RU2639510C2 - Способ диагностики полиморфизма smc2, ассоциированного с гаплотипом фертильности нн3 крупного рогатого скота - Google Patents
Способ диагностики полиморфизма smc2, ассоциированного с гаплотипом фертильности нн3 крупного рогатого скота Download PDFInfo
- Publication number
- RU2639510C2 RU2639510C2 RU2015149920A RU2015149920A RU2639510C2 RU 2639510 C2 RU2639510 C2 RU 2639510C2 RU 2015149920 A RU2015149920 A RU 2015149920A RU 2015149920 A RU2015149920 A RU 2015149920A RU 2639510 C2 RU2639510 C2 RU 2639510C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- smc2
- fertility
- polymorphism
- haplotype
- cattle
- Prior art date
Links
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 35
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000035558 fertility Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 101150112440 smc2 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 101100095966 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) cut14 gene Proteins 0.000 title 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 101000633445 Homo sapiens Structural maintenance of chromosomes protein 2 Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102100029540 Structural maintenance of chromosomes protein 2 Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims abstract description 3
- 101100369915 Drosophila melanogaster stas gene Proteins 0.000 claims abstract 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 101150094083 24 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 23
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 12
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 11
- 244000309464 bull Species 0.000 description 10
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 6
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 5
- 102000019448 GART Human genes 0.000 description 4
- 102100039708 Glucose-6-phosphate exchanger SLC37A2 Human genes 0.000 description 4
- 108010064209 Phosphoribosylglycinamide formyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 108091006910 SLC37A2 Proteins 0.000 description 4
- 108010089417 Sex Hormone-Binding Globulin Proteins 0.000 description 4
- 102100030758 Sex hormone-binding globulin Human genes 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- 102100029538 Structural maintenance of chromosomes protein 1A Human genes 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 108010004731 structural maintenance of chromosome protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039164 Acetyl-CoA carboxylase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029226 Cancer-related nucleoside-triphosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101000963424 Homo sapiens Acetyl-CoA carboxylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020844 Hyperthermia malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018717 Malignant hyperthermia of anesthesia Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 108010075285 Nucleoside-Triphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000008011 embryonic death Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000023404 leukocyte cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 1
- 201000007004 malignant hyperthermia Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108091052345 ryanodine receptor (TC 1.A.3.1) family Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 208000002254 stillbirth Diseases 0.000 description 1
- 231100000537 stillbirth Toxicity 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии. Описан способ диагностики полиморфизма SMC2, ассоциированного с гаплотипом фертильности НН3 крупного рогатого скота. Способ включает однопробирочную аллелеспецифическую амплификацию (STAS PCR) фрагментов гена SMC2, и отличается тем, что продукты амплификации аллелей Т и С в позиции 95410507 (сборка генома UMD 3.1) в экзоне 24 гена структурного поддержания хромосом SMC2 различаются по длине; идентификация генотипов животных осуществляется по результатам электрофореза продуктов STAS PCR в агарозном геле. Изобретение расширяет арсенал средств, позволяющих диагностировать полиморфизм SMC2. 2 ил, 1 пр.
Description
Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма генов, а именно гена структурного поддержания хромосом 2 (SMC2), ассоциированного с гаплотипом фертильности голштинского скота НН3, и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота.
