RU2847660C1

RU2847660C1 - Способ выявления гаплотипа фертильности HH2 у крупного рогатого скота голштинской породы

Info

Publication number: RU2847660C1
Application number: RU2024134929A
Authority: RU
Inventors: Сергей Александрович Олейник; Валентин Сергеевич Скрипкин; Артем Васильевич Лесняк; Марина Геннадьевна Кокотка; Дмитрий Анатольевич Ковалев; Сергей Владимирович Писаренко; Ирина Владимировна Кузнецова; Анна Сергеевна Волынкина; Екатерина Игоревна Василенко; Василий Валерьевич Сосунов; Татьяна Вячеславовна Радаева
Filing date: 2024-11-22
Publication date: 2025-10-15

Abstract

Изобретение относится к молекулярной генетике и предназначено для диагностики мутантного аллеля гена IFT80, ассоциированного с гаплотипом фертильности 2 (HH2) у крупного рогатого скота голштинской породы. Технический результат заявляемого изобретения заключается в идентификации специфичной мутации сдвига рамки считывания в гене IFT80 хромосомы 1 КРС и выявления точечной мутации rs523422030 (Т>del), ассоциированной с гаплотипом фертильности 2 (HH2) у крупного рогатого скота голштинской породы, методом ПЦР в режиме реального времени в пробах крови крупного рогатого скота джерсейской породы. Технический результат достигается с помощью способа выявления гаплотипа фертильности HH2 у крупного рогатого скота голштинской породы, включающего выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием реакционной смеси, состоящей из следующих компонентов: ДНК исследуемого образца исходной концентрацией 10 нг/мкл, в количестве 1 мкл; 10х буфер для TaqPol, в количестве 2,5 мкл; смесь растворов праймеров, включающая прямой праймер HH2-F 5'-AAATCCTACTTGAGAATGCA-3' и обратный праймер HH2-R 5'-GGAAGCGCCCTTCATAAGA-3', где концентрация каждого праймера в его растворе составляет 10 мкМ, в общем количестве 2,5 мкл; раствор HH2-T - аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда FAM-TAG+ACATTT+TCTTC+TTGTAG-BHQ1 с концентрацией в растворе 10 мкМ, в количестве 1 мкл; раствор HH2-del - аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда VIC-TAG+ACATTTCTTC+TTGTAG-BHQ1 с концентрацией в растворе 10 мкМ, в количестве 1 мкл; раствор смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) концентрацией 10 мкМ, в количестве 1 мкл; полимераза TaqPol активностью 5 ед./мкл, в количестве 0,5 мкл; вода для ПЦР до общего объема реакции 25 мкл, затем проводят оценку результатов реакции по наличию и сочетанию сигналов флуоресценции по каналам Green (FAM) и Yellow (VIC) для определения генотипа: отсутствие мутации (генотип Т/Т, дикий тип) устанавливают при наличии сигнала флуоресценции по каналу Green (FAM) и отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Yellow (VIC); наличие гетерозиготной мутации (генотип Т/del) устанавливают при наличии сигналов флуоресценции по обоим каналам – Green (FAM) и Yellow (VIC); наличие гомозиготной мутации (генотип del/del) устанавливают при отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Green (FAM) и наличии сигнала флуоресценции по каналу Yellow (VIC). 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Description

Изобретение относится к молекулярной генетике и предназначено для диагностики мутантного аллеля гена IFT80, ассоциированного с гаплотипом фертильности 2 (HH2) у крупного рогатого скота голштинской породы.

