RU2841901C1

RU2841901C1 - Method for simulating coagulation haemostasis system disorders in lungs

Info

Publication number: RU2841901C1
Application number: RU2024136309A
Authority: RU
Inventors: Елена Павловна Федорова; Мария Васильевна Филонова; Оксана Владимировна Неупокоева; Павел Евгеньевич Никифоров; Любовь Александровна Сандрикина; Татьяна Ивановна Фомина; Татьяна Юрьевна Дубская; Лариса Юрьевна Котловская; Алексей Александрович Чурин; Владимир Васильевич Удут
Filing date: 2024-12-04
Publication date: 2025-06-18

Abstract

FIELD: medical science.

SUBSTANCE: invention refers to experimental medicine, namely haematology. Acidin-pepsin 0.1 ml at pH 1.2 is administered once intratracheally into female outbred rats. On 3rd day following the administration of the preparation, the blood is sampled to analyse the coagulation haemostasis system activity values.

EFFECT: method enables inducing the significant changes in the haemostatic system that in turn enables creating a model of disturbed haemostasis in the conditions of a descending damage of the pulmonary conductive system.

1 cl, 2 dwg, 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к области воспроизведения болезней человека в эксперименте, и может быть использовано для моделирования нарушений системы коагуляционного гемостаза при пневмоните.The invention relates to the field of medicine, namely to the field of reproducing human diseases in an experiment, and can be used to model disorders of the coagulation hemostasis system in pneumonitis.

В физиологическом состоянии эндотелиоциты легочных сосудов обеспечивают преобладание атромбогенных факторов над протромбогенными, поддерживая в микроциркуляторном русле циркулирующей крови повышенную фибринолитическую активность в условиях низких уровней тромбопластина [1; 2; 3]. Совокупность изменений, происходящих при воспалении/повреждении легочной ткани, способствует развитию острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), сопровождаюшегося выраженными изменениями в системе гемостаза – развитием легочной коагулопатии [4]. In a physiological state, pulmonary vascular endothelial cells ensure the predominance of athrombogenic factors over prothrombogenic ones, maintaining increased fibrinolytic activity in the microcirculatory bed of circulating blood under conditions of low thromboplastin levels [1; 2; 3]. The combination of changes occurring during inflammation/damage to lung tissue contributes to the development of acute respiratory distress syndrome (ARDS), accompanied by pronounced changes in the hemostasis system – the development of pulmonary coagulopathy [4].

Развитие эндотелиальной дисфункции, в том числе за счет прямого повреждения эндотелиоцитов, имеет определяющую роль в развитии гемостазиологических нарушений, что отображается повышением прокоагулянтной активности крови с одновременным угнетением фибринолиза и естественных антикоагулянтов. Совокупность приведенных выше изменений способствует развитию регионарных и системных изменений агрегатного состояния крови, приводя к развитию тромбо-геморрагических осложнений. Помимо этого, коагулопатия при ОРДС может способствовать усугублению повреждений легочной ткани и, как следствие, прогрессии патологического состояния [5].The development of endothelial dysfunction, including due to direct damage to endothelial cells, plays a decisive role in the development of hemostatic disorders, which is reflected by an increase in the procoagulant activity of the blood with simultaneous inhibition of fibrinolysis and natural anticoagulants. The combination of the above changes contributes to the development of regional and systemic changes in the aggregate state of the blood, leading to the development of thrombohemorrhagic complications. In addition, coagulopathy in ARDS can contribute to the aggravation of damage to the lung tissue and, as a consequence, the progression of the pathological condition [5].

Известен способ моделирования тромбоэмболии легочной артерии у крыс [6], который достигается перекрытием кровотока в нижней полой вене. Для развития тромбоэмболии мелких ветвей легочной артерии на уровне сегментарных артерий окклюзию вены сохраняют в течение 1,5-3,0 часов, а для формирования тромбоэмболии на уровне долевых артерий окклюзию вены сохраняют в течение 3,1-6,0 часов с последующим открытием кровотока. A method for modeling pulmonary embolism in rats is known [6], which is achieved by blocking the blood flow in the inferior vena cava. To develop thromboembolism of small branches of the pulmonary artery at the level of segmental arteries, the vein is occluded for 1.5-3.0 hours, and to form thromboembolism at the level of lobar arteries, the vein is occluded for 3.1-6.0 hours with subsequent opening of the blood flow.

