RU2843305C1 - Иммуноферментная тест-система для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма "SAT-2/XIV/2023" вируса ящура - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Описана иммуноферментная тест-система для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, содержащая иммуноспецифические реагенты и неспецифические реагенты. Технический результат заключается в разработке чувствительной и специфичной иммуноферментной тест-системы на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, предназначенной для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины. 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, созданию иммуноферментной тест-системы для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

Ящур – острая высоко контагиозная везикулярная болезнь домашних и диких парнокопытных жвачных животных, которая вызывается РНК-содержащим афтовирусом семейства Picornaviridae и сопровождается лихорадкой, развитием афтозных поражений слизистой и эпителиальной тканей животных и другими симптомами инфекции. Классифицировано 7 следующих серотипов ящура: A, O, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3 и Asia 1. Ящур влечёт за собой значительные экономические потери, связанные с негативным влиянием на производство животноводческой продукции, и является препятствием для региональной и международной торговли животными и продуктами животного происхождения. По оценкам WOAH (Всемирная организация здравоохранения животных, основана как OIE), болезнь циркулирует у 77% мирового поголовья домашнего скота в Африке, на Ближнем Востоке и в Азии, а также на ограниченной территории Южной Америки [1, 2]. В связи с чем существует риск заноса инфекции в страны, свободные от ящура без вакцинации.

Борьба с ящуром заключается в проведении своевременных профилактических мероприятий, таких как эффективный эпидемиологический контроль за болезнью; вакцинирование против ящура домашних и сельскохозяйственных животных; надзор за передвижением диких парнокопытных животных в приграничных районах, подверженных риску проникновения возбудителя из стран, неблагополучных по ящуру; мониторинговые исследования по оценке иммунного статуса сельскохозяйственного и домашнего скота, включая ретроспективную диагностику ящура. Поскольку вирус разных серотипов практически не вызывает перекрестного иммунитета и при использовании вакцин на основе штаммов возбудителя, отличных от полевых, даже в рамках одного серотипа защита может быть слабой, при разработке вакцинных препаратов необходим тщательный подбор штаммов для обеспечения максимально возможной защиты поголовья от ящура в конкретном регионе [1, 2, 3].

На территории Африканского континента периодически регистрируются вспышки ящура серотипа SAT 2. Представители вируса ящура серотипа SAT 2 характеризуются высокой генетической изменчивостью и разделяются на 14 топотипов (I - XIV). Такое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении ящура серотипа SAT 2 [1, 2].

В настоящее время эпизоотическая ситуация на Африканском континенте преимущественно связана с представителями возбудителя данного заболевания серотипа SAT 2 топотипа VII (генотип SAT2/VII), однако в 2022 году началось быстрое распространение вируса ящура серотипа SAT 2 топотипа XIV (генотип SAT2/XIV), в результате чего он вышел за пределы эндемичных территорий. Вспышки ящура генотипа SAT2/XIV зарегистрированы в 2023 году в некоторых странах Евразийского континента, в том числе, в Ираке, Иордании, Турции (Фиг. 1).

Вирус ящура серотипа SAT 2, циркулировавший в Ираке в 2023 году, относится к XIV топотипу, тесно связанному с изолятами вируса, выделенными в Эфиопии в 2022 году (SAT2/ETH/3/22 и SAT2/ETH/2/22). Оба вируса были выделены от инфицированного крупного рогатого скота в марте 2022 года. Согласно сообщениям, вирус, циркулирующий в настоящее время в Иордании, также тесно связан с указанным иракским вирусом. Распространение экзотического вируса ящура на крупные восприимчивые популяции крупного рогатого скота и буйволов в Ираке угрожает многочисленным популяциям животных в Иране, Турции и других странах Ближнего Востока и вызывает серьёзную обеспокоенность [4].

Тесное сотрудничество со странами СНГ и Ближнего Востока, торгово-экономические связи Российской Федерации со странами африканского континента, где не проводится профилактическая вакцинация поголовья скота против ящура серотипа SAT 2, вследствие этого возникает серьёзный риск заноса вируса ящура данного серотипа на территорию Российской Федерации. В связи с чем большую актуальность приобретают производство вакцин против ящура серотипа SAT 2, в том числе, генотипа SAT2/XIV, разработка и внедрение диагностических тест-систем для оценки эффективности вакцинации и напряжённости иммунитета против ящура генотипа SAT2/XIV у сельскохозяйственных и домашних парнокопытных животных, а также для обнаружения постинфекционных противоящурных антител в сыворотке крови не вакцинированных животных.

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработано и успешно прошла испытания противоящурная моно- и поливалентная вакцина на основе антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура [5]. Данный штамм был депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2023 году под регистрационным номером: №489 – деп/23-39 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Также получен патент на штамм «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура [6].

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура был получен путём адаптации к репродукции в первично-трипсинизированной монослойной клеточной линии почки свиньи СП, в перевиваемых культурах клеток BНK-21/SUSP/ARRIAH, IB-RS-2, ПСГК-30, а также в организме крупного рогатого скота и свиней изолята вируса ящура, выделенного в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, отобранного от крупного рогатого скота на территории Иорданского Хашимитского Королевства в августе 2023 года. Штамм был предложен для изготовления вакцинных препаратов и средств диагностики.

Эффективность вакцины, иммунный фон и напряженность противоящурного иммунитета у восприимчивых животных оценивается по уровню специфических вируснейтрализующих (защитных) антител в сыворотке крови животных после вакцинирования или инфицирования. Вирион ящура является безоболочечным и представляет собой капсид, окружающий РНК-геном. Капсид, имеющий структуру икосаэдра с коэффициентом седиментации 146S, сформирован из 60 копий протомерной субъединицы, состоящей из четырех структурных белков VP₁–VP₄. Поверхностные белки VP₁–VP₃ несут эпитопы, отвечающие за серотипоспецифичность вируса ящура и выработку вируснейтрализующих антител, в то время как внутренний белок VP₄ более консервативен у разных серотипов возбудителя и антитела против эпитопов VP₄ не обеспечивают защиту от инфекции [7, 8].

В лабораторной диагностике используют два основных метода исследования образцов сыворотки крови на наличие антител к структурным белкам вируса ящура: реакцию нейтрализации вируса (РН) и иммуноферментный анализ (ИФА) [9, 10].

Реакция нейтрализации вируса ящура считается по праву золотым стандартом, поскольку позволяет выявлять непосредственно вируснейтрализующие антитела в сыворотке крови вакцинированных или переболевших животных, тем самым определяя уровень защиты против ящура определенного серотипа. Однако существует ряд факторов, ограничивающих или затрудняющих использование реакции в условиях лабораторий. К ним относятся необходимость работы с живым вирусом ящура, требующей наличия уровня биобезопасности лаборатории не ниже III, длительность по времени (не менее 72 ч), необходимость использования СО₂ для улучшения ростовых свойств культуры клеток, зависимость результатов реакции от состояния клеточной культуры и дозы вируса, и т.д.

