[go: up one dir, main page]

SK1222002A3 - Tenascin-c nucleic acid ligands - Google Patents

Tenascin-c nucleic acid ligands Download PDF

Info

Publication number
SK1222002A3
SK1222002A3 SK122-2002A SK1222002A SK1222002A3 SK 1222002 A3 SK1222002 A3 SK 1222002A3 SK 1222002 A SK1222002 A SK 1222002A SK 1222002 A3 SK1222002 A3 SK 1222002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
tenascin
nucleic acid
ligand
nucleic acids
complex
Prior art date
Application number
SK122-2002A
Other languages
English (en)
Inventor
Brian Hicke
Stephen Warren
David Pharma
Larry Gold
Original Assignee
Gilead Sciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gilead Sciences Inc filed Critical Gilead Sciences Inc
Publication of SK1222002A3 publication Critical patent/SK1222002A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/547—Chelates, e.g. Gd-DOTA or Zinc-amino acid chelates; Chelate-forming compounds, e.g. DOTA or ethylenediamine being covalently linked or complexed to the pharmacologically- or therapeutically-active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C12N2310/3183—Diol linkers, e.g. glycols or propanediols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2541/00—Reactions characterised by directed evolution
    • C12Q2541/10—Reactions characterised by directed evolution the purpose being the selection or design of target specific nucleic acid binding sequences
    • C12Q2541/101—Selex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F02—COMBUSTION ENGINES; HOT-GAS OR COMBUSTION-PRODUCT ENGINE PLANTS
    • F02B—INTERNAL-COMBUSTION PISTON ENGINES; COMBUSTION ENGINES IN GENERAL
    • F02B75/00—Other engines
    • F02B75/02—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke
    • F02B2075/022—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle
    • F02B2075/027—Engines characterised by their cycles, e.g. six-stroke having less than six strokes per cycle four
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
    • G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
    • G01N2333/163—Regulatory proteins, e.g. tat, nef, rev, vif, vpu, vpr, vpt, vpx
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]
    • G01N2333/503—Fibroblast growth factors [FGF] basic FGF [bFGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/62—Insulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • G01N2333/8121—Serpins
    • G01N2333/8125—Alpha-1-antitrypsin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96455—Kallikrein (3.4.21.34; 3.4.21.35)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/966—Elastase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)

