RU2823029C1 - Method for increasing antimicrobial activity of cell-free supernatant bifidobacterium bifidum 791 with respect to klebsiella pneumoniae and escherichia coli - Google Patents
Method for increasing antimicrobial activity of cell-free supernatant bifidobacterium bifidum 791 with respect to klebsiella pneumoniae and escherichia coli Download PDFInfo
- Publication number
- RU2823029C1 RU2823029C1 RU2023126169A RU2023126169A RU2823029C1 RU 2823029 C1 RU2823029 C1 RU 2823029C1 RU 2023126169 A RU2023126169 A RU 2023126169A RU 2023126169 A RU2023126169 A RU 2023126169A RU 2823029 C1 RU2823029 C1 RU 2823029C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cell
- bifidum
- free supernatant
- supernatant
- antimicrobial activity
- Prior art date
Links
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 title claims abstract description 85
- 241000186016 Bifidobacterium bifidum Species 0.000 title claims abstract description 73
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 52
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 229940002008 bifidobacterium bifidum Drugs 0.000 title claims abstract description 10
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract 1
- 239000007259 schaedler broth Substances 0.000 abstract 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 42
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 23
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 16
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 14
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 14
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 13
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 11
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 10
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 9
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 9
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 8
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 8
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 5
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 5
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 5
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 4
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000037041 Community-Acquired Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 241000617624 Escherichia coli M17 Species 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000008649 adaptation response Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002368 bacteriocinic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001764 biostimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013325 dietary fiber Nutrition 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000002352 surface water Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии и медицине и может использоваться в научно-исследовательских и производственных бактериологических лабораториях с целью получения бесклеточных супернатантов бифидобактерий с высокой антимикробной активностью в качестве сырья для производства местных (топических, наружных) лечебно-профилактических средств и метабиотиков с антимикробным действием против представителей грамнегативных бактерий рода клебсиелл и эшерихий.The invention relates to microbiology, biotechnology and medicine and can be used in research and production bacteriological laboratories in order to obtain cell-free supernatants of bifidobacteria with high antimicrobial activity as raw materials for the production of local (topical, external) therapeutic and prophylactic agents and metabiotics with antimicrobial action against representatives of gram-negative bacteria of the genus Klebsiella and Escherichia.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART
Рост и распространение возбудителей инфекционных заболеваний, характеризующихся множественной лекарственной устойчивостью, является одной из основных проблем современной прикладной биологии, медицины и ветеринарии [6, 21]. Это связано прежде всего с чрезмерным назначением антимикробных средств, нарушением сроков приема препаратов, а также низким уровнем информированности населения о сложившейся ситуации, что приводит к самостоятельному бесконтрольному применению этиотропных антимикробных препаратов, как в здравоохранении, так и в ветеринарии [7, 20, 22]. Представители семейства Enterobacteriaceae (эшерихии и клебсиеллы), являются одними из наиболее частых возбудителей нозокомиальных и внебольничных инфекций. По данным анализа онлайн-платформы резистентности к антимикробным препаратам AMRmap, энтеробактерии обладают высокими значениями формирования устойчивости к различным антибиотикам [Зацаринная Е.А., Колупаева Н.В., Колупаева Л.В. Антибиотикоустойчивость энтеробактерий, выделенных из поверхностных водных объектов разных природно-климатических зон. Acta biomedica scientifica. 2022; 7(3): 142-149. doi: 10.29413/ABS.2022-7.3.15].The growth and spread of infectious disease agents characterized by multidrug resistance is one of the main problems of modern applied biology, medicine and veterinary medicine [6, 21]. This is primarily due to the excessive prescription of antimicrobial agents, violation of the timing of drug administration, as well as a low level of public awareness of the current situation, which leads to the independent uncontrolled use of etiotropic antimicrobial drugs, both in public health and in veterinary medicine [7, 20, 22] . Representatives of the Enterobacteriaceae family (Escherichia and Klebsiella) are among the most common causative agents of nosocomial and community-acquired infections. According to the analysis of the online antimicrobial resistance platform AMRmap, enterobacteria have high rates of resistance to various antibiotics [Zatsarinnaya E.A., Kolupaeva N.V., Kolupaeva L.V. Antibiotic resistance of enterobacteria isolated from surface water bodies of different climatic zones. Acta biomedica scientifica. 2022; 7(3): 142-149. doi: 10.29413/ABS.2022-7.3.15].
Поиск альтернативных методов и средств борьбы с возбудителями инфекционных заболеваний на современном этапе крайне актуально. В настоящее время в медицинской, микробиологической и ветеринарной практике проводится поиск и широкое использование бактерий-антагонистов и бактерий-продуцентов антимикробных веществ, в том числе на основе штаммов бифидобактерий.The search for alternative methods and means of combating pathogens of infectious diseases is extremely important at the present stage. Currently, in medical, microbiological and veterinary practice, there is a search for and widespread use of antagonist bacteria and bacteria producing antimicrobial substances, including those based on strains of bifidobacteria.
В научной литературе известно наличие антимикробной (антагонистической) активности бифидобактерий против различных видов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Антимикробная активность бифидобактерий и продуктов их вторичного метаболизма является важным конкурентным фактором, препятствующим вторжению и персистенции патогенных и условна-патогенных бактерий. Описаны разнообразные неспецифические механизмы антагонистического действия бифидобактерий в отношении грампозитивной и грамнегативной микрофлоры [1, 2, 48]. Такие как, ингибирующее действие молекул органических кислот, вызывающих локальное снижение рН в биотопе кишечника, конкуренция за питательные вещества, сайты адгезии; продукция специфических антимикробных субстанций (bacteriocin-like inhibitory substances, BLIS); стимуляция врожденного и адаптивного иммунитета хозяина.The presence of antimicrobial (antagonistic) activity of bifidobacteria against various types of opportunistic and pathogenic microorganisms is known in the scientific literature. The antimicrobial activity of bifidobacteria and the products of their secondary metabolism is an important competitive factor that prevents the invasion and persistence of pathogenic and opportunistic bacteria. Various nonspecific mechanisms of the antagonistic action of bifidobacteria against gram-positive and gram-negative microflora have been described [1, 2, 48]. Such as the inhibitory effect of organic acid molecules that cause a local decrease in pH in the intestinal biotope, competition for nutrients, adhesion sites; production of specific antimicrobial substances (bacteriocin-like inhibitory substances, BLIS); stimulation of the host’s innate and adaptive immunity.
Однако важной проблемой, является снижение антагонистической (антимикробной) активности штаммов бифидобактерий, возникающая при применении бифидосодержащих пробиотических препаратов. В связи с этим необходимо проводить исследования, направленные на поиск не только новых штаммов бифидобактерий и создания препаратов на основе метаболитов (метаболических пробиотиков с антимикробным действием) [1], но и способов повышения антимикробной (антагонистической) активности пробиотических штаммов и их метаболитов.However, an important problem is the reduction in the antagonistic (antimicrobial) activity of bifidobacteria strains, which occurs when using bifido-containing probiotic preparations. In this regard, it is necessary to conduct research aimed at searching not only for new strains of bifidobacteria and creating drugs based on metabolites (metabolic probiotics with antimicrobial effects) [1], but also ways to increase the antimicrobial (antagonistic) activity of probiotic strains and their metabolites.