Наблюдаемый в культурных породах крупного рогатого скота поступательный рост гомозиготности (так, например, средний коэффициент инбридинга у голштинского скота США вырос с 0,4% в 1970 г. до 5,8% в 2012 г. [Trend in Inbreeding Coefficients of Cows for Holstein or Red & White (Calculated August 2015) [Электронный ресурс] // US Department of Agriculture-Animal Improvement Laboratories (USDA-AIPL) URL: https://www.cdcb.us/eval/summary/inbrd.cfm? (дата обращения 30.09.2015)] обусловливает возрастающее негативное влияние на воспроизводительные способности коров так называемых LoF-мутаций (loss-of-function - потеря функций). Исследования на человеке показали, что геном обычного человека несет более 100 LoF-мутаций [MacArthur D.G. et al. A systematic survey of loss-of-function variants in human protein-coding genes // Science. 2012. Is. 335. Pp. 823-828], которые в гомозиготном состоянии могут быть летальными, приводя к эмбриональной гибели. У крупного рогатого скота LoF мутации, обусловливающие наследственные аномалии и вызывающие эмбриональную смертность, проявляются практически во всех молочных породах скота, при этом регулярно регистрируются случаи появления новых дефектов. Так, в голштинской породе идентифицированы LoF мутации, вызывающие такие наследственные заболевания, как дефицит уридинмонофосфатсинтазы, DUMPS, дефицит лейкоцитарной адгезии, BLAD, комплексный порок позвоночника, CVM, брахиспинальный синдром, BY [Зиновьева Н.А. и др. Моногенные наследственные дефекты и их роль в воспроизводстве // Животноводство России. 2015. №6. С. 30-31]. Экономический вес таких дефектов обусловлен, прежде всего, их влиянием на фертильность коров, чем собственно на гибель теленка.
Развитие полногеномных методов анализа способствовало выявлению ряда новых гаплотипов, ассоциированных со снижением воспроизводительной способности коров, получивших название гаплотипов фертильности (НН - голштинские гаплотипы). В настоящее время в голштинской породе выявлено по крайней мере 5 таких гаплотипов (НН1-НН5) [VanRaden P.M. Harmful recessive effects on fertility detected by absence of homozygous haplotypes // J. Dairy Sci. 2011. Is. 94. Pp. 6153-6161; Fritz S. Detection of Haplotypes Associated with Prenatal Death in Dairy Cattle and Identification of Deleterious Mutations in GART, SHBG and SLC37A2 // PLoS ONE. 2013. Vol. 8. Is. 6: e65550; Cooper T.A. Genomic evaluation of Ayrshire dairy cattle and new haplotypes affecting fertility and stillbirth in Holstein, Brown Swiss and Ayrshire breeds // Amer. Dairy Sci. Assoc.-Amer. Soc. Anim. Sci. joint annual meeting, Indianapolis, IN, July 9, 2013. Poster Т206]. Один из них (НН3) ассоциирован с эмбриональной смертностью телят-носителей до 60-го дня стельности. Анализ результатов осеменений коров, отцы которых являются скрытыми носителями НН3, с быками - скрытыми носителями аналогичного гаплотипа, проведенный в североамериканской и французской популяциях голштинов, показал снижение степени стельности, соответственно, на 3,2 и 5,4-5,5% [VanRaden P.M. Harmful recessive effects on fertility detected by absence of homozygous haplotypes // J. Dairy Sci. 2011. Is. 94. Pp. 6153-6161; Fritz S. Detection of Haplotypes Associated with Prenatal Death in Dairy Cattle and Identification of Deleterious Mutations in GART, SHBG and SLC37A2 // PLoS ONE. 2013. Vol. 8. Is. 6: e65550].