Description

Predkladaný vynález sa týka nukleových kyselín, ktoré pôsobia s vysokou afinitou ako Ugandy tenascinu-C. Ďalej sa vynález týka spôsobu identifikácie a spôsobu prípravy vysokoafinitných ligandových nukleových kyselín pre tenascin-C. Na identifikáciu takýchto nukleových kyselín sa použil spôsob SELEX, čo je akronym z termínu Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment. Ďalej sa vynález týka ligandových nukleových kyselín pre tenascin-C s vysokou afinitou, RNA ligandov pre tenascin-C a oligonukleotidov obsahujúcich deriváty chemicky modifikované v 2'-polohách purínov a pyrimidínov. Ďalej sa vynález týka RNA ligandov pre tenascin-C, ktoré obsahujú modifikácie skupinami 2'-F a 2'-0Me. Oligonukleotidy podľa vynálezu sú užitočné ako diagnostické a/alebo terapeutické činidlá.
Doterajší stav techniky
Tenascin-C je hexamérny glykoproteín veľkosti 1,1 až 1.5xl06 Da, lokalizovaný predovšetkým v extracelulárnom matrixe. Tenascin-C sa exprimuje počas embryogenézy, hojenia poranenia a neoplázie, čo vedie k predstave o tom, že tento proteín hrá úlohu pri prestavbe (remodeling) tkanív (Erickson and Bourdon (1989) Annu Rev Celí Biol 5:71-92). Proces neoplázie zahŕňa tiež prestavbu tkanív a tenascin-C sa nadmerne exprimuje v mnohých typoch nádorov vrátane napr. karcinómu pľúc, prsníka, prostaty, hrubého čreva, astrocytov, glioblastómov, melanómov a sarkómov. (Soini et al. (1993) Am J Clin Pathol 100 (2):145—50; Koukoulis et al. (1991) Hum Pathol 22 (7) :636-43; Borsi et al. (1992) Int J Cancer 52 (5) :688-92; Koukoulis et al. (1993) Submicrosc Cytol
Pathol 25(2):285-95,- Ibrahim et al. (1993) Hum Pathol 24(9):982-9; Riedi et al. (1998) Dis Colon Rectum 41(1):86-92,- Touminen and Kallioinen (1994) J Cutan Pathol 21(5):424-9,- Natali et al. (1990) Int J Cancer 46 (4) :586-90; Zagzag et al. (1995) Cancer Res 55(4):907-14; Iiasegawa et al. (1997) Acta Neuropathol (Berl) 93(5):431-7,- Saxon et al. (1997) Peóiatr Pathol Lab Med 17(2):259-66,- Hasegawa et al. (1995) Hum Pathol 26(8):38-45).
Okrem toho sa tenascin-C nadmerne exprimuje pri hyperproliferatívnych ochoreniach kože ako je napr. psoriáza (lupienka) (Schalkwijk et al. (1991) Br J Dermatol 124(1):13-20) a v aterosklerotických léziách (Fukumoto et al. (1998) J Atheroskler Thromb 5(1):29-35,- Wallner et al. (1999) Circulation
99(10):1284-9). Rádioaktívne označené protilátky, ktoré sa viažu na tenascin-C, sa používajú na zobrazovanie a terapiu nádorov v klinickej praxi (Paganelli et al. (1999) Eur J Nucl Med 26(4):348-57,- Paganelli et al. (1994) Eur J Nucl Med 21(4):314-21; Bigner et al. (1998) J Clin Oncol 16(6):2202-12,- Merlo et al. (1997) Int J Cancer 71(5):810-6).
Aptaméry pre tenascin-C sú potenciálne užitočné na diagnostiku a terapiu nádorov, aterosklerózy a psoriázy. V porovnaní s protilátkami sú aptaméry malé molekuly, 7000 až 20000 Da, klírens z krvi je velmi rýchly a je možné ich pripraviť chemickou syntézou. Velmi rýchly klírens z krvi je dôležitý pre in vivo diagnostické zobrazovacie metódy, pri ktorých hladiny v krvi sú primárnym faktorom určujúcim pozadie rušiace kvalitu zobrazenia. Rýchly klírens z krvi môže byť tiež dôležitý pre terapiu tam, kde hladina v krvi prispieva k toxicite.
Technológia SELEX dovoľuje rýchlu izoláciu aptaméru a chemická syntéza dovoľuje ľahkú a miestne špecifickú konjugáciu aptamérov s celým radom inertných a bioaktívnych molekúl. Aptamér pre tenascin-C by bol preto užitočný na terapiu nádorov alebo na in vivo a ex vivo diagnostické zobrazovanie a/alebo na prenos rôznych terapeuticky účinných činidiel v komplexe s ligandovou nukleovou kyselinou tenascinu-C na liečenie ochorení, pri ktorých sa tenascin-C exprimuje.
Počas mnohých rokov sa udržovala dogma, že nukleová kyselina má primárne informačnú úlohu. Metódou známou pod označením SELEX (systematický vývoj ligandov exponenciálnym obohacovaním, Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichmenť') sa objasnilo, že nukleové kyseliny majú diverzitu trojrozmernej štruktúry nie odlišnú od proteínov. Metóda SELEX je metóda pre in vitro vývoj molekúl nukleových kyselín, ktoré sa vysoko špecificky viažu na cielové molekuly a sú opísané v patentovej prihláške USA č. 07/536,428, podanej 11. júna 1990, s názvom Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichmenť' teraz opustenej, v patente USA č. 5,475,096 s názvom Nucleic Acid Ligands, a patente USA č. 5,270,163 (pozri tiež WO 91/19813) s názvom Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands, ktorých dokumenty sú tu zahrnuté formou odkazu. Každý z týchto patentových dokumentov, súhrnne tu nazývaných patentové dokumenty SELEX opisuje zásadne novú metódu prípravy nukleových kyselín ako ligandov pre požadované cieľové molekuly. Metóda SELEX poskytuje triedu produktov, ktoré sa nazývajú ligandové nukleové kyseliny alebo aptaméry, z ktorých má každý jedinečnú sekvenciu a má vlastnosť sa špecificky viazať na požadovanú cieľovú zlúčeninu alebo molekulu. Každá z ligandových nukleových kyselín identifikovaných metódou SELEX je špecifickým ligandom požadovanej cieľovej zlúčeniny alebo molekuly.
Metóda SELEX je založená na jedinečnej myšlienke, že nukleové kyseliny majú dostatočnú schopnosť vytvárať rôzne dvoja trojrozmerné štruktúry a dostatočnú premenlivosť v rámci ich monomérov na to, aby mohli pôsobiť ako ligandy (t.j. vytvárať špecifické väzbové páry) prakticky s akoukoľvek chemickou zlúčeninou, monomérnou alebo polymérnou. Pri metóde SELEX sú cielové molekuly akejkoľvek veľkosti a akéhokoľvek zloženia. Metóda SELEX na vysokoafinitnú väzbu zahŕňa selekciu zo zmesi kandidátnych oligonukleotidov a postupné opakovanie naviazania, oddelenia a amplifikácie podľa rovnakej všeobecnej schémy, aby sa dosiahlo takmer akékoľvek požadované kritérium na afinitu a selektivitu väzby. Vychádzajúc zo zmesi nukleových kyselín, ktorá výhodne obsahuje segment randomizovanej sekvencie, metóda SELEX zahŕňa kroky, pri ktorých sa zmes privedie do kontaktu s cieľovou molekulou v podmienkach výhodných pre väzbu, nenaviazané nukleové kyseliny sa oddelia od nukleových kyselín, ktoré sa špecificky naviazali na cieľovú molekulu, komplexy cieľová molekula-nukleová kyselina sa disociujú a nukleové kyseliny disociované z komplexov sa amplifikujú, čím sa vytvorí ligandami obohatená zmes nukleových kyselín, a potom sa opakujú kroky naviazania, oddelenia, disociácie a amplifikácie v toľkých cykloch, koľko ich je potrebných na získanie vysoko špecifickej ligandovej nukleovej kyseliny viažucej sa na cieľovú molekulu s vysokou afinitou.
Pôvodcovia predkladaného vynálezu uznávajú, že metóda SELEX ukázala, že nukleové kyseliny ako chemické zlúčeniny môžu vytvárať velké spektrum tvarov, veľkostí a konfigurácií, a sú schopné omnoho väčšieho repertoáru väzieb a ďalších funkcií, ako sú tie väzby a funkcie, ktoré prejavujú nukleové kyseliny v biologických systémoch.
Základná metóda SELEX sa modifikovala pre mnoho špecifických cieľov. Tak napr. patentová prihláška USA č. 07/960,093, podaná 14. októbra 1992, teraz opustená, a patent USA č. 5,707,796, oba dokumenty s názvom Methods for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure opisujú použitie metódy SELEX v spojení s gélovou elektroforézou na selekciu molekúl nukleovej kyseliny so špecifickými štruktúrnymi vlastnosťami, ako je napr. zahnutá DNA (bent DNA) .
Patentová prihláška USA č. 08/123,935, podaná 17. septembra 1993, s názvom Photoselection of Nucleic Acid Ligands teraz opustená, Patent USA č. 5,763,177, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic
Acid Ligands and Solution SELEX a patentová prihláška USA č. 09/093,293, podaná 8. júna 1998, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX opisujú metódu založenú na metóde SELEX na selekciu iigandových nukleových kyselín, ktoré obsahujú fotoreaktívne skupiny schopné väzby a/alebo fotozosieťovania (photocrosslinking) na cieľovú molekulu a/alebo fotoinaktivácie cieľovej molekuly. Patent USA č. 5,580,737, s názvom High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine opisuje spôsob identifikácie vysoko špecifických iigandových nukleových kyselín, schopný rozlišovať medzi blízko príbuznými molekulami, ktoré môžu byť inej ako peptidovej povahy, nazvaný Counter-SELEX. Patent USA č. 5,567,588, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX opisuje metódu založenú na SELEX, ktorá dosahuje vysoko účinné rozdelenie oligonukleotidov majúcich vysokú a nízku afinitu k cieľovej molekule.
Metóda SELEX zahŕňa identifikáciu vysokoafinitných Iigandových nukleových kyselín obsahujúcich modifikované nukleotidy, ktoré poskytujú napr. zlepšenú stabilitu in vivo alebo zlepšené vlastnosti na podávanie. Medzi príklady takýchto modifikácií patria chemické substitúcie v polohách ribózy a/alebo fosfátu a/alebo bázy. Ligandové nukleové kyseliny obsahujúce modifikované bázy, ktoré sa identifikovali metódou SELEX, sa opísali v Patente USA č. 5, 660,985, s názvom High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides, kde sú opísané oligonukleotidy obsahujúce nukleotidové deriváty chemicky modifikované v 5-a 2'-polohách pyrimidínov. Už spomenutý Patent USA č 5,580,737, opisuje vysoko špecifické ligandové nukleové kyseliny, ktoré obsahujú jeden alebo viac nukleotidov modifikovaných 2'-aminoskupinou (2'-NH2), 2'-f luoroskupinou (2'-F) a/alebo 2'-0-metylovou skupinou (2'-0Me). Patentová prihláška USA č. 08/264,029, podaná 22. júna 1994, s názvom Novel Methods of
Preparation of Known and Novel 2' Modified Nucleosides by
Intramolecuiar Nucleophilic Displacement, teraz opustená, opisuje oligonukleotidy obsahujúce rôzne 2'-modif ikované pyrimidíny.
Metóda SELEX zahŕňa tiež kombinovanie vybraných nukleotidov s inými vybranými nukleotidmi a inými ako nukleotidovými funkčnými jednotkami, ako je opísané v Patente USA č. 5,637,459, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX, a Patente USA č. 5,683,867, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX. Tieto metódy umožňujú kombinácie širokého spektra tvarov a ďalších vlastností a účinných amplifikačných a replikačných vlastnosti oligonukleotidov s požadovanými vlastnosťami iných molekúl.
Metóda SELEX ďalej zahŕňa kombináciu vybraných ligandových nukleových kyselín s lipofilnými zlúčeninami alebo neimunogénnymi vysokomolekulovými zlúčeninami do diagnostických alebo terapeutických komplexov, ako je opísané v patentovej prihláške USA č. 08/434,465, podanej 4. mája 1995, s názvom Nucleic Acid Ligand Complexes.
Každý z uvedených patentových dokumentov, ktorý opisuje modifikácie základnej procedúry SELEX je v predkladanej prihláške zahrnutý formou odkazu ako celok.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález opisuje spôsob izolácie ligandových nukleových kyselín, ktoré sa vysoko špecificky viažu na tenascin-C. Vynález ďalej opisuje ligandové nukleové kyseliny, t.j. nukleové kyseliny pôsobiace ako ligandy pre tenascin-C. Vynález ďalej opisuje vysokoafinitné RNA ligandy pre tenascin-C obsahujúce pyrimidíny modifikované 2'-f luoroskupinou (2'-F) a puríny modifikované 2'-0-metylovou skupinou (2'-OMe) . Spôsob tu použitý na identifikáciu nukleových kyselín pôsobiacich ako ligandy (ligandových nukleových kyselín) sa nazýva SELEX, čo je akronym zo Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (Systematický vývoj ligandov exponenciálnym obohacovaním). Vynález zahŕňa tiež ligandy uvedené v tabuľkách 3 a 4 a na obrázku 10.
Predkladaný vynález sa ďalej týka spôsobu detekcie ochorenia, pri ktorom sa v biologickom tkanive exprimuje tenascin-C. Ďalej sa týka spôsobu detekcie nádoru, ktorý exprimuje tenascin-C v biologickom tkanive. Ďalej sa vynález týka komplexov na použitie na in vivo a ex vivo diagnostiku. Ďalej sa vynález týka komplexu na použitie na podávanie liečivého prípravku na profylaxiu alebo liečenie chorého tkaniva, ktoré exprimuje tenascin-C.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 ukazuje väzbu bunkových SELEX RNA poolov na bunky U251.
Obr. 2 ukazuje predpokladanú sekundárnu štruktúru aptamérov TTA1 a TTA1.NB. Na obrázku je znázornená konjugácia aptamérov s chelatačným činidlom Tc-99m. Všetky A sa modifikovali 2'0me, všetky G, až na uvedené výnimky, sa modifikovali 2'0me a všetky C a U sa modifikovali 2Έ.
Obr. 3 ukazuje zobrazenie xenotransplantátov nádorov 0251 u myší získaných použitím Tc-99m značených TTA1 a TTA1.NB, 3 hodiny po injekcii.
Obr. 4 ukazuje fluorescenčnú mikroskopiu rezu glioblastómu 0251 3 hodiny po i.v. injekcii Rhodamin-Red-X značeného TTA1.
Obr. 5 ukazuje spôsob akým sa Tc-99m a linker naväzuje prostredníctvom 5'G TTA1.
Obr. 6 opisuje príjem TTA1/GS7641 xenotransplantátmi rôznych humánnych nádorov u myši po 3 hodinách v porovnaní s príjmom kontrolného aptaméru, ktorý sa neviaže. ID/g = injekčné podaná dávka na gram.
Obr. 7 ukazuje biodistribúciu In-111 značeného TTA1/GS7641
použitím buď DOTA alebo DTPA ako chelatačného činidla
rádioaktívneho kovu, 3 hodiny po injekcii . ID/g - injekčné
podaná dávka na gram.
Obr. 8 ukazuje konjugáciu aptaméru s DTPA. 111-Γ- in sa znázornilo
ako chelatované DTPA.
Obr. 9 ukazuje konjugáciu aptaméru s DOTA. 111t„ r.-. In sa znázornilo
ako chelatované DTPA.
Obr. 10 ukazuje predpokladanú sekundárnu štruktúru aptaméru TTA1. Na obrázku je tiež konjugácia aptaméru s chelatačným činidlom Tc-99m. Aptamér je znázornený v jeho Tc-99m značenej forme. Všetky A sa modifikovali 2'0me, všetky G, až na uvedené výnimky, sa modifikovali 2'0me a všetky C a U sa modifikovali 2'F.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Základnou metódou, ktorá sa použila na identifikáciu nukleových kyselín pôsobiacich ako ligandy pre tenascin-C (ligandových nukleových kyselín) bola metóda SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), ktorá zahŕňa kroky: (a) kandidátna zmes nukleových kyselín sa privedie do kontaktu s tenascinom-C (b) členy kandidátnej zmesi sa rozdelia na základe afinity k tenascinu-C, a (c) selektované molekuly sa amplifikujú, čím vznikne zmes obohatená sekvenciami nukleových kyselín s relatívne vysokou afinitou väzby na tenascin-C.
Vynález zahŕňa tiež ligandové RNA (t.j. RNA pôsobiace ako ligandy) pre tenascin-C. Vynález zahŕňa tiež špecifické ligandy uvedené v tabuľkách 3 a 4 a na obrázku 10.
Predkladaný vynález zahŕňa tiež sekvencie nukleových kyselín, ktoré sú v podstate homológne s a tiež majú v podstate rovnakú schopnosť viazať tenascin-C ako špecifické ligandové nukleové kyseliny uvedené v tabuľkách 3 a 4 a na obr. 10. Termínom v podstate homológne sa myslí miera homológie primárnej sekvencie vyššia ako 70%, výhodnejšie vyššia ako 80% a najvýhodnejšie vyššia ako 90%, 95% alebo 99%. Percento homológie, ktoré sa tu uvádza je vypočítané ako percento nukleotidov nájdených v kratšej z dvoch sekvencií, ktoré sa zhodujú s príslušným nukleotidom porovnávanej sekvencie, pričom 1 medzera sa môže vniesť na dĺžku 10 nukleotidov, aby sa napomohlo pripojeniu sekvencií. V podstate rovnaká schopnosť viazať tenascin-C znamená, že afinita je v rámci jednej až dvoch rádových hodnôt afinity ligandov tu uvedených. Je úplne v kompetencii odborníka určiť, či daná sekvencia, ktorá je v podstate homologická so sekvenciami tu opísanými, má tiež rovnakú schopnosť viazať tenascin-C.
Prehľad sekvenčných homológii ligandových nukleových kyselín uvedených v tabuľke 3 a 4 a na obr. 10 ukazuje, že sekvencie s malou alebo žiadnou primárnou homológiou môžu mať v podstate rovnakú schopnosť viazať tenascin-C. Z tohto dôvodu predkladaný vynález zahŕňa tiež ligandové nukleové kyseliny, ktoré majú v podstate rovnaké predpokladané štruktúry alebo štruktúrne motívy a schopnosť viazať tenscin-C ako ligandové nukleové kyseliny uvedené v tabulke 3 a 4 a na obr. 10. V podstate rovnaké predpokladané štruktúry alebo štruktúrne motívy možno postulovať na základe priradenia sekvencií (sequence alignment) pomocou programu Zukerfold (pozri Zuker (1989) Science 244:48-52). Ako je odborníkom dostatočne známe, aj iné počítačové programy sa môžu použiť na predikáciu sekundárnej štruktúry a štruktúrnych motívov. V podstate rovnaká štruktúra alebo štruktúrne motívy ligandových nukleových kyselín v roztoku alebo ako viazaných štruktúr sa môžu postulovať pomocou NMR alebo inej metódy, ako je známe v odbore.
Ďalej sa predkladaný vynález týka spôsobu detekcie ochorenia, pri ktorom sa exprimuje tenascin-C v biologickom tkanive, ktoré môže tenascin-C obsahovať, keď sa a) identifikuje ligandová nukleová kyselina z kandidátnej zmesi nukleových kyselín, pričom nukleová kyselina je ligandom tenscinu-C, spôsobom zahŕňajúcim kroky I) kandidátna zmes nukleových kyselín sa privedie do kontaktu s tenascinom-C, pričom nukleová kyselina, ktorá má zvýšenú afinitu k tenascinu-C v porovnaní so zvyškom kandidátnej zmesi sa môže oddeliť od zvyšku kandidátnej zmesi, II) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa oddelia od zvyšku kandidátnej zmesi, III) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa amplifikujú, čím sa pripraví zmes nukleových kyselín s relatívne vysokou afinitou a špecificitou k tenascinu-C, čím sa identifikuje ligandová nukleová kyselina k tenascinu-C, b) na ligandovú nukleovú kyselinu identifikovanú v kroku III sa naviaže marker, ktorý sa môže použiť na in vivo alebo ex vivo diagnostiku, c) tkanivo, ktoré by mohlo obsahovať ochorenie, sa vystaví pôsobeniu komplexu ligandovej nukleovej kyseliny s markerom a d) deteguje sa prítomnosť komplexu ligandovej nukleovej kyseliny s markerom v tkanive, čím sa identifikuje ochorenie exprimujúce tenascin-C.
Predkladaný vynález ďalej poskýtuje komplex na použitie na in vivo a ex vivo diagnostiku, ktorý obsahuje jednu alebo viac nukleových kyselín pôsobiacich ako ligand tenascinu-C (ligandových nukleových kyselín) a jeden alebo viac markérov. Ďalej sa vynález týka spôsobu podávania terapeutických činidiel na profylaxiu alebo liečenie ochorení, pri ktorých sa exprimuje tenascin-C.
Definície
Predkladaný vynález sa opisuje pomocou rôznych špecifických termínov. Aby sa uľahčilo pochopenie opisu, termíny sa definujú nasledovne:
Termín ligandová nukleová kyselina je nukleová kyselina, ktorá sa nevyskytuje v prírode, a ktorá pôsobí požadovaným účinkom na cieľovú molekulu. Ligandové nukleové kyseliny sa označujú ako aptaméry. Cieľovou molekulou je podľa predkladaného vynálezu tenascin-C, čo vyjadruje termín ligandová nukleová kyselina tenascinu-C. Požadovaným účinkom sa, okrem iného, rozumie väzba s cieľovou molekulou, katalytické pôsobenie na cieľovú molekulu, reakcia s cieľovou molekulou spôsobom, ktorý modifikuje/mení cieľovú molekulu alebo jej funkčnú aktivitu, kovalentné naviazanie na cieľovú molekulu ako to je napr. u samovražedných inhibítorov, alebo uľahčenie reakcie cieľovej molekuly s inou molekulou. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je požadovaným účinkom špecifická väzbová aktivita k cieľovej molekule, kde cieľová molekula je trojrozmerná chemická štruktúra iná ako polynukleotid, ktorá sa viaže na ligandovú nukleovú kyselinu mechanizmom, ktorý obzvlášť závisí od Watson/Crickovho princípu párovania báz alebo od trojzávitnicovej väzby, pričom ligandová nukleová kyselina nie je nukleová kyselina, ktorej známa fyziologická funkcia by bola viazať sa na cieľovú molekulu. Ligandová nukleová kyselina sa identifikuje z kandidátnej zmesi nukleových kyselín, pričom pôsobí ako ligand tenascinu-C, nasledujúcim spôsobom: a) kandidátna zmes nukleových kyselín sa privedie do kontaktu s tenascinom-C, pričom nukleové kyseliny majúce zvýšenú afinitu k tenascinu-C sa môžu oddeliť od zvyšku kandidátnej zmesi, b) nukleové kyseliny majúce zvýšenú afinitu k tenascinu-C sa oddelia od zvyšku kandidátnej zmesi a c) selektované molekuly nukleovej kyseliny sa amplifikujú, čím vznikne zmes obohatená ligandovými nukleovými kyselinami (pozri patentová prihláška USA č. 08/434,425, podaná 3. mája 1995, teraz Patent USA č. 5,789,157, zahrnutý formou odkazu).
Termín kandidátna zmes označuje zmes nukleových kyselín s rôznymi sekvenciami, z ktorých sa vyrába ligand (t.j. ligandová' nukleová kyselina). Zdrojom kandidátnej zmesi môžu byť prirodzene sa vyskytujúce nukleové kyseliny alebo ich fragmenty, chemicky syntetizované nukleové kyseliny alebo nukleové kyseliny pripravené kombináciou uvedených spôsobov. Vo výhodnom uskutočnení má každá nukleová kyselina fixnú sekvenciu obklopenú randomizovaným úsekom pre uľahčenie amplifikácie.
Termín nukleová kyselina znamená DNA, RNA, a to jednoreťazcové alebo dvojreťazcové formy a akékoľvek ich modifikácie. K modifikáciám patria okrem iného modifikácie, ktoré poskytujú ďalšie chemické skupiny nesúce dodatočný náboj, polarizovatelnosť, vodíkové väzby, elektrostatické interakcie a fluxionalita báz iigandovej nukleovej kyseliny alebo celej ligandovej nukleovej kyseliny. K modifikáciám patrí, bez toho aby bol zoznam obmedzujúci, modifikácia sacharidu v polohe 2', modifikácia pyrymidínu v polohe 5, modifikácia purínu v polohe 8, modifikácia exocyklických amínových skupín, substitúcia 4-tiouridínu, substitúcia 5-bróm- alebo 5-jóduracilu, modifikácia kostry, metylácia, neobvyklé kombinácie párovania báz ako sú napr. izobázy izocytidín a izoguanín a pod. K modifikáciám patria tiež modifikácie 3'- a 5'- koncov ako je napr. pripojenie čiapočky (cappíng) .
Metóda SELEX je postup, ktorý zahŕňa kombináciu selekcie ktoré interagujú požadovaným napr. väzbou na proteín, ligandových nukleových kyselín, spôsobom s cieľovou molekulou, s amplifikáciou takto vybraných molekúl. Prípadné opakované cykly týchto krokov selekcia/amplifikácia umožňujú vybrať z pôvodného poolu obsahujúceho veľký počet nukleových kyselín nakoniec jednu alebo len malý počet molekúl, ktoré interagujú s cieľovou molekulou velmi silno. Opakovanie cyklov selekcia/amplifikácia pokračuje dovtedy, kým sa nedosiahne požadovaný ciel. V predkladanom vynáleze sa metóda SELEX využila na získanie ligandovej nukleovej kyseliny pre tenascin-C.
Metóda SELEX sa podrobne opísala vo vyššie uvedených patentových dokumentoch SELEX.
Termín „SELEX ciel alebo „ciel znamená akúkoľvek zlúčeninu alebo molekulu, pre ktorú sa požaduje ligand. Cieľom môže byť proteín, peptid, sacharid, polysacharid, glykoproteín, hormón, receptor, antigén, protilátka, vírus, substrát, metabolit, analóg v prechodnom stave, kofaktor, ingibítor, liečivo, farbivo, živina, rastový faktor apod., bez akéhokoľvek obmedzenia.
V predkladanej prihláške vynálezu je cieľom resp. cieľovou molekulou tenascin-C.
Termín komplex označuje molekulovú entitu vytvorenú kovalentnými väzbami jednej alebo niekolkých ligandových nukleových kyselín tenascinu-C s jedným alebo niekolkými markermi.
V niektorých uskutočneniach predkladaného vynálezu je komplex znázornený ako A-B-Y, kde A je marker, B je voliteľná časť napr. linker a Y je ligandová nukleová kyselina tenascinu-C.
Termín marker označuje molekulovú entitu, ktorá ak je v komplexe s ligandovou nukleovou kyselinou tenascinu-C, buď priamo alebo nepriamo prostredníctvom linkera (Iinkerov) alebo spacera (spacerov) umožňuje detekciu komplexu v podmienkach in vivo alebo ex vivo vizuálne alebo chemickými prostriedkami. K príkladom markerov patria, avšak zoznam nie je obmedzujúci, rádionukiidy ako je 99mTc, 188Re, 64Cu, 67Cu, 18F, 125I, 131I, inIn, 32P, 186Re, všetky fluorofory ako je fluoresceín, rodamín, Texas červeň, deriváty fluoroforov ako je napr. Rhodamin-Red-X, magnetické zlúčeniny a tiež biotín.
Linker je molekulová entita, ktorá spája dve (alebo viac) iné molekulové entity prostredníctvom kovalentných väzieb alebo nekovalentných interakcií a môže umožniť priestorové oddelenie molekulových entít takým spôsobom, ktorý zachováva funkčné vlastnosti jednej alebo oboch molekulových entít. Linker sa niekedy označuje termínom spacer. K neobmedzujúcim príkladom Iinkerov patrí (CH2CH2O)6 a hexylamínové štruktúry ukázané na obr. 2.
Termín terapeutický sa v opise vynálezu používa v zmysle liečivý a/alebo profylaktický. Tento termín sa používa vo vzťahu k človeku alebo zvieratám.
Termín kovalentná väzba označuje chemickú väzbu vytvorenú spoločnými elektrónmi.
Nekovalentné interakcie označujú to, že molekulové entity sa držia spolu interakciami inými ako sú kovalentné väzby, napr. iónovými interakciami alebo vodíkovými väzbami.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa ligandová nukleová kyselina podlá predkladaného vynálezu získa metódou SELEX, ktorá sa opísala v patentovej prihláške USA č. 07/536,428, podanej 11. mája 1990, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment teraz opustená, v patente USA č. 5,475,096 s názvom Nucleic Acid Ligands, a patente USA č. 5,270,163 (pozri tiež WO 91/19813) s názvom Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands. Tieto dokumenty sú vložené formou odkazu, súhrnne sa označujú ako patentové dokumenty
SELEX.
Metóda SELEX poskytuje triedu produktov, ktoré sú ligandové nukleové kyseliny, z ktorých má každá jedinečnú sekvenciu a má vlastnosť špecificky sa viazať na požadovanú cieľovú zlúčeninu alebo molekulu. Cieľové molekuly sú výhodne proteíny, ale môžu to byť aj sacharidy, peptidoglykány a rôzne malé molekuly, pričom tento zoznam nie je obmedzujúci. Metódu SELEX možno použiť tiež na zacielenie na biologické štruktúry ako je bunkový povrch alebo vírus, a to prostredníctvom špecifickej interakcie s molekulou, ktorá je integrálnou súčasťou takej biologickej štruktúry.
V najzákladnejšej podobe sa metóda SELEX definuje nasledujúcimi krokmi:
1) pripraví sa kandidátna zmes nukleových kyselín rôznych se15 kvencií. Kandidátna zmes všeobecne obsahuje úseky fixných sekvencii (t.j. každý člen kandidátnej zmesi obsahuje rovnaké sekvencie na rovnakom mieste) a úseky randomizovaných (náhodných) sekvencii. Úseky fixných sekvencii sa vybrali pre to, aby sa a) buď pomohlo amplifikačným krokom opísaným vyššie alebo b) napodobnila sekvencia, o ktorej je známe, že sa viaže na ciel, alebo c) aby sa zvýšila koncentrácia daného štruktúrneho usporiadania nukleových kyselín v kandidátnej zmesi. Randomizované sekvencie môžu byť buď úplne randomizované (t.j. pravdepodobnosť nájdenia bázy v akejkoľvek polohe je 1:4) alebo len čiastočne randomizované (t.j. pravdepodobnosť nájdenia bázy v akejkoľvek polohe sa môže vybrať z akejkoľvek hladiny medzi 0 a 100 %).
2) Kandidátna zmes sa privedie do kontaktu s vybraným cieľom v podmienkach, ktoré sú výhodné pre väzbu cieľa a členov kandidátnej zmesi. Za týchto podmienok spočíva interakcia medzi cieľom a nukleovými kyselinami kandidátnej zmesi vo vytváraní párov nukleová kyselina-ciel medzi cieľovou molekulou a tými nukleovými kyselinami, ktoré majú najvyššiu afinitu k cieľovej molekule.
3) Nukleová kyselina s najvyššou afinitou pre ciel sa oddelí od nukleových kyselín s menšou afinitou. Keďže v kandidátnej zmesi existuje len mimoriadne malý počet sekvencii (prípadne len jediná molekula nukleovej kyseliny), ktoré zodpovedajú molekule s najvyššou afinitou, je všeobecne potrebné stanoviť selekčné kritériá, tak aby sa významné množstvo (približne 5 až 50%) nukleových kyselín zachytilo v priebehu oddeľovania.
4) Nukleové kyseliny, ktoré sa vybrali v priebehu oddeľovania pre relatívne vysokú afinitu k cieľu, sa potom amplifikujú, čím sa vytvorí nová kandidátna zmes, ktorá je obohatená o nukleové kyseliny, ktoré majú relatívne vysokú afinitu k cieľu.
5) Opakovaním krokov oddelenia a amplifikácie už opísaných, novo vytvorená kandidátna zmes obsahuje stále menej a menej jedinečných sekvencii a priemerná afinita nukleovej kyseliny k cieľu všeobecne rastie. V extrémnych prípadoch by nakoniec metóda SELEX poskytla kandidátnu zmes, obsahujúcu jednu alebo len veľmi malý počet jedinečných sekvencií, ktoré predstavujú sekvencie nukleových kyselín z pôvodnej kandidátnej zmesi, ktoré majú najvyššiu afinitu k cieľovej molekule.
Základná metóda SELEX sa modifikovala na dosiahnutie mnohých špecifických cieľov. Tak napr. patentová prihláška USA č. 07/960,093, podaná 14.októbra 1992, teraz opustená a Patent USA č. 5,707,796, oba dokumenty s názvom Methods for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure opisujú použitie metódy SELEX v spojení s gélovou eiektroforézou na selekciu molekúl nukleovej kyseliny so špecifickými štruktúrnymi vlastnosťami, ako je napr. ohnutá DNA. Patentová prihláška USA č. 08/123,935, podaná 17. septembra 1993, s názvom Photoselection of Nucleic Acid Ligands teraz opustená, Patent USA č. 5,763,177, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX a patentová prihláška USA č. 09/093.293, podaná 8. júna 1998, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX opisujú metódu založenú na postupe SELEX na selekciu ligandových nukleových kyselín obsahujúcich fotoreaktívne skupiny schopné väzby a/alebo zosietenia účinkom svetla na („photocrosslinking) a/alebo fotoinaktiváciu cieľovej molekuly. Patent USA č. 5,580,737, s názvom High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine opisuje spôsob identifikácie vysoko špecifických ligandových nukleových kyselín, schopných rozlíšiť medzi blízko príbuznými molekulami, ktoré môžu byť inej ako peptidovej povahy, a táto metóda dostala pomenovanie Counter-SELEX. Patent USA č. 5,567,588, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX opisuje metódu založenú na SELEX, ktorá dosahuje vysoko účinné rozdelenie oligonu17 kleotidov majúcich vysokú a nízku afinitu k cieľovej molekule. Patent USA č. 5,496,938, s názvom Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev, opisuje metódu získaných zlepšených ligandových nukleových kyselín po uskutočnení metódy SELEX. Patent USA č. 5,705,337 s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX opisuje metódu kovalentného naviazania ligandu na ciel.
Metóda SELEX zahŕňa identifikáciu vysokoafinitných ligandových nukleových kyselín obsahujúcich modifikované nukleotidy, ktoré poskytujú zlepšené vlastnosti ligandu, napr. zlepšenú stabilitu in vivo alebo zlepšené vlastnosti na podávanie. K príkladom takýchto modifikácií patrí chemická substitúcia v polohe ribózy a/alebo fosfátu a/alebo bázy. Ligandové nukleové kyseliny obsahujúce modifikované nukleotidy, ktoré sa identifikovali metódou SELEX, sa opísali v Patente USA č. 5,660,985, s názvom High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides, kde sú opísané oligonukleotidy obsahujúce nukleotidové deriváty chemicky modifikované v 5- a 2'polohách pyrimidínov. Už spomenutý Patent USA č 5,580,737, opisuje vysoko špecifické ligandové nukleové kyseliny obsahujúce jeden alebo viac nukleotidov modifikovaných 2'-aminoskupinou (2'— -NH2) , 2'-fluoroskupinou (2'-F) a/alebo 2'-0-metylovou skupinou (2'-OMe). Patentová prihláška USA č. 08/264,029, podaná 22. júna 1994, s názvom Novel Methods of Preparation of Known and Novel 2' Modified Nucleosides by Intramolecuiar Nucleophilic Displacement, teraz opustená, opisuje oligonukleotidy obsahujúce rôzne 2'-modifikované pyrimidíny.
Metóda SELEX zahŕňa tiež kombinovanie vybraných oligonukleotidov s inými vybranými oligonukleotidmi a inými funkčnými skupinami, ktoré nie sú oligonukleotidmi, čo sa už opísalo v Patente USA č. 5,637,459, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX, a Patente USA č. 5,683,867, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX. Tieto metódy umožňujú kombinácie širokého spektra tvarov a ďalších vlastností a účinných amplifikačných a replikačných vlastností oligonukleotidov s požadovanými vlastnosťami iných molekúl.
V Patente USA č. 5,496,938, sa opisuje metóda získania zlepšených ligandových kyselín po tom, čo sa uskutočnil postup SELEX. Tento patent s názvom Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev, je špecificky zahrnutý formou odkazu.
Patentová prihláška USA č. 08/434,425, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Tissue SELEX, podaná 3. mája 1995, teraz už Patent USA č. 5,789,157, opisuje metódu identifikácie ligandových nukleových kyselín pre makromolekulárne komponenty tkanív, vrátane nádorových buniek, a tiež týmto spôsobom identifikované ligandy. Tento patent je špecificky zahrnutý formou odkazu.
Jedným potenciálnym problémom pri terapeutickom alebo diagnostickom využití nukleových kyselín je to, že oligonukleotidy v ich fotodiesterovej forme sa môžu lahko degradovať v telesných tekutinách pôsobením intracelulárnych a extracelulárnych enzýmov ako sú napr. endonukleázy, ešte pred tým, ako sa prejaví požadovaný účinok. Určité chemické modifikácie ligandových nukleových kyselín možno realizovať s cieľom, aby sa zvýšila in vivo stabilita nukleových kyselín alebo aby sa zlepšil či sprostredkoval prenos ligandovej nukleovej kyseliny do organizmu (pozri napr. patentová prihláška USA č. 08/117,991, podaná 8. septembra 1993, teraz opustená, a Patent USA č. 5,660,985, oba dokumenty s názvom High Affinity
Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides, zahrnuté formou odkazu).
K modifikáciám ligandových nukleových kyselín podlá vynálezu patria, bez toho aby zoznam bol obmedzujúci, také modifikácie, ktoré poskytujú ďalšie chemické skupiny nesúce dostatočný náboj, polarizovatelnosť, vodíkové väzby, elektrostatické interakcie a fluxionalitu báz ligandovej nukleovej kyseliny alebo celej ligandovej nukleovej kyseliny. K modifikáciám patria, bez toho aby zoznam bol obmedzujúci, modifikácie sacharidu v polohe 2', modifikácia pyrimidínu v polohe 5, modifikácia purínu v polohe 8, modifikácia exocyklických amínových skupín, substitúcia 4-tiouridínu, substitúcia 5-brómuracilu alebo 5-jóduracilu, modifikácia kostry, metylácia, neobvyklé kombinácie párovania báz ako napr. izobázy izocytidín a izoguanín a pod. K modifikáciám patria tiež modifikácie 3'- a 5'- koncov ako je napr. pripojenie čiapočky (capping) . Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú ligandové nukleové kyseliny molekuly RNA, ktoré sú modifikované 2'-fluoroskupinou (2'F) na sacharídovej časti pyrimidínového zvyšku.
Modifikácie sa môžu uskutočniť buď pred (pre-SELEX) alebo po uskutočnení postupu SELEX (post-SELEX). Pre-SELEX modifikácie poskytujú ligandové nukleové kyseliny jednak so špecifitou pre ciel ako aj so zlepšenou in vivo stabilitou. Post-SELEX modifikácie urobené na 2'-0H ligandových nukleových kyselín vedú k zlepšeniu in vivo stability bez toho aby poškodili väzbovú schopnosť ligandovej nukleovej kyseliny.
Ďalšie typy modifikácií sú odborníkom známe. Takéto modifikácie sa môžu uskutočniť ako post-SELEX modifikácie (modifikácie skôr identifikovaného ligandu) alebo v priebehu procesu SELEX.
Ligandy podlá predkladaného vynálezu sa pripravili metódou SELEX, ktorá sa podrobne opísala v už citovaných patentových dokumentoch SELEX.
Aptaméry tenascinu-C podľa predkladaného vynálezu sa viažu na heparínové väzbové miesto COOH konca tenascinu-C.
V niektorých uskutočneniach vynálezu sú ligandové nukleové kyseliny pre tenascin-C užitočné na diagnostické účely a môžu sa použiť na zobrazovanie patologických stavov (napr. zobrazovacie metódy pri diagnostike nádorov). Okrem toho ligandové nukleové kyseliny pre tenascin-C sa môžu využiť na prognózy a monitorovanie ochorení, pri ktorých sa exprimuje tenascin-C.
Diagnostické činidlá musia dovoliť identifikovať prítomnosť daného ciela v konkrétnom mieste alebo v určitej koncentrácii. Jednoducho schopnosť vytvárať väzbové páry s cieľom, môže byť dostatočná pre vznik pozitívneho signálu vhodného na diagnostické účely. Odborník je schopný ľahko adaptovať akúkoľvek ligandovú nukleovú kyselinu pre tenascin-C pomocou markera tak, aby mohol sledovať prítomnosť ligandovej nukleovej kyseliny. Také markery, aby sa mohli využiť v celom rade diagnostických aplikácií, napr. na detekciu primárnych nádorov a metastáz alebo na detekciu aterosklerotických lézií. K príkladom značiacich markérov patria technecium-99m a U1ln, hoci je možné použiť aj rad iných markérov ako napr. ďalšie rádionuklidy, magnetické zlúčeniny, fluorofory alebo biotín, ktoré môžu byť konjugované s ligandovou nukleovou kyselinou tenascinu-C na využitie pri zobrazovaní v podmienkach in vivo alebo ex vivo pri diagnostike ochorení, pri ktorých sa exprimuje tenascin-C (napr. rakovina, ateroskleróza alebo psoriáza; . Marker sa môže viazať kovalentne v rôznych polohách ligandovej nukleovej kyseliny tenascinu-C, napr. na exocyklickú aminoskupinu bázy, v polohe 5 pyrimidínového nukleotidu, v polohe 8 purínového nukleotidu, na hydroxylovú skupinu fosfátu, alebo hydroxylovú skupinu alebo inú skupinu na 5'- alebo 3'-konci ligandovej nukleovej kyseliny tenascinu-C.