В настоящее время применяются различные способы повышения антимикробной активности пробиотических штаммов. Известен способ повышения антимикробной активности у пробиотических микроорганизмов, основанный на выращивании антагонистически активных штаммов бифидо- и лактобактерий с использованием пищевых волокон (виноградных выжимок) в качестве стимуляторов их роста. Основой данного способа является внесение в питательную среду дополнительного компонента - виноградной выжимки, которая усиливает антимикробные свойств пробиотических бактерий (Макарова Н.В., Игнатова Д.Ф. Еремеева Н.Б. Использование отходов переработки винограда в качестве источника комплекса биологически активных веществ // Вестник ВГУИТ. 2020. Т. 82. № 4. С. 207-212. doi:10.20914/2310-1202- 2020-4-207-212). Однако, внесение в среду предлагаемого компонента, предполагает предварительное получение виноградной выжимки, что требует дополнительных временных и ресурсных затрат на осуществление способа. Недостатком данного способа является также, что в данном способе используются клетки пробиотических бактерий, а не их супернатант (метаболиты), заведомо содержащий более высокий уровень антимикробных веществ. Кроме того, виноградная выжимка может обладать собственными антимикробными свойствами, в том числе против штаммов бифидо- и лактобацилл.Currently, various methods are used to increase the antimicrobial activity of probiotic strains. There is a known method of increasing the antimicrobial activity of probiotic microorganisms, based on the cultivation of antagonistically active strains of bifidobacteria and lactobacilli using dietary fiber (grape pomace) as stimulants for their growth. The basis of this method is the introduction of an additional component into the nutrient medium - grape pomace, which enhances the antimicrobial properties of probiotic bacteria (Makarova N.V., Ignatova D.F. Eremeeva N.B. Using grape processing waste as a source of a complex of biologically active substances // Bulletin of VGUIT. 2020. T. 82. No. 4. P. 207-212. However, introducing the proposed component into the environment presupposes the preliminary receipt of grape pomace, which requires additional time and resource costs to implement the method. The disadvantage of this method is also that this method uses cells of probiotic bacteria, and not their supernatant (metabolites), which obviously contains a higher level of antimicrobial substances. In addition, grape pomace may have its own antimicrobial properties, including against strains of bifidobacteria and lactobacilli.
Известен способ повышения антагонистической активности некоторых штаммов-антагонистов (Enterococcus faecalis, Escherichia coli M-17, Bacillus subtilis) (Семенов А.В. Способ повышения антагонистической активности бактерий, Вестник ОГУ №6, С. 100 - 103). Указанный способ позволяет повысить антагонистическую бактерий-антагонистов, путем активации штамма-антагониста компонентами исследуемой культуры S. aureus, по отношению к которой добиваются повышение антагонизма. При этом в данном способе используется фрагменты клеточных стенок и экзометаболиты индикаторного штамма стафилококка. Основным недостатком данного способа является то, что он не позволяет повысить антагонистическую активность пробиотических штаммов бифидобактерий. Способ характеризуются высокой трудоемкостью, многостадийностью и большой продолжительностью осуществления способа.There is a known method for increasing the antagonistic activity of some antagonist strains (Enterococcus faecalis, Escherichia coli M-17, Bacillus subtilis) (Semenov A.V. Method for increasing the antagonistic activity of bacteria, Bulletin of OSU No. 6, pp. 100 - 103). This method makes it possible to increase the antagonistic activity of antagonist bacteria by activating the antagonist strain with components of the studied culture of S. aureus, in relation to which an increase in antagonism is achieved. Moreover, this method uses fragments of cell walls and exometabolites of an indicator strain of staphylococcus. The main disadvantage of this method is that it does not allow increasing the antagonistic activity of probiotic strains of bifidobacteria. The method is characterized by high labor intensity, multi-stage nature and long duration of implementation of the method.
Известен способ получения и композиция для повышения эффективности пробиотических микроорганизмов (Патент RU 2740140 C1) заключающийся в культивировании бифидобактерий в среде с пониженной концентрацией лимитирующего энергетического углеводного субстрата при его дробной подаче, при температуре от 36 до 38°C, при рН культуральной жидкости в интервале от 5,0 до 7,0, и прекращении процесса культивирования, когда суспензия содержит не менее 2·109 КОЕ бифидобактерий в мл и не менее 70% клеток агломерируют в микроколонии, при последующем удалении среды культивирования и ее замене среды культивирования на забуференный физиологический раствор, смешении и сорбировании на частицах активированного угля с размером не более 100 мкм в количестве от 10 до 40%, добавлении сахарозо-желатиновой защитной среды до 100% и лиофильном высушивании.There is a known method of production and composition for increasing the effectiveness of probiotic microorganisms (Patent RU 2740140 C1) which consists in cultivating bifidobacteria in an environment with a reduced concentration of a limiting energy carbohydrate substrate with its fractional supply, at a temperature from 36 to 38°C, at a pH of the culture fluid in the range from 5.0 to 7.0, and termination of the cultivation process, when the suspension contains at least 2 10 9 CFU of bifidobacteria per ml and at least 70% of the cells agglomerate in microcolonies, with the subsequent removal of the cultivation medium and its replacement of the cultivation medium with a buffered saline solution , mixing and sorption on activated carbon particles with a size of no more than 100 microns in an amount from 10 to 40%, adding a sucrose-gelatin protective medium up to 100% and freeze drying.
Основным недостатком данного способа является то, что он направлен на защиту пробиотических микроорганизмов от стрессового воздействия и гибели в экстремальных условиях желудка и верхних отделов кишечника, либо при длительном хранении и не позволяет повысить антимикробную (антагонистической) активность штаммов бифидобактерий. В данном способе используются клетки пробиотических бактерий, а не их супернатант (метаболиты), заведомо содержащий более высокий уровень антимикробных веществ. Также указанный способ характеризуются высокой трудоемкостью, многостадийностью и большой временной продолжительностью.The main disadvantage of this method is that it is aimed at protecting probiotic microorganisms from stress and death under extreme conditions of the stomach and upper intestines, or during long-term storage and does not allow increasing the antimicrobial (antagonistic) activity of bifidobacteria strains. This method uses cells of probiotic bacteria, rather than their supernatant (metabolites), which obviously contain a higher level of antimicrobial substances. Also, this method is characterized by high labor intensity, multi-stage and long time duration.
Близким аналогом к заявляемому способу по совокупности существенных признаков является способ получения биологического стимулятора, обладающего пробиотическим и иммуномодулирующим действием [В.А. Несчисляев, Л. П. Чистохина Способ получения биологического стимулятора / Патент РФ 2224018].A close analogue to the claimed method in terms of the totality of essential features is a method for producing a biological stimulant with probiotic and immunomodulatory effects [V.A. Neschislyaev, L.P. Chistokhina Method for obtaining a biological stimulant / RF Patent 2224018].
Данный способ основан на приготовлении бактериальной взвеси лакто- и бифидобактерий, полученной путем глубинного культивирования, её ультрафильтрацию с последующей стабилизацией фильтрата путем термической обработки при 80-1100С в течение 15-30 мин. Однако данный способ направлен на стимуляцию биологических свойств пробиотических штаммов лакто- и бифидобактерий под действием полученного биологического стимулятора и назначение данного способа не связано с повышением антимикробной активности супернатанта бифидобактерий в отношении грамнегативных бактерий (эшерихий и клебсиелл).This method is based on the preparation of a bacterial suspension of lacto- and bifidobacteria obtained by deep cultivation, its ultrafiltration, followed by stabilization of the filtrate by heat treatment at 80-110 0 C for 15-30 minutes. However, this method is aimed at stimulating the biological properties of probiotic strains of lacto- and bifidobacteria under the influence of the resulting biological stimulant, and the purpose of this method is not associated with an increase in the antimicrobial activity of the supernatant of bifidobacteria against gram-negative bacteria (Escherichia and Klebsiella).
При этом усиление антимикробных свойств супернатанта бифидобактерий не очевидно, поскольку термическая обработка сохраняет биостимулирующие свойства продукта, не исключая снижения антимикробных свойств супернатанта бифидобактерий.At the same time, the enhancement of the antimicrobial properties of the supernatant of bifidobacteria is not obvious, since heat treatment preserves the biostimulating properties of the product, without excluding a decrease in the antimicrobial properties of the supernatant of bifidobacteria.