Недостатком данного способа является невозможность его использования для моделирования нарушений в системе гемостаза при прямом поражении легочной ткани. Способ моделирования тромбообразования включает в себя проведение хирургических манипуляций с животными и предполагает владение определенными навыками, использование дорогостоящего оборудования, что значительно усложняет способ.The disadvantage of this method is the impossibility of its use for modeling disorders in the hemostasis system with direct damage to the lung tissue. The method of modeling thrombus formation includes surgical manipulations with animals and requires possession of certain skills, the use of expensive equipment, which significantly complicates the method.

Известен способ моделирования тромбоза легочной артерии в условиях венозного тромбоза [7], при котором у мышей линии C57BL/6 перекрывают кровоток в нижней полой вене под левой почечной веной путем наложения лигатуры. Перевязывают все боковые и задние притоки нижней полой вены до места слияния подвздошных вен таким образом, что нижняя полая вена оказывается оголенной. Окклюзию сохраняют до 48 часов для достижения тромбоза легочной артерии.A method for modeling pulmonary artery thrombosis under venous thrombosis conditions is known [7], in which the blood flow in the inferior vena cava under the left renal vein is blocked in C57BL/6 mice by applying a ligature. All lateral and posterior tributaries of the inferior vena cava are ligated to the point of confluence of the iliac veins in such a way that the inferior vena cava is exposed. Occlusion is maintained for up to 48 hours to achieve pulmonary artery thrombosis.

Данный метод предполагает инвазивное хирургическое вмешательство, что требует определенных навыков, а также моделирует только тромбоэмболии легочной артерии и ее мелких ветвей, представляемый же способ предполагает нарушение гемостаза при пневмоните. This method involves invasive surgical intervention, which requires certain skills, and also models only thromboembolism of the pulmonary artery and its small branches, while the presented method involves a violation of hemostasis in pneumonitis.

Наиболее близким к заявленному является способ моделирования нарушений гемостаза при сочетанном поражении легких бактериальным воспалением и тромбозом легочных сосудов [8], заключающийся в том, что самцам и самкам аутбредных крыс вводят липополисахарид E. coli интратрахеально в дозе 0,5 мг/кг, затем через час внутривенно вводят 3% раствор тромбопластина в объеме 0,3 мл и на 7 сутки после введения препаратов забирают кровь и анализируют показатели активности коагуляционного звена гемостаза.The closest to the claimed method is the method of modeling hemostasis disorders in combined lung damage by bacterial inflammation and thrombosis of the pulmonary vessels [8], which consists in the fact that male and female outbred rats are administered E. coli lipopolysaccharide intratracheally at a dose of 0.5 mg/kg, then an hour later a 3% thromboplastin solution is administered intravenously in a volume of 0.3 ml and on the 7th day after the administration of the drugs, blood is taken and the activity indicators of the coagulation link of hemostasis are analyzed.

Недостатком данного способа является системное введение тромбопластина.The disadvantage of this method is the systemic administration of thromboplastin.

Новый технический результат заявленного изобретения – создание способа моделирования нарушений гемостаза в условиях нисходящего повреждения кондуктивной системы легких.The new technical result of the claimed invention is the creation of a method for modeling hemostasis disorders under conditions of descending damage to the conductive system of the lungs.