Известен метод диагностики голштинского гаплотипа 2 (гаплотип фертильности HH2), который приводит к эмбриональной смертности у крупного рогатого скота голштинской породы на сроках до 100 суток у гомозиготных эмбрионов по мутантному аллелю. Установлено, что причинной мутацией НН2 является делеция тимина в позиции 107172616 на первой хромосоме, которая приводит к сдвигу рамки считывания и преждевременному образованию стоп-кодона, в результате аминокислотная последовательность сокращается с 760 до 383 аминокислот, что в значительной степени изменяет структуру и функцию белка IFT80 ( Ortega MS, Bickhart DM, Lockhart KN, Null DJ, Hutchison JL, McClure JC, Cole JB. Truncation of IFT80 causes early embryonic loss in Holstein cattle associated with Holstein haplotype 2. J Dairy Sci. 2022 Nov;105(11):9001-9011. doi: 10.3168/jds.2022-21853. Epub 2022 Sep 7. PMID: 36085107; Yang Y, Si J, Lv X, Dai D, Liu L, Tang S, Wang Y, Zhang S, Xiao W, Zhang Y. Integrated analysis of whole genome and transcriptome sequencing reveals a frameshift mutation associated with recessive embryonic lethality in Holstein cattle. Anim Genet. 2022 Feb; 53(1):137-141). Аллель голштинского гаплотипа 2 (HH2), который приводит к ежегодным потерям фертильности более чем на 2 миллиона долларов только в США, присутствует у 1,66% домашней популяции голштинской породы [Harmful recessive effects on fertility detected by absence of homozygous haplotypes / P. M. VanRaden, K. M. Olson, D. J. Null, J. L. Hutchison // Journal of Dairy Science, Volume 94, Issue 12, 6153 - 6161, doi: 10.3168/jds.2011-4624] и оказывает значительное негативное влияние на фертильность в виде ранних эмбриональных потерь.

В мировой практике для диагностики гаплотипа HH2 у крупного рогатого скота используется метод полногеномного секвенирования. Для этого применяют кастомные (смоделированные пользователем) биочипы, которые сканируют SNP, однако проведение ДНК-диагностики таким способом требует наличия дорогостоящего оборудования и высокой стоимости биочипов (VanRaden, P.M. & Olson, K.M. & Null, D.J. & Hutchison, Jana. (2011). Harmful recessive effects on fertility detected by absence of homozygous haplotypes. Journal of dairy science. 94. 6153-61. 10.3168/jds.2011-4624; McClure MC, Bickhart D, Null D, Vanraden P, Xu L, Wiggans G, Liu G, Schroeder S, Glasscock J, Armstrong J, Cole JB, Van Tassell CP, Sonstegard TS. Bovine exome sequence analysis and targeted SNP genotyping of recessive fertility defects BH1, HH2, and HH3 reveal a putative causative mutation in SMC2 for HH3. PLoS One. 2014 Mar 25; 9(3):e92769. doi: 10.1371/journal.pone.0092769. PMID: 24667746; PMCID: PMC3965462.).

Недостатком указанных технических решений является то, что в этих работах использовались реагенты и смеси реактивов импортного происхождения, что создает трудности для проведения массового мониторинга наличия или отсутствия указанной генетической мутации у российского племенного скота голштинской породы.

Задачей предлагаемого изобретения является выявление гаплотипа фертильности HH2 у крупного рогатого скота голштинской породы, с использованием ПЦР в реальном времени, обнаружение даже минимального количества генетического материала, что делает его более чувствительным методом, а результаты исследований доступны в течение одного рабочего дня, что значительно быстрее по сравнению с традиционными методами (ПЦР-ПДРФ) и секвенированием; применение разработанного состава (тест-системы) реагентов, доступных в Российской федерации для проведения мониторинга распространения генетической аномалии НН2 у крупного рогатого скота голштинской породы в племенных и товарных стадах..

Технический результат заявляемого изобретения заключается в идентификации специфичной мутации сдвига рамки считывания в гене IFT80 хромосомы 1 КРС и выявления точечной мутации rs523422030 (Т>del), ассоциированной ассоциированного с гаплотипом фертильности 2 (HH2) у крупного рогатого скота голштинской породы, методом ПЦР в режиме реального времени в пробах крови крупного рогатого скота джерсейской породы.