Наиболее близким по назначению и совокупности существенных признаков является методика, использованная при изучении влияния экзометаболитов Bifidobacterium bifidum на пролиферативную активность условно-патогенных микроорганизмов (Регулирующее влияние экзометаболитов Bifidobacterium bifidum на пролиферативную активность условно-патогенных микроорганизмов / А.А. Марков, Т.Х. Тимохина, Н.Б. Перунова, Я.И. Паромова // Вестн. Смоленской государственной медицинской академии. - 2018. - № 1 (17). - С. 5662). Данная методика основана на получении экзометаболитов Bifidobacterium bifidum 791, выделенных из препарата «Бифидумбактерин» (ЗАО «Экополис», г. Ковров) при культивировании на бульоне Шедлера. Для получения супернатанта бульонные культуры Bifidobacterium bifidum 791 центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин и отделяли от клеток, стерилизовали через мембранные фильтры (Millipore, 0,22 мкм), взятая нами за прототип.The closest in purpose and set of essential features is the technique used in studying the effect of exometabolites of Bifidobacterium bifidum on the proliferative activity of opportunistic microorganisms (Regulatory influence of exometabolites of Bifidobacterium bifidum on the proliferative activity of opportunistic microorganisms / A.A. Markov, T.Kh. Timokhina , N.B. Perunova, Y.I. Paromova // Bulletin of the Smolensk State Medical Academy - 2018. - No. 17. This technique is based on the production of exometabolites of Bifidobacterium bifidum 791, isolated from the preparation “Bifidumbacterin” (JSC “Ekopolis”, Kovrov) during cultivation in Schedler’s broth. To obtain the supernatant, broth cultures of Bifidobacterium bifidum 791 were centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes and separated from the cells, sterilized through membrane filters (Millipore, 0.22 μm), which we took as a prototype.
Однако данный способ не свидетельствует о стабильности полученного супернатанта и его эффективности под действием различных стрессовых факторов, в том числе и температуры, а также культур антимикробной активности в отношении клебсиелл и кишечных палочек. Существенным недостатком методики является то, что антимикробная активность супернатанта бифидобактерий, полученного по описанному способу, связана с физиологическим состоянием микробной популяции штамма B. bifidum 791 и может изменяться в зависимости от влияния различных биотических и абиотических факторов.However, this method does not indicate the stability of the resulting supernatant and its effectiveness under the influence of various stress factors, including temperature, as well as cultures of antimicrobial activity against Klebsiella and Escherichia coli. A significant drawback of the technique is that the antimicrobial activity of the supernatant of bifidobacteria obtained by the described method is associated with the physiological state of the microbial population of the B. bifidum 791 strain and can vary depending on the influence of various biotic and abiotic factors.
Техническая задача - разработка способа повышения антимикробной активности бесклеточного супернатанта Bifidobacterium bifidum 791 в отношении штаммов Klebsiella pneumoniae и Escherichia coli.The technical task is to develop a method for increasing the antimicrobial activity of the cell-free supernatant of Bifidobacterium bifidum 791 against Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli strains.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ СПОСОБАIMPLEMENTATION OF THE METHOD
Технический результат, на достижение которого направлено патентуемое изобретение, способ повышения антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении штаммов K. pneumonia и E. coli.The technical result to be achieved by the patented invention, a method for increasing the antimicrobial activity of a cell-free supernatant B. bifidum 791 regarding strains K. pneumoniaAndE. coli.
Способ осуществляется следующим образом:The method is carried out as follows:
Получают бульонную культуру B. bifidum 791.A broth culture of B. bifidum 791 is obtained.
Приготовление бульона Шедлера производят по прилагаемой инструкции к коммерческой питательной среде (производитель HIMEDIA, Индия, кат. номер № M292-500G). Питательная среда (в количестве 28,4 г) растворяется в 1000 мл дистиллированной водой, перемешивается и доводится до кипения. Питательную среду (бульон Шедлера) стерилизуют методом автоклавирования при температуре 1210С (1,1 атм) в течение 15 мин, охлаждают до температуры культивирования, разливают в стерильные пробирки по 9 мл (10 пробирок). Preparation of Schedler's broth is carried out according to the attached instructions for the commercial nutrient medium (manufacturer HIMEDIA, India, cat. number No. M292-500G). The nutrient medium (in an amount of 28.4 g) is dissolved in 1000 ml of distilled water, mixed and brought to a boil. The nutrient medium (Schedler's broth) is sterilized by autoclaving at a temperature of 121 0 C (1.1 atm) for 15 minutes, cooled to cultivation temperature, and poured into sterile 9 ml tubes (10 tubes).
Далее готовят рабочий раствор инокулята бифидобактерий. Для этого берут 1 флакон сухого лиофилизированного препарата «Бифидумбактерин» штамм B. bifidum 791 (ЗАО «Экополис», Россия, г. Ковров), содержащего 5 доз препарата (в одной дозе содержание микробных клеток 1×107), соответственно во флаконе концентрация микробных клеток 5×107, которые разводят в 10 мл бульона Шедлера. Приготовленный рабочий раствор инокулята бифидобактерий по 1 мл вносят стеклянной пипеткой на дно пробирки с 9 мл бульоном Шедлера в каждую из 10 пробирок (конечная концентрация B. bifidum в растворе составляет 5×105). Пробирки инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов.Next, prepare a working solution of bifidobacteria inoculum. To do this, take 1 bottle of dry lyophilized drug “Bifidumbacterin” strain B. bifidum 791 (JSC “Ekopolis”, Russia, Kovrov), containing 5 doses of the drug (in one dose the content of microbial cells is 1 × 10 7 ), respectively, the concentration in the bottle microbial cells 5 × 10 7 , which are diluted in 10 ml of Schedler broth. The prepared working solution of bifidobacteria inoculum, 1 ml, is added with a glass pipette to the bottom of a test tube with 9 ml of Schedler's broth in each of 10 test tubes (the final concentration of B. bifidum in the solution is 5 × 10 5 ). The tubes are incubated in a thermostat at 37°C for 48 hours.
Далее получают бесклеточный супернатант B. bifidum 791.Next, the cell-free supernatant of B. bifidum 791 is obtained.
Полученные бульонные культуры бифидобактерий центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут, надосадочную культуральную жидкость забирают стеклянной пипеткой и пропускают ее через мембранные бактериальные фильтры «Millipore» (США), таким образом получают бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Полученный бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещают в стерильные стеклянные флаконы объемом 250 мл.The resulting broth cultures of bifidobacteria are centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes, the supernatant culture liquid is taken with a glass pipette and passed through Millipore membrane bacterial filters (USA), thus obtaining the cell-free supernatant of B. bifidum 791. The resulting cell-free supernatant of B. bifidum 791 is placed in sterile glass bottles of 250 ml.
После чего производят прогревание бесклеточного супернатанта B. bifidum 791. Стерильные стеклянные флаконы, содержащие бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещают на водяную баню при температуре 60 - 70°С и выдерживают в течение 20 минут. Охлаждают при комнатной температуре.Then the cell-free supernatant of B. bifidum 791 is heated. Sterile glass vials containing the cell-free supernatant of B. bifidum 791 are placed in a water bath at a temperature of 60 - 70 ° C and incubated for 20 minutes. Cool at room temperature.
