[go: up one dir, main page]

SU1648976A1 - Bacterial strain achromobacter agile: producer of restrictase aag 5251 - Google Patents

Bacterial strain achromobacter agile: producer of restrictase aag 5251 Download PDF

Info

Publication number
SU1648976A1
SU1648976A1 SU894735705A SU4735705A SU1648976A1 SU 1648976 A1 SU1648976 A1 SU 1648976A1 SU 894735705 A SU894735705 A SU 894735705A SU 4735705 A SU4735705 A SU 4735705A SU 1648976 A1 SU1648976 A1 SU 1648976A1
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
biomass
aad
yield
restrictase
strain
Prior art date
Application number
SU894735705A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Николай Николаевич Соколов
Иштван Иштванович Фодор
Андрей Борисович Фицнер
Нина Васильевна Аникейчева
Алексей Александрович Калугин
Ольга Тихоновна Самко
Михаил Анатольевич Эльдаров
Элла Борисовна Хорошутина
Original Assignee
Институт Биологической И Медицинской Химии Амн Ссср
Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Институт Биологической И Медицинской Химии Амн Ссср, Институт Биохимии И Физиологии Микроорганизмов Ан Ссср filed Critical Институт Биологической И Медицинской Химии Амн Ссср
Priority to SU894735705A priority Critical patent/SU1648976A1/en
Application granted granted Critical
Publication of SU1648976A1 publication Critical patent/SU1648976A1/en

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано в молеку- л рно-генетических исследовани х, в микробиологической промышленности. Целью изобретени   вл етс  получение штамма, продуцирующего новую рестриктазу Аад 5251, обладающую более высоким выходом. Штамм-продуцент Achromobacter agile 525 выращивают на питательной среде , содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в услови х аэрации, целевой продукт выдел ют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма Achromobacter agile 525 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Аад 5251, узнающую и расщепл ющую нуклеотидную последовательность ДНК5 -AT CGAT -3 , в количествах, достаточных дл  получени  рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы в биомассе 5-6 х 103 ед/г сырой биомассы. Дл  изоши- зомера Аад 5251 - рестриктазы Cla 1 выход очищенного фермента около 430 ед. на 1 г сырой биомассы. Выход очищенного фермента Аад 5251 составл ет (1,7-1,9) х 10 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что более чем в 4 раза превышает выход известной рестриктазы Cla 1 (430 ед). ЈThe invention relates to biotechnology and can be used in molecular genetic studies, in the microbiological industry. The aim of the invention is to obtain a strain that produces the new restriction enzyme Aad 5251, which has a higher yield. The strain producing Achromobacter agile 525 is grown on a nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts under aeration conditions, the target product is isolated from the obtained biomass using known methods. The biomass of the strain Achromobacter agile 525 contains the novel restriction endonuclease Aad 5251, which recognizes and cleaves the nucleotide sequence DNA5 -AT CGAT -3, in quantities sufficient to produce restrictase on a preparative scale: the content of restrictase in biomass is 5-6 x 103 u / g raw biomass . For isodisomer Aad 5251 - restriction enzymes Cla 1, the yield of the purified enzyme is about 430 units. per 1 g of raw biomass. The yield of the purified enzyme Aad 5251 is (1.7-1.9) x 10 units. activity per 1 g of raw biomass, which is more than 4 times higher than the yield of the known restriction enzyme Cla 1 (430 units). J

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано в экспериментальной работе в области молекул рно-геметических исследований, в микробиологической промышленности.The invention relates to biotechnology and can be used in experimental work in the field of molecular gemetric research in the microbiological industry.

Цель изобретени  - получение штамма, продуцирующего новую рестриктазу Аад 5251, обладающую более высоким выходом .The purpose of the invention is to obtain a strain that produces the new restriction enzyme Aad 5251, which has a higher yield.

