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JP2003505111A - テネイシンｃの核酸リガンド - Google Patents

テネイシンｃの核酸リガンド

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Publication number
JP2003505111A
JP2003505111A JP2001513645A JP2001513645A JP2003505111A JP 2003505111 A JP2003505111 A JP 2003505111A JP 2001513645 A JP2001513645 A JP 2001513645A JP 2001513645 A JP2001513645 A JP 2001513645A JP 2003505111 A JP2003505111 A JP 2003505111A
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JP
Japan
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nucleic acid
tenascin
nucleic acids
complex
ligand
Prior art date
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Application number
JP2001513645A
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English (en)
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JP2003505111A5 (ja
Inventor
ヒッケ，ブライアン
ウォーレン，スティーブン
パーマ，デイビッド
ゴールド，ラリー
Original Assignee
ジリード サイエンシズ，インコーポレイティド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by ジリード サイエンシズ，インコーポレイティド filed Critical ジリード サイエンシズ，インコーポレイティド
Publication of JP2003505111A publication Critical patent/JP2003505111A/ja
Publication of JP2003505111A5 publication Critical patent/JP2003505111A5/ja
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、テネイシンＣに対する核酸リガンドの同定方法及び調製方法を記載する。本発明は、SELEX 法により同定されたテネイシンＣに対する特定の核酸リガンドを含む。また、本発明は、生物学的組織において、テネイシンＣを発現している病症状の存在を検出する方法も含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本文では、テネイシンＣに対する高親和性核酸リガンドを記載する。また、テ
ネイシンＣに対する高親和性核酸リガンドを同定する方法及び調製する方法を記
載する。この様な核酸リガンドを同定するために用いる方法をSELEX と呼ぶ。こ
れは、「指数関数的な集積によるリガンドの系統的進展（Systemic Evolution o
f Ligands by Exponential enrichment）」の頭文字である。更に、テネイシン
Ｃに対する高親和性核酸リガンドを開示する。更に、テネイシンＣに対するRNA
リガンドを開示する。また、ピリン及びピリミジンの２’の位置で化学的に修飾
されたヌクレオチド誘導体を含んでいるオリゴヌクレオチドも含まれる。更に、
2'-F及び2' OMe修飾を含んでいるテネイシンＣに対するRNA リガンドを開示する
。本発明のオリゴヌクレオチドは、診断薬及び／又は治療薬として有用である。
【０００２】発明の背景 テネイシンＣは、1.1〜1.5×106Da の６量体の糖タンパク質であり、主に細胞
外マトリクスに存在している。テネイシンＣは、胚発生、傷の治癒及び新生組織
形成中に発現し、これは、組織の再構築における当該タンパク質の役割を示唆す
る（Erickson and Bourdon (1989) Ann Rev Cell Biol 5 : 71-92）。新生組織
形成過程は組織再構築にも関係し、そしてテネイシンＣは、多くの腫瘍タイプ、
例えば肺、乳房、前立腺及び大腸のカルシノーマ、アストロサイトーマ、グリオ
ブラストーマ、メラノーマ、及びサルコーマにおいて過剰に発現している（Soin
i et al. (1993) Am J Clin Pathol 100 (2) : 145-50 ; Koukoulis et al. (19
91) Hum Pathol 22 (7) : 636-43 : Borsi et al. (1992) Int J Cancer 52 (5) : 688-92 ; Koukoulis et al. (1993) J Submicrosc Cytol Pathol 25 (2) : 2
85-95 ; Ibrahim et al. (1993) Hum Pathol 24 (9) : 982-9 ; Riedl et al. (
1998) Dis Colon Rectum 41 (1) : 86-92 ; Tuominen and Kallioinen (1994) J
Cutan Pathol 21 (5) : 424-9 ; Natali et al. (1990) Int J Cancer 46 (4)
: 586-90 ; Zagzag et al. (1995) Cancer Res 55 (4) : 907-14 ; Hasegawa et
al. (1997) Acta Neuropathol (Berl) 93 (5) : 431-7 ; Saxon et al. (1997)
Pediatr Pathol Lab Med 17 (2) : 259-66 ; Hasegawa et al. (1995) Hum Pat
hol 26 (8) : 838-45). In addition, tenascin-C is overexpressed in hyperp
roliferative skin diseases, e.g. psoriasis (Schalkwijk et al. (1991) Br
J Dermatol 124 (1) : 13-20). and in atherosclerotic lesions (Fukumoto et
al. (1998) J Atheroscler Thromb 5 (1) : 29-35 ; Wallner et al. (1999) C
irculation 99 (10) : 1284-9). Radiolabeled antibodies that bind tenascin
-C are used for imaging and therapy of tumors in clinical settings (Paga
nelli et al. (1999) Eur J Nucl Med 26 (4) : 348-57 ; Paganelli et al. (1
994) Eur J Nucl Med 21 (4) : 314-21 ; Bigner et al. (1998) J Clin Oncol 16 (6) : 2202-12 ; Merlo et al. (1997) Int J Cancer 71 (5) : 810-6)。
【０００３】 テネイシンＣに対するアプタマーは、ガンの診断と治療、並びにアテローム性
動脈硬化症の診断と治療、及び乾癬の治療のために潜在的な有用性を有している
。抗体と比べて、アプタマーは、小さくて（７〜20kDa ）、血液から非常に速や
かに排除され、そして化学的に合成される。血中レベルが、画像を妨げる背景の
主な決定因子であるので、急速な血液クリアランスは、インビボにおける画像的
診断にとって重要である。また、血中レベルは毒性に寄与しうるので、急速な血
液クリアランスは治療上でも重要であろう。SELEX 技術は、迅速なアプタマーの
単離を可能にし、そして化学的合成により、アプタマーと、種々の非反応性で且
つ生物活性な分子との容易で且つ部位特異的な結合が可能である。従って、テネ
イシンＣに対するアプタマーは、腫瘍の治療、あるいはインビボ又はエキソビボ
の画像診断のために、そして／又は、テネイシンＣを発現している疾病症状の治
療のための、テネイシンＣの核酸リガンドと複合体化した種々の治療剤の供給の
ために、有用であろう。
【０００４】 長年のドクマは、核酸は主に情報上の役割を有するということであった。「指
数関数的な集積によるリガンドの系統的進展」法として知られている、SELEX 法
と呼ばれる方法を通して、核酸は、タンパク質と異なることなく、三次元立体構
造上の多様性を有することが明かとなった。このSELEX 法は、標的分子に非常に
特異的な結合能を有する核酸分子のインビトロでの進化のための方法であり、米
国特許出願07/536,428（1990年６月11日出願、名称「Systematic Evolution of
Ligands by Exponential Enrichmeut」、現在放棄されている）；米国特許 5, 4
75,096（名称「Nucleic Acid Ligands」）；米国特許 5,270,163（WO91/19813参
照）（名称「Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands」）に記載されて
いる。これらの出願の各々を、ここでは総称してSELEX 特許出願と呼び、それら
には、任意の所望の標的分子に対する核酸リガンドを作るための根本的に新しい
方法が記載されている。
【０００５】 SELEX 法は、各々が特有の配列を有し、かつ所望の標的化合物又は分子に特異
的に結合する特性を有する、核酸リガンド又はアプタマーと称される一群の生産
物を提供する。SELEX 法により同定された各核酸リガンドは、所定の標的化合物
又は分子の特異的リガンドである。SELEX 法は、核酸が、種々の二次元及び三次
元構造を形成するための十分な能力を有し、かつモノマー又はポリマーに拘わら
ず、実際上任意の化学化合物と（特異的結合対を形成する）リガンドとして機能
するために、当該モノマー内に利用可能な十分な化学的多様性を有するという独
特な見識に基づいている。SELEX 法では、任意の大きさ及び組成の分子が標的と
して機能しうる。
【０００６】 高親和性結合の応用に適用されるSELEX 法は、結合親和性及び選択性の任意の
所望の基準を事実上達成するために、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選
択、並びに同一の総合的選択行程による結合、分画及び増幅の段階的な繰り返し
を必要とする。SELEX 法は、核酸、好ましくはランダムな配列部分を含んでなる
核酸の混合物から始まり、結合に有利な条件下で、その混合物を標的に接触させ
る過程；標的分子に特異的に結合する核酸から、結合しない核酸を分画する過程
；核酸−標的複合体を解離する過程；核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅
して、リガンドが濃縮された核酸混合物を生産する過程；そして、標的分子に対
する特異的な高親和性核酸リガンドを得るために望まれる多数回のサイクルを通
して、結合、分画、解離及び増幅する過程を反復する過程を含んでいる。
【０００７】 本発明者は、SELEX 法により、化学化合物としての核酸は、広範な形状、大き
さ、及び立体構造を有する群を形成し、そして、生物学的なシステムにおいて核
酸が示すものよりもはるかに広範な種類の結合性やその他の機能を有しうること
が証明されることを認識している。
【０００８】 多くの特定の目的を達成するために、基本的なSELEX 法が改変されている。例
えば、米国特許出願07/960,093（1992年10月14日出願、現在放棄されている）及
び米国特許 5,707,796（両方とも、名称「Method for Selecting Nucleic Acids