V uskutočneniach vynálezu, kde marker je technécium-99m alebo inIn, sa marker viaže na 5'- alebo 3'-hydroxylovú skupinu fosfátu alebo v polohe 5 modifikovaného pyrimidínu. V najvýhodnejšom uskutočnení sa marker viaže na 5'-hydroxylovú skupinu fosfátovej skupiny ligandovej nukleovej kyseliny s linkerom alebo bez linkera. V inom uskutočnení vynálezu sa marker konjuguje s ligandovou nukleovou kyselinou tým, že sa do nukleovej kyseliny inkorporuje pyrimidín obsahujúci primárny amín v polohe 5 a tento amín sa potom využije na konjugáciu s markerom. Naviazanie markera sa môže uskutočniť priamo alebo pomocou linkera. V uskutočneniach vynálezu, kde sa použije ako marker 99mTc alebo mIn, je výhodný hexylamínový linker, ako vidno na obr. 10.
V ďalších uskutočneniach vynálezu sú ligandové nukleové kyseliny tenascinu-C užitočné na podávanie terapeutických zlúčenín (napr. cytotoxických zlúčenín, látok zvyšujúcich imunitu, terapeutických rádionuklidov, avšak tento zoznam nie je obmedzujúci) do tkanív alebo orgánov exprimujúcich tenascin-C. K ochoreniam, pri ktorých sa exprimuje tenascin-C, patrí (avšak zoznam nie je obmedzujúci) rakovina, ateroskletóza a psoriáza. Odborník lahko adaptuje akúkoľvek ligandovú nukleovú kyselinu známym postupom tak, aby vytvorila komplex s terapeutickým činidlom. Terapeutická zlúčenina sa môže kovalentne viazať v rôznych polohách ligandovej nukleovej kyseliny tenascinu-C, napr. na exocyklickú aminoskupinu bázy, v polohe 5 pyrimidínového nukleotidu, v polohe 8 purínového nukleotidu, na hydroxylovú skupinu fosfátu alebo hydroxylovú skupinu alebo iné skupiny na 5'- alebo 3'-konci ligandovej nukleovej kyseliny tenascinu-C. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa terapeutické činidlo viaže na 5'-aminoskupinu ligandovej nukleovej kyseliny. Naviazanie terapeutického činidla môže byť priame alebo prostredníctvom linkera. V uskutočneniach vynálezu, kde cieľovým ochorením je rakovina, možno inkorporovať 5-fluórdeoxyuracil alebo iný nukleotidový analóg známy ako účinné protinádorové činidlo, interne do existujúcich U v ligandovej nukleovej kyseline tenascinu-C alebo sa môže pridať interne alebo konjugovať s ktorýmkoľvek z koncov nukleovej kyseliny buď priamo alebo prostredníctvom linkera. Okrem toho sa môžu inkorporovať ako pyrimidínový analóg 2', 2'-difluórcytidín tak aj purínový analóg deoxycoformycin. Patentová prihláška USA č.08/993,765, podaná
18. decembra 1997, zahrnutá formou odkazu, opisuje okrem iného predliečivá, založené na nukleotidoch, ktoré obsahujú ligandové nukleové kyseliny namierené proti nádoru, napr. proti tenascinu—C, na presnú lokalizáciu látok používaných na zvýšenie vnímavosti na chemoterapiu (chemoradiosenzitizers), rádioterapiu (radiosenzitizers), rádionuklidov a iných rádioterapeutických agensov v nádore.
Podľa vynálezu sa môže asociovať s ligandovou nukleovou kyselinou marker i terapeutické činidlo, takže podávanie terapeutického činidla aj detekcia sa uskutočňujú spoločne pomocou zmesi dvoch alebo viacerých modifikovaných verzií toho istého adaptéra. V zmysle vynálezu sa môže tiež marker a/alebo terapeutické činidlo asociovať s neimunogénnou vysokomolekulovou zlúčeninou alebo lipofilnou zlúčeninou ako je napr. lipozóm. Metódy na konjugáciu ligandových nukleových kyselín s lipozómami a vytváranie diagnostických alebo terapeutických komplexov sa opísalo v patentovej prihláške USA č. 08/434,465, podanej 4. mája 1995, s názvom Nucleic Acid Ligand Complexes, ktorá sa zahrnula formou odkazu.
Terapeutické alebo diagnostické prípravky podľa predkladaného vynálezu sa môžu podávať parenterálne injekciou (napr. intravenóznou, subkutánnou, intradermálnou alebo do lézie) aj keď možno využiť iné formy podávania ako je napr. intraartikulárne injekcie, inhalácie hmly, orálne účinné prípravky, transdermálna ionoforéza alebo čapíky. Prípravky podľa vynálezu sa môžu podávať aj lokálne priamou injekciou alebo uvoľnením z terapeutického systému, ako sú implantované stenty alebo katétre, alebo sa dodajú priamo na miesto infúznou pumpou. Výhodným farmaceutickým nosičom je fyziologický roztok, resp. fyziologický roztok, avšak v zmysle vynálezu možno využiť aj iné farmaceutický prijateľné nosiče. V jednom uskutočnení vynálezu tvorí komplex nosiča a ligandovej nukleovej kyseliny tenascinu-C fyziologicky kompatibilnú formu s pomalým uvolňovaním liečiva. Primárne rozpúšťadlo v takomto nosiči je vodnej alebo nevodnej povahy. Nosič môže naviac obsahovať ešte ďalšie farmakologicky prijateľné vehikulá, ktoré udržujú alebo modifikujú pH, osmolaritu, viskozitu, priezračnosť, farbu, sterilitu, stabilitu, rýchlosť rozpúšťania alebo vôňu prípravku. Nosič môže obsahovať ešte ďalšie farmaceutický prijatelné vehikulá modifikujúce alebo udržujúce stabilitu, rýchlosť rozpúšťania, rýchlosť uvoľňovania alebo absorbciu ligandovej nukleovej kyseliny tenascinu-C. K týmto vehikulám patria látky bežne využívané na formuláciu liekov na parenterálne podávanie v jednotkovej alebo násobnej liekovej forme.
Akonáhie sa prípravok formuloval, môže sa skladovať v sterilných nádobkách ako roztok, suspenzia, gél, emulzia, pevná látka alebo dehydrovaný alebo lyofilizovaný prášok. Takéto prípravky možno skladovať vo forme pripravenej na použitie alebo vo forme, ktorá vyžaduje rekonštitúciu bezprostredne pred použitím. Spôsob podávania prípravku, ktorý obsahuje ligandovú nukleovú kyselinu tenascinu-C určeného na systémové podávanie je napr. subkutánne, intramuskulárne, intravenózne, intraarteriálne alebo intranazálne alebo formou vaginálnych alebo rektálnych čapíkov.
Nasledujúce príklady slúžia na vysvetlenie a ilustráciu predkladaného vynálezu a rozsah vynálezu nijak neobmedzujú. Príklad 1 opisuje materiály a experimentálne postupy použité v príklade 2 na prípravu RNA ligandov pre tenascin-C. Príklad 2 opisuje RNA ligandy tenascinu-C a predpovedanú sekundárnu štruktúru selektovaných nukleových kyselín. Príklad 3 opisuje stanovenie minimálnej velkosti nevyhnutnej pre vysokoafinitnú väzbu selektovaných ligandových nukleových kyselín a substitúciu 2'-0H purínov 2'-0Me purínmi. Príklad 4 opisuje biodistribúciu Tc-99 m značených ligandových nukleových kyselín tenascinu-C u myší s nádormi. Príklad 5 opisuje použitie flourescenčne označených ligandových nukleových kyselín tenascinu-C na lokalizáciu tenascinu-C v tkanive nádorov. Príklad 6 opisuje detekciu nádorov in vivo pomocou aptaméru TTA1 (ktorý poznáme tiež pod označením GS7641). Príklad 7 opisuje alternatívne označenie pomocou 111In.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Využitie ligandových nukleových kyselín tenascinu-C a glioblastómových buniek U251
Materiály a metódy
Tenascin-C sa zakúpil od firmy Chemicon (Temecula, CA). Jednoreťazcové DNA priméry a templáty syntetizovala firma Operon Technologies Inc. (Alameda, CA).
Metódu SELEX sme podrobne opísali v patentovej dukumentácii SELEX uvedenej v predchádzajúcej časti prihlášky.
V stručnosti: dvojreťazcové transkripčné templáty sa pripravili extenzným použitím Klenowho fragmentu ssDNA 40N7a: 5'-TCGCGCGAGTCGTCTG(40N)CCGCATCGTCCTCCC-3' (Sekvencia SEQ ID NO: 1) použitím priméru 5N7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3' (Sekvencia SEQ ID NO: 2), ktorý obsahuje promótor T7 polymerázy (podčiarknutý). RNA sa pripravila pomocou T7 RNA polymerázy postupom, ktorý opísali Fitzwater a Polisky (1996) Methods Enzymol. 267: 275-301 (publikácia sa zahrnula formou odkazu). Všetky transkripčné reakcie sa uskutočnili za prítomnosti pyrimidínovéhc nukleotidu, ktorého sacharidová časť sa modifikovala 2'-fluoroskupinou (2'-F) . Táto substitúcia viedla k zvýšeniu rezistencie k ribonukleázam, ktoré využívajú 2'-hydroxylovú skupinu na štiepenie fosfodiesterovej väzby. Špecificky každá transkripčné reakčná zmes obsahovala 3,3 mM 2'-F UTP a 3,3 mM 2'-F
CTP spoločne s 1 mM GTP a ATP.
Počiatočná randomizovaná RNA knižnica poskytla 3 x ΙΟ14 molekúl. Afinity jednotlivých ligandových nukleových kyselín tenascinu-C sa určili štandardným postupom delenia na nitroceluiózovom filtri (Tuerk and Gold (1990) Science 249 496:505-10).
Pre každý cyklus SELEX sa doštičky Lumino (Labsystems, Needham Heights, MA) potiahli, 2 hodiny pri teplote miestnosti, použitím 200 μΐ Dulbeccovho PBS obsahujúceho tenascin-C v koncentrácii uvedenej v tab. 1. Po potiahnutí sa jamky blokovali použitím pufra HBSMC+ [20 mM Hepes, pH 7,4, 137 mM NaCl, 1 mM
CaCl2, 1 mM MgClí a 1 g/1 humánny sérový albumín (Sigma, Frakcia V) na opakovanie cyklov 1 až 6, zatiaľ čo na cykly 7 a 8 sa jamky blokovali pufrom HBSMC+ obsahujúcim 1 g/1 kazeínu (Iblock; Tropix). Väzbový a premývací pufor bol pufor HBSMC+ obsahujúci 0,05% Tween 20. Pre každý cyklus SELEX sa RNA nariedila do 100 μΐ väzbového pufra a nechala sa inkubovať 2 hodiny pri 37 °C v jamkách potiahnutých proteínom, ktorý sa vopred premyl väzbovým pufrom. Po naviazaní sa uskutočnilo 6 premytí vždy po 200 μΐ. Po premytí sa suché doštičky umiestnili na 5 minút na ohrievací blok s teplotou 95 °C. Štandardná reakcia s AMV reverznou transkriptázou (50 μΐ) sa uskutočnila pri 48 °C priamo v jamkách a reakčné produkty sa potom použili na štandardnú PCR a transkripčnú reakciu. V týchto krokoch reverznej transkripcie a amplifikácie templátu sa použili dva syntetické priméry 5N7 (pozri vyššie) a 3N7a: 5'TCGCGCGAGTCGTCTG-3' (Sekvencia SEQ ID NO: 3) .
Na postup SELEX s bunkami sa humánne glioblastómové bunky U251 (Hum. Hered. (1971) 21:238) kultivovali do konfluencie v médiu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) s 10 % fetálnym teľacím sérom (GIBCO BRL. Gaithersburg, MD) na šesťjamkových miskách na kultiváciu tkanív (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) a trikrát sa opláchli Dulbeccovým PBS s CaCl2 (DPBS, GIBCO BRL). RNA označená vnútorne pri transkripcii (Fitzwater (1996) supra) sa inkubovala s bunkami 1 hodinu pri 37°C. Označená RNA sa potom odstránila a bunky sa premyli šesťkrát po 10 min s DPBS pri 37°C. Potom sa pridala DPBS obsahujúca 5 mM EDTA a bunky sa ďalej 30 minút inkubovali, aby sa eluovala naviazaná RNA, ktorá zostala po premytí. Táto RNA sa kvantifikovala štandardným scintilačným postupom a potom amplifikovala metódou RT-PCR.
Väzbový test buniek 0251
Vnútorne označená RNA sa inkubovala so zväčšujúcou sa koncentráciou konfluentných buniek 0251 v šesťjamkových kultivačných miskách (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) 60 minút pri 37°C. Nenaviazaná RNA sa vymyla v troch premytiach po 10 minútach s DPBS+ CaCl2 pri 37 ’C, a viazaná sa odobrala tak, že sa bunky rozrušili Trizolom (GIBCO BRL. Gaithersburg, MD) . Naviazaná RNA sa kvantifikovala štandardným meraním scintilácie.
Klonovanie a sekvenovanie
Amplifikované afinitne obohatené oligonukleotidové pooly sa purifikovali na 8% polyakrylamidovom géle, reverznou transkripciou prepísali do ssDNA a táto DNA sa potom amplifikovala v polymerázovej reťazcovej reakcii (PCR) použitím primérov obsahujúcich miesta pre BamHI a HindlII reštrikčné endonukleázy. PCR fragmenty sa klonovali, plazmidy sa izolovali a DNA sa sekvenovala štandardnými postupmi, ktoré odborníci poznajú (pozri Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2nd Ed. 3 vols., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
Príklad 2
RNA Ugandy tenascinu-C
Ligandové nukleové kyseliny pre bunky U251 sa získali metódou SELEX, ktorá sa opísala v patentovej prihláške USA č. 08/434,425, s názvom Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Tissue SELEX, podaná 3. mája 1995, teraz už Patent USA č. 5,789,157. Následne sa určilo, že získané ligandy sú ligandové nukleové kyseliny tenascinu-C.
Na získanie ligandových nukleových kyselín k humánnemu tenascinu-C sa uskutočnilo 8 cyklov SELEX s randomizovanou nukleotidovou knižnicou, ako je opísané v časti Materiály a metódy. RNA a proteín, ktoré slúžili ako vstupný materiál v každom cykle sú uvedené v tab. 1. Po 8 cykloch SELEX bola afinita oligonukleotidového poolu k tenascinu-C 10 nM, a už sa ďalej nezvyšovala v ďalších cykloch SELEX.
Na získanie ligandov ku glioblastómovým bunkám U251 sa uskutočnilo 9 cyklov SELEX s randomizovanou nukleotidovou knižnicou. Po 9 cykloch väzby na bunky U251 a elúcii EDTA sa produkty z 3., 5. a 9. cyklu testovali na ich schopnosť viazať bunky U251. Obr. 1 ukazuje, že s narastajúcim počtom cyklov SELEX rastie aj množstvo naviazanej RNA pri konkrétnej koncentrácii. Vzhladom k zložitosti cieľa nebolo možné stanoviť afinitu oligonukleotidového poolu k neznámej cieľovej molekule na týchto bunkách.
Pool oligonukleotidov E9 (9 cyklov naviazania a EDTA elúcie z buniek U251) sa potom použil ako východiskový materiál pre ďalší SELEX proti purifikovanému tenascinu-C. Dva Cykly SELEX s purifikovaným tenascinom-C sa uskutočnili rovnako, ako sa opísalo vyššie. Proteíny a RNA koncentrácie v dvoch cykloch SELEX (E9P1 a E9P2) sú uvedené v tabuľke 2.
Celkom sa
experiment, kde
experiment, kde
experiment, kde
uskutočnili tri rôzne experimenty SELEX: SELEX cieľom bol purifikovaný tenascin-C, druhý cieľom boli glioblastómové bunky U251 a tretí pool z experimentu s glioblastómovými bunkami
U251 sa použil ako východiskový materiál v experimente s purifikovaným tenascinom-C ako cielom.
Všetky tri uvedené experimenty sa analyzovali klonovaním a sekvenovaním získaných iigandov z 8 cyklov SELEX proti purifikovanému tenascinu-C (TN sekvencie), z 9 cyklov SELEX proti bunkám U251 (E9 sekvencie), a z dvoch cyklov hybridnej U251/tenascin-C SELEX (E9P2 sekvencie). Sekvencie jedinečných klonov sú ukázané v tabuľke 3 a rozdelili sa do dvoch hlavných skupín: ligandy tenascinu-C (TN a E9P2 sekvencie) a ligandy buniek U251 (E9 ligandy). Medzi ligandami tenascinu-C väčšina klonov (celkom 65) predstavuje jednu z dvoch odlišných tried sekvencii označených ako rodina I a rodina II (pozri obrázok 1).
Vyšetrenie variabilných úsekov 12 klonov z rodiny I ukázalo 7 jedinečných sekvencii, ktoré sú príbuzné prostredníctvom kanonickej (consensus) sekvencie GACNYLJUCCNGCYAC (Sekvencia SEQ ID NO: 12). Vyšetrenie variabilných úsekov 18 klonov z rodiny II odhalilo zdieľanú kanonickú sekvenciu CGUCGCC (Tab. 3). Sekvencie E9 sa môžu zoskupiť podľa konzervatívnych úsekov GAY a CAD vo variabilných úsekoch. Zostávajúce sekvencie nie sú s ostatnými sekvenciami nijak príbuzné a označili sa ako siroty. Tri sekvencie prevládajú, s E9P2-1, E9P2-2 a TN9 reprezentovanými 14x, 16x a lOx v tomto poradí. V kategórii sirôt je jedna sekvencia TN18, zastúpená 2x. Celkovo môžeme zhrnúť, že tieto údaje ukazujú na vysoko obohatený pool sekvencii.
Väčšina jedincov vykazovala nízku nanomolárnu disociačnú konštantu, pričom najčastejšie sekvencie TN9, E9P2-1 a E9P2-2 mali najvyššie afinity, a to 5 nM, 2 nM a 8 nM (pozri tabuľka 3) . Tieto výsledky ukazujú, že metóda SELEX s bunkami U251 je dobrým zdrojom aptamérov pre tenascin-C, pričom len dva cykly SELEX stačili na izoláciu Iigandov špecifických pre tenascin-C z celého poolu SELEX oligonukleotidov. Podobne sa môžu izolovať oligonukleotidové ligandy pre iné proteíny z poolu E9 pomocou purifikovaného proteínového cieľa.
Príklad 3 minimálne velkosti TN9 a
Stanovenie 2'-0Me purínmi:
Použil sa štandardný postup odborníci poznajú (Green et al.
2'-fluórpyrimidínfosforamiditové JBL Scientific (San Luis Obispo, rínové, hexylamínové a styrénový pevný nosič, (Šterling, VA) . Afinity na nitrocelulózovom filtri
Syntéza aptaméru TTA1 substitúcia 2'-OH purínov syntézy oligonukleotidov, ktorý (1995) Chem Biol 2 10:683-95). monoméry sa získali od firmy CA) ; 2' -OMe-purínové, 2'-OH-pumonoméry, a tiež dľ—polyfirmy Glen Research pomocou delenia (CH2CH2O) 6 sa získali od aptamérov sa stanovili (Green et al., supra).
TN9 sa vybral pre ďalšiu analýzu na základe jeho vysokej afinity k tenascinu-C. Najskôr sa skúmala minimálna sekvencia nevyhnutná pre vysokoafinitnú väzbu. Štandardným postupom (Green et al., supra) sa zistilo, že 55 nukleotidov 3'-konca bolo nutných na väzbu na tenascin-C, pričom žiadne nukleotidy sa nemohli odstrániť z 5'-konca bez straty afinity. Na zistenie, či možno TN9 ešte z dĺžky 55 nukleotidov skrátiť a pritom zachovať vysokú afinitu väzby, uskutočnili sa pokusy s vnútornými deléciami v TN9. Prvých 55 nukleotidov TN9 spoločne s prvými 55 nukleotidmi ligandov TN7, TN21, TN41 rodiny II sa analyzovalo počítačovým programom z hľadiska možného usporiadania sekundárnej štruktúry RNA (mfold 3.0,. dostupný na adrese http://www.ibc.wustl.eduhzuker/ (pozri tiež M. Zuker, D.H. Turner. Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide. In: RNA Biochemistry and Biotechnology, J. Barciszewski & B.F.C Clark, eds., NATO ASI Šerieš, Kluwer Academic Publishers, (1999)). Okrem mnohých potenciálnych zostáv RNA predikovaných pomocou použitého algoritmu sa našla štruktúra spoločná každému oligonukleotidu. Táto štruktúra, ktorú predstavuje oligonukleotid TTA1 uvedený na obr. 2, obsahuje 3 stonky stretávajúce sa v jednom bode, tzv. trojstonkový uzol. Pri tomto usporiadaní sú naj konzervatívnejšie nukleotidy z oligonukleotidov rodiny II lokalizované v oblasti uzla. Pri porovnávaní TN9, TN7, TN21 a TN41 sa ukázalo, že druhá stonka má premenlivú dĺžku a sekvenciu, čo viedlo k predpokladu, že extenzia druhej stonky nie je nutná na väzbu na tenascin-C. Pri testovaní tejto väzby sa zistilo, že nukleotidy 10 až 26 sa môžu nahradiť etylénglykolovým linkerom (CH2CH2O)e. Tento linker slúži ako náhradná slučka a znižuje veľkosť aptaméru. Navyše štvornukleotidové slučky (CACU alebo GAGA), ktoré nahradia nukleotidy 10 až 26, vytvoria sekvenciu s vysokou afinitou k tenascinu-C. Odborník lahko stanoví ďalšie nukleotidové slučky alebo iné spacery, ktoré by mohli nahradiť nukleotidy 10 až 26, aby vznikli sekvencie s vysokou afinitou k tenascinu-C.
