreleri içerir. Alternatif ya da ek olarak, ilgili molekülün ADCC aktivitesi, in vivo ortamda, örnegin"Clynes ve ark., Proc. Nat'l Acad. Sci. ABD 95 (1998) 652- 656" referansinda tarif edilen gibi bir hayvan modelinde degerlendirilebilir. antikorun Clq reseptörünü baglayamadigini ve dolayisiyla, CDC aktivitesine sahip olmadigini dogrulamak için, Clq testlerine bakiniz. Kompleman aktivasyonuiiu degerlendirmek için, bir CDC eseyi yapilabilir (örnegin, bakiniz: Gazzano-Santoro ve ark., J . ömrü, sektörde bilinen yöntemler kullanilarak da tayin edilebilirler (örnegin, bakiniz: Petkova, S.B. ve ark., Int'l. Immunol. 18(12) (2006) 1759-1769). Bulus konusu bir PC varyantiiii içeren polipeptidlerin, bir veya daha fazla FcyR aracili efektör hücre fonksiyonunu tespit etmeye yönelik in vitro fonksiyonel eseyleriyle karakterize edildigi düsünülmektedir. Bu bulusun belirli bazi yapilarinda, bulus konusu antikorlar, in vivo modellerde (örnegin bu patent basvurusunda tarif edilenler ve açiklananlar gibi), in vitro eseylerdekine benzer baglanma özelliklerine ve efektör hücre fonksiyonlarina sahiptirler. Bununla birlikte, mevcut bulus,in vitro eseylerde arzu edilen fenotipi göstermeyen, ancak in vivo eseylerde arzu edilen fenotipi gösteren bulus konusu varyantlari bulusuii kapsami disinda tutmaz. Bu bulusun bir yapisinda, bulus konusu bir PC varyantini içeren polipeptidler, modifiye edilmemis yabani tip Fc polipeptidlerine kiyasla azaltilmis ADCC aktiviteleri gösterirler. Bu bulusun baska bir özelliginde, bulus konusu bir PC varyantini içeren polipeptidler,modifiye edilmemis bir antikorun ADCC aktivitelerine kiyasla en az 2 kat ya da en az 3 kat ya daha az ADCC aktiviteleri gösterirler. Bu bulusun yine baska bir yapisinda, bu bulusa konu olan antikorlar, modifiye edilinemis bir antikora kiyasla en az %10 ya da en az %20ya da en az %30ya da en aktiviteleri gösterirler. Bu bulusun baska bir özelliginde, Fc varyantini içeren polipeptidin indükledigi ADCC düsüsü veya asagi modülasyonu, yabani tip FC bölgesini içeren polipeptidiii indükledigi ADCC veya CDC veya ADCP için gözlemlenen degerlerin, sirasiyla bulusun belirli bazi yapilarinda, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler,tespit edilebilir düzeyde bir ADCC aktivitesine sahip degildirler. Bu bulusun spesifik yapilarinda, ADCC aktivitesinde gerçeklesen düsüs ve/veya ablasyon, bulus konusu bir FC varyantmi içeren polipeptidlerin FC ligandlarina ve/veya reseptörlerine karsi afinitelerinin düsmesine atfedilebilir. Bu bulusun spesifik bir yapisinda,ADCC asagi modülasyonu, potenste gerçeklesen ve bir FC varyantini içeren bu polipeptidin EC50 degerinin yabani tip FC polipeptidine kiyasla yaklasik 10 kat ya da daha fazla düstügü bir azalmadir. Bu bulusun yine baska bir özelliginde, bu bulusa konu olan bir Fc varyantini içeren polipeptidlerADCC ve/veya CDC ve/veya ADCP aktivitesini modüle ederler. Bu bulusun spesifik bir özelliginde, bu buluslara uygun varyantlar, azaltilmis bir CDC ve ADCC ve/veya ADCP aktivitesi gösterirler. Azaltilmis CDC Aktivitesi Kompleman aktivasyonu yolagi, koinpleman sisteiiiinin birinci bilesenini (Clq), bir kognat antijenle komplekslestirilmis bir moleküle, örnegin bir antikora baglamak suretiyle baslatilir. Kompleman aktivasyonunu degerlendirmek için, bir CDC eseyi, örnegin "Gazzano-Santoro, et al, J. Iinmunol. Methods 202 (1996) 163" referansina tarif edilen bir esey yapilabilir. Farkli varyantlarin Clqyya baglanma 'Özellikleri, bir ELISA sandviç tipi immünoesey kullanilarak analiz edilebilir. Yari maksimum cevaptaki antikor konsantrasyonu, ECso degerini belirler. Bu okuina, ayni plaka üzerinde, numune ve referans varyasyonu katsayisiyla birlikte ölçülen referans standardina göre nispi fark olarak rapor edilir. Bu bulusun bir yapisinda, bu bulusa konu olan bir FC varyaiitini içeren polipeptidler, C lq reseptörüiçin, bir yabani tip polipeptide kiyasla azaltilmis afiiiiteler gösterirler. Bu bulusun baska bir yapisinda, bu bulusa uygun bir PC varyantini içeren polipeptidler,Clq reseptörîi için, yabani tip polipeptidden en az 2 kat ya da en az 3 kat ya da en az 5 kat en az 200 kat daha az afiniteler gösterirler. Bu bulusun baska bir yapisinda, bu bulusa uygun bir PC varyantini içeren polipeptidler, Clq reseptöri'i için, yabani tip polipeptidin afinitelerinden en az %90, en az %80, en az %70, en az %60, en az oranda daha az afiniteler gösterirler. Bu bulusun baska bir yapisiiida, bu bulusa uygun varyantlar, yaklasik 100 nM ilâ yaklasik 100 "M ya da yaklasik 100 nM ilâ yaklasik 10 HM ya da yaklasik 100 nM ilâ yaklasik 1 uM ya da yaklasik 1 nM ilâ yaklasik 100 uM ya da yaklasik 10 nM ilâ yaklasik 100 uM ya da yaklasik 1 uM ilâ yaklasik 100 uM ya da yaklasik 10 uM ilâ yaklasik 100 uM araliginda afiniteler gösterirler. Bu bulusun belirli bazi yapilarinda, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler,C1q reseptörû için, 1 uM°den daha fazla, 5 uM7den daha fazla, 10 uM°den daha fazla, 25 uM"den daha fazla, 50 uM"den daha fazla ya da 100 uM"den daha fazla afiniteler gösterirler. Bu bulusun bir yapisinda, bulus konusu. bir FC varyantini içeren polipeptid, yabani tip FC polipeptide kiyasla azaltilmis CDC aktiviteleri gösterirler. Bu bulusun baska bir yapisinda, bulus konusu bir PC varyantini içeren polipeptid,bir yabani tip polipeptidin CDC aktivitelerinden en az 2 kat ya da en az 3 kat ya da en az 5 kat ya da en az 10 kat ya da en az 50 kat ya da en az 100 kat daha az CDC aktiviteleri gösterirler. Bu bulusun yine baska bir yapisinda, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptid, yabani tip polipeptide kiyasla en az %10 ya da en az %20 ya da en az %30 ya da en az %40 ya da en az %400 ya da en az %500 oranda azaltilinis CDC aktiviteleri gösterirler. Bu bulusun belirli bazi özelliklerinde, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptid, tespit edilebilir düzeyde hiçbir CDC aktivitesi göstermez. Bu bulusun spesifik yapilarinda, CDC aktivitesinde gerçeklesen düsüs ve/veya ablasyon,bir Fc varyantini içeren polipeptidlerinFc ligandlarina ve/veya reseptörlerine karsi afinitelerinin azalmasina atfedilebilir. Azaltilmis Antikor Iliskili Toksisite Biyolojik tedavilerin immün sistemi istenineyen hücreleri ve/Veya hedefleri taniyacak ve onlara saldiracak sekilde yönlendirmenin kompleks niteligiyle iliskilendirilen advers toksisite sorunlari olabilecegi sektörde anlasilmaktadir. Tedavinin gerektigi durumlarda bu saldiriya yönelik bir tanima ve/veya hedefleme olmadiginda, advers toksisite gibi sonuçlar ortaya çikabilir. Örnegin, hedeflenmeyen dokularin antikor boyamasi potansiyel toksisite sorunlarinin göstergesi olabilir. Bu bulusun bir özelliginde, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptid, yabani tip polipeptide kiyasla azaltilmis bir hedeflenmeyen doku boyama özelligi gösterir. Bu bulusun baska bir özelliginde, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptid hedeflenmeyen doku boyamasinda bir azalma gösterir ve bu azalma, bir yabani tip FC polipeptidininkinin en az 2 kat ya da en az 3 kat ya da en az 5 kat ya az 200 kat daha azina tekabül eder. Bu bulusun baska bir yapisinda, bulus konusu varyantlar hedeflenmeyen doku boyamasinda bir azalma gösterirler ve bu azalma, yabani tip Fc polipeptidine kiyasla en az Bu bulusun bir yapisinda, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidlerinantikor iliskili toksisitesibir yabani tip polipeptide kiyasla azaltilmistir. Bu bulusun baska bir yapisinda, bu bulusa konu olan bir PC varyantini içeren polipeptid,bir yabani tip polipeptidinkinden en az 2 kat ya da en az 3 kat ya da en az 5 kat ya az 200 kat daha az toksisiteler gösterirler. Bu bulusun baska bir özelliginde, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler, yabani tip polipeptide kiyasla en az %10 ya da en az %20 ya da en az azaltilmis toksisiteler gösterirler. Trombosit agregasyonu Bu bulusun bir özelliginde, yabani tip polipeptid platelet aktivasyonu ve/Veya platelet agregasyonu indükler ve onun varyantlari, yani Fc varyantlarini içeren polipeptidler azaltilmis ya da hatta tamamen kesilniisaktivasyon ve/Veya agregasyon özelligi gösterirler. Bu bulusun yine baska bir özelliginde,bu yabani tip polipeptidler,bir platelet proteinini hedefleyen antikorlardir. Bu bulusun yine baska bir özelliginde, bu antikor bir CD9 antikorudur. Bu bulusun yine baska bir yapisinda, bu CD9 antikoru, P329G pozisyonunda ve/Veya P pozisyonunda bir mutasyona sahiptir. Bu bulusun baska bir spesifik yapisinda, bu antikor, SEKANS KOD NO: 8-14 ile karakterize edilir. Biyolojik tedavilerin advers etki olarak trombosit agregasyonuna sahip olabilecekleri sektörde anlasilmaktadir. Trombosit agregasyonunu Ölçmek için, in Vitrove in Vivoeseyleri kullanilabilir. In vitro eseyin in VIVO durumu yansittigi varsayilniaktadir. Bu bulusun bir özelliginde, bulus konusu bir Fe varyantini içeren polipeptidler,bir in vitro eseyde, yabani tip polipeptide kiyasla azaltilmis trombosit agregasyonu gösterirler. Bu bulusun baska bir özelliginde, bulus konusu bir FC varyantini içeren polipeptidler,bir in Vitro eseyde, yabani tip polipeptidiii trombosit agregasyonundan en az trombosit agregasyonu gösterirler. Bu bulusun baska bir yapisinda, bulus konusu bir PC varyantini içeren polipeptidler,bir in vitro eseyde, yabani tip polipeptide kiyasla en az %10 ya da en az %20ya da en az azaltilmis tronibosit agregasyonu gösterirler. Bu bulusun yine baska bir özelliginde, bulus konusu bir Fc varyantini içeren polipeptidler, yabani tip polipeptide kiyasla azaltilmis bir in Vivo trombosit agregasyonu gösterirler. Bu bulusun baska bir özelliginde, bu bulusa konu olan varyantlar, bir in Vivo eseyde, yabani tip Fc polipeptidin trombosit agregasyonundaii en az 2 kat ya da en az da en az 100 kat ya da en az 200 kat azaltilmis trombosit agregasyonu gösterirler. Bu bulusun baska bir yapisinda, bulus konusu bir PC varyantini içeren polipeptidler,bir in Vivo eseyde, yabani tip polipeptide kiyasla en az %10 ya da en az %20 ya da en az %30 ya da az %300 ya da en az %400 ya da en az %500 oranda azaltilmis trombosit agregasyonu gösterirler. Antikorlarin Internalize Edilmesi Bu bulusa konu olan varyantlar, antikorlari hücre içine internalize edebilen, ilave olarak tasiyabilen hücre yüzeyi anti jenlerine baglanabilirler. Bu varyantlar hücre içine girdiklerinde, sitoplazinaya salinabilir, spesifik bir kompartmana yönlendirilmis olabilirler ya da hücre yüzeyine geri dönüstürülebilirler. Bu bulusun bazi yapilarinda, bu bulusa konu olan varyantlar, antikorlari internalize eden bir hücre yüzeyi anti jenine baglanirlar. Bu bulusun diger yapilarinda, bu bulusa konu olan antikorlar, hücrenin spesifik organelleri veya kompartmanlarina yönlendirilmis olabilirler. Bu bulusun yine diger yapilarinda, bu bulusa konu olan varyantlar, internalizasyondan sonra, hücre yüzeyine veya disina geri dönüstürülebilirler. Bu bulusun spesifik bir yapisinda, bu bulusa konu olan antikorp- Selektin, CD9, CD19, CD81, CCRS veya CXCR5, ILl7a veya IL-33 için spesifiktir. Antikor Preparati Bu bulusun tercih edilen yapisinda, bu patent basvurusundaki ögretilere göre modifiye edilmis polipeptidi içeren FC bölgesi, bir antikordur. Antikorlari üretmeye iliskin teknikler asagida açiklanmaktadir: Antijen Seçimi ve Preparati Bu polipeptid an antikor oldugunda, ilgili bir antijene karsi yönlendirilir. Tercihen, bu antijen biyolojik açidan önemli bir polipeptiddir ve bu antikorun bir hastalik veya rahatsizliktan mustarip bir meineliye uygulanmasi o inemelide terapötik bir fayda elde edilmesiyle sonuçlanabilir. Bununla birlikte, polipeptid olinayan antijenlere (ömegin tümörle iliskilendirilen glikolipid antijenler; bakiniz: karsi yönlendirilen antikorlar da düsünülmektedir. Bu antijen bir polipeptid oldugunda, bir büyüme faktörü gibi bir transmembran molekülü (örnegin reseptör) veya ligandiolabilir. Ornek niteligindeki anti jenler; reninginsan büyüme hormonuve bovinbüyüme hormonu da dâhil, bir büyüme hormonu; büyüme hormonusalim faktörü; paratiroid hormonu; tiroid stiinüle edici hormon; lipoproteinler; alfa-l-antitripsin; insülin A zinciri; insülin B zinciri; proinsülin; folikül stimüle edici hormon; kalsitonin; lütenleyici hormon; glukagon; faktör VHIC, faktör IX, doku faktörü (TF) ve V0n Willebrands faktörü gibi pihtilasma faktörleri; Protein C gibi anti- pihtilasma faktörleri; atriyal natriüretil faktör; akciger sürfaktani; ürokinazya da insan ürin veya doku tipi plazminojen aktivatörü (t-PA) gibi bir plazminojen aktivatörü; boinbesin; trombin; hemopoietik büyüme faktörü; tümör nekroz faktörü-alfa ve -beta; enkefalinaz; RANTES (aktivasyon ile regüle olan ve normal T hücrelerinde eksprese olup salgilanan); insan makrofaj inflamatuar proteini (MIP- 1-alfa); insan serum albümini gibi bir serum albümin; Müllerian inhibe edici madde; relaksin A zinciri; relaksin B zinciri; prorelaksin; fare gonadotropiniyle baglantili peptid; beta-laktamaz gibi bir mikrobiyal protein; DNaz; IgE; CTLA-4 gibi bir sitotoksik T- lenfositlebaglantili antijen (CTLA); inhibin; aktivin; vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF); hormonlar veya büyüme faktörleri için reseptörler; protein A veya D; romatoid faktörler; kemik kaynakli nörotrofik faktör, nörotrofin-3, -4, -5 veya -6 (NT-3, NT-4, NT-5 veya NT-6)gibi bir nörotrofik faktör ya da NGF-ß gibi bir sinir büyüme faktörü; platelet kaynakli büyüme faktörü (PDGF); aFGF ve bFGF gibi bir fibroblast büyüme faktörü; epiderinal büyüme faktörü (EGF); TGF-ßl, TGF-BZ, TGF-B3, TGF-ß4 veya TGF-ßS de dâhil, TGF-alfa ve TGF-beta gibi transforme edici büyüme faktörü; insülin benzeri büyüme faktörü-I ve -II (IGF-I ve IGF-II); des(1-3)-IGF-I (beyin IGF-I), insülin benzedri büyüme faktörü baglama proteinleri; CD4, CDS, CD19 ve CD20 gibi CD proteinleri; eritropoietin; osteoindüktif faktörler; immünotoksinler; bir kemik morfogenetik proteini (BMP); interferon-alfa, -beta ve -gamma gibi bir interferon; örnegin M-CSF, GM-CSF ve G-CSF gibi koloni stimüle edici faktörler (CSF"ler); örnegin IL-l ilâ IL-lO gibi interlökinler (ILsler); süperoksit dismutaz; yüzey membran proteinleri; parçalanmayi hizlandiran faktör; örnegin AIDS zarfinin bir parçasi gibi Viral anti jen; tasima proteinleri; homing reseptörleri; addressinler; regülatör proteinler; CDlla, CDllb, CDllc, CD18, bir ICAM, VLA-4 ve VCAM gibi integrinler; HERZ, HER3 veya HER4 reseptörü gibi bir tümörle iliskili antijen