RU2842052C1 - Азеластин в качестве противовирусного лечения - Google Patents

Abstract

Группа изобретений может быть использована для профилактики или лечения патологического состояния, связанного с инфекцией SARS-CoV-2. Предложено применение азеластина или его фармацевтически приемлемой соли в количестве 0,1-500 мкг/дозу для профилактического или терапевтического лечения субъекта, нуждающегося в лечении патологического состояния, вызванного или связанного с инфекцией SARS-CoV-2. Также предложено применение азеластина или его фармацевтически приемлемой соли для обработки биологической поверхности с целью предотвращения инфекции SARS-CoV-2 и/или распространения SARS-CoV-2. Группа изобретений обеспечивает сильный противовирусный эффект в отношении SARS-CoV-2 даже при очень низкой концентрации азеластина. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 10 ил., 7 табл., 8 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новым вариантам применения антигистаминного лекарственного соединения для лечения вирусных инфекций, в частности, к способам и соединениям для лечения инфекций Coronaviridae (например, вируса SARS или вируса MERS), аденовирусных инфекций, инфекций респираторно-синцитиального вируса человека и инфекций гриппа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Коронавирусы представляют собой одноцепочечные РНК-вирусы диаметром примерно 120 нанометров. Они склонны к мутациям и рекомбинации и поэтому очень разнообразны. Существует примерно 40 различных разновидностей, которые в основном инфицируют человека и млекопитающих, отличных от человека, а также птиц. Их хозяевами являются летучие мыши и дикие птицы, и они могут передаваться другим животным и, следовательно, людям.

Существует четыре основных рода (альфа, бета, гамма и дельта-коронавирус) на основании их геномной структуры. Альфа- и бета-коронавирусы инфицируют только млекопитающих, обычно вызывая респираторные симптомы у человека и гастроэнтериту других животных. До декабря 2019 года было известно шесть различных коронавирусов, инфицирующих человека. Четыре из них (HCoV-NL63, HCoV-229E, HCoV-OC43 и HKU1) обычно вызывали легкие симптомы, подобные обычной простуде, у иммунокомпетентных людей, а два других вызывали пандемии в течение последних двух десятилетий. В 2002-2003 годах коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV) вызвал эпидемию SARS, которая привела к 10% смертности. Сходным образом, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) вызвал пандемию в 2012 году с 37% уровнем смертности.

В конце 2019 года и в начале 2020 года было обнаружено, что новый коронавирус, SARS-коронавирус 2 (SARS-CoV-2), являющийся близкородственным SARS-CoV, является причиной большой и быстро распространяющейся вспышки респираторного заболевания, включая пневмонию. Поскольку новый коронавирус был распознан, вызванное им заболевание было названо коронавирусным заболеванием 2019 (CoVID-19).

Коронавирусы, родственные SARS, покрыты белками шипов (спайк-белками), которые содержат вариабельный рецепторсвязывающий домен (RBD). Этот RBD связывается с рецептором ангиотензин-превращающего фермента-2 (АПФ-2), присутствующим в сердце, легких, почках и желудочно-кишечном тракте, что облегчает проникновение вируса в клетки-мишени.

Исходный штамм вируса, распространившийся из Уханя, считается вирусом «дикого типа», который вскоре образовал варианты, т.е. мутанты, которые эволюционировали в результате естественного отбора на основании более высокой инфекционности. В начале марта 2020 года в Европе был идентифицирован вариант с мутацией D614G в белке шипов (вариант В.1), который вскоре заменил исходный штамм из Уханя во всем мире. Впоследствии варианты SARS-CoV-2 В.1.1.7 (также известные как 201/501Y.V1, VOC 202012/01) и В.1.351 (также известный как 20Н/501Y.V2) были идентифицированы в Великобритании и Южной Африке, соответственно, и с тех пор распространились во многие страны. Эти варианты содержат различные мутации в гене, кодирующем белок шипов. Одна из них находится в рецепторсвязывающем домене (RBD, который связывает АПФ-2 человека) в положении 501, в котором аминокислота аспарагин (N) была заменена тирозином (Y) (мутация N501Y). Вариант В.1.1.7 также имеет несколько других мутаций, включая: делецию 69/70 и, вероятно, приводит к конформационному изменению в белке шипов, а также Р681Н, рядом с сайтом расщепления фурином S1/S2. Комбинация этих мутаций приводит к более высокому связыванию рецепторов, более эффективному распространению и более высокой способности вызвать заболевание по сравнению с исходным вариантом, который появился в Ухане в Китае в 2019 году. Вариант В.1.351 также имеет, помимо N501Y, мутации E484K и K417N, но не делецию 69/70. Несколько линий свидетельств указывают на то, что этот вариант появился из-за иммунного давления, то есть как ускользание от иммунного ответа человека, вызванного естественной инфекцией, или пассивной иммунной терапии или активной иммунизации различными вакцинами. Мутация E484K, по-видимому, ответственна за снижение эффективности вакцины. Эта мутация (наряду с 16 другими мутациями N501Y и K417T) также была обнаружена в бразильском варианте, обозначенном как Р.1. Вариант Р.1 вызвал широкое распространение инфекции в Бразилии и позднее был обнаружен во всем мире. Предполагается, что этот мутант вызывает более тяжелое заболевание у молодых людей, приводит к более высокой смертности и ускользает от иммунного ответа, индуцированного предыдущим вариантом и некоторыми вакцинами.

Мутант В.1.617 был впервые обнаружен и распространен в Индии. Он имеет 13 мутаций из 3, связанных с иммунным ускользанием: E484Q, L452R и P681R. Линия В.1.618 стала одним из доминирующих мутантов в Западной Бенгалии, она несет делецию двух аминокислот (H146del и Y145del), а также мутации E484K и D614G в белке шипов. Предполагается, что она обладает более высокой инфекционностью и представляет угрозу для ускользания от естественного или индуцированного вакциной иммунитета.

Весьма вероятно, что широкомасштабная вакцинация будет индуцировать появление дополнительных вариантов с разной комбинацией известных в настоящее время и новых мутаций.

Ускоренная глобальная вакцинация с одновременным интенсивным распространением вируса создает огромное эволюционное давление для появления ускользающих мутантов. Все вакцины полагаются, почти исключительно, на запуск иммунного ответа против белка шипов. Кроме того, в соответствии с современным представлением нейтрализующий иммунный ответ против рецепторсвязывающего домена белка шипов считается основным фактором защиты. На основании этих двух фактов из естественно появляющихся вариантов вируса будут отобраны те, которые экспрессируют мутированные белки шипов, обладающие селективным преимуществом (более высокое связывание с рецептором и/или ускользание от нейтрализующего иммунного ответа). Последующие варианты могут накапливать несколько последовательных мутаций с более высокой общей вирулентностью/трансмиссивностью и/или с более высокой вероятностью иммунного ускользания. Предполагается, что помимо упомянутых выше вариантов появятся дополнительные новые варианты вирусов с потенциальной потребностью в вакцинах второго поколения для оптимальной защиты от них.

Таким образом, противовирусные соединения, активные против доминирующего в настоящее время в Великобритании варианта (В1.1.7) и варианта SA (В.1.351), а также против других появляющихся вариантов, которые связаны со значительным снижением индуцированной вакцинами защиты, являются весьма актуальными как для предотвращения, так и для лечения.

Аденовирусы представляют собой большие безоболочечные вирусы с двухцепочечной геномной ДНК. Семейство Adenoviridae содержит шесть родов вирусов, обладающих широкой специфичностью в отношении хозяев. Все семь семейств аденовирусов человека (от А до G) принадлежат к роду Mastadenovirus. В настоящее время вирусы человека подразделяются на 88 различных (серо)типов, которые ответственны за различные инфекции слизистой оболочки. Типы в семействах В (HAdV-B) и С (HAdV-C) отвечают за инфекции верхних дыхательных путей, типы HAdV-F (в основном типы 40 и 41) и HAdV-G (в основном тип 52) вызывают гастроэнтерит. Конъюнктивит связан с HAdV-B и HAdV-D. Эти инфекции слизистой оболочки обычно являются самоограничивающими, но могут быть более тяжелыми у хозяина с ослабленным иммунитетом. Аденовирус серотипа 14 является новым патогеном, который вызывает вспышки тяжелых респираторных инфекций, которые могут быть смертельными даже у иммунокомпетентных хозяев.

Аденовирусы имеют классический икосаэдрический капсид, состоящий из 240 белков гексона и 12 белков пентона. Основания пентона связаны с выступающими фибриллами, которые связываются с рецепторами клеток-хозяев: CD46 (семейство В) и рецептором коксаки/аденовируса (CAR, для всех других семейств). За начальным связыванием следует взаимодействие вирусных структур основания пентона с αV-интегринами, что стимулирует эндоцитоз вирусных частиц. Внутри клетки капсид дестабилизируется, эндосома разлагается, и вирусная ДНК проникает в ядро через ядерную пору. После ассоциации с гистоновыми белками механизм транскрипции хозяина используется для экспрессии вирусных генов без интеграции вирусного генома в геном хозяина. Вирусные белки экспрессируются на ранних этапах (в основном регуляторные белки) и поздних этапах (структурные белки), разделенных репликацией генома. Наконец, вирусные геномы упаковываются в белковую оболочку и высвобождаются из клетки-хозяина после процедуры лизиса, индуцированной вирусом.

Аденовирусы относительно устойчивы к дезинфицирующим средствам и детергентам (не инкапсулированным) и долго выживают на поверхностях и в воде. Не существует одобренных противовирусных лекарственных средств для лечения аденовирусных инфекций, поэтому лечение в значительной степени направлено на симптомы. В настоящее время не существует аденовирусной вакцины, доступной широкой общественности, но Вооруженными силами США использовалась вакцина для типов 4 и 7. Недавно сконструированные аденовирусы были успешно использованы в генной терапии и в качестве вирусных векторов для доставки гетерологичного вакцинного антигена (Эбола и Covid).

Респираторно-синцитиальный вирус человека (чРСВ) представляет собой оболочечный вирус с отрицательно-смысловым одноцепочечным РНК-геномом. Геном является линейным и имеет 10 генов, кодирующих 11 белков. РСВ делится на два антигенных подтипа, А и В, с 16 и 22 кладами (или штаммами), соответственно.

РСВ очень заразен и может вызывать вспышки как при контактной передаче, так и при больничной передаче. Каждый год РСВ вызывает приблизительно 30 миллионов случаев острых респираторных заболеваний и более 60000 случаев детских смертей во всем мире. Передача происходит через зараженные капли аэрозоля, попадающие на поверхности слизистой оболочки носа, рта или глаз. После инфекции цилиарных клеток верхних дыхательных путей следует распространение в нижние дыхательные пути. Это одна из наиболее распространенных детских инфекций различной степени тяжести в диапазоне от инфекции верхних дыхательных путей легкой степени тяжести до бронхиолита и вирусной пневмонии, для лечения которых в наиболее тяжелых случаях может потребоваться искусственная вентиляция легких. Индивидуумы с ослабленным иммунитетом (включая недоношенных младенцев) имеют более высокий риск более тяжелых исходов заболевания. Терапевтические варианты обычно ограничиваются поддерживающей терапией, хотя рибавирин был лицензирован для лечения инфекций РСВ у детей. Вакцины недоступны (несмотря на значительные усилия по разработке), однако пассивная иммунизация моноклональными антителами (паливизумабом) стала доступна в качестве выбора для профилактики.

Инфекция вирусами Influenza, обычно называемая «гриппом», является инфекционным заболеванием, вызванным вирусами гриппа. В каждый сезон (зимние месяцы в Северном полушарии) 5-15% населения заболевает гриппом с приблизительно 3-5 миллионами тяжелых случаев. Ежегодно более полумиллиона смертей приходится на группы высокого риска, включая детей младшего возраста, пожилых и людей с хроническими заболеваниями. После 1-4 дней инкубационного периода внезапно появляются симптомы, включающие лихорадку, озноб, головные боли, боль или ломоту в мышцах, потерю аппетита, усталость и спутанность сознания. Пневмония может быть вызвана первичной вирусной инфекцией или вторичной бактериальной инфекцией, например, пневмококком или S. aureus. Передача гриппа опосредуется каплями аэрозоля. Первичным очагом инфекции являются верхние дыхательные пути с последующим прогрессированием в нижние дыхательные пути и инвазивной инфекцией.

Существует четыре типа (вида) вирусов гриппа: А, В, С и D. Сезонные эпидемии (т.е. сезон гриппа) вызываются вирусами гриппа человека A (IAV) и В (IBV), в то время как С и D редко ассоциируются с симптоматическими инфекциями у человека. Вирусы гриппа А делятся на подтипы на основании двух белков на поверхности вируса: гемагглютинина (Н) и нейраминидазы (N). Хотя потенциально существуют 198 различных комбинаций подтипов гриппа А, в настоящее время типы H1N1 и H3N2 циркулируют по всему миру. Вирусы гриппа В не делятся на подтипы, а вместо этого дополнительно классифицируются на две линии: B/Yamagata и B/Victoria. Исходя из этого, сезонные вакцины против гриппа обычно содержат комбинацию двух А (H1N1 и H3N2) и одного или двух штаммов В. Вирусы гриппа имеют отрицательно-смысловой одноцепочечный РНК-геном, который является сегментированным. Оба IAV и IBV содержат 8 сегментов, которые могут комбинироваться с геномом других вирусов гриппа при совместной инфекции одной и той же клетки. Этот процесс (называемый реассортацией (reassortment)) дает потомство со значительно измененным составом вирусных антигенов. Такие реассортированные варианты вируса являются новыми для человеческой популяции и могут вызывать пандемии (например, испанский грипп в 1918 году, H1N1). Реассортация также может происходить между вирусами, специфичными для разных хозяев. Например, пандемия «свиного гриппа» в 2009 году была вызвана тройным реассортированным вирусом, несущим комбинацию вирусных последовательностей, специфичных для свиней, птиц и человека (H1N1). Сходным образом, штаммы птичьего гриппа, которые распространены у диких водоплавающих птиц, иногда инфицируют человека («птичий грипп или грипп птиц», H5N1). При реассортации таких птичьих вирусов с вирусами гриппа человека могут возникать варианты, которые приводят к распространению от человека к человеку, и, следовательно, потенциально могут вызывать глобальные пандемии.

Терапия индивидуумов из групп более низкого риска в основном сосредоточена на симптоматическом лечении (лихорадка) и изоляции. Пациентов, страдающих тяжелым или прогрессирующим клиническим заболеванием, связанным с подозреваемой или подтвержденной инфекцией вирусом гриппа, лечат противовирусными лекарственными средствами (например, осельтамивиром или другими ингибиторами нейраминидазы) и поддерживающей терапией (например, противовоспалительными лекарственными средствами). Группы высокого риска (пожилые, беременные женщины, индивидуумы с ослабленным иммунитетом, связанными хроническими заболеваниями) должны получать ежегодные сезонные вакцины против гриппа в качестве профилактики.