on the Basis of Structure」）には、特定の構造特性を有する核酸分子、例え
ば屈曲したONA 、を選択するために、ゲル電気泳動と共にSELEX 法を用いること
が記載されている。米国特許出願08/123,935（1993年９月17日出願、名称「Phot
oselection of Nucleic Acid Ligands」、現在は放棄されている）、米国特許 5
,763,177（名称「Systematic Evolution of Ligands by Exponential Eurichmen
t : Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX 」）及び米
国特許出願09/093,293（1998年６月８日出願、名称「Systematic Evolution of
Ligands by Exponential Eurichment : Photoselection of Nucleic Acid Ligan
ds and Solution SELEX 」）には、標的分子と結合及び／又は光架橋することの
できる、及び／又は標的分子を光不活性化することのできる光反応性基を含んで
いる核酸リガンドを選択するための、SELEX に基づく方法が記載されている。
【０００９】 米国特許 5,580,737（名称「High-Affinity Nucleic Acid Ligands that Disc
riminate Between Theophylline and Caffeine」）には、非ペプチド性でもよい
非常に近縁の分子を識別することのできる高度に特異的な核酸リガンドを同定す
るための、カウンターSELEX 法と称する方法が記載されている。米国特許 5,567
,588（名称「Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment :
Solution SELEX」）には、標的分子に対する親和性の高いオリゴヌクレオチドと
低いオリゴヌクレオチドとを非常に効率良く分離することのできる、SELEX 法に
基づく方法が記載されている。
【００１０】 SELEX 法は、リガンド特性、例えばインビボでの安定性又は供給特性を向上さ
せる修飾ヌクレオチドを含んでいる高親和性核酸リガンドの同定を包含する。こ
の様な修飾の例には、リボース及び／又はリン酸及び／又は塩基の位置における
化学的な置換がある。SELEX 法により同定された、修飾ヌクレオチドを含んでい
る核酸リガンドが、米国特許 5,660,985（名称「High Affinity Nucleic Acid L
igands Containing Modified Nucleotides」）に記載されており、これには、ピ
リミジンの５及び２’の位置で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含んでいる
オリゴヌクレオチドが記載されている。前出の米国特許 5,580,737には、２’−
アミノ（２’−NH2 ）、２’−フルオロ（2'-F）及び／又は２’−Ｏ−メチル（
2'-OMe）により修飾された１又は複数のヌクレオチドを含んでいる高度に特異的
な核酸リガンドが記載されている。米国特許出願08/264,029（1994年６月22日、
名称「Novel Method of Preparation of Known and Novel 2’Modified Nucleos
ides by Intramolecular Nucleophilic Displacement」、現在は放棄されている
）には、種々の２’−修飾ピリミジンを含んでいるオリゴヌクレオチドが記載さ
れている。
【００１１】 SELEX 法は、選択したオリゴヌクレオチドを、選択した他のオリゴヌクレオチ
ドや非オリゴヌクレオチド機能単位と組み合せることを包含する。これらは、各
々、米国特許 5,637,459（名称「Systematic Evolution of Ligands by Exponen
tial Enrichment : Chimeric SELEX」）及び米国特許 5,683,867（名称「System
atic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment : Blended SELEX」）
に記載されている通りである。この様な応用により、オリゴヌクレオチドの広範
な一群の形状及びその他の特性、並びに効率の良い増幅及び複製の特性と、その
他の分子の望ましい特性との組み合せが可能となる。
【００１２】 SELEX 法は、更に、診断用又は治療用複合体において、選択した核酸リガンド
を、親脂性化合物又は免疫原性のない高分子量化合物とを組み合せることを包含
する。これは、米国特許出願08/434,465（1995年５月４日出願、名称「Nucleic
Acid Ligand Complexes」）に記載されている通りである。基本的SELEX 法の改
修を記載している前記の各特許及び特許出願の総てを、引用により本文に組み込
むこととする。
【００１３】発明の要旨 本発明は、高い特異性でテネイシンＣに結合する核酸リガンドを単離する方法
を開示する。更に、テネイシンＣに結合する核酸リガンドを開示する。また、テ
ネイシンＣに対する高親和性RNA リガンドを開示する。更に、テネイシンＣに対
する、２’フルオロ修飾されたピリミジン及び2' OMe修飾されたプリンを有する
RNA リガンドを開示する。この様な核酸リガンドを同定するためにここで用いる
方法は、Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment の頭文
字であるSELEX 法と呼ばれる。本発明は、表３及び４、及び図10に示したリガン
ドを含む。
【００１４】 更に本発明は、テネイシンＣを発現する疾患の存在を、その疾患を有しうる生
物学的組織において検出するための方法を含む。更に本発明は、テネイシンＣを
発現する腫瘍の存在を、その腫瘍を有しうる生物学的組織において検出するため
の方法を含む。更に本発明は、インビボ又はエキソビボの診断に用いるための複
合体を含む。更に本発明は、テネイシンＣを発現する疾患組織の治療又は予防の
ための医薬剤を供給する方法を含む。更に本発明は、テネイシンＣを発現する疾
患組織の治療又は予防のための医薬剤を供給する際に用いるための複合体を含む
。
【００１５】好ましい態様の詳細な説明 テネイシンＣに対する核酸リガンドを同定するために用いられる中心的な方法
は、Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichmentの頭文字でS
ELEX 法と呼ばれ、この方法は、（ａ）核酸の候補混合物をテネイシンＣと接触
させること、（ｂ）テネイシンＣに対する親和性に基づいて、前記の候補混合物
中の核酸を分画すること、そして（ｃ）テネイシンＣに対する結合親和性のより
高い核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得るために、選択した分子を増幅する
こと、を必要とする。
【００１６】 本発明は、テネイシンＣに対するRNA リガンドを含む。本発明は、更に、表３
及び４、及び図10に示すテネイシンＣに対する特定のRNA リガンドを含む。より
詳しくは、本発明は、表３及び４、及び図10に示す特定の核酸リガンドと実質的
に相同であり、且つそれらと実質的に同一のテネイシンＣ結合能を有する核酸配
列を含む。実質的に相同である、とは、一次配列の相同性が70％超、より好まし
くは80％超、更により好ましくは90％超、95％超又は99％超であることを意味す
る。本文に記載の相同性の率は、整列させる２つの配列の内小さい方において、
その整列を促すために10ヌクレオチドの長さに１つのギャップを導入してよい場
合に、比較した配列中に同一のヌクレオチド残基を有すると認められるヌクレオ
チドの割合として計算される。実質的に同一のテネイシンＣ結合能とは、その親
和性が、本文に記載のリガンドの親和性の強さに比べて、１ケタ又は２ケタ異な
る範囲内であることを意味する。一定の配列、すなわち本文に特に記載した配列
と実質的に相同な配列が、同一のテネイシンＣ結合能を有するかどうかを決定す
ることは、当業者の技術の十分な範囲内である。
【００１７】 表３及び４、及び図10に示すテネイシンＣに対する核酸リガンドの配列相同性
の検証から、ほとんど又は全く一次相同性のない配列が、実質的に同じテネイシ
ンＣ結合能を有しうることが示される。この様な理由により、本発明は、表３及
び４、及び図10に示す核酸リガンドと実質的に同一な、必要条件としての構造又
は構造モチーフ及びテネイシンＣ結合能を有する核酸リガンドも含む。Zukerfol
dプログラム（Zuker（1989）Science 244 : 48-52）による配列の整列により、
実質的に同一の構造又は構造モチーフを、必要条件として仮定することができる
。当分野に知られている通り、二次構造及び構造モチーフを予想するために、そ
の他のコンピュータプログラムを用いることができる。当分野に知られている通
り、NMR 又はその他の技術により、溶液中での又は結合構造体での核酸リガンド
において、実質的に同一な構造又は構造モチーフを、必要条件として仮定するこ
ともできる。
【００１８】 更に本発明は、テネイシンＣを発現している疾患の存在を、その疾患を有しう
る生物学的組織において検出するための方法を含む。この方法は、（ａ）核酸の
候補混合物から、テネイシンＣのリガンドである核酸リガンドを同定すること、
ただし、（ｉ）核酸の候補混合物をテネイシンＣと接触させること、これは、そ
の候補混合物に比べて、テネイシンＣとの親和性がより高い核酸を、その候補混
合物の残りのものから分画するためであり；（ii）その親和性のより高い核酸を
、候補混合物の残りのものから分画すること；(iii）テネイシンＣに対する結合
親和性及び結合特異性が比較的により高い核酸の混合物を得るために、その親和
性のより高い核酸を増幅することを含んでなる方法により、テネイシンＣの核酸
リガンドを同定すること；（ｂ）マーカーと核酸リガンドとの複合体を形成する
ために、過程(iii）で同定した核酸リガンドに、インビボ又はエキソビボ診断に
用いることのできるマーカーを付着させること；（ｃ）前記疾患を有しうる組織
を、そのマーカー−核酸リガンド複合体に露出すること；そして（ｄ）テネイシ
ンＣを発現する疾患を同定するために、その組織において、そのマーカー−核酸
リガンド複合体の存在を検出すること、により行なわれる。
【００１９】 本発明の別の目的は、１又は複数のテネイシンＣの核酸リガンドと１又は複数
のマーカーとを含んでなる、インビボ又はエキソビボ診断に用いるための複合体
を提供することである。更に本発明は、テネイシンＣを発現している病症状の治
療又は予防のための医薬剤を供給するための方法を含む。更に本発明は、テネイ
シンＣを発現している病症状の治療又は予防のための医薬剤を供給する際に用い
られる複合体を含む。
【００２０】定義 本発明の各点を説明するために種々の用語を用いる。本発明の要素を明確に説
明するために、下記の定義を用いる。 本文では、「核酸リガンド」とは、標的に対する望ましい作用を有する天然に
は存在しない核酸のことである。核酸リガンドはしばしば「アプタマー」と呼ば
れる。本発明の標的はテネイシンＣであり、従ってテネイシンＣの核酸リガンド
という用語が用いられる。望ましい作用には、限定ではないが、標的に結合する
こと、触媒作用により標的を変更すること、標的自体又は標的の機能活性を修飾
／改変する様に標的と反応すること、自殺阻害剤として標的に共有結合すること
、標的と別の分子との反応を促すことなどが含まれる。
【００２１】 好ましい態様では、この作用は、標的分子に対する特異的な結合親和性であり
、その標的分子は、主にワトソン／クリックの塩基対又は三重らせん結合に依存
する機構により当該核酸リガンドに結合するポリヌクレオチドとは異なる三次元
化学構造を有し、この場合に、その核酸リガンドは、その標的分子によって結合
されるという既知の生理学的機能を有する核酸ではない。
【００２２】 テネイシンＣのリガンドである核酸リガンドは、核酸の候補混合物の中から、
下記の方法により同定される。その方法は、（ａ）その候補混合物をテネイシン
Ｃと接触させること、これは、その候補混合物に比べて、テネイシンＣとの親和
