SK279615B6

SK279615B6 - Alkaloidy z mappia foetida, spôsob ich výroby, ich

Info

Publication number: SK279615B6
Application number: SK834-94A
Authority: SK
Inventors: Ezio Bombardelli; Giuseppe Mustich; Luisella Verotta
Original assignee: Indena S.P.A.
Priority date: 1994-05-30
Filing date: 1994-07-12
Publication date: 1999-01-11
Also published as: EP0685481A2; ATE159527T1; JPH07330772A; NO179640B; RU94026100A; HU9402089D0; ES2081783T3; ITMI941112A0; KR950032253A; NO942633L; ES2081783T1; CA2127763A1; JP3615240B2; PL304577A1; FI943294L; NO179640C; GR960300006T1; US5525609A; HU216844B; IT1269862B

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka nových alkaloidov z Mappia foetida, ich terapeutického použitia a prípravkov, ktoré ich obsahujú.

Doterajší stav techniky

Alkaloidy podľa predkladaného vynálezu majú nasledujúci vzorec (I):

foetidín 1 : R = H foetidín 2 : R = OCH₃

Po ovplyvnení kyselinou alebo bázou, alebo hydrolytickými enzýmami, foetidíny 1 a 2 kvantitatívne uvoľňujú jednak známy alkaloid camptotecín, molekulu, ktorá bola široko farmakologicky i klinicky testovaná sama o sebe, či vo forme derivátov, na použitie v onkológii a na liečenie vírusových ochorení, alebo 9-metoxycamptotecín s rovnakým využitím.

bol prvý krát izolovaný, spolu s ďalšími zlúčeninami, z Camptoteca acuminata (Nyssaceae) a z iných rastlín, vrátane Mappia foetida (Olinaceae); aj keď bol neskôr dlhodobo študovaný, ďalším chemickým testovaním boli prekvapivo nájdené nové alkaloidy, z ktorých môže camptotecín vzniknúť až pri spracovávaní surových rastlinných extraktov.

Medzi zlúčeninami, z ktorých vzniká camptotecín, je vďaka svojmu pomerne vysokému obsahu v rastline zvlášť významný foetidín 1. Vyjasnenie jeho štruktúry pomocou spektroskopickej analýzy a chemickým odbúravaním viedlo k identifikácii zlúčeniny, charakterizovanej prítomnosťou spermidínovej jednotky, dvojito esterifikovanej kyselinou kumarovou, ktorá je naopak sama esterifikovaná otvorenou camptotecínovou jednotkou (pozri vzorec (I)). Túto zlúčeninu obsahujú všetky časti rastliny, ale najmä semená a korene, v množstve 0,1 a 0,5 %. V porovnaní s camptotecínom má výhodu ľahkej rozpustnosti vo vode pri slabo kyslom pH; camptotecín je naopak celkom nerozpustný vo vode i vo všetkých biologicky prijateľných nosičoch, preto bolo venované značné úsilie možnosti čiastočnej syntézy na odstránenie tohto nedostatku.

Podstata vynálezu

Foetidín 1 je získavaný extrakciou rôznych časti rastliny alifatickými alkoholmi a ketónmi s nízkou molekulovou váhou, samotnými, alebo v zmesi s vodou pri laboratórnej teplote. Extrakty sú pri nízkej teplote, najlepšie pod 25 °C a vo vákuu, koncentrované, organické rozpúšťadlo je odstránené a vodný koncentrát je extrahovaný chlórovanými rozpúšťadlami na extrakciu slabo zásaditých alkaloidov, okrem iných i camptotecínu, 9-metoxycamptotecínu a mappicinu. Vodná fáza je potom extrahovaná n-butanolom alebo s vodou nemiešateľnými alkoholmi, ktoré sú potom do sucha vákuovo odparené pri nízkej teplote. Zvyšok, získaný z butanolových extraktov, je vyčistený na silikagéli alebo podobných adsorbentoch s použitím zmesi chlórovaných rozpúšťadiel, najlepšie metylénchloridu, a alifatických alkoholov, najlepšie metanolu alebo etanolu, ako eluentu. Prednostne sa používajú zmesi v pomere 4 : 1 až 1 : 1. Frakcie, obsahujúce alkaloidy podľa vynálezu, sú spájané, zahustené do sucha a vzniknutý zvyšok je ďalej čistený pomocou preparatívnej HPLC, napríklad použitím kolóny LiChroprep RP8 a eluentu, tvoreného gradientom zmesi metanol/voda, od pomeru metanol/voda 1 : 1 až k čistému metanolu. Frakcie obsahujúce alkaloid, sú za nízkej teploty a vo vákuu zahustené a vodný koncentrát je lyofilizovaný. Čisté alkaloidy sú získané kryštalizáciou.

