PL205228B1

PL205228B1 - Zestaw diagnostyczny do badania surowic zwierząt na obecność przeciwciał RHD oraz zestaw diagnostyczny do wykrywania wirusa RHD

Info

Publication number: PL205228B1
Application number: PL376121A
Authority: PL
Inventors: Andrzej Fitzner; Andrzej Kęsy; Bogusław Szewczyk; Beata Gromadzka
Original assignee: Panstwowy Inst Weterynaryjny P; Panstwowy Instytut Weterynaryjny Panstwowy Instytut Badawczy; Univ Gdanski; Uniwersytet Gdanski
Priority date: 2005-07-08
Filing date: 2005-07-08
Publication date: 2010-03-31
Also published as: EP1904850A2; WO2007008092A3; PL376121A1; WO2007008092A2

Description

Przedmiotami wynalazku są zestaw diagnostyczny serologiczny do badania surowic zwierząt na obecność przeciwciał RHD oraz zestaw diagnostyczny do wykrywania wirusa RHD. Przedmioty wynalazku umożliwiają użycie w teście ELISA swoistych, monospecyficznych surowic odpornościowych uzyskanych w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych oczyszczonym rekombinowanym antygenem wirusa RHD (VLP RHDV), gwarantując wysoką czułość, specyficzność oraz powtarzalność uzyskiwanych wyników. Wykorzystanie w teście układu kontrolnego złożonego z antygenu dodatniego i kontroli ujemnej wirusa, a także próbki surowic kontrolnych pozwala szybko i precyzyjnie określić badane próbki jako dodatnie bądź ujemne.

Krwotoczna choroba królików (ang. Rabbit haemorrhagic disease RHD) określana powszechnie w Polsce jako pomór królików [Górski 1988] jest chorobą wirusową przebiegają c ą w postaci ostrej lub nadostrej, z wysokim odsetkiem śmiertelności, dochodzącym w niektórych ogniskach do 100%. Okres inkubacji choroby wynosi od 24 do 72 godzin. W obrazie sekcyjnym królików padłych dominuje silny obrzęk płuc z wyraźnymi cechami zapalenia krwotocznego. Stwierdza się obrzęk i zwyrodnienie wątroby, a także powiększenie śledziony oraz rozpulchnienie i przekrwienie nerek. Badaniem histopatologicznym stwierdza się liczne wynaczynienia w płucach, przekrwienie i obrzęk węzłów chłonnych, destrukcję i zanik jąder hepatocytów, zanik miazgi białej śledziony, zwyrodnienie i przekrwienie nerek.

Chorobę po raz pierwszy opisano w Chinach w 1984 roku, a niedługo później ogniska RHD odnotowano w Europie, Azji, Ameryce, Afryce. W Polsce pierwsze przypadki RHD stwierdzono w 1988 r. i wyizolowano szczepy wirusa oznaczone jako SGM i KGM [Górski 1988].

Na podstawie cech morfologicznych i właściwości fizyko-chemicznych (wielkość wirionów o średnicy 28-32 nm, gęstość w gradiencie chlorku cezu 1,31-1,36 g/cm³, oporność na działanie rozpuszczalników organicznych) wirus RHD został sklasyfikowany w rodzinie Caliciviridae. Wirus posiada zdolności aglutynowania krwinek czerwonych człowieka [Górski 1988, Liu 1984, Ohlinger 1990, Parra 1990].

Test immunoenzymatyczny ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) jest powszechnie znaną i użyteczną metodą diagnostyczną wykorzystywaną z powodzeniem do oznaczania różnych składników obecnych w płynach ustrojowych takich jak surowica lub mocz, czy też w supernatancie z hodowli tkankowych lub homogenatów.

W praktyce weterynaryjnej znajduje zastosowanie w diagnostyce wielu chorób zakaźnych np. pryszczycy, chorobie Aujeskiego. Test ELISA jest metodą czułą i specyficzną a przy tym szybką i prostą w wykonaniu.

W rutynowej diagnostyce krwotocznej choroby królików (ang. Rabbit haemorrhagic disease - RHD) do wykrywania wirusa wykorzystuje się odczyn hemaglutynacji (HA), a do wykrywania obecności swoistych przeciwciał w surowicy królików odczyn zahamowania hemaglutynacji (HI). W obu tych metodach wykorzystano zdolność wirusa RHD do aglutynacji erytrocytów człowieka grupy 0. Równocześnie istotne jest, że ograniczeniem odczynu hemaglutynacji (HA), jest brak możliwości wykrywania szczepów wirusa pozbawionych właściwości hemaglutynacyjnych [Chasey 1995, Anon 2004] a z powodu niskiej czułości i potrzeby ciągłego posiadania świeżych erytrocytów jest on pomocny w ograniczonym zakresie. Od wielu lat w diagnostyce RHD obok metod HA i HI, w wyspecjalizowanych ośrodkach badawczych, wykorzystuje się techniki mikroskopii elektronowej, a także metody western blotting, immunofluorescencję (IF) i techniki immunohistochemiczne. Rozpoznawanie RHD z wykorzystaniem wymienionych metod dostarcza wiarygodnych wyników, ale jest jednocześnie bardzo kosztowne i znajduje główne zastosowanie w przypadku prowadzenia badań naukowych. Znacznie powszechniej i na nieco wię kszą skalę w diagnostyce RHD wykorzystywany jest test immunoenzymatyczny ELISA, stosowany w wielu modyfikacjach, ze względu na czułość, swoistość reakcji i prostotę wykonania.

W większości przypadków opisane i używane metody ELISA opracowano w laboratoriach badawczych zajmujących się problematyką krwotocznej choroby królików. Od kilku lat, na niewielką skalę, oferowane są także komercyjnie zestawy testów ELISA do diagnostyki serologicznej i wirusologicznej wytwarzane przez włoski Instytut naukowy w Brescii (Istituto Zooprofilattico Sperimentale - IZS), który jest ośrodkiem referencyjnym OIE do spraw diagnostyki RHD. W zestawach IZS wykorzystuje się przeciwciała monoklonalne przeciw różnym epitopom wirusa RHD oraz odpornościowe surowice poliklonalne królików i natywny antygen RHDV izolowany z tkanek zakażonych królików.