Азеластин, производное фталазина, представляет собой антигистаминный препарат, доступный в форме интраназального спрея для лечения аллергического и вазомоторного ринита и в виде офтальмологического раствора для лечения аллергического конъюнктивита. Это рацемическая смесь, хотя нет отмеченного различия в фармакологической активности между энантиомерами, и она была впервые одобрена Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в 1996 году.

Gysi et al. («Network Medicine Framework for Identifying Drug Repurposing Opportunities for COVID-19», arXiv:2004.07229 [q-bio.MN] от 15.04.2020) раскрывают сетевой набор инструментов для COVID-19 для получения некоторых кандидатных лекарственных средств на основании их вероятной эффективности для пациентов с COVID-19, в том числе азеластина, но без каких-либо указаний на то, будет ли антигистаминный препарат оказывать прямое влияние на вирус, лежащий в основе заболевания.

Hasanain Abdulhameed Odhar et al. (Bioinformation 2020, 16(3):236-244) описывают молекулярную стыковку и динамическое моделирование лекарственных средств, одобренных FDA, с помощью основной протеазы из нового коронавируса 2019. Лекарственные средства ранжировали в соответствии с их минимальной связывающей активностью в отношении кристалла основной протеазы 2019-nCoV, при этом азеластин имеет менее предпочтительный ранг, чем кониваптан.

Xia Xiao et al. (bioRxiv July 6, 2020, DOI:10.1101/2020.07.06.188953) описывают противовирусную активность ряда соединений против ОС43, в том числе азеластина, в качестве антигистаминного препарата.

Fu et al. (Cell Prolif. 2014, 47:326-335) раскрывают гидрохлорид азеластина, нацеленный на котранспортирующий таурохолат натрия полипептид (NTCP), в терапии вируса гепатита В (ВГВ). NTCP представляет собой трансмембранный белок, экспрессируемый с высокими уровнями в гепатоцитах человека, который опосредует транспорт желчных кислот и играет ключевую роль в проникновении ВГВ в гепатоциты.

М.W. Simon (Pediatric Asthma, Allergy & Immunology, 2003, Vol.16:275-282) описывает азеластин как мощный и селективный антагонист гистаминового рецептора H₁ второго поколения, который отрицательно регулирует экспрессию рецептора молекулы внутриклеточной адгезии-1 (ICAM-1), который играет важную роль в прикреплении к слизистой оболочке риновируса человека, вирусов Коксаки типа А, аденовируса типа 5, вируса парагриппа человека типа 2 и 3 и респираторно-синцитиального вируса, а также в мобилизации иммунных эффекторных клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей настоящего изобретения является обеспечение новых противовирусных средств лечения, медицинских и фармацевтических продуктов, которые можно применять для предотвращения вирусной инфекции и/или распространения вируса, в частности, у субъектов, которые подверглись воздействию вируса или инфицированы им, или которые подвержены риску инфицирования. Задача решается с помощью объекта формулы настоящего изобретения и как дополнительно описано в настоящем документе.

Согласно настоящему изобретению предложено соединение азеластина в противовирусном эффективном количестве для применения в качестве противовирусного вещества в фармацевтическом препарате для применения при профилактическом или терапевтическом лечении субъекта, нуждающегося в противовирусном лечении.

В частности, соединение азеластина представляет собой азеластин или его фармацевтически приемлемую соль, такую как гидрохлорид азеластина.

В соответствии с конкретным аспектом фармацевтический препарат представляет собой медицинский продукт или лекарственный продукт. В частности, фармацевтический препарат содержит соединение азеластина и фармацевтически приемлемый носитель.

В частности, субъект нуждается в противовирусном лечении, нацеленном на респираторный вирус, такой как вирус гриппа, респираторно-синцитиальный вирус, аденовирус, коронавирус или вирус верхних дыхательных путей, такой как риновирус.

В настоящем документе под респираторным вирусом конкретно понимается вирус, вызывающий респираторное заболевание. Хотя некоторые из вирусов-мишеней, описанных далее в настоящем документе, могут не только вызывать респираторное заболевание, но и поражать другие части тела, в настоящем документе такие вирусы по-прежнему понимают как «респираторный вирус». В частности, противовирусное лечение нацелено на один или более вирусов человека, в частности, на респираторный вирус человека, например, выбранный из семейств вирусов Coronaviridae, Adenoviridae, Paramyxoviridae или Orthomyxoviridae.

В частности, лечат патологическое состояние, которое вызвано или связано с инфекцией одним или более из:

a) вирусов Coronaviridae, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из β-коронавируса, такого как SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV-1, HCoV-OC43, HCoV-HKU1, и α-коронавируса, такого как HCoV-NL63, HCoV-229E или PEDV, включая встречающиеся в природе варианты или мутантов любого из перечисленных выше, или

b) Adenoviridae, предпочтительно аденовирусов человека, таких как HAdVB, HAdVC или HAdVD;

c) респираторно-синцитиальных вирусов человека (РСВ), таких как РСВ подтипа А или В; или

d) вирусов гриппа, таких как вирусы гриппа человека, предпочтительно вирус гриппа A (IVA), такой как H1N1, H3N3 или H5N1, или вирус гриппа В (IVB), или вирус гриппа С (IVC), или вирус гриппа D (IVD).

В частности, лечат патологическое состояние, которое вызвано или связано с инфекцией одним или более вирусами Coronaviridae, в частности одним или более различными вирусами Coronaviridae.

В соответствии с конкретным аспектом указанные вирусы Coronaviridae предпочтительно выбраны из группы, состоящей из β-коронавируса, такого как SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV-1, HCoV-OC43 или HCoV-HKU1, или α-коронавируса, такого как коронавирус человека NL63 (HCoV-NL63, коронавирус Нью-Хейвена), HCoV-229E или вирус эпидемической диареи свиней (PEDV), включая встречающиеся в природе варианты или мутантов любого из перечисленных выше.

В частности, указанный один или более различных вирусов Coronaviridae, упомянутых в настоящем документе, представляют собой встречающиеся в природе варианты или мутантов SARS-CoV-2, в частности, тех, которые содержат одну или более мутаций белка шипов (S-белок SARS-CoV-2), таких как любая одна или более из следующих мутаций: K417N, L452R, N501Y, D614G, Р681Н, P681R, E484K, E484Q или делеция 69/70.

В частности, белок шипов содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентифицированной как SEQ ID NO: 4 (последовательность представлена на Фиг. 5, номер доступа NCBI QII57161.1, S-белок SARS-CoV-2).

Предпочтительно указанный один или более различных вирусов Coronaviridae представляют собой природные варианты или мутантов SARS-CoV-2, выбранных из группы, состоящей из британского варианта (В1.1.7), южноафриканского варианта (В.1.351), бразильского варианта (Р.1), индийского варианта (В.1.617) и бенгальского варианта (В.1.618).

Препараты, способы и варианты применения, описанные в настоящем документе, конкретно включают соединение азеластина в противовирусном эффективном количестве. Такое противовирусное эффективное количество может быть нацелено на один конкретный вирус или более чем на один из различных вирусов, мутантов вируса или вариантов вируса, таких как дополнительно описанные в настоящем документе.

Под вирусом-мишенью противовирусного эффекта, в частности, понимается вирус, который (прямо или косвенно) связан с показанием для лечения, описанным в настоящем документе, в частности, для лечения с целью профилактики или терапии патологического состояния или заболевания, которое вызвано или иным образом связано с таким вирусом-мишенью.

В частности, мишенью препаратов, способов и вариантов применения, описанных в настоящем документе, и, в частности, мишенью противовирусного эффекта, описанного в настоящем документе, может быть любой один или более из различных видов вирусов, мутантов вируса или вариантов вируса, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных видов вирусов, мутантов или вариантов вируса.

В частности, мишенью могут быть любые два или более вирусов, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 различных видов вирусов, мутантов вируса или вариантов вируса, причем по меньшей мере 2, 3 или 4 из вирусов относятся к различным семействам вирусов, таким как выбранные из семейств:

a) Coronaviridae (β-коронавирус, такой как SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV-1, HCoV-OC43, HCoV-HKU1; или α-коронавирус, такой как HCoV-NL63, HCoV-229Е или PEDV, включая природные варианты или мутантов любого из перечисленных выше);

b) Adenoviridae (таких как аденовирусы или аденовирусы человека, например, HAdVB, HAdVC или HAdVD);

c) Paramyxoviridae (такого как РСВ или РСВ человека, например, чРСВ подтипа А или В); или

d) Orthomyxoviridae (таких как вирусы гриппа или вирусы гриппа человека, предпочтительно вирус гриппа A (IVA), такой как H1N1, H3N3 или H5N1, или вирус гриппа В (IVB), или вирус гриппа С (IVC), или вирус гриппа D (IVD)).

В частности, такие вирусы, перечисленные в пунктах a)-d) выше, упоминаются в настоящем документе как примерные «респираторные вирусы».

В соответствии с конкретным примером мишенью может быть по меньшей мере один вирус, выбранный из а), и по меньшей мере один вирус, выбранный из b), с) или d). В частности, мишенью может быть по меньшей мере один β-коронавирус, такой как вирус SARS, в частности, SARS-CoV-2, и по меньшей мере один вирус гриппа.

В частности, мишенью может быть по меньшей мере один β-коронавирус, такой как вирус SARS, в частности, SARS-CoV-2, и по меньшей мере один аденовирус HAdVB, HAdVC или HAdVD.

В частности, мишенью может быть по меньшей мере один β-коронавирус, такой как вирус SARS, в частности, SARS-CoV-2, и по меньшей мере один чРСВ подтипа А или В.

В соответствии с конкретным примером мишенью может быть по меньшей мере один вирус, выбранный из d), и по меньшей мере один вирус, выбранный из а), b) или с).

В частности, мишенью может быть по меньшей мере один из вирусов гриппа или вирусов гриппа человека и по меньшей мере один аденовирус HAdVB, HAdVC или HAdVD.

В частности, мишенью может быть по меньшей мере один из вирусов гриппа или вирусов гриппа человека и по меньшей мере один чРСВ подтипа А или В.

В соответствии с конкретным примером мишенью может быть по меньшей мере один вирус, выбранный из b), и по меньшей мере один вирус, выбранный из a), с) или d).

В частности, мишенью может быть по меньшей мере один аденовирус HAdVB, HAdVC или HAdVD и по меньшей мере один чРСВ подтипа А или В.

В соответствии с конкретным примером мишенью может быть по меньшей мере один вирус, выбранный из а), и по меньшей мере один вирус, выбранный из b), и необязательно по меньшей мере один вирус, выбранный из с) или d). В частности, мишенью может быть по меньшей мере один β-коронавирус, такой как вирус SARS, в частности, SARS-CoV-2, и по меньшей мере один вирус гриппа, и необязательно по меньшей мере один аденовирус HAdVB, HAdVC или HAdVD и/или по меньшей мере один чРСВ подтипа А или В.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено соединение азеластина (как далее описано в настоящем документе) в противовирусном эффективном количестве для применения в качестве противовирусного вещества в фармацевтическом препарате с целью профилактического или терапевтического лечения патологического состояния, вызванного или связанного с инфекцией одним или более различными вирусами, которые представляют собой вирусы Coronaviridae, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из β-коронавируса, такого как SARS-CoV-2, MERS-CoV, SARS-CoV-1, HCoV-OC43 или HCoV-HKU1, или α-коронавируса, такого как HCoV-NL63, HCoV-229E или PEDV, включая природные варианты или мутантов любого из перечисленных выше, например, любой один или более из встречающихся в природе вариантов или мутантов SARS-CoV-2, упомянутых в настоящем документе, предпочтительно выбранных из группы, состоящей из британского варианта (В1.1.7), южно-африканского варианта (В.1.351), бразильского варианта (Р.1), индийского варианта (В.1.617) и бенгальского варианта (В.1.618).

В частности, патологическое состояние, связанное или вызванное вирусом-мишенью или респираторным вирусом, описанным в настоящем документе, в частности, при котором вирус-мишень представляет собой вирус из семейства Coronaviridae, Adenoviridae, Paramyxoviridae или Orthomyxoviridae, представляет собой обычную простуду, инфекцию носа, синусит, инфекцию горла и гортани, бронхиолит, диарею, сыпь на коже или пневмонию, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС). В частности, патологическое состояние может быть симптомом, связанным с любым одним или более из перечисленных выше. В частности, симптом, подлежащий лечению, может представлять собой любой из кашля, боли в горле, насморка, чихания, головной боли и лихорадки.

В соответствии с конкретным аспектом противовирусное эффективное количество эффективно предотвращает инфекцию восприимчивых клеток вирусом, что обеспечивает лечение патологического состояния. В частности, восприимчивые клетки находятся в организме субъекта или на биологической поверхности или у субъекта.

В соответствии с конкретным аспектом противовирусное эффективное количество составляет 0,1-500 мкг/дозу, предпочтительно ниже любого из 100, 90, 80, 70, 50, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1 или 1 мкг/дозу. В частности, число доз составляет до 1-10 в сутки.

В соответствии с конкретным аспектом противовирусное эффективное количество составляет от 15 мкг до 150 мкг на дозу, предпочтительно менее 100 мкг или менее 50 мкг.

В частности, противовирусное эффективное количество может быть еще меньше, например, меньше любого из 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 или 0,1% от количества в диапазоне от 15 мкг до 150 мкг. В частности, было доказано, что такие более низкие количества эффективны в отношении коронавирусов (или вирусов из семейства Coronaviridae) и/или вирусов, отличных от коронавирусов (или отличных от вирусов из семейства Coronaviridae), таких как вирусы из семейств Adenoviridae, Paramyxoviridae или Orthomyxoviridae.

Например, было доказано, что противовирусный эффект, нацеленный на любой из вирусов-мишеней, описанных в настоящем документе, высокоэффективен с 0,1%, т.е. 2,39 мМ, и 5-кратно сниженной (0,02%, т.е. 478 мкМ) дозой коммерческого препарата назального спрея азеластина, что снижает вирусную нагрузку у человека.

Например, было доказано, что эффект против вируса гриппа высокоэффективен при 5-кратном разведении (0,02%, т.е. 478 мкМ) и 10-кратном разведении (0,01%, т.е. 239 мкМ) коммерческого препарата азеластина (0,1%, 2,39 мМ).

Например, было доказано, что эффект против РСВ высокоэффективен в диапазоне 0,4-6,4 мкМ in vitro.

