RU2738404C1 - Method of human culture rotavirus inactivation - Google Patents
Method of human culture rotavirus inactivation Download PDFInfo
- Publication number
- RU2738404C1 RU2738404C1 RU2019126974A RU2019126974A RU2738404C1 RU 2738404 C1 RU2738404 C1 RU 2738404C1 RU 2019126974 A RU2019126974 A RU 2019126974A RU 2019126974 A RU2019126974 A RU 2019126974A RU 2738404 C1 RU2738404 C1 RU 2738404C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rotavirus
- inactivation
- minutes
- human
- culture
- Prior art date
Links
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 title claims abstract description 37
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 241000617996 Human rotavirus Species 0.000 claims abstract description 19
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims abstract 3
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 claims abstract 2
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 claims abstract 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 17
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 4
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000190534 Inkoo virus Species 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical class C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010017913 Gastroenteritis rotavirus Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241001147430 Ntaya virus group Species 0.000 description 1
- 206010048685 Oral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 1
- 241001137860 Rotavirus A Species 0.000 description 1
- 206010067470 Rotavirus infection Diseases 0.000 description 1
- 229940124859 Rotavirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
- A61K35/765—Reovirus; Rotavirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
- A61K41/10—Inactivation or decontamination of a medicinal preparation prior to administration to an animal or a person
- A61K41/17—Inactivation or decontamination of a medicinal preparation prior to administration to an animal or a person by ultraviolet [UV] or infrared [IR] light, X-rays or gamma rays
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
- A61L2/02—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor using physical phenomena
- A61L2/08—Radiation
- A61L2/10—Ultraviolet radiation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии и касается способа инактивации культурального ротавируса человека группы А для использования при получении диагностических и вакцинных препаратов.The invention relates to medical virology and biotechnology and relates to a method for inactivating a cultured human rotavirus of group A for use in obtaining diagnostic and vaccine preparations.
Ротавирусный гастроэнтерит относится к острым инфекционным заболеваниям, широко распространенным во всех странах мира, в том числе в Российской Федерации и вызывает более половины всех кишечных расстройств у детей первых двух лет жизни, поэтому разработка вакцин против ротавирусной инфекции является приоритетной.Rotavirus gastroenteritis is an acute infectious disease widespread in all countries of the world, including the Russian Federation, and causes more than half of all intestinal disorders in children in the first two years of life, therefore, the development of vaccines against rotavirus infection is a priority.
Известны живые ротавирусные вакцины, но они сохраняют некоторый уровень остаточной патогенности, хотя и очень низкий, и у детей, особенно с дефектной иммунной системой, они могут вызывать тяжелые формы заболевания. Серьезной проблемой живых вакцин может быть также их биологическая нестабильность при хранении.Live rotavirus vaccines are known, but they retain some level of residual pathogenicity, albeit very low, and in children, especially those with defective immune systems, they can cause severe disease. Biological instability during storage can also be a serious problem with live vaccines.
Трудности, возникающие при получении и использовании живых вакцин, удается преодолевать в случае использования инактивированных (убитых) ротавирусных вакцин. Риск заражения при вакцинации инактивированной вакциной практически отсутствует. Инактивированные вакцины отвечают требованиям инфекционной безопасности, отсутствия поствакцинальных последствий, обеспечивают стабильность иммуногенного начала, сохранение полноценности антигенных белков и химической чистоты вакцинного препарата. Инактивация при этом должна быть направлена на вирусный геном и, по возможности, не затрагивать белковый каркас вирусной частицы.The difficulties encountered in obtaining and using live vaccines can be overcome by using inactivated (killed) rotavirus vaccines. There is practically no risk of infection when vaccinating with an inactivated vaccine. Inactivated vaccines meet the requirements of infectious safety, the absence of post-vaccination consequences, ensure the stability of the immunogenic principle, the preservation of the usefulness of antigenic proteins and the chemical purity of the vaccine preparation. In this case, inactivation should be directed to the viral genome and, if possible, not affect the protein framework of the viral particle.