Иммуноферментный анализ, основанный на использовании в реакции инактивированного цельновирусного или рекомбинантного антигена, охватывает весь спектр вирусоспецифических антител, в первую очередь вируснейтрализующих, что обусловлено строением вириона ящура. Метод менее длительный по времени, чем РН, и более простой в постановке. Всё это позволяет использовать ИФА для диагностики ящура в лабораторной практике наряду с РН как альтернативный или подтверждающий метод.

Предлагаемая иммуноферментная тест-система для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT2/XIV основана на реакции жидкофазного блокирующего варианта ИФА.

Данный вариант ИФА впервые был предложен сотрудниками Пирбрайтского института, Великобритания, носящего звание Всемирной справочной лаборатории, Hamblin, et al., 1986, и рекомендован WOAH, как один из основных методов ретроспективной диагностики ящура: для оценки напряженности иммунитета, для контроля иммуногенности противоящурных вакцин, для мониторинговых исследований на ящур [10, 11, 12, 13]. Данный вариант ИФА был адаптирован и оптимизирован под условия ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Жидкофазный блокирующий вариант для определения антител к структурным белкам вируса ящура является разновидностью конкурентного варианта ИФА и отличается наличием предварительного этапа взаимодействия антигена вируса ящура с исследуемой сывороткой («жидкая фаза»), в процессе которого происходит блокирование иммунодоминантных эпитопов в аминокислотной последовательности антигена вируса ящура специфическими иммуноглобулинами. Остальные этапы реакции, в целом, аналогичны другим вариантам ИФА. Конкурирующими антителами выступают гомологичные штаммоспецифические поликлональные антитела в сыворотке крови морской свинки (детекторные антитела), связывающиеся со свободными антигенными детерминантами.

Неоспоримым достоинством данного варианта ИФА является тот факт, что образование комплекса «антиген-антитело» происходит в жидкой фазе, т.е. в условиях максимально приближенных к естественным. При этом не возникает деформации вириона и не изменяются антигенные сайты, что роднит его с реакцией вирусной нейтрализации в культуре клеток или куриных эмбрионах.

По завершении этапа «жидкой фазы» дальнейшая реакция проходит на твёрдом носителе («твёрдая фаза»): смесь исследуемого образца сыворотки и антигена переносится в лунки 96-луночного планшета, предварительно сенсибилизированного специфическими улавливающими антителами (сыворотка крови кролика). Свободный не связавшийся антиген взаимодействует со специфическими улавливающими антителами и детекторными антителами (сыворотка крови морской свинки) с образованием нового иммунного комплекса, который выявляется вторичными антителами к иммуноглобулину G морской свинки, конъюгированными с ферментом пероксидаза хрена. Данная процедура необходима для визуализации реакции в процессе окрашивания содержимого лунок планшета хромогенным субстратом. При этом, чем меньше содержит образец специфических антител, тем интенсивнее окраска.

На сегодняшний день с помощью жидкофазного блокирующего ИФА с особенностями проведения реакции и определенным составом компонентов реакции разработаны «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII» в сыворотках крови животных после иммунизации», «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма «О №2047/Саудовская Аравия/2008» генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации» и «Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму «О №2311/Забайкальский/2016» генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА» [14-16].

В настоящее время достоверно известно лишь об одном представленном на мировом рынке наборе для ретроспективной диагностики ящура тест-системе, позволяющим обнаруживать антитела к структурным белкам вируса ящура серотипа SAT 2 в ИФА. Это набор Solid-phase competitive ELISA (SPCE) for antibodies specific to FMDV serotype SAT 2 (прототип) разработан совместно Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna Brescia (IZSLER), Italy, и The Pirbright Institute, Pirbright, UK, производится IZSLER. Впервые информация о данной тест-системе появилась в 2014 году в материалах Открытой сессии европейской комиссии по контролю над ящуром (Open session of the standing Technical and Research Committees of the EuFMD. Cavtat (Croatia), 29-31 October 2014) [17]. В основу набора для обнаружения противовирусных антител в образцах сыворотки или плазмы крови инфицированных или вакцинированных против ящура восприимчивых животных положен твёрдофазный конкурентный вариант ИФА с использованием вируснейтрализующих моноклональных антител, специфичных к серотипу SAT 2 (прототип).

Набор включает:

- микропланшеты для ИФА, предварительно сенсибилизированные инактивированным вирусом ящура серотипа SAT 2, захваченным гомологичными моноклональными антителами (MAb) – 5 планшетов;

- конъюгат MAb, полученных против вируса ящура серотипа SAT-2, с пероксидазой хрена, 10х (2,5 мл) - 1 флакон;

- положительная контрольная сыворотка к вирусу ящура серотипа SAT-2 (300 мкл) – 1 флакон;

- отрицательный контроль (2 мл) – 1 флакон;

- фосфатно-буферный промывочный раствор с добавлением детергента TWEEN, 10х-концентрат (250 мл) – 1 флакон;

- ELISA-буфер для разведения сыворотки и конъюгата (120 мл), готовый к использованию – 1 флакон;

- раствор субстрата/хромогена ТМВ (30 мл), готовый к использованию – 1 флакон;

- стоп-раствор 0,6N H2SO4 (30 мл), готовый к использованию – 1 флакон.

При проведении скрининг-теста образец исследуемой сыворотки крови разводится 1:10 ELISA-буфером в лунках микропланшета для ИФА, где происходит взаимодействие специфических иммуноглобулинов с антигеном вируса ящура при их наличии в образце сыворотки крови. При добавлении на последующем этапе в лунки планшета конъюгата MAb-HRP его реакция с гомологичным антигеном будет ингибироваться антителами положительных сывороток, связавшихся ранее с вирусом, в случае отрицательных сывороток конъюгированные MAb беспрепятственно связываются со свободными антигенными детерминантами. Колориметрическая реакция после внесения субстрата/хромогена ТМВ на этапе визуализации результатов теста развивается, если исследуемая сыворотка отрицательная и MAb образовали с вирусом ящура иммунный комплекс.

Результаты анализа учитывают при длине волны 450 нм, регистрируя значения ОП в каждой лунке планшета с помощью спектрофотометра (ридера) для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения ОП контрольных и исследуемых проб переводят в значение процента ингибиции (PI) по формуле:

PI = 100 – (ОП_{сыворотки} / ОП_{контроля}*) × 100%;

где, *ОП контроля - среднее значение оптической плотности для 4 лунок с отрицательным контролем.

Тест должен соответствовать следующим критериям валидации:

- значения ОП в лунках с отрицательным контролем должны быть ≥1,0;

- положительный контроль демонстрирует ≥80% ингибиции в разведении 1:10 и >50% ингибиции во втором разведении 1:30.

Назвать набор SPCE for antibodies specific to FMDV serotype SAT 2 производства IZSLER (SAT2-IZSLER) прототипом предлагаемой тест-системы для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура можно весьма условно, тест-системы сильно отличаются друг от друга. Хотя обе тест-системы предназначены для выявления антител к структурным белкам вируса ящура серотипа SAT 2 в ИФА, предлагаемое изобретение представляет собой штаммоспецифическую поликлональную тест-систему на основе жидкофазного блокирующего варианта ИФА, набор IZSLER является серотипоспецифической моноклональной конкурентной тест-системой.

