RU2547573C2 - Method for detecting phosphatidyl serine on erythrocyte membrane surface - Google Patents
Method for detecting phosphatidyl serine on erythrocyte membrane surface Download PDFInfo
- Publication number
- RU2547573C2 RU2547573C2 RU2013117230/15A RU2013117230A RU2547573C2 RU 2547573 C2 RU2547573 C2 RU 2547573C2 RU 2013117230/15 A RU2013117230/15 A RU 2013117230/15A RU 2013117230 A RU2013117230 A RU 2013117230A RU 2547573 C2 RU2547573 C2 RU 2547573C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- membrane surface
- phosphatidyl serine
- phosphatidylserine
- detecting
- erythrocyte membrane
- Prior art date
Links
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 title claims abstract description 24
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 24
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- ICAKDTKJOYSXGC-UHFFFAOYSA-K lanthanum(iii) chloride Chemical compound Cl[La](Cl)Cl ICAKDTKJOYSXGC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 abstract 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229910052746 lanthanum Inorganic materials 0.000 description 6
- FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N lanthanum atom Chemical compound [La] FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 1-oleoyl-sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O WRGQSWVCFNIUNZ-GDCKJWNLSA-N 0.000 description 2
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторным методам исследования, и может использоваться для оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.The present invention relates to biology and medicine, namely to laboratory research methods, and can be used to assess the presence of phosphatidylserine on the surface of red blood cell membranes.
Известно, что в эритроцитах фосфолипиды расположены асимметрично. Фосфатидилхолин и сфингомиелин локализованы на внешней половине липидного бислоя, фосфатидилэтаноламин на внешней и внутренней половине мембраны. Отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин локализован исключительно на внутренней стороне липидного бислоя (Zwaal R.F.A., Schroit A.J. Blood. 1997. Vol.89. P.1121-1132). Выход фосфатидилсерина на поверхность мембран клеток крови при многих патологических состояниях ускоряет свертывание крови, приводит к тромботическим состояниям (Zwaal R.F.A, Comfurius P., Bevers E.V. Cell.Mol.Life Sci. 2005. Vol.62. P.971-988).In erythrocytes, phospholipids are known to be asymmetrically located. Phosphatidylcholine and sphingomyelin are located on the outer half of the lipid bilayer, phosphatidyl ethanolamine on the outer and inner half of the membrane. Negatively charged phospholipid phosphatidylserine is located exclusively on the inside of the lipid bilayer (Zwaal R.F.A., Schroit A.J. Blood. 1997. Vol.89. P.1121-1132). The release of phosphatidylserine on the surface of blood cell membranes under many pathological conditions accelerates blood coagulation and leads to thrombotic conditions (Zwaal R.F.A, Comfurius P., Bevers E.V. Cell.Mol.Life Sci. 2005. Vol.62. P.971-988).
Лантан, являясь трехвалентным катионом, имеет высокое сродство к фосфатидилсерину и в низких концентрациях избирательно взаимодействует с отрицательно заряженным фосфатидилсерином (Bentz J., Alford О., Cohen J., Duzgunes N. Biophys J. 1988. Vol.53. P.593-607).Lanthanum, being a trivalent cation, has a high affinity for phosphatidylserine and, at low concentrations, selectively interacts with negatively charged phosphatidylserine (Bentz J., Alford O., Cohen J., Duzgunes N. Biophys J. 1988. Vol.53. P.593- 607).
Принцип предлагаемого способа оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов основан на электростатическом взаимодействии положительно заряженного лантана с отрицательным фосфатидилсерином. В результате взаимодействия лантана с фосфатидилсерином происходит агрегация эритроцитов.The principle of the proposed method for assessing the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes is based on the electrostatic interaction of positively charged lanthanum with negative phosphatidylserine. As a result of the interaction of lanthanum with phosphatidylserine, aggregation of red blood cells occurs.
В качестве прототипа выбран способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов, который включает добавление к эритроцитам флюоресцентного белка аннексина V и последующее измерение флюоресценции с помощью проточного цитофлюориметра (Kuypers F.A., Lewis R.A., Hua M. Et al. Blood. l996. Vol.87. P.1179-1183).As a prototype, a method for assessing the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes was selected, which includes adding annexin V fluorescence protein to red blood cells and then measuring fluorescence using a flow cytometer (Kuypers FA, Lewis RA, Hua M. Et al. Blood. L996. Vol. 87. Vol99. P.1179-1183).
Однако для этого требуется дорогостоящее дефицитное оборудование (проточный цитофлюориметр) и дорогие дефицитные реактивы.However, this requires expensive scarce equipment (flow cytometer) and expensive scarce reagents.
Задача предлагаемого изобретения - совершенствование способа.The objective of the invention is the improvement of the method.
Технический результат - упрощение способа оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.EFFECT: simplification of the method for assessing the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes.