При разработке инактивированной ротавирусной вакцины большое значение имеет способ инактивации ротавируса, который должен обеспечить необратимое повреждение его репликативного механизма при полном сохранении исходной антигенной структуры. Особенно важен подбор способа инактивации ротавируса человека, трудно поддающегося культивированию и более чувствительного к разрушению.In the development of an inactivated rotavirus vaccine, a method of inactivation of a rotavirus is of great importance, which should ensure irreversible damage to its replicative mechanism while fully preserving the original antigenic structure. Particularly important is the selection of a method for inactivating human rotavirus, which is difficult to cultivate and more sensitive to destruction.
Существуют способы инактивации вирусного антигена химические и физические.There are chemical and physical ways to inactivate a viral antigen.
При химической инактивации вирусов используют разные химические препараты, в том числе формалин (RU 2078816), β-пропиолактон (RU 2537183), димер этиленимина (SU 594771) и другие. Однако надежное подавление инфекционности нередко сопровождается существенным снижением других видов биологической активности, в том числе иммуногенности. В ряде случаев требуется нейтрализация инактивирующих агентов. Кроме того, все инактивирующие агенты, в той или иной степени, вызывают изменения как в нуклеиновой кислоте, так и в белковой оболочке (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.Н. Вирусы и вирусные вакцины. М.: Библионика, 2007. - С. 206-216, http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=207).In the chemical inactivation of viruses, various chemical preparations are used, including formalin (RU 2078816), β-propiolactone (RU 2537183), ethyleneimine dimer (SU 594771), and others. However, reliable suppression of infectivity is often accompanied by a significant decrease in other types of biological activity, including immunogenicity. In some cases, neutralization of inactivating agents is required. In addition, all inactivating agents, to one degree or another, cause changes in both the nucleic acid and the protein envelope (Sergeev V.A., Sergeev E.A., Nepoklonov V.A., Aliper T.N. Viruses and viral vaccines.M .: Biblionika, 2007. - S. 206-216, http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=207).
К физическим способам инактивации вирусных антигенов относят воздействие повышенной температурой (прогревание) (Земсков М.В., Соколов М.И., Земсков В.М. Основы общей микробиологии, вирусологии и иммунологии. - М., Колос - 1972. - С. 117), гамма-лучами (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. М.: Библионика, 2007. - С. 216-217, http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=216).Physical methods of inactivation of viral antigens include exposure to elevated temperatures (warming up) (Zemskov M.V., Sokolov M.I., Zemskov V.M. Fundamentals of general microbiology, virology and immunology. - M., Kolos - 1972. - S. 117), gamma rays (Sergeev V.A., Sergeev E.A., Nepoklonov V.A., Aliper T.I. Viruses and viral vaccines. M .: Biblionika, 2007. - S. 216-217, http : //bookre.org/reader? file = 1483804 & pg = 216).
Тепловая обработка и воздействие инфракрасными лучами на вируссодержащую жидкость не всегда приводят к полной инактивации вирусных патогенов, при этом также происходит частичная инактивация иммуногенных белков.Heat treatment and exposure to infrared rays on vaccinated liquid do not always lead to complete inactivation of viral pathogens, while partial inactivation of immunogenic proteins also occurs.
Большой проникающей способностью обладают гамма-лучи. Инфекционность вирусов при воздействии гамма-лучами теряется быстрее, чем антигенность за счет различных повреждений нуклеиновых кислот, но при этом все-таки сохраняется возможность повреждения белковой оболочки (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. 2007. - С. 216, http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=216).Gamma rays have a high penetrating power. Infectiousness of viruses when exposed to gamma rays is lost faster than antigenicity due to various damage to nucleic acids, but at the same time the possibility of damage to the protein envelope remains (Sergeev V.A., Sergeev E.A., Nepoklonov V.A., Aliper T.I. Viruses and Viral Vaccines. 2007. - S. 216, http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=216).
