SU1761804A1 - Strain of bacteria bacillus coagulants - producer of restriction endonuclease bco ai - Google Patents
Strain of bacteria bacillus coagulants - producer of restriction endonuclease bco ai Download PDFInfo
- Publication number
- SU1761804A1 SU1761804A1 SU904896776A SU4896776A SU1761804A1 SU 1761804 A1 SU1761804 A1 SU 1761804A1 SU 904896776 A SU904896776 A SU 904896776A SU 4896776 A SU4896776 A SU 4896776A SU 1761804 A1 SU1761804 A1 SU 1761804A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- biomass
- bcoal
- restrictase
- restriction endonuclease
- enzyme
- Prior art date
Links
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title description 2
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 title 1
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 claims abstract description 11
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 6
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 abstract description 5
- 238000005273 aeration Methods 0.000 abstract description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical class N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical class [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 abstract description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 abstract description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 229910052500 inorganic mineral Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000011707 mineral Chemical class 0.000 abstract description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 230000007064 DNA hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000122973 Stenotrophomonas maltophilia Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229940099259 vaseline Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Использование: биотехнологи и в практике молекул рно-генетических и генноин- женерных работ. Сущность изобретени : продуцент B.coagulans ВКМ В-732 выращивают при аэрации в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выдел ют из полученной биомассы известными методами . Биомасса B.coagulans ВКМ В-732 содержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу BcoAl, узнающую и расщепл ющую последовательность ДН К 5 С-А-С G-T-G 3, в количествах, достаточных дл получени рестриктазы в препаративных количествах, содержание рестриктазы BcoAl в биомассе 6000-8000 ед/г сырой биомассы . Дл изошизомера BcoAl, рестриктазы PmaCl, выход очищенного фермента 20 ед на 1 г сырого веса биомассы. Выход очищенного препарата эндонуклеазы рестрикции BcoAl составл ет 700-1 200 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что в 35-60 раз превышает известные цифры дл рестриктазы PmaCl. Эндонуклеаза рестрикции BcoAl не содержит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и неспецифических эндонукле- аз. oW ЁThe use of: biotechnologists and in the practice of molecular genetic and genetic engineering works. SUMMARY OF THE INVENTION: B.coagulans producer VKM B-732 is grown by aeration in a nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts, until the late logarithmic growth phase, the target product is isolated from the biomass obtained by known methods. B.coagulans VKM B-732 biomass contains a new site-specific endonuclease BcoAl, recognizing and cleaving the sequence DN K 5 C-A-C GTG 3, in quantities sufficient to produce restrictase in preparative quantities, the content of BcoAl restrictase in biomass is 6000- 8000 u / g raw biomass. For an isoschizomer BcoAl, restriction enzyme PmaCl, the yield of the purified enzyme is 20 units per gram of wet weight of biomass. The yield of the purified BcoAl restriction endonuclease preparation is 700-1,200 units. activity per 1 g of raw biomass, which is 35-60 times higher than the known figures for PmaCl restrictase. The BcoAl restriction endonuclease does not contain impurities of phosphatases, exonucleases and non-specific endonucleases. oW Yo
Description
Изобретение относитс к области биотехнологии и может быть использовано в молекул рно-генетических и генноинже- нерных работах.The invention relates to the field of biotechnology and can be used in molecular genetic and genetic engineering works.
Сайт-специфические эндонуклеазы (синонимы: рестриктазы II класса, эндонуклеазы рестрикции) нашли широкое применение в качестве уникального инструмента исследовани в молекул рном клонировании, структурных исследовани х ДНК, разработке подходов к диагностике наследственных заболеваний у человека, вл ютс удобной моделью дл изучени механизмов ДНК- белковых взаимодействий.Site-specific endonucleases (synonyms: class II restrictases, restriction endonucleases) are widely used as a unique research tool in molecular cloning, DNA structural studies, the development of approaches to the diagnosis of hereditary diseases in humans, are a convenient model for studying DNA protein interactions.
К насто щему времени обнаружено и охарактеризовано более 1300 рестриктаз, одна из которых PmaCl выделена из Pseudomonas maltophila CB50P /1/. Фермент гидролизует ДНК фага Я в 3 участках, аденовируса Ad2 в 10 и не расщепл ет ДНК обезь ннего вируса SV40, ДНК и плазмиду pBR322 /2/.To date, more than 1,300 restriction enzymes have been detected and characterized, one of which is PmaCl isolated from Pseudomonas maltophila CB50P / 1 /. The enzyme hydrolyzes the DNA of phage I in 3 sites, the adenovirus Ad2 in 10 and does not cleave the DNA of the monkey virus SV40, the DNA and the plasmid pBR322 / 2 /.
