SU959634A3 - Способ получени ферментационного бульона - Google Patents

Description

вующего образованию хелатных соеди нений , ввод т этилендиаминтетрауксусную кислоту. После культивировани  в ферментационный бульон ввод т формальдегид в количестве 0,2-10 г/л. В качестве источника азота используют нитраты аммони , натри  и кали . Вода дл  приготовлени  питательной среды содержит менее чем 20 г/л кальци  и других осаждающих в виде фосфатов катионов, После культивировани  ферментацион . ный бульон выдерживают в течение 3-4 дней дл  получени  бульона, прак-t тически свободного от нерастворимых частиц, превышающих размер 0,65 мкм. Средой дл  выращивани  данного мик роорганизма может быть бульон УМ (Difco) или среда, содержаща  неочищенную глюкозу (церелозу), фосфаты натри  и кали j сульфат магни  и любое органическое соединение,  вл юще с  источником азота, например энзимную выварку соевых бобов или энзимную выварку казеина. После аэробно го размножени  в течение примерно 30 ч при 25°С аликвоту бульона перенос т в ферментер дл  осуществлени  второй стадии инокул ции. Предпочтительными углеводами  вл ютс  глюкоза, мальтоза, фруктоза, отфильтрованный крахмал или их смеси. Предпочтительным источником азота  вл етс  неорганический нитрат: нитрат аммони , нитрат натри  и нитрат кали  в заданных концентраци х. Магний, как один из необходимых микроэлементов, используют в виде MgSO -7HnO, или горькой соли, добавл   ее в концентрации до 1 г/л, нар ду с наличием следов магни  и железа . Веществом, способствующим образЪванио хелатов,  вл етс  этилендиаминтетрауксусна  кислота или, предпочтительно , лимонна  кислота, котора  используетс  в качестве реагента, спо собствующего росту, а также пассивато ра /У1Я кальци . В качестве буфера дл  среды, обеспечивающего значение рН 5 8,5 предпочтительно 6,0-7,5 ввод т большое количество моно- и дифосфатов кали . .После аэробного размножени  в течение ч при , предпочтительно при 28-30°С, аликвоту раствора внос т в бродильный чан, содержащий .обеспечивающую получение вещества среду. Эта среда подобна по составу среде, наход щейс  во йторой стадии инокул ции , за исключением того, что вместо фосфатов кали  предпочтительно используют фосфаты натри  (в св зи с их низкой стоимостью) и малое количество кальци  в форме солей, таких как хлористый кальций или нитрат кальци , или окислов, которые добавл ют дл  увеличени  выхода ксантана. Количество добавл емогокальци  зависит от количестна кальци , присутствующего в воде , используемой при приготовлении среды, используемого источника получени  азота и видов и цепей используемого микроорганизма Xanthomonas Если вместе нитрата аммони  используют нитрат .натри  или кали , требуетс  меньшее количество кальци  (примерно 27 Ч. на млн). Дл  полумени  среды можно использовать такие деионизован-т 1Уую воду, дистиллированную воду- или 1 воду, содержащую менее 20 ч на млн. кальци  и других осаждаемых при образовании фосфатов катионов, Ионы кальци  можно добавл ть в требуемой концентрации . Роль ионов кальци  в обеспечении получени  ксантата велика,.но дл  предложенного способа наиболее существенным  вл етс  предотвращение избыточного осаждени  катионов кальци  и других катионов в виде нерастворимых фосфатных солей. Это осуществл ют путем добавлени  реагента, способствующего образованию хелатов, такого как этилендиаминтетрауксусна  кислота. Важным параметром дл  обеспечени  роста бактерий Xanthomonas  вл етс  рН среды. Предпочтительными значени ми  вл ютс  величины от 6,0 до 7,5. Регулирование рН в указанных пределах осуществл ют использованием буферных соединений, таких как динатрийфосфат, Дл  предотвращени  осаждени  ионов кальци  введенных в воду, в виде нерастворимых солей кальци  в буфер добавл ют этилендиаминтетрауксусную кислоту. Пpeдпoчtитeльнo регулировать рН в ходе цикла ферментации путем добавлени  растворов гидратов окиси натРй  или кали , при использовании которых обеспечиваетс  дополнительное преимущество, заключающеес  в уменьшении в зкости бульона без уменьшени  выхода ксантана и в отсутствии необходимости хелатации буферного раствора . Дл  быстрой ферментации необходимо точное количество