Использование моноклональных антител в диагностических иммуноферментных тест-системах для серотипирования специфических антител к вирусу ящура призвано создать универсальность анализа внутри конкретного серотипа ящура – возможность обнаружения в исследуемых образцах сыворотки или плазмы крови антител, выработанных к разным штаммам вируса ящура одного серотипа, с одинаковой чувствительностью, то есть тест-система должна обладать широкой серотипоспецифичностью.

Однако в случае с тест-системой SAT2-IZSLER наблюдалась выраженная генотипоспецифичность. При исследовании в тест-системе SAT2-IZSLER образцов моноспецифической сыворотки крови крупного рогатого скота или свиней к вирусу ящура штаммов «SAT2/ERI/1998» (генотип SAT2/VII), «SAT2/LIB/39/2012» (генотип SAT2/VII), «SAT-2/XIV/2023» (генотип SAT2/XIV) вируса ящура наибольшее количество положительных результатов было получено для образцов сыворотки к генотипу SAT2/VII, в то время как антитела к генотипу SAT2/XIV выявлялись с меньшей эффективностью, чем в представленном изобретении. Это свидетельствует о том, что использование набора SAT2-IZSLER для изучения антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины, включающей антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, не позволяет дать объективную и достоверную оценку эффективности вакцины методом иммуноферментного анализа. Исходя из этого, требуется разработать чувствительную, специфичную иммуноферментную тест-систему для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура. Таким образом, иммуноферментная тест-система для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, имеющая 100%-ю степень гомологии с вакцинным штаммом «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, обладающая высокими диагностическими показателями, является незаменимым, безальтернативным на данный момент инструментом оценки качества вакцины в ИФА.

Учитывая указанные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе наиболее близкого прототипа, для точного определения антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин, содержащих вирус ящура генотипа SAT2/XIV, актуальной является разработка иммуноферментной тест-системы для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

В настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА, которая позволила бы с высокой достоверностью проводить оценку антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

Целью изобретения является создание иммуноферментной тест-системы для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

Уникальность предлагаемой тест-системы для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT2/XIV состоит в использовании при получении специфических компонентов реакции: антигена вируса ящура, улавливающих и детекторных антител, положительной и слабоположительной контрольных сывороток, штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура. Данная тест-система обладает 100%-й степенью гомологии с вакцинными продуктами, включающими инактивированный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, что позволяет максимально достоверно и эффективно оценить антигенные и иммуногенные свойства противоящурной вакцины после её введения животным. Уровень поствакцинального иммунитета определяется по количеству специфических антител в сыворотке крови иммунизированного скота, выраженному через процент ингибиции (PI) в соответствии с формулой

,

где ОП_пробы – среднее значение оптической плотности смеси исследуемого или контрольного образца с антигеном вируса ящура;

ОП _КА - среднее значение оптической плотности контроля антигена;

ОП _КК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.

Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемой тест-системе используются два расчётных и три стандартных внутренних контроля: контроль антигена (КА); контроль конъюгата (КК); положительная и слабоположительная сыворотки крови, содержащие специфические антитела к антигену штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура; отрицательная сыворотка крови, не имеющая специфических антител, что позволяет более точно интерпретировать результаты реакции.

Предлагаемая тест-система предназначена, в основном, для скрининговых массовых исследований точечным методом разведения образцов, но возможно исследование сывороток и методом последовательных разведений с определением конечной точки титрования или титра сыворотки. Данная иммуноферментная тест-система для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение) также предназначена для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин; мониторингового обследования вакцинированного поголовья на напряжённость иммунитета к ящуру; пост- и предпродажной сертификации сельскохозяйственных животных для целей международной и внутригосударственной торговли; обследования не вакцинированного против ящура поголовья с целью подтверждения или получения регионами статуса зоны, свободной от ящура без вакцинации; ретроспективной диагностики ящура, в том числе, в комплексе с исследованиями на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура выявление переболевших животных либо животных-носителей вируса.

Иммуноферментная тест-система для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура представляет собой специфические и неспецифические компоненты для проведения реакции непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА.

Иммуноспецифические компоненты:

К1 – Сенсибилизирующие антитела, IgG кролика против интактного антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, лиофилизированные, объём 0,5 см³ – 1 флакон;

К2 - Антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, высокоочищенный и концентрированный, лиофилизированный, объём 0,5 см³ - 1 флакон;

К3 - Детекторные антитела, IgG морской свинки против интактного антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, лиофилизированные, объём 0,5 см³ – 1 флакон;

К4 - Контроль 1, положительная сыворотка крови против антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, лиофилизированная, объём 0,2 см³ – 1 флакон;

К5 - Контроль 2, положительная сыворотка крови против антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, лиофилизированная, объём 0,2 см³ – 1 флакон;

К6 - Контроль 3, нормальная сыворотка крови, не содержащая антител к вирусу ящура, лиофилизированная, объём 0,2 см³ – 1 флакон;

К7 – Конъюгат, иммунопероксидазный конъюгат вторичных антител против IgG морской свинки, лиофилизированный или нативный, объём 0,1 см³ – 1 флакон;

К8 – Блокирующая сыворотка не иммунная, лиофилизированная, объём 4,0 см³ – 1 флакон.

Неспецифические компоненты:

К9 – Соли для карбонатно-бикарбонатного буферного раствора, порошок в капсуле или таблетке, масса 0,215-0,43г – 1 флакон;

К10 – Буферный раствор 20х, жидкость, объём 100,0 см³ - 1 флакон;

К11 – Хромогенный субстрат АБТС, жидкость, объём 25,0 см³ - 1 флакон;

К12 - Стоп-раствор, 1% додецилсульфат натрия, жидкость, объём 25,0 см³ - 1 флакон.

Также в состав тест-системы входят:

- полистироловый 96-луночный планшет для иммуноферментного анализа, цельный или стрипованный – 3 шт.;

- полимерный планшет – 3 шт.;

- инструкция по применению – 1 экз.

Технический результат от изобретения заключается в разработке чувствительной и специфичной иммуноферментной тест-системы на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, предназначенной для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины. Кроме того, лиофильно высушенные иммуноспецифические компоненты стабильны и сохраняют свою активность на протяжении не менее 3 лет (период наблюдения), что является преимуществом в использовании данной тест-системы.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 – Эпизоотическая ситуация в мире по ящуру (тип SAT 2).

Фиг. 2 – Аминокислотные последовательности полипептида VP₁ вируса ящура серотипа SAT 2 топотипов XIV и VII из базы данных NCBI или ФГБУ «ВНИИЗЖ» (до 216 а.о.). Примечание: красным цветом выделена зона GH-loop.

Фиг. 3 – Расположение штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура на филогенетическом дереве вируса ящура серотипа SAT 2. Дендрограмма основана на сравнении нуклеотидных последовательностей гена VP₁. Примечание: топотипы I-XIV выделены квадратными скобками.

Фиг. 4 - Выделение 146S-антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» в ходе фракционирования преципитата антигена при ультрацентрифугировании в градиенте плотности сахарозы: А – седиментационный профиль антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура при длине волны 260 нм; Б – электрофореграмма фракций градиента плотности сахарозы, включающих структурные белки VP ₁ , VP ₂ , VP ₃ вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023».