В соответствии с конкретным аспектом указанный фармацевтический препарат выполнен с возможностью локального введения, такого как местное или местное мукозальное введение, предпочтительно для применения в верхних и нижних дыхательных путях, для назального, легочного, внутриротового, глазного или дермального введения, или для системного введения, предпочтительно путем внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутрикожного, трансдермального или перорального введения. Обычно для парентерального введения предпочтительным является внутривенное или пероральное введение.

В соответствии с конкретным аспектом указанный фармацевтический препарат вводят субъекту в виде спрея, такого как спрей для носа, порошка, такого как растворимый порошок или порошок для ингаляции, или с помощью медицинского устройства, такого как, например, содержащее поверхность или ткань, пропитанную соединением азеластина для ингаляции, геля, мази, крема, пены или жидкого раствора, лосьона, раствора для полоскания полости рта, аэрозолированного порошка, аэрозолированной жидкой формы, гранул, капсул, капель, таблетки, сиропа, пастилки, глазных капель или препарата для инфузии или инъекции.

В частности, предложены противовирусные составы и формы для введения, например, для ветеринарного применения и применения у человека. В частности, составы содержат заранее определенное количество соединения азеластина в качестве активного ингредиента; например, в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии типа «масло-в-воде» или жидкой эмульсии типа «вода-в-масле».

В соответствии с конкретным аспектом соединение азеластина применяют в противовирусном эффективном количестве для обеспечения пиковой концентрации (или максимальной концентрации) в крови или плазме, которая составляет примерно 0,01-2 мкг/мл или до любого из 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 или 0,1 мкг/мл.

В соответствии с конкретным аспектом соединение азеластина применяют в составе в концентрации 1 мкМ - 10 мМ, предпочтительно до любого из 1 мМ, 100 мкМ, 90 мкМ, 80 мкМ, 70 мкМ, 60 мкМ или 50 мкМ. В соответствии с конкретным вариантом реализации концентрация составляет 3-50 мкМ.

В частности, жидкий раствор или дисперсию используют для назального введения, например, с помощью капель для носа или назального спрея, причем предпочтительно противовирусное эффективное количество составляет 1-1000 мкг на ноздрю, предпочтительно 1-500 мкг на ноздрю или до любого из 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, более предпочтительно до 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 мкг на ноздрю.

В частности, доза может быть введена путем назального введения и составляет примерно 2-2000 мкг на дозу, предпочтительно 2-1000 мкг на дозу или до любого из 400, 380, 360, 340, 320, 300, 280, 260, 240, 220, более предпочтительно до 200, 180, 160, 140, 120, 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 4, 3 или 2 мкг на дозу.

Состав предпочтительно применяют в виде назального спрея, назальных капель, аэрозоля, такого как аэрозолированная жидкость или порошок, например, в виде спрея для горла или для внутрилегочного введения, или в виде глазных капель.

Примерные составы могут содержать соединение азеластина в качестве активного ингредиента в количестве, например, от 0,001 до 2% (масс./масс.), например, примерно 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9% или 2,0% (масс./масс.).

В частности, объем 100-1000 мкл на дозу может быть применен в распыляемом составе, например, до 500 мкл объема распыления. В соответствии с конкретным примером назальный спрей может доставлять объем примерно 100-150 мкл на впрыскивание. Как правило, проводят два впрыскивания в ноздрю один или два раза в сутки.

При использовании спрея дозированный спрей предпочтительно используют для введения определенного объема спрея или дозы на распыление.

Составы, подходящие для внутрилегочного введения, могут иметь размер частиц в диапазоне от 0,1 до 500 микрон и могут быть введены путем ингаляции через носовой ход или путем ингаляции через рот для достижения альвеолярных мешков. Подходящие составы включают водные или масляные растворы соединения азеластина. Составы, подходящие для введения в виде аэрозоля или сухого порошка, могут быть получены в соответствии с обычными способами и могут быть доставлены с другими терапевтическими агентами, такими как соединения, используемые при лечении или профилактике воспаления легких или заболеваний легких.

В частности, жидкий раствор или дисперсию используют для парентерального введения, например, путем инфузий или инъекций, причем предпочтительно противовирусное эффективное количество обеспечивает дозу примерно 1-500 мг.

В частности, однократную нагрузочную дозу, составляющую примерно 1 -500 мг, можно вводить парентерально с последующим введением поддерживающих доз, составляющих примерно 10-200 мг или примерно 100 мг, или примерно 200 мг, например, путем ежедневного введения в течение 1-10 дней или до достижения определенного клинического ответа.

В частности, таблетку, гель или пастилку используют для перорального введения, причем предпочтительно противовирусное эффективное количество составляет от 1 мкг до 12 мг на дозу, предпочтительно до любого из 5, 4, 3, 2 или 1 мг; или до 100 мкг на дозу.

В частности, можно использовать таблетку, содержащую соединение азеластина, которую можно вводить от одного до трех раз в сутки.

Составы, подходящие для местного введения во рту, включают пастилки, содержащие активный ингредиент в ароматизированной основе, такой как сахароза, гуммиарабик или трагакант, пастилки, содержащие соединение азеластина в инертной основе, такой как желатин и глицерин, сахароза или гуммиарабик, или полоскания для ротовой полости, содержащие соединение азеластина в подходящем жидком носителе.

При изготовлении в виде геля или мази для местного применения активные ингредиенты можно применять с парафиновой или смешиваемой с водой мазевой основой. В качестве альтернативы, активные ингредиенты могут быть изготовлены в виде крема с кремовой основой «масло-в-воде».

Составы, подходящие для местного введения в глаз, могут включать глазные капли, гель или крем, причем соединение азеластина растворено или суспендировано в подходящем носителе, в частности, в водном растворителе или эмульсии масло/вода.

В соответствии с конкретными примерами такие составы для местного введения во рту или местно применяемую форму, такую как гель или мазь, могут содержать соединение азеластина в концентрации, например, от 0,001 до 20% (масс./масс.), например, примерно 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 9 или 20% (масс./масс.).

В соответствии с конкретным аспектом лечение соединением азеластина можно комбинировать с дополнительным лечением путем введения соединения азеластина (которое может представлять собой такое же или другое соединение) в другой форме введения. Например, лечение с помощью интраназального или горлового спрея, содержащего гидрохлорид азеластина, можно комбинировать с таблеткой, содержащей соединение азеластина (которое может представлять собой гидрохлорид азеластина или может отличаться от гидрохлорида азеластина).

В соответствии с конкретным аспектом соединение азеластина вводят в качестве единственного противовирусного вещества, или при этом лечение комбинируют с дополнительным лечением, таким как дополнительное противовирусное, противовоспалительное и/или антибиотическое лечение, например, включающим введение одного или более противовирусных веществ или агентов, и/или одного или более противовоспалительных и/или антибиотических веществ или агентов, с помощью одного или более различных препаратов и/или одного или более различных путей введения.

В частности, соединение азеластина можно комбинировать с одним или более дополнительными активными терапевтическими агентами в единичной лекарственной форме для одновременного, совместного введения или последовательного введения субъекту. Комбинированную терапию, например, можно вводить в виде одновременного, параллельного или последовательного режима. При последовательном введении комбинация может быть введена в виде двух или более введений.

В соответствии с конкретным аспектом лечат субъекта, который был инфицирован или который подвержен риску инфицирования указанным вирусом, предпочтительно человека или млекопитающее, не являющееся человеком, такого как собака, кошка, лошадь, верблюдовые, крупный рогатый скот или свинья.

В частном варианте субъект подвергается или подвергался воздействию вируса, или иным образом подвергается риску инфицирования вирусом.

В частном варианте субъект имеет ослабленную иммунную систему и подвергается более высокому риску развития вирусного заболевания или повышенной тяжести вирусного заболевания.

В частном варианте у субъекта было установлено или диагностировано инфицирование вирусом.

Согласно конкретным вариантам реализации лечат субъекта, который является больным субъектом или пациентом, страдающим заболеванием, вызванным вирусом Coronaviridae, например, заболеванием, вызванным вирусом SARS, при контакте с патогеном, таким как COVID19, или пневмонией, связанной с COVID19.

Согласно дополнительным конкретным вариантам реализации лечат субъекта, который является больным субъектом или пациентом, страдающим заболеванием, вызванным вирусом гриппа, например, гриппом.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено соединение азеластина, описанное в настоящем документе, для применения в качестве противовирусного вещества в медицинском продукте для обработки биологической поверхности, чтобы предотвратить вирусную инфекцию и/или распространение вируса.

В соответствии с конкретным аспектом указанный медицинский продукт выполнен с возможностью местного применения, предпочтительно для применения в верхних и нижних дыхательных путях, назального, легочного, внутриротового, глазного или дермального применения.

Местное применение, как правило, относится к поверхности кожи, ране и/или слизистым клеткам или тканям (например, альвеолярной, буккальной, лингвальной, жевательной или назальной слизистой оболочке и т.д.).

В соответствии с конкретным аспектом указанный медицинский продукт применяют в составе, который подходящим образом используется для местного введения, в частности, для введения через слизистую оболочку, таком как спрей, раствор, дисперсия, сухой порошок или аэрозолированная жидкость или порошок.

В соответствии с конкретным аспектом соединение азеластина наносят на биологическую поверхность в противовирусном эффективном количестве, причем предпочтительно количество составляет от 1 нг до 1000 нг на см², предпочтительно 10-800 нг/см² или до любого из 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50 нг/см².

Любой из медицинских продуктов, который подходящим образом применяется для местного лечения, как описано в настоящем документе, можно применять для обработки биологической поверхности.

В соответствии с конкретным аспектом биологическая поверхность содержит или состоит из поверхности слизистой оболочки, которая инфицирована или подвержена риску инфицирования указанным вирусом.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложено применение соединения азеластина, описанного в настоящем документе, в качестве вирусного дезинфицирующего средства, в частности, подходящего для обработки биологической поверхности или небиологической поверхности, такой как санитарные устройства, маски для лица и т.д. В частности, дезинфицирующим средством можно обрабатывать живые или неживые поверхности.

В частности, вирусное дезинфицирующее средство представляет собой противовирусный препарат, такой как медицинский продукт.

В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения предложено соединение азеластина, описанное в настоящем документе, для применения при предотвращении или лечении вирусной инфекции Coronaviridae, в частности, инфекции вируса SARS, у человека или млекопитающего, отличного от человека.

В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения предложено соединение азеластина, описанное в настоящем документе, для применения при предотвращении или лечении вирусной инфекции Coronaviridae, в частности, инфекции вируса SARS, у человека или млекопитающего, отличного от человека.

В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения предложено соединение азеластина, описанное в настоящем документе, для применения при предотвращении или лечении вирусной инфекции Adenoviridae, в частности, инфекции вируса HAdVB, HAdVC или HAdVD у человека.

В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения предложено соединение азеластина, описанное в настоящем документе, для применения при предотвращении или лечении вирусной инфекции Paramyxoviridae, в частности, инфекции вируса РСВ человека, у человека.

В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения предложено соединение азеластина, описанное в настоящем документе, для применения при предотвращении или лечении вирусной инфекции Orthomyxoviridae, в частности, инфекции вируса гриппа, у человека или млекопитающего, не являющегося человеком.

В соответствии с конкретным аспектом предложен набор, который содержит одну или более отдельных единиц дозирования соединения азеластина, как дополнительно описано в настоящем документе, и инструкции по их применению при лечении вирусной инфекции Coronaviridae или заболевания, вызванного вирусом Coronaviridae, у человека или млекопитающего, не являющегося человеком.

В соответствии с другим конкретным аспектом предложен набор, который содержит одну или более отдельных единиц дозирования соединения азеластина, как дополнительно описано в настоящем документе, и инструкции по их применению при лечении вирусной инфекции Adenoviridae, в частности, инфекции вируса HAdVB, HAdVC или HAdVD, у человека.

В соответствии с другим конкретным аспектом предложен набор, который содержит одну или более отдельных единиц дозирования соединения азеластина, как дополнительно описано в настоящем документе, и инструкции по их применению при лечении вирусной инфекции Paramyxoviridae, в частности, инфекции вируса РСВ человека, у человека.

В соответствии с другим конкретным аспектом предложен набор, который содержит одну или более отдельных единиц дозирования соединения азеластина, как дополнительно описано в настоящем документе, и инструкции по их применению при лечении вирусной инфекции Orthomyxoviridae, в частности, инфекции вируса гриппа, у человека или млекопитающего, не являющегося человеком.

В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения предложен противовирусный фармацевтический препарат, содержащий соединение азеластина, как дополнительно описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В частности, фармацевтический препарат предложен для медицинского применения, в частности, для применения при профилактическом или терапевтическом лечении патологического состояния, вызванного вирусом Coronaviridae, таким как COVID19.

В частности, фармацевтический препарат предложен для медицинского применения, в частности, для применения при профилактическом или терапевтическом лечении патологического состояния, вызванного вирусом Coronaviridae и/или вирусом Adenoviridae и/или вирусом Paramyxoviridae и/или вирусом Orthomyxoviridae.

В соответствии с конкретным аспектом настоящего изобретения дополнительно предложены способы лечения субъекта, инфицированного или подверженного риску инфицирования одним или более различными вирусами, такими как один или более из вирусов Coronaviridae и/или вирусов Adenoviridae и/или вирусов Paramyxoviridae и/или вирусов Orthomyxoviridae, включающие введение противовирусного эффективного количества соединения азеластина и соответствующих медицинских продуктов или фармацевтических препаратов, как дополнительно описано в настоящем документе.

В соответствии с дополнительным конкретным аспектом настоящего изобретения предложен противовирусный препарат соединения азеластина, описанного в настоящем документе (такой как медицинский продукт, фармацевтический препарат или дезинфицирующее средство), и способы получения такого противовирусного препарата, включающие изготовление противовирусного эффективного количества соединения азеластина с фармацевтически приемлемым носителем с получением противовирусного препарата, в частности, медицинского продукта или фармацевтического препарата.

Местное нанесение любого из противовирусных препаратов, описанных в настоящем документе (такого как медицинский продукт, фармацевтический препарат или дезинфицирующее средство) на биологическую поверхность предпочтительно таково, что при определенном времени контакта, например, от 10 минут до 24 часов и/или до 24, 18, 12, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 часа, приведение в контакт приводит по меньшей мере к 0,5-кратному (наполовину) снижению или 1-log, 2-log, 3-log, 4-log, 5-log снижению количества вируса на указанной поверхности.

ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

На Фигуре 1 показана иллюстрация подхода на основе энтропии Шеннона для идентификации гомологов лекарственного средства с совпадающими профилями путей (А) и идентификации соответствующих путей SARS-CoV-2 (В). Профили путей были рассчитаны для гидроксихлорохина и ингибиторов SARS с четко определенными механизмами и способом действия: SSAA09E2, низкомолекулярный ингибитор АПФ-2, и SSAA09E3, общий ингибитор слияния мембран хозяина и вируса.