Технический результат достигается с помощью способа выявления гаплотипа фертильности HH2 у крупного рогатого скота голштинской породы, включающего выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием реакционной смеси, состоящей из следующих компонентов:

ДНК исследуемого образца, исходной концентрацией 10 нг/мкл, в количестве 1 мкл;

10х буфер для TaqPol, в количестве 2,5 мкл;

смесь растворов праймеров, включающая прямой праймер HH2-F 5'- AAATCCTACTTGAGAATGCA -3' и обратный праймер HH2-R 5'- GGAAGCGCCCTTCATAAGA -3', где концентрация каждого праймера в его растворе составляет 10 мкМ, в общем количестве 2,5 мкл;

раствор HH2-T - аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда FAM-TAG+ACATTT+TCTTC+TTGTAG-BHQ1 с концентрацией в растворе 10 мкМ, в количестве 1 мкл;

раствор HH2-del - аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда VIC-TAG+ACATTTCTTC+TTGTAG-BHQ1 с концентрацией в растворе 10 мкМ, в количестве 1 мкл;

раствор смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), концентрацией 10 мкМ, в количестве 1 мкл;

полимераза TaqPol, активностью 5 ед/мкл, в количестве 0,5 мкл;

вода для ПЦР до общего объема реакции 25 мкл

затем проводят оценку результатов реакции по наличию и сочетанию сигналов флуоресценции по каналам Green (FAM) и Yellow (VIC) для определения генотипа: отсутствие мутации (генотип Т/Т, дикий тип) устанавливают при наличии сигнала флуоресценции по каналу Green (FAM) и отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Yellow (VIC); наличие гетерозиготной мутации (генотип Т/del) устанавливают при наличии сигналов флуоресценции по обоим каналам – Green (FAM) и Yellow (VIC); наличие гомозиготной мутации (генотип del/del) устанавливают при отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Green (FAM) и наличии сигнала флуоресценции по каналу Yellow (VIC).

На фигуре 1 - Праймеры и зонды для амплификации целевых локусов крупного рогатого скота голштинской породы.

На фигуре 2 - Программа для проведения ПЦР в реальном времени.

На фигуре 3 – Кривые накопления флуоресценции, полученные при исследовании образцов крови КРС на наличие однонуклеотидной делеции в гене IFT80, приводящей к эмбриональной смертности у крупного рогатого скота голштинской породы.

Дизайн праймеров и зондов к подобранным ДНК-мишеням осуществляли с помощью сервиса «Primer BLAST» (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Предварительную оценку специфичности праймеров, ампликонов и зондов осуществляли с помощью on-line программы BLAST. Конструирование набора реагентов для выявления генетических аномалий у КРС методом ПЦР в режиме «реального времени».

Определение молекулярных мишеней и фланкирующих последовательностей ДНК производили путем проведения поиска нуклеотидных последовательностей локусов генов, несущих генетические аномалии. Аналитические работы проводили путем мониторинга в банке аннотированных нуклеотидных последовательностей GenBank Национального Центра Биотехнологической Информации США (GenBank NCBI, США). В результате анализа литературных источников в качестве мишеней для исследования была выбрана точечная мутация для голштинской (HH2) породы в гене IFT80: 1: g.107172616delT, c.1140del, p.(L381Ffs*3). Assembly: ARS-UCD1.3 (GCF_002263795.2).

Разработку дизайна праймеров и зондов для амплификации выбранных ДНК-мишеней проводили с помощью количественной полимеразной цепной реакции. Полученные реагенты использовали для мониторинга наличия или отсутствия генетической аномалии НН2 у крупного рогатого скота голштинской породы.

1. Образцы ДНК. Получение образцов производилось из крови крупного рогатого скота голштинской породы

2. Дизайн праймеров и зондов к подобранным ДНК-мишеням осуществляли с помощью сервиса «Primer BLAST» (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Предварительную оценку специфичности праймеров, ампликонов и зондов осуществляли с помощью on-line программы BLAST.

3. Конструирование набора реагентов для выявления генетических аномалий у КРС методом ПЦР в режиме «реального времени»

3.1 Определение молекулярных мишеней и фланкирующих последовательностей ДНК

Поиск нуклеотидных последовательностей локусов генов, несущих генетические аномалии, проводили в банке аннотированных нуклеотидных последовательностей GenBank Национального Центра Биотехнологической Информации США (GenBank NCBI, США). В результате анализа литературных источников в качестве мишеней для исследования была определена точечная мутация для крупного рогатого скота голштинской (HH2) породы в гене IFT80: 1: g.107172616delT, c.1140del, p.(L381Ffs*3). Assembly: ARS-UCD1.3 (GCF_002263795.2).

3.2. Дизайн праймеров и зондов с флуоресцентными метками.

