RU2813754C1

RU2813754C1 - Method of stimulating antagonistic activity of lactobacilli

Info

Publication number: RU2813754C1
Application number: RU2023106608A
Authority: RU
Inventors: Владимир Иванович Терехов; Александр Сергеевич Тищенко; Елена Юрьевна Облогина; Павел Павлович Яковенко; Дмитрий Олегович Алферов
Filing date: 2023-03-20
Publication date: 2024-02-16

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: following is proposed: a method of stimulating the antagonistic activity of lactobacilli, which involves adding a test culture exometabolite to the nutrient medium for lactobacilli, and Escherichia toxoid taken relative to the nutrient medium of lactobacilli in a ratio of 1:10,000-1:100,000 is used as an exometabolite.

EFFECT: invention provides an expansion of the arsenal of methods of stimulating the antagonistic activity of lactobacilli.

1 cl, 3 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии для получения пробиотических препаратов.The invention relates to microbiology and can be used in biotechnology to obtain probiotic preparations.

В настоящее время пробиотические препараты нашли широкое применение, как в гуманитарной, так и ветеринарной медицине. Это связано с чрезвычайно важной ролью симбионтных микроорганизмов в механизмах обмена веществ и резистентности человека и животных. Поэтому при различных патологиях, особенно связанных с применением антибиотиков, назначаются препараты живых молочнокислых бактерий, в т.ч. лактобактерий. Лактобактерии входят в основной пул симбионтных микроорганизмов кишечного тракта. Они обладают антагонистической активностью к широкому кругу патогенов, способных заселять естественные полости биологических объектов и вызывать воспалительно-дегенеративные процессы. Однако штаммы-пробионты или аутоштаммы лактобактерий могут естественным образом снижать или не проявлять свою антагонистическую активность (АА), что побуждает микробиологов постоянно осуществлять скрининг их активных вариантов или разрабатывать способы повышения у лактобактерий АА. Для повышения АА лактобактерий ранее были использованы различные способы. Так с целью повышения АА лактобактерий зарубежные авторы [Chung Т.С., Axelsson L., Lindgren S.E., Dobrogosz W.J. In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri // Microbial ecology in health and disease, 1989. 2:137-144; DOI: 10.3109/08910608909140211] предложили метод совместного культивирования Lactobacillus reuteri с бактерией-индуктором. Данный метод позволят стимулировать продукцию лактобактерией бактериоцина рейтерина. В качестве бактерии-индуктора авторы использовали представителей энтеробактерий, стафилококков, псевдомонад, клостридий и др. групп бактерий. Было установлено, что продукция лактобактерией бактериоцина была тем выше, чем выше становилась концентрация бактерии-индуцента в культуральной среде. Несмотря на положительный результат, этот способ стимуляции имеет недостатки, заключающиеся в том, что не позволяет контролировать рост бактерий-индукторов, а, следовательно, получать чистый и безопасный пробиотический продукт. Поэтому было предложено использовать в качестве стимуляторов не живых бактерий, а их метаболиты или клеточные компоненты.Currently, probiotic preparations have found wide use in both humanitarian and veterinary medicine. This is due to the extremely important role of symbiont microorganisms in the mechanisms of metabolism and resistance of humans and animals. Therefore, for various pathologies, especially those associated with the use of antibiotics, preparations of live lactic acid bacteria are prescribed, incl. lactobacilli. Lactobacilli are part of the main pool of symbiont microorganisms of the intestinal tract. They have antagonistic activity against a wide range of pathogens that can colonize the natural cavities of biological objects and cause inflammatory and degenerative processes. However, probiont strains or autostrains of lactobacilli may naturally reduce or not exhibit their antagonistic activity (AA), which prompts microbiologists to constantly screen for their active variants or develop ways to increase AA in lactobacilli. Various methods have previously been used to increase the AA of lactobacilli. So, in order to increase the AA of lactobacilli, foreign authors [Chung T.S., Axelsson L., Lindgren S.E., Dobrogosz W.J. In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri // Microbial ecology in health and disease, 1989. 2: 137-144; DOI: 10.3109/08910608909140211] proposed a method for co-cultivating Lactobacillus reuteri with an inducer bacterium. This method will stimulate the production of bacteriocin reuterin by lactobacilli. The authors used representatives of enterobacteria, staphylococci, pseudomonads, clostridia and other groups of bacteria as inducer bacteria. It was found that the production of bacteriocin by lactobacilli was higher, the higher the concentration of the inducing bacterium in the culture medium. Despite the positive result, this method of stimulation has the disadvantages that it does not allow to control the growth of inducer bacteria and, therefore, to obtain a pure and safe probiotic product. Therefore, it was proposed to use not living bacteria as stimulants, but their metabolites or cellular components.