Содержание рестриктазы PmaCl в биомассе не указано, а выход очищенного препарата фермента составл ет около 20 ед активности на 1 г биомассы.The content of PmaCl restrictase in biomass is not indicated, and the yield of the purified enzyme preparation is about 20 units of activity per 1 g of biomass.
Целью изобретени вл етс получение штамма бактерий, продуцирующего новуюThe aim of the invention is to obtain a strain of bacteria producing a new
VI (VI (
СОWITH
о about
рестриктазу BcoAl со специфичностью 5 ... С-А-С G-T-G ... 3 с высоким выходом фермента .restrictase BcoAl with a specificity of 5 ... C-A-C G-T-G ... 3 with a high yield of the enzyme.
Поставленна задача достигаетс тем, что биомассу B.coagulans BKM В-732 выращивают при аэрации в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выдел ют из полученной биомассы известными методами.The task is achieved by the fact that the biomass of B.coagulans BKM B-732 is grown by aeration in a nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts until the late logarithmic growth phase, the target product is isolated from the obtained biomass by known methods.
Рестриктаза BcoAl - изошизомер PmaCI, узнает и расщепл ет участок нукле- отидной последовательности ДНК 5 ... С-А- С G-T-G ... З1. Фермент гидролизует ДНК фага А по 3 участкам, ДНК аденовируса Ad2 по 10 и не имеет сайтов узнавани на ДНК обезь ннего вируса SV40, ДНК фага0 Х174 и плазмиде pBR322.The BcoAl restriction enzyme, PmaCI isoshizomer, recognizes and cleaves a region of the nucleotide DNA sequence 5 ... C-A-C G-T-G ... H1. The enzyme hydrolyzes phage A DNA at 3 sites, the DNA of adenovirus Ad2 10 each, and has no recognition sites for the monkey virus SV40, the phage0 X174 DNA and the plasmid pBR322.
Поиск штамма продуцента проводили с использованием толуольного экспресс-метода тестировани рестриктазной активности в клетках микроорганизмов с последующим электрофоретическим разделением продуктов гидролиза ДНК в геле агарозы. Всего обследовано 48 штаммов, относ щихс к родам Bacillus.The search for a producer strain was carried out using a toluene express method for testing restriction enzyme activity in microorganism cells, followed by electrophoretic separation of the products of DNA hydrolysis in an agarose gel. A total of 48 strains belonging to the genera of Bacillus were examined.
Штамм B.coagulans BKM В-732 получен из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов АН СССР, где хранитс под № ВКМ В-732 «-ССМ 3557.The B.coagulans strain BKM B-732 was obtained from the All-Union Collection of Microorganisms of the Academy of Sciences of the USSR, where it is stored under the number VKM B-732 "-CCM 3557.
Характеристика штамма.Characteristics of the strain.
Морфологические особенности. Клетки палочковидные, пр мые или почти пр мые, подвижны, образуют споры. Грамположи- тельные.Morphological features. Cells are rod-shaped, straight or almost straight, motile, forming spores. Gram-positive.
Культурально-биохимические свойства. На скошенном агаре рост по штриху обильный . На чашках Петри с м со-пептонным агаром колонии крупные, матовые. На м со- пептонном бульоне и бульоне Хсттингера равномерное помутнение, осадок.Cultural and biochemical properties. On sloped agar, growth by stroke is abundant. On the Petri dishes with m-peptone agar, the colonies are large, dull. On m and peptone broth and Hsttinger broth, uniform turbidity, sediment.
отношение к кислороду - строгий аэроб.attitude to oxygen - strict aerobic.
Каталаза +,Catalase +,
Индол -,Indole -,
На глюкозе - кислота +, газ -,On glucose - acid +, gas -,
Желатина уколом - разжижение.Gelatin injection - thinning.
Оптимальные услови выращивани и хранени культуры.Optimum growing and storage conditions.
Культура Bacillus coagulans BKM В-732 хорошо растет на твердых и жидких полноценных питательных средах: м со-пептон- ном бульоне, среде LB, бульоне Хоттингера.The culture of Bacillus coagulans BKM B-732 grows well on solid and liquid high-grade nutrient media: medium with peptone broth, LB medium, Hottinger broth.
Оптимальные значени температуры и рН роста культуры наход тс при 37° С и рН 7,2-7,4.The optimum temperature and pH of culture growth are at 37 ° C and pH 7.2-7.4.
Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу BcoAl, достигаетс при вы- ращивании штамма-продуцента вThe highest yield of biomass containing BcoAl restriction enzyme is achieved by growing the producer strain in
ферментере при 37° С в аэробных услови х на питательной среде Хоттингера, котора содержит в 1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера; 5 г NaCI; 1 г К2НР04 и до 1 лthe fermenter at 37 ° C under aerobic conditions on the Hottinger nutrient medium, which contains in 1 liter: 250 ml of Hottinger basic formula; 5 g of NaCl; 1 g of K2HP04 and to 1 l
воды. Выращивание прекращают в конце логарифмической фазы роста, когда рост достигает ,5-1,7. Выход биомассы 7-8 г/л.water. Growing stops at the end of the logarithmic growth phase, when growth reaches 5-1.7. Biomass yield 7-8 g / l.
На рыбной среде культура растет плохоThe culture of the fish grows poorly
(при 18-часовой ферментации на качалке ,3).(at 18-hour fermentation on the rocking chair, 3).
Ферментацию культуры провод т после добавлени в ферментер инокул та в соотношении 1:10 к объему среды.Fermentation of the culture is carried out after the inoculum is added to the fermenter in a ratio of 1:10 to the volume of the medium.
Рабочие культуры пересевают на м сопептонный бульон или среду Хоттингера один раз в 8-10 дней.Working cultures are subcultured on a mint broth or medium of Hottinger once in 8-10 days.
Хран т культуру в полужидком м со- пептонном агаре под вазелиновым масломThe culture is stored in semi-liquid and peptone agar under vaseline oil.
или в лиофилизированном виде в ампулах.or in a lyophilized form in ampoules.
Выделение рестриктазы BcoAl провод т фракционированием бесклеточных экстрактов двухфазной системе полиэтиленгли- коль/декстран и хроматографией на колонкахIsolation of BcoAl restrictase was carried out by fractionating cell-free extracts with a two-phase polyethylene glycol / dextran system and column chromatography.
с ионообменниками.with ion exchangers.
Инкубационна смесь дл определени активности рестриктазы BcoAl объемом 30- 50 мкл содержит: 0,01 М трис-HCI буфер, рН 7,5, 0,01 М MgCl2, 0,1 М NaCI, 0001 М дитиотреитола , 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 1 мкг ДНК фага А и 0,2-2 мкл фермента, Инкубацию провод т при 37° С в течение 60 мин. Продукты расщеплени ДНК фага А анализируют электрофоретически в 0,8-1 % агарозном геле с последующим прокрашиванием гел в бромистом этидии. За единицу активности рестриктазы BcoAl принимают количество фермента (в мкл), которое за 1 ч инкубации полностьюThe incubation mixture for determining the activity of BcoAl restriction enzyme with a volume of 30-50 μl contains: 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.5, 0.01 M MgCl2, 0.1 M NaCl, 0001 M dithiotreitol, 100 μg / ml bovine serum albumin, 1 µg of phage A DNA and 0.2-2 µl of the enzyme. Incubation is carried out at 37 ° C for 60 minutes. Phage A DNA digestion products are analyzed by electrophoresis in a 0.8-1% agarose gel, followed by staining of the gel in ethidium bromide. Per unit of activity restrictase BcoAl take the amount of enzyme (µl), which for 1 hour of incubation completely
гидролизует 1 мкг ДНК фага А при оптимальных услови х реакции.hydrolyzes 1 µg of phage A DNA under optimal reaction conditions.
Пример Культуру B.coagulans BKM В-732 предварительно адаптируют в течение ночи при 37° С в услови х аэрации наExample B.coagulans BKM B-732 culture is pre-adapted overnight at 37 ° C under aeration conditions on
основной питательной среде, содержащей в 1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера: 5 г NaCI; 1 г К2НР04; до 1 л НаО. Инокул т дл посева в ферментер готов т, пересева адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10 и размножают в услови х аэрации.basic nutrient medium containing in 1 liter: 250 ml of Hottinger's basic formula: 5 g of NaCI; 1 g of K2HP04; up to 1 l Nao. The inoculum for sowing into the fermenter is prepared by replanting an adapted culture in 1 liter of fresh medium at a rate of 1:10 and propagated under aeration conditions.
Ферментацию культуры провод т после добавлени в среду инокул та в соотношении 1:10 к объему среды в услови х аэрацииThe culture is fermented after inoculum is added to the medium at a ratio of 1:10 to the volume of the medium under aeration conditions.
при температуре 37° С; рН среды 7,2-7,4.at a temperature of 37 ° C; pH of 7.2-7.4.
Во врем выращивани рН культураль- ной жидкости поддерживают в пределах 7,0-7,6.During cultivation, the pH of the culture liquid is maintained within the range of 7.0-7.6.
