RU2768194C1 - Method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes - Google Patents
Method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2768194C1 RU2768194C1 RU2021122927A RU2021122927A RU2768194C1 RU 2768194 C1 RU2768194 C1 RU 2768194C1 RU 2021122927 A RU2021122927 A RU 2021122927A RU 2021122927 A RU2021122927 A RU 2021122927A RU 2768194 C1 RU2768194 C1 RU 2768194C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phosphatidylserine
- externalization
- erythrocyte
- erythrocytes
- erythrocyte membranes
- Prior art date
Links
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 37
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 title claims abstract description 36
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- ICAKDTKJOYSXGC-UHFFFAOYSA-K lanthanum(iii) chloride Chemical compound Cl[La](Cl)Cl ICAKDTKJOYSXGC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 7
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 12
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229910052746 lanthanum Inorganic materials 0.000 description 4
- FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N lanthanum atom Chemical compound [La] FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 3
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 2
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- -1 anionic phospholipid Chemical class 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/02—Devices for withdrawing samples
- G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
- G01N1/20—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state for flowing or falling materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hydrology & Water Resources (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторным методам исследования и может использоваться для оценки степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов.The present invention relates to biology and medicine, namely to laboratory research methods and can be used to assess the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes.
Известно, что в эритроцитах фосфолипиды расположены асимметрично. Фосфатидилхолин и сфингомиелин локализованы на внешней половине липидного бислоя, фосфатидилэтаноламин на внешней и внутренней половине мембраны (Op den Kamp J.A. Annu. Rev. Biochem.1979. Vol. 48. P.47-71). Отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин локализован исключительно на внутренней стороне липидного бислоя (Zwaal R.F.A., Schroit A.J. Blood.1997. Vol. 89. P.1121-1132).Phospholipids are known to be arranged asymmetrically in erythrocytes. Phosphatidylcholine and sphingomyelin are localized on the outer half of the lipid bilayer, phosphatidylethanolamine on the outer and inner half of the membrane (Op den Kamp J.A. Annu. Rev. Biochem.1979. Vol. 48. P.47-71). The negatively charged phospholipid phosphatidylserine is localized exclusively on the inner side of the lipid bilayer (Zwaal R.F.A., Schroit A.J. Blood.1997. Vol. 89. P.1121-1132).
Выход фосфатидилсерина на поверхность мембран клеток крови при многих патологических состояниях ускоряет свертывание крови, приводит к тромботическим состояниям. Нарушение асимметричного расположения фосфолипидов в эритроцитах приводит к их апоптозу и исчезновению из кровотока (Zwaal R.F.A, Comfurius P., Bevers E.V. Cell.Mol.Life Sci. 2005. Vol. 62. P. 971-988).The release of phosphatidylserine on the surface of blood cell membranes in many pathological conditions accelerates blood clotting, leading to thrombotic conditions. Violation of the asymmetric arrangement of phospholipids in erythrocytes leads to their apoptosis and disappearance from the bloodstream (Zwaal R.F.A, Comfurius P., Bevers E.V. Cell.Mol.Life Sci. 2005. Vol. 62. P. 971-988).
Одним из ранних признаков апоптоза является экстернализация на поверхность плазматических мембран анионного фосфолипида – фосфатидилсерина, который, как известно, может регулировать поверхностный заряд и локализацию белков мембраны (Yeung T., Gilbert G.E., Shi J., Silvius J., Kapus A., Grinstein S. Science.2008. Vol. 319. P. 210-213).One of the early signs of apoptosis is the externalization to the surface of plasma membranes of an anionic phospholipid - phosphatidylserine, which, as is known, can regulate the surface charge and localization of membrane proteins (Yeung T., Gilbert GE, Shi J., Silvius J., Kapus A., Grinstein S. Science. 2008. Vol. 319. P. 210-213).