В работе Barefoot S.F. с соавторами [Barefoot S.F., Chen Y.R., Hughes Т.А., Bodine A.B., Shearer M.Y., Hughes M.D. Identification and purification of a protein that induces production of the Lactobacillus acidophilus bacteriocin lacta-cin В // Appl. Environ Microbiol., 1994. 60(10):3522-3528; DOI: 10.1128/aem.60.10.3522-3528.] было показано, что выработка Lactobacillus acidophilus лактацина В индуцируется белком клеточной стенки Lactobacillus delbrueckii. Недостатком данного способа является сложность и высокая стоимость получения белка-индуцента, а также то обстоятельство, что продуцируемый бактериоцин подавляет рост близкородственных лактобактерий.In Barefoot S.F. with co-authors [Barefoot S.F., Chen Y.R., Hughes T.A., Bodine A.B., Shearer M.Y., Hughes M.D. Identification and purification of a protein that induces production of the Lactobacillus acidophilus bacteriocin lacta-cin B // Appl. Environ Microbiol., 1994. 60(10):3522-3528; DOI: 10.1128/aem.60.10.3522-3528.] it was shown that the production of lactacin B by Lactobacillus acidophilus is induced by the cell wall protein of Lactobacillus delbrueckii. The disadvantage of this method is the complexity and high cost of obtaining the inducing protein, as well as the fact that the produced bacteriocin inhibits the growth of closely related lactobacilli.