性がより高い核酸を、その候補混合物の残りのものから分画するためであり；（
ｂ）その親和性のより高い核酸を、候補混合物の残りのものから分画すること；
そして、（ｃ）リガンドが濃縮された核酸混合物を得るために、その親和性のよ
り高い核酸を増幅することを含んでなる（米国特許出願08/434,425、1995年５月
３日出願、現在、米国特許 5,789,157）。
【００２３】 本文では、「候補混合物」とは、その中から望ましいリガンドを選択するため
の、異なる配列を有する核酸の混合物のことである。候補混合物の原料を、天然
の核酸又はそれらの断片、化学合成した核酸、酵素により合成した核酸、あるい
は前記技術の組み合せにより作られた核酸から得ることができる。好ましい態様
では、各々の核酸は、前記の増幅行程を容易に行うために、ランダムな領域を取
り囲む固定配列を有している。
【００２４】 本文では、「核酸」とは、一本鎖又は二本鎖のDNA, RNA、及びその任意の化学
修飾体のいずれかを意味する。修飾には、例えば、限定でなく、追加の電荷、分
極率、水素結合性、静電気的相互作用性、及び流動性を組み込むための種々の化
学基を、核酸リガンドの塩基に、又は核酸リガンド全体に提供するものがある。
この様な修飾には、例えば、限定でなく、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修
飾、８位のプリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロ
モ又は５−ヨード−ウラシルの置換；骨格の修飾、メチル化、珍しい塩基対の組
合せ、例えばイソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジンなどの組合せ、がある
。修飾には、また、３’又は５’の修飾、例えばキャッピングもある。
【００２５】 「SELEX 」法は、望ましい様式で標的と相互作用する、例えばタンパク質と結
合する核酸リガンドの選択と、その様な選択された核酸の増幅との組み合せを必
要とする。選択／増幅過程のサイクルを任意に反復することにより、非常に多数
の核酸を含んでいるプールから、標的に最も強く相互作用する１又は少数の核酸
を選択することが可能となる。選択／増幅過程のサイクルを、目的とする選択を
達成するまで続ける。本発明では、テネイシンＣに対する核酸リガンドを得るた
めに、このSELEX 法を用いる。 SELEX 法は、前記のSELEX 特許出願に記載されている。
【００２６】 「SELEX 標的」又は「標的」とは、リガンドを希望する任意の注目の化合物又
は分子を意味する。標的は、限定なく、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖
、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、
遷移状態アナログ、補助因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、増殖因子、などで
よい。ここでの適用では、SELEX 標的はテネイシンＣである。
【００２７】 本文では、「複合体」とは、１又は複数のテネイシンＣの核酸リガンドを、１
又は複数のマーカーと共有結合することにより形成される分子全体を意味する。
本発明のいくつかの態様では、この複合体をＡ−Ｂ−Ｙと示す。ただしＡはマー
カーであり、Ｂは任意であり、そしてリンカーを含んでなり、そしてＹは、テネ
イシンＣの核酸リガンドである。
【００２８】 本文では、「マーカー」とは、直接的に、又はリンカー若しくはスペーサーを
介して、テネイシンの核酸リガンドと共に複合体を形成した場合に、視覚的方法
又は化学的方法により、インビボ又はエキソビボ状態で、その複合体を検出する
ことを可能にする１又は複数の分子のことである。マーカーの例は、限定でなく
、放射性核種、例えばTc-99m, Re-188, Cu-64, Cu-67, F-18, 125I, 131I, 111I
n, 32P, 186Re ；全てのフルオロフォア、例えばフルオレッセイン、ローダミン
、テキサスレッド；前記フルオロフォアの誘導体、例えばローダミン−レッド−
Ｘ；磁気化合物；及び、ビオチンである。
【００２９】 本文では、「リンカー」とは、２つ以上の分子を、共有結合又は非共有結合的
相互作用を介して接続する分子のことであり、これにより、１つ以上の分子の機
能特性を保持する様に、それらの分子を空間的に隔てることができる。リンカー
は、スペーサーとも知られている。リンカーの例は、限定でなく、(CH2CH2O)6及
び図２に示すヘキシルアミン構造である。
【００３０】 本文では、「治療的」とは、治療及び／又は予防を含んでいる。この用語を用
いる場合、人間及びその他の動物に対して用いる。「共有結合」とは、電子の共
有によって形成される化学結合のことである。 「非共有結合的相互作用」とは、共有結合以外の相互作用、例えばイオン性相
互作用及び水素結合により、複数の分子が結合されることを意味する。
【００３１】 好ましい態様では、本発明の核酸リガンドをSELEX 法により得る。SELEX 法は
、米国特許出願07/536,428（名称「Systematic Evolution of Ligands by Expon
ential Enrichmeut」、現在は放棄されている）、米国特許 5, 475,096（名称「
Nucleic Acid Ligands」及び米国特許 5,270,163（WO91/19813参照）（名称「Me
thods for Identifying Nucleic Acid Ligands」）に記載されている。これらの
出願を、総称としてSELEX 特許出願と呼び、各々を本文に組み込む。
【００３２】 SELEX 法により、各々が特有の配列を有し、かつ所望の標的化合物又は分子に
特異的に結合する特性を有する、核酸である一群の産物が提供される。標的分子
は、好ましくはタンパク質であるが、その他の中では、特には、炭水化物、ペプ
チドグリカン及び種々の小分子であってもよい。生物学的構造、例えば細胞表面
又はウイルスを標的にするために、その生物学的構造の構成部分である分子との
特異的な相互作用を介することにより、SELEX 法を用いることもできる。
【００３３】 最も基本的な形として、SELEX 法は、下記の一連の過程によって規定されうる
。 １）異なる配列からなる核酸の候補混合物を調製する。この候補混合物は、一
般的には、固定配列領域（すなわち、候補混合物中の各成員が同一の位置に同一
の配列を有する）及びランダムな配列領域を含んでいる。その固定配列領域は、
（ａ）下記の増幅過程を補助するため、（ｂ）標的に結合することが知られてい
る配列を擬似するため、又は（ｃ）候補混合物中で所定の構造配置を有する核酸
の濃度を高めるために、選択される。そのランダム配列は、全体的にランダム（
すなわち、任意の位置の塩基の検出確率が４分の１である）、又は一部分のみラ
ンダム（例えば、任意の位置の塩基の検出確率が、１〜100％ 内で任意のレベル
で選択されうる）であってよい。
【００３４】 ２）標的と、候補混合物中の構成員との結合にとって望ましい条件下で、その
候補化合物を、選択した標的と接触させる。この様な状況下では、標的と、候補
混合物中の構成員との間の相互作用により、標的と、その標的に対する親和性が
最も強い核酸との間で、核酸−標的対が形成されると考えられる。
【００３５】 ３）標的との親和性が最も高い核酸を、標的との親和性がより低い核酸から分
画する。候補混合物中には、最も高い親和性を呈する核酸は、非常にほんの少数
（おそらく１分子のみ）しか存在しないので、一般的には、分画中に、候補混合
物中の核酸が有意な量（約５〜50％）で維持される様に、分画の基準を設定する
ことが望ましい。
【００３６】 ４）次に、標的との親和性が比較的により高い、分画により選択された核酸を
増幅して、標的との親和性が比較的により高い核酸が濃縮された新しい候補混合
物を調製する。
【００３７】 ５）上記の分画過程及び増幅過程を繰り返すことにより、新しく形成される候
補混合物は、徐々により少ない種類の特有配列を有する様になり、従って、一般
的には、核酸の標的との親和性の平均レベルは高くなるだろう。究極的には、SE
LEX 法により、標的分子との親和性が最も高い、元々の候補混合物中の核酸に由
来する１又は少数の特有の核酸を含有する候補混合物が生じるであろう。
【００３８】 多くの特定の目的を達成するために、基本的なSELEX 法が改変されている。例
えば、米国特許出願07/960,093（1992年10月14日出願、現在は放棄されている）
及び米国特許 5,707,796（両方とも、名称「Method for Selecting Nucleic Aci
ds on the Basis of Structure」）には、特定の構造特性を有する核酸分子、例
えば屈曲したONA 、を選択するために、ゲル電気泳動と共にSELEX 法を用いるこ
とが記載されている。米国特許出願08/123,935（1993年９月17日出願、名称「Ph
otoselection of Nucleic Acid Ligands」、現在は放棄されている）、米国特許
5,763,177（名称「Systematic Evolution of Ligands by Exponential Eurichm
ent : Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX 」）及び
米国特許出願09/093,293（1998年６月８日出願、名称「Systematic Evolution o
f Ligands by Exponential Eurichment : Photoselection of Nucleic Acid Lig
ands and Solution SELEX 」）には、標的分子に結合及び／又は光架橋すること
のできる、及び／又は標的分子を光不活性化することのできる光反応性基を含ん
でいる核酸リガンドを選択するための、SELEX に基づく方法が記載されている。
【００３９】 米国特許 5,580,737（名称「High-Affinity Nucleic Acid Ligands that Disc
riminate Between Theophylline and Caffeine」）には、非常に近縁の分子を識
別することのできる高度に特異的な核酸リガンドを同定するための、カウンター
SELEX 法と称する方法が記載されている。米国特許 5,567,588（名称「Systemat
ic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment : Solution SELEX」）に
は、標的分子に対する親和性の高いオリゴヌクレオチドと低いオリゴヌクレオチ
ドとを非常に効率良く分離することのできる、SELEX 法に基づく方法が記載され
ている。米国特許 5,496,938（名称「Nucleic Acid Ligands to HIV-RT及びHIV-
1 Rev 」）には、SELEX を行った後に、改善された核酸リガンドを得るための方
法が記載されている。米国特許 5,705,337（名称「Systematic Evolution of Li
gands by Exponential Enrichment : Chemi-SELEX 」）には、リガンドをその標
的に共有結合するための方法が記載されている。
【００４０】 SELEX 法は、リガンド特性、例えばインビボでの安定性又は供給特性を向上さ
せる修飾ヌクレオチドを含んでいる高親和性核酸リガンドの同定を包含する。こ
の様な修飾の例には、リボース及び／又はリン酸及び／又は塩基の位置における
化学的な置換がある。SELEX 法により同定された、修飾ヌクレオチドを含んでい
る核酸リガンドが、米国特許 5,660,985（名称「High Affinity Nucleic Acid L
igands Containing Modified Nucleotides」）に記載されており、これには、ピ
リミジンの５及び２’の位置で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含んでいる
オリゴヌクレオチドが記載されている。前出の米国特許 5,637,459には、２’−
アミノ（２’−NH2 ）、２’−フルオロ（2'-F）及び／又は２’−Ｏ−メチル（