Для решения поставленной задачи в способе моделирования нарушений гемостаза при прямом поражении легких ацидин-пепсином, заключающегося в однократном интрахеальном введении самкам аутбредных крыс 0,1 мл ацидин-пепсина с pH 1,2 на животное и отличающегося исключением системного введения индукторов тромбогенеза, а морфологическое исследование легких и анализ показателей гиперкоагуляционного сдвига гемостаза, оцениваемой по ПТВ, АПТВ содержанию фибриногена и активности АТ III.To solve the problem in the method of modeling hemostasis disorders in direct lung damage by acidin-pepsin, consisting of a single intracheal administration of 0.1 ml of acidin-pepsin with a pH of 1.2 per animal to female outbred rats and distinguished by the exclusion of systemic administration of thrombogenesis inducers, and a morphological study of the lungs and an analysis of the indicators of hypercoagulation shift in hemostasis, assessed by PT, APTT, fibrinogen content and AT III activity.

Поставленная задача решается путем однократного интратрахеального введения самкам крыс линии SD ацидин-пепсина с рН-1,2 (ОАО «Белмедпрепараты») в количестве 0,1 мл на животное (в условиях общей анестезии внутрибрюшинно: ксилазин 0,3 мл/кг «Interchemiewerken», Нидерланды и золетил 0,2 мл/кг ВИРБАК, Франция). На 3 сутки после введения препаратов осуществляют морфологическое исследование легких, взятие крови и анализ показателей активности коагуляционного звена гемостаза.The task is solved by a single intratracheal administration of acidin-pepsin with pH-1.2 (OAO Belmedpreparaty) to female SD rats in the amount of 0.1 ml per animal (under general anesthesia intraperitoneally: xylazine 0.3 ml/kg (Interchemiewerken), Netherlands and zoletil 0.2 ml/kg VIRBAC, France). On the 3rd day after the administration of the drugs, a morphological study of the lungs, blood sampling and analysis of the activity indicators of the coagulation link of hemostasis are carried out.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что для постановки модели используется однократное интратрахеальное введение самкам крыс линии SD ацидин-пепсина с рН-1,2 (ОАО «Белмедпрепараты») в количестве 0,1 мл на животное.What is new in the proposed invention is that a single intratracheal administration of acidin-pepsin with a pH of 1.2 (OAO Belmedpreparaty) to female SD rats in an amount of 0.1 ml per animal is used to establish the model.

Предлагаемый в качестве изобретения способ может быть использован для изучения возможности фармакологической коррекции нарушений свертывающей системы крови при пневмоните. The method proposed as an invention can be used to study the possibility of pharmacological correction of disorders of the blood coagulation system in pneumonitis.

Изобретение будет понятно из следующего описания.The invention will be clear from the following description.

Способ осуществляют следующим образом. В условиях общей анестезии (внутрибрюшинно: ксилазин 0,3 мл/кг и золетил 0,2 мл/кг) самкам аутбредных крыс вводят интратрахеально ацидин-пепсин с рН-1,2 (ОАО «Белмедпрепараты») в количестве 0,1 мл на животное, затем на 3 сутки осуществляют забор крови и легких. Для гистологического исследования легкие фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Гистологические препараты изготовляли по стандартной методике, срезы окрашивали гематоксилином и эозином [6]. Забор крови осуществляли путем пункции сердца, в пластиковые пробирки с добавлением в качестве стабилизатора крови 3,8%-го раствора цитрата натрия в соотношении 9:1. Для получения плазмы кровь центрифугировали в течение 15 минут на 3000 об/мин. Далее осуществляли анализ показателей активности коагуляционного звена – активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), протромбиновое время (ПВ), концентрация фибриногена, активность антитромбина III (АТ III) на полуавтоматическом коагулометре Helena C-4 (Helena Biosciences Europe, Великобритания) с использованием реактивов производства «Технология-Стандарт» (г. Барнаул, Россия). И сокращение ПТВ на 28% и АПТВ на 20% и более, повышение содержания фибриногена на 91% и активности АТ III на 37% и более свидетельствуют о состоянии гиперкоагуляции.The method is carried out as follows. Under general anesthesia (intraperitoneal: xylazine 0.3 ml/kg and zoletil 0.2 ml/kg), acidin-pepsin with pH 1.2 (OAO Belmedpreparaty) is administered intratracheally to female outbred rats in an amount of 0.1 ml per animal, then on the 3rd day, blood and lungs are collected. For histological examination, the lungs were fixed in 10% neutral buffered formalin. Histological preparations were made according to the standard technique, sections were stained with hematoxylin and eosin [6]. Blood was collected by cardiac puncture, in plastic test tubes with the addition of 3.8% sodium citrate solution in a ratio of 9:1 as a blood stabilizer. To obtain plasma, the blood was centrifuged for 15 minutes at 3000 rpm. Next, we analyzed the coagulation link activity indices – activated partial thromboplastin time (APTT), prothrombin time (PT), fibrinogen concentration, antithrombin III (AT III) activity on a Helena C-4 semiautomatic coagulometer (Helena Biosciences Europe, UK) using reagents manufactured by Tekhnologiya-Standart (Barnaul, Russia). A reduction in PTTT by 28% and APTT by 20% or more, an increase in fibrinogen content by 91% and AT III activity by 37% or more indicate a state of hypercoagulation.