Поиск штамма-продуцента проводили при помощи разработанного экспресс-метода тестировани  активности в толуольных экстрактах микробных клеток с последующим электрофорезом продуктов расщеплени  ДНК в агарозном геле.The search for the producer strain was carried out using the developed express method for testing the activity in toluene extracts of microbial cells followed by electrophoresis of the products of DNA cleavage on an agarose gel.

Штамм Achromobacter agile 525 получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов АН СССР, где хранитс  под Ms BKM-525 КМ МГУ (Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов).The strain Achromobacter agile 525 was obtained from the All-Union Collection of Microorganisms of the Academy of Sciences of the USSR, where it is stored under MS BKM-525 KM MGU (Catalog of cultures of the All-Union collection of non-pathogenic microorganisms).

Штамм Achromobacter agife 525 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в услови х аэрации, целевой продукт выдел ют из полученной биомассы известными методами.The strain Achromobacter agife 525 is grown on a nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts, under aeration conditions, and the target product is isolated from the obtained biomass using known methods.

Рестриктаза Аад 5251, изошизомер Clal, узнает последовательность нуклеотидов А Т С G А Т и расщепл ет ДНК фага А в 15 участках, Ad 2 в двух, pBR322 в одном и неAad 5251 restriction enzyme, the isalisomer of Clal, recognizes the nucleotide sequence A T C G A T and cleaves the DNA of phage A in 15 sites, Ad 2 in two, pBR322 in one and not

ОABOUT

ЬьB

0000

юYu

V4 OsV4 os

гидролизует ДНК обезь ньего вируса SV 40 и ОХ 174;hydrolyzes the DNA of monkey virus SV 40 and OX 174;

Эндонуклеаза рестрикции Аад 5251  вл етс  ценным инструментом дл  работ в области генетической инженерии. Фермент имеет один участок узнавани  на наиболе распространенном в генетической инженерии векторе дл  клонировани  плазмиде pBR322, причем сайт рестрикции локализуетс  в области гена, ответственного за ус- тойчивость к тетрациклину. Таким образом, клонирование ДНК в данном участке при помощи Аад 5251 в значительной степени облегчаетс  возможностью проведени  селекции рекомбинантов по фенотипу Тс (чувствительность к тетрациклину).Aad 5251 restriction endonuclease is a valuable tool for genetic engineering work. The enzyme has one recognition site on the most common genetic engineering vector for cloning the plasmid pBR322, with the restriction site located in the region of the gene responsible for tetracycline resistance. Thus, the cloning of DNA at this site using Aad 5251 is greatly facilitated by the possibility of selecting recombinants for the Tc phenotype (tetracycline sensitivity).

Характеристика штамма.Characteristics of the strain.

Морфологические свойства,Morphological properties

Палочки размером 0,7 х 2-4 мкм обычно расположены поодиночке, подвижны, грамотрицательны.Rods measuring 0.7 x 2-4 microns are usually located singly, mobile, gram-negative.

Культурально-биохимические свойства,Cultural and biochemical properties

На скошенном агаре рост по штриху нежный. Колонии на чашке Петри с м со- пептонным агаром мелкие, блест щие, кра  ровные. На м сопептонном бульоне на дне пробирки осадок, среда прозрачна .On beveled agar, growth along the stroke is gentle. The colonies on the Petri dish with m-peptone agar are small, shiny, smooth. On m of septone broth at the bottom of the tube, the precipitate is clear.

Отношение к кислороду: строгий аэроб.Attitude to oxygen: strict aerobic.

Желатина уколом - очень медленное разжижение.Gelatin injection - very slow liquefaction.

Чувствительность к антибиотикам: культура чувствительности ко многим антибиотикам, резистентна к пенициллину , стрептомицину, полимиксину.Sensitivity to antibiotics: a culture of sensitivity to many antibiotics, resistant to penicillin, streptomycin, polymyxin.

Услови  выращивани  и хранени .Conditions of growing and storage.