Было установлено влияние метаболитов пробиотических и патогенных бактерий на антагонистическую активность лактобактерий (Вахитов Т.Я., Вербицкая Н.Б., Добролеж О.В., Полевая Е.В., Кобатов А.И. Влияние метаболитов пробиотических и патогенных бактерий на антагонистическую активность Lactobacillus acidophilus Д №75 // Научный журнал КубГАУ, 2013. №92(08); http://ej.kubagro.ru/2013/08/pdf/22.pdf). Данные метаболиты представляют собой водные растворы комплексов различных хелатных солей натрия и монокарбоновых аминокислот. Показано, что эти комплексы метаболитов (Aktoflor и Patogen) стимулировали на плотной питательной среде антагонистическую активность у Lactobacillus acidophilus Д №75 в 2-5 раз, проявляющуюся в виде увеличения зоны задержки роста кишечной палочки, золотистого стафилококка и синегнойной палочки. Однако аналогичного действия в жидкой питательной среде авторы не отметили. Недостатком данного способа стимуляции является искусственный состав метаболитов, не отвечающий естественному (природному) составу и их дороговизна. По своему действию рассматриваемые комплексы метаболитов в большей степени представляют собой дополнительные ростовые компоненты к питательной среде, чем и объясняется стимуляция роста лактобактерий, а также увеличение их АА. Причем, как показывают авторы, с увеличением дозы ввода в питательную среду стимулятора и продолжительностью культивирования лактобактерий повышается АА. Это свидетельствует не столько в пользу стимуляции собственно АА, сколько в пользу накопления в культуральной среде метаболитов лактобактерий, обладающих подавляющим действием на условно патогенные бактерии. Кроме того, данные комплексы метаболитов представляют собой водные растворы, которые авторы предлагают вводить в питательную среду для лактобактерий не из расчета объема (в миллилитрах), а исходя из концентрации в растворе сухого вещества в миллиграммах, что затрудняет расчет дозы ввода стимуляторов в питательную среду.The influence of metabolites of probiotic and pathogenic bacteria on the antagonistic activity of lactobacilli was established (Vakhitov T.Ya., Verbitskaya N.B., Dobrolezh O.V., Polevaya E.V., Kobatov A.I. The influence of metabolites of probiotic and pathogenic bacteria on the antagonistic activity activity of Lactobacillus acidophilus D No. 75 // Scientific journal of KubSAU, 2013. No. 92(08); http://ej.kubagro.ru/2013/08/pdf/22.pdf). These metabolites are aqueous solutions of complexes of various chelated sodium salts and monocarboxylic amino acids. It was shown that these complexes of metabolites (Aktoflor and Pathogen) stimulated the antagonistic activity of Lactobacillus acidophilus D No. 75 on a solid nutrient medium by 2-5 times, manifested in the form of an increase in the zone of growth inhibition of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. However, the authors did not note a similar effect in a liquid nutrient medium. The disadvantage of this method of stimulation is the artificial composition of metabolites, which does not correspond to the natural composition and their high cost. In their action, the metabolite complexes under consideration are to a greater extent additional growth components to the nutrient medium, which explains the stimulation of lactobacilli growth, as well as an increase in their AA. Moreover, as the authors show, with an increase in the dose of stimulant introduced into the nutrient medium and the duration of cultivation of lactobacilli, AA increases. This indicates not so much in favor of stimulation of AA itself, but in favor of the accumulation in the culture medium of lactobacilli metabolites, which have an inhibitory effect on opportunistic bacteria. In addition, these complexes of metabolites are aqueous solutions, which the authors propose to introduce into the nutrient medium for lactobacilli not based on volume (in milliliters), but based on the concentration of dry matter in the solution in milligrams, which makes it difficult to calculate the dose of stimulants introduced into the nutrient medium.

Близким по технической сущности к заявляемому способу является описанный А.В. Семеновым способ повышения АА бактерий [Семенов А.В. Способ повышения антагонистической активности бактерий // Вестник ОГУ, 2007. №7. С. 100-103; http://vestnik.osu.ru/2007_6/17.pdf]. Данный способ заключается в том, что экзометаболиты и фрагменты клеточной стенки Staphylococcus aureus добавляли в культуральную среду бактерий симбионтов в соотношении 1:2. В качестве экзометаболитов использовался центрифугат суточной бульонной культуры стафилококка обезвреженный хлороформом, а фрагменты клеточной стенки получали вначале путем щелочного, а затем трипсинового протеолиза с последующим осаждением спиртом и ацетоном. Было установлено, что экзометаболиты и фрагменты клеточных стенок могут стимулировать, подавлять или вовсе не оказывать действие на АА различных бактерий в отношении Staphylococcus aureus.Close in technical essence to the claimed method is that described by A.V. Semenov’s method of increasing the AA of bacteria [Semenov A.V. A method for increasing the antagonistic activity of bacteria // Bulletin of OSU, 2007. No. 7. pp. 100-103; http://vestnik.osu.ru/2007_6/17.pdf]. This method involves adding exometabolites and cell wall fragments of Staphylococcus aureus to the culture medium of symbiont bacteria in a 1:2 ratio. Centrifugate of a daily broth culture of staphylococcus neutralized with chloroform was used as exometabolites, and cell wall fragments were obtained first by alkaline and then trypsin proteolysis, followed by precipitation with alcohol and acetone. It was found that exometabolites and cell wall fragments can stimulate, suppress, or have no effect at all on the AA of various bacteria against Staphylococcus aureus.

Недостатком данного способа стимуляции АА является узкий спектр действия - только в отношении Staphylococcus aureus, низкая эффективность, высокая доза введения в культуральную среду лактобактерий.The disadvantage of this method of AA stimulation is its narrow spectrum of action - only against Staphylococcus aureus, low efficiency, high dose of lactobacilli introduced into the culture medium.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности способа стимуляции антагонистической активности лактобактерий и расширение применения специфического препарата.The technical result of the present invention is to increase the efficiency of the method for stimulating the antagonistic activity of lactobacilli and expand the use of a specific drug.