При разработке нуклклеотидных последовательностей праймеров и зондов учитывали следующие параметры: размер (длину) ампликона, температуру отжига, нуклеотидный состав, распределение нуклеотидов по длине праймеров, длину праймеров и зондов, возможность образования шпилек и димеров. Проверку выбранных последовательностей праймеров и зондов с флуоресцентными метками на специфичность отжига проводили in silico с использованием on-line сервиса NCBI – Primer BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), осуществляющего локальное попарное выравнивание каждого из праймеров с нуклеотидными последовательностями базы данных.

Последовательности праймеров и зондов с флуоресцентными метками к четырем специфическим мишеням для выявления генетических аномалий у КРС джерсейской и голштинской пород представлены фиг. 1.

4. Подбор состава реакционной смеси для проведения ПЦР

Производилось определение возможного состава реакционной смеси, соотношение концентраций праймеры/зонды для мишени, обеспечивающие стабильное нарастание уровня флуоресценции по каналам специфической детекции.

В целях разработки ПЦР тест-системы для детекции выбранной генетической аномалии в геноме КРС предложен следующий порядок приготовления реакционных смесей и учета результатов, требующий дальнейшей экспериментальной апробации и оптимизации.

Для проведения анализа необходимо приготовить рабочий раствор смеси праймеров (F+R) и зондов с концентрацией 10 мкМ. Кроме того, для постановки реакции ПЦР необходимы следующие реагенты: 10мМ смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), ДНК-полимераза Thermus aquaticus (TaqPol), 10х буфер для ДНК-полимеразы (концентрация MgCl2 – 1.5-2 мМ, присутствие ионов NH4+). Реакцию проводят в объеме 25 мкл. Реакционная смесь состоит из следующих компонентов:

10х буфер для TaqPol, в количестве 2,5 мкл;

вода для ПЦР до общего объема реакции 25 мкл.

Учет и анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора на основании отсутствия или наличия сигнала флуоресценции в исследуемых пробах и контрольных образцах по детектируемым каналам. Интерпретацию результатов реакции проводят в соответствии со следующим алгоритмом:

1. Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции только по каналу FAM свидетельствует о наличии гомозиготы Т/Т.

2. Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции только по каналу HEX свидетельствует о наличии гомозиготы del/del.

3. Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции одновременно по двум каналам свидетельствует о наличии гетерозиготы Т/del.

Пример выполнения способа выявления гаплотипа фертильности HH2 у крупного рогатого скота голштинской породы.

В эксперименте в образцах цельной крови КРС определяли наличие мутантного аллеля гена IFT80, ассоциированного с гаплотипом фертильности 2 (HH2) у крупного рогатого скота голштинской породы.

Выделение ДНК проводили методом спиртовой преципитации с использованием набора реагентов «РИБО-преп» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия), согласно инструкции производителя. Объем пробы крови для выделения ДНК – 100 мкл. Образцы крови КРС до проведения экстракции ДНК хранили при температуре -80°C. Образцы ДНК до момента исследования хранили при температуре -20 °C.

Для проведения реакции амплификации готовили реакционную смесь, состав реакционной смеси (на 1 реакцию):

10х буфер для TaqPol, в количестве 2,5 мкл;

вода для ПЦР до общего объема реакции 25 мкл.

Приготовленные смеси раскапывали по 20 мкл на дно амплификационных пробирок и вносили 5 мкл ДНК исследуемого образца. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл.

Для оценки правильности приготовления реакционной смеси осуществляли постановку контрольных реакций амплификации:

а) отрицательного контроля амплификации (К-) – внесили в пробирку или лунку 5 мкл воды 1 типа.

б) положительного контроля амплификации (К+Т) – вносили в пробирку или лунку 5 мкл К+Т (препарата рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей аллель гена IFT80 дикого типа).

в) положительного контроля амплификации (К+del) – вносили в пробирку или лунку 5 мкл К+del (препарата рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей аллель гена IFT80 содержащего искомую мутацию).

ПЦР проводили в амплификаторах c детекцией результатов в режиме реального времени плашечного и роторного типа в соответствии с программой амплификации:

Результаты учитывали на основе анализа накопления флуоресценции в реакционных смесях по каналам FAM и VIC. Результаты интерпретировали на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции S-образной (сигмообразной) формы с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.

