RU2266323C2 - Bacterium strain sphingobacterium mizutae-32 as producer of spml restriction endonuclease, recognizing and cleaving 5'-at'cgat-3' nucleotide sequence - Google Patents
Bacterium strain sphingobacterium mizutae-32 as producer of spml restriction endonuclease, recognizing and cleaving 5'-at'cgat-3' nucleotide sequence Download PDFInfo
- Publication number
- RU2266323C2 RU2266323C2 RU2003118019/13A RU2003118019A RU2266323C2 RU 2266323 C2 RU2266323 C2 RU 2266323C2 RU 2003118019/13 A RU2003118019/13 A RU 2003118019/13A RU 2003118019 A RU2003118019 A RU 2003118019A RU 2266323 C2 RU2266323 C2 RU 2266323C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- restriction endonuclease
- enzyme
- nucleotide sequence
- spml
- Prior art date
Links
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 8
- 241001136275 Sphingobacterium Species 0.000 title claims abstract description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 6
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 abstract description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 abstract 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 241000190872 Sphingobacterium mizutaii Species 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088237 ATCGAT-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241001468186 Caryophanon latum Species 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102100034330 Chromaffin granule amine transporter Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 101000641221 Homo sapiens Chromaffin granule amine transporter Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к поиску новых штаммов - продуцентов биологически активных веществ, перспективных для микробиологической промышленности и генной инженерии, и касается получения нового штамма, обладающего свойством роста при низких температурах и продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5'-ATCGAT-3'.The invention relates to the search for new strains - producers of biologically active substances, promising for the microbiological industry and genetic engineering, and for the production of a new strain possessing the property of growth at low temperatures and producing a site-specific restriction endonuclease capable of recognizing and cleaving the 5'-ATCGAT nucleotide sequence -3 '.
Психрофильные микроорганизмы мало изучены из-за их экстремальных условий обитания и трудности их выделения. Однако в настоящее время они привлекают все больше внимания ученых.Psychrophilic microorganisms have been little studied because of their extreme living conditions and the difficulty of their isolation. However, they are currently attracting more and more attention from scientists.
Эндонуклеаза рестрикции данной специфичности используется для исследования первичной структуры ДНК, физического картирования различных геномов и ранее не обнаружена в штаммах рода Sphingobacterium.A restriction endonuclease of this specificity is used to study the primary structure of DNA, physical mapping of various genomes and has not been previously detected in strains of the genus Sphingobacterium.
В настоящее время в литературе описаны изошизомеры данной эндонуклеазы рестрикции [3]. Однако ни один из них не выделялся из психрофильных микроорганизмов и не проявлял оптимума действия ниже 10°С.Currently, the literature describes isoshizomers of this restriction endonuclease [3]. However, none of them stood out from psychrophilic microorganisms and showed no optimum action below 10 ° C.
Известны несколько штаммов [2-8], способных продуцировать эндонуклеазу рестрикции (сайт узнавания 5'-ATCGAT-3'). Однако ни один из них не относится к роду Sphingobacterium.Several strains are known [2-8] capable of producing a restriction endonuclease (recognition site 5'-ATCGAT-3 '). However, none of them belongs to the genus Sphingobacterium.
В литературе приводятся данные о выходе ферментов для некоторых изошизомеров [4-7]. Выход фермента ClaI из штамма Caryophanon latum L составляет 400 Е/г [6], BsmI из Bacillus species-12000 Е/г [7], а BspXI из Bacillus sphericus - 42000 Е/г [4]. Однако в последнем штамме содержатся два фермента, а не один, как в нашем штамме. Наличие нескольких эндонуклеаз рестрикции всегда затрудняет процесс выделения чистого препарата фермента.The literature provides data on the yield of enzymes for some isoshizomers [4-7]. The output of the ClaI enzyme from Caryophanon latum L strain is 400 U / g [6], BsmI from Bacillus species is 12000 U / g [7], and BspXI from Bacillus sphericus is 42000 U / g [4]. However, the last strain contains two enzymes, and not one, as in our strain. The presence of several restriction endonucleases always complicates the process of isolating a pure enzyme preparation.
Наиболее доступным и близким к заявляемому штамму является штамм В. Stearothermophilus 29, продуцирующий рестриктазу Bsa29I [3, 5], прототип.The most accessible and close to the claimed strain is a strain of B. Stearothermophilus 29, producing the restriction enzyme Bsa29I [3, 5], the prototype.