Технический результат достигается тем, что в способе стимуляции антагонистической активности лактобактерий предусматривающем добавление в питательную среду для лактобактерий экзометаболита тест-культуры согласно изобретению в качестве экзометаболита используют эшерихиозный анатоксин, взятого относительно питательной среды лактобактерий в соотношении 1:10000-1:100000.The technical result is achieved by the fact that in the method of stimulating the antagonistic activity of lactobacilli, which involves adding a test culture exometabolite to the nutrient medium for lactobacilli according to the invention, Escherichia toxoid is used as an exometabolite, taken relative to the nutrient medium of lactobacilli in a ratio of 1:10000-1:100000.

Новизна заявляемого предложения состоит в том, что в качестве стимулятора антагонистической активности лактобактерий используют эшерихиозный анатоксин.The novelty of the proposed proposal is that Escherichia toxoid is used as a stimulator of the antagonistic activity of lactobacilli.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружены аналогичные заявляемой совокупности признаков, позволяющие получить технический результат, который ранее не достигался известными средствами, что позволяет судить об изобретательском уровне и новизне заявляемого предложения.In the patent and scientific and technical literature, no set of features similar to the claimed one has been found that would allow one to obtain a technical result that has not previously been achieved by known means, which makes it possible to judge the inventive step and novelty of the proposed proposal.

Конкретные примеры, описывающие осуществление способа стимуляции антагонистической активности лактобактерий.Specific examples describing the implementation of a method for stimulating the antagonistic activity of lactobacilli.

Пример 1. Стимуляция АА лактобактерий на плотной питательной среде. В 99-99,9 мл стерильной растопленной и охлажденной до 40-45°С агаровой среды для культивирования лактобактерий МРС-4 (НИЦФ, Санкт-Петербург) вносили цельный эшерихиозный анатоксин (патент РФ №2432174 от 27.10.2011) в объеме 1 мл, что соответствовало его разведению в питательной среде 1:100 и разведенный 1:10-1:100 стерильным 0,9% раствором хлорида натрия в объеме 0,1-1 мл, что соответствовало разведению анатоксина в среде 1:1000-1:1000000. В предварительных опытах было установлено, что при введении эшерихиозного анатоксина до концентрации 1:10 рост лактобактерий полностью подавлялся из-за содержащегося в препарате консерванта.Example 1. Stimulation of AA lactobacilli on a solid nutrient medium. Whole Escherichia toxoid (RF patent No. 2432174 dated October 27, 2011) in a volume of 1 ml was added to 99-99.9 ml of sterile melted and cooled to 40-45°C agar medium for the cultivation of lactobacilli MRS-4 (NICF, St. Petersburg). , which corresponded to its dilution in a nutrient medium of 1:100 and diluted 1:10-1:100 with a sterile 0.9% sodium chloride solution in a volume of 0.1-1 ml, which corresponded to a dilution of the toxoid in a medium of 1:1000-1:1000000 . In preliminary experiments, it was found that when Escherichia toxoid was administered to a concentration of 1:10, the growth of lactobacilli was completely suppressed due to the preservative contained in the preparation.

Далее среду тщательно размешивали и разливали в чашки Петри диаметром 90 мм в объеме 20 мл. Таким образом, на каждое разведение эшерихиозного анатоксина расходовалось 5 чашек Петри, что соответствовало 5-ти повторностям на каждое разведение. В контроле в питательную среду вносили аналогичный объем стерильного 0,9% хлорида натрия.Next, the medium was thoroughly stirred and poured into Petri dishes with a diameter of 90 mm in a volume of 20 ml. Thus, for each dilution of Escherichia toxoid, 5 Petri dishes were consumed, which corresponded to 5 replicates for each dilution. In the control, a similar volume of sterile 0.9% sodium chloride was added to the nutrient medium.