Культура хорошо растет на твердых и жидких полноценных питательных средах: бульоне Хотгингера, среде LB. При культивировании на среде LB наблюдаетс  продолжительна  лаг-фаза. Оптимум роста при.37°С. Зона рН роста культуры лежит в пределах 4,6-9,5. Оптимум роста культуры и образовани  фермента при рН среды 7,2-7,4, При рН 10,0 культура не растет.Culture grows well on solid and liquid full nutrient media: Hotginger broth, LB medium. When cultured on LB medium, a long lag phase is observed. Optimum growth at .37 ° C. The pH of the culture growth is between 4.6 and 9.5. The optimum growth of the culture and the formation of the enzyme at a pH of 7.2-7.4, at pH 10.0, the culture does not grow.

Культура типична дл  Actiromobacter agile.The culture is typical of Actiromobacter agile.

Наибольший выход биомассы, содержащей эндонуклеазу рестрикции Аад 5251, получают в том случае, когда штамм-продуцент выращивают на питательной среде Хоттингера, котора  содержит в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера, 5 г NaCI,The highest yield of biomass containing the restriction endonuclease Aad 5251 is obtained when the producer strain is grown on Hottinger's nutrient medium, which contains, in 1 l, 250 ml of Hottinger's basic food,

1 Г К2НР04, ДО 1 Л ВОДЫ.1 G K2NP04, up to 1 L of water.

Выделение рестриктазы провод т фракционированием и хроматографией на колонках.The restriction enzyme isolation was carried out by fractionation and column chromatography.

П р и м е р 1. Культуру Achromobacter agile, штамм 525 предварительно адаптируют на питательной среде, содержащей в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера,PRI me R 1. Achromobacter agile culture, strain 525 is preliminarily adapted on a nutrient medium containing 250 ml of Hottinger primary food in 1 liter,

5 г NaCI, 1 г К2НР04, до 1 л воды, при 37°С в течение ночи. Инокул т дл  ферментера готов т , пересева  адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10, и размножают в услови х аэрации.5 g of NaCI, 1 g of K2HP04, up to 1 l of water, at 37 ° C overnight. The inoculum for the fermenter is prepared by replanting an adapted culture in 1 liter of fresh medium at a rate of 1:10, and propagated under aeration conditions.

Ферментацию культуры провод т после добавлени  в среду инокул та в соотношении 1:10 к объему среды при 37°С в услови х аэрации. рН среды 7,2-7.4.Fermentation of the culture is carried out after inoculum is added to the medium in a ratio of 1:10 to the volume of the medium at 37 ° C under aeration conditions. pH of 7.2-7.4.

Во врем  выращивани  рН культуральной жидкости поддерживают в пределах 7,4- 7,6.During cultivation, the pH of the culture liquid is maintained within the range of 7.4-7.6.

Выращивание продолжают до фазы замедлени  роста.Growing is continued until the growth phase is slow.

Выход биомассы 5 г/л культуральной жидкости.Biomass yield 5 g / l of culture fluid.

Содержание рестриктазы Аад 5251 6000 ед/г биомассы.The content of restrictase Aad 5251 6000 u / g biomass.

Определение активности фермента провод т экспресс-методом в толуольных экстрактах бактериальных клеток с последующим электрофорезом в агарозном геле продуктов расщеплени  ДНК.The enzyme activity is determined by a rapid method in toluene extracts of bacterial cells, followed by agarose gel electrophoresis of DNA cleavage products.

Выделение эндонуклеазы рестрикции Аад 5251.Isolation of the restriction endonuclease Aad 5251.

5 г биомассы Achromobacter agile 525 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при 2-4°С. После удалени  остатков клеточных оболочек и неразрушенных клеток фермент фракционируют 1 %-ным полиэтиленимином, а затем в двухфазной системе полиэтиленгликоль - декстран. Обогащенный рестриктазой экстракт хроматографируют в калийфосфатном буфере в градиенте КС1 на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЕ-52), затем на колонках с гепаринсефарозой и голубой сефаро- зой (фирмы Фармаци ).5 g of Achromobacter agile 525 biomass is suspended in a buffer solution and the cells are sonicated at 2-4 ° C. After removal of cell debris and intact cells, the enzyme is fractionated with 1% polyethylenimine and then polyethylene glycol - dextran in a two-phase system. The restriction-rich extract is chromatographed in potassium phosphate buffer in a KC1 gradient on DEAE-cellulose columns (DE-52), then on columns with heparin sepharose and blue sepharose (from Pharmacia).