кислорода, обеспе595 чивающее рост бактериальной культуры. Ферментационную среду аэрируют с целью обеспечени  требуемого количества кислорода дл  получени  значени  сульфитного окислени , в пределах от 1,5 до 3,5 ммоль кислорода на литр в минуту. Величина сульфитного окислени   вл етс  мерой скорости кисло . рода на входе в бродильный чан при перемешивании и осуществлении аэрации Ферментацию провод т при температуре около до тех пор, пока концентраци  ксантана в бульоне не станет по крайней мере 100 ч. на млн., предпочтительно около 1 и наиболее предпочтительно около 1,k% (30-96 ч). В зкость раствора составл ет обычно 4,000 сП, предпочтительно 7,000 сП. Желательно убивать микробные клетки путем добавлени  бактерицида. Пред почтительным бактерицидом  вл етс  формальдегид в концентрации 0,210 ,2 г/л, который может быть добавлен на заключительной стадии Ферментации, до или во врем  хранени . Предложенный способ пригоден дл  работы со многими вариантами бактерий Xanthomonas. Предпочтительным видом  вл етс  Xanthomonas carnpestris. Испытание на фильтруемость  вл етс  экспериментальной методикой, при которой измер етс  скорость протекани  через фильтр, имеющий микропоры размером 0,45-3,0 мкм, как функци  от объема при посто нном давлении (2,82 кг/см ). Фильтрационное отношение соответствует отношению периода времени, необходимого дл  собирани  четвертых 250 мл раствора дл  регулировани  подвижности, к времени, которое необходимо дл  собирани  первых 250 мл этого раствора. Фильтрационное отношение, равное 1 свидетельствует о том, что раствор не обладает тенден - -цией к забиванию. Допустимые значени  фильтрационных отношений дл  растворов дл  регулировани  подвижности составл ют 1-3 (микропористые фильтры с размером пор 0,45-3 мкм), предпочтительно 1,7. Требуемые значени  фильтрационных отношений и размеры пор фильтров, используемых дл  испытаний конкретного раствора.дл  регулировани  подвижности , завис т от проницаемости подземных слоев нефт ного месторождени , дл  которого планируетс  вытеснение нефти. Растворы дл  регулировани  подвижности на основе завершенных ферментационных растворов, полученных в соответствии с предложенным способом, имеют фильтрационные отношени , которые пригодны дл  большинства нефтеносных месторождений. Если проницаемость подземных слоев очень низка , то используют растворы дл  регулировани  подвижности с малыми фильтрационными отношени ми, причем целые или неочищенные бульоны предпочтительно не должны иметь никаких нерастворимых веществ с размерами частиц, превышающими 0,б5 мкм. Это можно осуществить простым хранением готового ферментационного бульона в присутствии формальдегида в течение дней. В процессе старени  клетки Xanthomonas сжимаютс  таким образом, что их размеры не превышают 0,б5 мкм. Клетки, имеют форму стерхш , причем обычно наибольший размер по длине превышает 0,65 мкм а меньший размер составл ет 0,4-1,0 мкм., Температура хранени  некритична (О135°С , предпочтительно 20-45 0). На практике хранение при комнатной температуре в течение длительного времени осуществл етс  до тех пор, пока микроскопическое исследование не показыва- ет, что наименьший размер клеток не превышает 0,5 мкм (через 3-4 дн ). Методики испытаний. Готоб т 1000 мл раствора, содержащего 750 ч. -на млн. ксантана в растворе соли с концентрацией 500 ч. на млн (10:1 NaCJ-CaCl), следующим образом. В смесителе типа Варинга (Waring), снабженном реостатом, замер ют количество бульона (основыва сь на содержании ксантана), необходимое дл  получени  0,75 г твердого ксантана, Провод т разбавление от 1 до 6 раствором соли. Сдвигают смесь следующим образом: 40% мощности (2 мин 60 мощности ) 2 мин, 80 мощности 2 мин. Разбавл ют раствор в смесителе до концентрации ксантана 750 ч. на млн. и сдвигают при 40% мощности в теуение 2 мин (раствор также используют дл  определени  в зкости). Используют экспериментальное устроиство , которое позвол ет определ ть скорость протекани  через диск из микропористого фильтра (47 мм, размер пор 0,46-8,0 мкм) как функцию от объема при посто нном давлении в 28 н/м . Резервуар емкостью 1 л заполн ют 1 л ксантанового раствора (750 ч.

