PL177042B1

PL177042B1 - Nowe alkaloidy i sposób ich wytwarzania oraz środek farmaceutyczny

Info

Publication number: PL177042B1
Application number: PL94304577A
Authority: PL
Inventors: Ezio Bombardelli; Giuseppe Mustich; Luisella Verotta
Original assignee: Indena Spa
Priority date: 1994-05-30
Filing date: 1994-08-05
Publication date: 1999-09-30
Also published as: SK83494A3; ITMI941112A0; GR960300006T1; IT1269862B; PL304577A1; RU2123005C1; FI943294L; JP3615240B2; DE69406430D1; ES2081783T3; GR3025120T3; DK0685481T3; DE685481T1; RU94026100A; CN1121075A; CN1052233C; NO942633D0; NO942633L; FI106202B; CZ290320B6

Abstract

1. Nowe alkaloidy o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru lub grupe metoksylowa. Wzór 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe alkaloidy z Mappia foetida i sposób ich wytwarzania oraz środek farmaceutyczny zawierający te alkaloidy.

Alkaloidy według wynalazku są to związki o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru lub grupę metoksylową. Związek o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, to foetydyną 1, a związek o wzorze 1, w którym R oznacza grupę metoksylową, to foetydyną 2.

W wyniku działania kwasów lub zasad albo enzymów hydrolitycznych foetydyny 1 i 2 uwalniają albo znany alkaloid kamptotecynę, który jako taki lub w postaci pochodnych szeroko zbadano farmakologicznie i klinicznie w dziedzinie onkologii i leczenia pewnych chorób wirusowych, albo 9-metoksykamptotecynę, użyteczną przy innych wskazaniach.

Kamptotecynę o wzorze 2 wyodrębniono najpierw, wraz z innymi związkami, z Camptoteca acuminata (Nyssaceae) i z innych roślin, a wśród nich z Mappia foetida (Olinaceae). Jakkolwiek tę właśnie roślinę badano już przez długi czas, to dopiero obecnie nieoczekiwanie

177 042 odkryto nowe alkaloidy, z których powstaje kamptotecyna nawet w procesie obróbki surowych ekstraktów roślinnych.

Szczególnie ważnym związkiem spośród związków, z których powstaje kamptotecyna, jest foetydyna 1, z powodu jej stosunkowej obfitości w roślinie. Badania jej struktury drogą analizy spektroskopowej i degradacji chemicznej doprowadziły do zidentyfikowania związku, którego cechą charakterystyczną jest to, że ma ugrupowanie spermidyny podwójnie zestryfikowane kwasem kumarynowym, który z kolei jest zestryfikowany otwartym ugrupowaniem kamptotecyny (patrz wzór 1). Związek ten jest zawarty we wszystkich częściach roślin, ale zwłaszcza w nasionach i w korzeniach, w ilości 0,1-0,5%. W porównaniu z kamptotecyną ma on tę zaletę, że jest łatwo rozpuszczalny w wodzie przy słabo kwaśnym pH. Natomiast kamptotecyna jest zupełnie nierozpuszczalna w wodzie i we wszystkich biologicznie douszczalnych nośnikach, toteż w celu uniknięcia tej niedogodności czyniono intensywne starania na drodze półsyntezy.

Foetydyny otrzymuje się przez ekstrakcję różnych części rośliny alifatycznym alkoholem lub ketonem o niskiej masie cząsteczkowej, ewentualnie w mieszaninie z wodą, w temperaturze pokojowej. Ekstrakt zatęża się w niskiej temperaturze, korzystnie poniżej 25°C i pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozpuszczalnik organiczny usuwa się co najmniej częściowo, zatężony ekstrakt ewentualnie rozcieńcza się wodą i ekstrahuje się chlorowanym rozpuszczalnikiem, ekstrahując słabo zasadowe alkaloidy, a wśród nich kamptotecynę, 9-metoksykamptotecynę i mapicyny. Następnie fazę wodną ekstrahuje się n-butanolem lub innym alkoholem nie mieszającym się z wodą, a ekstrakt zatęża się do sucha w niskiej temperaturze i pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskaną pozostałość oczyszcza się na żelu krzemionkowym lub podobnym adsorbencie, stosując jako eluent mieszaniny chlorowanego rozpuszczalnika, korzystnie chlorku metylenu, i alkoholu alifatycznego, korzystnie metanolu lub etanolu. Korzystnie stosuje się mieszaniny o stosunku 4:1 do 1:1.

Frakcje zawierające alkaloidy według wynalazku łączy się, zatęża do sucha, a pozostałość dalej oczyszcza się drogą preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), stosując np. kolumnę LiChroprep RP 8 i prowadząc elucję gradientową przy użyciu metanolu/wody, rozpoczynając od mieszaniny metanol/woda o stosunku 1:1 aż do czystego metanolu. Frakcje zawierające alkaloidy zatęża się w niskiej temperaturze i pod zmniejszonym ciśnieniem, a wodny koncentrat liofilizuje się. Czyste alkaloidy otrzymuje się przez krystalizację.