После застывания агара в контрольных и опытных чашках на его поверхность вносили 0,1 мл суточной бульонной культуры лактобактерий и распределяли шпателем по всей поверхности для получения сплошного газона. В качестве лактобактерий использовали изолят Lactobacillus plantarum, выделенный из фекалий новорожденного теленка.After the agar solidified in the control and experimental dishes, 0.1 ml of a daily broth culture of lactobacilli was added to its surface and distributed with a spatula over the entire surface to obtain a continuous lawn. An isolate of Lactobacillus plantarum isolated from the feces of a newborn calf was used as lactobacilli.

Чашки инкубировали при 37°С в условиях анаэростата или повышенного содержания СО₂ с использованием газогенерирующих пакетов в течение 48 ч. По истечении этого времени одну половину агаровой пластины удаляли, а на ее место вносили расплавленный питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар, ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск), после застывания которого перпендикулярными штрихами к агаровой пластинке с выросшими колониями лактобактерий бактериологической петлей диаметром 2 мм засевали тест-культуры (кишечная палочка, золотистый стафилококк, клебсиелла пневмоника, синегнойная палочка) с концентрацией 10⁷ КОЕ/мл и помещали чашки Петри в термостат на 20-24 ч. По истечении времени инкубации чашки вынимали из термостата и линейкой или штангенциркулем производили измерение размера зоны задержки роста тест-культуры в миллиметрах. Величина стимуляции АА L. plantarum равнялась отношению значения среднего показателя величины зоны задержки роста тест-культур в опытных и контрольных чашках Петри. Результаты представлены в таблице 1.The dishes were incubated at 37°C under conditions of anaerostat or high CO ₂ content using gas-generating bags for 48 hours. After this time, one half of the agar plate was removed, and in its place melted nutrient agar for cultivating microorganisms (GRM-agar, FBUN) was added State Scientific Center for Medical and Biomedical Medicine, Obolensk), after solidification of which test cultures (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa) with a concentration of 10 ⁷ CFU/ml were inoculated with perpendicular streaks to the agar plate with grown colonies of lactobacilli with a bacteriological loop with a diameter of 2 mm and plates were placed Petri in a thermostat for 20-24 hours. After the incubation time, the dishes were removed from the thermostat and the size of the growth inhibition zone of the test culture in millimeters was measured using a ruler or caliper. The magnitude of AA stimulation of L. plantarum was equal to the ratio of the average value of the growth inhibition zone of the test cultures in the experimental and control Petri dishes. The results are presented in Table 1.

Как видно из материалов таблицы, используемый в опыте изолят лактобактерий обладает достаточно выраженной антагонистической активностью. Средняя величина зоны задержки роста тест-культур была равна 8,0 мм. При добавлении эшерихиозного анатоксина питательную среду для лактобактерий в концентрации от 1:100 до 1:100000 стимулировало АА L. plantarum в 1,14-1,45 раз, но при концентрации 1:1000000 стимулирующее действие практически не проявлялось. Наиболее эффективно стимулировали АА L. plantarum концентрации эшерихиозного анатоксина в диапазоне 1:10000-1:100000, когда индекс стимуляции составлял 1,38-1,45.As can be seen from the table, the lactobacilli isolate used in the experiment has quite pronounced antagonistic activity. The average value of the growth inhibition zone of the test cultures was 8.0 mm. When adding Escherichia toxoid, the nutrient medium for lactobacilli at a concentration of 1:100 to 1:100000 stimulated the AA of L. plantarum by 1.14-1.45 times, but at a concentration of 1:1000000 the stimulating effect was practically not manifested. The AA of L. plantarum was most effectively stimulated by concentrations of Escherichia toxoid in the range of 1:10000-1:100000, when the stimulation index was 1.38-1.45.