а млн.), создают давление 28 H/M, отpbiBarot клапан и регистрируют объем ильтрата и врем  (с).

Определ ют фильтрационное отношеие .5

Определение в зкости. В зкость опедел ют с помощью синхроэлектрического вискозиметра Брукфильда (модель LVT с VL-приставкой). Измерени  ведут . при 25°С и скорост х 6 и 12 об/мин. ю В зкость выражают в сантипаузах,

Определение содержани  ксантана. Ксантан высокой степени очистки содерит около 18, глюкуроновой кислоты. Количество глюкуроновой кислоты в ком-is позици х на основе ксантана определ ют в отсутствие формальдегида и без бората при по методу Кнутсона и Джинса.

Содержание ксантана определ ют по 20 формуле

Глюкуронова  кислота, % к ТОО о,

., fgnp

Пример 1. Клетки Xanthomonas campestris из косого агара перенос т в 300 мл бульона УМ, наход щегос  в Z,, 8-литровой колбе Фернбаха, и встр хивают на вращающемс  шейкере в течение 31 ч при 28°С. Аликвоту 25 мл перенос т в колбу Фернбаха (2,8 л) , содержащую 500 мл среды следующего состава , г/л:

Глюкоза-фруктоза

(Изосвит 100) 10,1

Неочищенна  глю-3S

коза (церелоза) 25,1

NH4N031,0

MgS04-7H iO0,10

MnS04HiO0,03

FeS04-7HxO0,0140

Безводна  лимонна 

кислота1 0

КаНР04,1

KHaPL40,69

Церелозу и Изосвит 100 раствор - ют в дистиллированной воде и обрабатывают в автоклаве по отдельности. Остальные ингредиенты объедин ют, довод т рН до 6,Ц.и также обрабатывают в автоклаве. Прошедшие раздельную об-работку в автоклаве материалы затем объедин ют вместе.

После встр хивани  при 28С в течение 33 ч 200 мл раствора перемеща- ют в 4-литровый ородильный бак с механической мешалкой, содержащей 2 л среды следующего состава, г/л:

Церелоза 25,7 автоклавируют ю отдельности. Изосвит 100 10,1 NH4H031,0

MgS047H-iO0,10

,03

FeS04-7H,2.00.10

Безводна  лимонна  кислота1,0 СаС1-2Но О 0,20 NaHP04 3,3 0,70 Сахара раствор ют в 300 мл воды, .обрабатывают в автоклаве по отдельности , остальные ингредиенты раствор ют в 1700 мл воды, обрабатывают в автоклаве , после чего объедин ют оба раствора . Затем провод т аэрацию с такой скоростью, чтобы обеспечить количество кислорода 1, ммоль/л в минуту

Ферментацию провод т при 30°С в течение 8 ч, при этом рН раствора поддерживают на уровне 5-7,5 добавлением буфера на основе фосфата натри  разведенного Ъ водопроводной воде. В буфер на основе фосфата натри  добавл ют также этилендиаминтетрауксусную кислоту дл  предотвращени  осаждени  фосфата кальци . В конце ферментации в зкость бульона 7ВОО сП (при скорости сдвига 6,27 ), выход ксантана 1,5.

Раствор дл  регулировани  подвижноти имеет фильтрационнЬе отношение 1,7 (микропористый фильтр с размером пор 3 мкм).

Пример 2. Повтор ют методику примера 1 с использованием следующей ферментационной среды, г/л:

Г1осевна  среда 1-  стади  Церелоза10,0

(NH4)T.HP042,0

KHQ,P041,0

MgS04-7HlO0,5

NZ-амин УТ (энзимна  выварка казеина ) рН -7,0 11,0 Посевна  среда (2-  стади / D-глюкоза

Claims (6)

