RU2846092C1

RU2846092C1 - Способ выявления моногенного летального заболевания - спинальная мышечная атрофия - у крупного рогатого скота джерсейской породы

Info

Publication number: RU2846092C1
Application number: RU2024135008A
Authority: RU
Inventors: Сергей Александрович Олейник; Валентин Сергеевич Скрипкин; Артем Васильевич Лесняк; Марина Геннадьевна Кокотка; Дмитрий Анатольевич Ковалев; Сергей Владимирович Писаренко; Ирина Владимировна Кузнецова; Анна Сергеевна Волынкина; Екатерина Игоревна Василенко; Василий Валерьевич Сосунов; Татьяна Вячеславовна Радаева
Filing date: 2024-11-22
Publication date: 2025-08-29

Abstract

Изобретение относится к молекулярной генетике и предназначено для диагностики генетического заболевания, обусловленного однонуклеотидной заменой в гене KDSR (FVT1), локализованном на 24 хромосоме у крупного рогатого скота джерсейской породы. Технический результат заявляемого изобретения заключается в детекции аллельных вариантов 490C/T гена KDSR (FVT1) и выявления точечной мутации 24:g.62138835C>T, ассоциированной с моногенным летальным заболеванием - спинальная мышечная атрофия, методом ПЦР в режиме реального времени в пробах крови крупного рогатого скота джерсейской породы. Технический результат достигается с помощью способа выявления моногенного летального заболевания - спинальная мышечная атрофия у крупного рогатого скота джерсейской породы, включающего выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием реакционной смеси, состоящей из следующих компонентов:

- ДНК исследуемого образца, исходной концентрацией 10 нг/мкл, в количестве 1 мкл;

- 10х буфер для TaqPol, в количестве 2,5 мкл;

- смесь растворов праймеров, включающая прямой праймер SMA-D 5'-GGATGAAGAGTATGCTGTGT-3' и обратный праймер SMA-R 5'-CCACCATGAAGGAACGC-3', где концентрация каждого праймера в его растворе составляет 10 мкМ, в общем количестве 2,5 мкл;

- раствор SMA-Т - аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда FAM-CGGCCTGGGAAG-BHQ1;

- раствор SMA-С - аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда VIC-GGTCTGGGAAGAC-BHQ1;

- раствор смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), концентрацией 10 мкМ, в количестве 1 мкл;

- полимераза TaqPol, активностью 5 ед/мкл, в количестве 0,5 мкл;

- вода для ПЦР до общего объема реакции 25 мкл,

затем проводят оценку результатов реакции по наличию и сочетанию сигналов флуоресценции по каналам Green (FAM) и Yellow (VIC) для определения генотипа: отсутствие мутации (генотип C/C, дикий тип) устанавливают при наличии сигнала флуоресценции по каналу Green (FAM) и отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Yellow (VIC); наличие гетерозиготной мутации (генотип C/T) устанавливают при наличии сигналов флуоресценции по обоим каналам – Green (FAM) и Yellow (VIC); наличие гомозиготной мутации (генотип T/T) устанавливают при отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Green (FAM) и наличии сигнала флуоресценции по каналу Yellow (VIC). 3 ил., 1 табл., 1 пр.

Description

Изобретение относится к молекулярной генетике и предназначено для диагностики генетического заболевания, обусловленного однонуклеотидной заменой в гене KDSR (FVT1), локализованном на 24 хромосоме у крупного рогатого скота джерсейской породы.