Пример 2. Стимуляция АА лактобактерий в жидкой питательной среде. В 99-99,9 мл стерильной жидкой питательной среды для культивирования лактобактерий МРС-1 (НИЦФ, Санкт-Петербург) вносили цельный эшерихиозный анатоксин (патент РФ №2432174 от 27.10.2011) в объеме 1 мл, что соответствовало его разведению в питательной среде 1:100 и разведенный 1:10-1:100 стерильным 0,9% раствором хлорида натрия в объеме 0,1-1 мл, что соответствовало разведению анатоксина в среде 1:1000-1:1000000. В предварительных опытах было установлено, что при введении эшерихиозного анатоксина в питательную среду до концентрации 1:10 рост лактобактерий полностью подавлялся из-за содержащегося в препарате консерванта. В контроле в питательную среду добавляли аналогичный объем стерильного 0,9% хлорида натрия.Example 2. Stimulation of AA lactobacilli in a liquid nutrient medium. Whole Escherichia toxoid (RF patent No. 2432174 dated October 27, 2011) was added to 99-99.9 ml of a sterile liquid nutrient medium for the cultivation of lactobacilli MRS-1 (NICF, St. Petersburg) in a volume of 1 ml, which corresponded to its dilution in the nutrient medium 1:100 and diluted 1:10-1:100 with a sterile 0.9% sodium chloride solution in a volume of 0.1-1 ml, which corresponded to a dilution of the toxoid in a medium of 1:1000-1:1000000. In preliminary experiments, it was found that when Escherichia toxoid was introduced into the nutrient medium to a concentration of 1:10, the growth of lactobacilli was completely suppressed due to the preservative contained in the preparation. In the control, a similar volume of sterile 0.9% sodium chloride was added to the nutrient medium.

Из каждого разведения эшерихиозного анатоксина и контрольной среды отбирали по 10 мл и вносили в пробирки.From each dilution of Escherichia toxoid and control medium, 10 ml was taken and added to test tubes.

Во все опытные пробирки и пробирки контроля №1 (положительный) вначале вносили по 100 тыс. микробных клеток L. plantarum, а через 2 часа такое же количество клеток Е. coli (по 3 пробирки) и S. aureus (по 3 пробирки). Одновременно в пробирки контроля №2 (отрицательный), содержащие только стерильную питательную среду МРС-1, также вносили по 100 тыс. клеток Е. coli и S. aureus. Через 2, 6, 24, 48, 72 ч после посева тест-культур производили посевы из пробирок на дифференциально-диагностические среды. Для индикации кишечной палочки использовали среду Эндо, а стафилококков - солевой агар. Для этого из каждой опытной и контрольных пробирок отбирали по 0,1 мл культуральной среды вносили в пробирки с 9,9 мл стерильного раствора хлорида натрия, из которых также отбирали по 0,1 мл и переносили в чашки Петри с дифференциально-диагностической средой и шпателем жидкость распределяли по всей поверхности агаровой пластинки. Через 24 ч осуществляли подсчет выросших колоний. Результаты отражены в таблице 2 и 3.All test tubes and control tubes No. 1 (positive) were first filled with 100 thousand microbial cells of L. plantarum, and after 2 hours the same number of E. coli cells (3 tubes each) and S. aureus (3 tubes each). At the same time, 100 thousand E. coli and S. aureus cells were also added to control tubes No. 2 (negative), containing only the sterile nutrient medium MPC-1. 2, 6, 24, 48, 72 hours after sowing the test cultures, the test tubes were inoculated onto differential diagnostic media. Endo medium was used to indicate E. coli, and salt agar was used for staphylococci. To do this, 0.1 ml of culture medium was taken from each test and control tubes and added to test tubes with 9.9 ml of sterile sodium chloride solution, from which 0.1 ml was also taken and transferred to Petri dishes with a differential diagnostic medium and a spatula the liquid was distributed over the entire surface of the agar plate. After 24 hours, the grown colonies were counted. The results are shown in Tables 2 and 3.