Výsledné zlúčeniny boli podrobené biologickému testovaniu na líniách ľudských nádorových buniek (z vaječníkov, prsu, čreva, pľúc odolným i neodolným proti protinádorovým liekom a podobne) a na niektorých kmeňoch vírusov. O camptotecíne, alebo lepšie o niektorých z jeho derivátov, je v skutočnosti známe, že prejavujú cytotoxickú aktivitu, ktorá je spojovaná s inhibíciou topoizomerázy I a II.

Cytotoxicita, napríklad proti bunkovej línii črevného karcinómu, je zrejmá približne v koncentrácii 25 nM. Protivírusová aktivita foetidínu 1, aj keď v závislosti od rôznej odolnosti kmeňov, sa prejavuje v koncentráciách od 1 do 100 ng/ml. Foetidín 2, líšiaci sa od foetidínu 1 prítomnosťou metoxylu v polohe 9, pôsobí podobne. Ako citlivé na alkaloidy podľa vynálezu sa prejavili herpes vírus, cytomegalovírus a vírusy HIV.

Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť súčasťou všetkých druhov farmaceutických prípravkov, ale predovšetkým môžu byť ľahko podávané parenterálne vo vodnom roztoku a pri pH zlučiteľnom s krvou, bez toho, že by spôsobovali ťažkosti ako zrážanlivosť či nezlučiteľnosť. V prípravkoch môžu byť použité všetky bežné pomocné látky. Dávkovanie týchto nových alkaloidov môže byť v rozmedzí od 0,5 mg do 200 mg v jednej dávke a liečebnom cykle. Dávky približne 50 mg/m² boli overené ako základne účinné.

Ďalej uvedené príklady ilustrujú vynález bez toho, že by obmedzovali jeho rozsah.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava foetidínu 1 zo semien Mappia foetida kg jemne pomletých semien Mappia foetida sa trojnásobne extrahuje 50 1 acetónu za miešania a laboratórnej teploty; spojené acetónové extrakty sú vákuovo zahustené na 10 1 a výsledný koncentrát je zriedený 10 1 roztoku 1% kyseliny citrónovej. Nerozpustné zložky sú odstránené fil2 tráciou, zatiaľ čo vodno-acetónová fáza je extrahovaná metylénchloridom až do vyčerpania látok, z ktorých možno extrahovať alkaloidy (camptotecín, metoxycamptotecín a podobne). Vodno-acetónová fáza jc koncentrovaná na vodu a po neutralizácii pri pH 7,5 sa extrahuje n-butanolom na vyčerpanie foetidínu 1 a 2. Roztok n-butanolu je zahustený a vzniknutý zvyšok je vysušený so ziskom približne 200 g butanolovej frakcie, ktorá je frakcionovaná nasledovne: 30 g butanolovej frakcie sa chromatografuje s použitím 500 g silikagélu tak, že je kolóna najprv premytá zmesou metylénchlorid/metanol v pomere 4:1a následne zmesou týchto látok v pomere 7 : 3. Produkt nachádzajúci sa vo frakcii, eluovanej zmesou s pomerom 7 : 3, je čistený na kolóne LiChroprep RP8 elúciou gradientom metanol/voda. Frakcie obsahujúce foetidíny 1 a 2 sú spojené, vákuovo odparené do sucha pri teplote nižšej ako 30°C a zvyšok je prekryštalizovaný zo zmesi acetón/hexán. Získa sa tak 5,1 g foetidínu 1 s nasledujúcimi charakteristikami: bod topenia 157 - 158 °C, a_d = -37.9 (c = 0,31, MeOH).

1_H-NMR < 300 MHz, DHSO d_fi) 8.60 (1H, s, H-7), 8.19 (1H, t, J=5.2, H-10'), S·³⁵ <^1H- ^d' ^J=⁸·⁶' H-12), 8.05 (1H, d, J=8.6, H-9), 8.04 (1H, t, J=5.2, H-19'), 7.80 (IK, t, J=7.8, H-11), 7.65 (1H, t, 3=7.8, H-10), 7.35 (2H, d, J=8.6, H-3'+H-5'), 7.34 (2H, d, J=8.6, H-24'+H-28¹), 7.29 (1H d, J=15.S,H-7') , 7.28 (1H, d, J = 15.8, H-22'), 6.76 (4H, d, J=8.6 H-2'tH-6'+H-25’4H-27'), 6.36 (1H, d,3=15.8, H-ä'), 6.35 (1H, d, J=15.8, Η-21'l, ⁸·⁵⁸. 5.41 (2H, systém AB, 3=10.6, H-17), 5.18Ϊ2Η, s, H-5)> 3.21 (2H, m, H-lľ), 3.13 (2H, m, H-18'), 2.84 (4H, bt, J=7.2, H-l3¹+H-15‘), 2.02 (1H, m, H-19A), 1.96 (3H, s, CH^CO), 1.90 (1H, m, H-19B), 1.74 (2H, m, Η-12'l, 1-55 (2H, m, H-16'), 1-46 m, H-17' ) , 0.84 (3H, t,