2'-OMe）により修飾された１又は複数のヌクレオチドを含んでいる高度に特異的
な核酸リガンドを記載している。米国特許出願08/264,029（1994年６月22日、名
称「Novel Method of Preparation of Known and Novel 2’Modified Nucleosid
es by Intramolecular Nucleophilic Displacement」）には、種々の２’−修飾
ピリミジンを含んでいるオリゴヌクレオチドが記載されている。
【００４１】 SELEX 法は、選択したオリゴヌクレオチドを、選択した他のオリゴヌクレオチ
ドや非オリゴヌクレオチドの機能単位と組み合せることを包含する。これらは、
各々、米国特許 5,637,459（名称「Systematic Evolution of Ligands by Expon
ential Enrichment : Chimeric SELEX」）及び米国特許 5,683,867（名称「Syst
ematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment : Blended SELEX」
）に記載されている通りである。この様な応用により、オリゴヌクレオチドの広
範な一群の形状及びその他の特性、並びに効率の良い増幅及び複製の特性と、そ
の他の分子の望ましい特性との組み合せが可能となる。
【００４２】 米国特許 5,496,938には、SELEX 法を行った後に、核酸リガンドを改良する方
法が記載されている。この特許（名称「Nucleic Acid Ligands to HIV-RT及びHI
V-1 Rev 」）を引用より本文に組み込む。 米国特許出願08/434,425（名称「Systematic Evolution of Ligands by Expon
ential Enrichment : Tissue SELEX」、1995年５月３日出願）、すなわち現在の
米国特許 5,789,157には、組織、例えばガン細胞、の高分子成分に対する核酸リ
ガンドを同定する方法、及びその方法により同定された核酸リガンドが記載され
ている。この特許を引用により本文に組み込む。
【００４３】 診断又は治療のための核酸の使用において認められうる一つの潜在的な問題は
、ホスボジエステルの形のオリゴヌクレオチドが、所望の効果が表れる前に、細
胞内及び細胞外の酵素、例えばエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによ
って体液中で急速に分解されうることである。核酸リガンドのインビボでの安定
性を高めるために、又は核酸リガンドの供給を促進、若しくは仲介するために、
核酸リガンドの一定の化学修飾を行うことができる。例えば米国特許出願08/117
,991（1993年９月８日出願、現在は放棄されている）及び米国特許 5,660,985（
両者共、名称「High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nuc
leotides」）を参照されたい。これを引用により本文に組み込む。
【００４４】 本発明において考慮しうる核酸リガンドの修飾には、例えば、限定でなく、追
加の電荷、分極率、疎水性、水素結合性、静電気的相互作用性、及び流動性を組
み込むための種々の化学基を、核酸リガンドの塩基に、又は核酸リガンド全体に
提供するものがある。この様な修飾には、例えば、限定でなく、２’位の糖修飾
、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリ
ジンの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの置換；骨格の修飾、ホスホ
ロチオエート又はアルキルホスフェート修飾、メチル化、珍しい塩基対の組合せ
、例えばイソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジンなどの組合せ、がある。修
飾には、また、３’又は５’の修飾、例えばキャッピングもある。本発明の好ま
しい態様では、当該核酸リガンドは、ピリミジン残基の糖部分で２’−フルオロ
（2'-F）修飾されたRNA 分子である。
【００４５】 この様な修飾は、SELEX 行程の前、又は後の修飾であってよい。SELEX 行程前
の修飾は、SELEX 標的への特異性及びインビボでの安定性の向上を共に示す核酸
リガンドを生成する。核酸リガンドの２’−OHに行ったSELEX 行程後の修飾によ
り、その核酸リガンドの結合能に悪影響を与えないで、インビボでの安定性を向
上させることができる。 その他の修飾が当業者に知られている。その様な修飾を、SELEX 行程後に（既
に同定された未修飾リガンドの修飾）、又はSELEX 行程内に組み込んで、行いう
る。
【００４６】 本発明の核酸リガンドを、上記に概説し、そして引用により本文に組み込んだ
SELEX 出願に従って完全に実現されるSELEX 法により調製する。 本発明のテネイシンＣのアプタマーは、テネイシンＣのCOOH末端のヘパリン結
合部位に結合する。 本発明の一定の態様では、本文に記載するテネイシンＣに対する核酸リガンド
は、診断のために有用であり、そして病理症状の画像化（例えばヒトの腫瘍の画
像化）のために用いることができる。このテネイシンＣの核酸リガンドは、診断
に加えて、テネイシンＣを発現している病症状の予後診断及び経過監察において
も有用である。
【００４７】 診断剤は、特定の場所又は濃度で、所定の標的の存在を同定することができる
ことのみが要求される。単純には、標的と結合対を形成する能力は、診断のため
に陽性シグナルを惹起するために十分であろう。当業者は、テネイシンＣの核酸
リガンドの存在を追跡するために、マーカーを組み込むために当分野で知られて
いる方法において、任意のテネイシンＣの核酸リガンドを用いることができるだ
ろう。この様なマーカーを、多数の診断方法において、例えば原発性及び転移性
の腫瘍、並びにアテローム性動脈硬化症の病変の検出において用いることができ
た。本文で例示する標識マーカーはテクネチウム−99m 及び 111Inである。しか
し、その他のマーカー、例えばその他の放射性核種、磁気化合物、フルオロフォ
ア、ビオチンなどを、テネイシンＣが発現している病症状（例えば、ガン、アテ
ローム性動脈硬化症、及び乾癬）をインビボ又はエキソビボ状態で画像化するた
めに、テネイシンＣの核酸リガンドに結合することができる。
【００４８】 このマーカーを、テネイシンＣの核酸リガンド上の種々の位置に、例えば、塩
基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５位、プリンヌクレオチドの８位
、リン酸のヒドロキシル基、又は当該核酸リガンドの５’若しくは３’末端のヒ
ドロキシル基若しくはその他の基に共有結合しうる。マーカーがテクネチウム−
99m 又は 111Inである態様では、好ましくは、これを、リン酸基の５’若しくは
３’のヒドロキシル基に、又は修飾されたピリミジンの５位に結合する。最も好
ましくは、そのマーカーを、当該核酸リガンドのリン酸基の５’ヒドロキシル基
に、リンカーを用いて、又は用いずに結合する。別の態様では、５位に第一アミ
ンを含有するピリミジンを組み込み、そしてマーカーとの結合のために、そのア
ミンを用いることにより、そのマーカーを当該核酸リガンドに結合する。そのマ
ーカーの結合は、直接的に、又はリンカーを用いて行うことができる。マーカー
としてテクネチウム−99m 又は 111Inを用いる態様では、好ましいリンカーは、
図10に示すヘキシルアミンリンカーである。
【００４９】 その他の態様では、テネイシンＣの核酸リガンドは、テネイシンＣを発現して
いる組織又は臓器に、治療用化合物（例えば、限定でなく、細胞毒性化合物、免
疫増強物質、及び治療用放射線核種）を供給するために有用である。テネイシン
Ｃを発現しうる病症状は、例えば、限定でなく、ガン、アテローム性硬化症、及
び乾癬である。当業者は、治療用化合物を複合体に組み込むために当分野に知ら
れている方法において、任意のテネイシンＣの核酸リガンドを用いることができ
るだろう。この治療用化合物を、テネイシンＣの核酸リガンド上の種々の位置に
、例えば、塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの５位、プリンヌクレ
オチドの８位、リン酸のヒドロキシル基、又は当該核酸リガンドの５’若しくは
３’末端のヒドロキシル基若しくはその他の基に共有結合しうる。好ましい態様
では、治療剤を、当該核酸リガンドの５’アミンに結合する。治療剤の結合は、
直接的に、又はリンカーを用いて行うことができる。
【００５０】 ガンが標的疾患である態様では、抗腫瘍活性を呈することが知られている５−
フルオロデオキシウラシル又はその他のヌクレオチドアナログを、テネイシンＣ
の核酸リガンド内に存在するＵ内に内部的に組み込むことができ、又は直接的に
、若しくはリンカーを通して、いずれかの末端に内部的に付加し、若しくは結合
することができる。また、ピリミジンアナログ２’２’−ジフルオロシチジン及
びプリンアナログ（デオキシコホルマイシン）を組み込むことができる。また、
米国特許出願08/993,765（1997年12月18日出願、引用により本文に組み込む）に
は、特に、化学的放射線感受性増強物質、及び放射線感受性増強物質、及び放射
線核種、及び腫瘍に対するその他の放射線治療剤を正確に局在化させるために、
腫瘍、例えばテネイシンＣ、に対する核酸リガンドを含んでなるヌクレオチドベ
ースのプロドラッグが記載されている。
【００５１】 また、１つのアプタマーにおいて、又は同一アプタマーの２つ以上の異なる修
飾体の混合物として、当該病症状の検出及びその治療剤の供給を共に達成するた
めに、マーカー及び治療剤を共にテネイシンＣの核酸リガンドに結合することも
考えられる。また、マーカー及び／又は治療剤の一方又は双方を、非免疫原性の
高分子量化合物又は親脂性化合物、例えばリポソームに結合することも考えられ
る。診断又は治療用複合体において、核酸リガンドを親脂性化合物又は非免疫原
性化合物に結合する方法が、米国特許出願08/434,465（1995年５月４日出願、名
称「Nucleic Acid Ligand Complexes」、これを引用により本文に組み込む）に
記載されている。
【００５２】 本文に記載した治療又は診断用組成物を腸管外（静脈内、皮下、皮内、病巣内
）に注射することにより投与しうる。しかし、その他の有効な投与形、例えば関
節内注射、吸入噴霧、経口活性製剤、経皮イオン泳動、又は座剤もまた考えられ
る。また、これらの組成物を、直接的な注射により局所的に適用してもよく、装
置、例えば移植したステント又はカテーテルから放出することができ、あるいは
注入ポンプにより当該部位に直接的に供給することができる。一つの好ましい担
体は生理食塩水溶液であり、しかしその他の医薬上容認される担体を用いること
も考えられる。
【００５３】 一つの態様では、担体、及び治療用化合物と共に複合体化したテネイシンＣの
核酸リガンドから、生理学的に適合する遅延放出性製剤が構成されると考えられ
る。その様な担体における第一の溶媒は、本質的に水性又は非水性のいずれかの
ものでありうる。更に、当該担体は、製剤のpH、浸透圧、粘性、透明性、色、無
菌性、安定性、溶解速度、又は香りを修飾又は維持するための、その他の医薬上
容認される賦形剤を含みうる。同様に、当該担体は、テネイシンＣの核酸リガン
ドの安定性、溶解速度、放出、吸収を修飾又は維持するための、更に別の医薬上
容認される賦形剤を含みうる。その様な賦形剤は、単位投与剤形又は複数回投与
剤形のいずれかの腸管外投与用製剤を調合するために通常及び慣習的に用いられ
る物質である。
【００５４】 一旦、治療又は診断用組成物を調合したならば、それを、無菌バイアル中で、
溶液、懸濁液、ゲル、乳状液、固体、あるいは脱水化又は凍結乾燥した粉末とし
て保存しうる。その様な製剤を、即座に使える形又は投与直前に再構成を要する
形のいずれかで保存しうる。全身供給のために、テネイシンＣの核酸リガンドを
含有する製剤を投与する方法は、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、鼻内、又は膣
内経由、又は直腸用座剤による。