Новым в предлагаемом способе повышения антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении исследуемых штаммов грамнегативных бактерий (клебсиелл и эшерихий), является то, что в нем, в сравнении с прототипом, происходит обработка бесклеточного супернатанта на водяной бане при температуре 60 - 70°С в течение 20 минут, что приводит к повышению антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении штаммов K. pneumoniae и E. coli. Это отличает предлагаемое техническое решение от прототипа.What is new in the proposed method for increasing the antimicrobial activity of the cell-free supernatant of B. bifidum 791 against the studied strains of gram-negative bacteria (Klebsiella and Escherichia) is that, in comparison with the prototype, the cell-free supernatant is processed in a water bath at a temperature of 60 - 70° C for 20 minutes, which leads to an increase in the antimicrobial activity of the cell-free supernatant of B. bifidum 791 against strains of K. pneumoniae and E. coli . This distinguishes the proposed technical solution from the prototype.
Теоретической предпосылкой для изучения влияния температуры на антимикробные свойства бесклеточного супернатанта бифидобактерий послужило то, что в биотехнологическом производстве пробиотических продуктов, бифидобактерии находятся под воздействием нагревания, охлаждения, осмотического шока, аэробной среды и др. [4], что, в свою очередь, вызывает необходимость исследовать стрессовые условия в технологическом процессе создания препарата. В настоящее время наиболее изученным является адаптивный ответ бифидобактерий на тепловое воздействие, который проявляется в увеличении белков теплового шока, экспрессии SOS-генов, а также в изменении клеточного деления [5]. Кроме того, для приготовления композиционных препаратов (мягких лекарственных форм) необходимо пастеризация. Однако, в литературе отсутствуют данные о влиянии температуры на изменение антимикробной активности бесклеточного супернатанта бифидобактерий.The theoretical prerequisite for studying the effect of temperature on the antimicrobial properties of the cell-free supernatant of bifidobacteria was that in the biotechnological production of probiotic products, bifidobacteria are exposed to heating, cooling, osmotic shock, aerobic environment, etc. [4], which, in turn, creates the need investigate stress conditions in the technological process of creating the drug. Currently, the most studied is the adaptive response of bifidobacteria to heat exposure, which manifests itself in an increase in heat shock proteins, expression of SOS genes, as well as changes in cell division [5]. In addition, pasteurization is necessary for the preparation of composite drugs (soft dosage forms). However, there is no data in the literature on the effect of temperature on changes in the antimicrobial activity of cell-free supernatant of bifidobacteria.
В работе был использован штамм B. bifidum 791, полученный из лиофилизированного препарата «Бифидумбактерин» (ЗАО «Экополис», Россия, г. Ковров). В качестве представителей энтеробактерий были использованы два наиболее часто встречающихся и клинически-значимых вида энтеробактерий: K. pneumoniae (n=12) и E. coli (n=12).The strain used in the work was B. bifidum 791, obtained from the lyophilized preparation “Bifidumbacterin” (JSC “Ekopolis”, Russia, Kovrov). The two most common and clinically significant species of enterobacteria were used as representatives of enterobacteria: K. pneumoniae (n=12) and E. coli (n=12).
На первом этапе получали бульонную культуру B. bifidum 791. Для этого готовили бульон Шедлера по прилагаемой инструкции к коммерческой питательной среде (производитель HIMEDIA, Индия, кат. номер № M292-500G). Питательную среду (в количестве 28,4 г) растворяется в 1000 мл дистиллированной водой, перемешивали, доводили до кипения и стерилизовали методом автоклавирования при температуре 121°С (1,1 атм) в течение 15 мин, затем охлаждали до температуры культивирования, разливали в стерильные пробирки по 9 мл (10 пробирок). Далее готовили рабочий раствор инокулята бифидобактерий. Для этого 1 флакон сухого лиофилизированного препарата «Бифидумбактерин» штамм B. bifidum 791 (ЗАО «Экополис», Россия, г. Ковров), содержащего 5 доз препарата (в одной дозе содержание микробных клеток 1×107), соответственно во флаконе концентрация микробных клеток 5×107, разводили в 10 мл бульона Шедлера. Приготовленный рабочий раствор инокулята бифидобактерий по 1 мл вносили стеклянной пипеткой на дно пробирки с 9 мл бульоном Шедлера в каждую из 10 пробирок (конечная концентрация B. bifidum в растворе составляет 5×105). Пробирки инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов.At the first stage, a broth culture of B. bifidum 791 was obtained. For this, Schedler broth was prepared according to the attached instructions for a commercial nutrient medium (manufacturer HIMEDIA, India, cat. no. M292-500G). The nutrient medium (in an amount of 28.4 g) is dissolved in 1000 ml of distilled water, mixed, brought to a boil and sterilized by autoclaving at a temperature of 121 ° C (1.1 atm) for 15 minutes, then cooled to cultivation temperature, poured into sterile tubes of 9 ml (10 tubes). Next, a working solution of bifidobacteria inoculum was prepared. For this, 1 bottle of dry lyophilized drug “Bifidumbacterin” strain B. bifidum 791 (JSC “Ecopolis”, Russia, Kovrov), containing 5 doses of the drug (in one dose the content of microbial cells is 1 × 10 7 ), respectively, in the bottle the concentration of microbial cells 5×10 7 , diluted in 10 ml of Schedler's broth. The prepared working solution of bifidobacteria inoculum, 1 ml, was added with a glass pipette to the bottom of a test tube with 9 ml of Schedler's broth in each of 10 test tubes (the final concentration of B. bifidum in the solution is 5 × 10 5 ). The tubes were incubated in a thermostat at 37°C for 48 hours.
На следующем этапе получали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Полученные бульонные культуры бифидобактерий центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут, надосадочную культуральную жидкость забирали стеклянной пипеткой и пропускали ее через мембранные бактериальные фильтры «Millipore» (США), таким образом получали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Полученный бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещают в стерильные стеклянные флаконы объемом 250 мл.At the next stage, the cell-free supernatant of B. bifidum 791 was obtained. The resulting broth cultures of bifidobacteria were centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes, the supernatant culture liquid was taken with a glass pipette and passed through membrane bacterial filters "Millipore" (USA), thus obtaining a cell-free B. bifidum 791 supernatant. The resulting cell-free B. bifidum 791 supernatant is placed in sterile 250 ml glass vials.
Далее прогревали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Стерильные стеклянные флаконы, содержащие бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещали на водяную баню при различной температуре и времени экспозиции. Исследовали влияние температуры 50, 60, 70, 80, 90 и 100°С и экспозицию в течение 10, 20 и 30 минут.Next, the cell-free supernatant of B. bifidum 791 was heated. Sterile glass vials containing the cell-free supernatant of B. bifidum 791 were placed in a water bath at different temperatures and exposure times. The effects of temperatures of 50, 60, 70, 80, 90 and 100°C and exposure for 10, 20 and 30 minutes were studied.
Параллельно готовили взвеси исследуемых культур культур K. pneumoniae и E. coli в физиологическом растворе хлорида натрия. Для этого штаммы K. pneumoniae и E. coli (каждые в отдельности) выращивали на агаре Мюллер-Хинтона в течение 24 часов при 37°С. Из выросших агаровых культур клебсиелл и кишечных палочек (каждой в отдельности) готовили суспензию на 0,9% растворе NaCl соответствующую концентрации 0,5 MF (1,5х108 КОЕ/мл) и доводили до рабочей концентрации взвеси культур K. pneumoniae и E. coli 3х103 КОЕ/мл путем последовательного разведения исходной концентрации в физиологическом растворе.In parallel, suspensions of the studied cultures of K. pneumoniae and E. coli were prepared in physiological sodium chloride solution. For this purpose, K. pneumoniae and E. coli strains (each separately) were grown on Mueller-Hinton agar for 24 hours at 37°C. From the grown agar cultures of Klebsiella and Escherichia coli (each separately), a suspension was prepared in a 0.9% NaCl solution corresponding to a concentration of 0.5 MF (1.5x10 8 CFU/ml) and brought to the working concentration of a suspension of K. pneumoniae and E. cultures. coli 3x10 3 CFU/ml by serial dilution of the initial concentration in physiological solution.