К физическим способам инактивации вирусных антигенов относится также воздействие ультрафиолетовыми лучами (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. М.: Библионика, 2007. - С.217, http://bookre.org/reader?file= 1483804&pg=217.The physical methods of inactivation of viral antigens also include exposure to ultraviolet rays (Sergeev V.A., Sergeev E.A., Nepoklonov V.A., Aliper T.I. Viruses and viral vaccines. M .: Bibionika, 2007. - S. 217, http://bookre.org/reader?file= 1483804 & pg = 217.
Изучено действие ультрафиолетового облучения на инфекционность ротавируса обезьяны SA11 9 (Смирнов Ю.А. Действие ультрафиолетового облучения на РНК-содержащие вирусы. Автореф. дисс.на соиск. уч. степени д.м.н. - Москва, 1993. - С.4, 40 http://earthpapers.net/preview/424125/a#?page=1). Показано, что коротковолновое ультрафиолетовое облучение (УФ) оказывает необратимое повреждающее воздействие на геномный аппарат и наиболее мягкое воздействие на белки капсида ротавируса обезьяны SA11 без изменения первичной и вторичной структуры белка.Studied the effect of ultraviolet irradiation on the infectivity of the monkey rotavirus SA11 9 (Smirnov Yu.A. Effect of ultraviolet irradiation on RNA-containing viruses. Abstract of the thesis for the degree of Doctor of Medical Sciences - Moscow, 1993. - P.4 , 40 http://earthpapers.net/preview/424125/a#?page=1). It was shown that short-wave ultraviolet irradiation (UV) has an irreversible damaging effect on the genomic apparatus and the mildest effect on the SA11 monkey rotavirus capsid proteins without changing the primary and secondary structure of the protein.
Ротавирус человека более чувствителен к разрушительному воздействию, нежели обезьяний. Для его инактивации необходим более мягкий способ инактивации, который должен обеспечить необратимое повреждение его репликативного механизма при полном сохранении исходной антигенной структуры.The human rotavirus is more sensitive to destructive effects than the monkey. To inactivate it, a milder method of inactivation is required, which should ensure irreversible damage to its replicative mechanism while fully preserving the original antigenic structure.
Целью предлагаемого изобретения является способ инактивации культурального ротавируса человека, обеспечивающий 100% инактивацию инфекционных свойств ротавируса, не изменяющий белковую структуру и сохраняющий его иммуногенные свойства.The aim of the present invention is a method for inactivation of human cultured rotavirus, providing 100% inactivation of the infectious properties of rotavirus, not changing the protein structure and preserving its immunogenic properties.
Поставленной цели достигают воздействием ультрафиолетового излучения определенной длины волны и экспозиции на ротавирус человека группы А с проведением предварительного высокоскоростного центрифугирования ротавирусной суспензии для удаления компонентов клеточного детрита и обеспечения эффективности инактивации вирусной РНК.This goal is achieved by exposure to ultraviolet radiation of a certain wavelength and exposure to group A human rotavirus with preliminary high-speed centrifugation of the rotavirus suspension to remove cellular debris components and ensure the efficiency of viral RNA inactivation.