【００５５】 下記の実施例は、本発明を説明するために提供され、本発明を限定するもので
はない。実施例１は、テネイシンＣに対するRNA リガンドの作製のために実施例
２で用いられる材料と実験方法を記す。実施例２は、テネイシンＣに対するRNA
リガンド、及び選択された核酸リガンドの予想した二次構造を記す。実施例３は
、選択された核酸リガンドの高親和性結合のために必要な最小サイズの決定、及
び2'-OMeプリンによる2'-OH プリンの置換を記す。実施例４は、腫瘍を有するマ
ウスにおける、Tc-99m標識したテネイシンＣの核酸リガンドの生体分布を記す。
実施例５は、腫瘍組織内のテネイシンＣを検出するための、蛍光標識したテネイ
シンＣの核酸リガンドの使用を記す。実施例６は、アプタマーTTA1（GS7641とも
知られている）によるインビボでの腫瘍の検出を記す。実施例７は、 111Inを用
いた代替標識を記す。
【００５６】実施例 実施例１：テネイシンＣに対する核酸リガンド及びU251グリオブラストーマ細胞
に対する核酸リガンドを得るためのSELEX の使用 材料及び方法： テネイシンＣをChemicon（Temecula, CA）から購入した。一本鎖DNA プライマ
ー及び鋳型をOperon Technologies Inc. (Alameda, CA) により合成した。 SELEX 法は、前記のSELEX 特許出願に詳細に記載されている。簡単に述べると
、二本鎖の転写用鋳型を、クレノウ断片を用いて、40N7a ssDNA： 5'-TCGCGCGAGTCGTCTG[40N]CCGCATCGTCCTCCC 3'（配列番号１）を、T7ポリメラ
ーゼプライマー（下線）を含んでいる5N7 プライマー： 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3'（配列番号２）により伸長させるこ
とにより調製した。Fitzwater and Polisky (1996) Methods Enzymol. 267 : 27
5-301 に以前に記載されている通り、T7 RNAポリメラーゼによりRNA を調製した
。全ての転写反応を、糖部分上で２’−フルオロ（2'-F）として修飾されている
ピリミジンの存在下で行った。この置換により、ホスホジエステル結合を切断す
るために２’−ヒドロキシル部分を用いるリボヌクレアーゼに対する耐性が向上
する。特に述べると、各転写混合液は、１mMのGTP 及びATP と共に、3.3mMの2'-
F UTP及び 3.3mMの2'-F CTP を含有した。この様にして生産した最初のランダム
なRNA ライブラリーは３×1014分子を含んでいた。テネイシンＣに対する各リガ
ンドの親和性を、ニトロセルロースフィルター分画を用いた標準的な方法（Tuer
k and Gold (1990) Science 249 (4968) : 505-10）により決定した。
【００５７】 SELEX の各ラウンドのために、Luminoプレート（Labsystems, Needham Height
s, MA ）を、表１に示す濃度のテネイシンＣを含有するタルベッコのPBS 200μl
により室温で２時間コーティングした。コーティング後、ラウンド１〜６のため
に、HBSMC＋ 緩衝液（20mM HEPES, pH7.4, 137mM NaCl, １mM CaCl2, １mM MgCl 2 及び1g/Lヒト血清アルブミン（Sigma、第Ｖ分画））により、そしてラウンド
７及び８のために、1g/Lカゼイン（Ｉ−ブロック：Tropix）を含有する HBSMC＋
緩衝液により、ウエルをブロッキング処理した。結合用及び洗浄用緩衝液として
、0.05％ Tween20を含有する HBSMC＋緩衝液を用いた。SELEX の各ラウンドのた
めに、RNA を 100μｌの結合用緩衝液中に希釈し、そして予め結合用緩衝液によ
り洗浄したタンパク質コーティングしたウエル中で37℃で２時間インキュベーシ
ョンした。結合後、各回 200μｌの洗浄液で６回洗浄した。洗浄過程後、乾燥し
たウエルを、95℃のヒートブロック上に５分間置いた。そのウエル中で直接的に
、48℃で、標準的なAMV 逆転写酵素反応（50μｌ）を行い、その反応産物を標準
的なPCR 及び転写反応のために用いた。２つの合成プライマー5N7 （前記）及び
3N7a： 5'-TCGCGCGAGTCGTCTG-3'（配列番号３） を、前記の鋳型の増幅及び逆転写過程のために用いた。
【００５８】 細胞によるSELEX のために、６ウエル組織培養プレート（Becton Dickinson L
abware, Lincoln Park, NJ）上で、U251ヒトグリオブラストーマ細胞（Hum. Her
ed. (1971) 21 : 238）を、10％胎児ウシ血清を補充したダルベッコ改変イーグ
ル培地（GIBCO BRL, Gaitherburg, MD）中で全面密集に至るまで増殖させ、そし
てCaCl2 を補充したダルベッコPBS 緩衝液（DPBS, GIBCO BRL ）により３回洗浄
した。転写により内部的に標識したRNA（Fitzwater (1996) 前出）を、その細胞
と共に37℃で１時間インキュベーションした。その後、標識RNA を除き、そして
細胞を37℃でDPBSにより、各回10分間で６回洗浄した。次に、洗浄過程後に残っ
ている結合したRNA を溶離するために、５mM EDTA を含有するDPBSを加えて、細
胞と共に30分間インキュベーションした。このRNA を、標準的な液体シンチレー
ション計数法により定量し、そしてRT-PCRにより増幅した。
【００５９】 U251細胞との結合検査： 内部標識したRNA を、段階的に高くした濃度で、６ウエル組織培養プレート（
Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ）上の全面密集状態のU251細胞と
共に37℃で60分間インキュベーションした。37℃でDPBS＋CaCl2 により３回10分
間洗浄することにより、非結合RNA を洗い流し、そしてTrizol（Gibco BRL, Gai
thersburg, MD）により細胞を破壊することにより、結合RNA を集めた。結合RNA
を液体シンチレーション計数により定量した。
【００６０】 クローニング及び配列決定： 増幅した、親和性の向上したオリゴヌクレオチドプールを、８％ポリアクリル
アミドゲル上で精製し、ssDNA に逆転写し、そしてそのDNA を、BamHI 及びHind
III 制限エンドヌクレアーゼ部位を有するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖
反応(PCR）により増幅した。PCR 断片をクローン化し、そのプラスミドを精製し
、そして標準的な方法（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Labor atory Manual , 2nd Ed. 3 vols., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor）に従って、その配列を分析した。
【００６１】 実施例２：テネイシンＣに対するRNA リガンド 米国特許出願08/434,425（名称「Systematic Evolution of Ligands by Expon
ential Enrichment : Tissue SELEX」、1995年５月３日出願）、現在、米国特許
5,789,157に記載されている通りに、SELEX 法により、U251細胞に対する核酸リ
ガンドを得た。その後、得られたリガンドがテネイシンＣの核酸リガンドである
ことを決定した。 ヒトのテネイシンＣに対するオリゴヌクレオチドリガンドを得るために、前記
の「材料及び方法」に記載したランダムヌクレオチドライブラリーを用いて８ラ
ウンドのSELEX を行った。各ラウンドに用いたRNA 及びタンパク質の量を表１に
示す。８ラウンドのSELEX を行った後、テネイシンＣに対するオリゴヌクレオチ
ドプールの親和性は10nMであった。この親和性は、SELEX のラウンドを追加して
も向上しなかった。
【００６２】 U251グリオブラストーマ細胞に対するリガンドを得るために、前記のランダム
ヌクレオチドライブラリーを用いて９ラウンドのSELEX を行った。９ラウンドの
U251に対する結合過程及びEDTA溶離を行った後、ラウンド３，５及び９における
U251細胞との結合能を検査した。図１は、SELEX のラウンド数が増えるに連れて
、結合RNA 量も、特定の濃度で増えることを示している。標的組織の複雑さのた
めに、当該細胞上の未知の標的分子に対するオリゴヌクレオチドプールの親和性
を推定することはできなかった。 次に、このE9プール（９ラウンドの結合過程後に、U251細胞からEDTA溶離した
もの）を出発点として用いて、精製テネイシンＣに対するSELEX を行った。前記
の通りに、精製したテネイシンＣを用いて、２ラウンドのSELEX を行った。２ラ
ウンドの SELEX（E9P1とE9P2）に用いたタンパク質及びRNA の濃度を表２に示す
。
【００６３】 要約すると、３つ異なるSELEX 実験を行った。すなわち、標的として精製テネ
イシンＣを用いた実験、標的としてU251グリオブラストーマ細胞を用いた実験、
そしてU251グリオブラストーマ細胞を用いて得られたSELEX プール及び標的とし
て精製テネイシンＣを用いてSELEX を行うという実験、である。 ３つの全てのSELEX 実験を分析するために、精製テネイシンＣによるSELEX の
ラウンド８のリガンド（“TN”配列）、U251細胞によるSELEX のラウンド９のリ
ガンド（“E9”配列）、及びU251／テネイシンＣによるハイブリットSELEX のラ
ウンド２のリガンド（“E9P2”配列）をクローニングし、そして配列決定した。
34個の独立クローンの配列を、２つの主要な群：テネイシンＣリガンド（“TN”
及び“E9P2”配列）及びU251細胞リガンド（“E9”リガンド）に分け、そして表
３に示す。テネイシンＣリガンドの内、そのクローン（総数65）の大部分が、群
Ｉ及び群IIと表示した２つの異なる配列群のいずれかに属する（図１）。群Ｉ内
の12クローンの可変領域の調査から、一致配列 GACNYUUCCNGCYAC（配列番号12）
を通して関連する７個の独特の配列が明かにされた。群II内の18クローンの可変
領域の調査から、一致配列CGUCGCC を共有する配列が明かにされた（表３）。
【００６４】 E9配列を、可変領域内に保存されているGAY 及びCAU 配列に基づいて、関連群
に分けることができた。残りの配列は、その他の配列と明かには関連しなかった
ので、「孤立」群として分類した。３つの配列、E9P2-1, E9P2-2及びTN9 が優勢
であり、各々14, 16及び10回表れた。「孤立」群では、１つの配列TN8 が２回表
れた。全体として、これらのデータは、高度に濃縮された配列プールが得られた
ことを示している。 ほとんどの配列は、低いnMレベルの解離定数を示し、そして前記の最も広く存
在した配列、TN9, E9P2-1 及びE9P2-2が、各々５nM，２nM及び８nMという値を有
し、最も高い親和性を示した（表３）。これらの結果は、U251細胞によるSELEX
が、テネイシンＣに対するアプタマーを集積すること、そしてその細胞によるSE
LEX のプールからテネイシンＣ特異的リガンドを単離するために、ほんの２ラウ
ンドのSELEX しか要さなかったことを示す。同様にして、その他のタンパク質に
対するオリゴヌクレオチドリガンドを、精製した標的タンパク質を用いてE9プー
ルから単離することができる。
【００６５】 実施例３：TN9 の最小サイズの決定、及び2'-OMe プリンによる2'-OH プリンの
置換：アプタマーTTA1の合成 オリゴヌクレオチドの合成方法は、当業者にとって標準的な方法に従った（Gr
een et al. (1995) Chem Biol 2 (10) : 683-95）。２’−フルオロピリミジン
ホスホルアミダイトモノマーをJBL Scientific (San Luis Obispo, CA）から得
た。2'-OMe プリン、2-OHプリン、ヘキシルアミン、及び（CH2CH2O)6 モノマー
、そしてdTポリスチレン固体支持体を、Glen Research (Sterling, VA）から得
た。アプタマーの親和性を、ニトロセルロースフィルター分画法（Green et al.