Штамм культивируется при температуре 50°С. Фермент сохраняет активность от двух до шести месяцев хранения при -20°С. Выход фермента составляет 12000 ед/г препарата.The strain is cultivated at a temperature of 50 ° C. The enzyme retains activity from two to six months of storage at -20 ° C. The output of the enzyme is 12,000 units / g of the drug.
Недостатком данного штамма является невысокий выход эндонуклеазы рестрикции и отсутствие способности расти при низких температурах.The disadvantage of this strain is the low yield of restriction endonuclease and the lack of ability to grow at low temperatures.
Технической задачей изобретения является получение штамма, продуцирующего эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность 5'-ATCGAT-3', с высоким выходом фермента, стабильного при хранении и способного проявлять высокую активность при низкотемпературных условиях реакции.An object of the invention is to obtain a strain that produces a restriction endonuclease that recognizes and cleaves the nucleotide sequence of 5'-ATCGAT-3 ', with a high yield of the enzyme that is stable during storage and capable of exhibiting high activity under low temperature reaction conditions.
Поставленная техническая задача решается выявлением и использованием штамма-продуцента сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции SpmI.The stated technical problem is solved by the identification and use of a producer strain of the site-specific restriction endonuclease SpmI.
В процессе анализа образцов талой воды был выделен штамм Sphingobacterium mizutae, являющийся продуцентом эндонуклеазы рестрикции, названной SpmI согласно общепринятой номенклатуре [1]. Штамм культивируется при низких температурах и является продуцентом эндонуклеазы рестрикции, обладающей высокой активностью при температуре 6-10°С. Фермент является изошизомером известной эндонуклеазы рестрикции ClaI [2], но отличается от выделенных ранее изошизомеров тем, что он более активен при низких температурах и полностью инактивируется при 50°С.In the process of analysis of samples of melt water, a strain of Sphingobacterium mizutae was isolated, which is a producer of a restriction endonuclease called SpmI according to the generally accepted nomenclature [1]. The strain is cultivated at low temperatures and is a producer of restriction endonuclease, which has high activity at a temperature of 6-10 ° C. The enzyme is an isoshizomer of the known ClaI restriction endonuclease [2], but differs from the isoshizomers isolated earlier in that it is more active at low temperatures and completely inactivated at 50 ° C.
Согласно классификации Бердже этот род был описан еще в 1983 г. и включает 3 вида, выделенные из рода Flavobacterium [8].According to Bergee’s classification, this genus was described back in 1983 and includes 3 species isolated from the genus Flavobacterium [8].
Идентификацию проводят общепринятыми методами [9-10].Identification is carried out by conventional methods [9-10].
Штамм обладает следующими свойствами.The strain has the following properties.
Палочки прямые, спор не образуют, грамотрицательные, неподвижные, каталазоположительные. Ферментируют лактозу и сахарозу. Растет на минимальной среде с лактозой. Колонии первоначально белые, непрозрачные, через несколько суток инкубации при комнатной температуре становятся желтыми. Индол не образует, желатину не гидролизует. Образует кислоту из углеводов в результате их окисления, газ не выделяет. Штамм утилизирует рамнозу и характеризуется отсутствием дезоксирибонулеазы; отсутствие образования кислоты при окислении маннитола, этанола и гликогена. Штамм относится к психрофильным микроорганизмам, не растет при 37°С, хорошо растет при температуре 6-20°С.The rods are straight, do not form a spore, gram-negative, motionless, catalase-positive. Ferment lactose and sucrose. Grows on minimal medium with lactose. The colonies are initially white, opaque, after a few days of incubation at room temperature they turn yellow. Indole does not form, does not hydrolyze gelatin. It forms acid from carbohydrates as a result of their oxidation, gas does not emit. The strain utilizes ramnose and is characterized by the absence of deoxyribonulase; lack of acid formation during the oxidation of mannitol, ethanol and glycogen. The strain belongs to psychrophilic microorganisms, does not grow at 37 ° C, grows well at a temperature of 6-20 ° C.
Вид идентифицирован по определителю [8] как штамм бактерии Sphingobacterium mizutae 32.The species was identified by the determinant [8] as a strain of the bacterium Sphingobacterium mizutae 32.