ve ayrica, yukarida liste halinde verilen polipeptidlerden herhangi birinin fragmanlari gibi inolekülleri Mevcut bulusun kapsadigi antikorlara yönelik tercih edilen moleküler hedefleri CD4, CDS, CD19, CD20 ve CD34 gibiCD proteinlerini; EGF reseptörü, HERZ, HER3 veya HER4 reseptörü gibiErbB reseptör ailesinin üyelerini; OL veya [3 alt-birimleri (örnegin anti-CDlla, anti- CDl8 veya anti-CDllb antikorlari) da dâhil olinak üzere, LFA-l, integrin gibi hücre adezyon moleküllerini; VEGF gibi büyüme faktörlerini; doku faktörünü (TF); alfa interferonu (a-IFN); lL-8 gibi bir interlökini; IgE; kan grubu antijenlerini; flk2/flt3 reseptörünü; obezite (OB) reseptörünü; inpl reseptörünü; CTLA-4"ü; protein Istege bagli olarak diger moleküllere konjüge olan çözünebilir anti jenlerveya onlarin fragmanlari, antikor olusturmak için immünojen olarak kullanilabilirler. Reseptörler gibi transmembran molekülleri için, bunlarin fragmanlari (örnegin bir reseptörün ekstraselüler domaini) immünojen olarak kullanilabilirler. Alternatif olarak, transmembran molekülü eksprese eden hücreler immünojen olarak kullanilabilirler. Bu tür hücreler bir dogal kaynaktan (örnegin kanser hücre hatlari) türetilebilecekleri gibi, rekombinan tekniklerle transmembran molekül eksprese edecek sekilde transforme edilmis hücreler de olabilirler. Antikor hazirlamak için kullanisli diger anti jenler ve onlarin formlari sektörde bilgi ve beceri sahibi kisiler için açik ve anlasilir olacaktir. Poliklonal Antikorlar Poliklonal antikorlar, tercihen, ilgili antijen ve bir adjuvanla birden çok subkutan (80) veya intraperitoneal (ip) enjeksiyon yapilarak hayvanlarda üretilirler. Ilgili anti jeni immünize edilecek olan türde iminünojenik bir nitelik ortaya koyan bir proteine konjuge etmek faydali olabilir; antijen, `Örnegin, maleimidobenzoil sülfosüksinimid ester (sistein artiklari araciligiyla konjugasyon), N-hidroksisüksinimid (lizin artiklari araciligiyla), glutaraldehit, süksinik anhidrit, SOClgveya R ve R1 simgelerinin farkli alkil gruplarina karsilik geldikleri karbodiimid gibi bir bifonksiyonel veya türevlendirici ajan kullanilarak, 'Örnegin keyhole limpet hemosiyanini, serum albümini, bovin tiroglobulini veya soya fasulyesi tripsin inhibitörüne konjuge edilebilir. Hayvanlar, örnegin !00 ug veya 5 ug protein veya kon jugat (sirasiyla tavsanlar veya fareler için) ile 3 hacim kadar tamamlanmis Freund adjuvani koinbine edilip ardindan elde edilen çözelti birden çok yere intradermal yolla enjekte edilerek, anti jene, immünojenik kon jugatlara veya türevlere karsi immünize edilirler. Bu uygulamadan bir ay sonra, tamamlanmis Freund adjuvani içerisinde orijinal miktarinin 1/210°u düzeyinde kullanilan peptid veya konjugatla birden fazla yerden subkutan enjeksiyon yapilarak hayvanlara rapel dozlari uygulanir. 7 ilâ 14 gün sonra hayvanlardan kan alinir ve serum, antikor titresi açisindan analiz edilir. Titre plato seviyelerine ulasana kadar hayvanlara rapel dozlari verilmeye devam edilir. Rapel uygulamalari tercihen ayni anti jenin bulundugu, fakat konjugasyonun farkli bir proteinle ve/veya farkli bir çapraz baglama reaktifi araciligiyla kurulmus oldugu bir konjugatla yapilirlar. Konjugatlar, protein füzyonlari olarak rekombinan hücre kültürleri içerisinde de olusturulabilirler. Immün cevabi artirinak için, alum gibi agrege edici ajanlarin da kullanilmasi uygundur. Monoklonal Antikorlar Monoklonal antikorlar, ilk olarak Kohler ve arkadaslari tarafindan kullanilarak ya da rekombinan DNA yöntemleri (4.816.567 sayili ABD Patenti) kullanilarak olusturulabilirler. Hibridom yönteminde, bir fare ya da hamster veya makak maymunu gibi uygun baska bir konakçi hayvan, yukarida tarif edildigi gibi immünize edilerek, immünizasyon için kullanilan proteine spesifik baglanacak antikorlari üreten ya da bu antikorlari üretme kabiliyeti bulunan lenfositler hayvanda ortaya çikarilir. Alternatif olarak, lenfositler in vitro ortamda immünize edilebilirler. Daha sonra, lenfositler bir hibridom hücresi olusturmak amaciyla polietilen glikol gibi uygun bir füzyon ajani kullanilarak bir miyeloin hücre hattiyla füzyonlanirlar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986) pp. 59-103)). Bu yolla hazirlanan hibridoin hücreleri, füzyonlanmamis parental iniyeloin hücrelerinin çogalmasini ya da sürVisini inhibe eden bir ya da birden fazla sayida madde ihtiva etmesi tercih edilen uygun bir kültür vasatinda ekilir ve çogaltilirlar. Örnegin, ilgili parental iniyelom hücreleri hipoksaiitiii guanin fosforibozil transferaz (HGPRT ya da HPRT) enziininden yoksunsa, hibridonilar için kullanilan kültür vasati, tipik olarak, HGPRTeksikligi bulunan hücrelerin çogalmasini önleyen maddeler, yani hipoksantin, aminoprotein ve tiinidin (HAT vasati) içerecektir. Tercih edilen miyeloin hücreleri, etkili bir füzyonlanma ortaya koyan, seçilen antikor üreten hücrelerle yapilan stabil yüksek düzey antikor üretiinini destekleyen ve HAT vasati gibi bir vasata karsi duyarli olan miyelom hücreleridir. Bunlar arasindan tercih edilen miyeloin hücre hatlari, inurin miyelom hatlari, örnegin San Diego, California ABDide bulunan Salk Enstitüsü Hücre Dagitiin Merkezi'nden edinilebilecek olan MOPC-21 ve MPC-ll fare tüinörleri kullanilarak ve Rockville, Maryland ABD"de bulunan Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan edinilebilecek olan SP-2 veya X63-Ag8-653 hücreleri kullanilarak elde edilen hücre hatlaridir. Insan monoklonal antikorlarinin üretimi için kullanilabilecek insan miyelom ve fare-insan heteromiyelom hücre hatlari da tanimlanmistir (Kozbor, J., Immunol. 133 (1984) 3001; Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., NeW York (1987) pp. 51-63). Hibridom hücrelerinin çogaltildigi kültür vasati, antijeni hedef alan monoklonal antikorlarin üretimi bakimindan analiz edilir. Hibridom hücreleriyle üretilen monoklonal antikorlarin baglanma spesifisitesi, tercihen, radyoimmünoesey (RIA) ya da enzim-bagli immünosorbent eseyi (ELISA) gibi bir in vitro baglanma eseyiyle ya da immünopresipitasyon yöntemiyle tayin edilir. Istenen Spesifisite, afinite ve/Veya aktiviteye sahip antikorlari üreten hibridom hücreleri tanimlandiktan sonra, klonlar, sinirlayici seyreltme prosedürleri tatbik edilerek alt-klonlanabilir ve standart yöntemlerle çogaltilabilirler (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986) pp. 59-103). Bu amaçla kullanilabilecek uygun kültür vasatlari arasinda, örnegin D-MEM veya RPMI-164O vasatlari sayilabilir. Ek olarak, hibridom hücreleri, bir hayvanda assit tümörleri olarak in Vivo ortamda da çogaltilabilirler. Alt-klonlarin salgiladiklari monoklonal antikorlar, örnegin protein A- Sepharose, hidroksilapatit kromatografisi, jel elektroforezi, diyaliz veya afinite kromatografisi gibi geleneksel immünoglobulin saflastirma prosedürleri kullanilarak kültür vasatindan, assit sivisindan ya da serumdan uygun sekilde ayrilirlar. Monoklonal antikorlari kodlayan DNA, geleneksel prosedürler kullanilarak (örnegin, monoklonal antikorlarin agir ve hafif Zincirlerini kodlayan genlere spesifik baglanma kabiliyeti bulunan oligonükleotid problari kullanilarak) kolaylikla izole edilip sekanslanir. Hibridom hücreleri, bu gibi bir DNA için tercih edilen kaynak olarak islev görürler. DNA izole edildikten sonra ekspresyon vektörlerine yerlestirilebilir ve bu vektörler, daha sonra, immünoglobulin proteinini aksi takdirde üretmeyecek olan E. coli hücreleri, simian COS hücreleri, Çin Hamsteri Yumurtalik (CHO) hücreleri ya da miyelom hücreleri gibi konakçi hücrelere transfekte edilerek, rekoinbinan konakçi hücrelerde monoklonal aiitikorlarin seiitezlenmesi saglanir. Antikorlarin rekombiiian üretimi asagida daha detayli tarif edilecektir. Bu bulusun baska bir yapisinda, antikorlar veya antikor fragmanlari, edilen teknikler kullanilarak olusturulan antikor fa j kütüphanelerinden kütüphaneleri kullanilarak gerçeklestirilen sirasiyla murin ve insan antikoru izolasyon prosedürleri anlatilniaktadirDaha sonradan yayimlanan çalismalarda, zincir shuffling yöntemiyle (Marks, et al., kütüphaneleri olusturmaya dönük bir strateji olarak görülebilecek olan kombinatoryal enfeksiyon ve in Vivo rekombinasyon yöntemiyle afiniteye sahip (nM araliginda) insan antikorlari üretme yollari anlatilmaktadir. Dolayisiyla, bu teknikler, monoklonal antikorlari izole etmek için uygulanan geleneksel monoklonal antikor hibridom teknikleri yerine kullanilabilecek olan uygun alternatifleri teskil DNA'da modifikasyon da yapilabilir; bu modifikasyon, örnegin homolog muriii sekaiislari yerine insan agir zincir ve hafif zincir sabit domainleri için kodlama sekansi ikame edilerek (4.816.567 sayili ABD Pateiiti ve Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 imini'inoglobulin olmayan bir polipeptide iliskin kodlama sekansinin tamamina veya bir kismina kovalent baglanarak gerçeklestirilir. Immünoglobulin olmayaii bu gibi polipeptidler, normalde, bir antikorun sabit domainlerinin yerine ikame edilebilir ya da bir anti jene karsi spesifisitesi bulunan bir antijen birlesme yeri ile farkli bir anti jene karsi spesifisitesi bulunan baska bir anti jen birlesme yerinden olusan bir kiinerik bivalent antikor yaratmak amaciyla, bir antikorun bir antijen birlesme yerine ait degisken domainlerin yerine ikame Antikor Afinitesi Bulusun belirli yapilarinda, ayrisma sabiti (Kd) S 1 uM, S 100 nM, S (ömegin 108 M veya daha düsük, ömegin 10"8 M ilâ 10"'3 M, örnegin '9 M ilâ 10"3 M) düzeyinde olan bir antikor sunulmaktadir. Bulusun bir yapisinda, Kd degeri, asagida tarif edilen eseyde anlatildigi gibi, bir ilgili antikorun Fab versiyonu ve o antikorun anti jeniyle bir radyoaktif etiketli anti jen ya da FC reseptörü baglanma eseyi (RIA) tatbik edilerek ölçülür. Fabllarin anti jene yönelik çözelti baglanma afinitesi, bir etiketleiimemis anti jen titrasyon serisi esliginde asgari konsantrasyondaki bir (USD-etiketli anti jenle Fab°1n dengelenmesi ve ardindan, bagli anti jenin bir anti-Fab antikoru-kapli plakayla yakalanmasi yoluyla ölçülür (örnegin bkz: Chen, et al., J. amaciyla, MICROTITER® çok-kuyucuklu plakalar (Thermo Scientific), 50 mM sodyum karbonat (pH 9,6) içinde 5 tig/ml düzeyindeki bir anti-Fab yakalama antikoruyla (Cappel Labs) gece boyunca kaplanir ve ardindan, PBS içinde %2 (a/h) bovin serum albüminiyle oda sicakligi (yaklasik 23°C) altinda iki ilâ bes saat süreyle bloke edilirler.Absorban olmayan bir plakada (Nunc hazirlanmis seri seyreltilerle karistirilir (örnegin, "Presta, et al., Cancer 12 için yapilan degerlendirmeye uygun olarak). Akabinde, ilgili Fab gece boyunca inkübe edilir; bununla birlikte, denge durumuna ulasmak için daha uzun süreli (örnegin yaklasik 65 saat) bir inkübasyon da yapilabilir. Daha sonra, karisimlar yakalama plakasina aktarilarak oda sicakligi altinda (örnegin bir saat süreyle) inkübasyon gerçeklestirilir. Müteakiben, çözelti çikartilir ve plaka, PBS içinde %0,l polisorbat 20 (TWEEN-20®) ile sekiz defa yikanir. Plakalar kuruduktan sonra, 150 ul/kuyucuk sintilant (MICROSCINT-ZOTM; Packard) ilave edilir ve bir TOPCOUNTTM gama sayaci (Packard) kullanilarak plakalarda on dakika süre boyunca sayim yapilir. Kompetitif baglanma eseylerinde kullanilmak üzere, azami baglanmanin %20°sinden düsük ya da ona esit sonuç veren Fab konsantrasyonlari seçilir. Bulusun baska bir yapisina göre, Kd degeri, 25°C sicaklik altinda bir BlACORE®-2000 ya da bir BlACORE®-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) kullanilarak -10 cevap birimi (RU) düzeyinde immobilize antijen veya Fc reseptörü CM5 çipleriyle gerçeklestirilen yüzey plazinon rezonans eseylerinde ölçülür. Kisaca tarif etmek gerekirse, karboksimetillenmis dekstran biyosensör çipleri (CMS, BIACORE Inc), tedarikçinin verdigi talimatlara göre N-etil-N'-(3- diinetilaminopropil)-karbodiimid hidroklorür (EDC) ve N- hidroksisüksinimidle (NHS) aktive edilir.Antijen, 5 til/dakika akis hizinda enjeksiyondan önce 10 1nM sodyum asetat pH 4,8 ile 5 tig/ml düzeyinde bagli proteine ulasilir. Anti jen en jeksiyonundan sonra, 1 M etanolamin enjekte edilerek reaksiyona girinemis gruplar bloke edilir. Kinetik ölçümleri için, iki katlik seri Fab seyreltileri (0,78 nM ilâ , yaklasik 25 ul/dakika akis hizinda ve 25°C sicaklik altinda PBS'ye (PBST) enjekte edilirlerBirlesme hizlari (kon) ve ayrisina hizlari (kom), birlesme ve ayrisma sensorgramlarinin eszainanli oturtulmasi suretiyle basit bir bire-bir Langinuir baglanma modeli (BIACORE® Degerlendirme Yazilimi versiyon 3.2) kullanilarak hesaplanirDenge ayrisma sabiti (Kd), koff/kon orani olarak hesaplanir. açiklanan yüzey plazmon rezonansi eseyiyle tayin edilen birlesme hizinin 106 M"1 s" seviyesinden yüksek olmasi halinde, birlesme hizi, bir karistirilmis küvetin bulundugu bir 8000-serisi SLM-AMINCOTM spektrofotometre (ThermoSpectronic) ya da bir stop-flow donanimli spektrofotometre (Aviv Instruments) gibi bir spektroinetrede yapilan ölçüme göre artan konsantrasyonlarda antijenin varliginda, PBS pH 7,2 içinde bulunan 20 nM düzeyindeki bir anti-antijen antikorunun (Fab formu) 25°C sicaklik altindaki floresans emisyon yogunlugu (eksitasyon = 295 nm; emisyon = 340 nni, 16 nm bant-geçisi) artisini ya da düsüsünü ölçen bir floresans söndürme teknigi kullanilarak tayin edilebilir. Bulusun belirli yapilarinda, burada sunulan bir antikor, bir antikor fragmanidir. Antikor fragmanlari arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, FV ve scFV fragmanlari ve asagida açiklanan diger fragmanlar bulunur. Belirli antikor fragmanlarina dair bir inceleme için bkz: Hudson, et al., Nat. Med. 9 bkz: Pluckthün, in The Pharmacology of Monocloiial Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, NeW York), pp. sayili ABD patentleri. Kurtarici reseptör baglanma epitopu artiklari ihtiva eden ve in Vivo yari ömrü artirilmis olan Fab ve F(ab')2 fragmanlarina dair bir tartisma için bkz: 5.869.046 sayili ABD patenti. Dimerik antikor fragmanlari, bivalent veya bispesifik nitelikte olabilecek iki adet anti jen baglanma yeri barindiran antikor 129-134" eserinde, trimerik antikor fragmanlari ile tetramerik antikor fragmanlari da anlatilmaktadir. Tek domainli antikorlar, bir antikorun agir zincir degisken doniaininin tamamini veya bir kismini ya da hafif zincir degisken domaininin tamamini veya bir kismini ihtiva eden antikor fraginanlaridir. Bulusun belirli yapilarinda, tek domainli antikor bir insan tek domainli antikorudur (Domantis, Inc., Waltham, MA; örnegin bkz: 6.248.516 Bl sayili ABD patenti). Antikor fragmanlari, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, aralarinda bir intakt antikorun proteolitik sindirime ugratilmasina ve burada açiklandigi gibi rekombinan konakçi hücrelerle (örnegin E. coli veya faj) üretime dayanan tekniklerin de bulundugu çesitli tekniklerle yapilabilirler. Kimerik ve H'i'imanize Antikorlar Bulusun belirli yapilarinda, burada sunulan antikor bir kimerik antikordur. Örnegin 4.816.567 sayili ABD patentinde ve "Morrison, et kimerik antikorlar tanimlanmakta ve açiklanmaktadir. Bir örnekte, mensei insan olmayan bir degisken bölgenin (örnegin bir fare, siçan, hamster, tavsan veya insan disindaki bir primat, örnegin bir mayniundan elde edilen bir degisken bölge) ve bir insan sabit bölgesinin yer aldigi bir kimerik antikor konu edilmektedir. Bir diger örnekte, bir kimerik antikor, bagli bulundugu sinif veya alt-sinif degistirilerek ana antikorun bagli bulundugu sinif veya alt-siniftan farkli bir sinif veya alt-sinifa mensup hale getirilmis olan bir "sinifi degistirilmis" antikordur. Kimerik antikorlar, antijen baglanma fragmanlarini da kapsar. Bulusun belirli yapilarinda, bir kimerik antikor, bir hümanize antikordur. Insan menseli olmayan bir antikor, normalde, insan-disi ana antikoruii sahip oldugu spesifisite ve afinite düzeyinin korunmasi sartiyla, antikorun insanlara karsi immünojenisitesini düsürmek amaciyla hümanize edilir. Bir hümanize antikor genelde bir veya daha fazla sayida degisken domain ihtiva eder ve bunlar arasindan HVR'ler, örnegin CDR'ler (veya onlarin kisimlari), mensei insan olmayan bir antikordan, FR'ler (veya onlarin kisimlari) ise insan antikor sekanslarindan türetilirBir hümanize antikorda istege bagli olarak bir insan sabit bölgesinin en aziiidan bir kismi da bulunacaktir. Bu bulusun bazi yapilarinda, bir hümanize antikorda bulunan bazi FR artiklari, örnegin antikor spesifisitesi veya afinitesini düzeltmek veya gelistirmek adina, insan menseli olmayan bir antikordaki (örnegin HVR artiklarinin türetildikleri antikordaki) mütekabil artiklarla ikame Hüinanize antikorlar ve bu tür antikorlari yapmak için uygulanan yöntemler örnegin asagida sirali eserlerde incelenmistirzAlmagro, and et al., Methods 36 ( greftlemesi artiklarini degistirme" prosedürü anlatilmaktadir); Dall'Acqua, et al., Hümanizasyon amaciyla kullanilabilecek insan çerçeve bölgeleri arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, asagida siralanan bölgeler sayilabilir: "en iyi uydurma" adli yöntem kullanilarak seçilen çerçeve bölgeleri (örnegin bkz: Sims, et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296); hafif veya agir zincir degisken bölgelerinin olusturdugu belirli bir alt-gruba mensup insan antikorlarinin konsensüs sekansindan elde edilen çerçeve bölgeleri (örnegin bkz: Carter, et al., Proc. Natl. Acad. 2623)); insan matür (somatik olarak mutasyona ugratilmis) çerçeve bölgeleri veya insan germ hatti çerçeve bölgeleri (örnegin FR kütüphaneleri taramasindan elde edilen çerçeve bölgeleri (örnegin Insan Antikorlari Bulusun belirli yapilarinda, sunulan antikor bir insan antikorudur. Insan antikorlari, sektörde bilinen muhtelif teknikler kullanilarak üretilebilirler. Insan antikorlari, genel hatlariyla "van Di jk, and van de anlatilmakta ve açiklanmaktadirlar. Insan antikorlari, yapilan antijenik yüklemeye cevaben intakt insan antikorlari ya da insan degisken bölgelerinin bulundugu intakt antikorlar üretecek sekilde modifiye edilmis olan bir transgenik hayvana bir iminünojen uygulanmasi yoluyla hazirlanabilirler. Bu gibi hayvanlarda, normalde insan immünoglobulin lokuslarinin tamami veya bir kismi bulunur ve bu içerik, endojen immünoglobulin lokuslarinin yerine geçirilerek yerlestirilmistir ya da hayvanin kromozomlarinda ekstrakroinozomal olarak bulunur veya hayvanin kromozomlarina rastgele entegre edilmistirBu gibi transgenik farelerde, endojen immünoglobulin lokuslari genelde inaktive edilmis olurlar. Transgenik hayvanlardan insan antikorlari elde etmeye yönelik yöntemlere iliskin bir inceleme ve derleme için bkz: Lonberg, sayili ABD patentleri; HUMAB® teknolojisinin anlatildigi 5.770.429 sayili ABD patenti, K-M MOUSE® teknolojisinin anlatildigi 7.041.870 sayili ABD patenti; ve VELOCIMOUSE® teknolojisinin gibi hayvanlardan istifade edilerek elde edilen intakt antikorlardan edinilen insan degisken bölgeleri, örnegin farkli bir insan sabit bölgesi ile kombine edilerek daha da modifiye edilebilirler. Insan antikorlari, hibridom bazli yöntemlerle de yapilabilirler. Insan monoklonal antikorlarinin üretimi için kullanilabilecek insan miyelom ve fare-insan heteromiyelom hücre hatlari sektörde anlatilmis ve açiklanmistir (örnegin bkz: Kozbor, J. Immunol., 133 (1984) 3001; Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, lnc., New York, (1987) pp. 51-63 ve Boerner, et al., J. Immunol., 147 (1991) 86). Ayrica "Li, et al., hücresi hibridom teknolojisi yoluyla üretilen insan antikorlari anlatilmakta ve açiklanmaktadir. Ek yöntemler arasinda, örnegin 7.189.826 sayili ABD patentinde (hibridom hücre hatlarindan monoklonal insan IgM antikorlarinin üretiminin açiklandigi yayin) ve hibridomlarinin açiklandigi yayin) anlatilan yöntemler bulunmaktadir. Insan hibridom teknolojisi (Trioina teknolojisi) ayrica "Vollmers, aiid anlatilmakta ve açiklanmaktadir. Insan antikorlari, insan kaynakli faj görüntüleme kütüphaneleri içerisinden seçilen FV klonu degisken domain sekanslari izole edilerek de elde edilebilirler. Bu degisken domain sekanslari daha soiira istenen insan sabit domaini ile kombine edilebilirler. Antikor kütüphaneleri içerisinden insan aiitikorlarini seçme teknikleri asagida açiklanmaktadir. Kütüphane Kaynakli Antikorlar Bu bulusa konu olan antikorlar, koinbinatoryel kütüphanelerde istenen aktivite veya aktivitelere sahip olan antikorlara yönelik bir tarama yapilarak izole edilebilirler. Örnegin, faj görüntüleme kütüphanelerini olusturmaya ve bu gibi kütüphanelerde istenen baglanma karakteristiklerine sahip olan antikorlara yönelik tarama yapmaya dayanan sektörde bilinen çesitli yöntemler vardir. Bu gibi yöntemler, örnegin "Hoogenbooni, HR., et al., in Methods in Molecular Biology 178 (2002) " eserinde gözden geçirilmekte ve ayrica örnegin asagida siralanan eserlerde anlatilmakta ve açiklanmaktadirlar: McCafferty, J., et al., Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu, et al., J. Mol. Biol. 338(2) 12467- Belirli faj görüntüleme yöntemlerinde, VH ve VL genlerinden olusan repertuarlar, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yoluyla ayri ayri klonlanirlar ve faj görüntüleme kütüphanelerinde rastgele rekombine edilirler; bu kütüphaneler ise daha soiira "Winter, et al., Ann. Rev. baglanimli faj bakimindan taranabilirler. Faj normalde ya tek Zincirli FV (scFV) fragmanlari ya da Fab fragmanlari formunda olmak üzere antikor fragmanlarini görüntüler. Immünize kaynaklardan edinilen kütüphaneler, hibridomlar olusturulmasina gerek duyulmaksizin, immünojeni hedef alan yüksek afiniteli antikorlar elde edilmesini saglarlar.Altematif olarak, "Griffiths, et al., EMBO J, 12 (1993) 725- 734" eserinde açiklandigi gibi, naif repertuar klonlanarak (örnegin insandan), herhangi bir immüiiizasyon yapmaya gerek kalmaksizin hem non-self hem de self antijenleri kapsayan genis bir antijen popülasyonuna yönelik bir tekli antikor kaynagi temin edilebilir.Son olarak, naif kütüphaneler, "Hoogenboom, and Winter, J. Mol. Biol., yeniden düzenlenmemis V-geni segmeiitleriiii klonlayarak ve randomize sekans içeren PCR primerleri kullanarak yüksek düzeyde degisken CDR3 bölgelerini kodlamak ve in Vitro ortamda yeniden düzenleme gerçeklestirmek suretiyle sentetik olarak da olusturulabilirler.Insan antikoru faj kütüphanelerinin anlatildigi ve açiklandigi patent yayinlari arasinda 'Örnegin sunlar bulunur: Insan antikor kütüphanelerinden izole edilen antikorlar veya antikor fragmanlari burada insan antikorlari ya da insan antikor fragmanlari olarak degerlendirilmektedirler. Multispesifik Antikorlar Bulusun belirli yapilarinda, burada sunulan antikor bir multispesifik antikor, 'Örnegin bir bispesifik antikordur. Multispesifik antikorlar, en az iki farkli yere karsi baglanma Spesifisitesine sahip olan monoklonal antikorlardir. Bulusun belirli yapilarinda, baglanma spesifisitelerinden biri bir spesifik anti jene yönelikken, digeri baska herhangi bir anti jene yöneliktir. Bulusun belirli yapilarinda, bispesifik antikorlar anti jenin iki farkli epitopuna baglanabilirler. Bispesifik antikorlar, sitotoksik ajanlari, antikorun baglandigiantijen eksprese eden hücrelere lokalize etmek amaciyla da kullanilabilirler. Bispesifik antikorlar, tam boy antikorlar veya antikor fragmanlari olarak hazirlanabilirler. Multispesifik antikorlarin yapimi için kullanilabilecek teknikler arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, farkli spesifisitelere sahip olan iki adet immünoglobulin agir zincir-hafif zincir çiftinin rekombinan olarak birlikte eksprese edilmesine (bkz: Milstein, and bkz: dayanan teknikler bulunur. Multispesifik antikorlar, antikor Fc-heterodimerik inoleküller yapmaya yönelik elektrostatik yönlendirme etkileri düzenlenerek (WO fragmani çapraz baglanarak (örnegin bkz: 4.676.980 sayili ABD patenti ve Brennan, et al., Science, 229 (1985) 81); bispesifik antikorlar üretme gayesiyle lösin ferinuarlari kullanilarak (örnegin bispesifik antikor fragmanlari yapmaya yönelik "dimerik antikor fragmani" teknolojisi kullanilarak (örnegin bkz: Hollinger, et al., Proc. dimerleri kullanilarak (örnegin bkz: Gruber, et al., J. Immunol., 152 eserinde tarif edilen prosedüre göre trISpesifik antikorlar hazirlanarak da yapilabilirler. sayida fonksiyonel anti jen baglanma yeri barindiracak sekilde tasarlanan antikorlar da bu bulusun kapsainina girinektedir (örnegin Bu bulusa uygun antikor veya antikor fragmanlari arasinda, hem bir spesifik anti jene hem de baska farkli bir anti jene baglanan bir anti jen baglanma yerinin bulundugu bir "Çift Yönlü FAb" ya da "DAF" da Antijene baglanma afinitesi degismis olan antikor varyantlari Bulusun belirli yapilarinda, antikorun anti jene baglanma afinitesinin ve/Veya baska biyolojik özelliklerinin gelistirilmesi istenebilir. Bir antikorun amino asit sekansi varyantlari, antikoru kodlayan nükleotid sekansinda uygun modifikasyonlar yapilarak ya da peptid sentezi yoluyla hazirlanabilir. Bu gibi modifikasyonlar arasinda, örnegin, antikorun amino asit sekanslari içerisinde yer alan artiklarin siliiimesine ve/Veya ikame edilmesine ve/Veya söz konusu sekaiislara yeni artiklar sokulmasina dayanan modifikasyonlar sayilabilir. Nihai yapiya ulasmak için, silme, sokma ve ikameye dayali modifikasyonlardan olusan herhangi bir kombinasyon yapilabilir; ancak su sartla ki, nihai yapinin istenen karakteristiklere, örnegin anti jen baglama özelligine sahip olmasi gerekir. S'ûbstit'i'isyon, Insersiyon ve Delesyon Varyantlari Bu bulusun belirli yapilarinda, Fe varyantlari içeren ve ek olarak, FC kismi haricinde baska kisimlarda da bir veya daha fazla amino asit sübstitüsyonuna sahip olan polipeptidler sunulmaktadir.Sübstitusyonel mutagenez için uygun yerler arasinda HVR'ler ve FR'ler bulunur. Konservatif sübstiti'isyonlar asagidaki Tablo 1'de "konservatif sübstitüsyonlar" basligi altinda gösterilmektedir. Daha büyük degisiklikler ise yine asagidaki Tablo 1'de "örnek niteligindeki sübstitüsyonlar" basligi altinda gösterilmekte ve asagida ainino asit yan zinciri siniflarina göre daha ayrintili açiklanmaktadir. Amino asit sübstitüsyonlari, ilgili antikora sokulabilir ve ürünler, istenen aktivite açisindan, örnegin korunan/gelistirilen anti jen baglama ya da azalan immünojenisite açilarindan taramr. Orijinal Ornek Sübstitüsyonlar KonservatifSübstitüsyonlar Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Norlösin Leu (L) Norlösin; Ile; Val; Met; Ile Ala; Phe Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Orijinal Ornek Sübstitüsyonlar KonservatifSübstitüsyonlar Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Leu Norl'osin Amino asitler, ortak yan zincir özelliklerine göre asagida gösterildigi gibi gruplara ayrilabilirler: (l) hidrofobik: Ile, Met, Ala, Val, Leu, lle; (2) nötr hidrofilik: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) asidik: Asp, Glu; (4) bazik: His, Lys, Arg; (5) zincir oryantasyonunu etkileyen artiklar: Gly, Pro; (6) aromatik: Trp, Tyr, Phe. Konservatif olinayan sübstitüsyonlar, bu siniflardan herhangi birine mensup olan bir artigin baska bir sinifa mensup bir artikla degistirilmesini gerektirecektir. Bir sübstitüsyonel varyant tipinde, bir ana antikorun (örnegin bir hümanize antikor veya insan antikoru) bir veya daha fazla sayida hiperdegisken bölge artigi ikame edilir. Geiiel itibariyla, daha derinlemesine çalismalar yapmak için seçilen nihai varyant(lar), ana antikora göre belirli biyolojik 'ozellikler bakimindan modifiye edilmis (örnegin gelistirilmis) (örnegin artirilmis afinite, düsürülmüs immünojenisite) olacaklar ve/Veya ana antikorun belirli biyolojik özelliklerini büyük ölçüde muhafaza edeceklerdir. Sübstitüsyonel varyantlara verilebilecek örneklerden biri, faj görüntüleme bazli afinite matürasyon teknikleri, örnegin burada tarif edildigi gibi olan teknikler kullanilarak uygun sekilde üretilebilecek olan afinitematürasyonlu antikordur. Kisaca tarif etmek gerekirse, bir veya daha fazla sayida HVR artigi mutasyona ugratilir ve varyant antikorlar faj üzerinde görüntülenip belirli bir biyolojik aktivite (örnegin baglanma afinitesi) bakiniindan taranirlar. HVR'lerde örnegin antikor afinitesini gelistirmeye yönelik alterasyonlar (örnegin sübstit'ûsyonlar) yapilabilir. Bu gibi alterasyonlar, HVR "sicak noktalarinda", yani soinatik matürasyon prosesi esnasinda yüksek frekansta mutasyona ugrayan kodonlarin kodladiklari artiklarda (örnegin bkz: Chowdhury, Methods Mol. Biol. yapilabilirler ve olusan varyant VH veya VL, baglanma afinitesi bakimindan test edi]ir.Sekonder kütüphanelerin yapilip bu kütüphanelerden yeniden seleksiyon gerçeklestirilmesine dayanan afinite matürasyonu örnegin 37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))" eserinde anlatilmistir. Afinite matürasyonuna iliskin bulus yapilarindan bazilarinda, matürasyon için seçilen degisken genlere çesitli yöntemler (örnegin hata egilimli PCR, zincir shuffling veya oligonükleotid hedefli