前出）により決定した。
【００６６】 更に分析するために、テネイシンＣに対する高い親和性に基づいて、TN9 を選
んだ。先ず、高親和性結合に必要な最小配列を調べた。標準的な方法（Green et
al.前出）により、ヌクレオチド55の３’側ヌクレオチドは、テネイシンＣとの
結合に必要であり、一方、親和性の低下なく、その５’末端からヌクレオチドを
除くことはできないことが分かった。次に、高親和性結合を保ちながら、TN9 の
長さを、55個のヌクレオチドから更に減らすために、TN9 の内部欠失を見い出す
ことを試みた。TN9 の最初の55個のヌクレオチドと共に、関連する群IIのリガン
ドTN7, TN21 及びTN41の最初の55個のヌクレオチドを、可能性のあるRNA の二次
構造の折り畳みを決定するためのコンピューターアルゴリズムに入力した（mfol
d 3.0, http://www.ibc.wustl.edu/〜zuker/でアクセス可能。M. Zuker, D.H. M
athews & D.H. Turner. Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary St
ructure Prediction : A Practical Guide. In : RNA Biochemistry and Biotec
hnology, J. Barciszewski & B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer A
cademic Publishers, (1999)）。
【００６７】 このアルゴリズムによって予想された多くの潜在的なRNA の折り畳み構造の中
で、各オリゴヌクレオチドに共通な構造が見い出された。図２のオリゴヌクレオ
チドTTA1によって表されるこの構造は、単一の接合点で結ばれる３つの幹部、い
わゆる３幹部接合を有する。この折り畳み構造では、群IIのオリゴヌクレオチド
の中で最も保存性の高いヌクレオチドが接合領域に配置される。TN9, TN7, TN21
及びTN41の比較では、第二の幹部は可変的な長さと配列を有しており、このこと
は、第二幹部の広がりは、テネイシンＣとの結合に必要ではないことを示唆する
。TN9 に関するこの仮説を検証するために、ヌクレオチド10〜26を、エチレング
リコールリンカー（CH2CH2O)6 によって置換できることが分かった。このリンカ
ーは、置換ループとして働き、このアプタマーの大きさを小さくする。更に、ヌ
クレオチド10〜26を、４ヌクレオチドループ（CACU又はGAGA）により置換するこ
とにより、テネイシンＣとの高親和性を有する配列が生じる。テネイシンＣとの
高親和性を有する配列を作るために、ヌクレオチド10〜26を置換できるその他の
ヌクレオチドループ又はその他のスペーサーを決定することは、当業者に十分に
明かであろう。
【００６８】 ヌクレアーゼ活性に対する防護性を高めるために、対応する2'-OMe プリンに
よって置換することができるプリンの位置を決定した。当該オリゴヌクレオチド
を任意に５つの部域に分け、各部域内の全てのプリンを、対応する2'-OMe プリ
ンヌクレオチドにより置換して、合計５つのオリゴヌクレオチドを作った（表４
、相Ｉの合成）。各オリゴヌクレオチドのテネイシンＣ親和性を決定したところ
、部域１，３及び５内の全てのプリンを、検知できるほどの親和性の低下なく、
置換できることが分かった。次に、部域２及び４内で、各プリンを2'-OMe プリ
ンによって置換し、それらの親和性の効果を測定した（表４、相III の合成）。
これらの実験から、2-OMe G によるヌクレオチドG9, G28, G31、及びG34 の置換
が、テネイシンＣ親和性の低下を招くことが推論された。従って、アプタマーTT
A1では、これらのヌクレオチドを2'-OH プリンとしてそのまま残した。
【００６９】 次に、アプタマーTTA1（表４）を、（CH2CH2O)6 （スペーサー18）リンカー、
エキソヌクレアーゼからの保護のための3'-3'dT キャップ、５’ヘキシルアミン
（表４）を用いて、そして表４に示した５個のＧ以外の全てのプリンを2'-OMeプ
リンにして、合成した。非結合性コントロールアプタマーTTA1.NB を、３’末端
の５個のヌクレオチドを除去することにより作製した。TTA1は、５nMの平衡解離
定数（Kd）でテネイシンＣに結合し、一方TTA1.NB は、テネイシンＣに対して、
５μＭ超のKdを有した。 ヌクレオチド10〜26を、ヌクレオチドではないエチレングリコールリンカーに
より置換することができる。従って、TTA1を、２つの別の断片として合成できる
であろう。その場合、エチレングリコールリンカーの位置に分断点を導入して、
新しい５’及び３’末端を導入する。合成後に、その２つの分子を一緒にインキ
ュベーションして、ハイブリッドを形成させる。この方法により、新しい５’及
び３’末端に、追加のアミン基及びヌクレオチドを導入することができる。この
新しい機能特性を、生物学的結合のために用いることができるだろう。更に、２
つの断片を合成することから、その分子の長さが短かくなるので、化学合成の収
率が高まる。
【００７０】 実施例４：腫瘍を有するマウスにおけるTc-99m標識アプタマーの体内分布 図２に示す通りに、当該オリゴヌクレオチドの５’末端にTc-99mキレーター（
Hi15；Hilger et al. (1998) Tet Lett 39 : 9403-9406）を結合し、そしてその
アプタマーをTc-99mにより放射性標識することにより、そのアプタマーの体内分
布を調べた。Tc-99m標識した形のアプタマーを図10に示す。 100mMホウ酸ナトリ
ウム、pH9.3 を緩衝剤として、30％ジメチルホルムアミド中の50mg／mlのアプタ
マーと５Ｍ等量のHi15−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとを室温で30分間混合す
ることにより、TTA1及びTTA1.NB をHi15に結合した。Tc-99m標識した形のアプタ
マーを図10に示す。Hi15-TTA1 及び Hi15-TTA1.NB を逆相HPLCにより精製した。
【００７１】 次に、これらのオリゴヌクレオチドを、下記の通りに、Tc-99mにより標識した
。１nmole のHi15−アプタマーに、 200μＬの 100mMリン酸ナトリウム緩衝液（
pH8.5 ）、23mg／mLの酒石酸ナトリウム、及び、使用前12時間以内にMo-99 カラ
ム（Syncor, Denver）から溶出したTc-99mペルテクネテート50μＬ（5.0mCi）を
加えた。10μＬの５mg／mL SnCl2の添加により、標識反応を開始した。この反応
混合液を90℃で15分間インキュベーションした。分子量 30000をカットオフする
膜（Centrex, Schleicher & Scheull）を通す遠心透析により、300μＬで２回洗
浄して、反応産物を未反応Tc-99mから分離した。この標識方法により、加えたTc
-99mの30〜50％が組み込まれて、比活性2-3mCi／nmole RNAを得た。Tc-99mは、
図５に示す通り、5'G を介して結合している。
【００７２】 体内分布の実験のために、下記の通りに、異種移植片としてのU251腫瘍を調製
した。10％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（Gibco BRL, Gaithersburg, MD ）を補充し
たダルベッコ改変イーグル培地中でU251細胞を培養した。胸腺欠損マウス（Harl
an Sprague Dawley, Indianapolice, IN）に１×106 個のU251細胞を皮下注射し
た。その腫瘍の大きさが200〜300mgに達した時（１〜２週間）に、Tc-99m標識ア
プタマーを、3.25mg／kgで静脈内に注射した。指示した時間に、イソフルラン（
Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA）により動物を麻酔し、心臓穿刺に
より血液を集め、そして動物を殺した後、組織を採取した。ガンマ計数機（Wall
ac Oy, Turku, Finland ）を用いて、Tc-99mレベルを計数した。組織へのアプタ
マーの取り込みを、組織１グラムあたりの注入量に対する百分率％（％ID／ｇ）
として測定した。
【００７３】 ガンマカメラを用いて、マウスの画像を得た。麻酔（イソフルラン）下でマウ
スをカメラ（Siemens, LEM＋）上に置いた。データを集め（30秒〜10分間）、そ
してパワーMAC G3（Apple Computer, CA）上で核MAC ソフトウエア、バージョン
3. 22. 2（Scientific Imaging, CA）を用いて分析した。 体内分布実験から、表５に示す通り、アプタマーが腫瘍組織に急速かつ特異的
に取り込まれることが示された。非結合性アプタマーは腫瘍内に残存していない
。Tc-99mの血中レベルも急速になくなった。３時間後、Hi15-TTA1 により腫瘍内
に取り込まれたTc-99mレベルは、非常に長い半減期（18時間超）を示した。この
ことは、一旦、アプタマーが腫瘍内に進入すると、そのアプタマーによって運ば
れた放射標識は腫瘍内に長期間留まることを意味する。この様なデータは、この
アプタマーに結合した細胞毒性剤、例えば放射性核種及び非放射性活性剤も腫瘍
内に長い半減期で残留するであろうことを示す。
【００７４】 Tc-99m放射活性は、その他の組織、特に小腸及び大腸にも出現する。当業者は
、ここで見られる肝胆性クリアランスパターンを、例えば、Tc-99mキレーターの
親水性を変えることにより、キレーターを変えることにより、又は放射性金属／
キレーターの対を共に変えることにより、容易に変更できる。 Tc-99mで標識したHi15-TTA1 を用いて、その注射の３時間後に、動物の全体像
を得た。Hi15-TTA1 を注射したマウスから得た像には、明かに腫瘍が表れている
が、Hi15-TTA1.NBを注射したマウスから得た像には表れていない（図３）。体内
分布実験から予想される通り、胃腸管にも放射活性が明白である。