Известен способ оценки экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов, который включает добавление к эритроцитам флуоресцентного белка аннексина V и последующее измерение флуоресценции с помощью проточного цитофлуориметра (Kuypers F.A., Lewis R.A., Hua M. et al. Blood. 1996.Vol. 87. P. 1179-1183). Аннексин V имеет высокое сродство для отрицательно заряженного фосфатидилсерина. Однако он связывается с фосфатидилсерином только в присутствии высоких концентраций кальция (2.5 мМ).A method for assessing the externalization of phosphatidylserine to the surface of erythrocyte membranes is known, which includes adding the fluorescent protein annexin V to erythrocytes and subsequent measurement of fluorescence using a flow cytometer (Kuypers FA, Lewis RA, Hua M. et al. Blood. 1996. Vol. 87. P. 1179-1183). Annexin V has a high affinity for the negatively charged phosphatidylserine. However, it binds to phosphatidylserine only in the presence of high calcium concentrations (2.5 mM).
Для определения экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов требуется дорогостоящее оборудование (проточный цитофлуориметр) и дорогие флуоресцирующие реактивы.To determine the externalization of phosphatidylserine to the surface of erythrocyte membranes, expensive equipment (flow cytometer) and expensive fluorescent reagents are required.
Лантан, являясь трехвалентным катионом, также имеет высокое сродство к фосфатидилсерину и в низких концентрациях избирательно связывается с отрицательно заряженным фосфатидилсерином (Bentz J., Alford O., Cohen J., Duzgunes N. Biophys. J. 1988. Vol.5. P. 593-607).Lanthanum, being a trivalent cation, also has a high affinity for phosphatidylserine and selectively binds to negatively charged phosphatidylserine at low concentrations (Bentz J., Alford O., Cohen J., Duzgunes N. Biophys . J. 1988. Vol.5. P. 593-607).
Принцип предлагаемого способа оценки степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов основан на электростатическом взаимодействии положительно заряженного трехвалентного лантана (в низких концентрациях) с отрицательным фосфатидилсерином. В результате взаимодействия лантана с фосфатидилсерином происходит агрегация эритроцитов. Чем больше фосфатидилсерина на поверхности мембран эрироцитов, тем сильнее степень агрегации клеток.The principle of the proposed method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine to the surface of erythrocyte membranes is based on the electrostatic interaction of positively charged trivalent lanthanum (at low concentrations) with negative phosphatidylserine. As a result of the interaction of lanthanum with phosphatidylserine, erythrocyte aggregation occurs. The more phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes, the stronger the degree of cell aggregation.
В качестве прототипа выбран способ оценки степени присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов (Шереметьев Ю.А., Успенский А.Н. Способ оценки степени присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов. Патент RU 2701520. 2019), который включает фиксацию эритроцитов с помощью раствора глутарового альдегида в течение 30 минут, их отмывание забуференным физиологическим раствором, помещение в кювету агрегометра, добавление хлористого лантана в финальных концентрациях 15-25 мкМ, включение перемешивающего устройства, перемешивание в кювете агрегометра в течение 30 с, остановку перемешивания, процесс оседания агрегатов эритроцитов регистрирует в виде агрегатограммы, о степени присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов судят по максимальной амплитуде агрегатограммы.As a prototype, a method for assessing the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes (Sheremetiev Yu.A., Uspensky A.N. Method for assessing the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes. Patent RU 2701520. 2019), which includes the fixation of erythrocytes with a solution of glutaric aldehyde for 30 minutes, washing them with buffered saline, placing them in the aggregometer cuvette, adding lanthanum chloride in final concentrations of 15-25 μM, turning on the stirring device, stirring in the aggregometer cuvette for 30 s, stopping mixing, the process of sedimentation of erythrocyte aggregates is recorded in in the form of an aggregogram, the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes is judged by the maximum amplitude of the aggregogram.