На Фигуре 2 показано предотвращение цитопатического эффекта SARS-CoV-2, вызванного в клетках Vero Е6, на основе изображений фазово-контрастной микроскопии. А: Неинфицированная (контрольная) культура; В: Клетки, инфицированные SARS-CoV-2; C-F: Клетки, инфицированные SARS-CoV-2, в присутствии повышающихся концентраций азеластина-HCl: 3,125, 6,25, 12,5 и 25 мкМ. Клетки инфицировали вирусом SARS-Co-V2 при MOI 0,1 в течение 30 мин, затем культуральную среду удаляли и заменяли свежей культуральной средой без вируса (но содержащей азеластин), и микроскопические фотографии получали через 48 часов после инфекции.

На Фигуре 3 показано снижение цитопатического эффекта SARS-CoV-2 на восстановленную назальную ткань человека (MucilAir). Назальную ткань человека инфицировали SARS-CoV-2, а затем обрабатывали 5-кратно разведенным 0,1% раствором назального спрея, содержащего азеластин-HCl, в течение 20 минут каждые 24 часа в течение 3 дней. На фигуре показано микроскопическое изображение с низким разрешением назальной ткани человека через 48 и 72 часа после инфекции. Выработка муцина (как признак интактной функции ткани) демонстрируется как присутствие темных пятен на ткани.

На Фигуре 4 (In vitro ингибирование инфекции SARS-CoV-2 В.1.351 и В.1.1.7 азеластином) показан эффект ингибирования азеластином инфекции клеток Vero-TMPRSS2/АПФ-2 вирусом SARS-CoV-2 В.1.351 (А) или В.1.1.7 (В). Клетки инфицировали вирусом SARS-CoV-2 при MOI 0,01 в течение 30 минут, азеластин добавляли к инфицированным клеткам либо непосредственно перед инфекцией (профилактическое условие), либо через 30 минут после инфекции (терапевтическое условие). Через 48 ч после инфекции число копий вируса определяли с помощью количественной ПЦР. Ингибирование инфекции выражается как число копий вируса относительно лунок, содержащих только вирус (без обработки азеластином). Графики показывают среднее и стандартное отклонение, рассчитанное на основании 9 (А) или 6 (B) отдельных значений. Концентрацию азеластина, ингибирующую 50% инфекции (ЭК50), рассчитывали с использованием нелинейной регрессии (1og(агонист) в сравнении с нормированным ответом - переменный наклон) с использованием GraphPad Prism 8.4.3.

Фигура 5: SEQ ID NO: 4 (номер доступа NCBI QII57161.1, S-белок SARS-CoV-2).

Фигура 6: Противовирусный эффект азеластина в 2 различных концентрациях, определенный в клетках человека Calu-3, инфицированных SARS-CoV-2 при MOI 0,01, а также цитотоксичность этих же концентраций соединения, измеренная на идентичных клетках без вирусной инфекции. График показывает средние значения результатов трех повторов одного типичного эксперимента.

Фигура 7: Жизнеспособность неинфицированных клеток Нер-2, обработанных указанным конечным диапазоном концентраций азеластина-HCl и соответственно разбавленного носителя ДМСО в течение 48 часов. Среднее значение и СОС были рассчитаны для 3 независимых экспериментов. Порог статистически значимой разницы был Р<0,05. ****Р<0,0001

Фигура 8: Противовирусный эффект азеластина-HCl в указанном конечном диапазоне концентраций на инфекцию РСВ клеток НЕр-2. Азеластин-HCl применяли до (А), одновременно (В) или после (С) вирусной инфекции, и репликацию оценивали путем визуализации клеток, инфицированных РСВ, как описано в тексте. ДМСО, растворитель исходного раствора азеластина-HCl, разбавляли соответственно для использования в качестве контроля.

Эксперименты повторяли дважды с двумя повторами. Планки представляют собой среднее значение со стандартной ошибкой среднего в виде планок погрешности.

На Фигуре 9 показано влияние двух различных концентраций азеластина-HCl, а также осельтамивира на число копий вируса, полученных из апикальных промывок восстановленных назальных тканей через 24 часа после инфекции вирусом гриппа H1N1. Статистически значимые различия отмечены звездочками. График показывает средние результаты трех повторов одного типичного эксперимента. *Р<0,05; **Р<0,01.

Фигура 10: Эффект двух различных концентраций азеластина, а также осельтамивира на уровни IL-8 (панель А) и RANTES (панель В), секретируемых восстановленными назальными тканями, которые были инфицированы вирусом гриппа H1N1. Статистически значимые различия отмечены звездочками. График показывает средние значения результатов трех повторов одного типичного эксперимента. **Р<0,01; **Р<0,001; ***Р<0,0001.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Термины «содержать», «состоять», «иметь» и «включать» в контексте настоящего документа могут быть использованы в качестве синонимов и должны пониматься как открытое определение, допускающее дополнительных членов или части, или элементы. «Состоящий» считается ближайшим определением без дополнительных элементов признака составного определения. Таким образом, термин «содержащий» является более широким и содержит определение «состоящий».

Термин «примерно» в контексте настоящего документа относится к одному и тому же значению или значению, отличающемуся на +/-10% или +/-5% от заданного значения.

Термин «соединение азеластина» в контексте настоящего документа относится к азеластину или его соли.

Молекулярная формула азеластина представляет собой C₂₂H₂₄ClN₃O со следующей химической структурой (I):

Название согласно IUPAC: 4-[(4-хлорфенил)метил]-2-(1-метилазепан-4-ил)фталазин-1-он.

Номер CAS: 58581-89-8.

Соль азеластина предпочтительно представляет собой фармацевтически приемлемую соль, такую как, например, гидрохлорид.

Гидрохлорид азеластина представляет собой гидрохлоридную солевую форму азеластина и применяется в качестве антигистаминного лекарственного соединения, изготовленного в виде дозированного распыляемого раствора для интраназального введения. Коммерческие продукты, содержащие гидрохлорид азеластина, представлены в виде назального спрея, содержащего 0,1% или 0,15% гидрохлорида азеластина Фарм. США в водном растворе при рН 6,8±0,3.

Гидрохлорид азеластина представляет собой белый или почти белый кристаллический порошок. Он умеренно растворим в воде и растворим в этаноле и дихлорметане.

Молекулярная формула: C₂₂H₂₅Cl₂N₃O.

Название согласно IUPAC: 4-[(4-хлорфенил)метил]-2-(1-метилазепан-4-ил)фталазин-1-он; гидрохлорид.

Номера CAS: 58581-89-8; 37932-96-0; 79307-93-0.

Выбор соли азеластина определяется в первую очередь тем, насколько кислотным или основным является химическое вещество (рН), безопасностью ионизированной формы, предполагаемым применением лекарственного средства, способом введения лекарственного средства (например, через рот, инъекцию или на кожу) и типом лекарственной формы (такой как таблетка, капсула или жидкость).

Термин «фармацевтически приемлемый», также упоминаемый как «фармакологически приемлемый», означает совместимый с лечением животных, в частности, человека. Термин «фармакологически приемлемая соль» включает как фармакологически приемлемые кислотно-аддитивные соли, так и фармакологически приемлемые основно-аддитивные соли.

Термин «фармакологически приемлемая кислотно-аддитивная соль» в контексте настоящего документа означает любую нетоксичную органическую или неорганическую соль любого основного соединения согласно настоящему изобретению или любого из его промежуточных соединений. Основные соединения согласно настоящему изобретению, которые могут образовывать кислотно-аддитивную соль, включают, например, соединения, которые содержат основный атом азота. Иллюстративные неорганические кислоты, которые образуют подходящие соли, включают соляную, бромистоводородную, серную и фосфорную кислоты, а также соли металлов, такие как моногидроортофосфат натрия и гидросульфат калия. Иллюстративные органические кислоты, которые образуют подходящие соли, включают моно-, ди- и трикарбоновые кислоты, такие как гликолевая, молочная, пировиноградная, малоновая, янтарная, глутаровая, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, малеиновая, бензойная, фенилуксусная, коричная и салициловая кислоты, а также сульфоновые кислоты, такие как п-толуолсульфоновая и метансульфоновая кислоты. Могут быть образованы моно-, ди- или трикислотные соли, и такие соли могут существовать в гидратированной, сольватированной или по существу безводной форме. В целом, кислотно-аддитивные соли соединений согласно настоящему изобретению более растворимы в воде и различных гидрофильных органических растворителях и обычно демонстрируют более высокие температуры плавления по сравнению с их формами свободных оснований. Специалисту в данной области техники будет известен выбор подходящей соли. Другие фармакологически неприемлемые кислотно-аддитивные соли, например, оксалаты, могут быть использованы, например, для выделения соединений согласно настоящему изобретению, для лабораторного применения или для последующего превращения в фармакологически приемлемую кислотно-аддитивную соль.

Термин «фармакологически приемлемая основная соль» в контексте настоящего документа означает любую нетоксичную органическую или неорганическую основно-аддитивную соль любого кислотного соединения согласно настоящему изобретению или любого из его промежуточных соединений, которые подходят или совместимы с лечением животных, в частности, человека. Кислотные соединения согласно настоящему изобретению, которые могут образовывать основно-аддитивную соль, включают, например, соединения, которые содержат карбоновую кислоту, сульфоновую кислоту, сульфиновую кислоту, сульфонамид, N-незамещенный тетразол, сложный эфир фосфорной кислоты или сложный эфир серной кислоты. Иллюстративные неорганические основания, которые образуют подходящие соли, включают гидроксид лития, натрия, калия, кальция, магния или бария. Иллюстративные органические основания, которые образуют подходящие соли, включают алифатические, алициклические или ароматические органические амины, такие как метиламин, триметиламин и пиколин или аммиак. Специалисту в данной области техники будет известен выбор подходящей соли. Другие фармакологически неприемлемые основно-аддитивные соли могут быть использованы, например, для выделения соединений согласно настоящему изобретению, для лабораторного применения или для последующего превращения в фармакологически приемлемую основно-аддитивную соль. Образование желаемой соли соединения достигается с использованием стандартных методик. Например, нейтральное соединение обрабатывают основанием в подходящем растворителе, а образовавшуюся соль выделяют фильтрацией, экстракцией или любым другим подходящим способом.

Термин «противовирусный» в контексте настоящего документа относится к любому веществу, лекарственному средству или препарату, которые влияют на биологию вируса и ослабляют или ингибируют вирусное присоединение, проникновение, репликацию, отделение, латентность или их комбинацию, что приводит к снижению вирусной нагрузки или инфекционности. Термины «ослабление», «ингибирование», «снижение» или «предотвращение» или любая вариация этих терминов при использовании в формуле изобретения и/или описании включает любое измеримое уменьшение или полное ингибирование для достижения желаемого результата, например, снижение риска вирусной инфекции (до воздействия) или снижение вирусной выживаемости, нагрузки или роста после воздействия.

Примерные противовирусные препараты, описанные в настоящем документе, представляют собой медицинские продукты, фармацевтические препараты или дезинфицирующие средства для применения in vivo, ex vivo или in vitro.

Термин «биологическая поверхность» в контексте настоящего документа должен относиться к поверхности, содержащей жизнеспособные клетки, такие как клетки млекопитающих (человека или животного, не являющегося человеком), включая, например, поверхность биологической ткани, такую как поверхность эпителиальной или дермальной ткани (например, кожи), ткани слизистой оболочки или ткани мембраны.

Термин «эффективное количество» в отношении противовирусного эффекта в контексте настоящего документа должен относиться к количеству (в частности, заранее определенному количеству), которое обладает доказанным противовирусным эффектом. Количество, как правило, представляет собой количество или активность, которая при нанесении на поверхность или введении субъекту приводит к достижению благоприятных или желаемых результатов, включая противовирусные или клинические результаты, и, как таковое, эффективное количество или его синоним зависит от контекста, в котором оно применяется.

Предполагается, что эффективное количество фармацевтического препарата или лекарственного средства означает такое количество соединения, которое является достаточным для лечения, предотвращения или ингибирования заболевания, патологического состояния или нарушения. Такая эффективная доза конкретно относится к такому количеству соединения, которого достаточно для заживления, предотвращения или облегчения состояний, связанных с заболеваниями или нарушениями, описанными в настоящем документе.

В контексте заболевания эффективные количества (в частности, профилактически или терапевтически эффективные количества) соединения азеластина, описанного в настоящем документе, конкретно применяют для лечения, модуляции, ослабления, обращения вспять или воздействия на заболевание или состояние, при котором будет получена польза от противовирусного эффекта. Количество соединения, которое будет соответствовать такому эффективному количеству, будет варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как конкретное лекарственное средство или соединение, состав, путь введения, тип заболевания или нарушения, особенностей субъекта или хозяина, которого лечат, оценки медицинских ситуаций и других соответствующих факторов, но тем не менее может быть рутинно определено специалистом в данной области техники.

Режим лечения или профилактики у субъекта с использованием эффективного количества соединения азеластина, описанного в настоящем документе, может состоять из однократного применения или введения или, в качестве альтернативы, может включать ряд применений и введений, соответственно. Например, соединение азеластина можно применять по меньшей мере один раз в месяц или по меньшей мере один раз в неделю, или по меньшей мере один раз в сутки. Однако в некоторых случаях острой фазы, например, при подозреваемом или подтвержденном воздействии вируса, или после определения вирусной инфекции, соединение азеластина можно применять чаще, например, 1-10 раз в сутки.

В частности, предложена комбинированная терапия, которая включает лечение препаратом, описанным в настоящем документе, и стандартную терапию заболевания, вызванного вирусом Coronaviridae, и/или стандартную терапию заболевания, вызванного любым из других вирусов-мишеней.

Дозы можно применять в комбинации с другими активными агентами, такими как противовирусные агенты, противовоспалительные лекарственные средства или антибиотики, например, при риске распространения вируса у субъекта, чтобы предотвратить реакцию, связанную с патогеном.

Лечение можно комбинировать с противовирусным, противовоспалительным или антибиотическим лечением, причем предпочтительно фармацевтический препарат вводят до, во время (например, путем совместного введения или параллельно) или после указанного противовирусного, противовоспалительного или антибиотического лечения.

В частности, соединение азеластина, описанное в настоящем документе, можно комбинировать с дополнительным противовирусным агентом, который может представлять собой соединение азеластина, например, то же самое или другое соединение. Конкретные варианты реализации относятся к дополнительным противовирусным агентам, выбранным из ингибитора АПФ-2, ингибитора ионного канала, образованного вирусным белком М2, ингибитора нейраминидазы, ингибитора репликации и трансляции РНК и ингибитора полимеразы. Противовирусный агент может представлять собой амантадин или римантадин. В частности, противовирусный агент может представлять собой осельтамивир, занамивир, перамивир, рибавирин, лопинавир или ритонавир. Конкретные дополнительные противовирусные примеры представляют собой те, которые подходящим образом применяют для обработки биологической поверхности, такие как каррагинан, или те, которые в настоящее время изучаются для лечения инфекций SARS-Cov2, такие как гидроксихлорохин или ремдесивир.