Выращивание продолжают до достижени конца логарифмической фазы роста.Growing is continued until the end of the logarithmic growth phase is reached.
Выход сырой биомассы составл ет 7-8 г/л культуральной жидкости.The yield of raw biomass is 7-8 g / l of culture liquid.
Содержание рестриктазы ВсоА в биомассе составл ет 6000-8000 ед/г микробной массы.The VCOA restrictase content in biomass is 6000-8000 U / g microbial mass.
Выделение рестриктазы ВсоАThe allocation of restrictase VsoA
10 г биомассы B.coagulans BKM В-732 суспендируют в буферном растворе, клетки разрушают ультразвуком при температуре + 2-4° С и клеточную суспензию центрифугируют в течение 60 минут при 105 000 д. Осадок, содержащий клеточные оболочки и неразрушенные клетки, отбрасывают, а присутствующий в супернатанте фермент фракционируют в двухфазной системе полиэтиленгли- коль/декстран. Обогащенную по рестриктазе ВсоА верхнюю фазу хроматографируют в ка- лцй-фосфатном буфере в градиенте концентрации KCI на колонках с ДЭАЭ-сефарозой CL-6B и с фосфоцеллюлозой РП.10 g of biomass of B. coagulans BKM B-732 are suspended in a buffer solution, the cells are destroyed by ultrasound at a temperature of + 2-4 ° C, and the cell suspension is centrifuged for 60 minutes at 105 000 d. The pellet containing the cell membranes and intact cells are discarded, and the enzyme present in the supernatant is fractionated in a two-phase polyethylene glycol / dextran system. The VCOA-enriched upper phase is chromatographed in calcium phosphate buffer in a KCI concentration gradient on columns with DEAE-Separate CL-6B and with RP phosphocellulose.
Получают 12000 ед. активности фермента в 2 мл буфера с 50% глицерином. Выхрд очищенного препарата рестриктазы ВсоА составл ет 1200 ед на 1 г сырого веса биомассы . Препарат фермента стабильно сохран ет активность в течение 9-12 мес цев при хранении при -20° С.Earn 12,000 units. enzyme activity in 2 ml of buffer with 50% glycerol. The yield of the purified VsoA restrictase preparation is 1200 units per gram of wet weight of biomass. The enzyme preparation stably maintains activity for 9–12 months when stored at –20 ° C.
Фермент не содержит примесей фосфа- таз, экзонуклеаз и неспецифических эндо- нуклеаз и пригоден дл молекул рного клонировани и изучени структуры ДНК.The enzyme does not contain impurities of phosphatases, exonucleases and nonspecific endonucleases and is suitable for molecular cloning and studying the structure of DNA.
П р и м е р 2. Культивирование штамма B.coagulans BKM В-732 провод т аналогично описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду LB, котора содержит в 1PRI mme R 2. The cultivation of the B. Coagulans BKM B-732 strain is carried out as described in Example 1, except that LB medium containing 1 is used as the nutrient medium.
л: 10 гтриптона; 10 г дрожжевого экстракта; 10 г NaCI; до 1 л воды.l: 10 gtryptona; 10 g yeast extract; 10 g NaCl; up to 1 liter of water.
Выход биомассы 5-6 г/л культуральной жидкости.Biomass yield 5-6 g / l of culture fluid.
После проведени очистки фермента, какAfter purification of the enzyme, as
описано выше, выход рестриктазы ВсоА составл ет 700-900 ед. активности/г сырого веса биомассы.as described above, the yield of VCOA restrictase is 700-900 units. activity / g wet weight of biomass.
Таким образом, по предлагаемому спо- собу получают новую эндонуклеазу рестрикции BcoAI.Thus, according to the proposed method, a new BcoAI restriction endonuclease is obtained.
Биомасса штамма B.coagulans BKM B-732 содержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу BcoAI, узнающую и расщепл ющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 ... С-А-С G-T-G ... 3 в количествах, достаточных дл получени рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы BcoAI в биомассе 6000-8000 ед/г.The biomass of the B. coagulans strain BKM B-732 contains the new site-specific endonuclease BcoAI, which recognizes and cleaves the nucleotide DNA sequence 5 ... C-A-C GTG ... 3 in quantities sufficient to produce restrictase at preparative scales: content BcoAI restrictases in biomass of 6000-8000 units / g.
Выход очищенной рестриктазы PmaCI,The output of the purified restrictase PmaCI,
изошизомера BcoAI, 20 ед/г микробной массы .BcoAI isoschizomer, 20 u / g microbial mass.