mutagenez) kullanilarak çesitlilik katilabilirDaha sonra, bir sekonder kütüphane olusturulur. Ardindan bu kütüphanede istenen afiniteye sahip olan her türlü antikor varyantini belirleyip ayirt etmek amaciyla tarama yapilir. Çesitlilik katinak için uygulanabilecek bir diger yöntem, bir dizi HVR artiginin (örnegin tek seferde 4-6 adet artik) randomize edildigi HVR hedefli yaklasimlara dayanir. Anti jen baglaninasinda rol oynayan HVR artiklari, örnegin alanin taraina mutagenezi veya inodelleine gerçeklestirilerek spesifik olarak belirlenip ayirt edilebilirler. Ozellikle çogunlukla CDR-H3 ve CDR- L3 hedef alinir. Bulusun belirli yapilarinda, bir veya daha fazla sayida HVR'de sübstit'usyon, insersiyon ve/Veya delesyon söz konusu olabilir, ancak su sartla ki bu alterasyonlarin antikorun anti jene baglanma kabiliyetini büyük ölçüde düsürmemeleri gerekir. Örnegin, HVR'lerde baglanma afinitesini önemli ölçüde düsürmeyen konservatif alterasyonlar (örnegin burada gösterildigi gibi olan konservatif sübstitüsyonlar) yapilabilir. Bu gibi alterasyonlar, HVR "sicak noktalarinin" veya SDR'lerin disindaki yerlerde yapilabilirler. Yukarida sunulan varyant VH ve VL sekanslarina iliskin belirli bulus yapilarinda, ya HVR'lerin hiçbiri degisiklige ugratilmaz ya da HVR'lerin her birinde en fazla bir, iki veya üç adet amino asit sübstitüsyonu bulunur. Mutagenez için hedef alinabilecek antikor artiklari veya bölgelerini belirleyip ayirt etineye yönelik kullanisli yöntemlerden biri, açiklandigi gibi olan "alanin tarama mutagenezidir". Bu yöntemde, bir hedef artik veya bir hedef artiklar grubu (örnegin arg, asp, his, lys ve glu gibi yüklü artiklar) belirlenir ve bu artik veya artiklar bir nötr veya negatif yüklü amino asitle (örnegin alanin veya polialanin) degistirilerek antikorun anti jenle kurdugu etkilesimin bu degisiklikten etkilenip etkileninedigi tayin edilir. Yapilan ilk sübstitüsyonlara karsi fonksiyonel sensitivite sergileyen amino asit lokasyonlarinda baska sübstitüsyonlar yapilabilir. Alternatif veya ek olarak, bir antijen- antikor kompleksinin kristal yapisi incelenerek antikor ile antijen arasindaki temas noktalari belirlenip ayirt edilir. Bu temas artiklari ve bunlara komsu artiklar, sübstitüsyon adaylari olarak hedef alinabilir veya elimine edilebilirler. Varyantlar, istenen özellikleri tasiyip tasiinadiklarini belirlemek amaciyla taramaya tâbi tutulabilirler. Amino asit sekansi insersiyonlari arasinda, tek bir artiklik bir boya sahip olabilecegi gibi, yüz veya daha fazla sayida artiktan mütesekkil polipeptidlerden ibaret olmasi da muhtemel olan amino- ve/veya karboksil-terminal füzyonlari ve yani sira, tek veya çoklu amino asit artiklariyla yapilan intra-sekans iiisersiyonlari bulunur. Terminal insersiyonlara örnek olarak bir N-terminal metionil artigi içeren bir antikor gösterilebilir. Antikor molekülün'ûn diger insersiyon varyantlari arasinda, antikorun serum yari ömrünü uzatan bir enziinin (örnegin ADEPT için) ya da bir polipeptidin antikorun N- ya da C- terminal ucuna fuzyonlanmasi yoluyla olusturulan varyantlar bulunur. Glikozilasyon varyantlari Bulusun belirli yapilarinda, burada sunulan bir antikor, antikorun glikozillenme düzeyini artiracak ya da azaltacak bir alterasyona tâbi tutulur. Bir antikorun amino asit sekansi bir veya daha fazla sayida glikozilasyon yerinin olusturulmasina veya mevcut bir veya daha fazla sayida glikozilasyon yerinin çikartilmasina dayanan bir alterasyona ugratilarak söz konusu antikora glikozilasyon yerleri uygun sekilde eklenebilir veya söz konusu antikordaki mevcut glikozilasyon yerleri uygun sekilde silinebilir. Antikorda bir PC bölgesinin yer aldigi durumlarda, ona bagli karbonhidrat alterasyona ugratilabilir. Memeli hücrelerinin ürettikleri natiV antikorlar normalde bir dallaiimis iki-antenli oligosakkarit içerirler ve bu oligosakkarit genelde bir N-linkaji araciligiyla Fc bölgesinin CH2 doinainiiide yer alan Asn297 artigina bagli olur Oligosakkaritte, örnegin mannoz, N-asetil glukozamin (GlcNAc), galaktoz ve sialik asit gibi çesitli karbonhidratlar ve bunlarin yani sira, iki-antenli oligosakkarit yapisinin "kök" kismindaki bir GlcNAc"ye bagli halde bir fukoz bulunabilir. Bulusuii bazi yapilarinda, bulus konusu bir antikordaki oligosakkarit belirli özellikler bakiiiiindan gelismis olan antikor varyantlari olusturmak amaciyla modifiye edilebilirler. Fc varyantlari içeren polipeptidler, örnegin antikorun Fc bölgesiiie bagli Fc çekirdek oligosakkaritiniii diferansiyel sialilasyonunun saglandigi sialilleninis oligosakkaritlerle de sunulur. Bu polipeptidlerde sialilasyon armisve/veya ADCC fonksiyonu azalmis olabilir. Bu aiitikor varyatlarina örnekleri, "Kaneko, et al., Science Sisteinle degistirilmis antikor varyantlari Bulusun belirli yapilarinda, aiitikordaki bir veya daha fazla sayida artigin sistein artiklariyla sübstiti'ie edilmis oldugu sisteinle degistirilmis antikorlar, örnegin "tioMAb'lar" olusturulmasi istenebilirBulusun belirli yapilarinda, sübstitüe edilen artiklar antikorun erisilebilir yerlerinde bulunurlar. Bu artiklarin sisteinle ikame edilmesi sayesinde, reaktif tiyol gruplari antikorun erisilebilir yerlerinde konuinlanir ve antikoru burada ayrintili olarak açiklandigi gibi ilaç moiyeteleri veya baglayici-ilaç moiyeteleri gibi baska moiyetelere konjuge etmek ve bir immünokonjugat olusturmak amaciyla kullanilabilirler. Bulusuii belirli yapilarinda, asagida siralanan artiklardan biri veya daha fazlasi sisteinle sübstitüe edilebilir: hafif zincir V205 artigi (Kabat numaralandirmasi); agir zincir A118 artigi (AB nuinaralandirmasi) ve agir zincir FC bölgesi 8400 artigi (AB numaralandirmasi). Sisteinle degistirilmis antikorlar, üretilebilirler. Antikor Türevleri Bulusun belirli yapilarinda, burada sunulan bir antikor, sektörde biliiien ve rahatlikla elde edilebilecek olan ek proteinsiz moiyeteler ihtiva etmesini saglayacak bir modifikasyona ugratilabilir. Antikor derivatizasyonuna uygun moiyeteler arasinda, sadece bunlarla sinilir kalmaksizin, suda çözünür polimerler bulunur. Suda çözünür polimerlere verilebilecek örnekler arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, polietilen glikol (PEG), etilen glikol / propilen glikol kopolimerleri, karboksimetilselüloz, dekstran, poliVinil alkol, poliVinil pirolidon, poli-l, 3-dioksolan, poli-l,3,6-trioksan, etilen / maleik anhidrit kopolinieri, poliaininoasitler (homopolimerler ya da random kopolimerler) ve dekstran veya poli(n-Viiiil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimerleri, prolipropilen oksit / etilen oksit kopolimerleri, polioksietillenmis polioller (Örnegin gliserol), polivinil alkol ve bunlardan olusan karisimlar sayilabilir.Polietilen glikol propionaldehit, sudaki stabilitesinden dolayi üretimde avantaj saglayabilir. Polimer herhangi bir moleküler agirlikta olabilir ve dallanmis olabilecegi gibi, dallaninamis da olabilir. Antikora baglanan polimer sayisi degisebilir ve birden fazla sayida polimer baglanacaksa, bunlar ayni moleküller olabilecekleri gibi, farkli moleküller de olabilirler. Derivatizasyon için kullanilan poliinerlerin sayisi ve/Veya tipi, genel itibariyla, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, antikorun gelistirilmesi hedeflenen `Özellikleri veya fonksiyonlari, antikor türevinin belirlenmis kosullar altinda bir tedavide kullanilip kullanilmayacagi ve benzerleri de dahil bazi mülahazalar esasinda tayin edilebilir. Bulusun baska bir yapisinda, radyasyona tâbi tutularak selektif biçimde isitilabilecek bir proteinsiz moiyete ile bir antikordan olusan konjugatlar sunulur. Bulusun yapilarindan birinde, proteinsiz moiyete bir karbon nanotüptür (Kam, et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA '102 ve sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, siradan hücrelere zarar vermeyen, fakat proteinsiz moiyeteyi antikor-proteinsiz moiyeteye yakin hücrelerin ölmesini saglayacak bir sicakliga dek isitan dalgaboylari bunun kapsamina girer. Rekombinan Yöntemler ve Bilesimler Antikorlar, rekombinan yöntemler ve bilesimler kullanilarak, örnegin 4.816.567 sayili ABD patentinde tarif edildigi gibi rekombinan yöntemler ve bilesiinler kullanilarak üretilcbilirler. Bulusun bir yapisinda, burada tanimli bir antikoru kodlayan izole nükleik asit sunulmaktadir. Bu gibi bir nükleik asit, antikorun VL"sini içeren bir amino asit sekansini ve/veya aiitikorun VH°sini (örnegin antikorun hafif ve/veya agir zincirleri) içeren bir amiiio asit sekansini kodlayabilirBu bulusun baska bir yapisinda,bu gibi bir nükleik asit ihtiva eden bir veya daha fazla sayida vektör (örnegin ekSpresyon vektörü) sunulmaktadir. Bu bulusun baska bir yapisinda, bu gibi bir nükleik asit içeren bir konakçi hücre sunulmaktadirBulusun böyle bir yapisinda, bir konakçi hücrede sunlar bulunur (örnegin asagida belirtilen unsur veya unsurlarla transforme edilmistir): (1) antikorun VL"sinin bulundugu bir amino asit sekansini ve antikorun VH°sinin bulundugu bir ainino asit sekansini kodlayan bir nükleik asidin yer aldigi bir vektör ya da (2) antikoruii VL"sinin bulundugu bir amino asit sekansini kodlayan bir nükleik asidin yer aldigi bir birinci vektör ve antikorun VH°sinin bulundugu bir amino asit sekansini kodlayan bir nükleik asidin yer aldigi bir ikinci vektör. Bulusun bir yapisinda, konakçi hücre ökaryotiktir, örnegin bir Çin Hamsteri Yumurtalik (CHO) hücresi veya lenfoid hücredir (örnegin YO, NSO, Sp20 hücresi).Bulusun bir yapisinda, yukarida tanimlandigi gibi antikoru kodlayaii bir nükleik asidin yer aldigi bir konakçi hücrenin antikor ekspresyonu içiii uygun kosullar altinda kültürlenmesine ve istege bagli olarak söz konusu antikorun konakçi hücreden (veya konakçi hücre kültür vasatindan) geri kazanilmasina dayanan, bir antikor varyanti yapmaya yönelik bir yöntem sunulmaktadir. Bir antikor varyantinin rekombinan üretiminde, bir antikoru, örnegin burada tanimlandigi gibi olan bir antikoru kodlayan bir nükleik asit izole edilir ve bir koiiakçi hücrede yürütülecek olan ilave klonlama ve/Veya ekspresyon prosedürleri için bir veya daha fazla sayida vektöre sokulur. Bu gibi bir nükleik asit, geleneksel prosedürler kullanilarak (örnegin antikorun agir ve hafif ziiicirlerini kodlayan genlere spesifik baglanma kabiliyetine sahip oligonükleotid problari kullanilarak) kolayca izole edilip sekanslanabilir. Antikoru kodlayan vektörlerin klonlaninasi veya ekspresyonu için uygun konakçi hücreler arasinda, burada tanimlanan prokaryotik veya ökaryotik hücreler sayilabilir. Ozellikle glikozilasyonun ve Fc efekt'or fonksiyonunun gerekmedigi durumlarda olmak üzere, antikorlar antikor fraginanlarinin ekspresyonu hakkinda bilgi alinak için 'Örnegin antikor fragmanlarinin E. coli hücrelerinde ekspresyonunun anlatildigi eksprese edildikten sonra bakteriyel hücre inacunundan bir çözünür fraksiyon forinunda izole edilebilir ve akabinde daha da saflastirilabilir. Prokaryotlarin yani sira, filament'oz inantar veya maya gibi 'okaryotik mikroplar da antikor kodlayan vektörler için uygun klonlama veya ekspresyon konakçilarini teskil ederler ve bunlar arasinda, glikozilasyon yolaklari "hümanize" edilmis ve böylelikle kismen veya tainamen insan kaynakli bir glikozilasyon patemine sahip bir antikor üretmesi mümkün hale getirilmis olan mantar ve maya suslari da Glikozile antikoru eksprese etmek için uygun konakçi hücreler, multiselüler organizmalardan da (omurgasizlar ve oinurgalilar) elde edilebilirler. Omurgasiz hücrelerine verilebilecek örnekler arasinda, bitki ve böcek hücreleri bulunur. Ozellikle Spodoptera frugiperda hücrelerinin transfeksiyonu için olmak üzere, böcek hücreleriyle baglantili kullanilabilecek birçok bakuloviral sus tanimlanmistir. Bitki hücre kültürleri de konakçi görevi görebilirler. Örnegin bkz: (transgenik bitkilerde antikor üretimine yönelik PLANTIBODIESTM ve 6.417.429 sayili ABD patentleri. Omurgali hücreleri de konakçi görevi görebilirler. Örnegin, süspansiyon içerisinde çogalmaya adapte edilmis memeli hücre hatlari kullanilabilir.Kullanima uygun memeli konakçi hücre hatlarina verilebilecek diger örnekler arasinda, SV4O ile transforine edilmis maymun böbrek CV] hatti (CCS-7); insan embriyonik böbrek hatti (örnegin, ; fare sertoli hücreleri gibi olan TM4 hücreleri); maymun böbrek hücreleri (CV1); Afrika yesil maymunu böbrek hücreleri (VERO-76); insan servikal karsinom hücreleri (HELA), köpek böbrek hücreleri (MDCK); buffalo siçani karaciger hücreleri (BRL 3A); insan akciger hücreleri (W138); insan karaciger hücreleri (Hep (32); fare meme tümörü (MMT 060562), eserinde tanimlandigi gibi olan TRI hücreleri; MRC 5 hücreleri ve FS4 hücreleri sayilabilir.Ku1lanilabilecek diger memeli konakçi hücre hatlari arasinda, DHFR' CHO hücreleri de dahil olmak üzere Çin hamsteri yumurtalik (CHO) hücreleri (Urlaub, et al., Proc. Natl. hücre hatlari bulunur. Antikor üretimi için uygun belirli memeli konakçi hücre hatlari hakkinda bir derleme için örnegin bkz: Yazaki, L0, ed., Humana Press, Totowa, NJ). Eseyler Burada sunulan antikorlar, sektörde bilinen çesitli eseyler kullanilarak sahip olduklari fiziksel / kimyasal özellikler ve/Veya biyolojik aktiviteler bakiinindan tanimlanabilir, taranabilir ya da karakterize edilebilirler. Baglanma eseyleri ve baska eseyler Bulusun bir özelliginde, bulus konusu bir antikor, örnegin ELlSA,Western blot ve benzeri gibi bilinen yöntemlerle sahip oldugu anti jen baglama aktivitesi bakimindan test edilir. Ornek niteligindeki bir kompetisyon eseyinde, immobilize anti jen, bu anti jene baglanan bir birinci etiketli antikorun (örnegin,) ve bu anti jene baglanma konusunda birinci antikorla rekabet etme kabiliyeti bakimindan test edilmek üzere kullanilan bir ikinci etiketsiz antikorun bulundugu bir çözeltide inkübe edilir.Ikinci antikor, bir hibridom süpernatani içerisinde bulunabilir. Kontrol uygulamasi olarak, irnmobilize antijen, birinci etiketli antikorun yer aldigi fakat ikinci etiketsiz antikorun bulunmadigi bir çözeltide inkübe edilir. Birinci antikorun anti jene baglaninasina müsaade eden kosullar altinda gerçeklestirilen inkübasyondan sonra, baglanmamis antikor fazlasi çikartilir ve immobilize antijenle baglantili etiket miktari ölçülür.Imm0bilize antijenle baglantili etiket miktarinin kontrol nuinunesine kiyasla test numunesinde büyük ölçüde daha düsük olmasi, ikinci antikorun antjene baglanma konusunda birinci antikorla rekabet edebildigini gösterir. (Bakiniz: Harlow, and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.l4 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Immünokonjugatlar Bu bulus, bir veya daha fazla sayida sitotoksik ajana, 'Örnegin bir veya daha fazla sayida kemoterapötik ajan veya ilaç, çogalma veya büyüme inhibe edici ajan, toksin (Örnegin protein toksinleri, enzimatik açidan aktif bakteriyel, fungal, bitkisel veya hayvansal toksinler ya da bunlarin fragmanlari) ya da radyoaktif izotopa konjuge haldeki bir antikordan olusan immünokonjugatlar da ortaya koymaktadir. Bulusun bir yapisinda, bir immünokonjugat, bir antikorun sadece bunlarla sinirli kalmaksizin bir maytansinoid (bakiniz ABD Patent No. auristatin, örnegin moiiometilauristatin ilaç moiyeteleri DE ve DF ve 7.498.298); bir dolastatiri; bir kalikeamisin ya da onun türevi (bakiniz ABD Patent No. örnegin daunoniisin ya da doksorubisin (bakiniz: Kratz, et al., Current Patent No. 6.630.579); metotreksat; Vindesin; bir taksan, örnegin dosetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel ve ortataksel; bir trikotesen ve CC1065 de dahil bir veya daha fazla ilaca konjuge edildigi bir antikor-ilaç kon jugatidir (ADC). Bulusun baska bir yapisinda, bir immünokonjugat,sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, difteri A zinciri, difteri toksininiii baglanmayan aktif fragmanlari, eksotoksin A zinciri (Pseudomonas aerugiiiosa kaynakli), risin A ziiiciri, abrin A zinciri, modeccin A zinciri, alfa- sarcin, Aleurites fordii proteinleri, diantin proteinleri, Phytolaca americaiia proteinleri (PAPI, PAPII ve PAP-S), kudret nari inhibitörü, kursin, krotin, sabunotu inhibitörü, gelonin, niitogellin, restriktosin, feiioinisin, enoinisin ve trikotesenler dahil olinak üzere, enziinatik açidan aktif bir toksini ve fragmanina kon juge halde burada tarif edildigi gibi olan bir aiitikoru içerir. Bulusun baska bir yapisinda, bir immüiiokonjugat,bir radyokonjugat olusturmak amaciyla bir radyoaktif atoma kon juge edilen ve burada tarif edildigi gibi olan bir antikor içerir. Radyokonjugatlar üretimi için kullanilabilecek çesitli farkli radyoaktif izotoplar mevcuttur. Örnekler Lu'nun radyoaktif izotoplari bulunur. Belirleme için radyokonjugat kullanilacagi durumlarda, radyokonjugatta sintigrafi çalismalari için 99"] veya 1123 gibi bir radyoaktif atom ya da nükleer manyetik rezonans (NMR) görüntüleme (manyetik rezonans görüntüleme, MR olarak da bilinir) için yine iyot-123, iyot-131, indiyum-l l 1, flor-19, karbon-13, nitro jen-l 5, oksijen-17, gadolinyum, manganez veya demir gibi bir spin etiket de bulunabilir. Bir antikorun ve bir sitotoksik ajanin konjugatlari, , N-süksinimidil-3- (2- piridilditiyo) propionat (SPDP), süksinimidi1-4-(N- maleiinidometil) sikloheksan-l-karboksilat (SMCC), iminotiyolan (IT), bifonksiyonel iinidoester türevleri (dimetil adipimidat HCl gibi), aktif esterler (disüksinimidil suberat gibi), aldehitler (glutaraldehit gibi), bis-azido bilesikleri (bis (p-azidobenzoil) heksandiamin gibi), bis-diazonyum türevleri (bis-(p-diazonyuinbenzoil)-etilendiamin gibi), diizosiyanatlar (tolüen 2,6-diizosiyanat gibi) ve bis-aktif flor bilesikleri (1,5-difloro-2,4-dinitrobenzen gibi) gibi çesitli farkli bifonksiyonel protein kuplajlama ajanlari kullanilarak yapilabilirlerDrnegin, bir risin immünotoksini, "Vitetta, et al., hazirlanabilirKarbon-14-etiketli 1 -izotiyosiyanatobenzil-3- metildietilen triaminpentaasetik asit (MX-DTPA), radyonükleotidin antikora konjugasyonu için kullanilabilecek 'Örnek niteligindeki bir selatlama ajanidir (bkz: WO94/11026). Baglayici, hücrede bir sitotoksik ilacin serbest kalmasini kolaylastiran bir "klevajlanabilir baglayici" olabilir. Örnegin, bir asit-labil baglayici, peptidaz-hassas baglayici, fotolabil baglayici, dimetil baglayicisi veya disülfur-içeren sayili ABD Patenti) kullanilabilir. Bu patent basvurusunda sunulan immünokonjugatlar ya da ADC71er, sadece buiilarla sinirli kalmaksizin, (örnegin, Pierce Biotechnology, edilebilecek)BMPS, EMCS, GMBs, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sülfo-EMCS, sülfo-GMBS, sülfo-KMUS, sülfo-MBS, sülfo-SIAB, sülfo-SMCC ve sülfo-SMPB ve SVSB de (süksinimidil-(4-Vinilsülfoii)benzoat) dahil çapraz baglayici reaktiflerle hazirlaiian konjugatlari açikça kapsamaktadir. Tani ve Belirleme Için Yöntemler ve Bilesimler Bu bulusun belirli yapilarinda, burada sunulan antikor varyantlarinin herhangi birisi, bir biyolojik numunede antijenin 0 aiitikora baglanip baglanmadigini belirlemek ainaciyla kullanima uygundur. Burada geçen "belirleme" terimi, hem kantitatif hem de kalitatif belirlenieyi içine alan bir anlam tasir. Bulusun belirli yapilarinda, bir biyolojik numune bir hücre ya da dokuyu kapsar. Bulusun bir yapisinda, bir tani veya belirleme yönteminde kullanima yönelik bir antikor varyanti ortaya konmaktadir. Bulusun bir diger özelliginde, bir biyolojik nuinunede bahsi geçen antikor varyantinin baglandigi antijenin varligini belirlemeye yönelik bir yöntem sunulmaktadir. Bulusun belirli yapilarinda, bahsi geçen yöntem, antikorun anti jene baglanmasina izin veren kosullar altinda biyolojik numunenin burada tarif edildigi gibi olan bir antikorla temas ettirilmesi ve antikor ile antijen arasinda bir kompleks olusup olusmadiginin belirlenmesi basamaklarini kapsar. Bu yöntem in vivo veya in vitro bir yöntem olabilir. Bulusun bir yapisinda, bir antikor varyanti, bir antikorla tedaviye uygun denekleri belirleyip seçmek için kullanilir ve böyle bir uygulamada örnegin bahsi geçen antikorun baglandigi anti jen, hasta seçiminde bir biyomarker olarak esas alinir. Bu bulusa konu olan bir antikor kullanilarak tani konulabilecek hastalik 'Örnekleri arasinda kanser, kardiyovasküler hastaliklar, nöronal bozukluklar ve diyabet sayilabilir. Bulusun belirli yapilarinda, etiketli antikor varyantlari sunulmaktadir. Etiketler arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, dogrudan teSpit edilip belirlenen etiketler veya inoiyeteler (örnegin floresan, kromoforik, elektron-yogun, kemilüminesan ve radyoaktif etiketler) ve dolayli yollarla, örnegin bir enzimatik reaksiyon veya moleküler etkilesim araciligiyla tespit edilip belirlenen moiyeteler, 'örnegin enzimler ve ligandlar gibi moiyeteler bulunurDrnek niteligindeki etiketler arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, radyoizotoplar 32P, "C, '251, 3H ve '311, floroforlar, örnegin nadir toprak selatlari veya floresein ve onun türevleri, rodamiii ve onun türevleri, dansil, umbelliferon, lüsiferazlar, `Örnegin atesböcegi lüsiferazi ve bakteriyel lüsiferaz (, lüsiferin, 2,3- dihidroftalazindionlar, bayirturpu peroksidaz (HRP), alkalin fosfataz, ß-galaktosidaz, glukoainilaz, lizozim, sakkarit oksidazlar, örnegin glukoz oksidaz, galaktoz oksidaz ve glukoz-6-f0sfat dehidrogenaz; HRP, laktoperoksidaz veya mikroperoksidaz gibi bir boya prekürsorunu oksidize etmek için hidrojen peroksitten istifade eden bir enziinle kuplajli ürikaz ve ksantin oksidaz gibi heterosiklik oksidazlar; biyotin/avidin, spin etiketler, bakteriyofaj etiketleri, stabil serbest radikaller ve benzerleri sayilabilir. Farmasötik Formülasyonlar Burada taniinlandigi gibi olan bir antikor varyantinin yer aldigi farmasötik formülasyonlar, istenen saflik derecesine sahip olan bu gibi bir antikorun istege bagli olarak kullanilan bir veya daha fazla sayida farmasötik açidan kabul edilebilir tasiyiciyla (Remington's Pharinaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) karistirilmasi yoluyla liyofilize forinülasyonlar veya aköz çözeltiler formunda hazirlanirlar. Farmasötik açidan kabul edilebilirtasiyicilar, uygulandiklari dozajlarda ve konsantrasyonlarda alicilar için genelde toksik olinayan inaddelerdir ve bu tarz tasiyicilar arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, asagida sayilanlar vardir: tamponlar, de dahil antioksidanlar; koruyucular (örnegin, oktadesildimetilbenzil ainonyum klorür; heksametonyum klorür; benzalkonyum klorür; benzetonyum klorür; fenol, bütil veya benzil alkol; metil veya propil paraben gibi alkil parabenler; katekol; rezorkinol; sikloheksanol; 3- pentanol ve m-kresol gibi); düsük moleküler agirlikli (yaklasik 10 artiktan daha az) polipeptidler; serum albümini, jelatin veya immünoglobulin gibi proteinler; polivinilpirolidon gibi hidrofilik polimerler; glisin, glutamin, asparajin, histidin, arjinin veya lizin gibi amino asitler; glukoz, mannoz veya dekstrinler de dahil monosakkaritler, disakkaritler ve diger karbonhidratlar; EDTA gibi selatlama ajanlari; sukroz, mannitol, trehaloz veya sorbitol gibi sekerler; sodyum gibi tuz-Olusturucu karsit-iyonlar; metal kompleksleri (ömegin Zn-protein kompleksleri) ve/veya polietilen glikol (PEG) gibi iyonik olmayan yüzey aktif maddelerBu bulus kapsaminda kullanima uygun farmasötik açidan kabul edilebilir tasiyicilara verilebilecek örnekler arasinda, ayrica, çözünür nötr-aktif hiyalüronidaz glikoproteinleri (SHASEGP) gibi interstisyel ilaç dispersiyon ajanlari, örnegin rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter glikoproteinleri de bulunur. RhuPH20'nin de aralarinda bulundugu belirli SHASEGP örnekleri ve bunlari kullanma yöntemleri, anlatilmakta ve açiklanmaktadir. Bulusun özelliklerinden birinde, bir sHASEGP, kondroitinazlar gibi bir veya daha fazla sayida ek glikosaminoglikanazla kombine edilir. 6.267.958 sayili ABD pateiitinde liyofilize antikor formülasyonu örnekleri anlatilmakta ve açiklanmaktadir. Aköz antikorformülasyonlari arasinda, 6.171.586 sayili ABD Patenti ile WO bulunur; bahsi geçen ikinci yayina konu olan formülasyonlar arasinda bir histidin-asetat tamponu da yer alir. Burada açiklanan formülasyon, tedavi edilmesi hedeflenen endikasyon için gerekmesi halinde birden fazla sayida etkin bilesen de içerebilir ve böyle bir durumda, katilan birden fazla sayidaki etkin bilesenin birbirlerini advers yönde etkilemeyen ve tamainlayici aktivitelere sahip olan bilesenler olmalari tercih edilir. Bu etkin bilesenlerin ilgili amaç dogrultusunda etkin ve etkili olan miktarlarda kombinasyon halinde mevcut olmasi uygundur. Etkin bilesenler, 'Örnegin koaservasyon teknikleriyle ya da arayüzey polimerizasyonuyla hazirlanan mikrokapsüllerin, 'Örnegin sirasiyla hidroksimetilselüloz ya da jelatin-mikrokapsüller ve poli- (metilmetakrilat) mikrokapsüllerin içinde, koloidal ilaç tasima sistemlerinin (Örnegin lipozomlar, albümin mikrosferler, mikroemülsiyonlar, nano-partiküller ve nanokapsüller) içinde ya da makroemülsiyonlarin içinde hapsedilmis halde de sunulabilirler. Bu teknikler, "Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)" eserinde açiklanmaktadir. Sürekli-salimli preparatlar hazirlanabilir. Sürekli-salimli preparatlara verilebilecek uygun örneklerden biri, antikoru içeren kati hidrofobik polimerlerden olusan yari-geçirgen matrislerdir; bu matrisler, sekillendirilmis maddeler formunda, örnegin, filmler ya da mikrokapsüller formunda kullanilirlar. In vivo uygulama için kullanilacak formülasyonlar genelde steril hazirlanirlar. Sterilite, örnegin steril filtrasyon membranlarindan filtrasyon yoluyla kolayca saglanabilir. Terap'ötik Yöntemler ve Bilesimler Burada sunulan polipeptidlerin herhangi birisi, terapötik yönteinlerde kullanilabilir. Bulusun bir spesifik özelliginde, bu bulusa uygun polipeptid, bir hastaligi tedavi etmek için kullanilir. Bulusun daha spesifik bir özelliginde, hastalik, varyantin efektör fonksiyonunun yabani tip FC polipeptidi kapsayan polipeptide kiyasla kuvvetli biçimde - en az %50 oraninda - azaltilmasinin istendigi hastaliktir. Bu bulusun spesifik bir özelliginde, bulusa uygun polipeptid, polipeptidin efektör fonksiyonunun bir yabani tip FC polipeptidine kiyasla kuvvetli biçimde azaltilmasinin istendigi bir hastaligin tedavisi için bir ilaç üretim prosesinde kullanilir. Bu bulusun ilave spesifik bir özelliginde, bulusa uygun polipeptid,p01ipeptidin efektör fonksiyonunun bir yabani tip FC polipeptidine kiyasla en az %20 oraninda azaltilmasinin istendigi bir hastaligin tedavisi için bir ilaç Bu patent basvurusunda, ayni zamanda, varyaiitin efektör fonksiyonunun bir yabani tip FC polipeptidine kiyasla kuvvetli biçimde azaltilmasinin istendigi bir hastaligi bulunan bir kisiyi tedavi etme amacina yönelik olan ve bu kisiye, bu bulusa uygun polipeptidin etkin ve etkili bir miktarini uygulama basamagini kapsayan bir yöntein de açiklanmaktadir. Efektör fonksiyonda kuvvetli bir düsüs, efektör fonksiyonun, yabani tippolipeptidin indükledigi efektör fonksiyonun en az %50'si oraninda düsinesidir. Bu hastaliklar, örnegin, hedeflenen hücrenin Örnegin ADCC, ADCP veya CDC tarafindan harap edilmeinesinin gerektigi tüin hastaliklari kapsar. Ek olarak, bu, hedef hücreye bir ilaç (örnegin, toksinler ve izotoplar) tasimak için tasarlanan antikorlar için de geçerlidir; burada, Fc/FcyR aracili efektör fonksiyonlar, saglikli iminün hücreleri ölümcül yükün yakinina getirir ve böylece, hedef hücreler boyunca normal lenfoid dokunun deplesyonuna yol açar (Hutchins, et al, PNAS 125-145). Bu durumlarda, tamamlayici veya efektör hücreleri zayif bir sekilde alan antikorlarin kullanilmasi muazzam bir yarar saglayacaktir(bakiniz ömegin: Wu, et al., Cell lmmunol 200 (2000) Baska durumlarda, örnegin genis biçimde eksprese edilen bir reseptörün kognat ligandiyla etkilesiminin bloke edilmesinin hedeflendigi durumlarda, istenmeyen toksisiteyi azaltmak ainaciyla antibody efektör fonksiyonunun tamaminin azaltilmasi ya da elimine edilmesi avantajli olacaktir. Ayni zamanda,bir terapötik antikorun bir dizi insan dokusunda rastgele baglanma sergiledigi durumda, efektör fonksiyonunun toksisiteyi sinirlainak için farkli bir doku grubuna hedeflenmesini sinirlainak makul olacaktir. Agonist antikorlar için de, bu antikorlarin azalmis efektör fonksiyon göstermesi çok yararli olacaktir. Polipeptid varyantiyla tedavi edilebilecek birçok durum vardir ve bunlar arasinda kanser (örnegin antikor varyantinin HERZ reseptörünü, anjiopoietin reseptörünüya da vasküler endotelyal büyüme faktörünü (VEGF) bagladigi durum); astim gibi alerjik durumlar (bir anti-IgE antikoruyla) ve LFA-l-aracili bozukluklar (örnegin,p01ipeptid varyantininbirt anti-LFA-l veya anti-ICAM-l antikoru oldugu durum), nörolojik ve metabolik bozukluklar sayilabilir. Antikorun HER2 reseptörünü bagladigi durumda, bozukluk tercihen HERZ reseptörünün asiri ekspresyonuyla karakterize edilenbir benign veya malign tümör gibi HERZ-eksprese eden kanserdir. Bu kanserler