Полученный штамм Sphingobacterium mizutae 32 депонирован в НИИ ККМ Государственного Научного Центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под регистрационным номером В-907, а продуцируемая им рестриктаза названа SpmI согласно общепринятой номенклатуре.The obtained strain of Sphingobacterium mizutae 32 was deposited at the Vector Scientific Research Institute of KKM of the State Scientific Center for Virology and Biotechnology under registration number B-907, and the restriction enzyme produced by it was named SpmI according to generally accepted nomenclature.
Штамм хранится в лиофильном состоянии и в питательной среде с глицерином.The strain is stored in a lyophilic state and in a nutrient medium with glycerin.
Для культивирования Sphingobacterium mizutae 32 применяют среду следующего состава (г/л): бактотриптон (Difco) 10.0, дрожжевой экстракт (Difco) 5.0, NaCl 5.0, рН 7.0-7.2.For the cultivation of Sphingobacterium mizutae 32, a medium of the following composition (g / l) is used: bactotryptone (Difco) 10.0, yeast extract (Difco) 5.0, NaCl 5.0, pH 7.0-7.2.
Для получения препарата фермента штамм выращивают в поллитровых колбах в качалке при 200 об/мин и 12-14°С в течение 48 ч или в холодильнике при температуре 6°С. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин и температуре 4-5°С. Выделение проводят путем хроматографической очистки на фосфоцеллюлозе Р-11 ("Whatman", Англия). Все операции по выделению SpmI проводят при температуре 4-5°С. Клетки суспендируют в буфере А (10 мМ калийфосфатный буфер рН 7.5, 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0.1 мМ ЭДТА) из расчета 4 мл на 1 г биомассы и разрушают ультразвуком на дезинтеграторе ("MSE", Англия), затем осветляют центрифугированием на центрифуге J-21B ("Bekman", США) со скоростью 18000 об/мин в течение 30 мин. Экстракт наносят на колонку (1.6×14 см) фосфоцеллюлозы Р-11 ("Whatman", Англия), промывают буфером А и смывают фермент в градиенте концентрации NaCl (0.0-0.8 М). Фракции, содержащие рестриктазу, диализуют против буфера В (10 мМ трис-HCl рН 7,5, 1 мМ β-меркаптоэтанол, 0.1 мМ ЭДТА). Фракции с ферментом диализуют против 50%-ного раствора глицерина в буфере А.To obtain the enzyme preparation, the strain is grown in half-liter flasks in a shaker at 200 rpm and 12-14 ° C for 48 hours or in a refrigerator at a temperature of 6 ° C. Cells are pelleted by centrifugation at 5000 rpm and a temperature of 4-5 ° C. Isolation is carried out by chromatographic purification on P-11 phosphocellulose (Whatman, England). All operations for the isolation of SpmI are carried out at a temperature of 4-5 ° C. Cells are suspended in buffer A (10 mM potassium phosphate buffer pH 7.5, 7 mM β-mercaptoethanol, 0.1 mM EDTA) at a rate of 4 ml per 1 g biomass and sonicated using a disintegrator (MSE, England), then clarified by centrifugation on a J centrifuge. -21B (Bekman, USA) at a speed of 18,000 rpm for 30 minutes The extract was applied to a column (1.6 × 14 cm) of P-11 phosphocellulose (Whatman, England), washed with buffer A, and the enzyme was washed off in a NaCl concentration gradient (0.0-0.8 M). Fractions containing restrictase are dialyzed against buffer B (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM β-mercaptoethanol, 0.1 mM EDTA). Fractions with the enzyme are dialyzed against a 50% glycerol solution in buffer A.
Для электрофореза используют агарозу фирмы "Sigma", США. Рестрикционный анализ проводят в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис рН 7.5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол (ДТТ) и 1 мкг ДНК λсI857 при температуре 6-10°С.For electrophoresis use agarose company "Sigma", USA. Restriction analysis is carried out in 20 μl of the reaction mixture containing 10 mm Tris pH 7.5, 10 mm MgCl 2 , 10 mm NaCl, 1 mm dithiothreitol (DTT) and 1 μg of λсI857 DNA at a temperature of 6-10 ° C.