Известен метод диагностики генетического заболевания спинальная мышечная атрофия (SMA) – это моногенное летальное аутосомно-рецессивное нейродегенеративное заболевание, обусловленное однонуклеотидной заменой в гене KDSR (FVT1), локализованном на 24 хромосоме. Ген KDSR кодирует фермент кетодигидросфингозинредуктазу, которая катализирует решающую стадию метаболизма гликосфинголипидов (сфингозина, церамида). Однонуклеотидная замена цитозина на тимин в 7 экзоне гена KDSR приводит к миссенс-мутации, замене аминокислоты аланина на треонин в положении 175 аминокислотной последовательности белка. Мутация гена KDSR возникает в первые недели жизни телят (3–6 недель) и вызывает симптомы, сходные с дефицитом витамина Е или селена (беломышечная болезнь). Спинальная мышечная атрофия характеризуется гибелью мотонейронов в спинном мозге, что приводит к прогрессирующей мышечной слабости и впоследствии атрофии (Krebs, S., Medugorac, I., Röther, S., Strässer, K., Förster, M. A missense mutation in the 3-ketodihydrosphingosine reductase FVT1 as candidate causal mutation for bovine spinal muscular atrophy. // Proc Natl Acad Sci USA – 2007 – Т. 104 – С. 6746-6751).

В мировой практике известны несколько методов диагностики генетического заболевания спинальная мышечная атрофия – определение однонуклеотидных полиморфизмов с помощью ПЦР-ПДРФ в агарозном геле и поиск однонуклеотидных полиморфизмов при помощи генотипирования (SNP) (Krebs, S., Medugorac, I., Russ, I. et al. Fine-mapping and candidate gene analysis of bovine spinal muscular atrophy. Mamm Genome 17, 67–76 (2006). https://doi.org/10.1007/s00335-005-0102-3).

Недостатком указанных технических решений является то, что в этих работах использовались реагенты и смеси реактивов импортного происхождения, что создает трудности для проведения массового мониторинга наличия или отсутствия указанной генетической мутации у российского племенного скота джерсейской породы.

Предлагаемый нами метод определения выявления моногенного летального заболевания спинальная мышечная атрофия (SMA) у крупного рогатого скота, с использованием ПЦР в реальном времени, позволяет обнаруживать даже минимальные количества генетического материала, что делает его более чувствительным методом, а результаты исследований доступны в течение одного рабочего дня, что значительно быстрее по сравнению с традиционными методами (ПЦР-ПДРФ) и секвенированием.

Задачей предлагаемого изобретения является применение разработанного состава (тест-системы) реагентов, доступных в Российской федерации для проведения мониторинга распространения генетической мутации гена KDSR у крупного рогатого скота джерсейской породы в племенных и товарных стадах.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в детекции аллельных вариантов 490C/T гена KDSR (FVT1) и выявления точечной мутации 24:g.62138835C>T, ассоциированной с моногенным летальным заболеванием спинальная мышечная атрофия, методом ПЦР в режиме реального времени в пробах крови крупного рогатого скота джерсейской породы».

Технический результат достигается с помощью способа выявления моногенного летального заболевания спинальная мышечная атрофия у крупного рогатого скота джерсейской породы, включающего выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием реакционной смеси, состоящей из следующих компонентов:

- 10х буфер для TaqPol, в количестве 2,5 мкл;

- смесь растворов праймеров, включающая прямой праймер SMA-D 5'-GGATGAAGAGTATGCTGTGT -3' и обратный праймер SMA-R 5'- CCACCATGAAGGAACGC-3', где концентрация каждого праймера в его растворе составляет 10 мкМ, в общем количестве 2,5 мкл;

затем проводят оценку результатов реакции по наличию и сочетанию сигналов флуоресценции по каналам Green (FAM) и Yellow (VIC) для определения генотипа: отсутствие мутации (генотип C/C, дикий тип) устанавливают при наличии сигнала флуоресценции по каналу Green (FAM) и отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Yellow (VIC); наличие гетерозиготной мутации (генотип C/T) устанавливают при наличии сигналов флуоресценции по обоим каналам – Green (FAM) и Yellow (VIC); наличие гомозиготной мутации (генотип T/T) устанавливают при отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Green (FAM) и наличии сигнала флуоресценции по каналу Yellow (VIC).

На фигуре 1 - Праймеры и зонды для амплификации целевых локусов крупного рогатого скота джерсейской породы.