Суспензию ротавируса человека группы А получают путем последовательных пассажей на культуре перевиваемых клеток СПЭВ (культура клеток почки эмбриона свиньи) по общепринятой методике (Вирусология. Методы /под ред. Б. Мейхи.- М., Мир;1988. - С. 207). Монослой клеток СПЭВ выращивают на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС), отмывают 3-х кратно раствором Хенкса. Культуральный ротавирус человека группы А в отдельном флаконе обрабатывают раствором трипсина (20 мкг/мл). На отмытый клеточный монослой в течение 10 минут наслаивают активированный трипсином ротавирус человека. Добавляют поддерживающую среду во флаконы до первоначального объема и выдерживают при 37°С в течение 10 сут. Накопление вирусов в культуре клеток оценивают по цитопатогенному действию (ЦПД) - количеству разрушенных клеток монослоя к общему первоначальному количеству клеток, которое в процентном выражении должно быть равно 100% через 24-36 час от начала заражения. Проводят трехкратное замораживание с последующим оттаиванием ротавирусной суспензии и центрифугируют при 5000 g в течение 30 мин.Suspension of human rotavirus of group A is obtained by successive passages on a culture of transplanted cells SPEV (culture of kidney cells of a pig embryo) according to the generally accepted method (Virology. Methods / ed. B. Meikhi. - M., Mir; 1988. - S. 207). A monolayer of SPEV cells is grown on medium 199 with the addition of 10% bovine serum (cattle), washed 3 times with Hanks solution. Cultural human rotavirus of group A in a separate vial is treated with trypsin solution (20 μg / ml). Trypsin-activated human rotavirus is layered on the washed cell monolayer for 10 minutes. The supporting medium is added to the vials to the initial volume and kept at 37 ° C for 10 days. The accumulation of viruses in the cell culture is assessed by the cytopathogenic effect (CPE) - the number of destroyed cells of the monolayer to the total initial number of cells, which in percentage terms should be equal to 100% in 24-36 hours from the beginning of infection. Freezing is carried out three times, followed by thawing of the rotavirus suspension and centrifuged at 5000 g for 30 minutes.
Проводят контроль полученной суспензии электронно-микроскопическим методом для подтверждения типичной морфологии ротавирусных частиц и прямым подсчетом частиц в 1 мл культуральной жидкости.The resulting suspension is monitored by an electron microscopic method to confirm the typical morphology of rotavirus particles and by direct counting of particles in 1 ml of culture fluid.
В электронно-микроскопических препаратах видны икосаэдрические частицы размером 60-75 нм, отдельные и в виде скоплений, с уникальной для ротавируса структурой: внешний капсид в виде тонкой пленки, внутренний - с рисунком, похожим на спицы колеса и сердцевиной 30-40 нм. Капсомеры, формирующие внутренний капсид, образуют четкую структуру из пента- и гексомеров.In electron microscopic preparations, icosahedral particles 60-75 nm in size are visible, separate and in the form of clusters, with a structure unique for rotavirus: the outer capsid is in the form of a thin film, the inner one has a pattern similar to the spokes of a wheel and a core of 30-40 nm. The capsomeres forming the inner capsid form a clear structure of penta- and hexomers.
При прямом подсчете ротавирусных вирионов в препарате в пересчете в 1 мл количество вирионов составляет 108-109 частиц.When directly counting rotavirus virions in the preparation, calculated in 1 ml, the number of virions is 10 8 -10 9 particles.
Ротавирусная суспензия, полученная по вышеуказанной методике, содержит остаточные компоненты клеточного детрита, что затрудняет проведение полноценной инактивации ротавирусов.The rotavirus suspension obtained by the above method contains residual components of cell detritus, which makes it difficult to carry out a complete inactivation of rotaviruses.
Для очистки от клеточного детрита и посторонних примесей ротавирусную суспензию дополнительно подвергают высокоскоростному центрифугированию при 40000 g в течение 5 мин. Для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость, содержащую вирус.To remove cell debris and impurities, the rotavirus suspension is additionally subjected to high-speed centrifugation at 40,000 g for 5 min. For further work, a supernatant fluid containing a virus is used.
Полученную вируссодержащую жидкость помешают в кювету из кварцевого стекла размером 20 мм × 200. Кювету размещают на расстоянии в 1 мм от поверхности лампы бактерицидного облучателя ОБН-75 УХЛ4 и подвергают воздействию ультрафиолетового излучения с длиной волны 253,7 нм в течение 3, 5, 7, 10 мин.The resulting vaccinated liquid is placed in a quartz glass cuvette with a size of 20 mm × 200. The cuvette is placed at a distance of 1 mm from the surface of the lamp of the OBN-75 UHL4 bactericidal irradiator and exposed to ultraviolet radiation with a wavelength of 253.7 nm for 3, 5, 7 , 10 min.