Na zvýšenie ochrany proti proteázam sa vyhľadali polohy purínov, kde by sa mohli uskutočniť substitúcie príslušnými 2'-OMe-purínovými nukleotidmi. Oligonukletidy sa ľubovoľne rozdelili do piatich sektorov a všetky puríny v jednom sektore sa nahradili príslušnými 2'-OMe-purínovými nukleotidmi, celkovo 5 oligonukleotidov (tabuľka 4, fáza I syntézy). Afinita každého oligonukleotidu k tenascinu-C sa určila a zistilo sa, že všetky puríny v sektoroch 1, 3 a 5 sa môžu nahradiť, bez toho aby došlo k viditeľnej strate afinity. V sektoroch 2 a 4 sa potom substituovali jednotlivé puríny 2'-OMe purínmi a výsledný účinok sa zmeral (tabuľka 4, fáza III syntézy). Z týchto experimentov sa dalo usúdiť, že substitúcia nukleotidov G9, G28, G31 a G34 2'-OMeG viedla k strate afinity k tenascinu-C. Takže tieto nukleotidy sa v aptaméri TTAl ponechali ako 2'-OH puríny.
Aptamér TTAl (Tab. 4) sa potom syntetizoval s linkerom (CH2CH2O)6 (Spacer 18), a 3'-3' dT čiapočkou na ochranu proti exonukleázam, 5' -hexylamínom (Tab. 4) a všetkými purínmi vo forme 2'-OMe, s výnimkou 5 G uvedených v tabulke 4. Neviažuci sa kontrolný aptamér TTA1.NB sa pripravil deléciou 5 nukleotidov na 3'-konci. TTAl sa viaže na tenascin-C rovnovážnou disociačnou konštantou (Kd) 5 nM, kým TTA1.NB má pre tenascin-C Kd > 5 pM.
Nukleotidy 10 až 26 sa môžu nahradiť nenukleotidovým etylénglykolovým linkerom. Je teda pravdepodobné, že TTA1 sa môže syntetizovať v dvoch oddelených častiach, pričom prerušenie je v polohe etylénglykolového linkera a vnesú sa nové 5f- a 3'konce. Po syntéze sa tieto dve molekuly spoločne inkubujú tak, aby sa umožnil vznik hybridu. Táto metóda umožňuje vnesenie ďalších amínových skupín a tiež ďalších nukleotidov na nové 5'a 3'-konce. Na biokonjugáciu sa môžu použiť nové funkčné skupiny. Navyše takáto syntéza v dvoch častiach vedie k vyšším výťažkom, lebo sa syntetizujú kratšie molekuly.
Príklad 4
Biodistribúcia Tc-99m značených aptamérov u myší s nádormi
Biodistribúcia aptamérov sa testovala pomocou konjugácie chelatačného činidla 99raTc (Hi15: Hilger et al. (1998) Tet Lett 39:9403-9406) na 5'-koniec oligonukleotidov, ako vidno na obr. 2, a označením aptaméru ^“Tc. Aptamér vo forme značenej 59mTc vidno na obrázku 10. TTA1 a TTA1.NB sa konjugovali s Hii5 pri koncentrácii 50 mg/ml aptaméru v 30% dimetylformamide s 5 molárnymi ekvivalentmi Hi15-.W-lTydroxysukcínimidu, pufrovaného 100 mM boritanom sodným, pH 9,3; 30 minút pri teplote miestnosti. Po prečistení pomocou HPLC s reverznou fázou sa získali HÍ15-TTAI a Hixs-TTAl.NB. Oligonukleotidy sa potom značili nasledujúcim spôsobom: k 1 nmol Hii5-aptaméru sa pridalo 200 μΐ fosfátového purfru pH 8,5; s 23 mg/ml tartarátu sodného a 50 μΐ 99rTc pertechnetátu (5,0 mCi) eluovaného z kolóny 99Mo (Syncor, Denver) v priebehu 12 hodín. Označovacia reakcia sa zahájila pridaním 10 μΐ SnCl2· Reakčná zmes sa inkubovala 15 minút pri 90°C. Reakcia sa potom oddelila od nezreagovaného 99mTc rotačnou dialýzou cez membránu s prahom molekulovej hmotnosti (cut-off) 30 000 (Centrex, Schleicher & Scheull) s dvomi premytiami po 300 μΐ.
Tento označovací postup viedol k inkorporácii 30% až 50% pridaného 99mTc a špecifickej aktivite 2-3 mCi/nmol RNA. 99mTc sa naviazalo prostredníctvom 5'G, ako je vidno na obr. 5.
Na pokusy s biodistribúciou sa xenotransplantáty nádoru pripravili nasledovne: bunky 0251 sa kultivovali v médiu DMEM (Dulbeccos' Modified Eagle's Médium) s 10% (objem/objem) telacím fetálnym sérom (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) . Atýmusové myši (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) dostali subkutánnou injekciou 1 x 106 buniek U251. Keď nádory dosiahli veľkosť 200-300 mg (za 1 až 2 týždne), 99mTc značené aptaméry sa podali intravenózne v dávke 3,25 mg/kg. V určených časoch sa zvieratá podrobili anestézii izofluranom (isoflurane) (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, ΙΑ) , srdcovou punkciou sa im odobrala krv a zvieratá sa potom utratili a odobrali sa z nich tkanivá. Hladina 99mTc sa merala gama-počítačom (Wallac Oy, Turku, Finland). Príjem aptaméru do tkanív sa meral ako % injekčné aplikovanej dávky na gram tkaniva (% ID/g).
Snímky myší sa získali gama-kamerou. Myši boli pod anestéziou (izofluran) umiestnené na kameru (Siemens, LEM+). Údaje sa zbierali (30 sekúnd až 10 minút) a analyzovali pomocou programového vybavenia Nuclear MAC verzie 3.22.2 (Scientific Imaging. CA) na počítači Power MAC G3 (Apple Computer, CA) .
Biodistribučné experimenty (tab. 5) ukázali rýchly a špecifický príjem aptaméru do tkanív nádoru, neviažuci sa aptamér sa v nádore nezadržal. Hladina 99mTc v krvi klesala velmi rýchlo. Po troch hodinách hladina 99mTc vnesená do nádoru použitím HÍ15-TTAI mala velmi dlhý polčas (> 18 hodín) . To ukazuje, že akonáhle raz aptamér prenikne do nádoru, rádioaktívna značka ním nesená zostáva v nádore dlhý čas. To by ukazovalo, že také cytotoxické činidlá, vrátane rádionuklidov alebo nerádioaktívnych činidiel, konjugované s aptamérmi, by zostávali v nádore s dlhým polčasom.
99mTc rádioaktivita sa objavila i v iných tkanivách, najmä v tenkom a hrubom čreve. Profil hepatobiliálneho klírens, ktorý tu bol pozorovaný, môže odborník ľahko zmeniť, napr. tým, že sa zmení hydrofilnosť chelatačného činidla pre 99mTc, zmení sa chelatačné činidlo alebo sa zmení súčasne rádioaktívna značka i chelatačné činidlo.
Celotelové snímky zvierat sa získali použitím 99mTc značeného HÍ15-TTAI 3 hodiny po injekcii: Snímky myší, ktorým sa injekčné aplikoval HÍ15-TTAI, jasne zobrazujú nádory, kým snímky myší, ktorým sa injekčné aplikovalo HÍ15-TTAI.NB, nie (obr.3). Ďalšia rádioaktivita je pravdepodobná v gastrointestinálnom trakte, ako sa predpovedalo v biodistribučnom experimente.
Príklad 5
Použitie fluorescenčné značeného TTA1 na lokalizáciu tenascinu-C v nádorovom tkanive.
Materiály a metódy
TTA1 a TTA1.NB sa syntetizovali ako sa už opísalo. Fluorescenčné farbivo Succinimdyl Rhodamin-Red-X (Molecular Probes, Eugene, OR) sa konjugovalo na 5'-amínovú skupinu aptaméru, ako sa už opísalo pre H115-NHS konjugáty. Rhodamin-Red-X konjugované aptaméry, TTAl-Red a TTAl.NB-Red, sa purifikovali HPLC s reverznou fázou. Bunkové kultúry U251 a rast nádorov u nahých myší sa taktiež už opísali. 5 nmol TTAl-Red alebo TTAl.NB-Red sa aplikovalo intravenózne do myši a v požadovanom čase sa zviera podrobilo anestézii a perfundovalo sa 0,9 % NaCI a potom utratilo. Nádor sa vyoperoval a vložil do formalínu. Po 24 hodinách vo formalíne sa pripravili 10 pm rezy a rhodamin-Red-X sa detegovala fluorescenčnou mikroskopiou (Eclipse E800, Nikon, Japan).
Výsledky
TTAl-Red mal rovnakú afinitu k tenascinu-C ako nekonjugovaný pôvodný aptamér, TTA1, a to 5 nM. Porovnala sa hladina fluorescencie v nádore pre TTAl-Red a TTAl.NB-Red 10 minút po injekcii. Viažuci sa aptamér TTAl-Red silno sfarbil nádor, ale vôbec nie okolité tkanivá (obr. 4). Oproti tomu pri použití TTAl.NB-Red sa detegovala len vlastná fluorescencia tkanív. Tieto výsledky ukazujú užitočnosť aptamérov podľa vynálezu pre fluorescenčnú detekciu tenascinu-C in vivo.
Príklad 6
Detekcia in vivo pomocou aptaméru TTA1 (GS7641) : ďalšie typy nádorov
Označovanie aptaméru, biodistribúcia a xenotransplantácia nádorov na nahej myši boli zhodné s príkladom 4.
Je známe, že mnohé typy humánnych nádorov exprimujú tenascin-C. Na vyhodnotenie schopnosti TTA1/GS7641 zacieliť aj iné typy nádorov ako glioblastómy, sa kultivovali bunkové línie humánnych nádorov ako nádory na nahých myšiach. Nádorové tkanivá sa potom testovali na expresiu humánneho tenascinu-C, a potom nádory exprimujúce humánny tenascin-C sa testovali na príjem aptaméru.
Obr. 6 ukazuje príjem aptaméru u niekoľkých nádorov, ako napr. u glioblastómu, nádoru prsníka, kolorektálneho nádoru a rabdomyosarkómu. Špecifický príjem do nádoru sa demonštroval na základe porovnania viažuceho sa (TTA1/GS7641) a neviažuceho sa aptaméru (TTA1.NB). Zaujímavé bolo, že KB, xenotransplantát, ktorý exprimuje myšací a nie humánny TN-C, neprejavoval žiadny príjem do nádoru. Tento experiment rozširuje pozorovanie príjmu aptaméru do glioblastómu o ďalšie typy karcinómov a sarkómov, a dokazuje, že všetky nádory exprimujúce humánny tenascin-C vykazujú príjem TTA1/GS7641.
Príklad 7
Alternatívne označovanie pomocou inIn
Xenotransplantáty nádorov a biodistribučné štúdie sa uskutočnili zhodne s príkladom 4. Na naviazanie DTPA a DOTA na TTA1/GS7641, sa cyklický anhydrid každého z nich inkuboval s TTA1/GS7641 obsahujúcim amín v podmienkach neutrálneho pH štandardným spôsobom. Štruktúra DTPA a príslušného konjugátu sa uviedla na obr. 8 a 9, kde sú označené niIn. DOTA-konjugát má identické linkery ako DTPA. DOTA- a DTPA-konjugát sa označili ulIn inkubáciou 30 minút v 95°C v 0,5 M NaOAc, pH 5,5. Po odstránení neinkorporovanej rádioaktívnej značky odstreďovacou dialýzou cez membránu s lítiom priepustnosti 30K sa rádioaktívne označený aptamér preniesol do fosfátom pufrovaného roztoku soli, aby sa mohol injekčné aplikovať myšiam nesúcim nádory.
Biodistribúcia aptaméru značeného llxIn sa výrazne odlišovala od prípravkov značených Tc opísaných v príklade 4. Obr. 7 ukazuje, že v porovnaní s TTA1/GS7641 označeným S9mTc je rádioaktivita z TTA1/GS7641 označeného inIn v intestinálnom trakte značne znížená a súčasne sa zvýši príjem do pečene a obličiek. Tento experiment ukazuje, že chemické vlastnosti chelatačného činidla majú významný vplyv na distribúciu rádioaktívnej značky TTA1/GS7641 v živom zvierati. Biodistribučné profily odlišné od profilov Hi15-TTAl/GS7641 môžu byť užitočné na zacielenie nádoru za určitých klinických stavov, kedy hepatobiliárne klírens nie je žiaduce. K takýmto klinickým stavom patria, bez toho aby zoznam bol obmedzujúci, rádioterapeutické aplikácie a zobrazovanie intestinálneho traktu, prostaty a ďalších abdominálnych oblastí.
Tabuľka 1
Tenascin-C SELEX RNA a proteínový prísun
Cyklus Tenascin-C (pmol/jamka) RNA (pmol/j amka)
1 12 200
2 12 200
3 12 200
4 12 200
5 2 33
6 2 33
7 2 33
8 0,2 3,3
Tabuľka 2
Tenascin-C SELEX RNA a proteínový prísun v bunkovom SELEX
Cyklus Tenascin-C (pmol/jamka) RNA (pmol/ jamka)
E9P1 2 33
E9P2 2 33
Φ o
c φ
>
φ ts>
CM
Q_ σ>
TO
C “O o
CĽ s
c o
S S S 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 S
c C C c c c C C C C C c C C
o o O in o o lf) CM 00 o o in O m
m ^4 CM CM CM CM M*
o ul
U
U 3 U U U O
X
LLI —J
LXJ
CZ)
O
T3 •O
Φ
O
C
Φ >
_Í«£ ω
w
LO
CM
Φ ε
«φ c
TO >
O
Φ ’c jQ
N _l CL LLJ • · CZ)
o 1 Φ
3 >
C O
Ό 2mÍ
ω C
TO 3
c J3
Φ 3
Φ O
“3
o Ό
c Φ > Φ ε
•ω
Φ
w c
TO
CO > O
TO
U—
3 -Q TO U. 3 CL
h- TO
Ô
Q σ
ω
CZ3
X σ' u
u u
σ' o
ϋ «J σ>
u x
θ' x
u υ
α ο
□ υ
υ χ
υ υ
υ u
s ο
υ χ
υ
X ο
X
U
U
U
X (Z u
u υ
>·
X υ
ο υ
υ >
X
ia m (O 10
(0 <0 (0 σ σ σ σ
σ σ σ u U υ u
υ u u o u u u
υ o υ o □ □ u
u u υ σ σ σ σ
σ σ σ a u υ υ
υ u u 3 □ 3 □
3 3 3 □ u U u
U a U (0 10 ίο (0
(0 (0 X σ σ σ σ
σ σ σ u U ϋ u
u u u σ (0 ιο ια
<0 (0 <0 σ σ σ σ
σ σ σ 10 10 10 <0
<0 (0 <0 u u u υ
υ u u 0
2
υ o 0
υ 0 U U U ο
u u 0 0 0 0 0
ο u (Z 2 2 2 X
ο υ 2 0 0 0 0
2 o 0 0 0 0 2
0 2 2 2 2 2 U
Ο u 0 2 2 2 0
u u 0 «X 2 2 u
ο u 0 2 0 2 0
2 0 0 «X X 0 u
U u 0 2 2 2 2
u x 2 X X X x
0 2 2 0 0 0 0
2 2 2 0 0 0 x
a. U X 0
υ 0 0 0 0 0
x 2 rf 0 u 2 0
2 X Z (Z (Z X 0
u 2 2 2 2 2 2
u 2 rf «X tZ 2 X
x 0 rf 0 0 0 0
u 0 0 0 0 0 0 0
u 0 0 0 u 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0
a. 0 0 0 0 0 0
2 2 2 2 2
<z 2 2 0 0 0 X 0
0 0 0 U U U 2 0
u 0 0 0 u 2 0 0
u 0 0 2 rf 0 2
u X 2 <z rf X 2
x 2 «X 0 rf o 0
0 0 0 0
0 0 0 2 0
c x 2 2 x X 2
2 2 0 2 0 2 0
X X a. 2 0 0 2
υ 0 0 0 2 x 0
u 0 0 X 0 2 X
u 0 0 0 X x
x 0 0 X 2
2 □ 2 2 2
θ' σ σ σ σ σ σ σ
σ σ σ σ σ σ σ σ
u u υ u u u u υ
o σ σ σ 0 σ σ σ
3 3 3 3 3 3 3 3
X >0 χ (Π (0 (0 10 10
0 σ σ σ 0 σ σ σ
u υ υ u υ u u u
X m χ (D X π 10 >0
σ' σ σ σ σ σ σ σ
θ' σ σ σ σ σ σ σ
x m <0 χ «ί π ιο 10
u σ σ σ σ σ σ σ
σ σ σ σ σ σ σ σ
σ> σ σ σ σ σ σ σ
o H Γ4
TinkCr'COO'nT-lH
CO Λ s (N m 04 £2 *** *“’ Φ
H kf) C\ (Μ «Τ V O
Η^<Γ(\|(ηΗ^·Νζ
ZZZZZZZZo
σ σ σ σ σ σ σ
σ σ σ σ CT σ σ
υ u υ u u u u
σ σ σ σ θ' σ σ
3 3 3 3 3 3 3
(0 (0 10 10 to ιο ιο
σ σ σ σ cn σ σ
u u υ υ u υ υ
«ο (0 ιο (0 (0 10 ιο
σ σ σ σ θ' σ σ
σ σ σ σ σι σ σ
10 X 10 BJ TO (0 m
σ σ σ σ σ' σ σ
σ σ σ σ θ' σ σ
σ σ σ σ σ' σ σ
(0 X x
σ σ σ
u ω u
υ u u
u u u
σ σ σ
u u u
3 3 3
υ U υ
10 X x
σ σ σ
u u u
(0 x x
σ σ σ
(0 x x
υ u u
ο ω 0 l
0 0 2 (
0 u U 1
0 u 0 1
2 u u :
2 u 2 :
0 2 0 i
2 O 2 :
0 0 0 i
0 0 0 i
Ο u 0 :
0 0 rf .
2 0 rf :
2 2 rf
0 2 2
0 X X
0 0 2
X 0 0
0 2 x
0 2 2
0 2 0
0 0 X
0 0 x
2 2 0
X 2 2
0 0 0
0 0 0
X 0 0
2 2 X
0 U 0
0 2 u
2 U 2
0 2 σ
X 2 0
X 2 u
0 2 0
0 0 x
0 X 0
2 2 0
X 0 2
σ σ σ
σ σ σ
0 u υ
σ σ σ
3 3 3
X X X
σ σ σ
υ u u
X x x
σ σ σ
σ σ σ
X x x
σ σ σ
σ σ σ
σ σ σ
E9P2-17 23 gggaggacgaugcgg AUGGCAAGUCGAACCAUCCCCCACGCUUCUCCUGUUCCCC cagacgacucgcccga
E9P2-22 24 gggaggacgaugcgg ACUAGACcgCGAGUCCAUUCAACUUGCCCAAAAaAAAACcUCCCC cagacgacucgcccga
E9P2-40 25 gggaggacgaugcgg GAGAUCAACAUUCCUCUAGUUUGGUUCCAACCUACACCCC cagacgacucgcccga
E9P2-41 26 gggaggacgaugcgg ACGAGCGUCUCAUGAUCACACUAUUUCGUCUCAGUGUGCA cagacgacucgcccga
ΤΝΪ8 27 gggaggacgaugcgg UCGACCUCGAAUGACUCUCCACCUAUCUAACAUCCCCCCC cagacgacucgcccga
m *5· m LO Γ- 00 σ\
i-U rM T”4 cH
..
LO
m 00
*—* -- 3
o-H CM m O co
ι 1 1 ·—* rH c:
CM CM CM T-4 —» Φ
CU CU CU r* CM σ* 0Q
CTi σ> σ> z Z z Z C
ω ω ω Em e- H H O υ
O «—< CM CM CM CM
Γ* 03
τΉ ΤΓ τ—1
CMI <Ν| Λ
oj Ο. Q.
σ' σ σ
ωι ω| ωΙΙ
s
O τΗ
Λ £
O
Λ m to σ σι υ υ
<0 <0 (TJ σι θ' σ» υ u u u υ u ο υ σ' σ' σ' u u u 3 3 U U TO TO /0 σ' σ' σ' u υ υ TO TO TO σ' σ' cn TO TO TO U U U
(0 X θ' G x θ' G G
m σ> x G G
σ G θ' G σ'
u G G σ»
u <0 G U G 3
□ σ» σ> G □ G
u u σ' G X
u u □ G X o*
□ u G □ σ> G
u σ> X G G x
to u θ' X x σ'
σ □ G θ' θ' x
u u X U x u
<0 <0 σ> X u
σ' x θ'
0 u G x CJ
□ to G a CJ
θ' CJ CJ
to u u CJ
U G u a u 3
a u u 3 CJ
u cj CJ CJ x
u CJ 3 CJ U CJ
< a CJ 3 rf u
o u 3 CJ rf 3
fí. u 3 3 rf CJ
□ 3 U CJ rf u
u U 3 CJ t£ 3
u 3 U 3 (J 3
3 3 U CJ X
2 3 3 •X u CJ
u U 3 2 CJ CJ
υ U <x CJ 3 CJ
o 3 u x 3 3
3 3 3 CJ CJ 3
U) «C < 3 X X
a U U CJ 2 CJ
3 3 3 3 u U
3 3 3 X 3 u
3 3 3 3 3 3
O «C <X X X x
<£ U U CJ u u
3 3 x
U 3 «5 x
3 U 2 CJ CJ
CJ * 3 3 CJ
U a 3 CJ u x
3 u U x 3 CJ
3 <£ U CJ CJ CJ
tíj u 3 U X 3
CJ 3 3 3 CJ x
(Z 3 3 U CJ CJ
U U X cj CJ
U CJ CJ 2 CJ CJ
3 3 3 u CJ CJ
«X «X «X x x
CJ Ľ) Ľ) CJ u
rt U (J u x
U 3 X x 3
CJ CJ U
3 3 x
Φ c
TO >
O »O
TO
σ' θ' σ> θ' θ' θ' θ' θ' σ» σ θ' CJ σ> σ> θ' σ» θ' θ' σ' σ>
θ' θ' σ' σ> σ> σ' θ' σ' σ σ' σ> σ> σ» LU σ' σ> σ' cn σι σ>
G G G G G G G G G G G G u G G G u G ο
θ' σ' σ> σ> θ' σ> θ' σ» σ> σ' σ> θ' σ> θ' σ θ' θ' θ' θ'
□ 3 3 3 3 3 3 3 □ 3 3 3 3 3 □ 3 3 3 3
x X X X X X X X X X X X X X X X X X X
σ' θ' σ' θ' θ' θ' σ' σ σ> σ» σ' θ' σ> LJ σ' θ' σ» σ> σι σι
G G G G G G G G G G G G G LU G G G G G u
x X X X X X X X X X X X X TO X X X X X X
θ' σ' σ> θ' σ σ' θ' θ' θ' σ> θ' θ' σ> σ> σι θ’ σ' σ' θ'
θ' σ' θ’ θ' σ» σ> θ' θ' σ» θ' σ> σ> θ' Ο σ' σ> θ' σ> θ' θ'
x X X X X X X X X X X X X »33 X X X X X «
σ θ' σ' θ' σ' θ' σ' θ' σ> θ' σ' σ> θ' *Φ θ’ θ’ σ' θ' σ> σ»
θ' σ' σ» σ' σ' θ' σ» σ> σ σ' σ< θ’ θ' σ’ σ' σ σ σ> θ'
σ> σ' σ' θ' σ' σ σ' θ' σ' σ' σι σ σ> >-> σ σ σ' σ σ» θ'
•Φ
O
CL
CO
TO
-Q
TO
αο σι ο ^4 04 m ΤΡ LT) Ό r** CD σι O TO 04 m n· Tp m <0
OJ 04 (Ώ η (Ο η η ΓΟ cn m m cn CL TO
X
LU
U 1 1 1 CO
σι o L±J CO m 04
ο τΗ Γ~ σ\ •’Τ kO o o r4 CO ko m <*Ί σ\
ιΓ) 00 CM (Ο 04 ιΠ ro co rH rH rH m t 1 t I 1 I
Ζ Ζ Ζ Ζ Ζ Ζ Ζ Z Z Z Z Z Z CN σ» σ» σι σι σ\ <Τι
Η e-· Η Ε-ι É-· Η Η Ε-» E-· H H H H ZD b3 ω ω ω U3 w
i C X C S c s c 2 S C tí
o CN vo o r- n ^3* O
rd CN c rd
S s X s x x X y y
C C C c c c C d d
in CN r* f m in P Víl
vo CN H p rd CN m in r*
X
C in
X in
Λ
in m m m m
3 3 3 us
3 3 3 D
O U U CJ O
U U U Cl o u u u u o □ 3330 U U Cl Cl U
CD 3 3 us us
in m m in in in in ui m
US vo vo VO vo vo vo vo vo
O O O O O O O 3 O
3 C U u U U CJ CJ CJ
3 CJ u CJ u CJ CJ CJ CJ
CJ CJ CJ CJ CJ CJ u CJ CJ
O 3 O 3 3 □ 3 3 3
u CJ CJ CJ CJ CJ CJ U U
vo vo vo vo vo vo vo vo vo
Tabulka 4: 2'-0Me substitúcie, vnútorné delécie, TTA1 a TTA1.NB
O
G ω
cn
Φ
S
O
CU
CD
N •CO
U.
o c
o >
Φ cn
3 vo vo VO vo vo VO vo VO vo C
CD 3 3 3 3 3 US vo □ □ 3 3 3 3 3 3 3
O 3 3 3 □ □ 3 □ P P p P P P P P P cť
«< «5 *C «tí «tí P P vo vo vo vo vo vo vo vo vo vo
O 3 3 3 3 3 vo vo vo US vo US US US vo vo vo □
3 3 3 3 3 3 US vo 3 □ 3 3 3 3 3 3 3 r*
3 3 0 0 3 3 □ □ P P P P P P P P P Ό
3 $ 5 3 5 p P P P P P P P P P P MO
eC «tí <X *3. <C »tí p P 3 □ 3 □ 3 3 3 3 3 0
3 3) 3) 3 o 3 □ 3 3 3 3 3 3 U 3 3 31 r*
CD 3 3 3 3 vo 3 vo 3 u U 3 3 3 U 3 3 r*.
CJ CJ 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0
CJ CJ 3 3 U 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 31 3 0
CD 3 3 3 3 vo 3 US 3 3 3 3 U 3 3 3 3 {j
CJ CJ 3 3 3 3 3 3 □ 3 3 3 3 3 3 3 3 (j
3 0 3 3 3 3 □ 3 3 3 3 3 3 O vol 3 3 0
CD o 3 3 3 US 3 vo 3 3 3 3 3 U 3 3 3 Cj
CJ u 3 U 3 3 3 3 3 □ 3 □ 3 3 3 3 3 o
3 ΐ) 3 3 3 3 3 3 3 3 U 3 3 3 3 3 U u
CJ u U 3 U 3 3 3 P P P P P P P P P 0
«tí < *5 p < ftí P 3 3 3 U 3 U 3 U 3 i
CJ CJ 3 3 3 3 3 3 vo vo vo vo US vo vo US vo \e
CD 0 3 3 vo 3 3 vo □ 3 3 3 3 3 3 3 3 Λ
3 □ 3 3 3 3 3 3 P P P P P P P P P o
3 P P P P P P P P P P P c« 0
«C (4, «tí «tí P «tí «tí P 3 3 3 3 U 3 3 3 3 r »
CJ 0 3 3 3 3 3 3 P P P P P P P P P e·
Š S P 5 *$ P P P P P P P P P P 0
*c P «c «tí P US vo US vo US vo VO vo vo 0
σ 3 3 3 vo 3 3 vo vo 3 3 3 3 vol 3 3 3
Oi 3 3 vo 3 3 3 VO 3 3 3 3 3 U U 3 3 1
CJ O 3 3 3 3 3 3 vo 3 3 3 3 vol 3 3 3 0
Dl 0 3 vo 3 3 3 US □ □ □ 3 3 3 3 3 3 0
3 D 3 3 3 3 3 3 E P «tí «tí «tí p| «tí «ΐ «tí «tí r*
R) «tí P «tí »tí P CD vo 3 3 vol 3 3 3 3 3 vo
01 CD 3 vo 3 3 3 VO U U U 3 U U U U U VO
U u 3 3 3 3 3 3 X P «tí p| «< «tí «tí <tí «tí «tí r*
(D < P «< <tí «tí P ω vo vo| 3 3 3 3 3 3 3 vo
tr 3 3 vo 3 3 3 vo .c. vo VO vo vo US vo US vo vo vo
cn cd vo 3 3 3 3 vo P P P P P P P P P 0
Q «t: P «tí «tí «tí «tí P II vo vo vo vo vo vo vo VO vo rd
Oi 3 vo 3 3 3 3 vo t— vo vo vo vo vo vo vo vo vo 1
Dl 3 vo 3 3 3 3 vo vo vo vo vo vo vo vo vo vo
O) 3 vo 3 3 3 3 vo CD i—l rd rt r·1 rH H i—1 i-l T-l in
['•οοιοηνιί’?
^^^•ιηιηιηιηιη
2a£ >o o
Q.
CD »Ó il
M“) <
f“
C
CO c
<
Φ
S
O
Ôd ιηνοΓ*®σ\θΗ<ΜΓϊ iflifliniflifluuujtf xr
H
O
O CN 00 r-» XJ* in0<0<0000 minininintninintn (ΝΠί*ΐι*ιηηΓΩΠΓΠ
VO
rd CN n xr in (D II rd rd rd H rd rd rd rd rd
x X x x X X r* x x x x x x x x x
n n» Xj· xj· Xí· XJ* xj* • * XJ· xj* y y xr Xj* xr xj* ··
□ —- rd
σν ov σν σν σν σν σν σι E CD ov ov σν ov cn cn ov ov σι «<
s Z z z z z z z II N z z z z z z z Z z Eh
£-< H H H H t- ŕ- Eh »<D IX E-· Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh Eh