В частности, соединение азеластина комбинируют с противовоспалительным агентом, таким как стандартные стероидные противовоспалительные препараты, глюкокортикоиды и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП). Подходящие НПВП включают, но не ограничиваются ими, ибупрофен, напроксен, фенопрофен, кетопрофен, флурбипрофен, оксапрозин, индометацин, сулиндак, этодолак, кеторолак, диклофенак, набуметон, пироксикам, мелоксикам, теноксикам, дроксикам, лорноксикам, изоксикам, мефенамовую кислоту, меклофенамовую кислоту, флуфенамовую кислоту, толфенамовую кислоту и целекоксиб. Подходящие стероидные противовоспалительные агенты включают, но не ограничиваются ими, кортикостероиды, такие как синтетические глюкокортикоиды. Конкретные примеры представляют собой флутиказон, ингибиторы ЦОГ-2, ибупрофен, гидроксихлорохин, гепарин, низкомолекулярный гепарин, гирудин или иммунодепрессанты, такие как азатиоприн, циклоспорин А или циклофосфамид.

В частности, соединение азеластина комбинируют с антибиотиком, таким как бета-лактамный антибиотик, аминогликозидный антибиотик, ансамицин, карбацефем, карбапенем, цефалоспорин, гликопептид, линкозамид, липопептид, макролид, монобактам, нитрофуран, оксазолидинон, полипептид, сульфонамид, клофазимин, дапсон, капреомицин, циклосерин, этамбутол, этионамид, изониазид, пиразинамид, рифампицин, рифабутин, рифапентин, стрептомицин, арсфенамин, хлорамфеникол, фосфомицин, мупироцин, платензимицин, хинупристин/далфопристин, тиамфеникол, тигециклин, тинидазол, триметоприм, тейксобактин, малацидины, галицин, клиндамицин, ванкомицин, метронидазол, фузидиевая кислота, тиопептиды, фидаксомицин, хинолоны, тетрациклины, омадациклин, рифамицин, кибделомицин, оксазолидинон, кетолиды, тиазолиды, амиксицил, тейкопланин, рамопланин, оритаванцин, лантибиотики, капурамицин, суротомицин, турицин, эндолизин, авидоцин CD, кадазолид, рамизол, дефенсины, ридинилазол, среднецепочечные жирные кислоты, фаги, берберин, лактоферрин.

В частности, лечение соединением азеластина, описанным в настоящем документе, можно комбинировать с лечением, включающим введение по меньшей мере одного другого терапевтического агента, выбранного из группы, состоящей из кортикостероида, модулятора трансдукции противовоспалительного сигнала, бронходилататора-агониста 2-адренорецептора, антихолинергического средства, муколитического агента, гипертонического солевого раствора и других лекарственных средств для лечения вирусных инфекций Coronaviridae и/или инфекций, вызванных любым из других вирусов-мишеней, описанных в настоящем документе; или их смесей. Конкретные фармацевтические композиции, в частности, могут включать один или более противовоспалительных агентов и/или анальгетиков, агонистов PPAR-γ и модуляторов иммунного ответа.

Продолжительность периода лечения зависит от множества факторов, таких как тяжесть заболевания, является ли заболевание острым или хроническим, возраста пациента и концентрации соединения азеластина. Также следует понимать, что эффективная дозировка, применяемая для лечения или профилактики, может быть увеличена или снижена в ходе конкретного режима лечения или профилактики. Изменения дозировки могут являться результатом и могут стать очевидными с помощью стандартных диагностических анализов, известных в данной области техники.

В соответствии с конкретным аспектом медицинский продукт или фармацевтическая композиция, описанные в настоящем документе, содержат эффективное количество соединения азеластина, определенного в настоящем документе. Препарат, описанный в настоящем документе, может быть обеспечен для применения в виде однократных или многократных доз.

Могут быть использованы однодозовые или многодозовые контейнеры, например, запечатанные ампулы и флаконы или многоразовые спреи, и могут храниться, включая жидкую или сухую фазу, например, в сублимированном (лиофилизированном) состоянии, при котором необходимо только добавление стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Предпочтительные составы в виде единичных доз представляют собой те, которые содержат суточную дозу или часть единичной суточной дозы или многократные дозы соединения азеластина.

Термин «однократная доза» в контексте настоящего документа понимается следующим образом. Однократная доза или количество для однократного применения представляет собой количество, предусмотренное для введения, которое предназначено для применения у одного субъекта, такого как пациент, будь то человек или животное, для одного случая/процедуры/введения. Упаковки, содержащие однократную дозу, как правило, маркируются производителем как таковые. Под количеством однократной дозы конкретно понимают суточную дозу для индивидуума, такого как ребенок или взрослый, обеспечивающую эффективное количество.

Медицинский продукт или фармацевтическая композиция, описанные в настоящем документе, конкретно предложены в виде медицинского продукта или фармацевтической композиции для применения у человека или у животных. Под медицинскими продуктами понимаются вещества, которые применяют для лечения заболеваний, для облегчения жалоб или для предотвращения таких заболеваний или жалоб в первую очередь. Это определение применимо независимо от того, вводится ли медицинский продукт человеку или животным. Вещества могут действовать как в организме, так и на поверхности тела.

Медицинский продукт или фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, предпочтительно содержит одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и находится в фармацевтической форме, которая позволяет вводить активное фармацевтическое соединение с высокой биодоступностью. Подходящие вспомогательные вещества могут быть, например, на основе циклодекстринов. Подходящие составы могут включать, например, синтетические полимерные наночастицы, образованные из полимера, выбранного из группы, состоящей из акрилатов, метакрилатов, цианоакрилатов, акриламидов, полилактатов, полигликолятов, полиангидратов, полиортоэфиров, желатина, альбумина, полистиролов, поливинилов, полиакролеина, полиглутаральдегида и их производных, сополимеров и смесей.

Конкретные медицинский продукты или фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, содержат соединение азеластина и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в составе для медицинского или лечебного применения, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается перечисленными, буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант, и, в частности, физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер, декстрозу, глицерин, этанол и т.п.

Соединение азеластина в контексте настоящего документа может быть изготовлено с обычными носителями и вспомогательными веществами, которые будут выбраны в соответствии с обычной практикой.

Фармацевтически приемлемые носители обычно включают любые и все подходящие растворители, дисперсионные среды, покрытия, противовирусные, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и тому подобное, которые физиологически совместимы с противовирусным низкомолекулярным соединением или соответствующей композицией или комбинированным препаратом, описанным в настоящем документе.

В соответствии с конкретным аспектом соединение азеластина можно комбинировать с одним или более носителями, подходящими для желаемого пути введения. Соединение азеластина может быть смешано, например, с любым из лактозы, сахарозы, крахмала, сложных эфиров целлюлозы и алкановых кислот, стеариновой кислоты, талька, стеарата магния, оксида магния, натриевых и кальциевых солей фосфорной и серной кислот, гуммиарабика, желатина, альгината натрия, поливинилпирролидина, поливинилового спирта, и необязательно далее таблетировано или инкапсулировано для обычного введения. В качестве альтернативы, соединение азеластина может быть диспергировано или растворено в физиологическом растворе, воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, коллоидных растворах карбоксиметилцеллюлозы, этаноле, кукурузном масле, арахисовом масле, хлопковом масле, кунжутном масле, трагакантовой камеди и/или различных буферах. Другие носители, адъюванты и способы введения хорошо известны в области фармации. Носитель может включать материал с контролируемым высвобождением или материал, создающий временную задержку, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат по отдельности или с воском, или другие материалы, хорошо известные в данной области техники.

Соединения, описанные в настоящем документе, могут быть обеспечены в фармацевтических составах с контролируемым высвобождением («составы с контролируемым высвобождением»), в которых высвобождение соединения азеластина контролируется и регулируется для обеспечения менее частого дозирования или для улучшения фармакокинетического или токсического профиля данного активного ингредиента.

Фармацевтические композиции также могут быть покрыты обычными способами, обычно рН-зависимыми или зависимыми от времени покрытиями, так, что рассматриваемый агент высвобождается в желудочно-кишечном тракте в непосредственной близости от желаемого местного применения или в разное время для продления желаемого действия. Такие лекарственные формы обычно включают, но не ограничиваются перечисленными, одно или более из ацетата-фталата целлюлозы, поливинилацетатфталата, фталата гидроксипропилметилцеллюлозы, этилцеллюлозы, восков и шеллака.

Дополнительные фармацевтически приемлемые носители известны в данной области техники и описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22 пересмотренное издание (Allen Jr, LV, ed., Pharmaceutical Press, 2012). Жидкие составы могут представлять собой растворы, эмульсии или суспензии и могут включать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие агенты, солюбилизаторы, поверхностно-активные вещества, консерванты и хелатообразующие агенты.

Предпочтительный препарат находится в готовой к использованию, стабильной при хранении форме, со сроком хранения по меньшей мере один или два года.

Термин «состав» в контексте настоящего документа относится к препарату, готовому к использованию конкретным образом. В частности, композиции, описанные в настоящем документе, содержат соединение азеластина и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или вспомогательное вещество.

В соответствии с конкретным аспектом предложены составы, содержащие фармацевтически приемлемые носители для назального, внутрилегочного, перорального, местного, слизистого или парентерального введения. Введение также может быть внутрикожным или трансдермальным. Кроме того, настоящее изобретение включает такие соединения, которые были лиофилизированы и которые могут быть восстановлены с образованием фармацевтически приемлемых составов для введения.

Конкретные медицинские продукты или фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, изготовлены для интраназального введения или другим местным путем, например, на биологические поверхности, включая, например, слизистую оболочку или кожу. Фармацевтические носители, подходящие для облегчения таких путей введения, хорошо известны в данной области техники.

В частности, можно использовать назальный спрей, содержащий 0,001% или 0,15% (масс./масс.) соединения азеластина в водном растворе при рН 6,8±0,3, необязательно дополнительно содержащий любой один или более из моногидрата лимонной кислоты, додекагидрата гидрофосфата натрия, эдетата динатрия, гипромеллозы, очищенной воды, хлорида натрия и консерванта, такого как хлорид бензалкония.

Для введения соединения азеластина любым путем, отличным от парентерального введения, может потребоваться покрытие активного агента материалом для предотвращения его инактивации или совместное введение активного агента с ним. Например, можно применять подходящий носитель, например, липосомы или разбавитель. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы.

Соединение азеластина можно вводить перорально, например, с помощью инертного разбавителя или усваиваемого или съедобного носителя. Например, препарат может быть заключен в желатиновую капсулу с твердой или мягкой оболочкой или спрессован в таблетки. Для перорального терапевтического введения соединение азеластина может быть включено со вспомогательными веществами и может применяться в форме проглатываемых таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, пластинок и тому подобного. Процентное содержание соединения в композициях и препаратах, безусловно, может варьироваться. Количество соединения азеластина в таких терапевтически пригодных композициях таково, что будет получена подходящая дозировка.

Таблетки будут содержать вспомогательные вещества, вещества, способствующие скольжению, наполнители, связывающие агенты, разрыхлители, смазывающие вещества, ароматизаторы и тому подобное. Гранулы могут быть получены с использованием изомальтозы. Кроме того, предпочтительно обеспечивается препарат, изготовленный для действия в участке слизистой оболочки, например, в участках слизистых оболочек (таких как нос, рот, глаза, пищевод, горло, легкие), например, локально без системного действия. Водные составы готовят в стерильной форме, и, если они предназначены для доставки путем, отличным от перорального, они обычно будут изотоническими.

Термин «мукозальный» в отношении введения или применения или иного случая мукозального применения препарата для лечения субъекта или соответствующего состава относится к введению через мукозальный путь, включая системное или местное введение, причем активный ингредиент поглощается при контакте с поверхностями слизистой оболочки. Это включает назальное, легочное, оральное или пероральное введение и составы, например, жидкость, сироп, пастилку, глазные капли, таблетку, спрей, порошок, растворимый порошок, гранулы, капсулы, крем, гель, капли, суспензию или эмульсию.

Пероральные составы могут включать жидкие растворы, эмульсии, суспензии и тому подобное. Фармацевтически приемлемые носители, пригодные для получения таких композиций, хорошо известны в данной области техники. Типичные компоненты носителей для сиропов, эликсиров, эмульсий и суспензий включают этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, жидкую сахарозу, сорбит и воду. Для суспензии типичные суспендирующие агенты включают метил целлюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу, трагакант и альгинат натрия; типичные смачивающие агенты включают лецитин и полисорбат 80; и типичные консерванты включают метилпарабен и бензоат натрия. Пероральные жидкие композиции также могут содержать один или более компонентов, таких как подсластители, вкусоароматические агенты и красители, описанные выше.

Другие композиции, которые можно применять для обеспечения системной доставки соединения азеластина или соответствующих препаратов, включают сублингвальные, буккальные и назальные лекарственные формы. Такие композиции, как правило, содержат одно или более растворимых наполняющих веществ, таких как сахароза, сорбит и маннит; и связывающие агенты, такие как гуммиарабик, микрокристаллическая целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и гидроксипропилметилцеллюлоза, или вещества, способствующие скольжению, смазывающие вещества, подсластители, красители, антиоксиданты и вкусоароматические агенты.

Соединение азеластина или соответствующие препараты также можно вводить субъекту местно, например, путем непосредственного нанесения на эпидермальную или эпителиальную ткань субъекта или распределения по ним композиции, содержащей указанное соединение, или трансдермально через «пластырь». Такие композиции включают, например, лосьоны, кремы, растворы, гели и твердые вещества. Указанные композиции для местного применения могут содержать эффективное количество, обычно по меньшей мере примерно 0,001% по массе или даже от примерно 0,1% по массе до 5% по массе или от 1% по массе до примерно 5% по массе соединения азеластина. Подходящие носители для местного введения, как правило, остаются на месте на коже в виде сплошной пленки и устойчивы к удалению при потоотделении или погружении в воду. Обычно носитель является органическим по своей природе и способен диспергировать или растворять в себе терапевтический агент. Носитель может включать фармацевтически приемлемые смягчающие агенты, эмульгаторы, загущающие агенты, растворители и тому подобное.

Фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (в частности, если соединения или фармацевтически приемлемые соли являются водорастворимыми) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций для немедленного применения. В частности, композиция является, в частности, стерильной и жидкой настолько, что обеспечивает простое введение через шприц; она стабильна в условиях изготовления и хранения и защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки.

Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются указанными, любые неиммуногенные фармацевтические адъюванты, подходящие для перорального, парентерального, назального, мукозального, трансдермального, внутрисосудистого (в/в), внутриартериального (в/а), внутримышечного (в/м) и подкожного (п/к) путей введения, такие как фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ).