Фиг. 5 - Электрофорез в 12%-м полиакриламидном геле антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023»: преципитат антигена до фракционирования ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы; 146S-антиген.

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена, кодирующего белок VP₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT2/XIV вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VР₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура.

Основным материалом для исследования служат индивидуальные пробы сыворотки крови животных без признаков гемолиза и бактериальной контаминации, проявляющейся помутнением образца или образованием осадка. Допускается хранение сыворотки крови животных до исследования в ИФА при температуре (5±3)°С в течение 24-48 часов после отбора; для более длительного хранения образцы замораживают при температуре минус (18±2)°С. Перед исследованием образцы сыворотки крови оттаивают. Не рекомендуется многократное замораживание и оттаивание образцов.

Перед началом работы лиофилизированные компоненты К1-К8 восстанавливают до объёма, указанного на этикетке, для чего к содержимому флаконов добавляют необходимое количество дистиллированной воды. Конъюгат в нативном виде готов к использованию.

Готовят рабочие растворы:

- Раствор №1. Карбонатно-бикарбонатный буферный раствор для сенсибилизации планшетов. В соответствии с информацией, указанной на этикетке, содержимое капсулы или таблетку (К9) растворяют в 100 (50) см³ дистиллированной воды и тщательно перемешивают.

- Раствор №2. Раствор используется для межэтапной промывки планшетов и подготовки образцов для исследования, а также, как основа при приготовлении рабочего буферного раствора для разведения детекторных антител и конъюгата. Для чего содержимое флакона с концентратом (20х) буферного раствора (К10) переливают в мерную посуду, добавляют дистиллированную воду до 2000 см³ и перемешивают, либо делают необходимое количество раствора №2 в соответствующих пропорциях.

- Раствор №3. Рабочий буферный раствор для разведения детекторных антител и конъюгата готовится из раствора №2 с добавлением 10% блокирующей сыворотки. Для чего к 36 см³ раствора №2 следует добавить 4,0 см³ блокирующей сыворотки, восстановленной из лиофилизированного препарата К8 путем добавления к содержимому флакона с сывороткой 4,0 см³ дистиллированной воды. Готовится непосредственно перед использованием.

Хромогенный субстрат АБТС, К11, готов к использованию.

Стоп-раствор. Раствор, останавливающий реакцию окрашивания (К12), готов к использованию. При температуре (5±3)°С возможно выпадение осадка, который растворяется при нагревании до температуры (22±3)°С и последующем встряхивании содержимого флакона, что не влияет на качество реагента.

Реакцию непрямого жидкофазного блокирующего варианта иммуноферментного анализа для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура выполняют поэтапно в следующей последовательности:

- Сенсибилизация планшетов. Раствор сенсибилизирующих антител готовят в разведении, указанном на флаконе К1, в растворе №1 (карбонатно-бикарбонатный буферный раствор). Во все лунки полистиролового 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа вносят по 0,1 см³ (100 мкл) раствора сенсибилизирующих антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение (18±2) ч при температуре (5±3)°С.

- Промывание лунок планшета. Промывание производят с использованием автоматических устройств либо вручную. При этом содержимое лунок планшета удаляют, затем заполняют лунки раствором №2 и сбрасывают интенсивным встряхиванием. Процедуру повторяют два раза.

- Реакция в жидкой фазе. Проводят реакцию антигена с испытуемыми и контрольными образцами сыворотки крови. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно рекомендуемой схеме. В качестве контроля 1 используют положительную сыворотку крови (К4), контроля 2 - положительную сыворотку крови (К5), контроля 3 – нормальную сыворотку крови (К6). Вначале готовят разведения проб 1:16 в растворе №2. Для чего во все лунки круглодонного полимерного планшета за исключением лунок А1, В1, С1, D1, которые оставляют для контроля конъюгата (КК) и контроля антигена (КА), вносят по 0,047см³ (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см³ (3 мкл) пробы. В лунки А1, В1, С1, D1 вносят по 0,05 см³ (50 мкл) буферного раствора. Затем во все лунки планшета добавляют по 0,05 см³ (50 мкл) рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с информацией, указанной на этикетке (конечное разведение образца 1:32). Планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение (18±2) ч при температуре (5±3)°С.

- Улавливание антигена. В промытые лунки сенсибилизированного планшета вносят по 0,05 см³ (50 мкл) смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение (60±5) мин при температуре (37±2)°С.

- Промывание лунок планшета. Процедуру повторяют 3 раза, как описано выше.

- Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок А1 и В1 с КК, куда добавляют по 0,05 см³ (50 мкл) раствора №3, вносят по 0,05 см³ (50 мкл) рабочего разведения детекторных антител в растворе №3 в соответствии с разведением, указанным на этикетке флакона К3, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение (60±5) мин при температуре (37±2)°С.

- Промывание лунок планшета. Процедуру повторяют 3 раза, как описано выше.

- Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ (50 мкл) рабочего разведения конъюгата в растворе №3 в соответствии с разведением, указанным на этикетке флакона К7, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение (60±5) мин при температуре (37±2)°С.

- Промывание лунок планшета. Процедуру повторяют 3 раза, как описано выше.

- Окрашивание. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см³ (50 мкл) хромогенного субстрата АБТС, закрывают крышкой и выдерживают (15±5) мин при температуре (22±3)°С.

- Остановка реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см³ (50 мкл) стоп-раствора.

Результаты анализа учитывают инструментальным способом. Сразу после остановки реакции измеряют оптическую плотность (ОП) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 405-415 нм, используя спектрофотометр (ридер) для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения ОП контрольных и исследуемых проб переводят в значение процента ингибиции (PI) по формуле

,

где ОП_пробы – среднее значение оптической плотности смеси исследуемого или контрольного образца с антигеном вируса ящура;

ОП _КА - среднее значение оптической плотности контроля антигена;

ОП _КК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.

Реакция считается достоверной, если удовлетворяет следующим критериям:

- контроль антигена имеет значение ОП 0,5 оптических единиц и выше;

- разница между значениями ОП_КА и ОП_КК не менее 0,4 оптических единиц;

- контроль 1 имеет значение PI>75%;

- контроль 2 имеет значение PI>50%;

- контроль 3 имеет значение PI<50%.

Образцы, демонстрирующие значение PI≥50%, считают положительными, а животных, от которых получены данные образцы сыворотки крови, иммунными к ящуру генотипа SAT2/XIV. Значение PI<50% является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к вирусу ящура генотипа SAT2/XIV в сыворотке крови обследуемых животных.

В результате проведенных исследований были определены оптимальные рабочие разведения специфических реагентов. Активность в реакции ИФА сенсибилизирующих антител составила 1:1000; антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT2/XIV– 1:1000, или 0,55 мкг/см³; детекторных антител - 1:5000, коммерческого антивидового конъюгата – 1:1500, или 0,75 мкг/см³; подобраны контрольные образцы сыворотки крови, демонстрирующие значения PI в указанном выше диапазоне. При получении новых партий компонентов, одного или нескольких, требуется определение их рабочей концентрации для проведения реакции ИФА, обеспечивающей стандартные значения контрольных образцов, и валидация тест-системы.