TTAl.NB: 65 5·-1G667667CG-(CH2CH,O) (-CGUCGCCGU77U667U6UUUU6CU5
O o en o o CM m f- O O co m 05 o o T· τ-
r· CO CM ▼· o m en o 00 í- p— CD r- m o O O Ο
ťM o O o T“ CN m s T“ O <0 v o o o o o
CM Ó O d o a o d d O O en O o T· d d d
44 44 -H -H -H -H 44 -H -H H Ή +1 44 44 44 -H 44 44 44 44
m O O r— T- O < a O 05 cn O) < O o en CO < O O O ľ—
2 r— (N en CM S 2 CM Mt n- m CD γ- m CM en n- m y— O
mt <n CO CM n* (0 CM T- i CM ρ- cp o r— v CO o O o
< MT lO Mt T* d O O en CO Mt T“ T d CM ο r· CM OO ‘T— d Τ’ d d d
o O O 00 CO m O O CO o h- en O o 05 CO f— o o cn CM CM cn
eD MT CM o o in r- en n· n- MT TT OO en o CO en 05 o O O o
CM 05 o O o o CM o O r- CN CM o cn oo f— T“ o o O O o
V d d d d d d d fsi d d d d d d r- d d d d d d d o d
44 44 44 44 44 4i 44 44 44 44 44 H 44 44 44 44 44 44 44 44 H 44 44 41
O O Mt CO O O O CO 05 05 o O o 05 CM en CO o o n- CO en
en 00 CD 05 r*» CO Mt 05 05 00 CD 05 i— r— co τ- o
00 IO CM O CO O Γ- CN CN cn OO r- CM CM CM CO O O Ο o
Mt d T“ d O d en l< ιο t“ d d CM d d ed Τ- d r· d d d O d
Mt T· CM
CM O O o o o CM o o O o o CM o o o Ο o CM o o o O o
CO 00 h* CM CO 00 h- CN 5^· co 00 Γ- CM co CO p— CM
U5 O m“ in O ιο o m“ m O
ro >o
H
O
•Φ O •o O CO
> -Q > >
C. Φ 3 a? w
/11 k_
»o -C »o
Tabuľka 5: Biodistribúcia Tc-99m-TTA1 a TTA1.NB m
z
T“
É
O O OO r·
O T- -r- O O σι cn q o o ó o o o o co in a n to σ> i- o o in t-; o o o o o d d o o o in cn cn to cn a o o O) cn o o o d d d d d o o m o cn in cn cn m o cn eo o O o d d d d o o
cn
44 44 44 44 44 41 44 44 44 44 44 44 44 44 Ή 44 44 44 44 44 44
O O p— en 00 en r- CM n· í O O O r* O O en 00 O
T“ CM v— Mt O cn en n* CM MT O CO CM T· m (D
ip O o o O o o O z 05 O o z 05 MT CM o Z CO
V en o d d in CM d d O co d d d r< 05 d d d n*
o o o o co o CD m cn M— o O co co o O Mt r- en o
05 o CO CO en mt o o O o CO o o o en m 05 00 o
m en o o CM o o o O CM o o o o o m CM O o o o Mt
d d d d d d d d d d d d d d d ó d d d d d d
44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 44 -H 44 44 44 44 44 44 44
O O 05 en 05 O r- m CM CM en CO O O Γ- ao co r-. o O n· m O
P— Mt co 00 0) m *n· co en O r- en ΙΟ n- CM O CM CO en O O ί- O
MT 05 CO CO V·“ CM CM O o o 05 T— r· O O O MT CM n* ο
in CM M- 00 CM d d d d CO CM d d d b 05 CM d d d in
ex O O O o o
CO 00 f*. CM v IO o ex o o o o o CO CO I*- CN
1- IO O
CN O O O O O t- co oo r- cn i- CO O
CN O O O O O t- to co r- cn v lO O
CM
2.460 ± 0 210 1.220 ± 0.120
0.643 ± 0 076 0.110 ± 0.015
180 0.198 ± 0.026 0.038 1 0.005
570 0.062 ± 0.004 0.020 ± 0.001
1020 0.030 ± 0.003 N/A
O •CO >
k.
CO
c
CO o >c Φ >o N _Φ
φ CO
oZ O-
Zoznam sekvencii <110> Gilead Sciences, Inc.
<120> Nukleové kyseliny ako ligandy tenascinu-C <130 NEX 86/PCT <140 <141>
<150> 09/364,902 <151> 1999-07-29 <160> 65 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 71 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220 <221> modifikovaná báza <222> (1)..(56) <223> N v polohách 17-56 je A, C, T, alebo G <400 1 tcgcgcgagt cgtctgnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnccgc 60 atcgtcctcc c 71 <210 2 <211> 32 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <400> 2 taatacgact cactataggg aggacgatgc gg 32 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <400> 3 tcgcgcgagt cgtctg 16 <210> 4 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 4 gggaggacga ugcggcaauc aaaacucacg uuauucccuc aucuauuagc uuccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 5 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 5 gggaggacga ugcggcaauc uccgaaaaag acucuuccug cauccucuca ccccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 6 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1) . . (71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 6 gggaggacga ugcggcaacc ucgaaagacu uuucccgcau cacuguguac ucccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 7 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 7 gggaggacga ugcggcaacc ucgauagacu uuucccgcau cacuguguac ucccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 8 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400> 8 gggaggacga ugcggcaacc ucaaucuuga cauuucccgc accuaaauuu gcccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 9 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220 <221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400 9 gggaggacga ugcggcaaac gaucacuuac cuuuccugca ucugcuagcc ucccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210 10 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400 10 gggaggacga ugcggacgcc agccauugac ccucgcuucc acuauuccau ccccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210 11 <211> 70 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1) .. (70) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400> 11 gggaggacga ugcggccaac cucauuuuga cacuucgccg caccuaauug ccoocagacg 60 acucgcccga 70 <210> 12 <211> 15 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1) . . (15) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<220>
<221> modified_base <222> (1) . . (15) <223> N v polohách 4 a 10 je A, G, 2'-F-U alebo 2’-F-C <400> 12 gacnyuuccn gcayc 15 <210> 13 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <22C>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<22i> modifikovaná báza <222> (1) . .(71) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400> 13 gggaggacga ugcggaaccc auaacgcgaa ccgaccaaca ugccucccgu gcccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 14 <21i> 70 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <223>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(70) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400> 14 gggaggacga ugcggugccc auagaagcgu gccgcuaaug cuaacgcccu cccccagacg 60 acucgcccga 70 <210> 15 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 15 gggaggacga ugcggugccc acuaugcgug ccgaaaaaca uuucccccuc uaccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 16 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 16 gggaggacga ugcggaacac uuucccaugc gucgccauac cggauauauu gcucccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 17 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 17 gggaggacga ugcggacugg accaaaccgu cgccgauacc cggauacuuu gcucccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 18 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 18 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccugcagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 19 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F, <400> 19 gggaggacga ugcgguuaag ucucgguuga augcccaucc cagauccccc ugacccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 20 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 20 gggaggacga ugcggauggc aagucgaacc aucccccacg cuucuccugu ucccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 21 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1) .. (71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 21 gggaggacga ugcgggaagu uuucucugcc uugguuucga uuggcgccuc ccccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(21) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 22 gggaggacga ugcggucgag cggucgaccg ucaacaagaa uaaagcgugu cccugcagac 60 gacucgcccg a 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 23 gggaggacga ugcggauggc aagucgaacc aucccccacg cuucuccugu ucccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 24 <211> 76 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(76) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 24 gggaggacga ugcggacuag accgcgaguc cauucaacuu gcccaaaaaa aaaccucccc 60 cagacgacuc gcccga 76 <210> 25 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F, <400> 25 gggaggacga ugcgggagau caacauuccu cuaguuuggu uccaaccuac acccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 26 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 26 gggaggacga ugcggacgag cgucucauga ucacacuauu ucgucucagu gugcacagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 27 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 27 gggaggacga ugcggucgac cucgaaugac ucuccaccua ucuaacaucc ccccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 28 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina < z 2 0 >
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 28 gggaggacga ugcggucgac cucgaaugac ucuccaccua ucuaacagcc uuccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 29 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400> 29 gggaggacga ugcggagaac ucauccuaac cgcucuaaca aaucuugucc gaccgcagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 30 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400> 30 gggaggacga ugcggauaau ucgacaccaa ccaggucccg gaaaucaucc cucugcagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 31 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400> 31 gggaggacga ugcggaaacc aaccguugac caccuuuucg uuuccggaaa guccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 32 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400> 32 gggaggacga ugcggaagcc aacccucuag ucagccuuuc guuucccacg ccacccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 33 <211> 72 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> mcdifikcvaná báza <222> (1)..(72} <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 33 gggaggacga ugcgggacca acuaaacugu ucgaaagcug gaacaugucc ugacgccaga 60 cgacucgccc ga 72 <210> 34 <211> 7i <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 34 gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcugg aacacguccu gacgccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 35 <211> 71 <212> RNA ' <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 35 gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcuag aacacgucca gacgccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 36 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<4 00> 36
gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcugg aacacguucu gacucgcccg a gacgccagac 60 71
<210> 37
<211> 71
<212> RNA
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina
<220>
<221> modifikovaná báza
<222> (D · · (71)
<223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400> 37
gggaggacga ugcggaccaa cuaaacuguu cgaaagcugg aauacguccu gacgccagac 60
gacucgcccg a 71
<210> 38
<211> 71
<212> RNA
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina
<220>
<221> modifikovaná báza
<222> (D · · (71)
<223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400> 38
gggaggacga ugcggaaguu uagugcucca guuccgacac uccucuacuc agccccagac 60
gacucgcccg a 71
<210> 39
<211> 71
<212> RNA
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina
<220>
<221> modifikovaná báza
<222> (D · · (71)
<223> Všetky pyrimidiny sú 2'F.
<400> 39
gggaggacga ugcggagcca gagccucucu caguucuaca gaacuuaccc acuggcagac 60
gacucgcccg a 71
<210> 40 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 40 gggaggacga ugcggaccua acucaaucag gaaccaaacc uagcacucuc auggccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 41 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 41 gggaggacga ugcgggagau caacauuccu cuaguuuggu uccaaccuac acccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 42 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1) . . (71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 42 gggaggacga ugcggaucuc gauccuucag cacuucauuu cauuccuuuc ugccccagac 60 gacucgcccg a 71 <21O> 43 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 43 gggaggacga ugcggacgau ccuuuccuua acauuucauc auuucucuug ugccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 44 <211> 71 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(71) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 44 gggaggacga ugcggugacg acaacucgac ugcauaucuc acaacuccug ugccccagac 60 gacucgcccg a 71 <210> 45 <211> 72 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(72) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 45 gggaggacga ugcggacuag accgcgaguc cauucaacuu gcccaaaaac cucccccsga 60 cgacucgccc ga 72 <210> 46 <211> 70 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(70) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F.
<400> 46 gggaggacga ugcgggcgca ucgagcaaca uccgauucgg auuccuccac ucccccagac 60 gacugcccga 70 <210> 47 <211> 50 <212> RNA
<213> Umelá sekvencia
<220 <223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina
<220> <220 <222> <223> modifikovaná báza (D . . (50) Všetky pyrimidíny sú 2' a 51 je 3'-3’. F; väzba v polohách 50
<400 47
gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu 50 <210 48 <211> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F; väzba v polohách 55 a 56 je 3’-3’.
<400> 48 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 49 <211> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F; g v polohách 1-3, 5 a 55 sú 2'0Me; ”a v polohe 4 je 2'0Me; väzba v polohách 55 a 56 je 3'-3'.
<400 49 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 50 <211> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <22 0>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F; g v polohách 6, 9, 12 a 14 sú 2'0Me; a v polohách 7 a 10 sú 2'0Me; väzba v polohách je 3'-3'.
<400> 50 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug <210> 51 <211> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F; g v polohách 15 a 22 sú 2'OMe; a v polohách 16-17, 19-20 a 24 sú 2'0Me; väzba v polohách 55 a 56 je
3’-3 ' .
<400> 51 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug <210> 52 <211> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidiny sú 21 F; g v polohách 38, 41 a 44 sú 2'OMe; väzba v polohách 55 a 56 je 3'-3'.
<400> 52 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug <210> 53 <211> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F; ”g v polohách 39-40, a 48 sú 2'0Me; a v polohách 36-37 a 41 sú 2'0Me; väzba v polohách 55 a 56 je 3'-3' .
<400> 53 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug
<210> 54
<2il> 55
<212> RNA
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina
<220> <2 21 > modifikovaná báza
<222> (D · · (55)
<223> Všetky pyrimidíny sú 2 ' F; ' g v polohách 1-3,
5-6, 9, 12, 14-15, a 55 sú 2'0Me. 22, 28, 31, 34, 39-40, 43,
< 2 2 Ο >
<220 modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Αν polohách 7, 10, 16-17, 19-20, 24, 36-37, a 41 sú 2'OMe; väzba v polohách 55 a 56 je 3'-3' .
<400> 54 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 55 <2I1> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220 <221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F; g v polohách 1-3,
5-6, 9, 12, 14-15, 22, 39-40, 43~ 48 a 55 sú 2'0Me; a v polohách 4,7, 10, 16-17,19-20,
24-36-37, 40 sú 2'0Me.
<220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Väzba v polohách 55 a 56 je 3'—3 ' .
<400> 55 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210 56 <210 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220 <221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F; g v polohách 1-3,
5-6, 15, 22, 39-40, 43, 48 a 55 sú 2'0Me; a v polohách 4, 16-17,19-20, 24 36-37 a 40 sú 2'0Me; väzba v polohách 55 a 56 je 3'-3'.
<400> 56 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 57 <211> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F; ”g v 1-3, 5, 15, 22,
39-40, 43, 48, 55 sú 2'OMe; a v 4, 7, 16-17,
19-20, 24, 36-37, 40 sú 2'0Me; väzba v 55, 56 je 3’-3’.
<400> 57 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 58 <211> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidiny sú 2'F; g v 1-3, 5, 9, 15, 22,
39-40, 43, 48, 55 sú 2'OMe; ”a v 4, 16-17,
19-20, 24, 36-37, 41 sú 2'OMe; väzba v 55, 56 je 3'-3’.
<400> 58 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 59 <211> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidiny sú 2' F; ”g v 1-3, 5, 15, 22,
39-40, 43, 48 a 55 sú 2'OMe; a v 4, 10,
16-17, 19-20, 24, 36-37, a 41 sú 2'0Me; väzba v 55 a 56 je 3'—3'.
<400> 59 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug <210> 60 <211> 55 <212> RNA <213> umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F; g v 1-2, 5, 12, 14-15,
22, 39-40, 43, 48 a 55 sú 2'OMe; a v 4,
16-17, 19-20, 24, 36-37 a 41 sú 2'OMe; väzba v 55 a 56 je 3'-3'.
<400> 60 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug <210> 61 <211> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1) . . (55) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F; g v 1-3, 6, 15, 22,
28, 39-40, 43, 48, a 55 sú 2'OMe; ”a v 4,
16-17, 19-20, 24, 36-37 a 40 sú 2'CMe; väzba v 55 a 56 je 3'-3'.
<400> 51 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug <210> 62 <211> 55 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <22C>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(55) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F; g v 1-3, 5, 15, 22,
39-40, 43, 48 a 55 sú 2'OMe; a v 4, 16-17,
19-20, 27, 36-37 a 40 sú 2'OMe; väzba v 55 a 56 je 3'-3'.
<400> 62 gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug
<210> 63
<211> 55
<212> RNA
<213> Umelá sekvencia
<220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina
<220>
<221 > modifikovaná báza
<222> (D . . (55)
<22 3> Všetky pyrimidíny sú 2 'F; g v 1-3, 5, 15, 22,
39-40, 43, 43 a 55 sú 2'0i:e; a v 4, 16-17,
19-20, 24, 36-37, a 40 sú 2 'OMe; väzba v 55
a 56 je 3'-3 ' .
<400> 63
gggaggacga ugcggaacaa ugcacucguc gccguaaugg auguuuugcu cccug 55 <210> 64 <211> 39 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(39) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F; g v polohách 2-3,
5-6, 23-24, 27, 32, a 39 sú 2ΌΚ5; a v polohách 4, 7, 20-21, a 25 sú 2'C?4e;.
<220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(39) <223> Väzba v polohách 39 a 40 je 3'-3'.
<220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(39) <223> N v polohe 10 je (CH2CH20)o <400 64 gggaggacgn cgucgccgua auggauguuu ugcucccug 39 <210> 65 <211> 34 <212> RNA <213> Umelá sekvencia <220 <223> Opis umelej sekvencie: Nukleová kyselina <220 <221> modifikovaná báza <222> (1)..(34) <223> Všetky pyrimidíny sú 2'F; g v polohách 2-3,
5-6, 23-24, 27 a 32 sú 2'CMe; a v polohách 4, 7, 20-21, a 25 sú 2'0Me <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1) .. (34) <223> N v polohe 10 je (CH2CH2O)6 <220>
<221> modifikovaná báza <222> (1)..(34) <223> väzba v polohách 34 a 35 je 3' - 3' <400> 65 gggaggacgn cgucgccgua auggauguuu ugcu 34