Do wykrywania i ilościowej oceny przeciwciał neutralizujących opracowano test współzawodnictwa (ang. competition ELISA). W proponowanej metodzie płytkę o właściwościach sorbcyjnych opłaszcza się swoistą króliczą surowicą odpornościową. Na płytkę nanosi się mieszaninę badanej

PL 205 228 B1 surowicy i stałej dawki antygenu wirusa pomoru królików. W następnym etapie stosuje się przeciwciała monoklonalne wytworzone przeciw wirusowi RHD, związane z enzymem peroksydazą chrzanową. Obecność przeciwciał w badanej surowicy wykrywa się spektrofotometryczne na podstawie reakcji barwnej po dodaniu substratu. Ocenę wyników dokonuje się poprzez porównanie wartości absorpcji (OD492) badanych prób, z rezultatami próbek kontrolnych, dodatniej i ujemnej.

Zestaw do diagnostyki wirusologicznej (test pośredni ELISA - (ang. indirect sandwich ELISA) zawiera m. in. mieszaninę kilku przeciwciał monoklonalnych pozwalających wykrywać obecność wirusa RHD w narządach wewnętrznych zakażonych królików jak również rozpoznawać zakażenie zajęcy wirusem EBHSV. Na płytkę opłaszczoną swoistą króliczą surowicą odpornościową anty-RHDV, nanosi się badany antygen, który następnie wykrywa się stosując koniugat, czyli swoiste przeciwciała monoklonalne związane z enzymem-peroksydazą chrzanową. Wizualnym odzwierciedleniem obecności antygenu wirusa RHD - wyniku dodatniego jest reakcja barwna z substratem. Intensywność reakcji barwnej odczytuje się spektrofotometrycznie i analizuje w odniesieniu do prób kontrolnych, ujemnej i dodatniej. Wyniki interpretuje się ilościowo.

W piś miennictwie dotyczą cym RHD wymienia się takż e wykorzystanie metody ELISA typu „direct, w której do wykrywania przeciwciał płytki o właściwościach sorbcyjnych opłaszcza się bezpośrednio oczyszczonym wirusem RHD a następnie wykorzystuje do wykrywania przeciwciał (Rodak 1990).

W ostatnim czasie dostę pny jest w ofercie handlowej test ELISA firmy Kalon, do wykrywania przeciwciał RUD, w którym do opłaszczenia płytek użyto rekombinowanego białka RHDV uzyskanego w systemie bakulowirusa. Zestaw zawiera opł aszczone pł ytki sorbcyjne oraz surowice odniesienia dodatnią i ujemną.

Wirus RHD posiada dodatnio spolaryzowaną (ss RNA+), pojedynczą nić RNA zawartą w dwudziestościennym, bezotoczkowym kapsydzie. Genom wirusa (7,5 kb) został po raz pierwszy sklonowany przez Meyersa i wsp. [Meyers 1991a, 1991b], a następnie jego pełną sekwencję opublikował Rasschaert i wsp. wykazując 98% homologię sekwencji aminokwasowej [Rasschaert 1994]. Sekwencje fragmentu genomu kodującego białko kapsydu przedstawili m. in. Boga i wsp. [Boga 1994] dla szczepu wyizolowanego w Hiszpanii, Milton i wsp. dla szczepów wyizolowanych w Czechach i Austrii, a także Guittre i wsp., którzy wykazali identyczność sekwencji nukleotydów szczepów francuskich od do 98%.

Na podstawie badań molekularnych ustalono, że genom wirusa RHD wykazuje znaczną homologię z innymi kaliciwirusami (Feline calicivirus -FCV, San Miguel sealion virus - SMSV, Vesicular exanthema virus of swine - VESV), jednakże jest inaczej zorganizowany, gdyż wyróżnia się w nim tylko dwie ramki odczytu (ORF), a nie trzy jak u wymienionych. Główna ramka odczytu (ORF1) wirusa RHD o 2344 kodonach obejmuje prawie cały genom, od nukleotydu 10 do 7042 i koduje poliproteinę o wielkości 257 kDa, którą można rozdzielić na białka niestrukturalne (nt 1000 - 5000) i białko kapsydu VP60 (5305 - 7044). Sekwencja kodująca białko strukturalne znajduje się przy końcu 3' ORF1. Obok ORF1 występuje, mniejsza ramka odczytu - ORF2 (7025-7378) zawierająca 353 nukleotydy, która koduje białko VP12 o niesprecyzowanej dotychczas funkcji. Wyizolowano także subgenomowy RNA o wielkości 2.2 kb, który przypuszczalnie spełnia rolę w procesie replikacji [Meyers 1991a, 1991b].

Produkty ekspresji wirusowego cDNA RHDV uzyskane in vitro w systemach lizatów retykulocytów królika (RRL) i E. coli użyto do badania mechanizmu powstawania i rozpadu obszernej poliproteiny (257 kDa) kodowanej przez główną ramkę odczytu ORF 1. W wyniku rozpadu poliproteiny uzyskano kilka białek wirusowych RHDV, w tym proteinę o masie 60 kDa rozpoznawaną przez surowicę odpornościową anty-RHDV [Alonso 1996].

Ekspresję białka kapsydu (VP60) wirusa RHD uzyskano w wirusie vaccinii (krowianki). Rekombinowany wirus RecV-VP60 namnożono poprzez zakażenie komórek RK13. Jak wykazano w pośredniej reakcji immunofluorescencji (IF) i immunoprecypitacji z przeciwciałami anty-RHDV uzyskany produkt białkowy o masie 60 kDa - posiadał właściwości antygenowe. Po podaniu królikom, w iniekcji śródskórnej i doustnie, białko indukowało powstanie swoistych przeciwciał o wysokim mianie i chroniło w próbie zakażenia zjadliwym wirusem RHD wykonanej 15 dnia po zakażeniu [Bertagnoli 1996].

Laurent et al. zastosowali system bakulowirusa w celu ekspresji genu VP60 wirusa RHD. Stwierdzono wydzielanie się do pożywki z hodowli komórek owadzich S9 białka rekombinowanego, które formowało się w struktury pseudowirusowe VLP, strukturalnie i immunologicznie nie do odróżnienia od natywnych wirionów wirusa RHD [Laurent 1994].

Laurent et al. uzyskali ekspresję genu VP60 wirusa syndromu krwotocznej choroby zajęcy EBHSV, należącego do Caliciviridae. Wirus EBHSV jest bardzo blisko spokrewniony z wirusem RHD.

PL 205 228 B1

Ma podobną morfologię (wielkość i wygląd w mikroskopie elektronowym). Badania ochrony krzyżowej wykazały, że króliki szczepione rekombinowanym białkiem EBHSV (rEBHSV) nie są odporne na zakażenie zjadliwym wirusem RHD [Laurent 1997].