Эффективность УФ облучения проверяют на клетках СПЭВ, используя типичное культуральное свойство ротавируса - вызывать ЦПД на чувствительных к нему клетках млекопитающих: инактивированный вирус таким свойством не обладает. Монослой перевиваемых клеток СПЭВ заражают облученной вируссодержащей жидкостью и выращивают по вышеуказанной методике. Параллельно ставят контроль 1 - заражают клетки СПЭВ культуральным ротавирусом по той же методике; контроль 2 - культура клеток в поддерживающей среде, предварительно трижды отмытая раствором Хенкса и выращивают при таких же условиях.The effectiveness of UV irradiation is tested on SPEV cells, using a typical cultural property of rotavirus - to induce CPP on mammalian cells that are sensitive to it: an inactivated virus does not have this property. A monolayer of transplanted SPEV cells is infected with an irradiated vaccinated liquid and grown according to the above method. At the same time,
Полноту инактивации оценивают в процентах разрушенного монослоя по отношению к первоначальному монослою - до заражения инактивированным ротавирусом. Срок наблюдения - 10 дней. При заражении инактивированным вирусом нарушения монослоя не происходит, клетки продолжают делиться до образования плотного монослоя в течение срока наблюдения. Отсутствие ЦПД в течение срока наблюдения (0% разрушенных клеток монослоя от общего количества клеток) через 36 час от начала заражения и последующем наблюдении за культурой клеток в течение 10 суток является подтверждением полноты инактивации ротавируса и утраты им репродуктивных свойств в культуре клеток. Результаты инактивации ротавируса в зависимости от времени воздействия УФ излучения представлены в табл. 1The completeness of inactivation is estimated as the percentage of destroyed monolayer in relation to the original monolayer - before infection with inactivated rotavirus. The observation period was 10 days. When infected with an inactivated virus, the monolayer is not disturbed, the cells continue to divide until a dense monolayer is formed during the observation period. The absence of CPP during the observation period (0% of destroyed cells of the monolayer of the total number of cells) after 36 hours from the start of infection and subsequent observation of the cell culture for 10 days is a confirmation of the completeness of rotavirus inactivation and its loss of reproductive properties in the cell culture. The results of rotavirus inactivation depending on the time of exposure to UV radiation are presented in table. one
Установлено, что воздействие УФ излучения длиной волны 253,7 нм в течение 5 мин полностью лишает ротавирус человека способности размножаться на культуре клеток и разрушать клеточный монослой клеток СПЭВ.It was found that exposure to UV radiation with a wavelength of 253.7 nm for 5 min completely deprives human rotavirus of the ability to multiply in cell culture and destroy the cell monolayer of SPEV cells.
С целью подтверждения стойкого нарушения и отсутствия реверсии патогенных свойств по отношению к культуре клеток инактивированного ротавируса проводят три последовательных заражения клеток СПЭВ по вышеуказанной методике инактивированным вирусом и культуральным (контроль 1) с контролем культуры клеток в поддерживающей среде, предварительно трижды отмытой раствором Хенкса (контроль 2) при одинаковых условиях выращивания. Результаты контроля патогенности инактивированных ротавирусов человека по отношению к культуре клеток приведены в таблице 2.In order to confirm a persistent violation and the absence of reversion of pathogenic properties in relation to the cell culture of inactivated rotavirus, three consecutive infections of SPEV cells are carried out according to the above technique with inactivated virus and culture (control 1) with control of cell culture in a supporting medium, preliminarily washed with Hanks solution (control 2 ) under the same growing conditions. The results of monitoring the pathogenicity of inactivated human rotaviruses in relation to cell culture are shown in Table 2.
В последовательных (1, 2, 3) заражениях культуры клеток инактивированным ротавирусом отсутствуют признаки повреждения монослоя клеток. Клетки СПЭВ после заражения инактивированным ротавирусом продолжают делиться до образования плотного монослоя в течение всего срока наблюдения (10 дней), так же, как и в контроле 2 (незараженная культура клеток), что свидетельствует о полной необратимой инактивации вирусных частиц.In successive (1, 2, 3) infections of cell culture with inactivated rotavirus, there are no signs of damage to the cell monolayer. SPEV cells after infection with inactivated rotavirus continue to divide until a dense monolayer is formed during the entire observation period (10 days), as in control 2 (uninfected cell culture), which indicates complete irreversible inactivation of viral particles.