Разработанная тест-система дает возможность тестировать одновременно в формате одного 96-луночного планшета 86 образцов сыворотки крови без учёта контролей при постановке реакции в одной повторности или 43 исследования – в двух повторностях (рекомендуется).

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Выбор штамма вируса ящура серотипа SAT 2 для разработки тест-системы, позволяющей оценивать антигенную и иммуногенную активность противоящурной вакцины, включающей антиген производственного штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

При создании диагностических тест-систем для ящура разработчики стремятся к серотипоспецифичности ИФА. Действительно в пределах серотипа вирус ящура разных генетических линий, как правило, обнаруживает серологическое родство. Однако при обследовании первично вакцинированного молодняка тест-системы для обнаружения антител к вирусу ящура определённого серотипа разных производителей могут демонстрировать штаммовую/генотипическую специфичность. Это имеет огромное значение при оценке антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины. Следует тщательно подбирать инструмент для получения наиболее объективной и достоверной информации.

До разработки тест-системы для оценки антигенной и иммуногенной активность противоящурных вакцин серотипа SAT 2 топотипа XIV в ФГБУ «ВНИИЗЖ» были созданы две тест-системы для оценки гуморального иммунитета к ящуру серотипа SAT 2 топотипа VII на основе штаммов вируса ящура SAT2/LIB/2012 и SAT2/ERI/98, показавшие высокую степень родства и, как следствие, взаимозаменяемость. Предполагалось, что данные тест-системы смогут обеспечить полноценный контроль в ИФА эффективности вакцины, включающей антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура. Были проанализированы данные по генетическому и серологическому соответствию штаммов и изолятов вируса ящура VII и XIV топотипов серотипа SAT 2, рассмотрена целесообразность разработки данной тест-системы для ящура серотипа SAT 2 топотипа XIV.

Для выявления генетического родства (гомологии) между топотипами VII и XIV проводили сравнение аминокислотных последовательностей белка VP₁ вируса ящура серотипа SAT 2. Выравнивание выполняли согласно информации, полученной из NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [18] и базы данных ФГБУ «ВНИИЗЖ»: SAT2/ETH/2/2022 (GenBank: WKE35517.1); SAT2/JOR/11/2023 (GenBank: WUR05443.1); SAT-2/XIV/2023 (база данных ФГБУ «ВНИИЗЖ»); SAT2/ETH/2/91 (GenBank: WKE35516.1); SAT2/ERI/4/98 (GenBank: AAR09103); SAT2/LIB/39/2012 (GenBank: AFU55197.1); SAT2/EGY/Ismalia/2018 (GenBank: QZE50286.1); SAT2/EGY/Beni-Suef-2/2018 (GenBank: QEI49588.1); SAT2/EGY/Dakahlia/2017 (GenBank: AXR97922.1) (Фиг.2).

Как видно на фиг. 2, вакцинный штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура имеет 100%-ю степень гомологии с изолятом вируса ящура, выделенным на территории Иорданского Хашимитского Королевства в 2023 году (SAT2/JOR/11/2023), в аминокислотной последовательности полипептида VP₁, оба вируса отличаются от изолята SAT2/ETH/2/2022, выделенного в Эфиопии в 2022 году, одной аминокислотной заменой в области GH-loop и 20 заменами от эфиопского изолята SAT2/ETH/2/91. Данные вирусы относятся к топотипу XIV серотипа SAT 2 и значительно отличаются от изолятов вируса ящура серотипа SAT 2 топотипа VII, что непосредственно отражается на антигенном соответствии штаммов вируса ящура серотипа SAT 2, относящихся к разным топотипам. Филогенетическое дерево вируса ящура серотипа SAT 2 представлено на фиг. 3, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей гена VP₁, наглядно демонстрирует топотипические (генотипические) различия между штаммами вируса.

При изучении антигенного соответствия вакцинного штамма «SAT-2/XIV/2023» (топотип XIV) вируса ящура со штаммами вируса ящура SAT2/LIB/2012 (топотип VII) и SAT2/ERI/98 (топотип VII) в реакции нейтрализации на культуре клеток IB-RS-2 было установлено низкое родство между штаммами разных топотипов от 0,06 до 0,16. В то время, как штаммы SAT2/LIB/2012 и SAT2/ERI/98 демонстрировали близкое родство между собой, 0,36 и 0,69, соответственно (табл. 1), что свидетельствовало о хорошей перекрёстной защите между данными вирусами ящура.

Таким образом, при разработке иммуноферментной тест-системы для оценки антигенности и иммуногенности вакцины против ящура генотипа SAT2/XIV был выбран производственный штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

Пример 2. Получение иммуноспецифических компонентов иммуноферментной тест-системы для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

Особое внимание при получении специфических реагентов жидкофазного блокирующего варианта ИФА для обнаружения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT2/XIV уделено выделению 146S-компонента из инактивированной вируссодержащей суспензии культуры клеток ВНК-21 (146S-антиген вируса ящура генотипа SAT2/XIV). Это интактный антиген с коэффициентом седиментации 146S, т.е. антиген с неизменённой структурой, представляющий собой вирионы, потерявшие в процессе инактивирования свою инфекционность. Данный антиген представляет собой капсид с заключённой в нём инактивированной РНК. Целостность капсида обеспечивает иммуногенность противоящурной вакцины, так как поверхностные полипептиды VP₁-VP₃ продуцируют выработку вируснейтрализующих штаммо/серотипоспецифических антител. Использование высокоочищенного 146S-антигена в реакции ИФА при проведении «жидкой фазы», в ходе которой формируется иммунный комплекс со специфическими антителами в исследуемом образце, а также для иммунизации кроликов и морских свинок при получении улавливающих (сенсибилизирующих) и детекторных антител, соответственно, позволяет определять уровень гуморального иммунитета против ящура с максимально возможной достоверностью. Наличие инертных балластных белков в виде остатков клеточного детрита и сывороточного альбумина в частично очищенном антигене или антигенсодержащей клеточной суспензии может привести к искажению результатов реакции.

Антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура для получения иммуноспецифических компонентов реакции ИФА: антигена, улавливающих (сенсибилизирующих) и детекторных антител, выделяли из инактивированной вируссодержащей суспензии культуры клеток ВНК-21 по следующей схеме.