Выход фермента из 10 г клеток составляет 300000 ед. акт. За единицу активности (Е) принимают минимальное количество фермента, которое в течение 1 ч при температуре 6-10°С в оптимальных условиях полностью гидролизует 1 мкг ДНК фага λcI857.The output of the enzyme from 10 g of cells is 300,000 units. Act. The unit of activity (E) is the minimum amount of the enzyme, which for 1 h at a temperature of 6-10 ° C under optimal conditions completely hydrolyzes 1 μg of DNA of phage λcI857.
Штамм является уникальным не только по наличию данной эндонуклеазы рестрикции, но и имеет дополнительные свойства. Клетки штамма способны расти при низких температурах, а фермент гидролизует ДНК фага лямбда и Т7 при температуре 6-10°С.The strain is unique not only in the presence of this restriction endonuclease, but also has additional properties. The cells of the strain are able to grow at low temperatures, and the enzyme hydrolyzes the DNA of phage lambda and T7 at a temperature of 6-10 ° C.
Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является:The defining difference of the proposed strain from the strain of the prototype is:
- штамм относится к роду Sphingobacterium и растет при низких температурах,- the strain belongs to the genus Sphingobacterium and grows at low temperatures,
- высокая продуктивность штамма, превышающая по данному показателю штамм-прототип,- high productivity of the strain, exceeding the prototype strain in this indicator,
- высокая стабильность фермента (сохранение активности в течение двух недель хранения при +20°С),- high stability of the enzyme (maintaining activity for two weeks of storage at + 20 ° C),
- широкий температурный оптимум работы фермента, в результате чего расширяется температурный спектр его использования в области низких температур.- a wide temperature optimum for the enzyme, as a result of which the temperature spectrum of its use in the low-temperature range expands.
Для определения узнаваемой последовательности нукпеотидов эндонуклеазой рестрикции SpmI проводят сравнение экспериментально полученных путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле фрагментов, образующихся при гидролизе ДНК фага λсI857. Результаты сравнительного анализа позволяют сделать вывод, что данная эндонуклеаза рестрикции узнает последовательность нуклеотидов (5'-CTGCAG-3').To determine the recognizable sequence of nukpeotides with SpmI restriction endonuclease, we compare the fragments experimentally obtained by electrophoresis in a 1% agarose gel that are formed by hydrolysis of phage λсI857 DNA. The results of the comparative analysis allow us to conclude that this restriction endonuclease recognizes the nucleotide sequence (5'-CTGCAG-3 ').
На фиг.1 представлена электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага λсI857 ферментом Spml (дор.1), SpmI и Bsa29I (дор.2) Bsa29I (дор.3), (сайт узнавания 5'-ATCGAT-3') (дор.3).Figure 1 presents the electrophoregram of the products of DNA hydrolysis of phage λсI857 with the enzyme Spml (d.1), SpmI and Bsa29I (d.2) Bsa29I (d.3), (recognition site 5'-ATCGAT-3 ') (d.3) .
Как видно из представленной фиг.1, идентичность полос расщепления при параллельном и совместном гидролизе подтверждает их изошизомерию.As can be seen from the presented figure 1, the identity of the splitting bands in parallel and joint hydrolysis confirms their isoshisomerism.
Интерпретация полученных экспериментальных данных позволяет утверждать, что исследуемая эндонуклеаза рестрикции является изошизомером рестриктазы Bsa29I и может заменить его во всех молекулярно-биологических и генно-инженерных работах. Также установлено, что Bsa29I и SpmI и имеют общую точку расщепления и гидролизуют ДНК между нуклеотидами Т и С. Таким образом, впервые выделена эндонуклеаза рестрикции из психрофильного штамма, относящегося к роду Sphingobacterium, имеющая оптимальную температуру рестрикции 6-10°С.Interpretation of the obtained experimental data allows us to state that the studied restriction endonuclease is an isoshizomer of the Bsa29I restriction enzyme and can replace it in all molecular biological and genetic engineering studies. It was also established that Bsa29I and SpmI both have a common cleavage point and hydrolyze DNA between nucleotides T and C. Thus, the restriction endonuclease was isolated for the first time from a psychrophilic strain belonging to the genus Sphingobacterium having an optimal restriction temperature of 6-10 ° C.
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения "новизна" и "изобретательский уровень".Since the proposed strain was obtained for the first time and has never been used, we can conclude that the proposed strain meets the criteria of the invention of "novelty" and "inventive step".