Таким образом, инактивированный УФ облучением ротавирус не проявляет инфекционных свойств на культуре клеток СПЭВ в течение нескольких заражений (не реплицируется, не разрушает клетку, не изменяет структуру монослоя клеток), что свидетельствует о стойкой утрате ротавирусом репродуктивной способности.Thus, the rotavirus inactivated by UV irradiation does not exhibit infectious properties on the SPEV cell culture for several infections (does not replicate, does not destroy the cell, does not change the structure of the cell monolayer), which indicates a persistent loss of reproductive capacity by the rotavirus.
Способность инактивированного УФ-облучением штамма ротавируса человека образовывать в организме млекопитающих нейтрализующие антитела проверяли в эксперименте на белых лабораторных мышах (9 голов) с 5-кратной иммунизацией инактивированным вирусом в дозе 0,2 мл, чередуя внутримышечное заражение и пероральное, с последующим забором крови у иммунизированных животных. В контрольной группе (5 голов) иммунизацию в таком же режиме проводили поддерживающей средой 199 без сыворотки. Уровень антител к ротавирусу человека определяли следующим образом:The ability of a human rotavirus strain inactivated by UV irradiation to form neutralizing antibodies in mammals was tested in an experiment on white laboratory mice (9 heads) with 5-fold immunization with an inactivated virus at a dose of 0.2 ml, alternating intramuscular and oral infection, followed by blood sampling from immunized animals. In the control group (5 animals), immunization in the same mode was carried out with the maintenance medium 199 without serum. The level of antibodies to human rotavirus was determined as follows:
- в реакции непрямой гемагглютинации - РНГА - эритроцитарным диагностикумом определяли рабочую дозу антигена в АЕ (агглютинирующих единицах);- in the reaction of indirect hemagglutination - RNGA - erythrocyte diagnosticum was used to determine the working dose of antigen in AE (agglutinating units);
- в реакции торможения непрямой гемагглютинации - РТНГА -установленной рабочей дозой определяли титр антител сывороток иммунизированных животных (Иммунологическая диагностика вирусных инфекций /под ред. Т.В. Перадзе, П. Халонена. - М.: Медицина, 1985. - С. 108; Эпиднадзор за ротавирусными заболеваниями. Методические рекомендации. Утв. Гокомсанэпиднадзором России 28.11.1994;).- in the reaction of inhibition of indirect hemagglutination - RTNGA - with an established working dose, the titer of antibodies of the sera of immunized animals was determined (Immunological diagnosis of viral infections / edited by T.V. Peradze, P. Halonen. - M .: Medicine, 1985. - P. 108; Rotavirus disease surveillance. Methodical recommendations. Approved by the State Sanitary and Epidemiological Service of Russia on 28.11.1994;).
Результаты иммунизации представлены в таблице 3.Immunization results are shown in Table 3.
В результате пятикратной иммунизации животных инактивированным ротавирусом человека группы А установлено, что сыворотки иммунизированных инактивированным ротавирусом животных содержали поствакцинальные нейтрализующие антитела в титрах, не уступающих титрам при иммунизации культуральным ротавирусом.As a result of five-fold immunization of animals with inactivated human rotavirus of group A, it was found that the sera of animals immunized with inactivated rotavirus contained post-vaccination neutralizing antibodies in titers that were not inferior to those during immunization with cultural rotavirus.
Морфологию, геномную идентичность инактивированного ротавируса человека проверяют методом электрофореза РНК вируса и электронной микроскопией.The morphology, genomic identity of inactivated human rotavirus is checked by electrophoresis of the virus RNA and electron microscopy.