Получают 8,5х 103ед. фермента в 2,5 мл глицеринового буфера. Препарат фермента стабильно сохран ет активность в течение 12 мес. Выход очищенного препарата рестриктазы Аад 5251 составл ет 1,7 х 103 ед. на 1 г сырого веса биомассы.Get 8.5 x 103 units. enzyme in 2.5 ml glycerol buffer. The enzyme preparation stably maintains activity for 12 months. The yield of the purified drug restrictase Aad 5251 is 1.7 x 103 units. per 1 g wet weight of biomass.

Рестриктаза пригодна дл  анализа структуры ДНК и дл  молекул рного клонировани .The restriction enzyme is suitable for analyzing DNA structure and for molecular cloning.

П р и м е р 2. Культивирование штамма A. agile 525 провод т аналогично описанному в примере 1 за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду LB, котора  содержит в 1 л 10 г трип- тона, 10 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCJ и до 1 л воды.PRI mme R 2. Cultivation of strain A. agile 525 is carried out as described in Example 1, except that LB medium containing 10 g of tryptone, 10 g of yeast extract is used as a nutrient medium, 10 g of NaCJ and up to 1 l of water.

Выход биомассы 4 г/л культуральной жидкости.Biomass yield 4 g / l of culture fluid.

После проведени  очистки фермента, как описано выше, выход рестриктазы Аад 5251 1,9 х 103 ед/г биомассы.After purification of the enzyme, as described above, the yield of restrictase Aad 5251 1.9 x 103 u / g biomass.

Таким образом, по предлагаемому способу получают новую эндонуклеазу рестрикции Аад 5251.Thus, according to the proposed method, a new restriction endonuclease Aad 5251 is obtained.

Поиск новой рестриктазы проводилс  путем скрининга у 150 штаммов различных видов бактерий.A search for a new restriction enzyme was carried out by screening 150 strains of various types of bacteria.

Биомасса штамма A. agile 525 содержит новую эндонуклеазу рестрикции Аад 5251, узнающую и расщепл ющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 - A TIC G А Т, в количествах, достаточных дл  получени  рестриктазы в препаративных масштабах: соThe biomass of strain A. agile 525 contains the novel restriction endonuclease Aad 5251, which recognizes and cleaves the nucleotide sequence of the DNA 5 - A TIC G A T, in quantities sufficient to produce restrictase on a preparative scale:

держание рестриктазы в биомассе 5000-6000 ед. на 1 г сырой биомассы.Keeping restrictases in biomass 5000-6000 units. per 1 g of raw biomass.

Дл  изошизомера Аад 5251 - рестриктазы Cta 1 выход очищенного фермента около 430 ед. на 1 г сырого веса биомассы.For the isoshizomer Aad 5251 - restriction enzymes Cta 1, the yield of the purified enzyme is about 430 units. per 1 g wet weight of biomass.

Выход очищенного фермента Аад 5251 (1,7-1,9) х 103 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что более чем в 4 раза превышает известные цифры дл  Cta 1 (430 ед).The output of the purified enzyme Aad 5251 (1.7-1.9) x 103 units. activity per 1 g of raw biomass, which is more than 4 times higher than the known figures for Cta 1 (430 units).