Gen kodujący strukturalne białko kapsydu RHDV poddano ekspresji w systemie E. coli lub w systemie polimerazy T7 RNA. W systemie E. coli uzyskano białko fuzyjne, które tylko częściowo wykazywało podobieństwo antygenowe do natywnego białka VP60 i po immunizacji nie uzyskiwano ochrony w próbie zakażenia zjadliwym wirusem.

Natomiast w systemie T7 RNA uzyskano białko rekombinowane, które po dwukrotnej immunizacji królików (1-ego i 7-ego dnia) stymulowało powstawanie swoistych przeciwciał i ochronę po wykonaniu zakażenia śmiertelną dawką oczyszczonego wirusa RHD w 7 dniu po podaniu drugiej dawki immunizacyjnej [Boga 1994].

W systemie drożdży Saccharomyces cerevisiae uzyskano białko rekombinowane, które chroniło w próbie zakaż enia zjadliwym wirusem RHDV. Biał ko posiadał o wł aś ciwości antygenowe charakterystyczne dla RHDV. W mikroskopie elektronowym wykazano obecność struktur wirusopodobnych VLP wykazujących zbliżoną wielkość (średnicę).

W celu oceny immunogennoś ci rekombinowanego białka 4 króliki immunizowano podskórnie próbkami białka całkowitego stanowiącego osad uzyskany metodą ultrawirowania o stężeniu 400 μg (natomiast względna ilość białka rekombinowanego w próbce na podstawie analizy SDS-PAGE wynosiła ok. 10%). Zakażenie zjadliwym wirusem 100 LD50 wykonano 14 dni po immunizacji pojedynczą dawką [Boga 1997].

Białko kapsydu wirusa RHD uzyskano w systemie ekspresji bakulowirusa w komórkach owadzich. Króliki immunizowano dwukrotnie domięśniowo oczyszczonymi cząstkami pseudowirusowymi VLP w dawce 30 μg, natomiast myszy białe immunizowano dootrzewnowo podając 10 μg białka rekombinowanego. Antygen podawano łącznie z adiuwantem Titer Max. Dawkę przypominającą podawano po 14 dniach. Cztery szczepione króliki zakażono doświadczalne zjadliwym wirusem o mianie 1000 LD50. Króliki szczepione przeżyły zakażenie, natomiast 2 króliki kontrolne padły [Nagesha 1995].

Białko kapsydu wirusa RHD uzyskano w systemie ekspresji bakulowirusa w komórkach owadzich dwiema drogami: 1) na podstawie informacji genetycznej zapisanej na matrycy mRNA analogicznej do podgenomowego RNA wirusa RHD oraz 2) jako fragment większej poliproteiny białkowej obejmującej białka niestrukturalne (proteazę 3C i polimerazę RNA) i strukturalne białko kapsydu, wytworzonej na podstawie informacji genetycznej genomowego RNA. W obu sposobach ekspresji uzyskano cząstki pseudowirusowe VLPs, podobne antygenowo i morfologicznie do oczyszczonych wirionów natywnej postaci wirusa.

Sześć królików wolnych od swoistych przeciwciał poddano jednokrotnej immunizacji rekombinowanym białkiem VLPs w dawkach zawierających 10 i 100 μg białka z dodatkiem adiuwanta (żelu wodorotlenku glinu). Po 2 tygodniach pobrano surowice i wykonano zakażenie zjadliwym wirusem w dawce 10³LD50. Króliki wykazywały obecność swoistych przeciwciał o mianie od 1/60 do 1/400. Króliki immunizowane przeżyły nie wykazując żadnych objawów choroby, natomiast dwa zwierzęta kontrolne padły do 52 godziny po zakażeniu [Sibilia 1995].

W opisie patentowym PL183976 (opublikowanym 1998-12-07) przedstawiono sposób wykorzystania testu ELISA do badania surowic królików w kierunku krwotocznej choroby królików (VHD). Sposób polega na tym, że w teście ELISA wykorzystuje się mikropłytki opłaszczone swoistą surowicą odpornościową kury przeciw wirusowi pomoru królików, antygen wirusa VHD konserwowany glicerolem, swoistą surowicę odpornościową świnki morskiej przeciw wirusowi VHD, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny - OPD z dodatkiem H2O2 oraz układ referencyjny składający się z surowicy króliczej ujemnej, wysokododatniej i niskododatniej - progowej w kierunku krwotocznej choroby królików - VHD.

W opisie patentowym PL183983 (opublikowanym 1998-12-07) przedstawiono sposób wykorzystania testu ELISA do diagnostyki wirusa krwotocznej choroby królików. Sposób polega na tym, że w teście ELISA wykorzystuje się mikropłytki opłaszczone swoistą surowicą odpornościową kury przeciw wirusowi VHD, swoistą surowicę odpornościową świnki morskiej przeciw wirusowi VHD, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny - OPD z dodatkiem H2O2 oraz układ kontrolny składający się z antygenu referencyjnego dodatniego o właściwościach hemaglutynujących oraz pozbawionego tych właściwości i antygenu referencyjnego ujemnego.

W opisie patentowym PL160369 (opublikowanym 1991-03-11) opisano sposób wytwarzania szczepionki przeciwko pomorowi królików.

PL 205 228 B1

W zgłoszeniu patentowym US2003186431 (opublikowanym 2003-10-02) opisano szczepionkę przeciwko krwotocznej chorobie królików oraz antygen. Strukturalny antygen VP60 wirusa krwotocznej choroby królików (RHDV) bądź jego fragment może być uzyskiwany w roślinach poprzez zastosowanie wektora wirusowego opartego na wirusie plum pox (PPV), zawierającego promotor, rekombinowaną sekwencję DNA zawierającą cDNA przyłączone do genomu wirusa PPV, pełną długość, oraz sekwencję DNA kodującą białko RHDV VP60 lub jego fragment wprowadzony pomiędzy sekwencje nukleotydowe kodujące białka Nib i CP wirusa PPV, oraz element klonujący. Otrzymany antygen jest zdolny do pobudzania reakcji obronnych przeciwko śmiertelnej krwotocznej chorobie królików (RHDV) i może być wykorzystywany jako rekombinowaną podjednostka szczepionki przeciwko pomorowi królików.