Однако этот способ требует наличия высокочувствительного агрегометра. Кроме этого, существенным недостатком способа является то, что для процесса оседания эритроцитов требуется сильная агрегация клеток. Слабая агрегация эритроцитов не приводит к быстрому оседанию эритроцитов.However, this method requires a highly sensitive aggregometer. In addition, a significant disadvantage of this method is that the process of erythrocyte sedimentation requires strong cell aggregation. Weak erythrocyte aggregation does not lead to rapid erythrocyte sedimentation.
Этих недостатков лишен предлагаемый способ оценки степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов. These shortcomings are deprived of the proposed method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes.
Задача предполагаемого изобретения - совершенствование способа.The objective of the proposed invention is to improve the method.
Техническим результатом является автоматизация способа определения степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов, повышающая точность оценки их агрегации.The technical result is the automation of the method for determining the degree of externalization of phosphatidylserine to the surface of erythrocyte membranes, which increases the accuracy of assessing their aggregation.
Технический результат достигается за счет того, что в способе оценки степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов, включающем фиксацию эритроцитов глутаровым альдегидом, для оценки степени экстернализации фосфатидилсерина эритроциты фиксируют глутаровым альдегидом в течение 30 минут, затем один раз отмывают забуференным физиологическим раствором с рН 7.4, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 минут, добавляют хлористый лантан в финальной концентрации 15-25 мкМ, перемешивают, агрегаты эритроцитов помещают в поле зрения светового микроскопа (х200) и с помощью цифровой камеры получают изображение, которое обрабатывают и анализируют с применением алгоритмов компьютерного зрения, о степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов судят по показателю, равному отношению площади агрегированных к площади не агрегированных клеток.The technical result is achieved due to the fact that in the method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine to the surface of erythrocyte membranes, including the fixation of erythrocytes with glutaraldehyde, to assess the degree of externalization of phosphatidylserine, erythrocytes are fixed with glutaraldehyde for 30 minutes, then washed once with buffered saline with a pH of 7.4, centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes, lanthanum chloride is added at a final concentration of 15-25 μM, mixed, erythrocyte aggregates are placed in the field of view of a light microscope (x200) and an image is obtained using a digital camera, which is processed and analyzed using algorithms computer vision, the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes is judged by an indicator equal to the ratio of the area of aggregated to the area of non-aggregated cells.
Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты фиксируют в 0.25% растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере, в течение 30 минут при комнатной температуре. После фиксации эритроциты один раз отмывают забуференным физиологическим раствором (10 мМ трис-НCI, 150 мМ NaCI, рН 7.4) с помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут. К 0.9 мл 0.5 % суспензии фиксированных эритроцитов в забуференном физиологическом растворе добавляют 0.1 мл хлористого лантана в финальных концентрациях 15-25 мкМ, перемешивают, агрегаты эритроцитов помещают в поле зрения светового микроскопа (х200) и с помощью цифровой камеры получают изображение, которое обрабатывают и анализируют с применением алгоритмов компьютерного зрения, о степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов судят по показателю агрегации, равному отношению площади агрегированных к площади не агрегированных клеток.The method is carried out as follows. Erythrocytes are fixed in a 0.25% solution of glutaraldehyde prepared in phosphate buffer for 30 minutes at room temperature. After fixation, the erythrocytes are washed once with buffered saline (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7.4) by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes. To 0.9 ml of a 0.5% suspension of fixed erythrocytes in buffered saline, add 0.1 ml of lanthanum chloride at final concentrations of 15-25 μM, mix, place erythrocyte aggregates in the field of view of a light microscope (x200) and use a digital camera to obtain an image that is processed and analyzed using computer vision algorithms, the degree of externalization of phosphatidylserine to the surface of erythrocyte membranes is judged by the aggregation index, which is equal to the ratio of the area of aggregated to the area of non-aggregated cells.