Термин «субъект» в контексте настоящего документа относится к теплокровному млекопитающему, в частности, человеку или животному, не являющемуся человеком, включая, например, собак, кошек, кроликов, лошадей, крупный рогатый скот и свиней. В частности, лечение и медицинское применение, описанное в настоящем документе, относится к субъекту, нуждающемуся в профилактике или терапии патологического состояния, связанного с вирусной инфекцией Coronaviridae и/или инфекцией любым из других вирусов-мишеней, описанных в настоящем документе. В частности, лечение может быть осуществлено путем вмешательства в патогенез патологического состояния, при котором вирус Coronaviridae и/или вирус Adenoviridae и/или вирус Paramyxoviridae и/или вирус Orthomyxoviridae является причинным агентом состояния. Субъект может представлять собой пациента, подверженного риску такого патологического состояния или страдающего заболеванием. В частности, субъект может иметь ослабленную иммунную систему или существующее респираторное или сердечное заболевание, которое с большей вероятностью, чем другие, увеличивает риск заболевания или тяжесть заболевания.

Термин «подверженный риску» определенных патологических состояний относится к субъекту, у которого потенциально разовьется такое патологическое состояние, например, вследствие определенной предрасположенности, воздействия вируса или инфицированных вирусом субъектов, или который уже страдает таким патологическим состоянием на различных стадиях, в частности, связанным с другими причинными патологическими состояниями или другими состояниями или осложнениями, возникающими как последствие вирусной инфекции. Определение риска особенно важно у субъекта, у которого заболевание еще не диагностировано. Таким образом, это определение риска включает раннюю диагностику для обеспечения профилактической терапии. В частности, соединение азеластина применяют у субъектов с высоким риском, например, высокой вероятностью развития заболевания.

Термин «пациент» включает человека и других субъектов-млекопитающих, которые получают либо профилактическое, либо терапевтическое лечение. Термин «пациент» в контексте настоящего документа всегда включает здоровых субъектов. Термин «лечение», таким образом, подразумевает как профилактическое, так и терапевтическое лечение.

В частности, термин «профилактика» относится к предупредительным мерам и предназначен для включения предотвращения начала патогенеза или профилактических мер для снижения риска патогенеза.

Термин «терапия» в контексте настоящего документа в отношении лечения субъектов относится к медицинскому лечению субъекта с целью излечения, уменьшения, стабилизации, снижения частоты возникновения или предотвращения заболевания, патологического состояния или нарушения, которые по отдельности или вместе понимаются как «патологическое состояние». Термин включает активное лечение, направленное конкретно на улучшение патологического состояния, профилактику, направленную конкретно на предотвращение патологического состояния, а также включает причинно-следственное лечение, направленное на устранение причины связанного патологического состояния. Кроме того, этот термин включает паллиативное лечение, предназначенное для облегчения симптомов, а не для излечения патологического состояния, и дополнительное излечение патологического состояния, направленное на минимизацию или частичное или полное ингибирование развития связанного патологического состояния, и поддерживающее лечение, применяемое для дополнения другой конкретной терапии, направленной на улучшение связанного патологического состояния.

Приведенное выше описание будет более понятным со ссылкой на следующие примеры. Однако такие примеры являются лишь типичными для способов реализации одного или более вариантов реализации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Идентификация противовирусного лекарственного средства

Развитие математических представлений о малых молекулах (лекарственных средствах) является областью исследований, представляющей огромную ценность для современных фармацевтических исследований, и поэтому были разработаны многочисленные молекулярные дескрипторы, в которых используются 2-мерные и/или 3-мерные особенности химических структур. Эти дескрипторы были очень ценными при оценке количественных зависимостей структура-активность. В частности, оказалось, что атомоцентрированные пары признаков имеют большое значение для программ открытия лекарственных средств, поскольку они обеспечивают рентабельные подходы к высокопроизводительному анализу зависимости структура-активность, выбору соединения, виртуальному химическому скринингу и фармакологическому профилированию. Один из широко используемых химических дескрипторов называется SHED - дескриптор энтропии Шеннона (1). В этом подходе топологические распределения атомоцентрированных пар признаков количественно определены на основе теории информации (энтропия Шеннона). Конкретное преимущество заключается в том, что химически различные, но топологически родственные химические каркасы могут быть идентифицированы с использованием подхода SHED.

Для идентификации новых противовирусных лекарственных средств использовали стратегию идентификации лекарственных средств, основанную на стратегии вмешательства на основе биохимического пути. Клинически одобренные лекарственные средства, которые соответствуют заранее определенному механистическому профилю (способу действия), идентифицировали как кандидатные противовирусные лекарственные средства с использованием основанного на энтропии Шеннона описания характерных химических признаков малых молекул (лекарственных средств). Обоснование этого подхода заключается в том, что лиганды со сходными векторами энтропии Шеннона будут связываться со сходными белковыми мишенями.

В данном случае использовали базу данных DRUGBANK (2), хранилище одобренных лекарственных средств и их экспериментально проверенных белковых мишеней. Сходство лекарственных средств оценивали путем расчета евклидовых расстояний (0,25 брали в качестве значения отсечки).

В качестве отправной точки для анализа извлекали имеющуюся механистическую информацию об инфекции SARS-CoV-2 из недавнего биоинформатического анализа (3) вместе с анализом некоторых запрашиваемых антивирусных соединений. Профили путей запрашиваемых противовирусных соединений с известной активностью против SARS-CoV2 (гидроксихлорохин (RS)-2-[{4-[(7-хлор-4-хинолинил)амино]пентил}(этил)амино]этанол; SSAA09E2 {N-[[4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]метил]-1,2-оксазол-5-карбоксамид}; и SSAA09E3 [N-(9,10-диоксо-9,10-дигидроантрацен-2-ил)бензамид]) предсказывали с использованием подхода на основе энтропии Шеннона и, что интересно, показали значительное взаимное перекрытие.

Во-вторых, были предсказаны профили путей для ингибиторов SARS с четко определенными механизмами и способом действия: SSAA09E2, низкомолекулярный ингибитор АПФ-2, и SSAA09E3, общий ингибитор слияния мембран хозяина и вируса (4). Было обнаружено, что оба ингибитора имеют значительное число общих путей с гидроксихлорохином. Подытоживая, анализ показал, что в инфекцию SARS-CoV-2 вовлечены сходные пути, которые являются мишенями гидроксихлорохина и затрагиваются ингибиторами с четко определенными механизмами. Таким образом, был сделан вывод, что эти пути имеют большое значение для противовирусной активности и могут служить основой для перепрофилирования нового лекарственного средства на противовирусную активность путем поиска клинически одобренных лекарственных средств, о которых ранее не было известно, что они обладают противовирусной активностью с соответствующими профилями путей.

Изучали клинически одобренные лекарственные средства на предмет совпадения индивидуальных профилей путей. Предсказанные профили путей, полученные для различных запрошенных соединений (гидроксихлорохин, SSAA09E2 и SSAA09E3), использовали для скрининга базы данных SELLECKCHEM одобренных (и коммерчески доступных) лекарственных средств. Обоснование для отбора кандидатов было основано на одновременном появлении одобренных лекарственных средств в различных (предсказанных) наборах данных. Гидроксихлорохин и SSAA09E2 (ингибитор АПФ-2) показали значительное перекрытие друг с другом и с лекарственными средствами, полученными с профилем пути SARS-CoV-2. После исключения лекарственных средств на основании химического состава два одобренных лекарственных средства отобрали в качестве кандидатных противовирусных препаратов для дальнейшего тестирования в модели инфекции SARS-CoV-2 in vitro: азеластин и маравирок.

Список литературы

(1) Gregori-Puigjane, Е. and Mestres, J. SHED: Shannon Entropy Descriptors from Topological Feature Distributions. J. Chem. Inf. Model. 46, 1615-1622 (2006)

(2) Wishart, DS., Knox, C., Guo, AC:, Cheng, D., Shrivastava, S., Tzur, D., Gautam, B. and Hassanali, M. DrugBank: a knowledgebase for drugs, drug action and drug targets. Nucleic Acids Res. D901-D906, (2008)

(3) Zhou, Y, Hou, Y., Shen, J, Huang, Y., Martin, W. and Cheng, F. Network-based drug repurposing for novel coronavirus 2019-nCoV/SARS-CoV-2. Cell Discovery 6,14-32, (2020)

(4) Adedeji, AO., Severson, W., Jonsson, C., Singh, K., Weiss SR. and Sarafanos, SG. Novel Inhibitors of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Entry That Act by Three Distinct Mechanisms. J Virol. 87, 8017-8028, (2013).

Пример 2: Предотвращение инфекции вирусом SARS-CoV-2 клеток Vero Е6

Чтобы детектировать эффект азеластина-HCl на инфекцию SARS-CoV-2 клетки Vero Е6 (почки обезьяны), экспрессирующие АПФ-2, инфицировали SARS-CoV-2 в отсутствие или в присутствии азеластина-HCl, и цитопатогенный эффект оценивали путем микроскопического исследования клеток.

Методика эксперимента:

Клетки Vero Е6 (АТСС CRL-1586) высевали на 96-луночные планшеты. Через 2 дня клеточные культуры достигли конфлюентности и образовали однородный монослой. Клетки питали свежей культуральной средой (DMEM+ФБС?). Азеластин-HCl (Seleckchem, №по каталогу S2552, 10 мМ исходный раствор, растворенный в ДМСО) и маравирок (Seleckchem, №по каталогу S2003, 10 мМ исходный раствор, растворенный в ДМСО), противовирусный агент против ВИЧ, добавляли к среде для культивирования клеток в конечных концентрациях 50, 25, 12,5, 6,25 и 3,125 мкМ (разведения готовили в культуральной среде). Для вирусной инфекции вирус SARS-CoV-2 (hCoV-19/Hungary/SRC_isolate_2/2020, идентификационный номер доступа: EPI_ISL_483637) добавляли к супернатанту при MOI 0,1 (множественность инфекции: 1 вирусная частица на 10 клеток) сразу после замены культуральной среды (по сути одновременно). Исходную суспензию вируса получали путем размножения в клетках Vero Е6 и определяли инфекционный титр. После 30-минутной инкубации с вирусом культуральную среду удаляли и заменяли свежей культуральной средой, содержащей азеластин-HCl или маравирок в указанных выше концентрациях (совместное введение: моделирование предотвращения). Эксперименты также выполняли с азеластином в условиях, при которых лекарственное средство вводили только после 30-минутной инкубации с вирусом, но не в течение этого периода (постинфекционное введение: после воздействия/терапевтическое условие). Через 48 часов после инфекции клетки оценивали с помощью микроскопического наблюдения, а затем супернатанты собирали и хранили при -80°С для количественного анализа методом ПЦР. Вирусную РНК экстрагировали из образцов культурального супернатанта с помощью препаративного мининабора для выделения общей РНК Monarch (New England BioLabs, №по каталогу T2010S) в соответствии с инструкциями производителя. В общих чертах, 300 мкл буфера для лизиса смешивали с 100 мкл культурального супернатанта, загрязнение гДНК удаляли с помощью выделенной колонки (удерживающей ДНК), и проточную фракцию, содержащую РНК, наносили на РНК-связывающую колонку. После промывки колонки РНК элюировали Н₂О и образцы хранили при -80°С до анализа. После реакции обратной транскрипции ДНК амплифицировали с праймерами F, R и Р2 из гена RdRp

Использованные праймеры и зонды были специфичными для гена RdRp SARS-CoV-2:

Обратный праймер: CARATGTTAAASACACTATTAGCATA (SEQ ID NO: 1),

Прямой праймер: GTGARATGGTCATGTGTGGCGG (SEQ ID NO: 2),

Зонд: FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BBQ (SEQ ID NO: 3).

Использовали набор для капельной ПЦР (BioRad ddPCR™, Bio-Rad Laboratories GmbH, Германия). Результаты реакции ОТ-ПЦР количественно определяли и рассчитывали как вирусные частицы/мкл.

Результаты:

Конфлюентный однородный слой клеток (неинфицированных, Фиг. 2А) разрушается и появляются «дыры», указывающие на гибель клеток из-за вируса (Фиг. 2В). В присутствии азеластина-HCl во всех протестированных концентрациях инфицированные SARS-CoV-2 клетки были в значительной степени защищены от гибели, что свидетельствовало о непосредственном противовирусном эффекте (Фиг. 2C-F). Маравирок вообще не был эффективен при более низких концентрациях, и даже более высокие концентрации (от 12,5 до 50 мкМ) имели только незначительный защитный эффекте высокими оценками цитопатогенности (Таблица 1). Азеластин неожиданно оказался эффективным противовирусным веществом, которое по меньшей мере также эффективно, как и гидроксихлорохин.

Эти данные свидетельствуют о том, что соединение азеластина смогло остановить инфекцию SARS-CoV-2 немедленно после внесения к клеткам. Поскольку вирус должен проникать в клетки для репликации и распространения по организму, ожидается, что азеластин предотвратит COVID-19 прямо в том месте, где вирус инфицирует организм человека - на поверхности слизистой оболочки дыхательных путей.

Оценки:

0: без цитопатического эффекта (ЦПЭ), клетки оказались такими же, как в неинфицированном контроле

1: очень небольшие участки показали низкий уровень ЦПЭ

2: ЦПЭ наблюдали на небольших участках клеточной культуры

3: более сильный ЦПЭ, но не такой сильный, как в инфицированном контроле

4: ЦПЭ так же силен, как и в инфицированном контроле.

Количественный анализ методом ПЦР показал, что азеластин высокоэффективно уменьшал число вирусных частиц как при совместном введении (моделирование предотвращения) до >99%, так и до >97% в условиях введения после инфекции (моделирование условия после воздействия или терапии) (Таблица 2), это позволяет предположить, что азеластин можно применять как в профилактических, так и в терапевтических условиях. Как и ожидалось, совместное введение является более эффективным, но низкое число вирусных частиц при концентрации азеластина 25 мкМ демонстрирует, что текущую инфекцию можно остановить, а не только предотвратить.

Числа представляют собой медианные значения до 5 повторных образцов/концентрацию с 2-3 техническими повторами (количественная ПЦР, повторяемая из того же биологического образца).

Пример 3: Эффективность против вирусной инфекции SARS-CoV-2 восстановленной назальной ткани человека

Чтобы подтвердить эффективность азеластина-HCl против SARS-CoV2 на клетках человека, восстановленную трехмерную назальную ткань человека (MucilAir, трехмерный эпителий дыхательных путей человека, восстановленный in vitro) инфицировали SARS-CoV-2 и обрабатывали коммерческим назальным спреем, содержащим азеластин. Цитопатогенный эффект оценивали с помощью микроскопического исследования ткани, и число вирусных частиц определяли с помощью капельной ПЦР.