W opisie patentowym W09639177 (opublikowanym 1996-12-12) opisano kompozycje rekombinowanego wirusa poxvirus-calicivirus (wirusa krwotocznej choroby króliczej RHDV) i ich zastosowanie. Opisano atenuowane rekombinowane wirusy zawierające DNA kodujące antygen kaliciwirusa taki jak antygen RHDV, a mianowicie gen kapsydu, a także sposoby i kompozycje zawierające te wirusy, ekspresję ich produktów oaz przeciwciała powstałe w wyniku działania wirusów oraz produkty genowe o licznych zastosowaniach zapobiegawczych, terapeutycznych i diagnostycznych. Wirusowe DNA może być wykorzystywane zarówno do sond jak i primerów.

W opisie patentowym CN1134461 (opublikowanym 1996-10-30) opisano rekombinowane kapsydy i białka wirusa krwotocznej choroby królików (RHDV), zestawy diagnostyczne oraz szczepionki zawierające wspomniane kapsydy oraz białka. Rekombinowane kapsydy i rekombinowane białka wirusa krwotocznej choroby królików (RHDV) były wytwarzane w rekombinowanym systemie ekspresji bakulowirusa replikowanym w hodowli komórkowej owadów. Uzyskane kapsydy i białka są pod względem właściwości immunogennych i antygenowych analogiczne względem natywnego białka VP60 RHDV i nadają się do wytwarzania szczepionek stosowanych przeciwko krwotocznej chorobie królików, a także do przygotowywania testów diagnostycznych umożliwiających wykrycie obecności przeciwciał rozpoznających RHDV oraz obecności RHDV w próbkach biologicznych pobranych od królików.

W opisie patentowym EP0704529 (opublikowanym 1996-04-03) opisano szczepionkę przeciwko wirusowi krwotocznej choroby królików, wytwarzanie strukturalnego antygenu (VP60) wirusa RHD oraz jego zastosowanie jako szczepionki. Wytwarzanie antygenu oraz sposób szczepienia obejmuje następujące etapy: a) izolacja genu kodującego białko strukturalne (VP60) wirusa RHD; b) klonowanie wspomnianego genu w wektorze transferowym bakulowirusa pAcYM1; c) otrzymanie i izolacja rekombinowanego bakulowirusa AcVP60; d) zainfekowanie komórek owadzich Sf9 rekombinowanym bakulowirusem AcVP60; e) otrzymanie i izolacja białka VP60 wytwarzanego przez rekombinowany bakulowirus AcVP60; f) inokulacja królików przy zastosowaniu antygenu.

W opisie patentowym RU2007452 (opublikowanym 1994-02-15) przedstawiono szczep komórek hybrydowych mus musculus - wytwarzający monoklonalne przeciwciała wykorzystywane przy diagnozowaniu choroby krwotocznej królików.

W opisach patentowych CS9005797 (opublikowanym 1992-03-18) oraz CS8906486 (opublikowanym 1992-03-18) opisano limfocyty wytwarzane w liniach hybrydowych komórek nowotworowych myszy lub myszowatych RHDV-02 oraz RHDV-01 (odpowiednio dla zgłoszeń CS9005797 i CS8906486) wytwarzające monoklinalne przeciwciała przeciwko wirusowi krwotocznej choroby królików.

W opisie patentowym AU6247000 (opublikowanym 2000-12-14) opisano kompozycję rekombinowanego wirusa poxvirus-calicivirus oraz ich zastosowanie.

Podobnie w opisie patentowym US5989561 (opublikowanym 1999-11-23) opisano kompozycję rekombinowanego wirusa poxvirus-calicivirus krwotocznej choroby królików i ich zastosowanie. W rozwią zaniu tym przedstawione został y atenuowane rekombinowane wirusy zawierają ce DNA kodujące antygen kaliciwirusa taki jak antygen RHDV, mianowicie gen kapsydu, a także sposoby i kompozycje dotyczące wirusa, produkty ich ekspresji oraz przeciwciała wyprodukowane przez ten wirus bądź produkty ekspresji. Rekombinowane wirusy mogą być rekombinowanymi wirusami NYVAC lub ALVAC. Rekombinowane wirusy oraz produkty genowe z nich uzyskane a także przeciwciała wytworzone przez wirusy oraz produkty genowe mogą mieć liczne zastosowania zarówno prewencyjnie, terapeutycznie jak i diagnostycznie. DNA z wirusów może być wykorzystywane do sond oraz do primerów.

Pomimo opisanych powyżej badań poświęconych dostarczeniu zestawów diagnostycznych wykorzystujących test ELISA do badania surowic królików oraz do wykrywania antygenu wirusa krwotocznej choroby królików (RHD) oraz stosowania odczynów hemaglutynacji i zahamowania hemaglu6

PL 205 228 B1 tynacji, ze względu na stosunkowo niską czułość, pracochłonność a także konieczność posiadania świeżych erytrocytów, testy te w ograniczonym zakresie spełniają kryteria diagnostyczne. Ponieważ niedogodności związane są z produkcją reagentów, występowaniem reakcji nieswoistych wynikających ze sposobu pozyskiwania wirusa z tkanek zakażonych królików, czy też uzyskaniem i standaryzacją przeciwciał monoklonalnych, istnieje cią gła potrzeba uzyskania skutecznego rozwiązania umożliwiającego uzyskanie zestawów wykorzystujących oczyszczone, stabilne antygenowo preparaty natywnego wirusa.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie środków, które mogłyby być wykorzystane do opracowania zestawów diagnostycznych do badania surowic królików oraz innych gatunków zwierząt na obecność przeciwciał RHD oraz do wykrywania antygenu wirusa RHD u zwierząt. Zestawy te obejmują opracowane oczyszczone, stabilne antygenowo preparaty rekombinowanego białka VP60 w postaci cząstek pseudowirusowych VLP, umożliwiając użycie w teście ELISA swoistych, monospecyficznych surowic odpornościowych uzyskanych w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych oczyszczonym rekombinowanym antygenem wirusa RHD (VLP RHDV), zaś wykorzystanie w teście układu kontrolnego złożonego z antygenu dodatniego i kontroli ujemnej wirusa umożliwia szybkie i precyzyjne określenie badanych próbek jako dodatnich bą dź ujemnych, gwarantując wysoką czułość, specyficzność oraz powtarzalność uzyskiwanych wyników.

Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z opracowaniem i dostarczeniem zestawów diagnostycznych wykorzystujących test ELISA do badania surowic królików oraz innych gatunków zwierząt na obecność przeciwciał RHD a takż e do wykrywania wirusa RHD, których skł adniki czynne - swoiste, monospecyficzne surowice odpornościowe uzyskane zostały w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych oczyszczonym rekombinowanym antygenem wirusa RHD (VLP RHDV) zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny serologiczny do badania surowic zwierząt na obecność przeciwciał RHD oparty na teście ELISA, charakteryzujący się tym, że zestaw diagnostyczny obejmuje surowicę opłaszczającą-króliczą monospecyficzną surowicę odpornościową antyVLP RHDV, swoisty antygen - VLP RHDV, surowicę wykrywającą - monospecyficzną surowicę odpornościową świnki morskiej anty-VLP RHDV VP60, koniugat antyglobulinowy znakowany enzymem, substrat enzymatyczny oraz surowice królicze kontrolne, ujemną i wysokododatnią oraz niskododatnią - progową zawierające swoiste przeciwciała przeciw wirusowi RHD.

Korzystnie, gdy składniki czynne zestawu (surowice odpornościowe) uzyskano w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych rekombinowanym białkiem strukturalnym VP60 wirusa RHD, oczyszczonym metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy.

Korzystnie gdy do opłaszczenia płytki o właściwościach sorbcyjnych stosuje się poliwalentną, monospecyficzną, surowicę odpornościową królika (pierwsze przeciwciała) immunizowanego frakcją cząstek pseudo wirusowych wirusa RHD - rekombinowanego białka strukturalnego o masie 60 kDa (VLP RHDV VP60) uzyskanego w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynujacego szczepu SGM wirusa RHD.

Korzystnie, gdy antygen używany w fazie płynnej testu w stanowi pożywka komórek owadzich linii Spodoptera frugiperda transfekowanych rekombinowanym bakulowirusem (SGM 1800 BacV) przy m.o.i 2,0 - zebrana 4 dnia po zakażeniu hodowli komórek, konserwowana glicerolem.

Korzystnie, gdy cząstki pseudowirusowe VLP są w postaci pożywki z hodowli komórek owadzich zawierającej rekombinowane białko strukturalne kapsydu wirusa RHD (VLP RHDV VP60)

Korzystnie, gdy koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-IgG świnki morskiej związane z enzymem peroksydazą chrzanową zaś substratem jest związek chemiczny - chromogen o-phenylenediamine dihydrochloride -OPD aktywowany nadtlenkiem wodoru - H2O2.

Korzystnie, gdy surowicę referencyjną ujemną w kierunku krwotocznej choroby królików - RHD otrzymuje się przez zmieszanie w równych ilościach wielu porcji surowic pochodzących od królików klinicznie zdrowych, nieszczepionych, takich które nigdy nie miały kontaktu z wirusem krwotocznej choroby królików. Korzystnie, gdy surowicę referencyjną wysokododatnią w kierunku krwotocznej choroby królików - RHD, stanowi surowica królicza otrzymana po immunizacji królików inaktywowanym, natywnym wirusem RHD, poddanych zakażeniu zjadliwym wirusem.

Korzystnie, gdy surowicę referencyjną wysokododatnią cechuje miano w odczynie zahamowania hemaglutynacji (HI) nie mniejsze niż 1280.

PL 205 228 B1

Korzystnie, gdy surowicę referencyjną niskododatnią - progową stanowi surowica królików immunizowanych szczepionką przeciwko pomorowi królików, zebrana między 10-14 dniem po szczepieniu o mianie HI 1/40 - 1/80.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do wykrywania wirusa RHD oparty na teście ELISA, charakteryzujący się tym, że zestaw diagnostyczny obejmuje odpornościową surowicę króliczą anty-VLP RHDV VP60, surowicę odpornościową świnki morskiej anty-VLP RHDV VP60, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny oraz kontrolne próby antygenu wirusa RHD dodatnią i ujemną.

Korzystnie, gdy składniki czynne (surowice odpornościowe) uzyskano w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych rekombinowanym białkiem strukturalnym VP60 wirusa RHD, oczyszczonym metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy. Korzystnie, gdy antygen wirusa RUD zawarty w badanej próbce, wiąże się do surowicy opłaszczającej - odpornościowej surowicy króliczej anty-VLP RHDV VP60) i jest dostępny dla immunoglobulin (IgG) anty-VLP RHDV VP60 obecnych w surowicy świnki morskiej.

Korzystnie, gdy testowane próbki, których wartość OD492 jest co najmniej dwukrotnie wyższa od wartości absorbcji (OD) dla kontroli ujemnej są dodatnie. Korzystnie, gdy poliwalentne, monospecyficzne surowice odpornościowe królika i świnki morskiej uzyskano w wyniku czynnego uodpornienia zwierząt, po przeprowadzeniu dwóch kolejnych szczepień drogą iniekcji podskórnej, w odstępie 21-28 dni.

Korzystnie gdy do opłaszczenia płytki o właściwościach sorbcyjnych stosuje się poliwalentną, monospecyficzną, surowicę odpornościową królika (pierwsze przeciwciała) immunizowanego frakcją cząstek pseudowirusowych wirusa RHD - rekombinowanego białka strukturalnego masie 60 kDa (VLP RHDV VP60) uzyskanego w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynującego szczepu SGM wirusa RHD.

Korzystnie gdy surowicę wykrywającą (drugie przeciwciała) stanowi poliwalentna, monospecyficzna, surowica odpornościowa świnki morskiej immunizowanej frakcją cząstek pseudowirusowych wirusa RHD (VLP RHDV VP60), uzyskanego w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynującego szczepu SGM wirusa RHD.

Korzystnie, gdy koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-IgG świnki morskiej związane z enzymem peroksydazą chrzanową, zaś substratem jest związek chemiczny - chromogen o-phenylenediamine dihydrochloride - OPD aktywowany nadtlenkiem wodoru - H2O2.

Korzystnie, gdy próby kontrolne antygenu RHDV - dodatnią i ujemną stanowią oczyszczone homogenaty tkankowe.

Korzystnie, gdy dodatni antygen wirusa (+)RHDV stanowi 20% zawiesina wątroby królika zakażonego zakaźnym szczepem wirusa krwotocznej choroby królików o właściwościach hemaglutynujących, inaktywowana i oczyszczona poprzez wirowanie, chloroformowanie oraz zakonserwowana glicerolem w proporcji 1:1. Korzystnie, gdy ujemny antygen wirusa (-) RHDV stanowi 20% zawiesina uzyskana z wątroby zdrowych królików, oczyszczona chloroformem i zakonserwowana glicerolem w proporcji 1:1.

Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.

P r z y k ł a d I. Oceniano dynamikę powstawania swoistych przeciwciał (serokonwersję) w surowicach zwierząt laboratoryjnych - królików i świnek morskich immunizowanych dwukrotnie oczyszczonym, rekombinowanym białkiem SGM1800 VP60 w koncentracji ok. 100 μg/ml, z dodatkiem adiuwanta Freunda w formie pełnej (CFA) i niepełnej (ICFA).

Zwierzęta szczepiono śródskórnie i podskórnie, w odstępie 21 dni (świnki morskie) lub 28 dni (króliki). Preparat rekombinowanego białka SGM1800 VP60 - cząstki pseudowirusowe VLP obecne w pożywce hodowli komórek owadzich Sf9 oczyszczono metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy (60-10%) przy 82000xg, w temp. 4°C przez 1,3 h.

Do immunizacji użyto wybranych frakcji gradientu zawierających cząstki pseudowirusowe VLP o największej aktywności antygenowej, oznaczonej metodami western blotting, ELISA i w odczynie hemaglutynacji.

Czterem królikom przy pierwszym szczepieniu podano po 1 ml zawiesiny zawierającej 0,5 ml białka rekombinowanego i 0,5 ml CFA, natomiast przy drugiej immunizacji podano 0,6 ml zawiesiny złożonej po równych częściach z białka rekombinowanego SGM1800VP60 i ICFA. Piąty królik - nieszczepiony stanowił kontrolę.

PL 205 228 B1

Trzy świnki morskie immunizowano dwukrotnie podając kompozycję złożoną po równych częściach z pożywki hodowli komórek owadzich zawierającej rekombinowane białko VP60 i z adiuwanta CFA lub ICFA. Każdej śwince morskiej podawano po 0,5 ml mieszaniny.

Od immunizowanych zwierząt pobierano krew przed szczepieniem, po 14, 21 (lub 28) dniach po pierwszej immunizacji oraz 14 dnia po podaniu przypominającej dawki rekombinowanego antygenu.

Na podstawie serologicznych badań w kierunku przeciwciał dla wirusa RHD wykonanych w odczynie zahamowania hemaglutynacji (HI) i testem ELISA u immunizowanych zwierząt stwierdzono bardzo wysokie koncentracje swoistych przeciwciał po okresie obserwacji. Zgodnie z przewidywaniem dynamiczny wzrost miana przeciwciał nastąpił po podaniu przypominającej dawki antygenu. Od zwierząt zebrano poliklonalne, monospecyficzne surowice odpornościowe o mianach d 1/5120 do 1/40960, które użyto do opracowania i standaryzacji testu ELISA do diagnostyki wirusologicznej i serologicznej RHD.

Schemat nr 1

ELISA test serologiczny - rozmieszczenie próbek badanych i kontrolnych (badanie punktowe*)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	1	1	9	9	17	17	25	25	33	33	Ks (-)	Ks (-)
B	2	2	10	10	18	18	26	26	34	34	Ks (+)	Ks (+)
C	3	3	11	11	19	19	27	27	35	35	Ks prog	Ks prog
D	4	4	12	12	20	20	28	28	36	36	Ks prog	Ks prog
E	5	5	13	13	21	21	29	29	37	37	Ka	Ka
F	6	6	14	14	22	22	30	30	38	38	Ka	Ka
G	7	7	15	15	23	23	31	31	39	39	Ka	Ka
H	8	8	16	16	24	24	32	32	40	40	Ka	Ka

Objaśnienia:

Ks (-) - kontrola surowicy ujemnej

Ks (+) - kontrola surowicy dodatniej

Ks prog. - kontrola surowicy niskododatniej (progowej)

Ka - kontrola antygenu * identyczny wzór rozmieszczenia próbek kontrolnych (surowic i antygenu) stosuje się podczas mianowania surowic.

P r z y k ł a d II. Badanie punktowe lub mianowanie surowicy

Do wykonania testu ELISA w celu badania surowic króliczych wykorzystano w zestawie płaskodenne mikropłytki ELISA o dużych właściwościach sorbcyjnych IgG (maxisorb, Nunc) oraz płytki okrągłodenne. Płytki ELISA opłaszcza się monospecyficzną króliczą surowicą odpornościową anty-VLP RHDV w optymalnym rozcieńczeniu 1/4000 w buforze węglanowym o pH 9.6 i inkubuje przez 18-24 godz. W temp. 4-8°C. Równolegle, na płytki okrągłodenne (w kolumnach 1-10) nanosi się surowice badane oraz kontrolne (kolumny 11 i 12) w rozcieńczeniu 1/10 lub w kolejnych rozcieńczeniach w postępie

2-krotnym, tj. 1/10, 1/20, 1/40 itd. w buforze PBS + 0.05% Tween 20 (PBST), po czym do wszystkich zagłębień nanosi się po 50 μΐ rekombinowanego antygenu (VLP RHDV) w rozcieńczeniu 1/1500. Każdą surowicę w badaniu punktowym nakłada się dwukrotnie (schemat rozmieszczenia surowic badanych, kontrolnych i kontroli antygenu w badaniu punktowym i podczas mianowania - schemat nr 1). Płytki inkubuje się przez 18-24 godz. w temperaturze 4-8°C. Następnego dnia płytki ELISA przemywa się 5 razy buforem PBST i do odpowiednich studzienek przenosi po 50 μl mieszaniny antygen/surowica z płytki okrągłodennej. Po 1 godzinnej inkubacji w temp. 37°C, płytkę przemywa się j/w i do każdej studzienki na krapla się po 50 μl monospecyficznej surowicy, odpornościowej świnki morskiej anty-VLP RHDV rozcieńczonej w stosunku 1/8000 w buforze PBST zawierającym 1-2% albuminy bydlęcej lub surowicy cielęcej (PBST-BSA). Płytkę inkubuje się 1 godzinę w temp. 37°C i po przemyciu j/w nakrapla koniugat - swoiste IgG królicze anty IgG świnki morskiej znakowane enzymem peroksydazą chrzanową (HRP) w ilości 50 μl/studzienkę, w rozcieńczeniu 1/1000 w buforze PBST +BSA. Po 1 godzinnej inkubacji w temp. 37°C i po przemyciu j/w dodaje się substrat OPD (50 μl/studzienkę)

PL 205 228 B1 aktywowany H2O2, w buforze cytrynianowym o pH 5.0 w celu wywołania reakcji barwnej. Po 10-15 minutach reakcję barwną hamuje się nanosząc po 50 μΐ 1M roztworu H₂SO₄.