Гаплотип НН3 локализован на ВТА8 в области 90-95Mb (сборка генома UMD 3.0) [VanRaden P.M. et al. Harmful recessive effects on fertility detected by absence of homozygous haplotypes // J. Dairy Sci. 2011. Is. 94. Pp. 6153-6161]. В последующем его локализация была уточнена в области 94.0-96 Mb (UMD 3.0) [Fritz S. Detection of Haplotypes Associated with Prenatal Death in Dairy Cattle and Identification of Deleterious Mutations in GART, SHBG and SLC37A2 // PLoS ONE. 2013. Vol. 8. Is. 6: e65550] и установлена ассоциация с мутацией в гене структурного поддержания хромосом 2 (SMC2) [Sahana G. Novel harmful recessive haplotypes identified for fertility traits in Nordic Holstein cattle // PLoS One. 2013. Vol. 8: е82909]. Хайес (Hayes) с соавторами [Hayes В. et al. The 1000 Bull Genomes project - toward genomic selection from whole genome sequence data in dairy and beef cattle // Proc. Plant Anim. Genome XXI Conf., 12-16 January, 2013, San Diego, USA. Poster W150] впервые сообщили, a МакКлур (McClure) с соавторами [McClure M.C. et al. Bovine exome sequence analysis and targeted SNP genotyping of recessive fertility defects BH1, HH2 and HH3 reveal causative mutation inSMC2 for HH3 // PLoS ONE. 2014. Vol. 9: e92769] подтвердили и валидировали мутацию, служащую причиной НН3, как несинонимичную замену Т→С в позиции 95410507 в экзоне 24 гена SMC2 (UMD 3.1). Данный полиморфизм служит причиной аминокислотной замены Phe→Ser в позиции 1135, локализованной внутри домена НТФазы кодируемого белка. Животные, несущие генотип ТТ, являются не носителями НН3, генотип ТС - скрытыми носителями, генотип СС - носителями (плоды погибают до 60-го дня стельности). Детвюлер (Daetwyler) с соавторами [Daetwyler H.D. et al. Whole-genome sequencing of 234 bulls facilitates mapping of monogenic and complex traits in cattle // Nature Genet. 2014. Vol. 46. Pp. 858-865] выполнили секвенирование по Сангеру десяти известных скрытых носителей мутации и подтвердили ожидаемый полиморфизм.
Частота встречаемости скрытых носителей НН3 среди быков-производителей составляет 3,0-4,7% в США, 5,0% - во Франции [Fitz S. et al. Detection of Haplotypes Associated with Prenatal Death in Dairy Cattle and Identification of Deleterious Mutations in GART, SHBG and SLC37A2 // PLoS ONE. 2013. Vol. 8. Is. 6: e65550; McClure M.C. et al. Bovine exome sequence analysis and targeted SNP genotyping of recessive fertility defects BH1, HH2 and HH3 reveal causative mutation inSMC2 for HH3 // PLoS ONE. 2014. Vol. 9: e92769; Daetwyler H.D. et al. Whole-genome sequencing of 234 bulls facilitates mapping of monogenic and complex traits in cattle // Nature Genet. 2014. Vol. 46. Pp. 858-865]. Проведенный анализ родословных быков-производителей (n=560) племенных предприятий в России показал, что у тридцати быков-производителей в поколениях F1-F2 предков встречаются носители мутантного аллеля SMC2. Их частота в различных племпредприятиях варьирует от 2,7 до 8,4% и в среднем составляет 5,4%. Скрытые носители принадлежат двум широко распространенным генеалогическим линиям - Рефлекшн Соверинга и Уэс Идеала.
Анализ научно-технической, патентной и иной информации показал, что единственным применяемым сегодня способом диагностики полиморфизма в SMC2, ассоциированного с НН3, используемым в качестве аналога, является использование кастомных (смоделированных пользователем) биочипов, используемых для полногеномного сканирования SNP. Однако проведение ДНК-диагностики данным способом требует наличия дорогостоящего оборудования и, кроме того, сопряжено с высокой стоимостью биочипов. Если для проведения комплексной ДНК-диагностики (геномная оценка + исследование на наличие нескольких генетических аномалий) такой способ является экономически оправданным, то для массового скрининга популяций необходима разработка простого, относительно дешевого способа, не требующего использования дорогостоящего оборудования.
В качестве прототипа заявленного способа, наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату, можно считать секвенирование фрагмента гена SMC2, в результате которого была выявлена мутация, ассоциированная с гаплотипом фертильности НН3 [McClure D. et al. Bovine exome sequence analysis and targeted SNP genotyping of recessive fertility defects BH1, HH2 and HH3 reveal causative mutation in SMC2 for HH3 // PLoS ONE. 2014. Vol. 9: e92769].
Основной недостаток прототипа заключается в необходимости использования дорогостоящего оборудования и высокой стоимости исследований.
При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения аллеля С гена SMC2, ассоциированного с гаплотипом фертильности НН3, с целью идентификации скрытых носителей НН3 и разработки программ их использования в селекции без снижения репродуктивных способностей коров.
Задача изобретения - создание простого, не требующего использования дорогостоящего оборудования способа идентификации полиморфизма в гене SMC2, ассоциированного с гаплотипом фертильности НН3, для использования в селекции крупного рогатого скота.
Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ диагностики полиморфизма SMC2, ассоциированного с гаплотипом фертильности НН3, для использования в селекции крупного рогатого скота, включающий однопробирочный метод аллелеспецифической полимеразной цепной реакции (STAS PCR) [Zinovieva N.A. et al. Single tube allele specific (STAS) PCR for direct determination of the mutation in the porcine ryanodine receptor gene associated with malignant hyperthermia // Animal Biotechnology. 1996. Vol. 7. Is. 2. Pp. 173-177], позволяющий проводить идентификацию результатов с помощью метода электрофореза в агарозном геле без использования дорогостоящего оборудования, что обеспечит относительно невысокую стоимость разрабатываемого способа.
Принцип действия разрабатываемого способа основан на использовании двух «внутренних» аллелеспецифических праймеров, ориентированных в противоположных направлениях, последний нуклеотид которых на 3'-конце приходится на исследуемую нуклеотидную замену. К каждому из аллелеспецифических праймеров подбираются по одному «наружному» праймеру, таким образом, чтобы длины амлифицированных фрагментов, соответствующих разным аллелям, различались. При этом мутантному аллелю С, ассоциированному с НН3, соответствует фрагмент меньшей длины, в то время как нормальному (не мутантному аллелю) - фрагмент большей длины, что позволяет дифференцировать мутантные и немутантные аллели гена SMC2 методом электрофореза в агарозном геле.
Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов, возможно выявление мутантного аллеля С гена SMC2, что позволит применить данный метод в селекции животных.
Сущность изобретения - определение полиморфизма гена SMC2, ассоциированного с гаплотипом фертильности НН3 крупного рогатого скота, методом STAS PCR.
Разрабатываемый способ базируется на определении нуклеотидной трансверсии Т→С в позиции 95410507 в экзоне 24 гена SMC2 (UMD 3.1). С этой целью выбран участок гена SMC2 крупного рогатого скота с диагностируемой мутацией.
Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по SMC2 (n=60) были использованы образцы ткани (ушной выщип, n=30) и спермы (n=30) коров и быков голштинской и голштинизированной черно-пестрой породы. ДНК выделяли методом экстракции перхлоратом [Зиновьева Н.А. и др. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных // Дубровицы: ВИЖ, 2002, 112 с.], с использованием магнитных частиц (ООО «Изоген», Россия) и колонок Nexttec (Nexttec Biotechnologie GmbH, Германия) в соответствии с рекомендациями производителей. Каждым из вышеназванных методов выделяли ДНК из 10 образцов ткани и 10 образцов спермы. Создание серии референтных генотипов проводили посредством прямого определения последовательности в области мутации методом пиросеквенирования. С этой целью проводили амплификацию фрагмента длиной 199 п.о. с использованием праймеров SMC2_1Pyro и SMC2_2Pyro_Bio (меченые биотином) с последующим отжигом зонда SMC2_Zond и пиросеквенированием. Для него использовали базовую последовательность GTT/CGACACA, где Т/С - мутируемый нуклеотид, G - контрольные нуклеотиды.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения гаплотипа НН3 на основе метода пиросеквенирования (А) и результаты генотипирования референтных образцов (Б и В).
Фиг. 2 - теоретическая модель тест-системы определения гаплотипа НН3 на основе STAS PCR (А) и результаты генотипирования референтных образцов (Б).
На фиг. 1А представлены теоретически смоделированные гистограммы возможных генотипов НН3, где на верхнем рисунке гистограмма соответствует генотипу ТТ, на среднем - ТС и на нижнем - СС. На фиг. 1Б представлена результирующая пикограмма последовательности гена SMC2 в области исследуемой мутации соответствующая генотипу ТТ, на фиг. 1B - результирующая пикограмма последовательности SMC2 в области исследуемой мутации соответствующая генотипу ТС.
В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=60), в том числе 5 образцов с генотипом ТС (скрытый носитель НН3) и 55 образцов с генотипом ТТ (неноситель).