Достигаемый технический результат заключается в том, что однократное интратрахеальное введение ацидин-пепсина приводит к повреждению легких, что, в свою очередь, вызывает значимые изменения в системе гемостаза. The technical result achieved is that a single intratracheal administration of acidin-pepsin leads to damage to the lungs, which, in turn, causes significant changes in the hemostasis system.

ПримерExample

При проведении экспериментов аутбредные крысы были распределены по группам:During the experiments, outbred rats were divided into groups:

1. Контроль – аутбредные крысы самки, которым интратрахеально вводили физиологический раствор по 0,1 мл (n=5). 1. Control – outbred female rats, which were injected intratracheally with 0.1 ml of saline solution (n=5).

2. Ацидин-пепсин – аутбредные крысы самки, которым интратрахеально вводили ацидин-пепсин в количестве 0,1 мл на животное (n=5).2. Acidin-pepsin – outbred female rats that were administered acidin-pepsin intratracheally in an amount of 0.1 ml per animal (n=5).

Забор крови для исследования осуществляли в пластиковые пробирки путем пункции сердца. В качестве стабилизатора крови использовали 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1. Кровь центрифугировали для получения плазмы в течение 15 минут на 3000 об/мин. Blood for the study was collected in plastic tubes by cardiac puncture. A 3.8% sodium citrate solution in a ratio of 9:1 was used as a blood stabilizer. The blood was centrifuged to obtain plasma for 15 minutes at 3000 rpm.

Исследование показателей системы коагуляционного гемостаза выполняли на полуавтоматическом коагулометре Helena C-4 (Helena Biosciences Europe, Великобритания) с использованием реактивов «Технология-Стандарт» (г. Барнаул, Россия). Оцениваемыми показателями активности коагуляционного звена системы гемостаза являлись: активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), протромбиновое время (ПТВ), концентрация фибриногена, активность антитромбина III (АТ III).The study of the parameters of the coagulation hemostasis system was performed on a semi-automatic coagulometer Helena C-4 (Helena Biosciences Europe, UK) using reagents "Technology-Standard" (Barnaul, Russia). The assessed parameters of the activity of the coagulation link of the hemostasis system were: activated partial thromboplastin time (APTT), prothrombin time (PTT), fibrinogen concentration, antithrombin III activity (AT III).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ StatPlus версии 7.6.5. Межгрупповые различия оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия определяют при 0,05% уровне достоверности и отражаются значком*.Statistical processing of the obtained results was performed using the StatPlus software package version 7.6.5. Intergroup differences were assessed using the nonparametric Mann-Whitney criterion. Differences are determined at a 0.05% level of reliability and are indicated by the symbol *.

Для гистологического исследования легкие фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. Гистологические препараты изготавливали по стандартной методике, срезы окрашивали гематоксилином и эозином. For histological examination, the lungs were fixed in 10% neutral buffered formalin. Histological preparations were made using standard methods, sections were stained with hematoxylin and eosin.