Uzyskane związki poddano badaniom biologicznym na liniach ludzkich komórek, nowotworowych (jajnika, piersi, okrężnicy, płuc, opornych lub nie opornych na inne środki przeciwnowotworowe, itp.) i pewnych szczepach wirusów. W rzeczywistości wiadomo, że kamptotecyna, albo jeszcze lepiej niektóre z jej pochodnych, mają działanie cytotoksyczne związane z inhibitowaniem topoizomerazy DNA I i II.

Związki te wykazują cytotoksyczność, np. w przypadku linii komórek rakowych okrężnicy, w stężeniu około 25 nM. Działanie przeciwwirusowe foetydyny 1, jakkolwiek w odniesieniu do różnej oporności szczepów, występuje przy stężeniu 1-100 ng/ml. Foetydyna 2, która różni się od foetydyny 1 tym, że ma grupę metoksylową w pozycji 9, działa podobnie. Na alkaloidy według wynalazku wrażliwe są wirusy opryszczki, cytomegalowirusy i wirus HIV.

Związkom według wynalazku można nadawać postać środków farmaceutycznych wszystkich rodzajów, lecz przede wszystkim można je podawać drogą pozajelitową, w roztworach wodnych o pH zgodnym z krwią, bez takich problemów jak wytrącanie czy niekompatybilność. Do wytwarzania takich środków można stosować wszystkie znane zarobki farmaceutyczne. Nowe alkaloidy można podawać w ilości 0,5-200 mg na dawkę i cykl terapeutyczny. Dawki około 50 mg/m² okazały się prewencyjnie skuteczne.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady.

Przykład I. Wytwarzanie foetydyny 1 z nasion Mappia foetida kg drobno zmielonych nasion Mappia foetida wyekstrahowano 50 ml acetonu trzy razy, mieszając w temperaturze pokojowej. Połączone ekstrakty acetonowe zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do 10 l. Koncentrat rozcieńczono 10 l 1% roztworu kwasu cytrynowego. Substancje nierozpuszczalne odsączono i odrzucono, a fazę wodno-acetonową wyekstrahowano

177 042 przeciwprądowo chlorkiem metylenu do wyczerpania dających się wyekstrahować substancji alkaloidowych (kamptotecyna, 9-metoksykamptotecyna, itp.). Fazę wodno-acetonowązatężono do uzyskania fazy wodnej i koncentrat wyekstrahowano, po zobojętnieniu przy pH 7,5, n-butanolemdo wyczerpania foetydyn 1 i 2. Roztwór n-butanolowy zatężono, a pozostałość wysuszono i otrzymano około 200 g frakcji butanolowej, którą rozfrakcjonowano następująco. 20 g tej frakcji poddano chromatografii na 500 g żelu krzemionkowego, stosując jako eluent najpierw mieszaninę 4:1 chlorek metylenu/metanol a następnie mieszaninę 7:3 tych samych rozpuszczalników. Frakcje wyeluowane przy użyciu mieszaniny 7:3 oczyszczono w kolumnie LiChroprep RP 8, prowadząc elucję gradientową przy użyciu metanolu/wody. Frakcje zawierające foetydyny 1 i 2 połączono i zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze poniżej 30°C, a pozostałość poddano krystalizacji z acetonu/benzenu. Otrzymano 5,1 g foetydyny 1 o następującej charakterystyce: temperatura topnienia 157-158°C, ao = -37,9 (c = 0,31, CH3OH).

‘H-NMR (300 MHz, DMSO d₆), 8,60 (1H, s, H-7), 8,19 (1H, t, J=5,2, H-10'), 8,15 (1H, d, J=8,6, H-12), 8,05 (1H, d, J=8,6, H-9), 8,04 (1H, t, J=5,2, H-19'), 7,80 (1H, t, J=7,8, H-11), 7,65 (1H, t, J=7,8, H-10), 7,35 (2H, d, J=8,6, H-3'+H-5'), 7,34 (2H, d, J= 8,6, H-24'+H-28'), 7,29 (1H d, J=15,8, H-7'), 7,28 (1H, d, J=15,8, H-22'), 6,76 (4H, d, J=8,6 H-2'+H-6'+H-25'+H-27'), 6,36 (1H, d, J=15,8, H-8'), 6,35 (1H, d, J=15,8, H-21'), 5,58,5,41 (2H, układ AB, J=10,6, H-17), 5,18 (2H, s, H-5), 3,21 (2H, m, H-11'), 3,13 (2H, m, H-18'), 2,84 (4H, bt, J=7,2, H-13'5H-15'), 2,02 (1H, m, H-19A), 1,96 (3H, s, CH3CO), 1,90 (1H, m, H-19B), 1,74 (2H, m, H-12'), 1,55 (2H, m H-16'), 1,46 (2H, m, H-17'), 0,84 (3H, t, J=7,2, H-18).