На первом этапе антигенное сырьё при низкоскоростном центрифугировании (Avanti J-26 XP, Beckman Coulter, USA) в течение 30 минут освобождали от клеточного детрита. Надосадочную жидкость сливали и использовали для преципитации вирусного антигена в присутствии 8% полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 (ПЭГ6000) и 0,85% NaCl в течение 18-20 часов при температуре (6±2)°С. Преципитированный антиген осаждали на центрифуге Avanti J-26 XP, Beckman Coulter, USA, при 6000 об/мин, температуре 4°С в течение 60 минут. Надосадок удаляли, осадок ресуспендировали в фосфатно-буферном солевом растворе (ФБР), рН 7,4, 1/500 от первоначального объёма исходного сырья. Затем полученную суспензию тщательно гомогенизировали с 50% хлороформа и фракционировали при 3000 об/мин, температуре 4°С в течение 15 минут на центрифуге Allegra X-22R Centrifuge, Beckman Coulter, USA. Верхняя водная фракция являлась промежуточной субстанцией в виде концентрированного, частично очищенного антигена, обозначенной далее, как преципитат антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура (Аг_ПЦ SAT2/XIV). Затем Аг_ПЦSAT2/XIV фракционировали в ступенчатом градиенте плотности сахарозы, состоящем из последовательных слоёв 20%, 30%, 40%, 50% сахарозы в ФБР, на центрифуге Optima L-80 XP Ultracentrifuge, Beckman Coulter, USA, при 24000 об/мин, температуре 4⁰С в течение 3 часов. Основная масса 146S-частиц скапливалась на границе раздела 30% и 40% слоёв сахарозы в виде опалесцирующей полосы. Отобранные по 1мл фракции градиента анализировали спектрофотометрически при длине волны 260 нм для построения седиментационного профиля Аг_ПЦSAT2/XIV (фиг. 4А) и при электрофоретическом разделении белковых молекул в 12%-м полиакриламидном геле (фиг. 4Б). Для 146S-антигена отбирали фракции с наибольшим накоплением структурных полипептидов VP₁-VP₃ и наименьшим содержанием/отсутствием примесей. В результате, после объединения фракций, получили 146S-антиген SAT2/XIV с концентрацией белка примерно 0,55 мг/мл. На фиг. 5 изображена электрофореграмма антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в 12%-м полиакриламидном геле: преципитат антигена до фракционирования ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы; 146S-антиген (146S-Ag SAT2/XIV) вируса ящура.

Полученный 146S-Ag SAT2/XIV использовали для изготовления иммуноспецифических компонентов реакции жидкофазного блокирующего варианта ИФА: улавливающих и детекторных антител, антигена вируса ящура.

Кроликов и морских свинок иммунизировали двукратно 146S-Ag SAT2/XIV в дозе приблизительно 0,3 и 0,15 мг на голову, соответственно. Антиген для введения смешивали с адъювантом Montanide ISA-206 в равных пропорциях. Обескровливание производили на 35 сутки после вакцинации.

Тест-система для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, содержит иммуноспецифические реагенты в следующих рабочих разведениях: улавливающие антитела – 1:1000, детекторные антитела – 1:5000, антиген вируса ящура – 1:1000 или 0,55 мкг/мл.

Пример 3. Расчёт позитивно-негативного порога для качественной оценки результатов исследования образцов сыворотки крови животных с применением иммуноферментной тест-системы для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

При интерпретации результатов реакции ИФА необходимо установить критерии качественной оценки, для чего определяется cut-off – точка отсечения, позитивно-негативный порог (ПНП), позволяющий квалифицировать исследуемые образцы биоматериала, как положительные или отрицательные в отношении конкретного инфекционного агента. В конкурентных или блокирующих иммуноферментных тест-системах для выявления специфических антител к вирусу ящура разных производителей обычно ориентиром является значение процента ингибиции (PI) или отношения S/N в 50%. Однако производители иногда используют другие значения для ПНП в соответствии с чувствительностью и специфичностью своих тест-систем. Например, в сравниваемом с предложенной тест-системой для ящура SAT2/XIV ФГБУ «ВНИИЗЖ» наборе для ящура SAT 2 производства IZSLER установлен порог в 70%.

В предлагаемой тест-системе оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в основу качественного анализа результатов реакции ИФА заложен ПНП в 50% PI. Расчёт производили по данным, полученным в ходе тестирования 176 образцов сыворотки крови от клинически здоровых КРС и свиней, не вакцинированных против ящура. Были получены среднее значение PI и стандартное отклонение от среднего (SD). Среднее значение PI по данной выборке образцов сыворотки крови (n=176) составило 21,09%, SD – 14,67%. Позитивно-негативный порог рассчитывали по формуле ПНП=PI_сред.+2SD, что составило 50,43%.

Таким образом, значение позитивно-негативного порога для качественной характеристики образцов сыворотки крови, исследуемых в предлагаемой тест-системе оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, соответствовало прогнозируемому в 50% PI, что свидетельствовало об оптимальном выборе рабочих разведений иммуноспецифических компонентов, определяющих точность и объективность анализа.

Пример 4. Применение иммуноферментной тест-системы для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины, включающей антиген вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

Испытания предлагаемой тест-системы проводили в ходе опыта на крупном рогатом скоте по проверке антигенности и иммуногенности моновалентной сорбированной вакцины против ящура SAT2/XIV в сравнении с другими тест-системами для ящура серотипа SAT 2 (табл. 2). Пятнадцать бычков однократно иммунизировали вакциной в цельном виде, в разведениях 1:4 и 1:16, по 5 особей на каждое разведение вакцины. Одно контрольное животное не вакцинировалось. Кровь для исследования в ИФА и РН отбирали у всех животных на 0, 3, 7, 14, 21 день после введения вакцины против ящура генотипа SAT2/XIV. Образцы сыворотки крови проверяли на наличие антител к вирусу ящура серотипа SAT 2 в иммуноферментных тест-системах: SAT2/XIV-ВНИИЗЖ на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение), SAT2/VII-ВНИИЗЖ на основе штамма SAT2/LIB/39/2012 вируса ящура, SAT2-IZSLER, и в реакции нейтрализации вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023». Как видно из табл. 2, эффективность тест-системы SAT2/XIV-ВНИИЗЖ на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение) в регистрации выработки специфических антител была выше, чем у других рассматриваемых тест-систем. Уже на 7 сутки было выявлено по одной серопозитивной особи в трёх группах вакцинированного КРС, в других реакциях специфические антитела обнаруживали только на 14 сутки. Тенденция сохранялась и на 21 сутки после вакцинации. В результате, количество положительно реагирующих животных, установленное в ИФА и РН на 14-21 день после введения разных доз вакцины, составило: тест-система SAT2/XIV-ВНИИЗЖ на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение) – 22/30 (73,3%), SAT2/VII-ВНИИЗЖ – 13/30 (43,4%), SAT2-IZSLER – 8/30 (26,7%), SAT2/XIV-РН – 11/30 (36,7%), что свидетельствовало о неоспоримом преимуществе в диагностической чувствительности предлагаемой тест-системы.

Для подтверждения объективности данной иммуноферментной тест-системы при оценке антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение) были проанализированы 163 образца сыворотки крови от свиней и КРС. Анализ проведен c использованием следующих тест-систем: на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение), SAT2/VII-ВНИИЗЖ, SAT2-IZSLER. Результаты параллельных исследований сывороток крови в ИФА до и после вакцинации цельной дозой против ящура генотипов SAT2/XIV (вакцина на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура) и SAT2/VII (вакцины на основе штамма SAT2/LIB/39/2012 и SAT2/ERI/98), а также после заражения вирусом ящура штамма SAT2/ERI/98 представлены в таблице 3. Как показывает анализ табл. 3, тест-системы демонстрировали выраженную генотипоспецифичность при тестировании данной выборки образцов. Сыворотки крови КРС против антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура при использовании тест-системы для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины, включающей антиген вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение) имели положительный статус в 100% случаев, в реакции ИФА SAT2/VII-ВНИИЗЖ и SAT2-IZSLER – в 80% и 60%, соответственно. В то время, как серопозитивность животных в отношении ящура серотипа SAT 2 топотипа VII была установлена в тест-системах SAT2/VII-ВНИИЗЖ и SAT2-IZSLER на 88% и 91%, соответственно, в тест-системе для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины, включающей антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение) – на 81%.