На фиг. 1 изображен срез легкого контрольных животных. На фиг. 2 изображен срез легкого с отеком ткани легких, разрывом альвеолярных перегородок, вызванных повреждением альвеолярной стенки ацидин-пепсином. В бронхах усиливалось слущивание бронхиального эпителия, в некоторых участках обнаруживались язвы в стенке бронха, обнажалась базальная мембрана. В просвете бронхов наблюдалось большое количество детрита и скопления нейтрофильных лейкоцитов.Fig. 1 shows a section of the lung of control animals. Fig. 2 shows a section of the lung with pulmonary edema, rupture of the alveolar septa caused by damage to the alveolar wall by acidin-pepsin. In the bronchi, the desquamation of the bronchial epithelium increased, ulcers were found in the bronchial wall in some areas, and the basement membrane was exposed. A large amount of detritus and accumulations of neutrophilic leukocytes were observed in the lumen of the bronchi.

Таблица 1 – Показатели гемостаза экспериментальных животных при интратрахеальном введении ацидин-пепсина на 3 сутки, X±mTable 1 – Hemostasis indices of experimental animals with intratracheal administration of acidin-pepsin on day 3, X±m

ПоказателиIndicators ПВ, секPV, sec АПТВ, секAPTT, sec Фибриноген, г/лFibrinogen, g/l АТ III, %AT III, % Контроль (n=5)Control (n=5) 16,56±0,8716.56±0.87 21,56±0,9321.56±0.93 1,21±0,171.21±0.17 87,46±0,9187.46±0.91 Ацидин-пепсин (n=5)Acidin-pepsin (n=5) 11,9±0,76*11.9±0.76* 17,28±0,39*17.28±0.39* 2,31±0,40*2.31±0.40* 119,45±11,90*119.45±11.90*

Примечание: Р<0,05 – * при сравнении данных у животных, получавших ацидин-пепсин, с соответствующими значениями у контрольных животных.Note: P<0.05 – * when comparing data in animals receiving acidin-pepsin with the corresponding values in control animals.

В эксперименте на крысах самках показано, что при применении ацидин-пепсина на 3 сутки исследования отмечалось снижение протромбинового времени на 28% и АПТВ - на 20%, повышение содержания фибриногена 91% и активности АТ III - 37%. In an experiment on female rats, it was shown that when using acidin-pepsin on the 3rd day of the study, there was a decrease in prothrombin time by 28% and APTT by 20%, an increase in fibrinogen content by 91% and AT III activity by 37%.

Достигаемый технический результат заключается в том, что однократное интратрахеальное введение ацидин-пепсина приводит к повреждению легких, что, в свою очередь, вызывает значимые изменения в системе гемостаза.The technical result achieved is that a single intratracheal administration of acidin-pepsin leads to damage to the lungs, which, in turn, causes significant changes in the hemostasis system.

Список литературыReferences

1. Blondonnet R., Constantin J.M., Sapin V., Jabaudon M. Pathophysiologic approach to biomarkers in acute respiratory distress syndrome / Dis. Markers. 2016. Vol. 2016. ID 3501373. doi:10.1155/2016/3501273.1. Blondonnet R., Constantin J.M., Sapin V., Jabaudon M. Pathophysiologic approach to biomarkers in acute respiratory distress syndrome / Dis. Markers. 2016. Vol. 2016. ID 3501373. doi:10.1155/2016/3501273.

2. Camprubí-Rimblas M. et al. Anticoagulant therapy in acute respiratory distress syndrome / Ann. Transl. Med. 2018. – Vol. 6. – № 2. – P. 36. doi: 10.21037/atm.2018.01.08.2. Camprubí-Rimblas M. et al. Anticoagulant therapy in acute respiratory distress syndrome / Ann. Transl. Med. 2018. – Vol. 6. – No. 2. – P. 36. doi: 10.21037/atm.2018.01.08.

3. Sinkov S.V., Zabolotskikh I.B., Shaposhnikov S.A., Fedorenko A.A. Implication of Acute Lung Injury in the Pathogenesis of Hemostatic Disorders. Obshhaja reanimatologija=General Reanimatology / 2008. – Vol. 4. – № 3. – P. 9-13. [In Russian]. doi: 10.15360/1813-9779-2012-3-9.3. Sinkov S.V., Zabolotskikh I.B., Shaposhnikov S.A., Fedorenko A.A. Implication of Acute Lung Injury in the Pathogenesis of Hemostatic Disorders. Obshhaja reanimatologija=General Reanimatology / 2008. – Vol. 4. – No. 3. – P. 9-13. [In Russian]. doi:10.15360/1813-9779-2012-3-9.