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by the following examples of specific performance.
Пример 1. Получение биомассы и выделение фермента. Перед началом работы клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду. Косяки помещают в холодильник при температуре 10±2°С. После 42 ч инкубации подросшие клетки пересевают в колбы со свежей питательной средой.Example 1. Obtaining biomass and isolation of the enzyme. Before starting work, the cells of the producer strain are subcultured by a bacteriological loop on an agar medium. Weeds are placed in the refrigerator at a temperature of 10 ± 2 ° C. After 42 hours of incubation, the grown cells are transplanted into flasks with fresh nutrient medium.
Культивирование проводят в холодильном шкафу "MSE, Англия" при 10±2°С с аэрацией, при перемешивании 200 об/мин. Клетки собирают центрифугированием на центрифуге J-21 при 5000 об/мин и температуре 4-5°С. Дезинтеграцию, выделение и очистку проводят при описанной выше методике.Cultivation is carried out in a refrigerator "MSE, England" at 10 ± 2 ° C with aeration, with stirring 200 rpm Cells are harvested by centrifugation on a J-21 centrifuge at 5,000 rpm and a temperature of 4-5 ° C. Disintegration, isolation and purification are carried out using the method described above.
Пример 2. Определение специфичности и активности фермента. Специфичность фермента определяют по картине параллельного и совместного гидролиза ДНК Фага лямбда (фиг.1). Идентичность картин гидролиза на 1-3 дорожках говорит о том, что эти ферменты узнают и расщепляют одинаковую последовательность нуклеотидов 5'-ATCGAT-3'.Example 2. Determination of the specificity and activity of the enzyme. The specificity of the enzyme is determined by the picture of parallel and joint hydrolysis of the DNA of Phage lambda (Fig. 1). The identity of the hydrolysis patterns in lanes 1-3 indicates that these enzymes recognize and cleave the same nucleotide sequence 5'-ATCGAT-3 '.
Пример 3. Определение влияния температуры на активность фермента. Гидролиз ДНК фага лямбда проводят в стандартных условиях, но при различных температурах от 6 до 50°С в течение 60 мин. Фермент полностью инактивируется при 50°С, сохраняет свою активность при 37°С, максимальная активность наблюдается при температуре 6-10°С (фиг.2, табл.1).Example 3. Determination of the effect of temperature on enzyme activity. Hydrolysis of lambda phage DNA is carried out under standard conditions, but at various temperatures from 6 to 50 ° C for 60 minutes. The enzyme is completely inactivated at 50 ° C, retains its activity at 37 ° C, the maximum activity is observed at a temperature of 6-10 ° C (figure 2, table 1).
Поскольку эндонуклеаза рестрикции SpmI имеет сайт узнавания AT^CGAT, идентичный сайту узнавания эндонуклеазы рестрикции Bsa29I, которая также является изошизомером ClaI, она может заменить прототип во всех генно-инженерных работах.Since the restriction endonuclease SpmI has an AT ^ CGAT recognition site identical to the recognition site of the Bsa29I restriction endonuclease, which is also a ClaI isoschisomer, it can replace the prototype in all genetic engineering studies.
Пример 4. Культивирование штамма. Клетки штамма-продуцента пересевают бактериологической петлей на скошенную агаризованную среду. Культуру на скошенном агаре помещают в термостат на 37±2°С. После 48 ч инкубации роста клеток не наблюдают.Example 4. The cultivation of the strain. The cells of the producer strain are subcultured by a bacteriological loop on a beveled agar medium. The culture on mowed agar is placed in a thermostat at 37 ± 2 ° C. After 48 hours of incubation, cell growth was not observed.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫLIST OF REFERENCES
1. Roberts R.J., Belfort M., Bestor Т., Bhagwat A.S., Bickle T.A., Bitinaite J. // Nucleic Acids Res. - 2003. - V.31. - P.1805-1812.1. Roberts R.J., Belfort M., Bestor T., Bhagwat A.S., Bickle T.A., Bitinaite J. // Nucleic Acids Res. - 2003. - V.31. - P.1805-1812.
2. Kessler C., Neumaier P.S., Wolf W., (1985) Gene, vol. 33, pp.1-102.2. Kessler C., Neumaier P.S., Wolf W., (1985) Gene, vol. 33, pp. 1-102.