Материалы таблицы 2 и 3 свидетельствуют, что изолят L. plantarum в жидкой питательной среде в отношении Е. coli и S. aureus не сразу проявляет антагонистическую активность. В течение первых 6-ти часов интенсивность The materials in Tables 2 and 3 indicate that the L. plantarum isolate in a liquid nutrient medium does not immediately exhibit antagonistic activity against E. coli and S. aureus. During the first 6 hours the intensity

роста тест-культур в пробирках положительного контроля тождественна пробиркам отрицательного контроля. Однако через 24 ч в пробирках положительного контроля количество колониеобразующих единиц Е. coli и S. aureus резко снизилось, а через 48-72 ч достигло несколько десятков. Напротив, в пробирках отрицательного контроля рост кишечной палочки и золотистого стафилококка характеризовался высокой интенсивностью, о чем свидетельствовал сплошной газон колоний при высеве на агаровую среду.growth of test cultures in positive control tubes is identical to negative control tubes. However, after 24 hours in positive control tubes, the number of colony-forming units of E. coli and S. aureus decreased sharply, and after 48-72 hours it reached several dozen. On the contrary, in negative control tubes the growth of Escherichia coli and Staphylococcus aureus was characterized by high intensity, as evidenced by a continuous lawn of colonies when sown on agar medium.

При сравнении роста тест-культуры из опытных пробирок с ростом из пробирок положительного контроля из было установлено, что, несмотря на общую тенденцию тест-культур в течение первых 6-ти часов увеличивать свое количество клеток, интенсивность этого роста была неодинаковой. В посевах из опытных пробирок количество эшерихий и стафилококков было в 1,4-3,2 раза меньшим, чем из пробирок положительного контроля. Это может быть свидетельством того, что анатоксин выступил в качестве сигнального вещества для лактобактерий, активизирующих их еще до встречи с антагонистическими объектами. Через 24 ч разница в количестве выросших колоний тест-культур из опытных и контрольных пробирок стала еще более выраженной. Количество выросших колоний Е. coli из опытных пробирок было 3,4-8,4 раза, а стафилококков в 2-3,6 раза меньшим, чем в пробирках положительного контроля. Через 48 ч в опытных пробирках количество живых клеток эшерихий и стафилококков было в пределах одного-двух десятков, а через 72 ч они полностью подавлялись.When comparing the growth of the test culture from the experimental tubes with the growth from the positive control tubes from the test tubes, it was found that, despite the general tendency of the test cultures to increase their number of cells during the first 6 hours, the intensity of this growth was not the same. In cultures from test tubes, the number of Escherichia and staphylococci was 1.4-3.2 times less than from positive control tubes. This may be evidence that the toxoid acted as a signal substance for lactobacilli, activating them even before meeting antagonistic objects. After 24 hours, the difference in the number of grown colonies of test cultures from the experimental and control tubes became even more pronounced. The number of grown colonies of E. coli from the test tubes was 3.4-8.4 times, and staphylococci 2-3.6 times less than in the positive control tubes. After 48 hours in the test tubes, the number of living cells of Escherichia and Staphylococcus was within one to two dozen, and after 72 hours they were completely suppressed.

Таким образом, приведенные примеры показывают, что при добавлении в плотную или жидкую культуральную среду эшерихиозного анатоксина стимулирует антагонистическую активность лактобактерий в отношении различных бактерий. В большей степени стимуляция проявляется в отношении грамотрицательных бактерий, в меньшей - грамположительных. Наиболее эффективным стимуляция проявляется при добавлении в питательную среду эшерихиозного анатоксина в концентрации 1:10000-1:100000.Thus, the above examples show that when added to a solid or liquid culture medium, Escherichia toxoid stimulates the antagonistic activity of lactobacilli against various bacteria. To a greater extent, stimulation is manifested in relation to gram-negative bacteria, and to a lesser extent - gram-positive. The most effective stimulation occurs when Escherichia toxoid is added to the nutrient medium at a concentration of 1:10000-1:100000.

Claims

A method for stimulating the antagonistic activity of lactobacilli, which involves adding a test culture exometabolite to the nutrient medium for lactobacilli, characterized in that Escherichia toxoid taken relative to the nutrient medium of lactobacilli in a ratio of 1:10000-1:100000 is used as an exometabolite.