4. Арипов А. Н. и др. Роль лёгких в системе гемостаза (обзор литературы) // Клиническая лабораторная диагностика. – 2021. – Т. 66. – № 7. – С. 411-416. 4. Aripov A. N. et al. The role of the lungs in the hemostasis system (literature review) // Clinical laboratory diagnostics. - 2021. - V. 66. - No. 7. - P. 411-416.

5. Millar F.R. et al. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities / Thorax. 2016. – Vol. 71. – № 5. – P. 462-473. doi: 10.1136/thoraxjnl-2015-207461.5. Millar F.R. et al. The pulmonary endothelium in acute respiratory distress syndrome: insights and therapeutic opportunities / Thorax. 2016. – Vol. 71. – No. 5. – P. 462-473. doi: 10.1136/thoraxjnl-2015-207461.

6. Патент на изобретение RU 2610212 С1 «Способ моделирования тромбоэмболии легочной артерии у крыс» / А.В. Самородов Александр Владимирович, Ф.А. Халиуллин, Ф.Х. Камилов, Халимов Алмаз Радыкович (RU), патентообладатель Самородов Александр Владимирович (RU). – опубл. 08.02.2017, бюл. № 4.6. Patent for invention RU 2610212 C1 "Method for modeling pulmonary embolism in rats" / A.V. Samorodov Alexander Vladimirovich, F.A. Khaliullin, F.Kh. Kamilov, Khalimov Almaz Radykovich (RU), patent holder Samorodov Alexander Vladimirovich (RU). - published 08.02.2017, bulletin No. 4.

7. Патент на изобретение RU 2770355 С9 «Способ моделирования тромбоза легочной артерии в условиях венозного тромбоза» / О.Я. Порембская, С.А. Сайганов, В.Н. Кравчук Вячеслав Николаевич, патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. – опубл. 15.04.2022, бюл. № 11.7. Patent for invention RU 2770355 C9 "Method for modeling pulmonary artery thrombosis under conditions of venous thrombosis" / O. Ya. Porembskaya, S. A. Sayganov, V. N. Kravchuk Vyacheslav Nikolaevich, patent holder Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "North-West State Medical University named after I. I. Mechnikov" of the Ministry of Health of the Russian Federation. - published. 15.04.2022, bulletin No. 11.

8. Патент на изобретение RU 2800645 C1 «Способ моделирования нарушений гемостаза при сочетанном поражении легких бактериальным воспалением и тромбозом легочных сосудов» / Федотова Е.П., Филонова М.В., Неупокоева О.В., Никифоров П.Е., Сандрикина Л.А., Фомина Т.И., Дубская Т.Ю., Котловская Л.Ю., Чурин А.А., Удут В.В. Патентообладатель Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук» (Томский НИМЦ) (RU). – опубл. 25.07.2023, бюл. № 21.8. Patent for invention RU 2800645 C1 "Method for modeling hemostasis disorders in combined lung damage by bacterial inflammation and pulmonary vascular thrombosis" / Fedotova E.P., Filonova M.V., Neupokoeva O.V., Nikiforov P.E., Sandrikina L.A., Fomina T.I., Dubskaya T.Yu., Kotlovskaya L.Yu., Churin A.A., Udut V.V. Patent holder Federal State Budgetary Scientific Institution "Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences" (Tomsk NRMC) (RU). - published 25.07.2023, bulletin No. 21.

Claims

A method for modeling disorders of the coagulation hemostasis system in the lungs, consisting of a single intratracheal administration of 0.1 ml of acidin-pepsin with a pH of 1.2 to female outbred rats, and on the 3rd day after administration of the drug, blood is collected and the activity indicators of the coagulation hemostasis system are analyzed.