¹²C-NMR (78,1 MHz, DMSO de) δ: 175,23 (s, C-21), 170,81 (s, CH CO), 166,27 (s, C-9'), 165,83 (s, C-20'), 161,43 (s, C-16a), 159,40 (s, C-1'), 159,14 (s, C-15), 153,50 (s, C-2), 148,36 (s, C-13), 143,56 (s, C-3), 139,37 (d, C-7), 139,06 (d,C-22'), 131,74 (d, C-1), 130,58 (d, C-11), 130,33 (s, C-6), 129,63 (s, C-3'+C-5'), 129,56 (d, C-24'+C-28'), 129,40 (d, C-12), 128,83 (d, C-9), 128,23 (s, C-8), 127,78 (d, C-10), 126,23 (d, C-4'), 126,12 (s, C-23'), 123,42 (s, C-16), 119,01 (d, C-8'), 118,68 (d, C-21'), 116,18 (d, C-2'+C-6'+C-25'+C-27'), 100,68 (d, C-14), 80,28 (d, C-20), 59,87 (t, C-17), 50,45 (t, C-5), 47,23 (t, C-13'), 45,36 (t, C-15'), 38,41 (t, C-18), 36,36 (t, C-11'), 33,40 (t, C-19), 26,99 (t, C-12'), 26,87 (t, C-17'), 24,04 (t, C-16'), 21,22 (q, CH3CO), 9,29 (q, C-18).

Z roztworu macierzystego po krystalizacji foetydyny 1, drogą oczyszczanmchromatograficznego przy użyciu takiego samego eluentu w odwróconej fazie, otrzymano 1,2 g foetydyny 2 o następującej charakterystyce: temperatura topnienia 172-174°C, eto = -44,6 (c = 0,35, CH 3OH).

Widmo NMR jest takie samo jak widmo foetydyny 1, z tym, że przy 3,2 ppm pojawia się sygnał -OCH 3 w pierścieniu aromatycznym.

Przykład II. Wytwarzanie ampułek zawierających liofilizowaną foetydynę 1 g foetydyny 1 rozpuszczono w 500 ml destylowanej wody zawierającej 1,2 g kwasu cytrynowego, roztwór przesączono, wyjałowiono i w jałowym pomieszczeniu napełniono nim 100 ampułek, po czym szybko zamrożono i zliofilizowano.

m 042

177 042

Ο ΣΤ

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowe alkaloidy o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru lub grupę metoksylową.
2. Alkaloid według zastrz. 1, będący foetydyną 1 o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru.
3. Alkaloid według zastrz. 1, będący foetydyną 2 o wzorze 1, w którym R oznacza grupę metoksylową.
4. Sposób wytwarzania nowych alkaloidów o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru lub grupę metoksylową, znamienny tym, że a) różne części rośliny ekstrahuje się alifatycznym alkoholem lub ketonem o niskiej masie cząsteczkowej, ewentualnie w mieszaninie z wodą, w temperaturze pokojowej, b) ekstrakt zatęża się w niskiej temperaturze, korzystnie poniżej 25°C, pod zmniejszonym ciśnieniem, c) zatężony ekstrakt, uzyskany w wyniku usunięcia co najmniej części rozpuszczalnika organicznego, ewentualnie rozcieńcza się wodą i ekstrahuje się chlorowanym rozpuszczalnikiem, ekstrahując słabo zasadowe alkaloidy, d) fazę wodną ekstrahuje się alkoholem nie mieszającym się z wodą, korzystnie n-butanolem, e) ekstrakt, korzystnie butanolowy, uzyskany przez zatężenie w niskiej temperaturze pod zmniejszonym ciśnieniem, oczyszcza się drogą chromatografii na żelu krzemionkowym lub podobnym adsorbencie przy użyciu mieszanin chlorowanego rozpuszczalnika i alkoholu alifatycznego jako rozpuszczalnika, f) frakcje zawierające alkaloidy zatęża się do sucha i pozostałość oczyszcza się drogą preparatywnej wysokosprawnej chromatografii cieczowej prowadząc elucję gradientową przy użyciu metanolu/wody, rozpoczynając od mieszaniny metanol/woda o stosunku 1:1 aż do czystego metanolu, g) uzyskany wodny ekstrakt poddaje się liofilizacji i otrzymany liofilizat poddaje się krystalizacji.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w etapie e) stosuje się mieszaniny chlorku metylenu jako chlorowanego rozpuszczalnika i metanolu lub etanolu jako alkoholu alifatycznego w stosunku od 4:1 do 1:1.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w etapie f) stosuje się kolumnę LiChroprep RP 8.
7. Środek farmaceutyczny zawierający substancję czynną i nośnik oraz ewentualnie substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera alkaloid według zastrz. 1-3.