Далее соинкубировали взвеси культур K. pneumoniae и E. coli (каждую в отдельности) с полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, прогретыми при различной температуре (50, 60, 70, 80, 90 и 100°С) с экспозицией 10, 20 и 30 минут. Для этого 0,2 мл взвеси культур K. pneumoniae и E. coli (каждую в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл прогретых при различной температуре (50, 60, 70, 80, 90 и 100°С) с экспозиции 10, 20 и 30 минут супернатанта B. bifidum 791. Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37°С. После инкубации делали высев штаммов K. pneumoniae и E. coli по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности колоний K. pneumoniae и E. coli. Численность колоний клебсиелл и эшерихий определяли по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ), выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.Next, suspensions of cultures of K. pneumoniae and E. coli (each separately) were co-incubated with the resulting cell-free supernatant of B. bifidum 791, heated at different temperatures (50, 60, 70, 80, 90 and 100°C) with exposure times of 10, 20 and 30 minutes. To do this, 0.2 ml of a suspension of cultures of K. pneumoniae and E. coli (each separately) was added with sterile pipettes into test tubes with 1.8 ml heated at different temperatures (50, 60, 70, 80, 90 and 100°C) with exposures of 10, 20 and 30 minutes to the supernatant of B. bifidum 791. The resulting tubes were incubated for 24 hours at 37°C. After incubation, 0.1 ml of K. pneumoniae and E. coli strains were inoculated from each tube separately onto Mueller-Hinton medium to determine the number of K. pneumoniae and E. coli colonies. The number of Klebsiella and Escherichia colonies was determined by the number of colony-forming units (CFUs) grown on the surface of Mueller-Hinton agar.
В качестве контроля использовали соинкубирование взвеси культур K. pneumoniae и E. coli (каждая культура в отдельности) с питательным бульоном (контроль 1) и полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, без воздействия температуры (контроль 2). Для этого 0,2 мл взвеси культур K. pneumoniae и E. coli (каждый штамм в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл питательного бульона (контроль 1) или бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 (контроль 2). Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37°С. После инкубации также делали высев исследуемых штаммов по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности колоний K. pneumoniae и E. coli. Численность колоний клебсиелл и эшерихий определяли по количеству колониеобразующих единиц, выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.As a control, we used co-incubation of a suspension of cultures of K. pneumoniae and E. coli (each culture separately) with a nutrient broth (control 1) and the resulting cell-free supernatant of B. bifidum 791, without exposure to temperature (control 2). To do this, 0.2 ml of a suspension of cultures of K. pneumoniae and E. coli (each strain separately) was added with sterile pipettes into test tubes with 1.8 ml of nutrient broth (control 1) or cell-free supernatant of B. bifidum 791 (control 2). The resulting tubes were incubated for 24 hours at 37°C. After incubation, 0.1 ml of the test strains were also inoculated from each tube separately onto Mueller-Hinton medium to determine the number of K. pneumoniae and E. coli colonies. The number of Klebsiella and Escherichia colonies was determined by the number of colony-forming units grown on the surface of Mueller-Hinton agar.
О наличии антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 судили по снижению количества колониеобразующих единиц в контроле 2 по сравнению с контролем 1. Об увеличении антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 под воздействием температуры, судили по снижению количества колониеобразующих единиц или их полному отсутствию в опытной пробе по сравнению с контролем 2.The presence of antimicrobial activity of the cell-free supernatant of B. bifidum 791 was judged by the decrease in the number of colony-forming units in control 2 compared to control 1. The increase in the antimicrobial activity of the cell-free supernatant of B. bifidum 791 under the influence of temperature was judged by the decrease in the number of colony-forming units or their complete absence in experimental sample compared to control 2.
Авторами экспериментально установлено, что прогревание бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 при температуре 60-70°С в течении 20 минут приводит к увеличению его антимикробной активности в отношении штаммов K. pneumoniae и E. coli.The authors experimentally found that heating the cell-free supernatant of B. bifidum 791 at a temperature of 60-70°C for 20 minutes leads to an increase in its antimicrobial activity against strains of K. pneumoniae and E. coli .
На первом этапе было изучено влияние различных температур на антимикробную активность бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении штаммов K. pneumoniae и E. coli при экспозиции в течение 10 минут. Результаты исследований представлены в таблице в таблице 1.At the first stage, the effect of different temperatures on the antimicrobial activity of the cell-free supernatant of B. bifidum 791 against K. pneumoniae and E. coli strains upon exposure for 10 minutes was studied. The research results are presented in the table in Table 1.
Табл. 1 - Численность колониеобразующих единиц (КОЕ) исследуемых штаммов энтеробактерий под влиянием бесклеточного супернатанта B. bifidum 791, прогретого при различных температурах в течение 10 минут, в сравнении с контролями.Table 1 - The number of colony-forming units (CFU) of the studied strains of enterobacteria under the influence of the cell-free supernatant of B. bifidum 791, heated at various temperatures for 10 minutes, in comparison with controls.
без добавления супернатанта бифидобактерийControl 1
without adding bifidobacteria supernatant
с добавлением супернатанта бифидобактерий без воздействия температурыControl 2
with the addition of bifidobacteria supernatant without exposure to temperature
с добавлением супернатанта бифидобактерий после воздействия температурыExperience
with the addition of bifidobacteria supernatant after exposure to temperature
(n=12)K. pneumoniae
(n=12)
Полученные результаты свидетельствуют, что бесклеточный супернатант B. bifidum 791 обладает анттимикробной активностью в отношении исследуемых штаммов бактерий, снижая их численность до 102 КОЕ. При этом, прогревание на водяной бане при 50°С в течение 10 минут не приводило к изменению антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791. Увеличение температуры до 60°С и 70°С приводило к увеличению антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791, что сопровождалось снижением численности (КОЕ) энтеробактерий до единичных колоний.The results obtained indicate that the cell-free supernatant of B. bifidum 791 has antimicrobial activity against the studied bacterial strains, reducing their number to 10 2 CFU. At the same time, heating in a water bath at 50°C for 10 minutes did not lead to a change in the antimicrobial activity of the cell-free supernatant of B. bifidum 791. Increasing the temperature to 60°C and 70°C led to an increase in the antimicrobial activity of the cell-free supernatant of B. bifidum 791, which was accompanied by a decrease in the number (CFU) of enterobacteria to single colonies.
Дальнейшее повышение температуры до 80°С - 100°С приводило к снижению антимикробной активности супернатанта, о чем свидетельствовало повышение КОЕ энтеробактерий до 103.A further increase in temperature to 80°C - 100°C led to a decrease in the antimicrobial activity of the supernatant, as evidenced by an increase in the CFU of enterobacteria to 10 3 .
В связи с полученными данными на следующем этапе работы нами были проведены исследования по влиянию температуры 60°С и 70°С при экспозиции 10, 20 и 30 минут на антимикробную активность бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении исследуемых штаммов K. pneumoniae и E. coli. Полученные результаты представлены в таблице 2.In connection with the data obtained, at the next stage of work, we conducted studies on the effect of temperatures of 60°C and 70°C with exposure of 10, 20 and 30 minutes on the antimicrobial activity of the cell-free supernatant of B. bifidum 791 against the studied strains of K. pneumoniae and E. coli The results obtained are presented in Table 2.
Табл. 2 - Численность колониеобразующих единиц (КОЕ) исследуемых штаммов энтеробактерий под влиянием бесклеточного супернатанта B. bifidum 791, прогретого при 60°С и 70°С в течение 10, 20 и 30 минут, в сравнении с контролями.Table 2 - The number of colony-forming units (CFU) of the studied strains of enterobacteria under the influence of the cell-free supernatant of B. bifidum 791, heated at 60°C and 70°C for 10, 20 and 30 minutes, in comparison with controls.