Автоматизированный анализ изображения включает в себя предобработку изображения для устранения шумов, бинаризацию изображения для поиска объектов, определение границ найденных объектов, классификацию объектов на два класса –одиночные клетки (эритроциты) и агрегаты, а также расчет значения показателя, отражающего степень агрегации эритроцитов. Automated image analysis includes image preprocessing to eliminate noise, image binarization to search for objects, determination of the boundaries of the found objects, classification of objects into two classes - single cells (erythrocytes) and aggregates, as well as calculation of the indicator value reflecting the degree of erythrocyte aggregation.
На этапе предобработки изображения для устранения импульсного шума применяется медианный фильтр и выполняется адаптивное выравнивание гистограммы для повышения контрастности и качества изображения. The image pre-processing step uses a median filter to remove impulsive noise and performs adaptive histogram equalization to improve image contrast and quality.
Для бинаризации изображения применяется метод Оцу. В связи с цветовой неоднородностью искомых объектов в результате бинаризации изображения внутри объектов образуются разрывы, снижающие качество распознавания объектов на изображении. С целью устранения разрывов и улучшения качества бинаризации для каждого пикселя изображения исследуется окрестность в форме круга, рассчитывается процентное отношение черных и белых пикселей в этой окрестности. Если полученное значение отношения больше порогового значения, равного 80%, то считается, что найден объект, внутри которого есть разрыв, и все пиксели внутри исследуемой окрестности закрашиваются черным цветом. The Otsu method is used to binarize the image. Due to the color heterogeneity of the desired objects, as a result of image binarization, discontinuities are formed inside the objects, which reduce the quality of object recognition in the image. In order to eliminate discontinuities and improve the quality of binarization, a circle-shaped neighborhood is examined for each pixel of the image, and the percentage of black and white pixels in this neighborhood is calculated. If the obtained value of the ratio is greater than the threshold value equal to 80%, then it is considered that an object has been found inside which there is a gap, and all pixels within the studied neighborhood are painted over in black.
Для выделения и визуализации найденных объектов на изображении выполняется построение контуров связных областей, в которых у каждого пикселя имеется минимум один сосед, принадлежащий данному множеству пикселей. To select and visualize the found objects in the image, the contours of connected areas are constructed, in which each pixel has at least one neighbor belonging to a given set of pixels.
Для классификации найденных объектов на одиночные клетки и агрегаты выполняется следующее: определяются центры масс каждого объекта, рассчитываются расстояния от центра масс до каждой точки контура объекта и вычисляются отклонения полученных расстояний от их среднего значения. Если отклонение близко к 0, объект считается одиночным эритроцитом (объект в форме круга – форме одиночного эритроцита), в противном случае – агрегатом клеток (объект сложной формы).To classify the found objects into single cells and aggregates, the following is performed: the centers of mass of each object are determined, the distances from the center of mass to each point of the object contour are calculated, and the deviations of the obtained distances from their average value are calculated. If the deviation is close to 0, the object is considered to be a single erythrocyte (an object in the shape of a circle - the shape of a single erythrocyte), otherwise it is considered an aggregate of cells (an object of complex shape).
Рассчитывается значение показателя, характеризующего степень агрегации эритроцитов, определяемое отношением площади агрегированных клеток к площади одиночных клеток.The value of the indicator characterizing the degree of erythrocyte aggregation is calculated, determined by the ratio of the area of aggregated cells to the area of single cells.
По показателю степени агрегации эритроцитов судят о степени экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов. Связано это с тем, что, чем больше фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов, тем больше отрицательных участков для связывания положительно заряженного лантана. Результатом этого взаимодействия является агрегация эритроцитов. Чем сильнее агрегация клеток, тем большее количество фосфатидилсерина появилось на поверхности мембран эритроцитов.According to the degree of erythrocyte aggregation, the degree of externalization of phosphatidylserine to the surface of erythrocyte membranes is judged. This is due to the fact that the more phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes, the more negative sites for binding positively charged lanthanum. The result of this interaction is the aggregation of red blood cells. The stronger the aggregation of cells, the greater the amount of phosphatidylserine appeared on the surface of erythrocyte membranes.