Дл рестриктззы ВсоА выход очищенного фермента составл ет 700-1200 ед ак- тавности на 1 г сырой биомассы, что в 35-60 раз превышает указанные цифры дл рестриктазы PmaCi (50 ед).For the VCOA restriction enzyme, the yield of the purified enzyme is 700-1,200 units of relevance per 1 g of raw biomass, which is 35-60 times higher than the indicated figures for PmaCi restrictase (50 units).
Эндонуклеаза рестрикции ВсоА не содержит примесей фосфзтаз и неспецифиче- ских нуклеаз.The VCOA restriction endonuclease does not contain phosphortase or non-specific nuclease impurities.
Учитыва особенности строени участка узнавани рестриктазы BcoAI и его локализации на векторных молекулах ДНК, новый фермент может быть использован в молекул рно-генетических и биотехнологических работах.Taking into account the structural features of the BcoAI restriction enzyme recognition site and its localization on vector DNA molecules, the new enzyme can be used in molecular-genetic and biotechnological work.
ф ормула изобретени Штамм бактерий Bacillus coagulans BKM B-732 - продуцент рестриктазы Всо AI.Formula of the invention Bacillus coagulans bacterial strain BKM B-732 producing the restriction enzyme VCO AI.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU904896776A SU1761804A1 (en) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | Strain of bacteria bacillus coagulants - producer of restriction endonuclease bco ai |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU904896776A SU1761804A1 (en) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | Strain of bacteria bacillus coagulants - producer of restriction endonuclease bco ai |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1761804A1 true SU1761804A1 (en) | 1992-09-15 |
Family
ID=21552287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU904896776A SU1761804A1 (en) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | Strain of bacteria bacillus coagulants - producer of restriction endonuclease bco ai |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1761804A1 (en) |
-
1990
- 1990-12-27 SU SU904896776A patent/SU1761804A1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Walker J.N.B., Dean P.D.G., Saunders J.R., Nucleic Acids Research, 1986, v. 14. p. 1293-1301. Roberts R.J., Nucleis Acids Research, 1988, v. 16, p. r. 271-313. Авторское свидетельство СССР № 1170777, кл. С 12 N 9/14,1983. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS61212285A (en) | Xylose isomerase | |
| CA1209069A (en) | Microorganisms of the genus pseudomonas and process for degrading compounds which contain methyl groups in aqueous solutions | |
| SU1761804A1 (en) | Strain of bacteria bacillus coagulants - producer of restriction endonuclease bco ai | |
| CA1188643A (en) | Production of aryl acylamidases | |
| SU1707077A1 (en) | Method of restictase bsp di preparation | |
| SU1761803A1 (en) | Strain of bacteria bacillus alvei - producer of restriction endonuclease bav bii | |
| US4430432A (en) | Endo-deoxyribonuclease and process for the production thereof | |
| SU1712415A1 (en) | Method of restrictase bbv ai preparation | |
| SU1678833A1 (en) | Strain of bacteria bacillus alvei - a producer of restrictase bavi | |
| SU1832129A1 (en) | Strain of bacterium bacillus brevis - a producer of endonuclease restriction bbv bi | |
| SU1648976A1 (en) | Bacterial strain achromobacter agile: producer of restrictase aag 5251 | |
| SU1678832A1 (en) | Strain of bacteria lactobacillus plantarum - a producer of restrictase lpli | |
| SU1659480A1 (en) | Strain of bacterium klebsiella pneumoniae - a producer of restrictase kpn 378 1 | |
| RU2044055C1 (en) | Strain of bacterium klebsiella azeanae - a producer of restriction endonuclease kaz 48 ki | |
| SU1532583A1 (en) | Strain of paracoccus denitrificans bacteria as producer of endonuclease of restriction pde 12 i | |
| SU1449583A1 (en) | Strain of bacillus subtilis bacteria as producer of restriction endonuclease bsu 151 | |
| RU2044054C1 (en) | Strain of bacterium escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 110 ki | |
| RU2044053C1 (en) | Strain of bacterium escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco27k1 | |
| RU2070925C1 (en) | Strain of bacterium escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 71 ki | |
| SU1095645A1 (en) | Method of producing restriction endonuclease | |
| RU2500812C1 (en) | Recombinant bacillus licheniformis bacteria strain-producer of heat-resistant lipase | |
| SU1514774A1 (en) | Strain of meoraxella species bacteria as producer of site-specific endonuclease | |
| SU1618760A1 (en) | Strain of escherichia coli bacteria as producer of restrictase | |
| RU2053298C1 (en) | Strain of bacterium escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 75 ki | |
| SU1738853A1 (en) | Method for preparation of micrococcus luteus vkpm-2836 biomass - a producer of restrictase mlui |