J=7.2, H-18) ¹³C-HMR (78.1 MHZ, DHSO d6) 6: 175.23 (s, C-21), 170.81 (s, CKjCO), 166.27 (s, C-9'), 165.83 (s, C-20'), 161.43 (s, C-16a), 159.40 (s, C-l'), 159.14 (s, C-15), 153.50 (s, C-2), 148.36 (s, C-13), 143.56 (s, C-3), 139.37 (d, C-7), 139.06 (d, C-22'|, 131.74 (d, C-l}, 130.58 (d, C11), 130.33 (s, C-6), 129.63 (s, C-3'f C-5’), 129.56

(d,	C-	24'*	C-20' ) , 129.40 (d, C-l2 )	, 128.83 (d, C-9),
128	.23	(s,	C-8), 127.73 (d, C-10),	126.23	(d, C-4'l,
126	.13	(s.	C-23'), 123.42 (s, C-16J,	119.01	(d, C-8'1,
11B	.68	(6,	C-2ľ), 116.18 C-2 ’+C-6 ’-f C·	-25'.C-27'),
100	.68	(d,	C-14), 80.28 (d, C-20),	59.87	(t, C-17),
50 .	45	(t,	C-5), 47.23 (t, C-13’},	45.36	(t, C-15'),
38.	41		C-18 ), 36.36 (t, C-lľ),	33.40	(t, C-19),
26.	99	(t,	C-12'), 26.87 (t, C-17¹),	24.04	(t, C-16·J,
21.	22 '	(q, CH₃CO), 9.29 (q, C-18)

Foetidín 2 (1,2 g), získaný kryštalizáciou z materských lúhov foetidínu 1 čistením na reverznej fáze s použitím rovnakého chromatografického eluentu, má nasledujúce charakteristiky:

bod topenia 172 - 174°C, a_d = -44,6 (c = 0,35, MeOH). NMR spektrum je kópiou foetidínu 1, okrem signálu -OCH₃ na aromatickom kruhu pri 3,2 ppm.

Príklad 2

Príprava lyofilizovaných liekoviek s foetidínom 1

5g foetidínu 1 je rozpustených v 500 ml destilovanej vody obsahujúcej 1,2 g kyseliny citrónovej. Roztok je prefiltrovaný, sterilizovaný a v sterilnej miestnosti naplnený do 100 liekoviek, ktoré sú rýchlo zmrazené a lyofilizované.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY
2. Alkaloidy podľa nároku 1, foetidín 1, kde R je vodík.
3. Alkaloidy podľa nároku 1, foetidín 2, kde R je metoxyskupina.
4. Spôsob prípravy alkaloidov podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledujúce kroky:

a) extrakciu rôznych častí rastliny alifatickými alkoholmi a ketónmi s nízkou molekulovou váhou, samotnými alebo v zmesi s vodou pri laboratórnej teplote;

b) vákuové zahustenie extraktov pri teplote nižšej ako 25 °C;

c) extrakciu vodného acetónového koncentrátu, získaného odstránením organického rozpúšťadla, chlórovanými rozpúšťadlami, na extrahovanie slabo zásaditých alkaloidov;

d) extrakciu vodnej fázy n-butanolom alebo s vodou nemiešateľnými alkoholmi;

e) čistenie butanolových extraktov, získaných zahustením pri nízkej teplote vo vákuu, chromatografiu na silikagéli alebo podobných adsorbentoch, s použitím zmesi chlórovaných rozpúšťadiel a alifatických alkoholov ako rozpúšťadiel;

f) zahustenie frakcií obsahujúcich alkaloidy do sucha a vyčistenie zvyšku pomocou preparatívnej HPLC, ktorá používa ako eluent gradient metanol/voda od pomeru metanol/voda 1 : 1 až po čistý metanol;

g) lyofilizáciou vzniknutých vodných extraktov a kryštalizáciu čistých alkaloidov.
5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že v kroku e) sú metylénchlorid a metanol alebo etanol jednotlivo použité ako chlórované rozpúšťadlá a alifatické alkoholy, a to v zmesiach 4 : 1 až 1 : 1.
6. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, ževkrokuf)jepoužitákolónaLiChroprepRP8.
7. Farmaceutické prostriedky, vyznačujúce sa tým, že obsahujú ako aktívnu prísadu jednu zlúčeninu podľa nárokov 1 až 3.
8. Použitie alkaloidov podľa nárokov 1 až 3 na výrobu liečiv s antivírusovým účinkom.
9. Použitie alkaloidov podľa nárokov 1 až 3 na výrobu liečiva s protinádorovým účinkom.