Claims (8)

1/8
Obr. 1
Viazaná RNA (pmol) o
1. Ligandová nukleová kyselina pre tenascin-C identifikovaná spôsobom, ktorý obsahuje nasledujúce kroky:
a) kandidátna zmes nukleových kyselín sa privedie do kontaktu s tenascinom-C, pričom nukleové kyseliny, ktoré majú zvýšenú afinitu k tenascinu-C v porovnaní s kandidátnou zmesou sa môžu oddeliť od zvyšku kandidátnej zmesi;
b) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa oddelia od zvyšku kandidátnej zmesi;
c) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa amplifikujú, čím sa získa zmes nukleových kyselín obohatená nukleovými kyselinami s relatívne vysokou afinitou a špecificitou pre väzbu na tenascin-C, čím sa môže identifikovať ligandová nukleová kyselina tenascinu-C.
2. Ligandová nukleová kyselina podlá nároku 1, kde kandidátna zmes nukleových kyselín obsahuje j ednoreťazcové nukleové kyseliny. 3. Ligandová nukleová kyselina podlá nároku 2, kde
jednoreťazcové nukleové kyseliny sú ribonukleové kyseliny.
3/8
Obr. 3
TTA1
TTA1.NB nádor rf
Obr.
4. Ligandová nukleová kyselina podlá nároku 3, kde kandidátna zmes nukleových kyselín obsahuje ribonukleové kyseliny modifikované 2'-fluoroskupinou.
5/8
Obr. 5
LINKER
5. Purifikovaná a izolovaná ligandová nukleová kyselina pre tenascin-C, ktorá sa nevyskytuje v prírode.
6/8
Obr. 6
468 435
Obr. 7
6. Purifikovaná a izolovaná ligandová nukleová kyselina, ktorá sa nevyskytuje v prírode, podľa nároku 5, kde ligandová nukleová kyselina je jednoreťazcová.
7/8
Obr. 8
Obr. 9
HO2C—\ /“Λ z-CO2H .N N.
111ln ho2c hexylamínový linker aptamér
7. Purifikovaná a izolovaná ligandová nukleová kyselina, ktorá sa nevyskytuje v prírode, podlá nároku 6, kde ligandová nukleová kyselina je RNA.
8. Purifikovaná a izolovaná ligandová RNA, ktorá sa nevyskytuje v prírode, podľa nároku 7, kde ligandová RNA obsahuje nukleotidy modifikované 2'-fluoroskupinou.
9. Purifikovaná ligandová RNA, ktorá sa nevyskytuje v prírode, podlá nároku 8, kde ligandová RNA sa vybrala zo skupiny obsahujúcej sekvencie uvedené v tabuľkách 3 a 4 a na obrázku 2.
10. Spôsob identifikácie ligandových nukleových kyselín pre tenascin-C, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky:
a) kandidátna zmes nukleových kyselín sa privedie do kontaktu s tenascinom-C, pričom nukleové kyseliny majúce zvýšenú afinitu k tenascinu-C v porovnaní s kandidátnou zmesou sa môžu oddeliť od zvyšku kandidátnej zmesi;
b) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa oddelia od zvyšku kandidátnej zmesi;
c) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa amplifikujú, čím sa získa zmes nukleových kyselín obohatená nukleovými kyselinami s relatívne vysokou afinitou a špecificitou pre väzbu na tenascin-C, čím sa môže identifikovať ligandová nukleová kyselina tenascinu-C.
11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje krok:
d) opakujú sa kroky a), b) a c).
12. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že kandidátna zmes nukleových kyselín sa skladá z jednoreťazcových nukleových kyselín.
13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že jednoreťazcová nukleové kyseliny sú ribonukleové kyseliny.
14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že nukleové kyseliny sú ribonukleové kyseliny modifikované 2'-fluóroskupinou.
15. Komplex na použitie pri in vivo diagnostike, ktorý obsahuje ligandovú nukleovú kyselinu tenascinu-C a marker.
16. Komplex podľa nároku 15, kde ligandová nukleová kyselina tenascinu-C sa identifikovala spôsobom, ktorý obsahuje nasledujúce kroky:
a) kandidátna zmes nukleových kyselín sa privedie do kontaktu s tenascinom-C, pričom nukleové kyseliny majúce zvýšenú afinitu k tenascinu-C v porovnaní s kandidátnou zmesou sa môžu oddeliť od zvyšku kandidátnej zmesi;
b) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa oddelia od zvyšku kandidátnej zmesi;
c) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa amplifikujú, čím sa získa zmes nukleových kyselín obohatená nukleovými kyselinami s relatívne vysokou afinitou a špecificitou pre väzbu na tenascin-C, čím sa môže identifikovať ligandová nukleová kyselina tenascinu-C.
17. Komplex podlá nároku 16, kde kandidátna zmes nukleových kyselín sa skladá z jednoreťazcových nukleových kyselín.
18. Komplex podlá nároku 17, kde jednoreťazcové nukleové kyseliny sú ribonukleové kyseliny.
19. Komplex podľa nároku 18, kde kandidátna zmes nukleových kyselín obsahuje ribonukleové kyseliny modifikované 2'-fluoroskupinou.
20. Komplex podľa nároku 15, kde marker sa vybral zo skupiny obsahujúcej rádionukiidy, fluorofory, magnetické zlúčeniny a biotín.
21. Komplex podľa nároku 20, kde rádionuklid sa vybral zo skupiny obsahujúcej 99mTc (technécium-99m) , 188Re, 64Cu, 67Cu, 18F, 125I, 131I, iuln, 32P, a 186Re.
22. Komplex podľa nároku 21, kde marker je technécium-99m.
23. Komplex podľa nároku 22, ktorý ďalej obsahuje linker.
24. Komplex podľa nároku 23, kde linker má nasledujúcu štruktúru:
-o
I
O_ P _o μ
o
25. Komplex podľa nároku 24, ktorý je nasledujúci:
kde všetky A sú modifikované skupinou 2'-OMe, všetky G, s výnimkou označených, sú modifikované skupinou 2'-OMe, všetky C sú modifikované skupinou 2'-F a všetky U sú modifikované skupinou 2'-F.
26. Spôsob prípravy komplexu obsahujúceho ligandovú nukleovú kyselinu tenascinu-C a marker vyznačujúci sa tým, že obsahuje nasledujúce kroky:
a) kandidátna zmes nukleových kyselín sa privedie do kontaktu s tenascinom-C, pričom nukleové kyseliny majúce zvýšenú afinitu k tenascinu-C v porovnaní s kandidátnou zmesou sa môžu oddeliť od zvyšku kandidátnej zmesi;
b) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa oddelia od zvyšku kandidátnej zmesi;
c) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa amplifikujú, čím sa získa zmes nukleových kyselín obohatená nukleovými kyselinami s relatívne vysokou afinitou a špecificitou pre väzbu na tenascin-C; a
d) na ligandovú nukleovú kyselinu tenascinu-C sa kovalentne naviaže marker.
27. Spôsob podlá nároku 26, vyznačujúci sa tým, že marker sa vybral zo skupiny obsahujúcej rádionuklidy, fluorofory, magnetické zlúčeniny a biotín.
28. Spôsob pódia nároku 27, vyznačujúci sa tým, že rádionuklid sa vybral zo skupiny obsahujúcej 99mTc, 188Re, 64Cu, 67Cu, 18F, 125I, 131I, luIn, 32P, a 186Re.
29. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že marker je technécium-99m.
30. Spôsob podlá nároku 29, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje linker.
31. Komplex podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že linker má nasledujúcu štrukúru:
-O
I ,o_ p_o
II o
32. Komplex podlá nároku 31, vyznačujúci sa tým, že komplex je nasledujúci:
ξ,Ί (CH2CH2O)6 linker
Hexylamínový linker kde všetky A sú modifikované skupinou 2'-OMe, všetky G, s výnimkou označených, sú modifikované skupinou 2'-OMe, všetky C sú modifikované skupinou 2'-F a všetky U sú modifikované skupinou 2'-F.
33. Spôsob detekcie prítomnosti ochorenia, pri ktorom sa exprimuje tenascin-C v biologickom tkanive, ktoré je postihnuté chorobou, vyznačujúci sa tým, že obsahuje nasledujúce kroky:
a) identifikuje sa ligandové nukleová kyselina z kandidátnej zmesi nukleových kyselín, pričom táto ligandové nukleová kyselina je ligandom tenascinu-C, spôsobom keď
i) kandidátna zmes nukleových kyselín sa privedie do kontaktu s tenascinom-C, pričom nukleová kyselina majúca zvýšenú afinitu k tenascinu-C v porovnaní s kandidátnou zmesou sa môže oddeliť od zvyšku kandidátnej zmesi;
ii) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa oddelia od zvyšku kandidátnej zmesi;
iii) nukleové kyseliny so zvýšenou afinitou sa amplifikujú, čím sa získa zmes nukleových kyselín obohatená o nukleové kyseliny s relatívne vysokou afinitou a špecificitou pre väzbu na tenascin-C, čím sa identifikuje ligandová nukleová kyselina tenascinu-C; a
b) na uvedenú ligandovú nukleovú kyselinu identifikovanú v kroku iii) sa naviaže marker použiteľný na in vivo diagnostiku, čím sa pripraví komplex marker-ligandová nukleová kyselina;
c) tkanivo, ktoré môže obsahovať nádor, sa vystaví komplexu marker-ligandová nukleová kyselina; a
d) deteguje sa prítomnosť komplexu marker-ligandová nukleová kyselina v tkanive, čím sa identifikuje ochorenie, pri ktorom sa exprimuje tenascin-C.
34. Spôsob podlá nároku 33, vyznačujúci sa tým, že komplex marker-ligandová nukleová kyselina ďalej obsajuje linker.
35. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že marker sa vybral zo skupiny obsahujúcej rádionuklidy, fluorofory, magnetické zlúčeniny a biotín.
36. Spôsob podlá nároku 35, vyznačujúci sa tým, že ráčionuklid sa vybral zo skupiny obsahujúcej 99rnTc, 188Re, 64Cu, 67Cu, 18F, 125I, 131I, luIn, 32P, a 186Re.
37. Spôsob podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že marker je technécium-99m.
38. Spôsob podlá nároku 37, v y z že linker má nasledujúcu štrukúru:
tým, že
Spôsob podlá nároku 38, vyznačujúci sa tý komplex marker-ligandová nukleová kyselina je nasledujúci:
(CH2CH2O)6 linker kde všetky A sú modifikované skupinou 2'-0Me, všetky G, s výnimkou označených, sú modifikované skupinou 2' -OMe, všetky C sú modifikované skupinou 2'-F a všetky U sú modifikované skupinou 2'-F.
40. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje krok, v ktorom sa ku komplexu naviaže terapeutické alebo diagnostické činidlo.
41. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že ochorenie patrí do skupiny obsahujúcej rakovinu, psoriázu a aterosklerózu.
42. Spôsob podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že ochorenie je rakovina.
43. Spôsob podávania terapeutického činidla pri ochorení, pri ktorom sa exprimuje tenascin-C, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky pri ktorých sa ligandová nukleová kyselina tenascinu-C kovalentne naviaže na terapeutické činidlo a vytvorí s ním komplex, a tento komplex sa podáva pacientovi.
8/8
Obr. 10 (CH2CH2O)6 Iinker
b........
Q
ΟγΝ, ZN
Έ JlÍH V
J ggcgUu
A'U G-C 9 σε
O-P-O-*G-C ô U-G-3’-3’-T • =2’ OH G
Hexylamínový Iinker všetky A sú modifikované skupinou 2’-OMe, všetky G, s výnimkou označených, sú modifikované skupinou 2’-OMe, všetky C sú modifikované skupinou 2’-F a všetky U sú modifikované skupinou 2’-F.
SK122-2002A 1999-07-29 2000-01-28 Tenascin-c nucleic acid ligands SK1222002A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/364,902 US6232071B1 (en) 1990-06-11 1999-07-29 Tenascin-C nucleic acid ligands
PCT/US2000/002167 WO2001009390A1 (en) 1999-07-29 2000-01-28 Tenascin-c nucleic acid ligands