Электрофорез РНК. Электрофорез РНК штаммов ротавируса проводят в 8% разделяющем полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) в системе Лемли в течение 10 час, сила тока 11 мА, с последующим окрашиванием 0.2% раствором азотнокислого серебра.RNA electrophoresis. Electrophoresis of RNA strains of rotavirus is carried out in an 8% separating polyacrylamide gel (EF in PAGE) in the Lemli system for 10 hours, the current strength is 11 mA, followed by staining with a 0.2% solution of silver nitrate.
Электронная микроскопия. Электронную микроскопию проводят методом негативного контрастирования, используя 0,5% уранилацетат. Сетки с препаратом просматривают при инструментальном увеличении 85000 раз.Electron microscopy. Electron microscopy is carried out by the negative contrast method using 0.5% uranyl acetate. The grids with the preparation are viewed at an instrumental magnification of 85,000 times.
Перечень фигур с краткими пояснениямиList of figures with brief explanations
Фиг. 1. Электрофореграмма РНК ротавируса человека группы А до УФ облучения (А) и после (Б). Представлен результат электрофореза РНК ротавируса человека группы А в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ). У инактивированного ротавируса (Б) по сравнению с культуральным (А) не изменена молекулярная масса фрагментов РНК, скорость движения фрагментов и не нарушен характер распределения 11 фрагментов РНК ротавируса группы А: 4-2-3-2 в пределах штаммовой вариабельности.FIG. 1. Electropherogram RNA of human rotavirus group A before UV irradiation (A) and after (B). The result of polyacrylamide gel electrophoresis of human rotavirus RNA of group A (EF in PAGE) is presented. The inactivated rotavirus (B), as compared to the cultured one (A), did not change the molecular weight of RNA fragments, the speed of movement of the fragments, and the distribution pattern of 11 RNA fragments of group A rotavirus: 4-2-3-2 was not disturbed within the strain variability.
Фиг. 2. Ротавирус человека группы А до УФ облучения (А) и после (Б).FIG. 2. Human rotavirus of group A before UV irradiation (A) and after (B).
Электронная микроскопия. Негативное контрастирование. Увеличение в 430000 раз. Морфология вирионов инактивированного УФ облучением штамма ротавируса (Б) соответствует морфологии вирионов ротавируса до облучения (А), относящихся к роду Rotavirus семейства Reoviridae (тонкий внешний капсид, внутренний капсид в виде колеса, сердцевина 30-40 нм, капсомеры уложены в виде гексомеров).Electron microscopy. Negative contrasting. An increase of 430,000 times. The morphology of the virions of the UV-inactivated rotavirus strain (B) corresponds to the morphology of the rotavirus virions before irradiation (A) belonging to the genus Rotavirus of the Reoviridae family (thin outer capsid, inner capsid in the form of a wheel, core 30-40 nm, capsomeres are arranged in the form of hexomers).
Предлагаемым способом инактивированы 3 адаптированных к росту на культуре клеток штамма ротавируса человека группы А, депонированных в Государственной коллекции вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России (номера депонентов ГКВ №№2727, 2728, 2729).The proposed method inactivated 3 strains of human rotavirus of group A, adapted to growth on cell culture, deposited in the State collection of viruses of the FSBI "Research Institute of Virology named after DI. Ivanovsky "of the Ministry of Health and Social Development of Russia (numbers of the GKV depositors No. 2727, 2728, 2729).