Wyniki odczytuje się spektrofotometrycznie przy użyciu czytnika do mikro płytek przy długości fali 492 nm. Surowice, których wartość ekstynkcji w badaniu punktowym jest niższa niż 50% średniej wartości OD492 dla kontroli antygenu należy traktować jako dodatnie. Miano przeciwciał wyraża końcowe rozcieńczenie surowicy, przy którym wartość ekstynkcji stanowi 50% OD492 dla kontroli antygenu. Surowice referencyjne (ujemne, dodatnia i progowa) stanowią kontrolę prawidłowości wykonania badania.

LITERATURA

Alonso J.M., Casais R., Boga J.A., Parra Fr. Processing of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Polyprotein. 1996. J. Virol. 70, 1261-1265.

Anon. (2004) Manual of diagnostic tests and vaccine for terrestrial animals. OIE, fifth edition, chapter 2.8.3.

Bertagnoli S., Gelfi J., Petit F., Vautherot J.F., Rasschaert D., Laurent S., Gall Le G., Boilletot E., Chantal J., Boucraut-Baralon C. Protection of rabbits against viral haemorrhagic disease with a vaccinia-RHDV recombinant virus. Vacine, 1996 14, 506-510.

Boga J.A., Casais R., Marin M.S., Martin Alonso J.M., Carmenes R.S., Prieto., Parra F.: Molecular cloning, sequencing and expression in Escherichia coli of the capsid protein gene from rabbit haemorrhagic disease virus (Spanish isolate AST/89). J. Gen. Virol. 1994, 75, 2409-2413

Boga J.A., Martin Alonso J.M., Casais R., Parra F.: A single dose immunization with rabbit haemorrhagic disease virus major capsid protein produced in Saccharomyces cerevisiae induces protection. J. Gen. Virol. 1997, 78, 2315-2318,

Castanon S., Marin M.S., Martin-Alonso J.M., Boga J.A., Casais R., Humara J.M., Ordas R.J., Parra F. Immunization with potato plants expressing VP60 protein protects against rabbit hemorrhagic disease virus. J. Virol. 1999, 73, 4452-4455.

Chasey D., Lucas M.H., Westcott D.G., Sharp G., Kitching A., Hughes S.K.: Development of a diagnostic approach to the identification of rabbit haemorrhagic disease. Vet. Rec. 1995, 137, 158-160,

Chomczyhski P., Sacchi N.(1978). Single-step method of RNA isolation by amid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Bioch., 162, 156-159,

Fitzner A., Kęsy A., Niedbalski W., Paprocka G. 1999, Medycyna Wet. 55, 120-122. Zastosowanie reakcji RT-PCR do identyfikacji szczepów wirusa krwotocznej choroby królików (RHD) wyosobnionych w Polsce.

Górski J., Mizak B., Mizak Z., Komorowski A.: Obraz kliniczny oraz zmiany anatomopatologiczne w przebiegu pomoru królików (wirusowej krwiotocznej bronchopneumonii królików). Życie wet. 1988, 63, 266-269.

Jiang X., Graham D. Y., Wang M., Estes M. K.: Expression, self assembly and antigenicity of the Norwalk virus capsid protein. J. Virol. 1992, 66, 6527-6532,

Laurent S., Vautherot J-F., Madelaine M-F., Le Gall G., Rasschaert D.: Recombinant rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein expressed in baculovirus self-assembles into viruslike particles and induces protecion. J. Virol. 1994, 68, 6794-6798.

Laurent S. Vautherot J-F., Gall le G., Madelaine M-F., Rasschaert D.: Structural, antigenic and immunogenic relationships between European brown hare syndrome virus and rabbit haemorrhagic disease virus. J. Gen. Virol. 1997, 78, 2803-2811,

Liu S.J., Xue H.P., Pu B.Q., Quian N.H.: A new viral disease in rabbits. Anim. Husb. Vet. Med. 1984, 16, 253-255)

Meyers G.C., Wirblich H., Thiel H-J.: Rabbit hemorrhagic disease virus molecular-cloning and nucleotide sequencing of a calicivirus genome. Virology 1991, 184, 664-676,

Meyers G., Wirblich CH., Thiel H-J.: Genomic and subgenomic RNAs of rabbit hemorrhagic disease virus are both protein-linked and packaged into particles. Virology 1991,184, 677-686.

Nagesha H. S., Wang L.F., Hyatt A. D., Morrissy C. J., Lenghaus C., Westbury H. A.: Self assembly, antigenicity, and immunogenicity of the rabbit haemorrhagic disease virus (Czechoslovakian strain V-351) capsid protein expressed in baculovirus. Arch. Virol. 1995, 140, 1095-1108,

Ohlinger V. F., Haas B., Meyers G., Weiland F., Thiel H-J.: Identification of the virus causing rabbit hemorrhagic disease. J. Virol. 1990, 64, 3331-3336,

PL 205 228 B1

Parra F., Prieto M.: Purification and characterization of a calicivirus as the causative agent of a lethal hemorrhagic disease in rabbits. J. Virol. 1990, 64, 4013-4015.

Rasschaert D., Huguet S., Madelaine M-F., Vautherot J-F.: Sequence and genomic organization of a rabbit hemorrhagic disease virus isolated from a wild rabbit. Virus Genes. 1994, 9:2, 121-132.

Sibilia M., Boniotti M. B., Angoscini P., Capucci L., Rossi C.: Two independent pathways of expression lead to self-assembly of the rabbit hemorrhagic disease virus capsid protein. J. Virol. 1995, 69, 5812-5815.

Claims

1. Zestaw diagnostyczny serologiczny do badania surowic zwierząt na obecność przeciwciał RHD oparty na teście ELISA, znamienny tym, że zestaw diagnostyczny obejmuje surowicę opłaszczającą - króliczą monospecyficzną surowicę odpornościową anty-VLP RHDV, swoisty antygen - VLP RHDV, surowicę wykrywającą - monospecyficzną surowicę odpornościową świnki morskiej anty-VLP RHDV VP60, koniugat antyglobulinowy znakowany enzymem, substrat enzymatyczny oraz surowice królicze kontrolne, ujemną i wysokododatnią oraz niskododatnią - progową zawierające swoiste przeciwciała przeciw wirusowi RHD.

2. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że składniki czynne zestawu (surowice odpornościowe) uzyskano w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych rekombinowanym białkiem strukturalnym VP60 wirusa RHD, oczyszczonym metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy.

3. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że do opłaszczenia płytki o właściwościach sorbcyjnych stosuje się poliwalentną monospecyficzną surowicę odpornościową królika (pierwsze przeciwciała) immunizowanego frakcją cząstek pseudo wirusowych wirusa RHD - rekombinowanego białka strukturalnego o masie 60 kDa (VLP RHDV VP60) uzyskanego w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynującego szczepu SGM wirusa RHD.

4. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że antygen używany w fazie płynnej testu w stanowi pożywka komórek owadzich linii Spodoptera frugiperda transfekowanych rekombinowanym bakulowirusem (SGM1800 BacV) przy m.o.i 2,0 - zebrana 4 dnia po zakażeniu hodowli komórek, konserwowana glicerolem.

5. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1 albo 3, albo 4, znamienny tym, że cząstki pseudowirusowe VLP są w postaci pożywki z hodowli komórek owadzich zawierającej rekombinowane białko strukturalne kapsydu wirusa RHD (VLP PvHDV VP60)

6. Zestaw diagnostyczny wed ł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-IgG świnki morskiej związane z enzymem peroksydazą chrzanową zaś substratem jest związek chemiczny - chromogen o-phenylenediamine dihydrochloride -OPD aktywowany nadtlenkiem wodoru - H2O2.

7. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że surowicę referencyjną ujemną w kierunku krwotocznej choroby królików - RHD otrzymuje się przez zmieszanie w równych ilościach wielu porcji surowic pochodzących od królików klinicznie zdrowych, nieszczepionych, takich które nigdy nie miały kontaktu z wirusem krwotocznej choroby królików.

8. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, ż e surowicę referencyjną wysokododatnią w kierunku krwotocznej choroby królików - RHD, stanowi surowica królicza otrzymana po immunizacji królików inaktywowanym, natywnym wirusem RHD, poddanych zakażeniu zjadliwym wirusem.

9. Zestaw diagnostyczny wedł ug zastrz. 1 albo 8, znamienny tym, ż e surowicę referencyjną wysokododatnią cechuje miano w odczynie zahamowania hemaglutynacji (HI) nie mniejsze niż 1280.

10. Zestaw diagnostyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że surowicę referencyjną niskododatnią - progową stanowi surowica królików immunizowanych szczepionką przeciwko pomorowi królików, zebrana między 10-14 dniem po szczepieniu o mianie HI 1/40 - 1/80.

11. Zestaw diagnostyczny do wykrywania wirusa RHD oparty na teście ELISA, znamienny tym, że zestaw diagnostyczny obejmuje odpornościową surowicę króliczą anty-VLP RHDV VP60, surowicę odpornościową świnki morskiej anty-VLP RHDV VP60, koniugat antyglobulinowy, substrat enzymatyczny oraz kontrolne próby antygenu wirusa RHD - dodatnią i ujemną.

PL 205 228 B1

12. Zestaw według zastrzeżenia 11, znamienny tym, że składniki czynne (surowice odpornościowe) uzyskano w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych rekombinowanym białkiem strukturalnym VP60 wirusa RHD, oczyszczonym metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy.

13. Zestaw według zastrz. 11, znamienny tym, że antygen wirusa RHD zawarty w badanej próbce, wiąże się do surowicy opłaszczającej -odpornościowej surowicy króliczej anty-VLP RHDV VP60) i jest dostępny dla immunoglobulin (IgG) anty-VLP RHDV VP60 obecnych w surowicy świnki morskiej.

14. Zestaw według zastrz. 11 albo 13, znamienny tym, że testowane próbki, których wartość OD492 jest co najmniej dwukrotnie wyższa od wartości absorbcji (OD) dla kontroli ujemnej są dodatnie.

15. Zestaw według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że poliwalentne, monospecyficzne surowice odpornościowe królika i świnki morskiej uzyskano w wyniku czynnego uodpornienia zwierząt, po przeprowadzeniu dwóch kolejnych szczepień drogą iniekcji podskórnej, w odstępie 21-28 dni.

16. Zestaw według zastrz. 11, znamienny tym, że do opłaszczenia płytki o właściwościach sorbcyjnych stosuje się poliwalentną monospecyficzną surowicę odpornościową królika (pierwsze przeciwciała) immunizowanego frakcją cząstek pseudo wirusowych wirusa RHD - rekombinowanego białka strukturalnego masie 60 kDa (VLP RHDV VP60) uzyskanego w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynującego szczepu SGM wirusa RHD.

17. Zestaw według zastrzeżenia 11, znamienny tym, że surowicę wykrywającą (drugie przeciwciała) stanowi poliwalentną, monospecyficzną, surowica odpornościowa świnki morskiej immunizowanej frakcją cząstek pseudowirusowych wirusa RHD (VLP RHDV VP60), uzyskanych w systemie bakulowirusowym w wyniku ekspresji pełnego genu vp60 (1800 pz) hemaglutynującego szczepu SGM wirusa RHD.

18. Zestaw według zastrzeżenia 11, znamienny tym, że koniugat antyglobulinowy stanowi surowica zawierająca przeciwciała anty-IgG świnki morskiej związane z enzymem peroksydazą chrzanową zaś substratem jest związek chemiczny - chromogen o-phenylenediamine dihydrochloride OPD aktywowany nadtlenkiem wodoru - H2O2.

19. Zestaw według zastrzeżenia 11, znamienny tym, że próby kontrolne antygenu RHDV - dodatnią i ujemną stanowią oczyszczone homogenaty tkankowe.

20. Zestaw według zastrzeżenia 11 albo 20, znamienny tym, że dodatni antygen wirusa (+)RHDV stanowi 20% zawiesina wątroby królika zakażonego zakaźnym szczepem wirusa krwotocznej choroby królików o właściwościach hemaglutynujących, inaktywowana i oczyszczona poprzez wirowanie, chloroformowanie oraz zakonserwowana glicerolem w proporcji 1:1.

21. Zestaw według zastrzeżenia 11 albo 20, znamienny tym, że ujemny antygen wirusa (-) RHDV stanowi 20% zawiesina uzyskana z wątroby zdrowych królików, oczyszczona chloroformem i zakonserwowana glicerolem w proporcji 1:1.