На фигуре 2 – Программа для проведения ПЦР в реальном времени

На фигуре 3 – Кривые накопления флуоресценции, полученные при исследовании образцов крови КРС на наличие однонуклеотидной замены в участке гена KDSR (FVT1), обуславливающей генетическую аномалию спинальная мышечная атрофия (SMA) у крупного рогатого скота джерсейской породы.

Дизайн праймеров и зондов к подобранным ДНК-мишеням осуществляли с помощью сервиса «Primer BLAST» (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Предварительную оценку специфичности праймеров, ампликонов и зондов осуществляли с помощью on-line программы BLAST. Конструирование набора реагентов для выявления генетических аномалий у КРС методом ПЦР в режиме «реального времени».

Определение молекулярных мишеней и фланкирующих последовательностей ДНК производили путем проведения поиска нуклеотидных последовательностей локусов генов, несущих генетические аномалии. Аналитические работы проводили путем мониторинга в банке аннотированных нуклеотидных последовательностей GenBank Национального Центра Биотехнологической Информации США (GenBank NCBI, США). В результате анализа литературных источников в качестве мишеней для исследования была выбрана точечная мутация для джерсейской (SMA) породы в гене KDSR: 24:g.62138835C>T, с.490C>T, p.Ala164Thr

Assembly: ARS-UCD1.3 (GCF_002263795.2) (Krebs, S., Medugorac, I., Rother, S., Strasser, K. & Forster, M. 2007. A missense mutation in the 3- ketodihydrosphingosine reductase FVT1 as candidate causal mutation for bovine spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104, 6746-51).

Разработку дизайна праймеров и зондов для амплификации выбранных ДНК-мишеней проводили с помощью количественной полимеразной цепной реакции. Полученные реагенты использовали для мониторинга наличия или отсутствия мутации в гене KDSR (FVT1) у крупного рогатого скота джерсейской породы.

Разработка дизайна и изготовление праймеров и зондов для амплификации выбранных ДНК-мишеней с помощью количественной полимеразной цепной реакции.

Идентификации генетической мутации в геноме крупного рогатого скота на основе ПЦР в реальном времени.

1. Образцы ДНК. Получение образцов производилось из крови крупного рогатого скота джерсейской породы

2. Дизайн праймеров и зондов к подобранным ДНК-мишеням осуществляли с помощью сервиса «Primer BLAST» (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Предварительную оценку специфичности праймеров, ампликонов и зондов осуществляли с помощью on-line программы BLAST.

3. Конструирование набора реагентов для выявления генетических аномалий у КРС методом ПЦР в режиме «реального времени»

3.1 Определение молекулярных мишеней и фланкирующих последовательностей ДНК. Поиск нуклеотидных последовательностей локусов генов, несущих генетическую аномалию DUMPS, проводили в банке аннотированных нуклеотидных последовательностей GenBank Национального Центра Биотехнологической Информации США (GenBank NCBI, США). В результате анализа литературных источников в качестве мишеней для исследования была определена точечная мутация SMA для крупного рогатого скота джерсейской породы в гене KDSR: 24:g.62138835C>T, с.490C>T, p.Ala164Thr. Assembly: ARS-UCD1.3 (GCF_002263795.2)

3.2. Дизайн праймеров и зондов с флуоресцентными метками.

При разработке нуклеотидных последовательностей праймеров и зондов учитывали следующие параметры: размер (длину) ампликона, температуру отжига, нуклеотидный состав, распределение нуклеотидов по длине праймеров, длину праймеров и зондов, возможность образования шпилек и димеров. Проверку выбранных последовательностей праймеров и зондов с флуоресцентными метками на специфичность отжига проводили in silico с использованием on-line сервиса NCBI – Primer BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), осуществляющего локальное попарное выравнивание каждого из праймеров с нуклеотидными последовательностями базы данных.

Последовательности праймеров и зондов с флуоресцентными метками к четырем специфическим мишеням для выявления генетических аномалий у КРС джерсейской и голштинской пород представлены на фиг. 1.