без добавления супернатанта бифидобактерийControl 1
without adding bifidobacteria supernatant
с добавлением супернатанта бифидобактерий без воздействия температурыControl 2
with the addition of bifidobacteria supernatant without exposure to temperature
с добавлением супернатанта бифидобактерий после воздействия температурыExperience
with the addition of bifidobacteria supernatant after exposure to temperature
(n=12)K. pneumoniae
(n=12)
Как видно из представленной таблицы, наиболее высокой антимикробной активностью в отношении исследуемых штаммов K. pneumoniae и E. coli обладал бесклеточный супернатант B. bifidum 791, после воздействия на него температуры 60° и 70°С в течение 20 минут.As can be seen from the presented table, the highest antimicrobial activity against the studied strains K. pneumoniae and E. colihad cell-free supernatant B. bifidum 791, after exposure to a temperature of 60° and 70°C for 20 minutes.
Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить уровень антимикробной активности бесклеточного супернатанта B. bifidum 791 в отношении культур K. pneumoniae и E. coli, что может быть использовано для приготовления сырья с антимикробной активностью на основе супернатанта бифидобактерий при производстве местных (топических, наружных) лечебно-профилактических средств и метабиотиков с антимикробным действием против представителей грамнегативных бактерий K. pneumoniae и E. coli.Thus, the claimed method makes it possible to increase the level of antimicrobial activity of the cell-free supernatant of B. bifidum 791 in relation to cultures of K. pneumoniae and E. coli , which can be used for the preparation of raw materials with antimicrobial activity based on the supernatant of bifidobacteria in the production of local (topical, external) therapeutic -prophylactic agents and metabiotics with antimicrobial action against representatives of gram-negative bacteria K. pneumoniae and E. coli .
ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯEXAMPLES OF IMPLEMENTATION OF THE INVENTION
Пример 1.Example 1.
Определяли антимикробную активность бесклеточного супернатанта B. bifidum 791, прогретого при температуре 60°С в течение 20 минут в отношении тест-штамма E. coli АТСС 35218 и клинических изолятов E. coli.The antimicrobial activity of the cell-free supernatant of B. bifidum 791, heated at 60°C for 20 minutes, was determined against the test strain E. coli ATCC 35218 and clinical isolates of E. coli .
Готовили бульон Шедлера по прилагаемой инструкции к коммерческой питательной среде (производитель HIMEDIA, Индия, кат. номер № M292-500G): питательную среду (в количестве 28,4 г) растворяли в 1000 мл дистиллированной воды, перемешивали и доводили до кипения; затем стерилизовали методом автоклавирования при температуре 121°С (1,1 атм) в течение 15 мин, охлаждали до температуры культивирования. Бульон Шедлера разливали в стерильные пробирки по 9 мл (10 пробирок). Готовили рабочий раствор инокулята бифидобактерий. Для этого брали 1 флакон сухого лиофилизированного препарата «Бифидумбактерин» штамм B. bifidum 791 (ЗАО «Экополис», Россия, г. Ковров), содержащего 5 доз препарата (в одной дозе содержание микробных клеток 1×107), соответственно во флаконе концентрация микробных клеток 5×107, которые разводили в 10 мл бульона Шедлера. Приготовленный рабочий раствор инокулята бифидобактерий по 1 мл вносили стеклянной пипеткой на дно в каждой из пробирок с 9 мл бульона Шедлера (конечная концентрация B. bifidum в растворе 5×105). Пробирки инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов.Schedler's broth was prepared according to the attached instructions for a commercial nutrient medium (manufacturer HIMEDIA, India, cat. no. M292-500G): the nutrient medium (in an amount of 28.4 g) was dissolved in 1000 ml of distilled water, stirred and brought to a boil; then sterilized by autoclaving at a temperature of 121°C (1.1 atm) for 15 minutes, cooled to cultivation temperature. Schedler's broth was poured into sterile 9 ml tubes (10 tubes). A working solution of bifidobacteria inoculum was prepared. To do this, we took 1 bottle of the dry lyophilized drug “Bifidumbacterin” strain B. bifidum 791 (JSC “Ecopolis”, Russia, Kovrov), containing 5 doses of the drug (in one dose the content of microbial cells is 1 × 10 7 ), respectively, the concentration in the bottle microbial cells 5×10 7 , which were diluted in 10 ml of Schedler's broth. The prepared working solution of bifidobacteria inoculum, 1 ml, was added with a glass pipette to the bottom of each test tube with 9 ml of Schedler's broth (final concentration of B. bifidum in solution 5×10 5 ). The tubes were incubated in a thermostat at 37°C for 48 hours.
Полученные бульонные культуры бифидобактерий центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут, надосадочную культуральную жидкость забирали стеклянной пипеткой и пропускали её через мембранные бактериальные фильтры «Millipore» (США), таким образом получали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Полученный бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещали в стерильные стеклянные флаконы объемом 250 мл.The resulting broth cultures of bifidobacteria were centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes, the supernatant culture liquid was taken with a glass pipette and passed through Millipore membrane bacterial filters (USA), thus obtaining the cell-free supernatant of B. bifidum 791. The resulting cell-free supernatant of B. bifidum 791 was placed in sterile glass bottles with a volume of 250 ml.
Прогревали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Для этого стерильные стеклянные флаконы, содержащие бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещали на водяную баню при температуре 60°С и выдерживали в течение 20 минут. Охлаждали при комнатной температуре.The cell-free supernatant of B. bifidum 791 was heated. For this, sterile glass vials containing the cell-free supernatant of B. bifidum 791 were placed in a water bath at a temperature of 60°C and kept for 20 minutes. Cooled at room temperature.
Параллельно готовили взвеси культур E. coli (музейные и клинические изоляты эшерихий) в физиологическом растворе хлорида натрия. Для этого штаммы E. coli каждый в отдельности выращивали на агаре Мюллер-Хинтона в течение 24 часов при 37°С. Из выросшей агаровой культуры кишечных палочек каждой в отдельности готовили суспензию на 0,9% растворе NaCl соответствующую концентрации 0,5 MF (1,5х108 КОЕ/мл) и доводили до рабочей концентрации взвеси E. coli 3х103 КОЕ/мл путем последовательного разведения исходной концентрации в физиологическом растворе.In parallel, suspensions of E. coli cultures (museum and clinical Escherichia isolates) were prepared in physiological sodium chloride solution. For this purpose, E. coli strains were individually grown on Mueller-Hinton agar for 24 hours at 37°C. From each grown agar culture of E. coli, a suspension was prepared in a 0.9% NaCl solution corresponding to a concentration of 0.5 MF (1.5x10 8 CFU/ml) and brought to a working concentration of the E. coli suspension of 3x10 3 CFU/ml by serial dilution initial concentration in saline solution.
Далее соинкубировали взвеси культур E. coli каждую в отдельности с полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, прогретым при 60°С в течение 20 минут. Для этого 0,2 мл взвеси культур E. coli (каждую в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл прогретого при 60°С в течение 20 минут супернатанта B. bifidum 791. Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37°С. После инкубации делали высев штаммов E. coli по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности E. coli. Численность эшерихий определяли по количеству колониеобразующих единиц, выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.Next, suspensions of E. coli cultures were co-incubated, each separately, with the resulting cell-free supernatant of B. bifidum 791, heated at 60°C for 20 minutes. To do this, 0.2 ml of a suspension of E. coli cultures (each separately) was added with sterile pipettes into test tubes with 1.8 ml of B. bifidum 791 supernatant heated at 60°C for 20 minutes. The resulting test tubes were incubated for 24 hours at a temperature of 37°C WITH. After incubation, 0.1 ml of E. coli strains were inoculated from each tube separately onto Mueller-Hinton medium to determine the number of E. coli . The number of Escherichia was determined by the number of colony-forming units grown on the surface of Mueller-Hinton agar.