【００７５】 実施例５：蛍光標識TTA1による腫瘍組織内のテネイシンＣの局在決定 材料及び方法： TTA1及びTTA1.NBを、前記の通りに合成した。Hi15-NHS 結合に関する記載の通
りに、そのアプタマーの５’アミンに、スクシンイミジルローダミンレッドＸ（
Molecular Probes, Eugene, OR）を結合した。このローダミンレッドＸ結合アプ
タマーであるTTA1−レッド及び TTA1.NB−レッドを、逆相HPLCにより精製した。
U251細胞の培養及びヌードマウス内での腫瘍増殖を、前記の通りに行った。５nm
ole のTTA1−レッド又は TTA1.NB−レッドをヌードマウスに静脈内注射し、そし
て希望の時間に動物を麻酔し、 0.9％NaClにより潅流し、そして殺した。腫瘍を
切り出し、ホルマリン中に浸けた。ホルマリン中に24時間浸けた後、10μｍ切片
を切り出し、そして蛍光顕微鏡（Eclipse E800、ニコン、日本）を用いて、ロー
ダミンレッドＸを検出した。
【００７６】 結果： TTA1−レッドは、未結合の親アプタマーTTA1と同一のテネイシンＣ親和性を、
５nMの強さで有する。注射10分後に、腫瘍内のTTA1−レッド及び TTA1.NB−レッ
ドの蛍光レベルを比較した。結合性アプタマーTTA1−レッドは、腫瘍を強く染色
しているが、隣接する組織を染色していない（図４）。対象的に、 TTA1.NB−レ
ッドを用いた場合、組織の自己蛍光のみが検出された。これらの結果は、インビ
ボにおけるテネイシンＣの蛍光的検出において、このアプタマーが有用であるこ
と、同様に、エキソビボにおける組織切片の染色のために、このアプタマーを用
いうることを示す。
【００７７】 実施例６：アプタマーTTA1（現在GS7641とも云う）によるインビボでの腫瘍の検
出：別の腫瘍タイプ アプタマーの標識、体内分布、及びヌードマウスへの腫瘍の異種移植を、実施
例４の記載通りに行った。 多くのヒトの腫瘍タイプがテネイシンＣを発現していることが知られている。
TTA1／GS7641が、グリオブラストーマ以外の腫瘍タイプを標的にすることができ
るかどうかを調べるために、いくつかのヒト腫瘍細胞株を、ヌードマウス内で腫
瘍として増殖させた。ヒトのテネイシンＣの発現に関して、腫瘍組織を検査し、
そしてヒトテネイシンＣを発現している腫瘍を、アプタマーの取り込みについて
検査した。図６は、いくつかの腫瘍、例えばグリオブラストーマ、乳ガン、結腸
直腸ガン、及び横紋筋肉腫におけるアプタマーの取り込みを示す。結合性アプタ
マー（TTA1／GS7641）と非結合性アプタマー（TTA1.NB ）との比較により、腫瘍
への特異的な取り込みが証明される。ヒトのテネイシンＣではなく、マウスのテ
ネイシンＣを発現する異種移植片KBでは、腫瘍への取り込みは見られない。この
実験により、グリオブラストーマでの取り込みの観察が、その他のカルシノーマ
やサルコーマでの取り込みの観察にまで広がり、更に、ヒトテネイシンＣを発現
する全ての腫瘍が、TTA1／GS7641の取り込みを示すことが示される。
【００７８】 実施例７：In-111を用いた代替標識法 実施例４に記載の通りに、腫瘍の異種移植と体内分布の研究を行った。TTA1／
GS7641にDTPA及びDOTAを連結するために、その各々の環状無水物を、標準的な方
法により、中性pH条件下で、アミンを有するTTA1／GS7641と共にインキュベーシ
ョンした。DTPAの構造及び結合体の構造を、In-111で標識した状態で、各々図８
及び９に示す。DOTA結合体は、DTPAの場合と同一のリンカーを有する。0.5Ｍ Na
OAc（pH5.5）中で95℃で30分間インキュベーションすることにより、DOTA結合体
及びDTPA結合体をIn-111によって標識した。30Ｋカットオフ膜上で遠心透析する
ことにより、組み込まれなかった放射性標識を除いた後、腫瘍を有するマウスに
注射するために、放射性標識したアプタマーをリン酸緩衝塩水中に移した。
【００７９】 In-111標識アプタマーの体内分布は、実施例４に記載したTc標識アプタマーの
場合と著しく異なっている。図７は、Tc-99m標識TTA1／GS7641の場合と比べると
、腸におけるIn-111標識TTA1／GS7641の放射活性が非常に低下しており、これに
伴って、肝臓と腎臓における取り込みが増加していることを示している。この実
験から、当該キレーターの化学特性が、生きている動物における当該放射性標識
TTA1／GS7641の体内分布に大きく影響することが分かる。Hi15-TTA1／GS7641 の
場合とは異なる体内分布は、肝胆性クリアランスが望ましくない一定の臨床状況
下で、腫瘍を標的にするために有用であろう。この様な状況には、例えば、限定
でなく、腸、前立腺及びその他の腹部領域の放射線療法及び画像化がある。
【００８０】 表１：テネイシンＣ−SELEXにおけるRNA及びタンパク質の用量 ─────────────────────────── テネイシンＣ RNA ─────────────────────────── ラウンド （pMol／ウェル） （pMol／ウェル） ─────────────────────────── １ 12 200 ２ 12 200 ３ 12 200 ４ 12 200 ５ ２ 33 ６ ２ 33 ７ ２ 33 ８ 0.2 3.3 ───────────────────────────
【００８１】 表２：細胞−SELEX／テネイシンＣ−SELEXにおけるRNA及びタンパク質の用量 ─────────────────────────── テネイシンＣ RNA ─────────────────────────── ラウンド （pMol／ウェル） （pMol／ウェル） ─────────────────────────── E9P1 ２ 33 E9P2 ２ 33 ───────────────────────────
【００８２】 表３：テネイシンＣリガンド配列：精製タンパク質によるSELEX（テネイシン−
配列）及びU251細胞によるSELEX＋精製タンパク質によるSELEX（E9P2−配列）
【表１】
【００８３】
【表２】
【００８４】 表４：2'-OMe置換、内部欠失、TTA1、及びTTA1.NB
【表３】
【００８５】 表５：Tc-99m-TTA1及びTTA1.NBの体内分布
【表４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、細胞−SELEX によるRNA プールとU251細胞との結合を示す。
【図２】 図２は、アプタマーTTA1及びTTA1.NB の予想二次構造を示す。この図は、この
アプタマーとTc-99mキレーターとの結合を含んでいる。全てのＡは2' OMeとして
修飾されている。指示したもの以外の全てのＧは2' OMeとして修飾されている。
全てのＣとＵが2' Fとして修飾されている。
【図３】 図３は、Tc-99mで標識されたTTA1及びTTA1.NB を用いて、その注射の３時間後
に得られた、マウスに異種移植したU251腫瘍の画像を示す。
【図４】 図４は、ローダミンレッドＸで標識されたTTA1の静脈内注射の３時間後に得ら
れたU251グリオブラストーマ腫瘍切片の蛍光顕微鏡像を示す。
【図５】 図５は、Tc-99m及びリンカーが、TTA1の５’Ｇを介して結合されるという様式
を示す。
【図６】 図６は、マウスに異種移植した種々のヒトの腫瘍への、３時間後のTTA1／GS76
41の取込みを、非結合性コントロールアプタマーの取込みと比較して示す。ID／
ｇ＝注射量／グラム。
【図７】 図７は、放射性金属のキレーターとしてDOTA又はDTPAのいずれかを用いてIn-1
11で標識したTTA1／GS7641の、注射３時間後の体内分布を示す。
【図８】 図８は、アプタマーとDTPAとの結合を示す。 111InはDTPAによりキレート化さ
れている。
【図９】 図９は、アプタマーとDOTAとの結合を示す。 111InはDOTAによりキレート化さ
れている。
【図１０】 図10は、アプタマーTTA1の予想二次構造を示す。この図は、このアプタマーと
Tc-99mキレーターとの結合も示す。このアプタマーは、Tc-99mで標識された形で
示されている。全てのＡは2' OMeとして修飾されている。指示したもの以外の全
てのＧは2' OMeとして修飾されている。全てのＣ及びＵが2' Fとして修飾されて
いる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 35/00 ４Ｃ０８６ 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 33/60 Ｚ 33/60 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パーマ，デイビッド アメリカ合衆国，コロラド 80301，ブー ルダー，ハビタット ドライブ 6140 (72)発明者 ゴールド，ラリー アメリカ合衆国，コロラド 80302，ブー ルダー，フィフス ストリート 1033 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA26 DA44 FA16 FB02 FB08 FB10 4B024 AA01 AA12 CA09 CA10 CA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ42 QQ79 QR32 QR48 QR56 QR62 QS25 QS28 QX07 4C076 CC41 EE59A FF68 4C084 AA17 NA10 NA13 ZA422 ZA892 ZB262 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA02 MA05 NA10 NA13 ZA42 ZA89 ZB26

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記を含んでなる方法に従って同定される、テネイシンＣに
    対する核酸リガンド： （ａ）核酸の候補混合物をテネイシンＣと接触させること、これは、その候補混
    合物に比べて、テネイシンＣとの親和性がより高い核酸を、その候補混合物の残