3. Roberts R.J., Vincze Т., Posfai J., Macelis D. // Nucleic Acids Res. - 2003. - V.31 - P.418-420.3. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J., Macelis D. // Nucleic Acids Res. - 2003. - V.31 - P.418-420.
4. Zieger M., Patillon M., Roizes G., Lerouge Т., Dupret D., Jeltsch, J.M.// Nucleic Acids Res - 1987. - V.15 - P.3919.4. Zieger M., Patillon M., Roizes G., Lerouge T., Dupret D., Jeltsch, J.M. // Nucleic Acids Res - 1987. - V.15 - P.3919.
5. Repin V., Lebedev L., Puchkova L., Serov G., Terechenko Т., Chizikov V., Andreeva I.// Gene. - 1995. - V.157. - №1-2. - P.321-322.5. Repin V., Lebedev L., Puchkova L., Serov G., Terechenko T., Chizikov V., Andreeva I. // Gene. - 1995. - V.157. - No. 1-2. - P.321-322.
6. Mayer, H., Grosschedl, R., Schutte, H., Hobom, G., Nucleic Acids Res., - 1981. - vol.9, p.4833-4845.6. Mayer, H., Grosschedl, R., Schutte, H., Hobom, G., Nucleic Acids Res., - 1981. - vol. 9, p. 4833-4845.
7. Суджювене О.Ф., Тарасов А.П. // Мол. генет. микробиол. вирусология, 1987. №4, с.19-22.7. Sujuvain O.F., Tarasov A.P. // Mol. a gene. microbiol. Virology, 1987. No. 4, pp. 19-22.
8. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.1; Пер. с англ./ Под ред. Дж.Хоулта, H.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уилльямса. - M.: Мир, 1997. - 432 с.8. The determinant of bacteria Bergey. In 2 vols. T.1; Per. from English / Ed. J.Houlta, H.Krieg, P. Snit, J. Staley, S. Williams. - M .: Mir, 1997 .-- 432 p.
9. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./ Под ред. Ф.Герхардта и др. - M.: Мир, 1984. - 264 с.9. Methods of general bacteriology: Per. from English / Ed. F. Gerhardt et al. - M .: Mir, 1984. - 264 p.
10. А.С.Лабинская. Микробиология с техникой микробиологических исследований - M.: Медицина, 1972. - 479 с.10. A.S. Labinskaya. Microbiology with the technique of microbiological research - M .: Medicine, 1972. - 479 p.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003118019/13A RU2266323C2 (en) | 2003-06-16 | 2003-06-16 | Bacterium strain sphingobacterium mizutae-32 as producer of spml restriction endonuclease, recognizing and cleaving 5'-at'cgat-3' nucleotide sequence |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003118019/13A RU2266323C2 (en) | 2003-06-16 | 2003-06-16 | Bacterium strain sphingobacterium mizutae-32 as producer of spml restriction endonuclease, recognizing and cleaving 5'-at'cgat-3' nucleotide sequence |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003118019A RU2003118019A (en) | 2004-12-10 |
| RU2266323C2 true RU2266323C2 (en) | 2005-12-20 |
Family
ID=35869797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003118019/13A RU2266323C2 (en) | 2003-06-16 | 2003-06-16 | Bacterium strain sphingobacterium mizutae-32 as producer of spml restriction endonuclease, recognizing and cleaving 5'-at'cgat-3' nucleotide sequence |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2266323C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2593723C1 (en) * | 2015-05-19 | 2016-08-10 | Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм" | STRAIN OF BACTERIA Plantibacter flavus 3Kz - PRODUCER OF METHYL-DEPENDENT SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE PfsI |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1544802A1 (en) * | 1988-05-04 | 1990-02-23 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Strain of bacillus thuringiensis bacteria as producer of restrictase of isoschisomer |
| SU1648976A1 (en) * | 1989-07-12 | 1991-05-15 | Институт Биологической И Медицинской Химии Амн Ссср | Bacterial strain achromobacter agile: producer of restrictase aag 5251 |
-
2003
- 2003-06-16 RU RU2003118019/13A patent/RU2266323C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1544802A1 (en) * | 1988-05-04 | 1990-02-23 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Strain of bacillus thuringiensis bacteria as producer of restrictase of isoschisomer |