Методика эксперимента:

Назальную ткань человека MucilAir, полученную от здоровых доноров (Epithelix Sàri (Женева, Швейцария), №по каталогу: ЕР02МР), инфицировали SARS-CoV-2 (вирус SARS-CoV-2, hCoV-19/Hungary/SRC_isolate_2/2020, идентификационный номер доступа: EPI_ISL_483637) при множественности инфекции (MOI) 0,01 на апикальной стороне. После 20 мин инкубации при 37°С в 5% СО₂ среду, содержащую вирус, полностью удаляли. Затем 5-кратно разбавленный (в культуральной среде MucilAir) раствор назального спрея аллергодил (Allergodil) (0,1% азеластин-HCl, Mylan) добавляли на апикальную сторону (в 200 мкл объема) на 20 мин. После обработки разбавленный назальный спрей полностью удаляли с поверхности клеток для обеспечения границы раздела жидкость-воздух и инкубировали в течение 24 часов. 20-минутную обработку разбавленным аллергодилом повторяли через 24 и 48 часов после инфекции (часы после инфекции). Через 24, 48 и 72 часа после инфекции апикальные стороны клеток промывали в течение 15 мин культуральной средой MucilAir и собирали раствор для количественного определения инфекционных вирусных частиц. Клетки также были осмотрены под инвертированным микроскопом через 48 и 72 часа после инфекции.

Общую РНК экстрагировали из апикальных промывок (100 мкл) с использованием препаративного мининабора для выделения общей РНК Monarch (Promega, №по каталогу: T2010S) в соответствии с инструкциями производителя. Как описано в Примере 2, для количественного определения числа копий вируса применяли технологию цифровой капельной ПЦР (Bio-Rad Laboratories Inc. Система для цифровой капельной ПЦР QX200).

Результаты:

Микроскопический анализ тканей через 48 и 72 часа выявил снижение выработки муцина в инфицированных клетках, наблюдаемое как полное отсутствие черных пятен на микроскопическом изображении, по сравнению с контрольными клетками (отсутствие обработки вирусом или лекарственным средством, большое количество черного материала, наблюдаемое над клетками) (Фигура 3). Важно отметить, что продукция муцина, продемонстрированная присутствием черного материала на микроскопическом изображении, четко продемонстрирована в присутствии 5-кратно разбавленного аллергодила и сопоставима с таковой, наблюдаемой в отрицательном контроле (отсутствие обработки вирусом или лекарственным средством). Различий в морфологии тканей не было обнаружено ни в контрольных, ни и обработанных азеластином клетках (без вирусной инфекции), и во всех тканях было обнаружено цилиальное движение.

Анализ с помощью цифровой капельной ПЦР подтвердил эффективную инфекцию SARS-CoV-2 и быструю репликацию вируса, которая достигла нескольких тысяч копий на микролитр к 72 часам после инфекции в апикальном компартменте тканевых вставок. 5-кратно разбавленный назальный спрей (0,02% азеластина HCl), используемый ежедневно в течение 20 минут, существенно уменьшал число вирусных частиц через 48 и 72 часа после инфекции (ингибирование >99,9%) (Таблица 3).

Пример 4: Демонстрация in vitro эффективности азеластина против вызывающих озабоченность вариантов SARS-CoV-2 В.1.1.7 и В.1.351

Для детектирования противовирусного эффекта азеластина-HCl на варианты вируса SARS-CoV-2 клеточную линию Vero (почки обезьяны), экспрессирующую АПФ-2 и TMPRSS2, инфицировали вариантами В.1.1.7 и В.1.351, вызывающими озабоченность, в отсутствие или в присутствии азеластина-HCl, и эффект на распространение вируса оценивали с помощью количественной ПЦР.

Методика эксперимента:

Анализ инфекции SARS-CoV-2 с использованием Vero-TMPRSS2/АПФ-2 Клетки Vero, стабильно сверхэкспрессирующие человеческую сериновую протеазу TMPRSS2 и рецептор АПФ-2 (Riepler et al., Comparison of Four SARS-CoV-2 Neutralization Assays. Vaccines (Basel), 2020;9(1):13), высевали на 96-луночные планшеты по 10⁴/лунку за день до инфекции. Гидрохлорид азеластина (Sigma-Aldrich, PHR1636-1G, № партии LRAC4832), растворенный в ДМСО до концентрации 10 мМ, разбавляли модифицированной Дульбекко средой Игла (Merck, Дармштадт, Германия), содержащей 2% ФБС, до конечных концентраций в диапазоне от 50 мкМ до 0,4 мкМ (2-кратные серийные разведения). Перед инфекцией клеток супернатант клеточной культуры аспирировали и заменяли 50 мкл разведений азеластина-HCl в профилактическом условии (совместное введение) и 50 мкл среды в постинфекционном условии. Для каждой концентрации азеластина выполняли измерения с тремя повторами. Затем клетки инфицировали изолятами SARS-CoV-2, принадлежащими либо к типу В.1.1.7, либо к типу В.1.351, при MOI 0,01 в течение 30 минут при 37°С. Для обоих экспериментальных условий супернатант затем аспирировали и заменяли 50 мкл свежей среды и 50 мкл тех же концентраций азеластина, которые использовались ранее, в результате чего концентрации азеластина находились в диапазоне от 25 мкМ до 0,2 мкМ. Через 48 часов после инфекции оценивали цитопатический эффект и смешивали супернатант в соотношении 1:1 с буфером DLR (0,5% IGEPAL, 25 мМ NaCl в 10 мМ буфере Tris-HCl, 15 мкл ингибитора РНКазы RiboLock (ThermoScientific, 40 Ед/мкл, ЕО0381 на мл буфера DLR) для выделения вирусной РНК. Копии генома SARS-CoV-2 количественно определяли с помощью кПЦР с использованием специфичных для гена Е праймеров (5' АСА GGT ACG ТТА АТА GTT ААТ AGC GT 3' (SEQ ID NO: 5) и 5' ATA TTG CAG CAG ТАС GCA САС A3' (SEQ ID NO: 6)), FAM-меченого зонда (FAM-ACA СТА GCC АТС СТТ ACT GCG СТТ CG-BHQ1 (SEQ ID NO: 7)) и одностадийного набора универсальных зондов iTaq (BioRad, №по каталогу 1725141). Для количественной оценки результатов кПЦР использовали полученный собственными силами стандарт транскрибируемой in vitro РНК (ген Е SARS-CoV-2). Лунки, содержащие только вирус без обработки азеластином, устанавливали как 100%, и для каждого образца рассчитывали процент ингибирования относительно лунок, содержащих только вирус.

Результаты

Количественный анализ методом ПЦР показал, что азеластин высокоэффективно уменьшал число вирусных частиц как в профилактических (совместное введение), так и постинфекционных (моделирование условий после воздействия или терапии) условиях введения (Таблицы 4 и 5 и Фигура 4). Сходно с результатами для вируса дикого типа совместное введение является несколько более эффективным, но низкое число вирусных частиц (более 90% ингибирования) при концентрации азеластина 12,5 мкМ демонстрирует, что текущую инфекцию можно не только остановить, но и предотвратить. Эффективная концентрация азеластина, необходимая для ингибирования 50% инфекции (ЭК50), составляла от 4 до 6,5 мкМ в зависимости от условий и мутации вируса, она находится в диапазоне ЭК50, наблюдаемой для вируса дикого типа (~6 мкМ). Это демонстрирует, что эффективность азеластина против SARS-CoV-2 не зависит от появляющихся мутаций с высоким риском.

Заключение:

Эти данные свидетельствуют о том, что соединение азеластина смогло остановить инфекцию мутантами SARS-CoV-2 В.1.351 и В.1.1.7 немедленно после внесения к клеткам. Поскольку вирус должен проникать в клетки для репликации и распространения по организму, ожидается, что азеластин предотвратит COVID-19 прямо в том месте, где вирус инфицирует организм человека - на поверхности слизистой оболочки дыхательных путей.

Пример 5: Предотвращение инфекции вирусом SARS-CoV-2 клеток Calu-3

Для подтверждения противовирусного эффекта азеластина-HCl на клетки, экспрессирующие поверхностную протеазу TMPRSS2, клеточную линию аденокарциномы легкого человека Calu-3 инфицировали SARS-CoV-2 в отсутствие или в присутствии азеластина-HCl и через 48 часов измеряли число вирусных частиц.

Методика эксперимента:

Calu-3 (АТСС® НТВ-55™) высевали на 96-луночные планшеты. Через 2 дня, когда клетки достигли конфлюентности, культуры питали свежей средой для культивирования клеток (ЕМЕМ+10%ФБС+1% P/S, 1% L-глутамина, 1% заменимых аминокислот). Азеластин-HCl (Seleckchem, № по каталогу S2552, 10 мМ исходный раствор, растворенный в ДМСО) и сульфат гидроксихлорохина (TCl, № по каталогу Н1306, 10 мМ исходный раствор, растворенный в Н₂О и стерильно отфильтрованный) добавляли в среду для культивирования клеток в конечных концентрациях 50 и 25 мкМ (разведения готовили в культуральной среде). Сульфат гидроксихлорохина вызывает сильный эффект, направленный против SARS-CoV-2, на клетках Vero Е6 (не экспрессирующих TMPRSS2), но значительно теряет свою эффективность при тестировании на клетках, экспрессирующих поверхностную протеазу TMPRSS2, включая клетки Calu-3 (см. Hoffmann et al. Nature 2020, 585:588-590).

Исходную суспензию вируса получали путем размножения в клетках Vero Е6 и определяли инфекционный титр. Для вирусной инфекции вирус SARS-CoV-2 добавляли к супернатанту при MOI 0,01 (множественность инфекции: 1 вирусная частица на 100 клеток) сразу после замены культуральной среды (по сути одновременно). После 30-минутной инкубации с вирусом культуральную среду удаляли и заменяли свежей культуральной средой, содержащей азеластин-HCl или сульфат гидроксихлорохина в указанных выше концентрациях. Через 48 часов после инфекции супернатанты собирали и хранили при -80°С для количественного анализа методом ПЦР. Вирусную РНК экстрагировали из образцов культурального супернатанта с помощью препаративного мининабора для выделения общей РНК Monarch (New England BioLabs, № по каталогу T2010S) в соответствии с инструкциями производителя. В общих чертах, 300 мкл буфера для лизиса смешивали с 100 мкл культурального супернатанта, загрязнение гДНК удаляли с помощью выделенной колонки (удерживающей ДНК), и проточную фракцию, содержащую РНК, наносили на РНК-связывающую колонку. После промывки колонки РНК элюировали Н₂О и образцы хранили при температуре -80°С до анализа. После реакции обратной транскрипции ДНК амплифицировали с праймерами F, R и Р2 из гена RdRp с использованием одностадийного усовершенствованного набора ОТ-цкПЦР для зондов (BioRad ddPCR™, № по каталогу 1864021 и 1864022, https://www.bio-rad.com/de-at/product/1-step-rt-ddpcr-advanced-kit-for-probes?ID=NTGCRI15).

Результаты реакции ОТ-ПЦР количественно определяли и рассчитывали как число копий вируса/мкл и сравнивали с числом копий, измеренным в инфицированных клетках с имитационной обработкой (буфер) (положительный контроль).

Одновременно измеряли клеточную выживаемость на неинфицированных клетках Calu-3, обработанных азеластином-HCl или сульфатом гидроксихлорохина в течение 48 часов, с помощью анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo® 2.0 (Promega®, № по каталогу G9241) в соответствии с инструкциями производителя. В общих чертах, реагент CellTiter-Glo® 2.0 добавляли в объеме, равном объему среды, к клеткам и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Люминесцентный сигнал измеряли и сравнивали с сигналом, измеренным с необработанными клетками (отрицательный контроль).

Результаты:

Количественный анализ методом ПЦР показал, что азеластин-HCl высокоэффективно уменьшал число вирусных частиц на клетках аденокарциномы легких человека до>99% при концентрации 50 мкМ и более 90% при концентрации 25 мкМ (Фигура 6), это подтверждает, что азеластин оказывает свое действие, направленное против SARS-CoV-2, на эпителиальных клетках дыхательных путей человека, экспрессирующих поверхностную протеазу TMPRSS2 и наиболее значимых для инфекции SARS-CoV-2.

Пример 6: Предотвращение и лечение инфекции клеток НЕр-2 респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ)

Для подтверждения широкого противовирусного эффекта азеластина-HCl клетки НЕр-2 (АТСС CCL-23) инфицировали РСВ в отсутствие или в присутствии азеластина-HCl. Азеластин-HCl тестировали в 3 условиях: профилактическом условии (обработка азеластином-HCl с последующей инфекцией), совместном введении (клетки, инфицированные и обработанные азеластином-HCl одновременно) и терапевтическом условии (инфицированные клетки, обработанные азеластином-HCl через 1 час после инфекции). Определяли число пятен и число копий вирусного генома и сравнивали с клетками, обработанными буфером.

Методика эксперимента:

Азеластин-HCl (Sigma, №по каталогу PHR1636-1G) испытывали на активность против РСВ в диапазоне концентраций от 0,4 до 25 мкМ, используя 10 мМ исходный раствор, приготовленный в ДМСО.

1×10⁴ клеток НЕр-2 (АТСС CCL-23) высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в 50 мкл/лунку среды DMEM с добавлением 10% ФСТ и 2 мМ L-глутамина при 37°С при 5% СО₂ и 100% влажности в течение 3 часов. Через 3 часа клетки достигли адгезии и были инфицированы штаммом РСВ Long (АТСС VR-26, любезно предоставлен Т. Грюнвальд (Т. Grunwald), Институт клеточной терапии и иммунологии им. Фраунгофера, Лейпциг, Германия) при MOI 0,01. Азеластин-HCl добавляли к клеткам либо за 1 час до инфекции, либо одновременно с инфекцией, либо через 1 час после инфекции. Исходный раствор азеластина-HCl серийно разбавляли культуральной средой (DMEM/10% ФСТ/2 мМ L-глутамина) для достижения предусмотренной конечной концентрации. ДМСО разбавляли таким же образом и добавляли к клеткам как контрольный растворитель. Клетки, инфицированные и обработанные в общем объеме 200 мкл, инкубировали в течение 48 часов при 37°С при 5% СО₂ и 100% влажности. РСВ-инфицированные бляшки определяли с помощью иммуноцитохимического окрашивания поликлональным козьим антителом против РСВ (анти-РСВ Gt X (IgG Frac), Merck) и ПХ-конъюгированным кроличьим поликлональным антителом к козьему IgG (Novusbio). 3-амино-9-этилкарбазол (АЕС, Sigma) использовали в качестве хромогена в иммуногистохимии для визуализации клеток, инфицированных РСВ. Пятна подсчитывали вручную. Число копий вирусного генома определяли с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров РСВ-1 (5'-AGA ТСА ACT ТСТ GTC АТС CAG САА-3', SEQ ID NO: 18) и RSV-2 (5'-GCA CAT CAT ААТ TAG GAG TAT CAA T-3', SEQ ID NO: 19), как описано ранее Wilmschen et al. (Vaccines, 2019, 7:59). Значение Ct, полученное после обработки азеластином-HCl, сравнивали с клетками, обработанными только носителем. Для расчета числа копий вирусного генома в обработанных образцах относительно носителя использовали следующее уравнение: Увеличение на 1 Ct равно 50% меньшему числу копий.