В качестве контроля использовали соинкубирование взвеси культур E. coli (каждая в отдельности) с полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, без воздействия температуры. Для этого 0,2 мл взвеси культур E. coli (каждую в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл бесклеточного супернатанта B. bifidum 791. Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37°С. После инкубации также делали высев штаммов E. coli по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности колоний E. coli. Численность колоний эшерихий определяли по количеству колониеобразующих единиц, выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.As a control, we used co-incubation of a suspension of E. coli cultures (each separately) with the resulting cell-free supernatant of B. bifidum 791, without exposure to temperature. To do this, 0.2 ml of a suspension of E. coli cultures (each separately) was added with sterile pipettes into test tubes with 1.8 ml of cell-free supernatant of B. bifidum 791. The resulting test tubes were incubated for 24 hours at a temperature of 37°C. After incubation, 0.1 ml of E. coli strains were also inoculated from each tube separately onto Mueller-Hinton medium to determine the number of E. coli colonies. The number of Escherichia colonies was determined by the number of colony-forming units grown on the surface of Mueller-Hinton agar.
В результате, бесклеточный супернатант B. bifidum 791 прогретый при 60°С в течение 20 минут обладал более высокой антимикробной активностью в отношении штаммов E. coli в сравнении с не гретым бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, поскольку происходило снижение количества колониеобразующих единиц исследуемых штаммов: у E. coli АТСС 35218 с 40±3 до 0 КОЕ, E. coli № 25 с 301±10 до 60±5 КОЕ и у E. coli № 37 с 230±11 до 110±9 КОЕ. Данный факт свидетельствует о повышении антимикробной активности против исследуемых штаммов E. coli прогретого бесклеточного супернатанта B. bifidum 791.As a result, the cell-free supernatant of B. bifidum 791 heated at 60°C for 20 minutes had higher antimicrobial activity against E. coli strains in comparison with the unheated cell-free supernatant of B. bifidum 791, since there was a decrease in the number of colony-forming units of the studied strains: in E. coli ATCC 35218 from 40±3 to 0 CFU, E. coli No. 25 from 301±10 to 60±5 CFU and in E. coli No. 37 from 230±11 to 110±9 CFU. This fact indicates an increase in the antimicrobial activity of the heated cell-free supernatant of B. bifidum 791 against the studied E. coli strains.
Пример 2.Example 2.
Определяли антимикробную активность бесклеточного супернатанта B. bifidum 791, прогретого при температуре 70°С в течение 20 минут в отношении тест-штамма K. pneumoniae АТСС 7006003 и клинических изолятов K. pneumoniae (№ 170, 252, 254).The antimicrobial activity of the cell-free supernatant of B. bifidum 791, heated at 70°C for 20 minutes, was determined against the test strain K. pneumoniae ATCC 7006003 and clinical isolates of K. pneumoniae (No. 170, 252, 254).
Готовили бульон Шедлера по прилагаемой инструкции к коммерческой питательной среде (производитель HIMEDIA, Индия, кат. номер № M292-500G): питательную среду (в количестве 28,4 г) растворяли в 1000 мл дистиллированной воды, перемешивали и доводили до кипения; затем стерилизовали методом автоклавирования при температуре 1210С (1,1 атм) в течение 15 мин, охлаждали до температуры культивирования. Бульон Шедлера разливали в стерильные пробирки по 9 мл (10 пробирок). Готовили рабочий раствор инокулята бифидобактерий. Для этого брали 1 флакон сухого лиофилизированного препарата «Бифидумбактерин» штамм B. bifidum 791 (ЗАО «Экополис», Россия, г. Ковров), содержащего 5 доз препарата (в одной дозе содержание микробных клеток 1×107), соответственно во флаконе концентрация микробных клеток 5×107, которые разводили в 10 мл бульона Шедлера. Приготовленный рабочий раствор инокулята бифидобактерий по 1 мл вносили стеклянной пипеткой на дно в каждой из пробирок с 9 мл бульона Шедлера (конечная концентрация B. bifidum в растворе 5×105). Пробирки инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 48 часов.Schedler's broth was prepared according to the attached instructions for a commercial nutrient medium (manufacturer HIMEDIA, India, cat. no. M292-500G): the nutrient medium (in an amount of 28.4 g) was dissolved in 1000 ml of distilled water, stirred and brought to a boil; then sterilized by autoclaving at a temperature of 121 0 C (1.1 atm) for 15 minutes, cooled to cultivation temperature. Schedler's broth was poured into sterile 9 ml tubes (10 tubes). A working solution of bifidobacteria inoculum was prepared. To do this, we took 1 bottle of the dry lyophilized drug “Bifidumbacterin” strain B. bifidum 791 (JSC “Ecopolis”, Russia, Kovrov), containing 5 doses of the drug (in one dose the content of microbial cells is 1 × 10 7 ), respectively, the concentration in the bottle microbial cells 5×10 7 , which were diluted in 10 ml of Schedler's broth. The prepared working solution of bifidobacteria inoculum, 1 ml, was added with a glass pipette to the bottom of each test tube with 9 ml of Schedler's broth (final concentration of B. bifidum in solution 5×10 5 ). The tubes were incubated in a thermostat at 37°C for 48 hours.
Полученные бульонные культуры бифидобактерий центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут, надосадочную культуральную жидкость забирали стеклянной пипеткой и пропускали её через мембранные бактериальные фильтры «Millipore» (США), таким образом получали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Полученный бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещали в стерильные стеклянные флаконы объемом 250 мл.The resulting broth cultures of bifidobacteria were centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes, the supernatant culture liquid was taken with a glass pipette and passed through Millipore membrane bacterial filters (USA), thus obtaining the cell-free supernatant of B. bifidum 791. The resulting cell-free supernatant of B. bifidum 791 was placed in sterile glass bottles with a volume of 250 ml.
Прогревали бесклеточный супернатант B. bifidum 791. Для этого стерильные стеклянные флаконы, содержащие бесклеточный супернатант B. bifidum 791 помещали на водяную баню при температуре 70°С и выдерживали в течение 20 минут. Охлаждали при комнатной температуре.The cell-free supernatant of B. bifidum 791 was heated. For this, sterile glass vials containing the cell-free supernatant of B. bifidum 791 were placed in a water bath at a temperature of 70°C and kept for 20 minutes. Cooled at room temperature.
Параллельно готовили взвеси культур K. pneumoniae (музейные и клинические изоляты клебсиелл) в физиологическом растворе хлорида натрия. Для этого штаммы K. pneumoniae каждый в отдельности выращивали на агаре Мюллер-Хинтона в течение 24 часов при 37°С. Из выросшей агаровой культуры кишечных палочек каждой в отдельности готовили суспензию на 0,9% растворе NaCl соответствующую концентрации 0,5 MF (1,5х108 КОЕ/мл) и доводили до рабочей концентрации взвеси K. pneumoniae 3х103 КОЕ/мл путем последовательного разведения исходной концентрации в физиологическом растворе.In parallel, suspensions of K. pneumoniae cultures (museum and clinical isolates of Klebsiella) were prepared in physiological sodium chloride solution. For this purpose, K. pneumoniae strains were individually grown on Mueller-Hinton agar for 24 hours at 37°C. From each grown agar culture of Escherichia coli, a suspension was prepared in a 0.9% NaCl solution corresponding to a concentration of 0.5 MF (1.5x10 8 CFU/ml) and brought to a working concentration of the K. pneumoniae suspension of 3x10 3 CFU/ml by serial dilution initial concentration in saline solution.