Определение полиморфизма SMC2 предложенным способом выполняли следующим образом.
1. Исходя из локализации мутации были подобраны два «внутренних» аллелеспецифических праймера, ориентированные в противоположных направлениях, последний нуклеотид которых на 3'-конце приходится на исследуемую нуклеотидную замену, при этом прямой праймер SMC1FR является аллелеспецифическим для аллеля Т, в то время как обратный праймер SMC2CR является аллелеспецифическим для аллеля С:
SMC1FR-5'-TTGGTTCTTACCTGAGAATGTGCGA-3'
SMC2CR-5'-TGGACATATGCTACGTACTCACTC-3'.
2. Исходя из последовательности гена каждому из аллелеспецифических праймеров были подобраны по одному «наружному» праймеру (SMC1 и SMC2), таким образом, что длины амлифицированных фрагментов, соответствующих разным аллелям, различались, при этом мутантному аллелю С соответствует фрагмент длиной 112 п.о., ограниченный праймерами SMC2CR и SMC2, в то время как нормальному аллелю Т соответствует фрагмент длиной 155 п.о., ограниченный праймерами SMClFR и SMCl:
SMC1-5'-TTAGTGGCTCTGTCATTAATCCTG-3'
SMC2-5'-ATACTGACCATTACTAAAGAATAG-3'
Продукт амплификации праймеров SMC1 и SMC2 является общим для обоих аллелей и имеет длину 219 п.о. Место исследуемой мутации помечено звездочкой. Фиг. 2А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.
3. Выполняли 35 циклов ПЦР в 15 мкл реакционной смеси следующего состава: 1×ПЦР буфер (16.6 мМ (NH4)2SO4, 67.7 мМ Трис-HCl, рН=8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl2), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1,5 мМ MgCl2, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 95°С - 7 мин, 35 циклов последовательно - 94°С - 0,5 мин, 62°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин.
4. Определение аллелей Т и С гена SMC2 осуществляли методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 2% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1× ТАЕ буфере 20 мин при 100 В и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ), при этом генотипу ТТ (не носителю НН3) соответствуют два фрагмента длиной 219 и 155 п.о., генотипу СТ (скрытому носителю НН3) - три фрагмента длиной 219, 155 и 112 п.о. и генотипу СС (летальный, может быть выявлен только среди плодов на ранних этапах стельности) - два фрагмента длиной 219 и 112 п.о. (Фиг. 2Б). Длины фрагментов сравнивали в сопоставлении с М - маркером длины 100 п.о. (500×2), Биосан, Россия.
5. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.
Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма SMC2 было апробировано на выборке племенного поголовья голштинского и голштинизированного черно-пестрого, в том числе 632 быках-производителях и 363 коровах. Исследование выявило наличие 49 животных с генотипом СТ (скрытые носители НН3), в том числе 35 коров и 14 быков, что соответствует частотам встречаемости соответственно 9,9 и 2,2%. Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся скрытыми носителями мутации С в гене SMC2, ассоциированной с гаплотипом фертильности НН3.
Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в гене SMC2 крупного рогатого скота, ассоциированного с гаплотипом фертильности НН3, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота.