4. Подбор состава реакционной смеси для проведения ПЦР

Производилось определение возможного состава реакционной смеси, соотношение концентраций праймеры/зонды для мишени, обеспечивающие стабильное нарастание уровня флуоресценции по каналам специфической детекции.

В целях разработки ПЦР тест-системы для детекции выбранной генетической аномалии в геноме КРС предложен следующий порядок приготовления реакционных смесей и учета результатов, требующий дальнейшей экспериментальной апробации и оптимизации.

Для проведения анализа необходимо приготовить рабочий раствор смеси праймеров (F+R) и зондов с концентрацией 10 мкМ. Кроме того, для постановки реакции ПЦР необходимы следующие реагенты: 10мМ смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), ДНК-полимераза Thermus aquaticus (TaqPol), 10х буфер для ДНК-полимеразы (концентрация MgCl₂ – 1.5-2 мМ, присутствие ионов NH₄ ⁺). Реакцию проводят в объеме 25 мкл. Реакционная смесь состоит из следующих компонентов:

- 10х буфер для TaqPol, в количестве 2,5 мкл;

- вода для ПЦР до общего объема реакции 25 мкл.

Учет и анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора на основании отсутствия или наличия сигнала флуоресценции в исследуемых пробах и контрольных образцах по детектируемым каналам. Интерпретацию результатов реакции проводят в соответствии со следующим алгоритмом:

1. Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции только по каналу FAM свидетельствует о наличии гомозиготы С/С.

2. Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции только по каналу HEX свидетельствует о наличии гомозиготы Т/Т.

3. Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции одновременно по двум каналам свидетельствует о наличии гетерозиготы С/Т.

Пример выполнения способа выявления моногенного летального заболевания спинальная мышечная атрофия у крупного рогатого скота джерсейской породы

В эксперименте определяли наличие однонуклеотидной замены в гене KDSR (FVT1) в образцах цельной крови КРС джерсейской породы.

Выделение ДНК проводили методом спиртовой преципитации с использованием набора реагентов «РИБО-преп» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия), согласно инструкции производителя. Объем пробы крови для выделения ДНК – 100 мкл. Образцы крови КРС до проведения экстракции ДНК хранили при температуре -80°C. Образцы ДНК до момента исследования хранили при температуре -20 °C.

Для проведения реакции амплификации готовили реакционную смесь, состав реакционной смеси (на 1 реакцию):

- 10х буфер для TaqPol, в количестве 2,5 мкл;

Приготовленные смеси раскапывали по 20 мкл на дно амплификационных пробирок и вносили 5 мкл ДНК исследуемого образца. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл.

Для оценки правильности приготовления реакционной смеси осуществляли постановку контрольных реакций амплификации:

а) отрицательного контроля амплификации (К-) – вносили в пробирку или лунку 5 мкл воды 1 типа.

б) положительного контроля амплификации (К+С) – вносили в пробирку или лунку 5 мкл К+C (препарата рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей аллель гена KDSR дикого типа).

в) положительного контроля амплификации (К+T) – вносили в пробирку или лунку 5 мкл К+T (препарата рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей аллель гена KDSR содержащего искомую мутацию).

ПЦР проводили в амплификаторах c детекцией результатов в режиме реального времени плашечного и роторного типа в соответствии с программой амплификации:

Результаты учитывали на основе анализа накопления флуоресценции в реакционных смесях по каналам FAM и VIC. Результаты интерпретировали на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции S-образной (сигмообразной) формы с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.

Уровень пороговой линии для каналов FAM и VIC устанавливали на уровне 10 - 20 % от максимального уровня флуоресценции положительного контрольного образца в последнем цикле амплификации.

Результаты анализа учитывали, если:

- отсутствовал экспоненциальный рост уровня флуоресценции по двум каналам в пробирке с отрицательным контролем;

- регистрировался экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналу FAM в пробирке с положительным контролем К+C.

- регистрировался экспоненциальный рост уровня флуоресценции по каналу HEX в пробирке с положительным контролем К+T.

Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции только по каналу FAM свидетельствовала о наличии гомозиготы C/C (дикий тип).

Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции только по каналу HEX свидетельствовала о наличии гомозиготы T/T (мутация).

Регистрация экспоненциального роста уровня флуоресценции одновременно по двум каналам свидетельствовала о наличии гетерозиготы C/T.

Результаты, полученные при исследовании образцов, представлены в таблице 1.

Таблица 1 Значения Ct исследуемых образцов

Лунка	Проба	Ct (FAM)	Ct (VIC)	Генотип
H01	1	31,54	-	C/C (дикий тип)
D07	2	29,67	-	C/C (дикий тип)
G06	3	29,04	-	C/C (дикий тип)
G07	4	29,85	-	C/C (дикий тип)
C07	5	30,41	-	C/C (дикий тип)
H12	K-	-	-	ОК
H10	K+C	15,63	-	ОК
H11	K+T	-	15,90	ОК

Кривые накопления флуоресценции, полученные при исследовании образцов крови КРС на наличие однонуклеотидной замены в участке гена KDSR (FVT1), обуславливающей генетическую аномалию спинальная мышечная атрофия (SMA) у крупного рогатого скота джерсейской породы представлены на фиг. 3.

По сравнению с прототипом заявленное техническое решение имеет следующие преимущества:

- длительность программы амплификации составляет 1,5 часа;

- возможность исследования биологического материала от КРС на наличие специфической мутации без проведения секвенирования.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Способ выявления

моногенного летального заболевания спинальная мышечная атрофия у

крупного рогатого скота джерсейской породы.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2025-06-09">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Ставропольский государственный аграрный университет»

</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe

obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego obrazovaniia Stavropolskii

gosudarstvennyi agrarnyi universitet</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Олейник Сергей Александрович

(Oleinik Sergei Aleksandrovich)</InventorName>

<InventorNameLatin>Oleinik Sergei Aleksandrovich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ выявления моногенного

летального заболевания спинальная мышечная атрофия у крупного

рогатого скота джерсейской породы</InventionTitle>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggatgaagagtatgctgtgt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccaccatgaaggaacgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>12</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..12</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>CGGCCTGGGAAG</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>13</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..13</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>unidentified</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>GGTCTGGGAAGAC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

Способ выявления моногенного летального заболевания - спинальная мышечная атрофия - у крупного рогатого скота джерсейской породы, включающий выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием реакционной смеси, состоящей из следующих компонентов:
ДНК исследуемого образца, исходной концентрацией 10 нг/мкл, в количестве 1 мкл;
10х буфер для TaqPol, в количестве 2,5 мкл;
смесь растворов праймеров, включающая прямой праймер SMA-D 5'-(SEQ ID NO:1)-3' и обратный праймер SMA-R 5'- -(SEQ ID NO:2)-3', где концентрация каждого праймера в его растворе составляет 10 мкМ, в общем количестве 2,5 мкл;
раствор SMA-Т - аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда FAM--(SEQ ID NO:3)-BHQ1 с концентрацией в растворе 10 мкМ, в количестве 1 мкл;
раствор SMA-С - аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда VIC--(SEQ ID NO:4)-BHQ1 с концентрацией в растворе 10 мкМ, в количестве 1 мкл;
раствор смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ), концентрацией 10 мкМ, в количестве 1 мкл;
полимераза TaqPol, активностью 5 ед/мкл, в количестве 0,5 мкл;
вода для ПЦР до общего объема реакции 25 мкл,
затем проводят оценку результатов реакции по наличию и сочетанию сигналов флуоресценции по каналам Green FAM и Yellow VIC для определения генотипа: отсутствие мутации устанавливают при наличии сигнала флуоресценции по каналу Green FAM и отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Yellow VIC; наличие гетерозиготной мутации (генотип C/T) устанавливают при наличии сигналов флуоресценции по обоим каналам – Green FAM и Yellow VI; наличие гомозиготной мутации (генотип T/T устанавливают при отсутствии сигнала флуоресценции по каналу Green FAM и наличии сигнала флуоресценции по каналу Yellow VIC.