arasinda, sadece bunlarla sinirli kalmaksizin, meme kanseri, skuamöz hücreli kanser, küçük hücreli akciger kanseri, küçük hücreli olmayan akciger kanseri, gastrointestinal kanser, pankreaskanseri, glioblastom, servikal kanser, yumurtalik kanseri, mesane kanseri, hepatom, kolon kanseri, kolorektal kanser, endometrial karsinom, tükürük bezi karsinomu, böbrek kanseri, karaciger kanseri, prostat kanseri, vulval kanser, tiroid kanseri, hepatikkarsinom ve baska ve boyun kanserinin çesitli tipleri vardir. Polipeptidveya antikor varyanti, aralarinda parenteral, subkutan, intraperitoneal, intrapulmoner ve intranazal uygulama yollarinin ve lokal immünosupresif tedavi tercih ediliyorsa, intralezyonal uygulama yolunun da bulundugu uygun uygulama yollarindan herhangi biriyle uygulanirlar. Parenteral infüzyon seçenekleri arasinda intramüsküler, intravenöz, intraarteriyel, intraperitoneal ya da subkutan uygulama formlari bulunur. Bunlarin yani sira, antikor varyantinin puls intüzyon yoluyla, özellikle de polipeptid varyantinin azalan dozlariyla uygulanmasi da uygundur. Dozlama, tercihen, yapilacak uygulamanin kisa süreli bir uygulama mi yoksa kronik bir uygulama mi olacagina kismen bagli olarak, enjeksiyon yoluyla, en çok tercihen intravenöz veya subkutan enjeksiyon yoluyla yapilir. Hastaligin önlenmesi ya da tedavisiiçin, polipeptidveya antikor varyantinin uygun dozaji, tedavi edilecek hastaligin tipine, hastaligin siddetine ve seyrine, polipeptid varyantinin önleyici amaçlarla mi, yoksa terapötik amaçlarla ini uygulandigina, `Önceden uygulanan tedaviye, hastanin klinik hikayesine ve polipeptid varyantina cevaba ve tedaviyi yapan doktorun kararina bagli olacaktir. Polipeptid varyanti, hastaya bir defada ya da bir dizi tedavi boyunca uygun sekilde uygulanir. Hastaligin tipine ve siddetine bagli olarak, hastaya baslangiç aday uygulama dozaji olarak 'Örnegin bir veya daha fazla sayida ayri uygulama kapsaminda ya da kesintisiz infûzyon haliiide yaklasik 1 tig/kg ilâ 15 mg/kg (örnegin, 0,1-20 mg/kg) polipeptidveya antikor varyaiiti uygulanabilir. Tipik bir günlük dozaj, yukarida bahsi geçeii faktörlere bagli olarak yaklasik 1 ug/kg ile 100 mg/kg arasi bir degere veya daha yüksek bir degere tekabül edebilir. Birkaç günlük veya daha uzuii bir periyot içerisinde tekrarlanarak yapilan uygulamalarda, hastaligin ne olduguna bagli olarak, tedavi genelde hastalik semptomlarinda istenen baskilanma seviyesine ulasilana dek sürdürülürBununla birlikte baska dozlama rejimleri de kullanima uygundur. Bu tedavinin seyri geleneksel teknikler ve eseyler çerçevesinde kolayca izlenebilir. Belirli yapilarinda, bu bulus, kanser hastasi bir kisiyi tedavi etiiie amacina yönelik olan ve antikor varyantinin etkin ve etkili bir miktarini kisiye uygulama basamagini kapsayan bir yöntemde kullanmak için bir antikor varyanti veya polipeptid sunmaktadir. Böyle bir yapida, yöntem, ek olarak, örnegin yukarida açiklandigi gibi, en az bir ilave terapötik ajanin etkin ve etkili miktarinin kisiye uygulanmasini da kapsar. Ilave yapilarinda, bulus, bir kiside anjiogenezi inhibe etmek, hücre proliferasyonunu inhibe etmek ya da B hücrelerini tüketmek amaciyla antikor varyantinin etkin ve etkili bir miktarini kisiye uygulamak suretiyle o kiside anjiogenez inhibisyonu, hücre proliferasyonu inhibisyonu ya da B hücresi deplesyonunda kullanmak için bir antikor varyanti sunar; yukarida açiklanan bulus yapilarindan her birisine göre, bahsi geçen "kisi tercihen bir insandir. Ilave bir özelliginde, bu bulus, bir antikor varyantinin veya polipeptidin bir ilacin üretimi veya hazirlanisi kapsaminda kullanimini sunarBulusun yapilarindan birinde, bahsi geçen ilaç, kaiiserin veya inflamatuar hastaliklarin tedavisine yöneliktir. Bu bulusun baska bir yapisinda, ilaç, kanser, diyabet, nöronal bozukluklar ya da inflamatuar hastaliklarin tedavisi içiii olan ve kanser, diyabet, nöronal bozukluklar ya da inilamatuar hastaliklar bulunaii bir kisiye ilaçtan etkili bir miktarda uygulanmasina dayanan bir yöntem kapsaminda kullanima yöneliktir. Bu gibi bulus yapilariiidan birinde, bahsi geçen yöntemde, kisiye ayrica en az bir adet ek terapötik ajaiidan, örnegin asagida belirtildigi gibi olan bir ajandaii da etkili bir miktarda uygulanirBu bulusun baska bir yapisinda, ilaç, anjiogenezi iiihibe etmeye, hücre proliferasyonunu inhibe etmeye ya da B hücrelerini tüketmeye yöneliktir. Bu bulusun baska bir yapisinda, ilaç,bir kiside anjiogenezi inhibe etme, hücre proliferasyonunu inhibe etme ya da B hücrelerini tüketme amacina yönelik olan ve anjiogenezi inhibe etmek, hücre proliferasyonunu inhibe etmek ya da B hücrelerini tüketmek ainaciyla ilacin etkin ve etkili bir miktarini o kisiye uygulama basamagini kapsayan bir yöntemde kullanmak içindir. Yukarida açiklanan bulus yapilarindan her birisine göre, bahsi geçen "kisi tercihen bir insan olabilir. Ilave bir Özelliginde, bu bulus, burada sunulan antikor varyantlarinin herhangi birisinde kullanma amacina yönelik olan farmasötik formülasyonlar sunar. Bu bulusun bir yapisinda, farinasötik forniülasyon, burada sunulan antikor varyantlarinin herhangi birisini ve farmasötik açidan kabul edilebilir bir tasiyici içerir. Bulusun baska bir yapisinda, bir farmasötik formülasyon, burada sunulan antikor varyantlarinin herhangi birisini ve 'Örnegin asagida tarif edildigi gibi en az bir ilave terapötik ajan içerir. Bu bulusa konu olan antikorlar, bir tedavide tek baslarina ya da baska ajanlarla kombinasyon halinde kullanilabilirler. Örnegin, bulusa konu olan bir antikor, en az bir adet ek terap'otik ajan ile birlikte uygulanabilir. Yukarida kaydedilen bu kombinasyon tedavileri, kombine uygulamayi (iki veya daha fazla terapötik ajanin ayni ya da ayri formülasyonlara dahil edildigi durumlarda) ve bu bulusa konu olan antikor uygulamasinin ilave terapötik ajan ve/veya adjuvan uygulamasindan önce, onunla eszamanli ve/veya ondan sonra yapilabilecegi ayri uygulamayi kapsar. Bu bulusa konu olan antikorlar, radyasyon tedavisiyle kombinasyon halinde de kullanilabilir. Bu bulusa konu olan bir antikor (ve ilave herhangi bir terapötik ajan), parenteral, intrapulinoner ve intranazal ve lokal tedavi hedefleniyorsa, intralezyonel uygulama dahil olmak üzere uygun herhangi bir yolla uygulanabilir. Parenteral infuzyonlar arasinda intramüsküler, intravenöz, intraarteriyel, intraperitoneal veya subkutan uygulama sayilabilir. Dozlama, yapilacak uygulamanin kisa süreli bir uygulama mi yoksa kronik bir uygulama mi olacagina bagli olarak, ömegin intravenöz veya subkutan enjeksiyon gibi enjeksiyon yollarindan uygun herhangi biriyle yapilabilir. Bu dokümanda, bunlarla sinirli kalmaksizin tekli uygulama, çesitli farkli zaman noktalarinda çoklu uygulama, bolus uygulama ve puls infuzyon da dahil çesitli farkli dozlaina programlari tasarlanmaktadir. Bu bulusa konu olan antikorlar, iyi tibbi uygulamalara uygun bir tarzda formüle edilecek, dozlaiiacak ve uygulanacaktir. Bu baglamda dikkate alininasi gereken faktörler arasinda tedavi edilen belirli hastalik, tedavi edilen belirli memeli, münferit hastanin klinik durumu ve tablosu, hastaligin sebebi, ajanin uygulama yeri, uygulama yöntemi, tedavi uygulama programi ve tip profesyonellerinin bildigi diger faktörler sayilabilir. Antikor söz konusu hastaligi önlemek veya tedavi etmek için hali hazirda kullanilmakta olan bir veya birden çok ajanla birlikte istege bagli olarak formüle edilir, fakat bu zorunlu degildir. Bu gibi diger ajanlarin etkili miktarlari, formülasyonun içerdigi antikorunmiktarma, bozuklugun veya tedavinin tipine ve yukarida bahsedilen diger faktörlere baglidirBu ajanlar, genellikle, burada tarif edilenlerle ayni dozajlarla ve uygulama yollariyla veya burada açiklanan dozajlarin yaklasik % 1 ilâ % 99°una tekabül eden dozajlarda ya da ampirik/klinik olarak uygun oldugu tayin edilen herhangi bir dozajda kullanilirlar. Hastaligin önlenmesi ya da tedavisi için, bu bulusa konu olan bir antikorun uygun dozaji (tek basina ya da bir veya daha fazla ilave baska terapötik ajanla kombinasyon halinde kullanildiginda), tedavi edilecek hastaligin tipine, antikorun tipine, hastaligin siddetine ve seyrine, antikorun önleyici amaçlarla mi, yoksa terapötik amaçlarla m1 uygulandiginda, 'Önceden uygulanan tedaviye, hastanin klinik hikayesine ve antikora cevaba ve tedaviyi yapaii doktorun kararina bagli olacaktir.Antikorun hastaya bir defada ya da bir dizi tedavi boyunca uygulanmasi uygundurHastaligin tipine ve siddetine bagli olarak, yaklasik 1 tig/kg ila 15 mg/kg (örnegin 0,1 mg/kg - 10 mg/kg) antikor, örneginbir veya daha fazlasayida ayri uygulama yoluyla ya da kesintisiz infuzyon yoluyla hastaya uygulamak için ilk aday dozaj olabilir. Bir tipik günlük dozaj rejimi, yukarida atif yapilan faktörlere bagli olarak yaklasik 1 ug/kg ile 100 mg/kg araliginda ya da daha fazla olabilir. Birkaç gün ya da daha uzun süre boyunca yinelenen uygulamalar için, duruma bagli olarak, tedavi genellikle hastalik semptomlarinda istenen supresyon meydana gelene kadar sürdürülür. Antikorun bir örnek dozaji yaklasik 0,05 mg/kg ile yaklasik 10 mg/kg araligindadir. Sonuçta, yaklasik 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ya da 10 mg/kg (ya da bunlariii herhangi bir kombinasyonu) seviyesinde bir veya daha fazla doz hastaya uygulanabilir. Bu dozlar, aralikli olarak, örnegin her hafta ya da üç haftada bir (örnegin, hasta yaklasik iki ilâ yaklasik yirmi ya da örnegin yaklasik alti adet antikor dozu alacak sekilde) uygulanabilir. Baslangiçta yüksek doz uygulanip, daha sonra bir veya daha fazla sayida daha düsük doz uygulanabilir. Bununla birlikte, baska dozaj re jimleri de kullanilabilir. Bu tedavinin seyri, geleneksel teknikler ve eseylerle kolay izlenir. Yukaridaki formülasyonlarin ya da terapötik yöntemlerin herhangi birisinin bu bulusa uygun bir antikor yerine ya da buna ek olarak bu bulusa uygun bir immünokonjugat kullanilarak gerçeklestirilebilecegi anlasilmaktadir. Uretim Malzemeleri Bu bulusun baska bir özelliginde, yukarida tarif edilen bozukluklarin tedavisi, önlenmesi ve/veya tanisi için kullanilabilecek malzemeler içeren bir üretim malzemesi burada sunulmaktadir. Uretim malzemesi, bir kap ve bu kap üzerinde ya da onunla baglantili bulunan bir etiket veya bir ambalaj prospektüsü içerir. Uygun kaplar arasinda örnegin siseler, flakonlar, siringalar, IV çözelti torbalari ve benzerleri vardir. Kaplar cam veya plastik gibi çesitli farkli malzemelerden olusturulabilir. Kap içerisinde, tek basina ya da hastaligin tedavisi, önlenmesi ve/veya tanisi için etkin ve etkili baska bir bilesimle kombinasyon halinde bir bilesim bulunur ve kabin bir steril giris portu bulunabilir (örnegin, kap, bir hipodermik enjeksiyon ignesiyle delinebilecek bir tipasi bulunan bir intravenöz çözelti torbasi ya da flakonu olabilir). Bilesiinde bulunan en az bir etkin madde, bu bulusa konu olan bir antikordur. Etikette veya prospektüste, bilesimin seçilecek belirli bir hastaligin tedavisi için kullanildigi belirtilir. Ek olarak, üretim malzemesinde, (a) bu bulusa konu olan bir antikor içeren bir bilesimin yer aldigi bir birinci kap ve (b) bir ilave sitotoksik veya baska tip terapötik ajan ihtiva eden bir bilesimin yer aldigi bir ikinci kap bulunabilir. Bulusun bu yapisinda konu edilen üretim malzemesinde, bilesimlerin belirli bir hastaligi tedavi etmek için kullanilabileceklerini gösteren bir ambalaj prospektüsü de yer alabilir. Alternatif ya da ek olarak, üretim malzemesi örnegin bakteriyostatik enjeksiyonluk su (BWFI), fosfat-tamponlu salin, Ringer çözeltisi ve dekstroz çözeltisi gibi farmasötik açidan kabul edilebilir bir tampon içeren bir ikinci (ya da üçüncü) kap da içerebilir. Ticari açidan ve kullanici açisindan bakildiginda, baska tamponlar, seyrelticiler, filtreler, igneler ve sirmgalar da dahil baska malzemeler içermesi de istenebilir. Yukaridaki üretim malzemelerinin herhangi birisinin bir antikor varyanti yerine ya da buna ek olarak bulus konusu bir immünokonjugati kapsayabilecegi anlasilmaktadir. Polipeptid Için Terapötik Olmayan Kullanimlar Bu bulusa konu olan antikor varyanti, bir afinite saflastirma ajani olarak kullanilabilir. Bu proseste, antikor varyanti, sektörde iyi bilinen yöntemler kullanilarak bir Sephadex reçineya da filter kagidi gibi bir kati faza immobilize edilir. Immobilize polipeptid varyanti, saflastirilacak antijeni içeren bir numuneyle temas ettirilir ve daha sonra, destek, immobilize antikor varyaiitina bagli satlastirilacak anti jen hariç, numunede bulunan malzemelerin hemen hemen hepsini çikaracak uygun bir çözücuyle yikama islemine tâbi tutulur. Son olarak, destek, antijenin polipeptid varyantindan salinmasini saglayacak, glisin tamponu pH 5,0 gibi uygun baska bir çözücüyle yikanir. Antikor varyanti, ömegin, spesifik hücreler, dokular ya da serumda ilgili antijenin ekspresyonunu belirlemek amaciyla diyagnostik eseylerde kullanmak için de uygun olabilir. Diyagnostik uygulamalar için, antikor varyanti, tipik olarak, belirlenebilir bir moiyeteyle etiketlenecektir. Genel olarak asagidaki kategorilerde gruplandirilabilen çok sayida etiket mevcuttur: varyanti, ömegin "Coligen, et al., Current Protocols in York, N.Y., Pubs. (1991)" referansinda tarif edilen teknikler kullanilarak radyoizotopla etiketlenebilir ve sintilasyon sayaci kullanilarak radyoaktivite ölçülebilir. (b) Nadir toprak selatlari (evropyum selatlari) veya floresein ve onun türevlerigibi floresan etiketler, rodamin ve onun türevleri, dansil, Lissamin, fikoeritrin ve Teksas Kirmizisi mevcuttur. Floresan etiketler, `Örnegin yukarida atif yapilan "Current Protocols in Immunology" referansinda açiklanan teknikler kullanilarakpolipeptid varyantina konjuge edilebilir. Floresans miktari, bir tlorimetre kullanilarak tayin edilebilir. (0) Çesitli enzim-sübstrat etiketleri mevcuttur ya da ABD Patent No.: 4.275.149, buiilarin bazilarina bir genel bakis sunar. Enzim, genelde, bir kromojenik sübstratm çesitli teknikler kullanilarak ölçülebilen kimyasal degisimini katalize eder. Örnegin, enzim, bir sübstratin spektrofotometrik olarak ölçülebilen renk degisimini katalize edebilir.Alternatif olarak, enzim, sübstratin floresansini veya keiniluininesansini degistirebilir.Floresanstaki degisimleri Ölçme teknikleri yukarida anlatilmaktadir. Kemilüminesan sübstrat, bir kimyasal reaksiyon yoluyla elektronik olarak uyarildiktan sonra, isik yayabilir (örnegin bir kemilüminometre kullanilarak ölçülebilir) ya da bir floresan akseptöre enerji verebilir. Enzimatik etiketlere verilebilecek Örnekler arasinda, l'usiferazlar (örnegin, atesböcegi lüsiferazi ve bakteriyel lüsiferaz; 4.737.456 sayili ABD Patenti), lüsiferin, 2,3-dihidroftalazindionlar, malat dehidrogenaz, üreaz, bayirturpu peroksidazi (HRPO) gibi peroksidaz, alkalin fosfataz, ß-galaktosidaz, glukoamilaz, lisozim, sakkarid oksidazlar (örnegin, glukoz oksidaz, galaktoz oksidaz ve glukoz-6-fosfat dehidrogenaz), heterosiklik Oksidazlar (ürikaz ve ksantin oksidaz gibi), laktoperoksidaz, mikroperoksidaz ve benzerleri sayilabilir,Enziinleri antikorlara konjige etmek için kullanilan teknikler hakkinda bilgi almak için, "O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme- Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), bakilabilir. Enzim-sübstrat kombinasyonlarina verilebilecek `Örnekler arasinda asagida sayilanlar bulunmaktadir: (i) Bir sübstrat olarak hidrojen peroksidaz ile birlikte bayirturbu peroksidazi (HRPO); burada, hidrojen peroksidaz, bir boya prekürsörünü (örnegin, ortofenilen diamin (OPD) veya oksidize eder; (ii) Kromojenik sübstrat olarak para-nitrofenil fosfat ile birlikte alkalin fosfataz (AP) ve (iii) Bir kroinojenik sübstrat (örnegin, p-nitrofenil-ß-D- galaktosidaz) veya florojenik sübstrat (örnegin, 4- metiluinbelliferil-ß-D-galaktosidaz) ile birlikte ß-D- galaktosidaz (ß-D-Gal). Sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlarin kullanabilecekleri baska sayisiz enzim-sübstrat kombinasyonu buluninaktadir. 