Технический результат достигается за счет того, что в способе? включающем фиксацию эритроцитов с помощью глутарового альдегида, их отмывание, помещение на предметное стекло, обработанное хлористым лантаном, наблюдение за появлением агрегатов, по появлению агрегатов эритроцитов судят о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.The technical result is achieved due to the fact that in the method? including the fixation of red blood cells with glutaraldehyde, their washing, placement on a glass slide treated with lanthanum chloride, monitoring the appearance of aggregates, the appearance of red blood cell aggregates judges the presence of phosphatidylserine on the surface of red blood cell membranes.
Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты фиксируют в 1%-ном растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере, в течение 60 мин при комнатной температуре. После фиксации эритроциты трижды отмывают дистиллированной водой с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Отмытые эритроциты переносят на предметное стекло, обработанное 0.5 мМ раствором хлористого лантана, перемешивают и наблюдают с помощью светового микроскопа за образованием агрегатов клеток. Появление агрегатов свидетельствует о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.The method is as follows. Red blood cells are fixed in a 1% solution of glutaraldehyde prepared in phosphate buffer for 60 minutes at room temperature. After fixation, red blood cells are washed three times with distilled water, followed by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes. The washed red blood cells are transferred to a glass slide treated with a 0.5 mM lanthanum chloride solution, mixed and observed using a light microscope to form cell aggregates. The appearance of aggregates indicates the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes.
Известно, что эритроциты кренатной формы (эхиноциты) в отличие от эритроцитов нормальной формы (дискоциты) имеют на поверхности мембраны высокое содержание фосфатидилсерина (Wolfs J.L.N., Comfurius Р., Bevers E.M., Swaal R.F.A. Molecular Membrane Biology. 2003. Vol.20. P.83-91).It is known that erythrocytes of the krenate form (echinocytes), unlike normal erythrocytes (discocytes), have a high phosphatidylserine content on the membrane surface (Wolfs JLN, Comfurius P., Bevers EM, Swaal RFA Molecular Membrane Biology. 2003. Vol.20. P. 83-91).
В качестве примеров использовали дискоциты и эхиноциты. Эхиноциты получали путем истощения; по АТФ (Feo С., Mohandas N. Nature. 1977. Vol.265. P. 166-168) и после обработки лизофосфатидной кислотой (Chung S.M., Bae O.N., Lim K.M. et al. Arterioscler.Thromb. Vasc.Biol. 2007. Vol.27. P.414-421).Discocytes and echinocytes were used as examples. Echinocytes were obtained by depletion; by ATP (Feo C., Mohandas N. Nature. 1977. Vol.265. P. 166-168) and after treatment with lysophosphatidic acid (Chung SM, Bae ON, Lim KM et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007 Vol.27. P.414-421).
Пример 1. Фиксированные дискоциты помещают на предметное стекло, обработанное лантаном, перемешивают и наблюдают с помощью светового микроскопа. Наблюдается отсутствие агрегатов эритроцитов. На поверхности мембран эритроцитов фосфатидилсерин отсутствует.Example 1. Fixed discocytes are placed on a glass slide treated with lanthanum, mixed and observed using a light microscope. There is a lack of red blood cell aggregates. On the surface of the erythrocyte membranes, phosphatidylserine is absent.
Пример 2. Фиксированные эхиноциты, полученные после истощения по АТФ, помещают на предметное стекло, обработанное лантаном, перемешивают и наблюдают с помощью световой микроскопии. Наблюдаются агрегаты эритроцитов. На поверхности мембран эритроцитов присутствует фосфатидилсерин.Example 2. Fixed echinocytes obtained after depletion by ATP, placed on a glass slide treated with lanthanum, mixed and observed using light microscopy. Red blood cell aggregates are observed. Phosphatidylserine is present on the surface of erythrocyte membranes.
Пример 3. Фиксированные эхиноциты, полученные после обработки лизофосфатидной кислотой, помещают на предметное стекло, обработанное лантаном, перемешивают и наблюдают с помощью световой микроскопии. Наблюдаются агрегаты эритроцитов. На поверхности мембран эритроцитов присутствует фосфатидилсерин.Example 3. Fixed echinocytes obtained after treatment with lysophosphatidic acid, placed on a glass slide treated with lanthanum, mixed and observed using light microscopy. Red blood cell aggregates are observed. Phosphatidylserine is present on the surface of erythrocyte membranes.
Таким образом, предлагаемый способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов не требует специального оборудования.Thus, the proposed method for assessing the presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes does not require special equipment.