Таким образом, предлагаемая иммуноферментная тест-система для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины, включающей антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, может быть использована при оценке эффективности вакцины и напряжённости иммунитета против ящура генотипа SAT2/XIV.

Пример 5. Определение диагностических характеристик иммуноферментной тест-системы для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины, включающей антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

При валидации предлагаемой тест-системы были определены основные диагностические характеристики, такие как чувствительность, специфичность, точность и каппа-критерий, как описано в методике [19]. В таблице 4 приведены данные статистической обработки результатов тестирования в ИФА 113 образцов сыворотки крови КРС, полученной против антигена вируса ящура генотипа SAT2/XIV. Как видно из таблицы 4, высокие значения диагностической чувствительности в 90,0%, диагностической специфичности - 98,1%, диагностической точности - 93,8% иммуноферментной тест-системы для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины, включающей антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура (предлагаемое изобретение) определили высокую степень согласованности результатов реакции ИФА с известным диагностическим статусом обследуемых животных (k-критерий - 0,876).

Источники информации, использованные при составлении заявки на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Иммуноферментная тест-система для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура»:

1. Стандарты МЭБ. Руководство по наземным животным. Руководство по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных. Часть третья. Болезни, входящие в список МЭБ, и другие болезни, имеющие важность для международной торговли. https://rr-europe.woah.org/.

2. Луговская Н.Н., Силантьева Е.А., Михалишин Д.В., Мороз Н.В., Малыгин М.П., Харитонова А.А., Доронин М.И., Гочмурадов Ы.М., Оковытая Т.В., Борисов А.В. Диагностическая тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT2/VII в жидкофазном блокирующем варианте ИФА. Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2023; 4 (60): 43-52. https://doi.org/10.24412/2074-5036-2023-4-43-52.

3. Россельхознадзор обеспокоен распространением экзотического для Евразийского континента серотипа ящура на Ближнем Востоке и в Западной Азии. 16 марта 2023. Россельхознадзор. Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. https://fsvps.gov.ru/ru/fsvps/news/217101.html.

4. ProMED, International society for infectious diseases. https://promedmail.org/promed-post/?id=20230204.8708168.

5. Патент RU №2824660 от 03.04.2024 г., МПК A61K 39/135, «Вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная эмульсионная».

6. Патент RU №2817257 от 04.09.2023 г., МПК C12N 7/00, «Штамм "SAT-2/XIV/2023" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/XIV для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура».

7. Луговская Н.Н., Силантьева Е.А., Оковытая Т.В., Харитонова А.А., Гочмурадов Ы.М., Разгуляева Е.А., Будина О.О., Яснева Е.А. Изучение серотипоспецифичности диагностических тест-систем для выявления антител к структурным белкам вируса ящура иммуноферментным анализом. Ветеринария сегодня. 2024; 13(1): 44-56. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2024-13-1-44-56.

8.Ludi A., Morris A., Gubbins S., Asfor A., Afzal M., Browning C.F., et al. Cross-serotype reactivity of ELISAs used to detect antibodies to the structural proteins of foot-and-mouth disease virus. Viruses. 2022; 14: 1495. https://doi.org/10.3390/v14071495.

9. Феррари Д., Патон Д., Дуффи С., Бартелс К., Найт-Джонс Т. Вакцинация против ящура и поствакцинальный мониторинг. Руководство. Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций, Всемирная организация по охране здоровья животных. 2020. Режим доступа: https://rr-europe.woah.org/wp-content/uploads/2020/08/pvm-fmd_ru.pdf.

10. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2021. Updated 30 June 2021. 2021. Available online: https://www.oie.int/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/.

11. Hamblin C., Barnett I.T., Hedger R.S. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA. J Immunol Methods. 1986; 93 (1): 115-121.

12. Hamblin C., Barnett I.T., Crowther J.R. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. II. Application. J Immunol Methods. 1986; 93 (1): 123-129.

13. Hamblin C, Kitching R.P., Donaldson A.I., Crowther J.R., Barnett I.T. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. III. Evaluation of antibodies after infection and vaccination. Epidemiol Infect. 1987; 99 (3): 733-744.

14. Патент РФ №2787714, 11.01.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма А №2269/ВНИИЗЖ/2015 генотипа A/ASIA/G-VII в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка №2022108324 .

15. Патент РФ №2791614, 13.03.2023. Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных после иммунизации // Заявка №2022119118.

16. Патент РФ №2796393, 23.05.2023. Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА // Заявка №2022113420.

17. Dho G., Grazioli S., Bugnetti M., Pezzoni G., Maree F.F., Esterhuysen J., Chitray M., Scott K. and Brocchi E. Read-to-use kits for detection of antibody to FMDV serotypes SAT1 and SAT2. Open session of the standing Technical and Research Committees of the EuFMD. Cavtat (Croatia), 29-31 October 2014. https://www.fao.org/fileadmin/user_upload/eufmd/Open_Session_2014PPTS/Parallel29oct/WPar8.pdf

18. База данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

19. Луговская Н.Н., Калинина Е.Н., Малкова К.С., Воробьёва О.В., Горячева Г.М., Майорова Т.К. Валидация методики определения уровня противоящурных антител в реакции жидкофазного блокирующего "сэндвич"-варианта иммуноферментного анализа. Ветеринария сегодня. 2015;(3):22-29.

Таблица 1

Антигенное родство между штаммами вируса ящура серотипа SAT 2 в реакции нейтрализации, r₁

Образцы сыворотки крови	r 1сред. в реакции нейтрализации вируса ящура
	SAT2/LIB/2012	SAT2/ERI/98	«SAT-2/XIV/2023»
SAT2/LIB/2012	1,0	0,36	0,06
SAT2/ERI/98	0,69	1,0	0,16
«SAT-2/XIV/2023»	0,14	0,16	1,0

Примечание: если, r₁≥0,3 - близкое родство;

r₁<0,3 – низкое родство

Таблица 2

Результаты исследования в ИФА и РН образцов сыворотки крови КРС, вакцинированного против ящура штамма «SAT-2/XIV/2023»

(сорбированная моновалентная вакцина)