Известно, что инкубация отмытых эритроцитов при 370°С в течение 24 ч приводит к экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов (Klarl B.A. et al. Am.J. Physiol. Cell Physiol. 2006. Vol. 290.P.244-253). It is known that incubation of washed erythrocytes at 370°C for 24 h leads to the externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes (Klarl B.A. et al. Am.J. Physiol. Cell Physiol. 2006. Vol. 290.P.244-253).
Пример 1. Нормальные эритроциты фиксировали глутаровым альдегидом. К 0.9 мл 0.5% суспензии нормальных фиксированных эритроцитов добавляли 0.1 мл хлористого лантана в финальной концентрации 20 мкМ, перемешивали, агрегаты эритроцитов помещали в поле зрения светового микроскопа (х200) и с помощью цифровой камеры получали изображение, которое обрабатывали с применением алгоритмов компьютерного зрения (фиг. 1). Показатель экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран нормальных эритроцитов составил 2.1. Example 1 Normal erythrocytes were fixed with glutaraldehyde. To 0.9 ml of a 0.5% suspension of normal fixed erythrocytes, 0.1 ml of lanthanum chloride at a final concentration of 20 μM was added, mixed, erythrocyte aggregates were placed in the field of view of a light microscope (x200) and an image was obtained using a digital camera, which was processed using computer vision algorithms (Fig. . one). The index of phosphatidylserine externalization to the membrane surface of normal erythrocytes was 2.1.
Пример 2. Суспензию эритроцитов инкубировали при 37°С в течение 24 ч. После этого эритроциты фиксировали глутаровым альдегидом. К 0.9 мл 0.5% суспензии фиксированных эритроцитов добавляли 0.1 мл хлористого лантана в финальной концентрации 20 мкМ, перемешивали, агрегаты эритроцитов помещали в поле зрения светового микроскопа (х200) и с помощью цифровой камеры получали изображение, которое обрабатывали с применением алгоритмов компьютерного зрения (фиг. 2). Показатель экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов составил 11. Содержание фосфатилсерина эритроцитов на поверхности мембран увеличилось в 5 раз по сравнению с контролем. Example 2. The erythrocyte suspension was incubated at 37°C for 24 hours. After that, the erythrocytes were fixed with glutaraldehyde. To 0.9 ml of a 0.5% suspension of fixed erythrocytes, 0.1 ml of lanthanum chloride at a final concentration of 20 μM was added, mixed, erythrocyte aggregates were placed in the field of view of a light microscope (x200), and an image was obtained using a digital camera, which was processed using computer vision algorithms (Fig. 2). The indicator of externalization of phosphatidylserine to the surface of erythrocyte membranes was 11. The content of erythrocyte phosphatylserine on the membrane surface increased 5 times compared to the control.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить степень экстернализации фосфатидилсерина на поверхность мембран эритроцитов человека и может найти применение для изучения эритроцитов при различных патологических состояниях, в опытах in vitro по изучению механизмов эриптоза. Thus, the proposed method allows to determine the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of human erythrocyte membranes and can be used to study erythrocytes in various pathological conditions, in experiments in vitro to study the mechanisms of eryptosis.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021122927A RU2768194C1 (en) | 2021-08-02 | 2021-08-02 | Method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021122927A RU2768194C1 (en) | 2021-08-02 | 2021-08-02 | Method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2768194C1 true RU2768194C1 (en) | 2022-03-23 |
Family
ID=80819281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021122927A RU2768194C1 (en) | 2021-08-02 | 2021-08-02 | Method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2768194C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2665171C2 (en) * | 2016-08-15 | 2018-08-28 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия" (ФГБОУ ВО НГСХА) | Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface |
| RU2701520C1 (en) * | 2019-05-06 | 2019-09-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия" (ФГБОУ ВО НГСХА) | Method of assessing the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
| RU2731507C1 (en) * | 2013-03-15 | 2020-09-03 | Гладиатор Байосайенсиз, Инк. | Gla domains as targeting agents |
-
2021
- 2021-08-02 RU RU2021122927A patent/RU2768194C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2731507C1 (en) * | 2013-03-15 | 2020-09-03 | Гладиатор Байосайенсиз, Инк. | Gla domains as targeting agents |
| RU2665171C2 (en) * | 2016-08-15 | 2018-08-28 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия" (ФГБОУ ВО НГСХА) | Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface |
| RU2701520C1 (en) * | 2019-05-06 | 2019-09-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия" (ФГБОУ ВО НГСХА) | Method of assessing the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| J. KAPTY et al. Evaluation of Phosphatidylserine-Binding Peptides Targeting Apoptotic Cells / Journal of Biomolecular Screening, 2012, 17 (10), pages 1293- 1301. * |
| K. BALASUBRAMANIAN et al. Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis / THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2017, vol. 282, N 25, pages 18357-18364. * |
| K. BALASUBRAMANIAN et al. Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis / THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2017, vol. 282, N 25, pages 18357-18364. J. KAPTY et al. Evaluation of Phosphatidylserine-Binding Peptides Targeting Apoptotic Cells / Journal of Biomolecular Screening, 2012, 17 (10), pages 1293- 1301. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Arraud et al. | A simple flow cytometry method improves the detection of phosphatidylserine‐exposing extracellular vesicles | |
| Larson et al. | Calcium‐phosphate microprecipitates mimic microparticles when examined with flow cytometry | |
| CN109596841B (en) | Application of exosomal TβRII protein as a marker in the preparation of breast cancer detection kits | |
| JP2001004625A (en) | Analysis of blood and blood analysis kit | |
| RU2004118490A (en) | METHOD FOR DETECTING ANALYZED (S) SUBSTANCE (S) BY USING COLLOIDAL MAGNETIC PARTICLES | |
| NO162094B (en) | PROCEDURE FOR DETERMINING LOW DENSITY LIPOPRLDL) AND REAGENT FOR IMPLEMENTING IT. | |
| CN110376387A (en) | Blood CRP Quality Control object and its quality control method | |
| WO2002025280A1 (en) | Method for monitoring resting and activated platelets in unfixed blood samples | |
| JP2020535426A (en) | Specific malaria detection using digital holographic microscopy | |
| CN114487399A (en) | Method for joint analysis of particle size and surface marker | |
| US20160327555A1 (en) | Method for avoiding influence of endogenous lipoprotein and reagent | |
| Martel et al. | Serology for automated cytotoxicity assays: contrast fluorescence test | |
| JP7444386B2 (en) | Method for isolating and analyzing microvesicles from human urine | |
| RU2768194C1 (en) | Method for assessing the degree of externalization of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes | |
| WO2016125243A1 (en) | Exosome assay method and exosome extraction method | |
| RU2547573C2 (en) | Method for detecting phosphatidyl serine on erythrocyte membrane surface | |
| RU2665171C2 (en) | Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface | |
| RU2701520C1 (en) | Method of assessing the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes | |
| Koulov et al. | Biophysical studies of a synthetic mimic of the apoptosis‐detecting protein annexin v | |
| Shtam et al. | Aggregation by lectins as an approach for exosome isolation from biological fluids: Validation for proteomic studies | |
| Ginevri et al. | Peroxidative damage of the erythrocyte membrane in children with nephrotic syndrome | |
| WO2009118551A1 (en) | Ultrasound method for analysis of blood for blood typing, antibody detection and flow cytometry | |
| EP4377671A1 (en) | Detection of cell aggregates using quantitative phase-contrast microscopy | |
| Hochstrasser | Clinical and biomedical applications of proteomics | |
| Jones et al. | Detection of proteins in human amniotic fluid using two-dimensional gel electrophoresis |