| SU1648976A1 (en) * | 1989-07-12 | 1991-05-15 | Институт Биологической И Медицинской Химии Амн Ссср | Bacterial strain achromobacter agile: producer of restrictase aag 5251 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ROBERTS R.J. et al. REBASE: restriction enzymes, and methyltrans ferases. Nuelere acids res. 2003, v.31, № 1, p.418-420. REPIN V. et al. New restriction endonucleases from thermophilie soil bacteria. Gene. 1995, v. 157, p.321-322. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2593723C1 (en) * | 2015-05-19 | 2016-08-10 | Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм" | STRAIN OF BACTERIA Plantibacter flavus 3Kz - PRODUCER OF METHYL-DEPENDENT SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE PfsI |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pant et al. | Production, optimization and partial purification of protease from Bacillus subtilis | |
| Rakaz et al. | Isolation, Extraction, Purification, and Molecular Characterization for Thermostable α‐Amylase from Locally Isolated Bacillus Species in Sudan | |
| RU2288263C2 (en) | Strain bacillus coagulants sim-7 dsm 14043 for preparing l-(+)-lactate and method for preparing l-(+)-lactate | |
| Sneha et al. | Isolation and screening of protease producing bacteria from marine waste | |
| RU2266323C2 (en) | Bacterium strain sphingobacterium mizutae-32 as producer of spml restriction endonuclease, recognizing and cleaving 5'-at'cgat-3' nucleotide sequence | |
| RU2073717C1 (en) | Strain of bacterium bacillus schlegelii - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5'-ccnnnnnnngg-3' | |
| Odu et al. | Protease production capabilities of Micrococcus luteus and Bacillus species isolated from abattoir environment | |
| RU2500811C1 (en) | Recombinant bacillus subtilis bacteria strain-producer of specific phospholipase | |
| RU2115728C1 (en) | Strain of bacterium bacillus stearothermophilus - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ggtnacc-3' | |
| JPH02255081A (en) | Protease-producing bacterium, protease produced from the same bacterium and purification thereof | |
| RU2302459C2 (en) | BACTERIAL STRAIN OF Arthrobacter species Mn372 AS PRODUCER OF Asi3721 RESTRICTION ENDONUCLEASE RECOGNIZING AND CLEAVING OF 5'-ATGCAT-3' NUCLEOTIDE SEQUENCE | |
| Mahesh et al. | Optimization for the production of extracellular alkaline phosphatase from Proteus mirabilis | |
| RU2500812C1 (en) | Recombinant bacillus licheniformis bacteria strain-producer of heat-resistant lipase | |
| RU2046142C1 (en) | Strain of bacterium bacillus pumilus - a producer of restriction endonuclease bpu 19-1 | |
| RU2135581C1 (en) | Strain of bacterium streptomyces species sj-12 - producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ctgcag-3' | |
| RU2270859C1 (en) | STRAIN OF BACTERIUM BACILLUS SUBTILIS AS PRODUCER OF RESTRICTION ENDONUCLEASE Bisi | |
| Kannaiyram et al. | Production and characterization of alkaline phosphatase produced by Bacillus Species | |
| RU2021373C1 (en) | Strain of bacterium bacillus pumilis producing restriction endonuclease recognizing and cleaving nucleotide sequence 5′- cctnagc- 3′ | |
| RU2057806C1 (en) | Strain of bacterium bacillus coagulans - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5′-gatnnnn-atc-3′ | |
| RU2040540C1 (en) | Strain of bacteria bacillus coagulants being producer of side specific endonuclease which is enable to identify and to cleave series of 5′-ct(a/g)(t/c)ag-3′ nucleotides | |
| RU2053299C1 (en) | Strain of bacterium bacillus badius - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5′-(a/t)ccgg(a/t)-3′ | |
| SU1095645A1 (en) | Method of producing restriction endonuclease | |
| RU2037522C1 (en) | Strain of bacterium bacillus species - a producer of restriction endonuclease recognizing and cleaving nucleotide sequence 5'-(a/g)-ccgg-(t/c)-3' | |
| SU1694647A1 (en) | Strain of bacteria bacillus brevis - a producer of restrictase bbvi 21 | |
| RU2054040C1 (en) | Strain of bacterium bacillus coagulans - a producer of site-specific endonuclease which recognizes and splits the nucleotide sequence 5′-ctcttc-3′ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140617 |