Образцы сыворотки крови	Разведение вакцины	Используемые тест-системы
		SAT2/XIV-ВНИИЗЖ (предлагаемое изобретение) PIпл≥50%		SAT2/VII- ВНИИЗЖ PIпл≥50%		SAT2-IZSLER PIпл≥70%		РН ВЯ штамма «SAT-2/XIV/2023» ТплВНА≥5,5log2
		PIсред	пл/n	PIсред	пл/n	PIсред	пл/n	Тсред	пл/n
Sкрс 0 dpv	до вакцинации	23,2	0/16	33,0	0/16	22,3	0/16	0	0/16
Sкрс 3 dpv	цельная	16,1	0/5	22,2	0/5	2,4	0/5	0	0/5
	1:4	9,8	0/5	29,7	0/5	3,2	0/5	0	0/5
	1:16	11,1	0/5	36,1	0/5	2,9	0/5	0	0/5
	невакц.контроль	19,4	0/1	18,0	0/1	2,8	0/1	0	0/1
Sкрс 7 dpv	цельная	35,7	1/5	32,7	0/5	12,2	0/5	3,5	0/5
	1:4	26,8	1/5	36,9	0/5	16,9	0/5	2,8	0/5
	1:16	15,3	1/5	23,7	1/5	25,7	0/5	1,0	0/5
	невакц.контроль	13,8	0/1	17,7	0/1	19,2	0/1	0	0/1
Sкрс 14 dpv	цельная	75,0	5/5	65,9	4/5	72,4	3/5	5,3	3/5
	1:4	62,1	4/5	44,4	2/5	48,1	1/5	4,6	2/5
	1:16	40,7	2/5	36,6	1/5	32,0	0/5	3,4	1/5
	невакц.контроль	22,3	0/1	22,1	0/1	11,3	0/1	≤1,5	0/1
Sкрс 21 dpv	цельная	74,5	5/5	63,9	4/5	71,7	3/5	5,4	3/5
	1:4	63,4	4/5	32,0	1/5	44,2	1/5	4,4	1/5
	1:16	42,6	2/5	24,7	1/5	37,5	0/5	3,2	1/5
	невакц.контроль	15,7	0/1	9,5	0/1	7,3	0/1	≤1,5	0/1

Примечание: PI – процент ингибиции;

Т_плВНА – минимальный положительный титр вируснейтрализующих антител;

пл/n – количество положительно реагирующих особей к общему количеству животных в группе;

dpv – дни после вакцинации

РН – реакция нейтрализации

Таблица 3

Результаты исследования в ИФА образцов сыворотки крови КРС и свиней до и после вакцинации/после заражения против ящура серотипа SAT 2

Образцы сыворотки крови	Используемые тест-системы
	SAT2/XIV-ВНИИЗЖ (предлагаемое изобретение) PIпл≥50%			SAT2/VII-ВНИИЗЖ PIпл≥50%			SAT2-IZSLER PIпл≥70%
	PIсред	пл/n	SP,%	PIсред	пл/n	SP,%	PIсред	пл/n	SP,%
Sсвин. 0 dpv	23,2	0/16	-	13,9	0/16	-	22,3	0/16	-
Sкрс 0 dpv	25,1	0/37	-	30,3	0/37	-	20,2	0/37	-
Sсвин. 16-28 dpv SAT2/LIB/2012	68,2	28/30	93,3	83,7	29/30	96,7	90,2	29/30	96,7
Sкрс 14-35 dpv SAT2/LIB/2012	70,1	14/15	93,3	89,5	15/15	100,0	87,6	15/15	100,0
Sкрс 21-45 dpv/dpi SAT2/ERI/98	59,5	23/35	65,7	80,3	27/35	77,1	89,1	29/35	82,9
Sкрс 14-21 dpv «SAT-2/XIV/2023»	76,8	30/30	100,0	63,8	24/30	80,0	72,6	18/30	60,0

Примечание: PI – процент ингибиции;

пл/n – количество положительно реагирующих особей к общему количеству животных в группе;

SP – серопозитивность (количество положительно реагирующих животных);

dpv/dpi – дни после вакцинации/дни после заражения

Таблица 4

Диагностические характеристики тест-систем для обнаружения антител к структурным белкам вируса ящура серотипа SAT 2, определённые для генотипа SAT2/XIV

n=113

Используемые тест-системы	Диагностические характеристики ()
	Чувствительность	Специфичность	Точность	k-критерий*
SAT2/XIV-ВНИИЗЖ (предлагаемое изобретение)	90,0% (79,5%-96,2%)	98,1% (89,9%-100,0%)	93,8% (87,7%-97,5%)	0,876
SAT2/VII-ВНИИЗЖ	55,0% (41,6%-67,9%)	98,1% (89,9%-100,0%)	75,2% (66,2%-82,9%)	0,516
SAT2-IZSLER	40,0% (27,6%-53,5%)	100,0% (93,3%-100,0%)	68,1% (58,7%-76,6%)	0,385
РН ВЯ штамма «SAT-2/XIV/2023»	45,0% (29,3%- 61,5%)	100,0% (93,3%-100,0%)	76,3% (66,4%-84,5%)	0,483

Примечание: *k-критерий – согласованность результатов тестирования индивидуальных образцов сыворотки крови в ИФА и РН с диагностическим статусом животных:

<0 – нет согласованности;

0-0,20 – незначительная;

0,21-0,40 – слабая;

0,41-0,60 – умеренная;

0,61-0,80 – значительная;

0,81-1,00 – высокая.

Claims (5)

1. Иммуноферментная тест-система для оценки антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура, содержащая:

иммуноспецифические реагенты: высокоочищенный интактный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT2/XIV вируса ящура, лиофилизированный с активностью в ИФА 1:1000; сенсибилизирующие антитела, IgG кролика против штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT2/XIV вируса ящура, лиофилизированные с активностью в ИФА 1:1000; детекторные антитела, IgG морской свинки против штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT2/XIV вируса ящура, лиофилизированные с активностью в ИФА 1:5000; контроль 1 - положительная сыворотка крови к антигену штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT2/XIV вируса ящура с процентом ингибиции более 75%, лиофилизированная; контроль 2 - положительная сыворотка крови к антигену штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT2/XIV вируса ящура с процентом ингибиции более 50%, лиофилизированная; контроль 3 - нормальная сыворотка крови, не содержащая антител к вирусу ящура, с процентом ингибиции менее 50%, лиофилизированная; конъюгат - иммунопероксидазный конъюгат вторичных антител против IgG морской свинки, лиофилизированный; блокирующая сыворотка не иммунная, лиофилизированная;

неспецифические компоненты: КББ - соли для карбонатно-бикарбонатного буферного раствора, рН 9,5-9; буферный раствор - 20х, рН 7,4-7,6; хромогенный субстрат АБТС; стоп-раствор - 1%-ный раствор додецилсульфат натрия,

отличающаяся тем, что при получении иммуноспецифических компонентов используется инактивированный антиген вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура и уровень поствакцинального иммунитета определяется по количеству специфических антител в сыворотке крови иммунизированного скота, выраженному через процент ингибиции (PI) в соответствии с формулой: PI=(1-(ОП_пробы-ОП_КК)/(ОП_КА-ОП_КК))х100%, при этом титр противоящурных антител определяется как максимальное разведение сыворотки крови, для которой значение процента ингибиции составляет ≥50%.

2. Тест-система по п. 1, отличающаяся тем, что является специфичной и чувствительной, позволяющей быстро, в течение 4 часов, провести оценку антигенной и иммуногенной активности противоящурной вакцины на основе штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.