Уровень пороговой линии для каналов FAM и VIC устанавливали на уровне 10 - 20 % от максимального уровня флуоресценции положительного контрольного образца в последнем цикле амплификации.

Результаты анализа учитывали, если:

- отсутствовал экспоненциальный рост уровня флуоресценции по двум каналам в пробирке с отрицательным контролем;

- регистрировался экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналу FAM в пробирке с положительным контролем К+Т.

- регистрировался экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналу HEX в пробирке с положительным контролем К+ del.

Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции только по каналу FAM свидетельствовала о наличии гомозиготы Т/Т (дикий тип).

Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции только по каналу HEX свидетельствовала о наличии гомозиготы del / del (мутация).

Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции одновременно по двум каналам свидетельствовала о наличии гетерозиготы Т/ del.

Результаты, полученные при исследовании образцов, представлены в таблице 1.

Таблица 1 Значения Ct исследуемых образцов

Лунка	Проба	Ct (FAM)	Ct (VIC)	Генотип
H01	1	30,93	-	Т/Т (дикий тип)
D07	2	30,27	-	Т/Т (дикий тип)
G06	3	30,01	-	Т/Т (дикий тип) Т/Т (дикий тип)
G07	4	29,96	-	Т/Т (дикий тип)
C07	5	29,88	-	Т/Т (дикий тип)
H12	K-	-	-	ОК
H10	K+	13,43	-	ОК
H11	K+(del)	-	14,80	ОК

Кривые флуоресценции, полученные при исследовании образцов, представлены на фиг. 3.

По сравнению с прототипом заявленное техническое решение имеет следующие преимущества:

- длительность программы амплификации составляет 1,5 часа;

- возможность исследования биологического материала от КРС на наличие специфической мутации без проведения секвенирования.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ выявления

гаплотипа фертильности HH2 у крупного рогатого скота голштинской

породы.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2025-06-10">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Ставропольский государственный аграрный университет»

</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe

obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego obrazovaniia Stavropolskii

gosudarstvennyi agrarnyi universitet</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Олейник Сергей Александрович

</InventorName>

<InventorNameLatin>Oleinik Sergei Aleksandrovich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ выявления гаплотипа

фертильности HH2 у крупного рогатого скота голштинской

породы</InventionTitle>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaatcctacttgagaatgca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggaagcgcccttcataaga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tagacattttcttcttgtag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tagacatttcttcttgtag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

Способ выявления гаплотипа фертильности HH2 у крупного рогатого скота голштинской породы, включающий выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием реакционной смеси, состоящей из следующих компонентов:
ДНК исследуемого образца исходной концентрацией 10 нг/мкл, в количестве 1 мкл;
10х буфер для TaqPol, в количестве 2,5 мкл;
смесь растворов праймеров, включающая прямой праймер HH2-F 5'-(SEQ ID NO:1)-3' и с HH2-R 5'-(SEQ ID NO:2)-3', где концентрация каждого праймера в его растворе составляет 10 мкМ, в общем количестве 2,5 мкл;
раствор HH2-T - аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда FAM-(SEQ ID NO:3)-BHQ1 с концентрацией в растворе 10 мкМ, в количестве 1 мкл;
раствор HH2-del - аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда VIC-(SEQ ID NO:4)-BHQ1 с концентрацией в растворе 10 мкМ, в количестве 1 мкл;
раствор смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) концентрацией 10 мкМ, в количестве 1 мкл;
полимераза TaqPol активностью 5 ед./мкл, в количестве 0,5 мкл;
вода для ПЦР до общего объема реакции 25 мкл,
затем проводят оценку результатов реакции по наличию и сочетанию сигналов флуоресценции по каналам Green FAM и Yellow VIC для определения генотипа: отсутствие мутации (генотип Т/Т, дикий тип) устанавливают при наличии сигнала флуоресценции по каналу Green FAM и отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Yellow VIC; наличие гетерозиготной мутации, генотип Т/del, устанавливают при наличии сигналов флуоресценции по обоим каналам – Green FAM и Yellow VIC; наличие гомозиготной мутации, генотип del/del, устанавливают при отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Green FAM и наличии сигнала флуоресценции по каналу Yellow VIC.