Цитотоксичность азеластина-HCl по отношению к клеткам НЕр-2 определяли с помощью анализа на основе проточной цитометрии с использованием красителя для прижизненной окраски йодида пропидия.

Эксперименты выполняли независимо 3-4 раза.

Результаты:

Азеластин-HCl был цитотоксичен для клеток НЕр-2 при концентрации 12,8 и 25,6 мкМ (Фиг. 7). Таким образом, эффект азеластина-HCl оценивали при 6,4 мкМ и более низких концентрациях. РСВ-инфекция клеток, определенная с помощью подсчета пятен, была снижена до ~ 50% при концентрациях 3,2 и 6,4 мкМ по сравнению с контрольными образцами, обработанными носителем (ДМСО) (Фиг. 8), при всех 3 условиях, это указывает на мощный профилактический и терапевтический эффект азеластина-HCl на РСВ-инфекцию клеток НЕр-2. Определение числа копий вирусного генома подтвердило этот эффект при концентрации азеластина-HCl 6,4 мкМ (Таблица 6).

Пример 7. Предотвращение инфекции MucilAir™ вирусом гриппа А H1N1

Эффект повторных доз спрея для носа с азеластином-HCl (Pollival, UrsaPharm Arzneimittel) на инфекцию гриппа H1N1 тестировали на полностью дифференцированных назальных эпителиальных клетках человека, культивируемых на границе раздела воздух-жидкость (пул MucilAir™, Epithelix Sarl - первичные клетки из пула 14 различных нормальных доноров назальных клеток).

Методика эксперимента:

Противовирусный эффект азеластина-HCl против гриппа H1N1 тестировали, как описано Boda et al (Antiviral Research 156 (2018) 72-79). В общих чертах, после апикальной промывки пула MucilAir™ культуральной средой MucilAir ™ (200 мкл в течение 10 минут) 10 мкл азеластина-HCl в концентрации 0,02 или 0,01%, разведенного из спрея для носа полливал (Pollival®) (Ursapharm Arzneimittel GmbH) с собственным разбавителем наносили на апикальную сторону MucilAir™ на 10 минут. Затем на апикальную сторону наносили 100 мкл вируса гриппа H1N1 (АТСС VR-95) из исходной суспензии 10⁶ копий генома на мл и инкубировали в течение 3 часов. Инокулят смывали, трижды промывая апикальную сторону клеток 200 мкл культуральной среды MucilAir (20 мин инкубации). После 3 промывки аналогичную концентрацию азеластина-HCl добавляли к апикальной стороне клеток в объеме 10 мкл и инкубировали в течение 21 часа. Через 24 часа, 48 часов и 72 часа промывки клеток MucilAir™ повторяли, после чего азеластин заменяли на апикальной стороне, как и ранее. Число вирусных копий определяли в апикальных промывках в каждый момент времени. Основную культуральную среду также удаляли и ежедневно заменяли 500 мкл свежей культуральной среды. Измеряли высвобождение ЛДГ в основной промывке (для оценки гибели клеток через 96 часов), а также определяли уровни цитокинов (IL-8 и RANTES) в 48-часовой и 96-часовой временных точках. Все этапы инкубации проводили при 34°С при 5% СО₂ и 100% влажности. Число вирусных копий определяли в апикальной промывке: для этого РНК экстрагировали с помощью набора для вирусной РНК QIAamp® (Qiagen), и вирусную РНК количественно определяли с помощью ОТ-ПЦР (Зонд ОТ-ПЦР QuantyTect, Qiagen) с использованием системы детектирования qTOWER3. Данные Ct отмечали на стандартной кривой и выражали как число копий генома/мл.

В качестве отрицательного контроля включали неинфицированные клетки. В качестве положительного контроля использовали клетки, инфицированные вирусом гриппа H1N1, но обработанные только буфером. Противовирусный эффект азеластина-HCl сравнивали с эффектом карбоксилата осельтамивира (осельтамивир от Carbosynth, Комптон, Великобритания, при 10 мкМ), добавленного к инфицированным клеткам в базолатеральном компартменте. Соединения тестировали с тремя повторами.

Результаты:

Обработка клеток MucilAir™ азеластином-HCl в обеих концентрациях приводила к статистически значимому уменьшению числа копии вирусного генома через 24 часа после инфекции по сравнению с клетками, обработанными буфером. Уменьшение числа копий вируса составило ~1,9 log (снижение на 98,74%) при 0,02% азеластина-HCl и -0,9 log (снижение на 87,4%) при 0,01% азеластина-HCl (Фигура 9).

Кроме того, азеластин-HCl проявлял противовоспалительный эффект во время инфекции H1N1 MucilAir™; уровни IL-8 (Фигура 10/А) и RANTES (Фигура 10/В) были значительно снижены по сравнению с буферным контролем на 2 и 4 день после инфекции.

Азеластин-HCl в концентрации 0,02% показал незначительную цитотоксичность (6,5%) в неинфицированных клетках, но отсутствие цитотоксичности в инфицированных клетках или при более низкой (0,01%) концентрации.

Пример 8: Предотвращение и лечение инфекции клеток А549 аденовирусом

Для подтверждения широкого противовирусного эффекта азеластина-HCl клетки карциномы легкого человека (А549) инфицировали аденовирусом в отсутствие или в присутствии азеластина-HCl. Азеластин-HCl тестировали как при совместном введении, так и в терапевтическом условии.

Методика эксперимента:

Азеластин-HCl (Sigma, №по каталогу PHR1636-1G) тестировали на активность против аденовируса в диапазоне концентраций от 0,78 до 50 мкМ, используя 10 мМ исходный раствор, приготовленный в ДМСО.

3×10⁴ клеток А549 (АТСС CCL-185™) высевали в 96-луночные планшеты в 100 мкл полной питательной среды (DMEM, с высоким содержанием глюкозы с добавлением GlutaMAX™ и 10% ФБС, надлежащего качества, HI 500 мл, № по каталогу: 10500064, партия: 08Q6291K) и инкубировали при 37°С при 5% СО₂ и 100% влажности. Через 24 часа к клеткам добавляли 25 мкл свежей среды с MOI 0,01 TCID50 аденовируса hAdv5 (АТСС VR-5) для инициирования инфекции. В условиях совместного введения к клеткам одновременно с инфекцией добавляли 25 мкл азеластина-HCl, разведенного в полной питательной среде. В терапевтическом условии к клеткам добавляли азеластин-HCl через 6 часов после инфекции. Клетки инкубировали 48 часов после инфекции при 37°С при 5% СО₂ и 100% влажности. Затем планшет замораживали при -80°С, а вирус высвобождали из клеток с помощью 3-кратных циклов замораживания-оттаивания. Титр вируса определяли с помощью набора для быстрого титрования Adeno-X™ (3 повтора на лунку, Clontech, Takara Bio, №по каталогу РТ3651-2) в соответствии с инструкциями производителя.

Цитотоксичность азеластина в отношении неинфицированных клеток А549 определяли с помощью анализа CellTiter Glo (Promega, США) с использованием того же протокола, который описан выше, только без инфекции клеток аденовирусом.

--->

Перечень последовательностей

<110> CEBINA GmbH

<120> ПРОТИВОВИРУСНОЕ ЛЕЧЕНИЕ

<130> CB001P

<160> 19

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> R

<222> (3)..(3)

<223> представляет собой G/A

<220>

<221> S

<222> (12)..(12)

<223> представляет собой G/C

<400> 1

caratgttaa asacactatt agcata 26

<210> 2

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> R

<222> (5)..(5)

<223> представляет собой G/A

<400> 2

gtgaratggt catgtgtggc gg 22

<210> 3

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 3

caggtggaac ctcatcagga gatgc 25

<210> 4

<211> 1273

<212> БЕЛОК

<213> SARS-CoV-2

<400> 4

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

1010 1015 1020

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1025 1030 1035

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

1040 1045 1050

Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1055 1060 1065

Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1070 1075 1080

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1085 1090 1095

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1100 1105 1110

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1115 1120 1125

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1145 1150 1155

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1160 1165 1170

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu

1205 1210 1215

Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met

1220 1225 1230

Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro

1250 1255 1260

Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270

<210> 5

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 5

acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26

<210> 6

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 6

atattgcagc agtacgcaca c 21

<210> 7

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 7

acactagcca tccttactgc gcttcg 26

<210> 8

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> R

<222> (5)..(5)

<223> представляет собой G/A

<400> 8

gtgaratggt catgtgtggc gg 22

<210> 9

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 9

caggtggaac ctcatcagga gatgc 25

<210> 10

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<220>

<221> W

<222> (9)..(9)

<223> представляет собой A/T

<220>

<221> M

<222> (18)..(18)

<223> представляет собой A/C

<400> 10

ccaggtggwa crtcatcmgg tgatgc 26

<210> 11

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<220>

<221> R

<222> (3)..(3)

<223> представляет собой G/A

<220>

<221> S

<222> (12)..(12)

<223> представляет собой G/C

<400> 11

caratgttaa asacactatt agcata 26

<210> 12

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 12

acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26

<210> 13

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 13

acactagcca tccttactgc gcttcg 26

<210> 14

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 14

atattgcagc agtacgcaca ca 22

<210> 15

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 15

cacattggca cccgcaatc 19

<210> 16

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 16

acttcctcaa ggaacaacat tgcca 25

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 17

gaggaacgag aagaggcttg 20

<210> 18

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 18

agatcaactt ctgtcatcca gcaa 24

<210> 19

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 19

gcacatcata attaggagta tcaa 24

<---

Claims (16)

1. Применение азеластина или его фармацевтически приемлемой соли в количестве 0,1-500 мкг/дозу для профилактического или терапевтического лечения субъекта, нуждающегося в лечении патологического состояния, вызванного или связанного с инфекцией SARS-CoV-2.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанный SARS-CoV-2 представляет собой природный вариант или мутант SARS-CoV-2, такой как тот, который содержит одну или более мутаций S-белка SARS-CoV-2, предпочтительно K417N, L452R, N501Y, D614G, P681H, P681R, E484K, E484Q или делецию 69/70 в SEQ ID NO:4, причем предпочтительно указанный вариант или мутант SARS-CoV-2 выбран из группы, состоящей из мутантов B.1.1.7 (британский вариант), B.1.351 (южно-африканский), P.1 (бразильский), B.1.617 (индийский), B.1.618 (бенгальский).

3. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что азеластин или его фармацевтически приемлемая соль содержится в фармацевтическом препарате, таком как медицинский продукт или лекарственный продукт, содержащий эффективное количество азеластина или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель.

4. Применение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что указанное патологическое состояние представляет собой обычную простуду, инфекцию носа, синусит, инфекцию горла и гортани, бронхиолит, диарею, сыпь на коже или пневмонию, острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС).

5. Применение по любому из пп. 1-4, отличающееся тем, что азеластин или его фармацевтически приемлемая соль выполнены с возможностью местного введения, предпочтительно для мукозального введения.

6. Применение по любому из пп. 1-5, отличающееся тем, что азеластин или его фармацевтически приемлемую соль используют для применения в верхних и нижних дыхательных путях, для назального, легочного, внутриротового, глазного или дермального введения, или для системного введения, предпочтительно путем внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутрикожного, трансдермального или перорального введения.

7. Применение по любому из пп. 1-6, отличающееся тем, что азеластин или его фармацевтически приемлемую соль применяют в виде спрея, порошка, геля, мази, крема, пены или жидкого раствора, лосьона, раствора для полоскания рта, аэрозолированного порошка, аэрозолированной жидкой формы, гранул, капсул, капель, таблетки, сиропа, пастилки, глазных капель или препарата для инфузии или инъекции.

8. Применение по любому из пп. 1-7, отличающееся тем, что азеластин или его фармацевтически приемлемую соль применяют для назального введения в количестве, составляющем 1-1000 мкг на ноздрю.

9. Применение по любому из пп. 1-8, отличающееся тем, что азеластин или его фармацевтически приемлемую соль применяют в качестве единственного противовирусного вещества или предназначены для введения в комбинации с одним или более активными веществами, предпочтительно выбранными из группы, состоящей из противовирусных, противовоспалительных и антибиотических веществ.

10. Применение по любому из пп. 1-9, отличающееся тем, что указанный субъект инфицирован или подвержен риску инфицирования указанным вирусом, при этом предпочтительно субъект представляет собой человека, собаку, кошку, лошадь, верблюдовых, крупный рогатый скот или свинью.

11. Применение азеластина или его фармацевтически приемлемой соли для обработки биологической поверхности с целью предотвращения инфекции SARS-CoV-2 и/или распространения SARS-CoV-2.

12. Применение по п. 11, отличающееся тем, что указанная биологическая поверхность представляет собой поверхность слизистой оболочки, которая инфицирована или подвержена риску инфицирования SARS-CoV-2.

13. Применение по п. 11 или 12, отличающееся тем, что указанный SARS-CoV-2 представляет собой природный вариант или мутант SARS-CoV-2, такой как тот, который содержит одну или более мутаций S-белка SARS-CoV-2, предпочтительно K417N, L452R, N501Y, D614G, P681H, P681R, E484K, E484Q или делецию 69/70 в SEQ ID NO:4, причем предпочтительно указанный вариант или мутант SARS-CoV-2 выбран из группы, состоящей из мутантов B.1.1.7 (британский вариант), B.1.351 (южно-африканский), P.1 (бразильский), B.1.617 (индийский), B.1.618 (бенгальский).

14. Применение по любому из пп. 11-13, отличающееся тем, что азеластин или его фармацевтически приемлемая соль находится в медицинском продукте, который выполнен с возможностью местного применения, предпочтительно для применения в верхних и нижних дыхательных путях, назального, легочного, внутриротового, глазного или дермального применения.

15. Применение по п. 14, отличающееся тем, что указанный медицинский продукт представлен в виде раствора, дисперсии, сухого порошка или аэрозолированной жидкости или порошка.

16. Применение по любому из пп. 11-15, отличающееся тем, что азеластин или его фармацевтически приемлемая соль предназначены для введения в эффективном количестве, причем предпочтительно указанное количество составляет 1 нг - 1000 нг/см².