Далее соинкубировали взвеси культур K. pneumoniae каждую в отдельности с полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, прогретым при 70°С в течение 20 минут. Для этого 0,2 мл взвеси культур K. pneumoniae (каждую в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл прогретого при 70°С в течение 20 минут супернатанта B. bifidum 791. Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37°С. После инкубации делали высев штаммов K. pneumoniae по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности K. pneumoniae. Численность клебсиелл определяли по количеству колониеобразующих единиц, выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.Next, suspensions of K. pneumoniae cultures were co-incubated, each separately, with the resulting cell-free supernatant of B. bifidum 791, heated at 70°C for 20 minutes. To do this, 0.2 ml of a suspension of K. pneumoniae cultures (each separately) was added with sterile pipettes into test tubes with 1.8 ml of B. bifidum 791 supernatant heated at 70°C for 20 minutes. The resulting tubes were incubated for 24 hours at a temperature of 37°C WITH. After incubation, 0.1 ml of K. pneumoniae strains were inoculated from each tube separately onto Mueller-Hinton medium to determine the number of K. pneumoniae . The number of Klebsiella was determined by the number of colony-forming units grown on the surface of Mueller-Hinton agar.
В качестве контроля использовали соинкубирование взвеси культур K. pneumoniae (каждая в отдельности) с полученным бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, без воздействия температуры. Для этого 0,2 мл взвеси культур K. pneumoniae (каждую в отдельности) стерильными пипетками вносили в пробирки с 1,8 мл бесклеточного супернатанта B. bifidum 791. Полученные пробирки инкубировали 24 часа при температуре 370С. После инкубации также делали высев штаммов K. pneumoniae по 0,1 мл из каждой пробирки в отдельности на среду Мюллер-Хинтон для определения численности колоний K. pneumoniae. Численность колоний клебсиелл определяли по количеству колониеобразующих единиц, выросших на поверхности агара Мюллер-Хинтон.As a control, we used co-incubation of a suspension of K. pneumoniae cultures (each separately) with the resulting cell-free supernatant of B. bifidum 791, without exposure to temperature. To do this, 0.2 ml of a suspension of K. pneumoniae cultures (each separately) was added with sterile pipettes into tubes with 1.8 ml of cell-free supernatant of B. bifidum 791. The resulting tubes were incubated for 24 hours at a temperature of 37 0 C. After incubation, the strains were also seeded K. pneumoniae 0.1 ml from each tube separately on Mueller-Hinton medium to determine the number of K. pneumoniae colonies. The number of Klebsiella colonies was determined by the number of colony-forming units grown on the surface of Mueller-Hinton agar.
В результате, бесклеточный супернатант B. bifidum 791 прогретый при 80°С в течение 20 минут обладал более высокой антимикробной активностью в отношении штаммов K. pneumoniae в сравнении с не гретым бесклеточным супернатантом B. bifidum 791, поскольку происходило снижение количества колониеобразующих единиц исследуемых штаммов: у K. pneumoniae АТСС 7006003 с 130±10 до 55±8 КОЕ, у K. pneumoniae №170 с 55±5 до 33±3 КОЕ, у K. pneumoniae № 252 с 150±6 до 4±2 и у K. pneumoniae № 254 с 100±4 до 0 КОЕ. Данный факт свидетельствует о повышении антимикробной активности в отношении исследуемых штаммов K. pneumoniae прогретого бесклеточного супернатанта B. bifidum 791.As a result, the cell-free supernatant of B. bifidum 791 heated at 80°C for 20 minutes had higher antimicrobial activity against K. pneumoniae strains in comparison with the unheated cell-free supernatant of B. bifidum 791, since there was a decrease in the number of colony-forming units of the studied strains: in K. pneumoniae ATCC 7006003 from 130±10 to 55±8 CFU, in K. pneumoniae No. 170 from 55±5 to 33±3 CFU, in K. pneumoniae No. 252 from 150±6 to 4±2 and in K. pneumoniae No. 254 from 100±4 to 0 CFU. This fact indicates an increase in the antimicrobial activity of the heated cell-free supernatant of B. bifidum 791 against the studied strains of K. pneumoniae .
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2823029C1 true RU2823029C1 (en) | 2024-07-17 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Diepers et al. | In vitro ability of lactic acid bacteria to inhibit mastitis-causing pathogens | |
| AU2017271491A1 (en) | Composition and methods for microbiota therapy | |
| RU2460778C1 (en) | Method for producing autoprobiotic of enterocuccus faecium being representative of indigenic host intestinal microflora | |
| Mickymaray et al. | Anti-bacterial efficacy of bacteriocin produced by marine Bacillus subtilis against clinically important extended spectrum beta-lactamase strains and methicillin-resistant Staphylococcus aureus | |
| Chen et al. | A novel bacteriocin against multiple foodborne pathogens from Lacticaseibacillus rhamnosus isolated from juice ferments: ATF perfusion-based preparation of viable cells, characterization, antibacterial and antibiofilm activity | |
| CN114504599A (en) | New application of lactobacillus paracasei ET-22 in aspects of resisting aging and improving innate immunity | |
| CN114504106A (en) | New application of bifidobacterium lactis BL-99 in anti-aging and innate immunity improvement | |
| AL-Kafaween et al. | Characterization of biofilm formation by Escherichia coli: An in vitro study | |
| Pringgenies et al. | Explorations of symbiotic microbe from sea cucumber gut as an anti-multi-drug resistant microbe agent for utilization in hand sanitizer products | |
| RU2823029C1 (en) | Method for increasing antimicrobial activity of cell-free supernatant bifidobacterium bifidum 791 with respect to klebsiella pneumoniae and escherichia coli | |
| CN117327606A (en) | A Bifidobacterium longum strain and its preparation method and use | |
| Suryani et al. | New Probiotic Isolation of Coconut Water's Helpful Lactic Acid Bacteria Cure Covid-19 Patients | |
| TW202322832A (en) | Novel application of Bifidobacterium longum subsp. infantis YLGB-1496 in anti-aging and improving innate immunity | |
| RU2065875C1 (en) | Strain of bacterium escherichia coli used for colibacterin preparing | |
| LM et al. | COMPARATIVE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF SOME METABIOTICS SYNTHESIZED BY LACTIC ACID BACTERIA. | |
| Kravets et al. | INVESTIGATION OF STRAINS OF MICROORGANISMS ISOLATED FROM SICK CHILDREN WITH RECURRENT TONSILLITIS | |
| Samet et al. | Prevalence of different virulence factors and biofilm production ability of urinary Escherichia coli isolates | |
| RU2663720C1 (en) | Probiotic based on bacterial strain bacillus subtilis mg-8 vkpm v-12476 and method of application probiotic for prevention of gastrointestinal diseases in agricultural animals and poultry | |
| El-Sherbiny et al. | Enhancement of Streptomyces sp. Mh-133 activity against some antibiotic resistant bacteria using biotic elicitation | |
| RU2738858C1 (en) | Method of extracting uncultivated forms of staphylococci | |
| RU2803350C1 (en) | Bifidobacterium longum 174 strain for the preparation of region-specific probiotic preparations for the prevention and personalized treatment of diseases of the gastrointestinal tract in residents of the karachay-cherkess republic and/or for enrichment of the traditional fermented milk drink gypy airan based on indigenous kefir grains | |
| Hemalatha et al. | In vitro characterization of bacteriocin producing Bacillus subtilis from milk samples | |
| CN116064295B (en) | Lactobacillus paracasei with function of inhibiting haemophilus influenzae and application thereof | |
| RU2709136C1 (en) | Nutrient medium for pseudomonas aeruginosa release | |
| Al-Bermani et al. | Biofilm Producing by Staphylococcus aureus and Lactobacillus spp. Isolated from Urogenital Tract Infections of Women. |