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK1222002A3 true SK1222002A3 (en) 2002-09-10

Family

ID=23436596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK122-2002A SK1222002A3 (en) 1999-07-29 2000-01-28 Tenascin-c nucleic acid ligands

Country Status (29)

Country Link
US (4) US6232071B1 (sk)
EP (1) EP1198589B9 (sk)
JP (1) JP2003505111A (sk)
KR (1) KR100605072B1 (sk)
CN (2) CN100558411C (sk)
AT (1) ATE405675T1 (sk)
AU (1) AU767501C (sk)
BG (1) BG106361A (sk)
BR (1) BR0013170A (sk)
CA (1) CA2380473A1 (sk)
CZ (1) CZ2002365A3 (sk)
DE (1) DE60039986D1 (sk)
DK (1) DK1198589T3 (sk)
EA (1) EA004795B1 (sk)
EE (1) EE200200051A (sk)
ES (1) ES2310989T3 (sk)
HK (1) HK1048499B (sk)
HR (1) HRP20020186A2 (sk)
HU (1) HUP0202221A3 (sk)
IL (2) IL147872A0 (sk)
MX (1) MXPA02000819A (sk)
NO (1) NO20020424L (sk)
NZ (2) NZ516907A (sk)
PL (1) PL201637B1 (sk)
RS (1) RS50426B (sk)
SK (1) SK1222002A3 (sk)
UA (1) UA75578C2 (sk)
WO (1) WO2001009390A1 (sk)
ZA (1) ZA200200747B (sk)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6232071B1 (en) * 1990-06-11 2001-05-15 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
US7005260B1 (en) * 2000-01-28 2006-02-28 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
CA2328356A1 (en) 1999-12-22 2001-06-22 Itty Atcravi Recreational vehicles
US7645743B2 (en) * 1999-12-22 2010-01-12 Altermune, Llc Chemically programmable immunity
PT1401853E (pt) 2001-05-25 2010-12-07 Univ Duke Modulador de oligonucleotídeos
CA2487809A1 (en) * 2002-06-18 2003-12-24 Archemix Corp. Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US20040249130A1 (en) * 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US8853376B2 (en) 2002-11-21 2014-10-07 Archemix Llc Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US10100316B2 (en) 2002-11-21 2018-10-16 Archemix Llc Aptamers comprising CPG motifs
US8039443B2 (en) * 2002-11-21 2011-10-18 Archemix Corporation Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US7727969B2 (en) * 2003-06-06 2010-06-01 Massachusetts Institute Of Technology Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery
WO2006093932A2 (en) * 2005-03-01 2006-09-08 Cedars-Sinai Medical Center Use of eotaxin as a diagnostic indicator for atherosclerosis and vascular inflammation
UY29460A1 (es) * 2005-04-08 2006-11-30 Noxxon Pharma Ag Acidos nucleicos de union a ghrelin
EP3056509A1 (en) 2006-09-08 2016-08-17 Piramal Imaging SA Bombesin analogues for use in diagnosis
EP1897562A1 (en) * 2006-09-08 2008-03-12 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Aptamers labelled with Gallium-68
US20110136099A1 (en) 2007-01-16 2011-06-09 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
US8975026B2 (en) 2007-01-16 2015-03-10 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
SI2489743T1 (sl) * 2007-07-17 2015-04-30 Somalogic, Inc. Aptameri s 5-(N-naftilno) substituiranimi uridini
EP2036981A1 (en) * 2007-09-12 2009-03-18 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Aptamers labeled with 18F
BRPI1011269A2 (pt) 2009-05-05 2016-09-27 Altermune Technologies Llc imunidade quimicamente programável
US8841429B2 (en) 2009-11-03 2014-09-23 Vivonics, Inc. Nucleic acid ligands against infectious prions
US8236570B2 (en) 2009-11-03 2012-08-07 Infoscitex Methods for identifying nucleic acid ligands
GB201114662D0 (en) 2011-08-24 2011-10-12 Altermune Technologies Llc Chemically programmable immunity
CN102533772B (zh) * 2011-12-12 2013-10-09 中国科学院武汉病毒研究所 一种抗hbv诱饵适体及其筛选方法
JP6158825B2 (ja) * 2011-12-12 2017-07-05 オックスフォード ユニヴァーシティ イノヴェーション リミテッド テネイシンｃおよび関節リウマチにおけるその使用
CN104661664B (zh) 2012-07-13 2020-07-03 波涛生命科学有限公司 手性控制
CN107058596A (zh) * 2017-06-19 2017-08-18 上海市第十人民医院 一种与恶性胶质瘤诊断相关的标志物及其应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986005803A1 (fr) 1985-03-30 1986-10-09 Marc Ballivet Procede d'obtention d'adn, arn, peptides, polypeptides ou proteines, par une technique de recombinaison d'adn
WO1989006694A1 (en) 1988-01-15 1989-07-27 Trustees Of The University Of Pennsylvania Process for selection of proteinaceous substances which mimic growth-inducing molecules
US6232071B1 (en) * 1990-06-11 2001-05-15 Gilead Sciences, Inc. Tenascin-C nucleic acid ligands
US5789157A (en) * 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
KR970002255B1 (ko) * 1990-06-11 1997-02-26 넥스스타 파아마슈티컬드, 인크. 핵산 리간드
US6610841B1 (en) * 1997-12-18 2003-08-26 Gilead Sciences, Inc. Nucleotide-based prodrugs
US6127119A (en) * 1990-06-11 2000-10-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands of tissue target
US5496938A (en) * 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
IE920562A1 (en) 1991-02-21 1992-08-26 Gilead Sciences Aptamer specific for biomolecules and method of making
US5683874A (en) * 1991-03-27 1997-11-04 Research Corporation Technologies, Inc. Single-stranded circular oligonucleotides capable of forming a triplex with a target sequence
US5582981A (en) * 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
US5436132A (en) * 1993-02-13 1995-07-25 Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Quantitative determination of tenascin as glioma marker
US5859228A (en) * 1995-05-04 1999-01-12 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
US6229002B1 (en) * 1995-06-07 2001-05-08 Nexstar Pharmaceuticlas, Inc. Platelet derived growth factor (PDGF) nucleic acid ligand complexes
ATE318143T1 (de) * 1996-10-25 2006-03-15 Gilead Sciences Inc Gefaesszellen wachstumsfaktor (vegf) nukleinsaureligand-komplexe
US6242246B1 (en) * 1997-12-15 2001-06-05 Somalogic, Inc. Nucleic acid ligand diagnostic Biochip

Also Published As

Publication number Publication date
KR100605072B1 (ko) 2006-07-26
CN1365395A (zh) 2002-08-21
BG106361A (bg) 2002-10-31
NZ528077A (en) 2005-04-29
EP1198589A1 (en) 2002-04-24
EA004795B1 (ru) 2004-08-26
AU3351900A (en) 2001-02-19
EP1198589A4 (en) 2003-02-19
HK1048499B (zh) 2005-05-13
BR0013170A (pt) 2002-04-02
DK1198589T3 (da) 2008-11-17
NO20020424D0 (no) 2002-01-28
CN100558411C (zh) 2009-11-11
CA2380473A1 (en) 2001-02-08
US20030104377A1 (en) 2003-06-05
US6596491B2 (en) 2003-07-22
IL147872A (en) 2008-06-05
EE200200051A (et) 2003-04-15
RS50426B (sr) 2009-12-31
EP1198589B9 (en) 2009-08-12
MXPA02000819A (es) 2003-07-14
PL353357A1 (en) 2003-11-17
US20060105378A1 (en) 2006-05-18
HRP20020186A2 (en) 2004-02-29
DE60039986D1 (de) 2008-10-02
PL201637B1 (pl) 2009-04-30
NO20020424L (no) 2002-03-27
UA75578C2 (en) 2006-05-15
HK1048499A1 (en) 2003-04-04
HUP0202221A3 (en) 2010-01-28
YU6402A (sh) 2005-03-15
CZ2002365A3 (cs) 2002-06-12
AU767501B2 (en) 2003-11-13
US20040058884A1 (en) 2004-03-25
CN1589908A (zh) 2005-03-09
EA200200094A1 (ru) 2002-08-29
ES2310989T3 (es) 2009-02-01
ZA200200747B (en) 2004-01-28
CN1164760C (zh) 2004-09-01
NZ516907A (en) 2003-10-31
WO2001009390A1 (en) 2001-02-08
ATE405675T1 (de) 2008-09-15
IL147872A0 (en) 2002-08-14
HUP0202221A1 (en) 2002-10-28
US6232071B1 (en) 2001-05-15
AU767501C (en) 2004-06-17
KR20020092897A (ko) 2002-12-12
JP2003505111A (ja) 2003-02-12
EP1198589B1 (en) 2008-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK1222002A3 (en) Tenascin-c nucleic acid ligands
US6699843B2 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to PDGF
JP4176466B2 (ja) 前立腺特異的膜抗原に対する核酸リガンド
ES2426160T3 (es) Complejos de ligandos de ácidos nucleicos de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)
JP2003506025A (ja) Ｃｄ４０リガンドに対する核酸リガンド
JP2003505111A5 (sk)
Perkins et al. Radiolabelled aptamers for tumour imaging and therapy
TW201103983A (en) Aptamer against chymase and use thereof
KR20140083039A (ko) 글루카곤 결합형 핵산
WO2009033876A1 (en) Aptamers labeled with 18f
WO2001087351A1 (en) Method for treatment of tumors using nucleic acid ligands to pdgf
US7005260B1 (en) Tenascin-C nucleic acid ligands
EP4382133A1 (en) Pharmaceutical composition for treating triple negative breast cancer, containing non-natural nucleic acid ligand as active ingredient
CN118202053A (zh) 一种调节补体C3表达的siRNA、其缀合物和药物组合物及用途

Legal Events

Date Code Title Description
FC9A Refused patent application