    りのものから分画するためであり； （ｂ）その親和性のより高い核酸を、候補混合物の残りのものから分画すること
    ； （ｃ）テネイシンＣの核酸リガンドを同定するために、テネイシンＣに対する結
    合親和性及び結合特異性が比較的により高い核酸が濃縮された核酸混合物を得る
    ために、その親和性のより高い核酸を増幅すること。
  2. 【請求項２】 前記の核酸の候補混合物が一本鎖の核酸を含んでなる、請求
    項１の核酸リガンド。
  3. 【請求項３】 前記の一本鎖の核酸がリボ核酸である、請求項２の核酸リガ
    ンド。
  4. 【請求項４】 前記の核酸の候補混合物が、2'-F（２’−フルオロ）修飾さ
    れたリボ核酸を含んでなる、請求項３の核酸リガンド。
  5. 【請求項５】 テネイシンＣに対する、精製且つ単離された天然に存在しな
    い核酸リガンド。
  6. 【請求項６】 前記核酸リガンドが一本鎖である、請求項５の、精製且つ単
    離された天然に存在しない核酸リガンド。
  7. 【請求項７】 前記核酸リガンドがRNA である、請求項６の、精製且つ単離
    された天然に存在しない核酸リガンド。
  8. 【請求項８】 前記リガンドが２’−フルオロ（2'-F）修飾されたヌクレオ
    チドを含んでなる、請求項７の、精製且つ単離された天然に存在しないＲＮＡリ
    ガンド。
  9. 【請求項９】 前記リガンドが、表３及び４、並びに図２に示した配列から
    なる群から選択される、請求項８の、精製且つ単離された天然に存在しないＲＮ
    Ａリガンド。
  10. 【請求項１０】 下記を含んでなる、テネイシンＣに対する核酸リガンドを
    同定する方法： （ａ）核酸の候補混合物をテネイシンＣと接触させること、これは、その候補混
    合物に比べて、テネイシンＣとの親和性がより高い核酸を、その候補混合物の残
    りのものから分画するためであり； （ｂ）その親和性のより高い核酸を、候補混合物の残りのものから分画すること
    ； （ｃ）テネイシンＣの核酸リガンドを同定するために、テネイシンＣに対する結
    合親和性及び結合特異性が比較的により高い核酸が濃縮された核酸混合物を得る
    ために、その親和性のより高い核酸を増幅すること。
  11. 【請求項１１】 下記を更に含んでなる、請求項10の方法： （ｄ）過程ａ），ｂ）及びｃ）を繰り返すこと。
  12. 【請求項１２】 前記の核酸の候補混合物が一本鎖の核酸を含んでなる、請
    求項１０の方法。
  13. 【請求項１３】 前記の一本鎖の核酸がリボ核酸である、請求項12の方法。
  14. 【請求項１４】 前記の核酸が2'-F（２’−フルオロ）修飾されたリボ核酸
    である、請求項13の方法。
  15. 【請求項１５】 テネイシンＣの核酸リガンド及びマーカーを含んでなる、
    インビボの診断に用いるための複合体。
  16. 【請求項１６】 前記のテネイシンＣの核酸リガンドが、下記： （ａ）核酸の候補混合物をテネイシンＣと接触させること、これは、その候補混
    合物に比べて、テネイシンＣとの親和性がより高い核酸を、その候補混合物の残
    りのものから分画するためであり； （ｂ）その親和性のより高い核酸を、候補混合物の残りのものから分画すること
    ； （ｃ）テネイシンＣの核酸リガンドを同定するために、テネイシンＣに対する結
    合親和性及び結合特異性が比較的により高い核酸が濃縮された核酸混合物を得る
    ために、その親和性のより高い核酸を増幅すること を含んでなる方法により同定されるものである、請求項15の複合体。
  17. 【請求項１７】 前記の核酸の候補混合物が一本鎖の核酸を含んでなる、請
    求項16の複合体。
  18. 【請求項１８】 前記の一本鎖の核酸がリボ核酸である、請求項17の複合体
    。
  19. 【請求項１９】 前記の核酸の候補混合物が2'-F（２’−フルオロ）修飾さ
    れたリボ核酸を含んでなる、請求項18の複合体。
  20. 【請求項２０】 前記マーカーが、放射性核種、フルオロフォア、磁気化合
    物、及びビオチンからなる群から選択される、請求項15の複合体。
  21. 【請求項２１】 前記の放射性核種が、テクネチウム−99m（Tc-99m), Re-1
    88, Cu-64, Cu-67, F-18, 125I, 131I, 111In, 32P、及び186Re からなる群から
    選択される、請求項20の複合体。
  22. 【請求項２２】 前記マーカーがテクネチウム−99m である、請求項21の複
    合体。
  23. 【請求項２３】 更にリンカーを含んでなる、請求項22の複合体。
  24. 【請求項２４】 前記リンカーが、下記構造： 【化１】 を有する、請求項23の複合体。
  25. 【請求項２５】 前記複合体が 【化２】 である、ただし全てのＡが2'-OMeとして修飾され、指示したもの以外の全てのＧ
    が2'-OMeとして修飾され、全てのＣが2'-Fとして修飾され、そして全てのＵが2'
    -Fとして修飾されている、請求項24の複合体。
  26. 【請求項２６】 下記を含んでなる、テネイシンＣの核酸リガンド及びマー
    カーを含んでなる複合体を調製する方法： （ａ）核酸の候補混合物をテネイシンＣと接触させること、これは、その候補混
    合物に比べて、テネイシンＣとの親和性がより高い核酸を、その候補混合物の残
    りのものから分画するためであり； （ｂ）その親和性のより高い核酸を、候補混合物の残りのものから分画すること
    ； （ｃ）テネイシンＣに対する結合親和性及び結合特異性が比較的により高い核酸
    が濃縮された核酸混合物を得るために、その親和性のより高い核酸を増幅するこ
    と；及び （ｄ）同定されたテネイシンＣの核酸リガンドをマーカーに共有結合すること。
  27. 【請求項２７】 前記マーカーが、放射性核種、フルオロフォア、磁気化合
    物、及びビオチンからなる群から選択される、請求項26の方法。
  28. 【請求項２８】 前記の放射性核種が、Tc-99m, Re-188, Cu-64, Cu-67, F-
    18, 125I, 131I, 111In, 32P、及び186Re からなる群から選択される、請求項27
    の方法。
  29. 【請求項２９】 前記マーカーがTc-99mである、請求項28の方法。
  30. 【請求項３０】 更にリンカーを含んでなる、請求項29の方法。
  31. 【請求項３１】 前記リンカーが、下記構造： 【化３】 を有する、請求項30の複合体。
  32. 【請求項３２】 前記複合体が 【化４】 である、ただし全てのＡが2'-OMeとして修飾され、指示したもの以外の全てのＧ
    が2'-OMeとして修飾され、全てのＣが2'-Fとして修飾され、そして全てのＵが2'
    -Fとして修飾されている、請求項31の複合体。
  33. 【請求項３３】 テネイシンＣを発現している疾患の存在を、その疾患を有
    しうる生物学的組織において検出するための、下記を含んでなる方法： （ａ）核酸の候補混合物から、テネイシンＣのリガンドである核酸リガンドを同
    定すること、ただし、 （ｉ）核酸の候補混合物をテネイシンＣと接触させること、これは、その候
    補混合物に比べて、テネイシンＣとの親和性がより高い核酸を、その候補混合物
    の残りのものから分画するためであり； （ii）その親和性のより高い核酸を、候補混合物の残りのものから分画する
    こと； （iii)テネイシンＣに対する結合親和性及び結合特異性が比較的により高い
    核酸の混合物を得るために、その親和性のより高い核酸を増幅すること、 を含んでなる方法により、テネイシンＣの核酸リガンドを同定すること； （ｂ）マーカーと核酸リガンドとの複合体を形成するために、過程(iii）で同定
    した核酸リガンドに、インビボ診断に用いることのできるマーカーを付着させる
    こと； （ｃ）腫瘍を有しうる組織を、そのマーカー−核酸リガンド複合体に露出するこ
    と；及び （ｄ）テネイシンＣを発現する疾患を同定するために、その組織において、その
    マーカー−核酸リガンド複合体の存在を検出すること。
  34. 【請求項３４】 前記のマーカー−核酸リガンド複合体が更にリンカーを含
    んでなる、請求項33の方法。
  35. 【請求項３５】 前記マーカーが、放射性核種、フルオロフォア、磁気化合
    物、及びビオチンからなる群から選択される、請求項34の方法。
  36. 【請求項３６】 前記の放射性核種が、Tc-99m, Re-188, Cu-64, Cu-67, F-
    18, 125I, 131I, 111In, 32P、及び186Re からなる群から選択される、請求項35
    の方法。
  37. 【請求項３７】 前記マーカーがテクネチウム−99m である、請求項36の方
    法。
  38. 【請求項３８】 前記リンカーが、 【化５】 である、請求項37の方法。
  39. 【請求項３９】 前記マーカー−核酸リガンド複合体が 【化６】 である、ただし全てのＡが2'-OMeとして修飾され、指示したもの以外の全てのＧ
    が2'-OMeとして修飾され、全てのＣが2'-Fとして修飾され、そして全てのＵが2'
    -Fとして修飾されている、請求項38の方法。
  40. 【請求項４０】 前記複合体に、治療剤又は診断剤を付着することを更に含
    んでなる、請求項33の方法。
  41. 【請求項４１】 前記疾患が、ガン、乾癬及びアテローム性動脈硬化症から
    なる群から選択される、請求項33の方法。
  42. 【請求項４２】 前記疾患がガンである、請求項41の方法。
  43. 【請求項４３】 テネイシンＣを発現している疾患に治療剤を供給する方法
    であって、テネイシンＣの核酸リガンドを治療剤に共有結合して、複合体を形成
    すること、及びその複合体を患者に投与すること、を含んでなる、前記方法。
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