Claims (1)

Формула изобретени Invention Formula Штамм бактерий Achromobacter agile ВКМ 8-525 - продуцент рестриктазы Аад 5251.The strain of bacteria Achromobacter agile VKM 8-525 - producing restrictase Aad 5251.
SU894735705A 1989-07-12 1989-07-12 Bacterial strain achromobacter agile: producer of restrictase aag 5251 SU1648976A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU894735705A SU1648976A1 (en) 1989-07-12 1989-07-12 Bacterial strain achromobacter agile: producer of restrictase aag 5251

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU894735705A SU1648976A1 (en) 1989-07-12 1989-07-12 Bacterial strain achromobacter agile: producer of restrictase aag 5251

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1648976A1 true SU1648976A1 (en) 1991-05-15

Family

ID=21468962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU894735705A SU1648976A1 (en) 1989-07-12 1989-07-12 Bacterial strain achromobacter agile: producer of restrictase aag 5251

Country Status (1)

Country Link
SU (1) SU1648976A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2266323C2 (en) * 2003-06-16 2005-12-20 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Bacterium strain sphingobacterium mizutae-32 as producer of spml restriction endonuclease, recognizing and cleaving 5'-at'cgat-3' nucleotide sequence

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mayer H., Crosschedl R., Schutte H.. Hobot G. Cla I a Hew re striction endonuclease from Caryohatton latum L. - Nucl. Acids Res., 1981, v. 9, p. 4833-4845. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2266323C2 (en) * 2003-06-16 2005-12-20 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Bacterium strain sphingobacterium mizutae-32 as producer of spml restriction endonuclease, recognizing and cleaving 5'-at'cgat-3' nucleotide sequence

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SU1364343A1 (en) Method of producing manъs leukocytic interferon alfa-2
CN103509728B (en) Produce the construction process of Coenzyme Q10 99.0 engineering bacteria, engineering bacteria and application method
Rigby et al. Construction of intergeneric hybrids using bacteriophage P1CM: transfer of the Klebsiella aerogenes ribitol dehydrogenase gene to Escherichia coli
SU1648976A1 (en) Bacterial strain achromobacter agile: producer of restrictase aag 5251
US3909352A (en) Production of yeast biomass
SU1678832A1 (en) Strain of bacteria lactobacillus plantarum - a producer of restrictase lpli
Sone et al. Production and properties of pectin lyase in Pseudomonas marginalis induced by mitomycin C
SU1678833A1 (en) Strain of bacteria bacillus alvei - a producer of restrictase bavi
KR100877962B1 (en) Recombinant plasmid vector, Seratia Masson genus recombinant strain transformed with recombinant plasmid vector and lipase production method using the same
Manolov Influence of agitation rate on growth and ribonuclease production by free and immobilized Aspergillus clavatus cells
SU1761804A1 (en) Strain of bacteria bacillus coagulants - producer of restriction endonuclease bco ai
SU1707077A1 (en) Method of restictase bsp di preparation
SU1761803A1 (en) Strain of bacteria bacillus alvei - producer of restriction endonuclease bav bii
SU1832129A1 (en) Strain of bacterium bacillus brevis - a producer of endonuclease restriction bbv bi
SU1712415A1 (en) Method of restrictase bbv ai preparation
Haffie et al. Isolation of noninhibitory strains of Zymomonas mobilis
Mussenden et al. Physiological studies related to the immobilization of Penicillium chrysogenum and penicillin production
El-Sayed et al. Semicontinuous penicillin production by two Penicillium chrysogenum strains immobilized in calcium alginate beads
SU1761805A1 (en) Recombinant plasmid dna pil-2/21, encoding human interleukine-2, method of its construction and strain of bacteria esherichia coli - producer of human interleukine-2
SU1040794A1 (en) Bordetella bronchiseptica-4994 strain - producer of site-specific endonuclease
SU1458388A1 (en) Method of producing endonuclease-restrictases capable of recognizing and splitting nucleotide sequences
SU1618760A1 (en) Strain of escherichia coli bacteria as producer of restrictase
SU1738853A1 (en) Method for preparation of micrococcus luteus vkpm-2836 biomass - a producer of restrictase mlui
RU2044055C1 (en) Strain of bacterium klebsiella azeanae - a producer of restriction endonuclease kaz 48 ki
US20040241809A1 (en) Method for producing vitamin b12