Преимуществом предлагаемого способа является простота, доступность, быстрота, отсутствие необходимости в сложном дорогостоящем оборудовании и дорогих дефицитных реактивов.The advantage of the proposed method is simplicity, accessibility, speed, the absence of the need for complex expensive equipment and expensive scarce reagents.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013117230/15A RU2547573C2 (en) | 2013-04-15 | 2013-04-15 | Method for detecting phosphatidyl serine on erythrocyte membrane surface |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013117230/15A RU2547573C2 (en) | 2013-04-15 | 2013-04-15 | Method for detecting phosphatidyl serine on erythrocyte membrane surface |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013117230A RU2013117230A (en) | 2014-10-20 |
| RU2547573C2 true RU2547573C2 (en) | 2015-04-10 |
Family
ID=53296738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013117230/15A RU2547573C2 (en) | 2013-04-15 | 2013-04-15 | Method for detecting phosphatidyl serine on erythrocyte membrane surface |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2547573C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2665169C1 (en) * | 2017-04-03 | 2018-08-28 | Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) | Erythrometric method of assessment the intensity of tissue respiration |
| RU2665171C2 (en) * | 2016-08-15 | 2018-08-28 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия" (ФГБОУ ВО НГСХА) | Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface |
| RU2701520C1 (en) * | 2019-05-06 | 2019-09-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия" (ФГБОУ ВО НГСХА) | Method of assessing the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2277711C1 (en) * | 2004-10-26 | 2006-06-10 | ФГОУ ВПО Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия (ФГОУ ВПО НГСХА) | Method for evaluating stable state of erythrocytic membranes |
| RU2309754C2 (en) * | 2005-05-11 | 2007-11-10 | Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия (НГСХА) | Method for production of erythrocyte membranes |
-
2013
- 2013-04-15 RU RU2013117230/15A patent/RU2547573C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2277711C1 (en) * | 2004-10-26 | 2006-06-10 | ФГОУ ВПО Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия (ФГОУ ВПО НГСХА) | Method for evaluating stable state of erythrocytic membranes |
| RU2309754C2 (en) * | 2005-05-11 | 2007-11-10 | Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия (НГСХА) | Method for production of erythrocyte membranes |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Kuypers FA et al. Detection of altered membrane phospholipid asymmetry in subpopulations of human red blood cells using fluorescently labeled annexin V. Blood. 1996 Feb 1;87(3):1179-87. * |
| Liu F, Burgess J et al. Sample preparation and imaging of erythrocyte cytoskeleton with the atomic force microscopy. Cell Biochem Biophys. 2003;38(3):251-70 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2665171C2 (en) * | 2016-08-15 | 2018-08-28 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия" (ФГБОУ ВО НГСХА) | Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface |
| RU2665169C1 (en) * | 2017-04-03 | 2018-08-28 | Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего образования Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова Министерства обороны Российской Федерации (ВМедА) | Erythrometric method of assessment the intensity of tissue respiration |
| RU2701520C1 (en) * | 2019-05-06 | 2019-09-27 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Нижегородская Государственная Сельскохозяйственная Академия" (ФГБОУ ВО НГСХА) | Method of assessing the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013117230A (en) | 2014-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| D’Acunzo et al. | Isolation of mitochondria-derived mitovesicles and subpopulations of microvesicles and exosomes from brain tissues | |
| Gelibter et al. | The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study | |
| Issman et al. | Cryogenic transmission electron microscopy nanostructural study of shed microparticles | |
| Zhang et al. | Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies | |
| von Lersner et al. | Multiparametric single-vesicle flow cytometry resolves extracellular vesicle heterogeneity and reveals selective regulation of biogenesis and cargo distribution | |
| KR102792828B1 (en) | Quantitative method for the determination of lipoprotein cholesterol, quantitative reagents, and quantitative kits | |
| CN106399250A (en) | Method and kit for separating exosome | |
| Fernandez-Vizarra et al. | Blue-native electrophoresis to study the OXPHOS complexes | |
| Gorudko et al. | Binding of human myeloperoxidase to red blood cells: Molecular targets and biophysical consequences at the plasma membrane level | |
| RU2547573C2 (en) | Method for detecting phosphatidyl serine on erythrocyte membrane surface | |
| Choe et al. | Alteration of red cell membrane organization in sickle cell anaemia | |
| Notarangelo et al. | Rapid nickel-based isolation of extracellular vesicles from different biological fluids | |
| Pelissier Vatter et al. | Recent advances in experimental models of breast cancer exosome secretion, characterization and function | |
| Conde-Vancells et al. | Isolation of urinary exosomes from animal models to unravel noninvasive disease biomarkers | |
| RU2665171C2 (en) | Method for detecting phosphatidylserine on the erythrocyte membrane surface | |
| Khanna et al. | Separation and isolation of CD9-positive extracellular vesicles from plasma using flow cytometry | |
| ES2878114T3 (en) | Detection of beta-hemolytic pathogens | |
| JP6652873B2 (en) | Prothrombin time measuring reagent, method for producing the same and method for measuring prothrombin time | |
| RU2701520C1 (en) | Method of assessing the degree of presence of phosphatidylserine on the surface of erythrocyte membranes | |
| Jackson et al. | Facile, generic capture and on-fiber differentiation of exosomes via confocal immunofluorescence microscopy using a capillary-channeled polymer fiber solid-phase extraction tip | |
| Montes et al. | Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions | |
| Koulov et al. | Biophysical studies of a synthetic mimic of the apoptosis‐detecting protein annexin v | |
| Oresti et al. | Lipid biochemical and biophysical changes in rat spermatozoa during isolation and functional activation in vitro | |
| Dong et al. | Establishment of a method for measuring total complement activity based on a hemolysis system using own red blood cells | |
| Palazzo et al. | Circulating exosomes with unique lipid signature in relapsing remitting multiple sclerosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160416 |