1. (о(5рабатывают в автоклаве по отдельности )27,0 D-фруктоза3,0 NH4H031,0 HgS04.,10 Мп504-Н200,03 FeS04- 7НаО0,01 Безводна  лимонна  кислота1,0 , I ,69 Среда,дл  получени продукта О-глюкоза (обрабатываютс  в автоклаве по отдельности)27,0 О-фруктоза3,0 Безводна  лимонна  кислота1,0 NH4N031,0 Мд504-7Н О0,10 ,03 FeS04-7H-iOр,01 CaClQi-2H O0,20 Na HP043,3 НаН-тР040,70 Ферментацию осуществл ют так же, как и в примере 1, за исключением того, что регулирование рН осуществл ют растворЬм гидрата окиси натри без одновременного добавлени  этиле диаминтетрауксусной кислоты. Пример 3. Ферментацию в кр ном масштабе осуществл ют следующим образом. Среда дл  посевного материала (1-  стади ), г/л: Церелоза (NN4)1 РНО MgS04-HQ O NZ-амин УТ рН-7,0 Среду ввод т порци ми по 500 мл, в две 2,8-литровые колбы Фернбаха. После обработки в автоклаве и охлаж дени  колбы засевают клетками культ Xanthomonas campestris. После встр  хивани  в течение 3U ч при 28°С содержимое обеих колб объедин ют и ис пользуют дл  засевани  бродильного на емкостью 200 галлонов (757,08 п) Посевна  среда (2-  стади ), г/л Церелоза10,0 (МН4)гНР042,0 КН2Р040,453, Горькие соли 0,226 NZ-амин УТ рН - 7,0 4,99 Ферментационную среду перемешива механической мешалкой, аэрируют до получени  1,,5 ммоль кислорода н литр в минуту. Через определеные пр межутки времени добавл ют раствор г рата окиси натри  дл  поддержани  р на уровне 6,0-7,5. Дл  регулировани  образовани  изб точной пены дЪбавл ют соевое масло. После проведени  ферментации в тече ние 48 ч объем смеси, достаточный того, чтобы получить 5 соотношение О объемов, перенос т в бродильный бак емкостью 2000 галлонов (7570 л), соержащий 800 галлонов (3028 п) среды следующего состава: Посевна  среда ( стади  NH4M03 (50%-ный раствор ) , ,8 , кг 12,5 , кг 2,15 Горькие соли, г 306 MgS04H-3,0, г З FeS04-7H O, Г .30,5 Церелоза, кг 79,1 (обрабатывают по отдельности в автоклаве) Изосвит 100, кг 31,75 Безводна  лимонна  кислота рН 7,О,кг 3,05 После ферментации при вышеупом нуых услови х в течение примерно 31 м бъем, достаточный дл  получени  10% оотношений объемов, перенос т в родильный бак емкостью 2000 галлонов (7570 л), содержащий 1200 галлонов (4163 л).следующей среды: Церелоза, кг (обрабатываютс  в автоклаве по отдельности ) Изосвит 100, л (50Х-НЫЙ раствор), л ГиДратированный известн к , кг Безводна  лимонна  кислота, кг 4,53 Na,, , кг 3,17 Горькие соли ( Нд504-7НгО), г 454 MgS04-HiO, г 141 Ре504-7Нгб рН -7,0 г 45,4 Таким образом, ферментационный ульон, полученный по известному спообу , обеспечивает получение раствоов дл  контрол  подвижности с конценрацией 100-300 ч. на млн. коллоида сантомонаса и не содержит нераствоимые вещества, имеющее размеры часиц , превышающие 3 мкм. Формула изобретени  1. Способ; получени  ферментаионного бульона, используемого дл  олучени  растворов дл  регулироваи  подвижности, примен емых при добыче нефти, предусматривающий культивирование микроорганизмов Xanthomonas campestrts в услови х аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, предпочтительно углеводы, s источники азота, фосфора, воду и другие необходимые микроэлементы, о т ли чающи и с  тем, что, с целью обеспечени  отсутстви  в целевом продукте практически нерастворимых ве-tO ществ, размеры которых превышают 3,0 мкм, в состав питательной среды дополнительно ввод т лимонную кислоту, хелат кальци  и ионы железа в виде соли сернокислого железа в количест-, 15 вах соответственно равных 0,5-2,0; 0,02-0,07; 0,0005-0,0025 г/л объема ферментируемой среды.
2. 2.CnocoiS по п. 1,отличающ и и с   тем, что в процессе куль- 20 тивировани  в качестве , способствующего образованию хелатных соединений , ввод т этилендиамидтетрауксусную кислоту.
3. 3.Способ по п . 1 , о т л и ч а ющ и и с   тем, что после культивировани  в ферментационный бульон ввод т формальдегид в количестве 0,2-10 г/л.
4. k. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с   тем, что в качестве источника азота используют нитраты аммони , натри  и кали .
5. 5.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с   тем, что вода дл  приготовлни  питательной среды содержит менее чем 20 г/л кальци , и других осаждающих в виде фосфатов катионов.
6. 6.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с   тем, что после культивиро .вани  ферментационный бульон выдерживают в течение 3-4 дней дл  получени  бульона, практически свободного от нерастворимых частиц, превышающих размер 0,65 мкм. Приоритетпо

   05.08.76по пп. 2-5,

   03.05.77по пп. 1, 6. .

   Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

   1. Патент США № 3 27226, кл, 195-31, опублик. 19б9.