4.275.149 ve 4.318.980 sayili ABD Patentlerinde bu kombinasyonlardan olusan bir derleme bulunabilir. Etiket bazen polipeptid varyantiyla dolayli olarak konjuge edilir. Sektörde bilgi ve beceri sahibi uzmanlar, bunu basarmalarina yarayacak çesitli farkli tekniklerden haberdardirlar. Örnegin, polipeptid varyanti, biyotinle konjuge edilebilir ve yukarida bahsedilen dört genis etiket kategorisinden herhangi birisi, avidinle konjuge edilebilir ya da tam tersi yönde bir uygulama yapilabilir. Bu dolayli yöntemde, biyotin, avidine selektif baglanir ve böylece etiket, polipeptid varyantiyla konjuge edilebilir. Alternatif olarak, etiketin polipeptid varyantiyla dolayli konjugasyonunu saglamak için, polipeptid varyanti, küçük bir haptenle (örnegin, digoksin) konjuge edilir ve yukarida bahsedilen farkli tip etiketlerden biri, bir anti-hapten polipeptid varyantiyla (örnegin, anti-digoksin antikoru)konjuge edilir. Sonuçta, etiketin polipeptid varyantiyladolayli konjugasyonu saglanabilir. Bu bulusun baska bir yapisinda, antikor varyantinin etiketlenmesine gerek yoktur ve 0 antikor varyantinin varligi, polipeptid varyantina baglanan bir etiketli antikor kullanilarak belirlenebilir. Bu bulusa konu olan aiitikor varyanti, kompetitif baglanma eseyleri, dogrudan ve dolayli sandviç eseyleri ve immünopresipitasyon eseyleri gibi herhangi bir bilinen esey yönteminde kullanilabilir (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (1987) pp. 147- Antikor varyanti, in VIVO diyagnostik eseylerde de kullanilabilir. Genellikle, polipeptid varyanti, antijen ya da onu eksprese eden hücreler iminunosintigrafi kullanilarak lokalize edilebilecek sekilde, etiketlenir. Yukarida açiklanan bulus, daha net anlasilmasi amaciyla örnekleme ve resmetme yoluyla biraz daha detayli tarif edilmis olmasina ragmen, tarifler ve örnekler, bulusun kapsamini sinirlayici olarak yorumlanmamalidir. Sekans listesinin tanimi SEKANS KOD NO.:1 Insan kappa hafif zinciri SEKANS KOD NO.:2 Insan lambda hafif zinciri SEKANS KOD NO.:3 Insan IgGl (Kafkasyali Allotipi) SEKANS KOD NO.:4 Insan IgGl (Afroamerikan Allotipi) SEKANS KOD NO.:5 Insan IgGl LALA-Mutant (Kafkasyali Allotipi) SEKANS KOD NO.:6 Insan IgG4 SEKANS KOD NO.:7 Bu bulusa göre varyantlarm olusturinasi için temel olusturabilen kappa hafif zinciri, lambda hafif zinciri, Insan IgG4 SPLE-Mutanti. Sekans Kod No.: 3-5'te, insan IgGl allotipleri sekansi, yani Kabat AB indeksine göre P329 bölgesi, pozisyon 212°de konumlanir; Sekans kod no.: 6 ve 7°de bahsi geçen P329 bölgesi, pozisyon 209°da bulunabilir. SEKANS KOD NO.:8 mAb 40A746.2.3Kappa hafif zinciri SEKANS KOD NO.:9 mAb 40A746.2.3°i'in yabani tip IgGl agir zinciri SEKANS KOD NO.: 14 mAb 40A746.2.3°ün IgGl LALA agir zinciri Örnekler Asagidaki yedi örnek, karsilastirmali açiklamayla birlikte, talep edilen bulusa konu olan yöntemler ve bilesimlerin ömekleridir.Yukarida verilen genel açiklama dikkate alindiginda, çesitli farkli baska yapilarin uygulanabilecegi anlasilmaktadir. Yukarida açiklanan bulus, daha net anlasilinasi amaciyla Örnekleme ve resmetme yoluyla biraz daha detayli tarif edilmis olmasina ragmen, tarifler ve örnekler, bulusun kapsamini sinirlayici olarak yorumlanmainalidir. Antikorlar Asagida açiklanan deneyler için, CD9 (bakiniz SEKANS KOD No.: dokümanda tarif edilen sekanslar) karsi antikorlar kullanildi. Burada açiklanan varyantlarin hepsi, Örnegin selektin, CD9, CD20 (GAlOl) ve CD20 (GAl01)-gliko-degistirilmis baglanma antikorunun (AB nomenklatûrüne göre numaralandirina) P329G, P329A, P329R SPLE, LALA, P329G/LALA, P329G/SPLE varyantlari, PCR bazli mutagenez kullanilarak olusturuldu.. IgG molekülleri, HEK-EBNA ya da HEK sisteminde eksprese edildi ve protein A ve boyut dislaina kromatografisi kullanilarak saflastirildi. Farkli Fcy reseptörlerinin imm'ûnoglobulinlere yönelik baglanma afinitelerinin tayini Farkli FcyR"lerin iinmünoglobulinlere yönelik baglanma afiniteleri, °C sicaklikta bir Biacore T100 cihazi (GE Healthcare) kullanilarak Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) teknigiyle ölçüldü. BIAcore® sistemi, molekül etkilesiinleri çalisinasi için iyi bilinen sistemdir. Ligand/analit baglannialarinin kesintisiz gerçek zamanli izlenmesine ve böylece, birlesme hizi sabitleri (ka), ayrisma hizi sabitleri (kd) ve denge sabitlerinin (KD) tayin edilmesine olanak saglar. Refraktif indekste degisiklikler, yüzey üzerinde immobilize ligandin çözelti halinde enjekte edilen analitle etkilesiminin sebep oldugu kütle degisiklerine isaret eder. Moleküller, yüzey üzerinde irnmobilize ligandlari baglarsa, kütle artar; ayrisma durumunda ise kütle azalir. l:l etkilesim için, bir baglayici molekülün yüzeye enjekte edilmesi veya bir yüzey üzerine immobilize edilmesi durumunda, sonuçlarda hiçbir fark görülmemelidirBu nedenle, ligandin ya da karsilik gelen analitin çözünürlügü ve mevcudiyetine bagli olarak farkli ayarlar kullanilmistir (sirasiyla ligand veya analit olarak F cy reseptörüyle). Bir polihistidin sekansini (pentaHis monokloiial antikoru, Qiagen Hilden, katalog no.: 34660) taniyan bir yakalama sisteminin Fcle 10000 rezonansbirimleri (RU), GE Healthcare firmasinin tedarik ettigi bir amin kuplajlama kiti ve pH 4,5 seviyesinde bir CMS çipi kullanilarak immobilize edildi. FcyRI, 5 ;il/dakika akis hizinda 60 saniye pulsla 5 tig/ml konsantrasyonda yakalandi. 0 ile 100 nM araliginda farkli konsantrasyonlarda antikorlar, 30 til/dakika akis hiziyla 298 K,da 120 saniye süreyle akis hücrelerinden geçirilerek birlesme fazi kaydedildi. Ayrisma fazi 240 saniyeye kadar süreyle izlendi ve numune çözeltisinden akan tainpona geçilerek tetiklendi. 30 ml/dakika akis hizinda bir glisin pH 2 çözeltisiyle 2 dakika süreyle yikama islemiyle yüzey yeniden olusturuldu. Deneylerin hepsi için, GE Healthcare firmasinin tedarik ettigi HBS-P+ tainponu seçildi (10 mM HEPES, pH 7,4, Yüzey Aktif Madde P20). Bulk refraktif indeks farklari, yakalanan FcyRI olmadan bir yüzeyden elde edilen cevap çikartilarak düzeltildi. Blank en jeksiyonlar da çikartildi (=çift referans). ka/kd olarak tayin edilen denge ayrisma sabiti (KD),BIAevaluation yazilim paketi kullanilarak birkaç farkli konsantrasyonla elde edilen sensogram egrilerinin analiz edilmesi suretiyle belirlenmistir. Verilerin uydurulmasinda uygun bir baglama modeli izlendi. Test edilen bir monoklonal antikorun FcyRIIA ve FcyRIIIAV158 10000 rezoiiansbirimi (RU) için, GE firmasinin tedarik ettigi bir amin kuplajlaina kiti kullanilarak CMS çipe (10 tig/ml konsnatrasyonda pH 4,5) immobilize edildi. FcyRIIA ve IIIA"nin 0 ile 12800 nM araliginda farkli konsantrasyonlari,5 ul/dakika akis hiziyla 298 K"da 120 saniye süreyle akis hücrelerinden geçirilerek birlesme fazi kaydedildi. Ayrisma fazi 240 saniyeye kadar süreyle izlendi ve numune çözeltisinden akan tampona geçilerek tetiklendi. 30 ml/dakika akis hizinda bir 3 mM NaOH/lM NaCl çözeltisiyle 0,5 dakika süreyle yikama islemiyle yüzey yeniden olusturuldu. Deneylerin hepsi için, GE Healthcare firmasinin tedarik ettigi HBS-P+ tamponu seçildi (10 mM HEPES, pH 7,4, Yüzey Aktif Madde 1320). Bulk refraktif indeks farklari, yakalanan antikor olmadan bir yüzeyden elde edilen cevap çikartilarak düzeltildi. Blank en jeksiyonlar da çikartildi (:çift referans). Denge ayrisma sabiti (KD),BIAevaluation yazilim paketi kullanilarak birkaç farkli konsantrasyonla elde edilen sensogram egrileriiiin analiz edilmesi suretiyle belirlenmistir. Verilerin uydurulmasinda, kararli durum uydurma teknigi kullanilarak uygun bir baglaina modeli izlendi. Bir polihistidin sekansini (pentaHis monoklonal antikoru, Qiagen Hilden, katalog no.: 34660) taniyan bir yakalaina sisteininin FcyRIIB 10000 rezonansbirimleri (RU), GE Healthcare firmasinin tedarik ettigi bir amin kuplajlama kiti ve pH 4,5 seviyesinde bir CMS çipi kullanilarak immobilize edildi. FcyRIIB, 5 ul/dakika akis hizinda 120 saniye pulsla 5 tig/ml konsantrasyonda yakalandi. Farkli antikorlar, süreyle akis hücrelerinden geçirilerek birlesine fazi kaydedildi. Ayrisma fazi 120 saniyeye kadar süreyle izlendi ve numune çözeltisinden akan tampona geçilerek tetiklendi. 30 ml/dakika akis hizinda bir glisiii pH 2,5 çözeltisiyle 0,5 dakika süreyle yikama isleiniyle yüzey yeniden olusturuldu. Deneylerin hepsi için, GE Healthcare firmasinin tedarik ettigi HBS-P+ tainponu seçildi (10 HM HEPES, pH 7,4, Yüzey Aktif Madde P20). Bulk refraktif indeks farklari, yakalanan FcyRIIB olmadan bir yüzeyden elde edilen cevap çikartilarak düzeltildi. Blank en jeksiyonlar da çikartildi (=çift referans). FcyRIIB°riinyabani tip IgGl°e yönelik intrinsik afinitesi çok düsük oldugundan dolayi,hiç afinite hesaplanmadi; daha ziyade, kalitatif baglanma degerlendirildi. Asagida verilen tablolar, FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB ve FcyRIIIAVl- 58°ebaglanmada Fc kismina bir mutasyon sokulmasinin etkilerini (A) ve yani sira, ADCC ((BLT) olmadan ve hedef hücrelerle (ADCC) ölçülür) üzerinde ve Clq baglanmasi üzerinde etkileri (B) özetlemektedir. Tablo 2A: FcyRI FcyRIIaR131 FcyRIIIAVlSS FcyRIIB WT IgGl nM) ++ (2 nM) + ( ++ Fcle FclelaRl3lFclellAV158 FcyRIIB ge IgGl için Tablo ZB: Mutant FcyRI FcyRII FcyRIII Clq Hedef Hedef hücreler hücrelerle olmadan ADCC Esey Biacore Biacore Biacore CDC Clq BLT ADCC P329G + -- -- -- -- -- -- LP329G/LALA -- wt aksine kuvvetli biçimde azalmis/inaktif, - wt aksine azalmis, + wt etkilesimiyle kiyaslanabilir, n.d. tayin edilmedi / sonuç yok Daha detayli ilave etmek gerekirse, asagidaki sonuçlar elde edilmistir: FcyRI reseptör'ûne yönelik afinite P329G, P329A, SPLE ve LALA mutasyonlari, bir P-selektin, CD20 ve CD9 antikorunun Fc polipeptidine sokuldu ve FcyRI"ya baglanma afinitesi, Biacore sisteiniyle ölçüldü.P329G inutasyonlu antikor Fcle"e hâlâ baglaiiirken (Sekil la ve lb), sirasiyla P329G / LALA ve P329G / SPLE üçlü mutasyonlarinin sokulmasi, hemen hemen hüç baglanmanin belirleiiemedigi antikorlara yol açti (Sekil lb). LALA veya SPLE mutasyonlari, reseptöre baglaninayi tek basina P329G°den daha fazla, fakat P329G"yle kombinasyondan daha az düsürdü (Sekil la ve lb). Sonuçta, P329Gsnin LALA ya da SPLE mutasyonlariyla kombinasyonu, P329G mutasyonuna ya da tek basina SPLE veya LALA ikili mutasyonlarina kiyasla çok daha etkilidir. CD20 IgGl yabani tip antikorunun kd degeri 4,6 nM7ydive ayni antikorun P329G mutanti için 5,7 nM'ydi; fakat üçlü mutant P329G/LALA için herhangi bir kd degeri tayin edilemedi, çünkü antikorun Fcle reseptörüne baglanmasi hemen hemen belirlenemez düzeydeydi. Bir CD9 ya da CD20 ya da P-selektin antikorunun kendisi test edildi ve baglanma afinitesi üzerinde küçük bir etkisinin oldugu tespit edildi. FcyRIIA reseptör'i'ine yönelik afinite Sirasiyla P329G, SPLE ve LALA mutasyonlari,CD9 antikorunun Fc polipeptidine sokulmustur ve FcleIA-R131 reseptörüne baglanma afinitesi, Biacore sistemiyle ölçüldü. Baglaiima seviyesi normalize edilir; 'Örnegin yaklanan mAb 100 RU°yu temsil eder. Bu nedenle, 1:l stoikiometri için en fazla yaklasik 20 RU beklenmektedir. Sekil lc, FC varyaiitina LALA, SPLE/P329G, P329G ve LALA/P329G mutasyonusokularak FclelA reseptörüne baglanmanm kuvvetli biçimde azaltildigini göstermektedir. Fcle reseptörüne baglanmanin aksine, tek basina P329G mutasyonunun sokulmasi, bahsi geçen reseptöre baglanmayi çok kuvvetli biçimde, P329G / LALA üçlü mutasyonuyla az ya da çok benzer bir düzeye kadar bloke edebilir (Sekil lc). FcyRIIB reseptörüne yönelik afinite Sirasiyla SPLE, LALA, SPLE/P329G ve LALA/P329G mutasyonlari,CD9 ve P-selektin antikorunun Fc polipeptidine sokulmus ve Biacore sistemiyle FcyRIIB reseptörüne baglanma afinitesi ölçülmüstür. Sekil Id, FcyRIIB reseptörüne baglanmanin LALA ve üçlü inutantlar P329G/LALA , P329G / SPLE°de kuvvetli biçimde düsürüldügünü göstermektedir. FclellA reseptör'i'ine yönelik afinite P329G,LALA, SPLE, P329G / LALA ve SPLE/ P329G mutasyonlari, CD9"un Fc polipeptidine sokulmus ve Biacore sistemiyle FeyRIIIA- V158 reseptörüne baglanma afinitesi ölçülmüstür. P329G niutasyonuve üçlü mutasyon P329G / LALA, FcyRIIIA reseptörüne baglanmayi en kuvvetli biçimde, yani hemen hemen belirlenemez seviyelere kadar düsürmüstür. Ayni zamanda, P329G/SPLE de, baglanma afinitesinde kuvvetli bir düsüse yol açmistir; sirasiyla mutasyonlar SPLE ve LALA, FcyRIIIA reseptörüne baglanma afinitesini yalnizca hafif düzeyde azalmistir (Sekil le). C lQ ELISA Fc varyantlari içeren farkli polipeptidlerin Clq"ya baglanma edildi. Her bir varyant, bir hidrofobik Maxisorp 96 kuyucuklu plakaya 10 tig/ml ile 0 tig/ml arasinda 8 konsantrasyonda kuplajlandi. Bu kuplajlama, Clq molekülüne yüksek afiniteli baglanina için bir önkosul olan antikor koinpleksleriiii simüle eder. Yikama isleiniiiden sonra, numuneler inkübe edilerek Clq baglanmasina olanak saglanir. Ilave yikama isleminin ardindan, bagli C lq moleküli'i,bir poliklonal tavsan anti-hClq antikoruyla belirlenir. Sonraki yikama