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019126974A RU2738404C1 (en) | 2019-08-26 | 2019-08-26 | Method of human culture rotavirus inactivation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019126974A RU2738404C1 (en) | 2019-08-26 | 2019-08-26 | Method of human culture rotavirus inactivation |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020120477A Previously-Filed-Application RU2743300C1 (en) | 2020-06-19 | 2020-06-19 | Method of human culture rotavirus inactivation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2738404C1 true RU2738404C1 (en) | 2020-12-11 |
Family
ID=73835052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019126974A RU2738404C1 (en) | 2019-08-26 | 2019-08-26 | Method of human culture rotavirus inactivation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2738404C1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996015231A2 (en) * | 1994-11-10 | 1996-05-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Method for producing biologicals in protein-free culture |
| US9808544B2 (en) * | 2005-08-31 | 2017-11-07 | Ultraviolet Sciences, Inc. | Ultraviolet light treatment chamber |
-
2019
- 2019-08-26 RU RU2019126974A patent/RU2738404C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996015231A2 (en) * | 1994-11-10 | 1996-05-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Method for producing biologicals in protein-free culture |
| US9808544B2 (en) * | 2005-08-31 | 2017-11-07 | Ultraviolet Sciences, Inc. | Ultraviolet light treatment chamber |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| СМИРНОВ Ю.А. Действие ультрафиолетового облучения на РНК-содержащие вирусы // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, Москва, 1993. BECK S.E. Wavelength-Specific Effects of Ultraviolet Light on Microorganisms and Viruses for Improving Water Disinfection // A dissertation submitted to the Faculty of the Graduate School of the University of Colorado in partial fulfillment Of the requirement for the degree of Doctor of Philosophy, 2015. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mansoor et al. | Preparation and evaluation of chicken embryo-adapted fowl adenovirus serotype 4 vaccine in broiler chickens | |
| JP2017526737A (en) | Recombinant serotype 9 avian adenovirus vector vaccine | |
| RU2603003C1 (en) | Inactivated sorptive vaccine to fmd types a, o, asia-1 | |
| JP2021519782A (en) | Poliovirus inactivated by irradiation, composition containing it, and preparation method | |
| RU2738404C1 (en) | Method of human culture rotavirus inactivation | |
| Wu et al. | Antigenic and immunogenic characterization of infectious bronchitis virus strains isolated in China between 1986 and 1995 | |
| DK143437B (en) | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF A VACCINE FOR THE PREVENTION OF DISEASES Caused by KATELEUKAEMIVIRUS | |
| RU2743300C1 (en) | Method of human culture rotavirus inactivation | |
| CN102805862B (en) | Preparation method for SFTS bunyavirus purification and inactivation vaccines through VERO cell culture | |
| Musser et al. | Measles virus growth in canine renal cell cultures | |
| RU2665849C1 (en) | Inactivated emulsion vaccine against foot-and-mouth disease type o | |
| CN108018261A (en) | Canine parainfluenza virus strain and its application | |
| CN105543179A (en) | High-titer genotype I Japanese encephalitis virus strain and application thereof | |
| Cross | Newcastle Disease—Vaccine Production | |
| Hanafusa et al. | Transformation phenomena in the pox group viruses. I | |
| RU2798293C1 (en) | Fmd culture inactivated sorbed vaccine from a/afghanistan/2017 strain of a/asia/iran-05far-11 new genotype | |
| RU2144562C1 (en) | Turkey herpes virus strain "vniizzh/n 110" for preparing vaccine against mareck's disease | |
| RU2682876C1 (en) | Inactivated emulsion vaccine for o-type aphthous fever | |
| RU2835906C1 (en) | Inactivated cultural sorbed vaccine against foot-and-mouth disease of genotype sat-2/xiv from strain "sat-2/xiv/2023" | |
| KR920010872B1 (en) | Preparing vaccine against herpes simplex virus | |
| RU2796987C1 (en) | Yamal strain of avian influenza virus of alphainfluenzavirus genus of influenza a virus subtype h5n1 species for the manufacture of biological products for the specific prevention of avian influenza type a subtype h5 | |
| RU2266326C1 (en) | Transmissible gastroenteritis of swine virus strain for production of diagnosis and vaccine preparations | |
| RU2815536C1 (en) | Culture inactivated sorbed vaccine against foot and mouth disease from a/tanzania/2013 strain of a/africa/g-i genotype | |
| RU2081912C1 (en) | Strain of measles virus "orlov-b" for vaccine preparing | |
| RU2266327C1 (en) | Transmissible gastroenteritis of swine virus strain for production of diagnosis and vaccine preparations |