Claims (1)
- Способ диагностики полиморфизма SMC2, ассоциированного с гаплотипом фертильности НН3 крупного рогатого скота, включающий однопробирочную аллелеспецифическую амплификацию (STAS PCR) фрагментов гена SMC2, отличающийся тем, что продукты амплификации аллелей Т и С в позиции 95410507 (сборка генома UMD 3.1) в экзоне 24 гена структурного поддержания хромосом SMC2 различаются по длине, а идентификация генотипов животных осуществляется по результатам электрофореза продуктов STAS PCR в агарозном геле.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015149920A RU2639510C2 (ru) | 2015-11-20 | 2015-11-20 | Способ диагностики полиморфизма smc2, ассоциированного с гаплотипом фертильности нн3 крупного рогатого скота |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015149920A RU2639510C2 (ru) | 2015-11-20 | 2015-11-20 | Способ диагностики полиморфизма smc2, ассоциированного с гаплотипом фертильности нн3 крупного рогатого скота |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015149920A RU2015149920A (ru) | 2017-05-25 |
| RU2639510C2 true RU2639510C2 (ru) | 2017-12-21 |
Family
ID=58877797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015149920A RU2639510C2 (ru) | 2015-11-20 | 2015-11-20 | Способ диагностики полиморфизма smc2, ассоциированного с гаплотипом фертильности нн3 крупного рогатого скота |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2639510C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2847660C1 (ru) * | 2024-11-22 | 2025-10-15 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ выявления гаплотипа фертильности HH2 у крупного рогатого скота голштинской породы |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108456729A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-08-28 | 中国农业大学 | 用于同时检测奶牛8种遗传缺陷基因位点的引物组合、试剂盒及其应用 |
-
2015
- 2015-11-20 RU RU2015149920A patent/RU2639510C2/ru active
Non-Patent Citations (4)
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2847660C1 (ru) * | 2024-11-22 | 2025-10-15 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ выявления гаплотипа фертильности HH2 у крупного рогатого скота голштинской породы |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015149920A (ru) | 2017-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Babik | Methods for MHC genotyping in non‐model vertebrates | |
| Purdie et al. | Candidate gene and genome-wide association studies of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in cattle and sheep: a review | |
| KR102235340B1 (ko) | 토종닭의 성장 형질을 예측하기 위한 snp 마커 세트 및 이의 용도 | |
| CN104812912A (zh) | 乳腺炎抗性的遗传标记 | |
| AU2009275988B2 (en) | A genetic marker test for Brachyspina and fertility in cattle | |
| US20150376705A1 (en) | Method to predict the pattern of locomotion in horses | |
| Singh et al. | Effect of genetic variation in the MHC Class II DRB region on resistance and susceptibility to Johne’s disease in endangered Indian Jamunapari goats | |
| MXPA06009452A (es) | Polimorfismos del promotor de leptin y sus usos. | |
| RU2639510C2 (ru) | Способ диагностики полиморфизма smc2, ассоциированного с гаплотипом фертильности нн3 крупного рогатого скота | |
| US8932810B2 (en) | Identification of mutation and method for detecting lavender foal syndrome in the horse | |
| US20150344959A1 (en) | Compositions and methods for genotyping canines | |
| Yadav et al. | An association study of SNPs with susceptibility to bovine paratuberculosis infection in cattle | |
| Kul et al. | Investigation of severe combined immunodeficiency (SCID) disease of Arabian horses raised at the state stud farms in Turkey | |
| KR102304998B1 (ko) | 우리흑돈의 전신 흑모색 식별용 snp 마커 및 이를 이용한 전신 흑모색 식별 방법 | |
| US10745757B2 (en) | Compositions and methods for determining likelihood of an increased susceptibility to contracting Johne's disease | |
| KR101289576B1 (ko) | 한우 육량 관련 분자마커 개발 | |
| CA2832242C (en) | Detecting the brachyspina mutation | |
| Park et al. | Investigation of Hanwoo-specific structural variations using whole-genome sequencing data | |
| Diaz et al. | Development of an ELA‐DRA gene typing method based on pyrosequencing technology | |
| RU2809553C1 (ru) | Способ определения аллелей гена fgfr3 методом пцр в «реальном времени» | |
| KR20210042614A (ko) | 고양이의 골연골이형성증을 예측 또는 진단하기 위한 단일염기 다형성 마커 조성물 및 이를 이용한 예측 또는 진단 방법 | |
| US20250098650A1 (en) | Selection method for domestic animal breeding | |
| RU2614117C1 (ru) | Способ определения полиморфизма apaf1, ассоциированного с гаплотипом фертильности голштинского скота hh1 | |
| RU2715330C2 (ru) | Способ диагностики полиморфизма гена NHLRC2, обуславливающего генетический дефект дупликации развития крупного рогатого скота абердин-ангусской породы | |
| KR101796160B1 (ko) | 돼지의 산자수 예측용 dact3 유전자의 snp 마커 및 이를 이용한 돼지 다산 개체 선발 방법 |