basamagindan sonra, bir enzim etiketli anti-tavsan-Fcy spesifik antikoru ilave edilir. Immünolojik reaksiyon, enziinle bir renkli ürüne dönüstürülen bir sübstrat ilave edilerek görünür hale getirilir. Fotoinetrik olarak `ölçülen nihai absorbans, arastirilacak antikora bagli Clq iniktariyla orantilidir. Varyant-Clq etkilesiininin EC50 degerleri hesaplandi. Renklendirine reaksiyoiiundan elde edilen absorpsiyon birimleri, antikor konsantrasyonuna karsi grafik halinde çizildi. Yari maksiinum cevapta antikor konsantrasyonu, EC50 degerini belirler. Bu okuma, nuinune ve referans varyasyon katsayisiyla birlikte ayni plaka üzerinde ölçülen referans standartla bagil fark olarak rapor edilir. P-selektin ya da CD20 antikoruna sokulan P329G mutasyonu, SPLE inutasyonuiia benzer sekilde, Clq"ya baglanmayi kuvvetli biçimde azaltti (Sekil 2). Tablo 3, varyantlarin Clq reseptörüne baglanmasi için hesaplanan EC 50 degerlerini özetlemektedir. Clq, tamamlama aktivasyon proteinlerine aittir ve ineinbran saldiri koiiipleksinin olusmasina neden olan tamamlama klasik yolaginin aktivasyonunda temel bir rol oynar. Clq, ayrica, fagositozun artmasi, apoptotik hücrelerin temizlenmesi veya virüsün nötralizasyonu gibi baska immünolojik süreçlerde de rol oynar. Sonuçta, burada gösterilen mutantlarin örnegin P329G ve SPLE gibi Clq'ye baglanmayi azaltmasi beklenebilir; yani sira, yukarida bahsedilen tek mutasyonlari kapsayan üçlü mutasyonlarin dayukarida belirtilen Clq fonksiyonlarini kuvvetli bir sekilde azaltmasi çok muhtemeldir. Antikor ECSO degeri P-Selektin IgGlwt 1,8 GA101 IgGl wt 2,4 P-Selektin IgG1_P329G 2,7 P-Selektin IgG4 SPLE 3,0 GA101 IgGl P329G 5,5 GA101 lgG4 SPLE lO Hedef hücreler olmadan ADCC, BLT eseyi Test edilecek antikorlar (CDZO (GA101) ve CD9), 96 kuyucuklu düz tabanli uygun plakalarda 4°C sicaklikta gece boyunca PBS içinde kaplandi. Plaka PBSSyle yikandiktan sonra, geriye kalan baglanma yerleri, oda sicakliginda 1 saat süreyle bloke edildi. Bu arada, efektör hücreler (düsük ya da yüksek afiniteliinsan FcyRIII eksprese etmek için transfekte edilen NK-92 hücre hatti) hasat edildi ve bloklama tamponu atildiktan sonra, 200.000 canli hücre/kuyucuk,100 ul/kuyucuk AIM V vasati içinde kuyucuklara ekildi. 100 ul/kuyucuk saponin tamponu (PBS içinde % kullanilarak efektör hücreler tarafindan maksimum esteraz salimi tayin edildi. Hücreler, bir inkübatörde %5 C02 kosullarinda 37°C sicaklikta 3 saat süreyle inkübe edildi. 3 saat sonra, 20 ul/kuyucuk süpernatanlar, 180 ul/kuyucuk BLT sübstratiyla (0,1 M Tris-HCL, pH 8,0 içinde 0,2 mM BLT + karistirildi ve bir mikroplaka okuyucuda 405 nm"de plaka okunmadan önce 37°C sicaklikta 30 dakika süreyle inkübe edildi. Esteraz saliini yüzdesi, maksimum salim (saponinle tedavi edilmis hücreler) %1009e ayarlanarak ve stimüle edilmemis (ab kaplanmamis) hücrelerin salimi %021 ayarlanarak tayin edildi. Yabani tip CD20 antikor (GAlOl wt (1)), sitolitik aktivitenin kuvvetli biçimde indüklendigini gösterir. LALA varyanti, esteraz saliininda belirgin bir düsüs gösterir; P329G ve P329G / LALA varyanti, herhangi bit ADCC aktivitesi göstermez (Sekil 3a). Sekil 3b, pozisyon P329"da yalnizca G degisiminin degil, ayni zamanda P329"dan R329"a degisimin de (CD20 antikoru) sitosolik aktiviteyi belirgin düzeyde azalttigini göstermektedir. Sonuçta, arginin, glisine benzer sekilde, antikorda prolin sandviçinin fonksiyonuna zarar veriyor gözükmektedir. Burada P329G mutanti için gözlemlenen kuvvetli biçimde azaltilmis ADCC, çok büyük olasilikla, FcyRIIA ve FclellA reseptörüne baglanmanin kuvvetli biçimde azaltilmasindan kaynaklandi (bakiniz Sekil lc ve Sekil le). Hedef Hücrelerle ADCC Insan periferal kan monoiiükleer hücreleri (PBMC) efekt'or hücreler olarak kullanildilar ve aslinda imalatçiiiin talimatlari izlenerek ve Histopaque-' kullanilarak hazirlandilar. Kisacasi, heparinize siringalar kullanilarak gönüllülerden venözkan alindi. Bu kan, (Ca++ veya M g++ içermeyen) PBS ile 1:0.75-l.3 oraninda seyreltildi ve Histopaque-1077 üzerinde tabakalandirildi. Gradyan, oda sicakliginda (RT) ve 400 x g°de 30 dakika süreyle ara vermeden santrifüjlendi. PBMC içeren interfaz toplandi ve PES (iki gradyandan alinmis beher hücreler için 50 ml) ile yikandi ve ayrica, oda sicakliginda ve 300 X g"de 10 dakika süreyle santrifüjlenerek hasat edildi. Pelletin PBS ile tekrar süspanse edilmesinden sonra, PBMC sayildi ve ayrica, oda sicakliginda ve 200 x gade 10 dakika süreyle santrifüjlenerek ikinci kez yikandi. Ardindan, bu hücreler sonraki prosedürler için uygun vasatta tekrar süspanse edildiler. ADCC eseyleri için kullanilan efektörthedef orani, PBMC ve NK hücreler için, sirasiyla, 25:l ve 10zl°di. Yuvarlak tabanli, 96 kuyucuklu plakanin her bir kuyucuguna 50 ml ilave etmek için, uygun konsantrasyondaki AIM-V vasati içinde efektör hücreler hazirlandi. Hedef hücreler, %10 FCS içeren DMEM içinde çogaltilmis insan B lenfoma hücreleriydiler (örnegin, Raji hücreler). Her mikro-kuyucuk için 100 ml"de 30.000 hücre ilave etmek amaciyla, hedef hücreler PBS"de yikandi, sayildi ve beher ml için 0,3 milyon konsantrasyondaki AIM-V içinde tekrar süspanse edildiler. Antikorlar AIM-V içinde seyreltildiler; önceden tabakalandirilmis hedef hücrelere 50 ml halinde eklendiler ve RT°de 10 dakika süreyle hedeflere baglanmaya birakildilar. Ardindan, efekt'or hücreler ilave edildi ve bu plaka, %5 C02 içerenbir nemli atmosferde ve 37°C sicaklikta 4 saat süreyle inkübe edildi. Hedef hücrelerin ölümü, hasarli hücrelerden laktat dehidrogenaz (LDH) saliniinini Sitotoksisite TeSpit kitini (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Isviçre) kullanarak ölçmek suretiyle degerlendirildi. 4 saatlik inkübasyondan sonra, bu plakalar, 800 x g"de santrifüjlendi. Her kuyucuktan 100 ml süpernatanalindi ve yeni bir seffaf, düz tabanli, 96 kuyucuklu plakaya aktarildi. Beher kuyucuk için, kitten alinan 100 m1 renk sübstratitamponu ilave edildi. Renk reaksiyonunun VmkS degerleri, 490 nm°dekibir ELISA okuyucuda, SOFTmaX PRO yazilimi (Molecular Devices, Sunnyvale, CA kullanilarak en az 10 dakika için tayin edildi. Yalnizca hedef ve efektör hücreleri içeren, ancak hiçbir antikor içermeyen kuyucuklardan spontaiie LDH saliiiimi ölçüldü. Maksimum salinimin, yalnizca hedef hücreleri ve %1 Triton X-100 içeren kuyucuklardan gerçeklestigi tespit edildi. Spesifik antikor aracili burada, X simgesi, spesifik bir antikor konsantrasyonundaki Vmaks ortalamasidir; SR simgesi, spontane salinimin VmakS ortalamasidir ve MR simgesi ise, maksimal salinimin Vmaks ortalamasidir. Immün efekt'or hücreleri içeriye almak için gerekli potens, klasik ADCC eseyiyle ölçülen Fc varyanti tipine baglidir. Burada, insan FchlllA ile transfekte edilmis insan NK92 hücre hatti efektör olarak kullanildi ve CD20 pozitif Raji hücreleri ise, hedef hücreler olarak kullanildi. Sekil 4a"da da görülebilecegi üzere, ADCC,glisininprolini ikame ettigi durumlarda GAlOl (CD20) Fc varyantlarinda (P329G) ve ayrica, benzer bir ölçüye kadar, çift inutant P329G/LALA"dakuvvetli sekilde azaltilir. Bunun aksine, ADCC°deki düsüs, LALA mutasyonuyla daha az kuvvetliydi. Farkli varyantlar arasinda daha iyi bir ayrim yapabilmek amaciyla, ADCC potansiyelini artirmak için, gliko-degistirilmis versiyonda da varyantlar üretildi. Parenteral molekülün (GAlOl (CD20))› beklendigi gibi kuvvetli bir ADCC gösterdigi gözlemlenebilir. LALA versiyonu,ADCC potansiyelinde kuvvetli sekilde bozulur. P antikorunun bir P329A varyantindançok daha fazla, son derece kuvvetli sekilde azaltti (Sekil 4b). Kompleman Aktivitesi Hedef hücreler sayildi, PBS ile yikandi ve ayrica, beher m1 için 1 milyon hücre konsantrayonundaki AIM-V"de (Invitrogen) tekrar süspanse edildi. 50 ml hücre düz tabali, 96 kuyucuklu bir plakada, her kuyucuk için plakalandirildi. Antikorseyreltileri AIM-V içinde hazirlandi ve hücrelere 50 ml halinde ilave edildi. Antikorlar, oda sicakliginda 10 dakika süreyle hücrelere baglanmaya birakildilar. Insan serum komplemani (Quidel) taze sekilde çözdürüldü;AlM-V ile 3 katina kadar seyreltildi ve ayrica, kuyucuklara 50 ml haliiide ilave edildi. Tavsani komplemani (Cedarlane Laboratories) imalatçinin tarif ettigi gibi hazirlandi; AIM-V ile 3 katina kadar seyreltildi ve kuyucuklara 50 m1 halinde ilave edildi. Bir kontrol olarak eseye eklenmeden önce, kompleman kaynaklari 56°C sicaklikta 30 dakika süreyle isitildi. Esey plakalari 37°C sicaklikta 2 saat süreyle inkübe edildiler. Hücrelerin 'Ölümü, LDH salinimini ölçmek suretiyle tespit edildi. Kisaca ifade etmek gerekirse, plakalar 300 X g,de 3 dakika süreyle santrifüjlendi. Beher kuyucuk için 50 ml süperiiatan alindi ve yeni bir 96 kuyucuklu plakaya aktarildi ve ayrica, Sitotoksisite Kitinden alinan (Roche) esey reaktifinin 50 ml'si ilave edildi. ELISA okuyucuyla yapilan bir kinetikölçümde, süpernatanda LDH konsantrasyonuna tekabül eden Vmakstespit edildi. Hücreleri %1 Triton X-100 mevcudiyetinde inkübe etmek suretiyle maksimal salinim tespit SUDH-L4 hedef hücreler üzerinde CDC°ye aracilik etmek için, farkli Fc varyaiitlari analiz edildi. Gliko-degistirilmemis GA101 molekülü net bir CDC indüksiyonu gösterir. LALA varyanti sadece en yüksek konsantrasyonda aktivite gösterirken, P329G ve P329G/LALA varyantlari herhangi bir CDC aktivitesi gösterme:: (Sekil 5a). Ayrica, bir gliko-degistirilmis GAlOl molekülünün P329G ve P329A varyantlarinin yani sira, LALA varyanti da herhangi bir CDC aktivitesi göstermez (Sekil Sb). Insan IgG19in KarbohidratProfili Fc bünyesinde bulunan ve Fcy reseptörlerine baglanmayi ortadan kaldirmayi amaçlayan mutasyonlar içeren insan lgGl aiitikorlarinin karbohidrat profilleri, pozitif iyon modunda (nötral 01igosakkaritler)MALDI/TOF-MS ile analiz edildi. Terminal siyalik asitleri uzaklastirmak için, insan (11) IgGl varyantlari,imalatçinin taliinatlarina göre siyalidazla (QA-Bio) isleme tâbi tutuldu. Ardindan, önceden de tarif edildigi üzere (Ferrara, C. et oligosakkaritleri PNGaz F (QA-Bio) sindiriinle serbest birakildi. Karbohidrat profilleri,daha önce de tarif edildigi üzere (Ferrara, C. et spektrometriyle (Autoflex, Bruker Daltonics GmbH) analiz edildi. Insan IgG1"in nötral FC iliskili glikanlarinin karbohidrat profili, sifir (GO), bir (GI) veya iki (G2) terminal galaktoz artigina sahip fukosillenmis kompleks oligosakkaride atanabilen üç majör m/z pikiyle karakterize edilir. FC bünyesinde bulunan ve F0 reseptörlerine baglanmayi ortadan kaldirmayi hedefleyen inutasyonlari içeren hlgGl"in karbohidrat profilleri analiz edildi ve yabani tip antikor için elde edilenlerle karsilastirildi. FC bünyesindeki (P329G, LALA, P329A, P mutasyonlardan birini içeren IgG varyantlari, yabani tip antikora benzer karbohidrat profilleri gösterirler ve PC ile iliskili glikanlar fukosillenmis kompleks oligosakkaritlerdir (veriler amino asidin alaninleikaine edilmesi yoluyla gözlemlendigi gibi mutasyon, terminal galaktozilasyon ve terminal siyalilasyon seviyesini etkileyebilir. Sekil 6a,bu patent basvurusunda tarif edilen farkli hIgGl Fc varyantlari için nispi galaktozilasyonyüzdesini göstermektedir. Antikorlar farkli bir konakçida eksprese edildiklerinde hafif varyasyonlar gözlemlenebilir, ancak terminal galaktozilasyonda hiçbir önemli fark gözlemlenemez. Sekil 6b,dört farkli antikor için yabani tip ve IgGl-P329G/LALA açisindan galaktozilasyon içerigindeki degiskenligi göstermektedir; burada, dört farkli V-domaini, Hek293 EBNA hücrelerinde eksprese edildiklerindeki galaktozilasyon miktarlari açisindan karsilastirildilar. Tam Kan Eseyinde Antikorun Indükledigi Platelet Agregasyonu. Tam kan platelet agregasyon analizleri, Dynabyte firmasindan alinan Multiplate cihazi kullanilarak yapildi. Oncelikle, normal insan doiiörlerden 20 ml kan alindi ve hiruidin tüplerine (Dynabyte Medical, empedanscihazi (Dynabead #MP0021) kullanildi. Ardindan, minicell cihazina 175 ul %0,9 NaCl ilave edildi. Nihai test konsantrasyonunu elde etmek için, antikor,minicell cihazina eklendi. Ardindan, 175 ul insankani eklendi ve 37°C sicaklikta 3 dakika süreyle inkübe edildi. 37°C sicaklikta ilave 6 dakika için empedans analizleri otomatik olarak baslatildi. Veriler, egri altindaki alani bir platelet agregasyonu ölçüsü olarak ölçmek suretiyle analiz edildi. CD9 antikorununhem platelet aktivasyonunu, hem de platelet agregasyonunu indükledigi gösterilmistir (Worthington ve ark., Br. J. indükledigi platelet agregasyonunun,FcyRIIA reseptörüne baglaninayi kapsadigi daha önceden gösterilmistir (de Reys ve ark., Blood 81 ekleneii LALA, P329G, P329G/LALA ve P329G/SPLE mutasyoiilari CD9 antikorunun FcyRIIA reseptörûne baglanmasini kuvvetli sekilde azaltti (Sekil 10). Bir CD9 antikorunun indükledigi platelet agregasyonu ve aktivasyonu (Ca disari akisiyla ölçülmûstür;veri1er gösterilmemektedir), antikora P329G ve LALA üçlü mutasyonu eklenerek elimine edildi ve böylece, FcyRIIA baglanma özelligi yabani tipantikora kiyasla kuvvetli sekilde düsürüld'ü (bakiniz: Sekil 721 ve 7b). Mürin IgGl,düs`ûk antikor konsantrasyonlarinda (0,1-1 p/ml)platelet agregasyonu indükledi. Daha yüksek konsantrasyonlarda, plateletlerin asiri düzeyde stimüle edilmesi, agregasyon cevabinin susturulmasina yol açar (3-30 tig/ml).chim-hu-IgG4-SPLE ile donör degiskenligi gözlemlendi. Sekil 6a°da,daha yüksek antikor konsantrasyonlarindaki bir chim-hu-lgG4- SPLE cevap vereni için elde edilen veriler gösterilmektedir ve Sekil 6b"de,bir chini-hu-IgG4-SPLE cevap vermeyeni için elde edilen veriler gösterilmektedir. Kan numunelerinden hiçbiri chim-hu-IgGl- LALA, chim-hu-IgG-WT-P329G, chim-hu-IgGl-LALA-P329G, chim- hu-IgG4-SPLE-P329G, chim-hu-IgG4-SPLE-N297Q antikor varyantlariyla herhangi bir agregasyon cevabi göstermedi. Kontroller: isleme tâbi tutulmayan kan iiuniunesinde spontane agregasyon (arkaplan); ADP,nin indükledigi (ADP) ve Trombin analogonun indükledigi (TRAP6) platelet agregasyonu. Izotip kontroller: Mürin Uçlü mutasyonlara sahip CD9 antikorunun FcyRIIA reseptöri'ine baglanma özeliginde gerçeklesen azalmanm, bu tür mutant antikorlarla gözlemlenen azaltilniis platelet agregasyonunun sebebi olabilecegi bu verilere iliskin muhtemel bir yorumdur. Dolayisiyla, prensipte, FcyRIIA reseptör'ûne baglanmayi azaltabilen, yukarida bahsedilen mutasyonlari bir antikorun FC kismina eklemek suretiyle, bir antikor tedavisinin toksik yan etkilerinden biri olan trombosit agregasyonunu `onlemek mümkün olabilir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR