[go: up one dir, main page]

RU2618435C1 - Способ микроинкапсулирования стволовых клеток - Google Patents

Способ микроинкапсулирования стволовых клеток Download PDF

Info

Publication number
RU2618435C1
RU2618435C1 RU2016114809A RU2016114809A RU2618435C1 RU 2618435 C1 RU2618435 C1 RU 2618435C1 RU 2016114809 A RU2016114809 A RU 2016114809A RU 2016114809 A RU2016114809 A RU 2016114809A RU 2618435 C1 RU2618435 C1 RU 2618435C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
microcapsules
solution
mmol
cells
stem cells
Prior art date
Application number
RU2016114809A
Other languages
English (en)
Inventor
Андрей Александрович Карпов
Максим Викторович Пузанов
Фарида Ринатовна Альмухаметова
Александра Михайловна Ломакина
Дмитрий Евгеньевич Черепанов
Ольга Михайловна Моисеева
Михаил Михайлович Галагудза
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ)
Priority to RU2016114809A priority Critical patent/RU2618435C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2618435C1 publication Critical patent/RU2618435C1/ru

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, а именно к способу производства микрокапсул, содержащих стволовые клетки (СК) и предназначенных для лечения ишемического повреждения миокарда. Изобретение заключается в том, что суспензию СК в растворе альгината натрия пропускают через форсунку в электростатическом поле и стабилизацию микрокапсул осуществляют в растворе с осмоляльностью 0,23-0,31 осмоль/кг, содержащем 40-60 ммоль/л хлорида кальция и 40-60 ммоль/л хлорида бария. Способ обеспечивает оптимальные сроки биодеградации полученных микрокапсул, а именно 14 дней, и выживаемость инкапсулированных клеток в течение этого периода, превышающую 50%. 3 ил., 1 табл.

Description

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, а именно к производству микрокапсул, содержащих стволовые клетки (СК) и предназначенных для лечения ишемического повреждения миокарда.
Ишемическая болезнь сердца представляет собой широко распространенное заболевание и является основной причиной летальности и инвалидизации в большинстве промышленно развитых стран мира. Клеточная терапия на основе СК является одним из наиболее перспективных направлений развития подходов к лечению ишемического повреждения миокарда. Однако одной из важнейших проблем в этом терапевтическом подходе является массивная гибель стволовых клеток в ранние сроки после трансплантации под воздействием неблагоприятных факторов микроокружения, таких как гипоксия и воздействие иммунной системы реципиента, поэтому клеточная терапия не может продемонстрировать достаточный уровень эффективности. Для увеличения доли жизнеспособных клеток в зоне трансплантации предложен подход на основе микроинкапсулирования клеток.
Известен способ заключения клеток, в том числе клеток островков Лангерганса или гепатоцитов, в полупроницаемую мембрану (US 4391909 А, опубл. 5.07.1983). Способ предполагает создание микрокапсул с полупроницаемой мембраной, содержащих полисахарид, имеющий кислотные группы с молекулярной массой больше чем 3 кДа, стабилизированный катионами поливалентных металлов или полимерами. Инкапсулированные клетки предназначаются для имплантации в организм с целью продукции биоактивных субстанций, характерных для этих клеток в тканях in vivo, и достижения эффектов последних. Для формирования капсул использовали полисахариды, предпочтительно солей альгиновой кислоты, стабилизированные мультивалентными катионами, предпочтительно ионов кальция, или полимерами, содержащими реактивные группы, такие как аминогруппы или иминогруппы. Формирование капсул производили путем помещения капиллярной трубки в центр водоворота, создаваемого с помощью быстрого перемешивания раствора поливалентного катиона. Капли, выбрасываемые из кончика капилляра, немедленно контактировали со стабилизирующим раствором с формированием сферической капсулы.
К недостаткам указанных микрокапсул и способа их получения следует отнести, во-первых, недостаточную стабильность капсул в физиологическом растворе, фосфатном буфере или плазме крови и, во-вторых, низкую производительность синтеза в связи с отсутствием автоматизации процесса.
Известен способ заключения генетически модифицированных мезенхимных СК (МСК), экспрессирующих глюкагоноподобный пептид-1 (ГЛП-1), в микрокапсулы с целью лечения инфаркта миокарда (ЕР 2163243 А1, опубл. 12.09.2008). Для создания микрокапсул использовали раствор калиевой или натриевой соли альгината в физиологическом растворе (наиболее предпочтительная концентрация альгината 1-2% вес/объем) с суспензированными в нем МСК в наиболее предпочтительной концентрации 105-106 кл/мл, кодирующими и секретирующими ГЛП-1. Формирование капсул производили с помощью пропускания через насадку с внутренним диаметром 50-2000 мкм. Для стабилизации капсул использовали бивалентные катионы, предпочтительно катионы бария или кальция (5-100 ммоль/л). Полученные микрокапсулы предназначены для введения в инфарктную, периинфарктную области, а также в область окружающего миокарда и внутрисосудистым способом.
К недостаткам указанных микрокапсул и способа их получения следует отнести, во-первых, сложность процесса синтеза, заключающуюся в необходимости многоэтапного пропускания суспензии альгината и капсул через шприц-помпу. Во-вторых, отсутствие биодеградации микрокапсул, что приводит к длительному нарушению однородности миокарда, дополнительному фиброзу вокруг инородного тела, и, в свою очередь, способствует аритмогенезу.
Известен способ микроинкапсулирования СК для лечения острого ишемического инфаркта миокарда (Levit R. et al. Cellular encapsulation enhances cardiac repair. J Am Heart Assoc. 2013; 2., опубл. 10.11.13). Клетки заключали в микрокапсулы со средним диаметром 250 мкм. Для инкапсуляции использовали суспензию клеток в 1% растворе альгината натрия, пропускаемую через форсунку диаметром 170 мкм с помощью электростатического инкапсулятора (Nisco; Швейцария) и стабилизируемую в растворе 50 ммоль/л хлорида бария.
Недостатком микрокапсул, полученных указанным способом, является отсутствие биодеградации микрокапсул в физиологических условиях. В то же время, с точки зрения сроков формирования рубцовой ткани после повреждения и имеющихся данных о механизмах действия СК, оптимальный срок присутствия инкапсулированных СК в ткани реципиента составляет 14-21 день. Более короткий срок снижает эффективность клеточной терапии, а более продолжительное нахождение капсул в ткани может приводить к фиброзу и нарушению однородности ткани.
Технический результат заявленного изобретения заключается в создании микрокапсул, содержащих СК, с оптимальным временем биодеградации.
Заявленный технический результат достигается в способе микроинкапсулирования стволовых клеток, включающем пропускание суспензии стволовых клеток в растворе альгината натрия через форсунку в электростатическом поле и стабилизацию микрокапсул в растворе, содержащем хлорид бария, согласно которому стабилизацию осуществляют в растворе с осмоляльностью 0,23-0,31 осмоль/кг, содержащем 40-60 ммоль/л хлорида кальция и 40-60 ммоль/л хлорида бария.
Микрокапсулы, полученные с помощью системы высокопроизводительной микроинкапсуляции по принципу дробления потока инкапсулируемой суспензии и рассеивания полученных микрокапель в электростатическом поле с последующей стабилизацией их в растворе, содержащем катионы кальция и бария в диапазоне концентраций 40-60 ммоль/л хлорида кальция и 40-60 ммоль/л хлорида бария, характеризуются устойчивостью в фосфатном буфере в течение первых трех дней, проявляют признаки биодеградации после пятого дня инкубирования и полностью растворяются к четырнадцатому дню инкубирования. Поддержание осмоляльности стабилизирующего раствора в пределах 0,23-0,31 осмоль/кг обеспечивает оптимальную осмотическую силу раствора, которая не влияет на функциональное состояние СК. Микрокапсулы заключают в себе СК, выживаемость которых в течение 14 суток после инкапсулирования превышает 50%.
На чертежах представлены:
Фиг. 1 - динамика биодеградации микрокапсул, полученных по примеру 1;
Фиг. 2 - динамика биодеградации микрокапсул, полученных по примеру 2;
Фиг. 3 - выживаемость инкапсулированных СК.
Способ осуществляют, например, следующим образом.
Для получения микрокапсул 1 мл суспензии клеток в фосфатном буфере (PBS), содержащий 1×106 СК, смешивают с 3 мл 1% раствора альгината натрия. Полученную смесь подают на вход установки Encapsulator В-390 (BUCHI, Швейцария) с параметрами работы: диаметр используемой форсунки - 100-150 мкм, частота вибрации 2500-3500 Гц, напряжение электродов 1500-2500В, давление 400-550 мбар. Такие параметры позволяют получить капсулы из альгината со средними размерами от 150 до 400 мкм. В качестве стабилизирующего раствора для формирования поверхностной оболочки микрокапсулы используют раствор, содержащий 40-60 ммоль/л хлорида кальция и 40-60 ммоль/л хлорида бария, с осмолярностью 0,23-0,31 осмоль/кг. Продолжительность инкубирования в стабилизирующем растворе составляет 5 минут. В дальнейшем капсулы отмывают 5 раз 10 мл PBS.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
1. Для получения микрокапсул 1 мл суспензии клеток в PBS, содержащий 1×106 МСК, смешивали с 3 мл 1% раствора альгината натрия. Полученную смесь подавали на вход установки Encapsulator В-390 с параметрами работы: диаметр используемой форсунки 120 мкм, частота вибрации 2500 Гц, напряжение электродов 2400 В, давление 530 мбар.
В качестве стабилизирующего раствора для формирования поверхностной оболочки микрокапсулы использовали раствор, содержащий 40 ммоль/л хлорида кальция и 60 ммоль/л хлорида бария, при этом осмолярность 0,230 осмоль/кг. Продолжительность инкубирования в стабилизирующем растворе составила 5 минут. В дальнейшем капсулы отмывали 5 раз 10 мл PBS.
В результате были получены капсулы заданного размера 200-250 мкм, среднее количество клеток в одной капсуле 30±3.
2. Для получения микрокапсул 1 мл суспензии клеток в PBS, содержащий 1×106 МСК, смешивали с 3 мл 1% раствора альгината натрия. Полученную смесь подавали на вход установки Encapsulator В-390 с параметрами работы: диаметр используемой форсунки 120 мкм, частота вибрации 3200 Гц, напряжение электродов 1600В, давление 410 мбар.
В качестве стабилизирующего раствора для формирования поверхностной оболочки микрокапсулы использовали раствор, содержащий 60 ммоль/л хлорида кальция и 40 ммоль/л хлорида бария, при этом осмолярность составила 0,245 осмоль/кг. Продолжительность инкубирования в стабилизирующем растворе составила 5 минут. В дальнейшем капсулы отмывали 5 раз 10 мл PBS.
В результате были получены капсулы заданного размера 220-280 мкм, среднее количество клеток в одной капсуле 30±3.
Была проведена оценка стабильности полученных микрокапсул. В обоих примерах стабильность микрокапсул, помещенных в фосфатный буфер, оценивали визуально в динамике в 1 день, 3 день, 5 день, 10 день, 14 день.
Динамика состояния микрокапсул при их инкубировании в фосфатном буфере представлена в таблице и на фигурах 1 и 2.
Figure 00000001
Для оценки жизнеспособности инкапсулированных клеток был использован витальный краситель LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen, США), содержащий бромистый этидий для окраски мертвых клеток и кальцеин AM для окраски живых клеток. Результаты окрашивания визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. Количественную оценку жизнеспособных клеток производили через 30 минут, 5 дней и 14 дней после окрашивания. Процент выживших клеток в обоих примерах не различался и составил 76±6%, 68±9% и 57±8%, соответственно (фиг. 3).
Использование заявленного способа обеспечивает оптимальные сроки биодеградации полученных микрокапсул, а именно 14 дней, и выживаемость инкапсулированных клеток в течение этого периода, превышающую 50%.

Claims (1)

  1. Способ микроинкапсулирования стволовых клеток, включающий пропускание суспензии стволовых клеток в растворе альгината натрия через форсунку в электростатическом поле и стабилизацию микрокапсул в растворе, содержащем хлорид бария, отличающийся тем, что стабилизацию осуществляют в растворе с осмоляльностью 0,23-0,31 осмоль/кг, содержащем 40-60 ммоль/л хлорида кальция и 40-60 ммоль/л хлорида бария.
RU2016114809A 2016-04-15 2016-04-15 Способ микроинкапсулирования стволовых клеток RU2618435C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016114809A RU2618435C1 (ru) 2016-04-15 2016-04-15 Способ микроинкапсулирования стволовых клеток

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016114809A RU2618435C1 (ru) 2016-04-15 2016-04-15 Способ микроинкапсулирования стволовых клеток

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2618435C1 true RU2618435C1 (ru) 2017-05-03

Family

ID=58697897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016114809A RU2618435C1 (ru) 2016-04-15 2016-04-15 Способ микроинкапсулирования стволовых клеток

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2618435C1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6146655A (en) * 1997-08-29 2000-11-14 Softy-Flex Inc. Flexible intra-oral bandage and drug delivery system
US20030044391A1 (en) * 2000-01-20 2003-03-06 Elliott Robert Bartlet Preparation and xenotransplantation of porcine islets
RU2393867C2 (ru) * 2004-10-12 2010-07-10 ФМС БиоПолимер АС Саможелирующиеся альгинатные системы и их применение
WO2013039380A1 (en) * 2011-09-15 2013-03-21 Bender Analytical Holding B.V. Sterile alginate-based aqueous composition for medical use and process for the preparation thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6146655A (en) * 1997-08-29 2000-11-14 Softy-Flex Inc. Flexible intra-oral bandage and drug delivery system
US20030044391A1 (en) * 2000-01-20 2003-03-06 Elliott Robert Bartlet Preparation and xenotransplantation of porcine islets
RU2393867C2 (ru) * 2004-10-12 2010-07-10 ФМС БиоПолимер АС Саможелирующиеся альгинатные системы и их применение
WO2013039380A1 (en) * 2011-09-15 2013-03-21 Bender Analytical Holding B.V. Sterile alginate-based aqueous composition for medical use and process for the preparation thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEVIT R. et al. Cellular encapsulation enhances cardiac repair. J. Am. Heart. Assoc. 2013, 2, РР. 1-11. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2677005T3 (es) Composición parenteral que comprende microesferas con un diámetro entre 10 y 20 micras
KR102063571B1 (ko) 다양한 세포로부터의 표면개질된 엑소좀의 제조방법
AU2003263249B2 (en) Targeting system comprising uniformly-sized nanoparticles with at least one polymer and at least one positively-charged polysaccharide and preparation method thereof
Xu et al. pH-responsive Astragalus polysaccharides-loaded poly (lactic-co-glycolic acid) nanoparticles and their in vitro immunogenicity
ES2205065T3 (es) Medicamento, en especial para modulacion de la respuesta inmunitaria den la lucha contra virus, tumores, bacterias y parasitos.
US20130331738A1 (en) Compositions and methods for potentiating sonothrombolysis
US20250249025A1 (en) Drug delivery carrier utilizing property of d-allose being uptaken by cancer cell, drug delivery method, and composition for treating renal cell carcinoma
RU2618435C1 (ru) Способ микроинкапсулирования стволовых клеток
ES2403544B2 (es) Sistemas nanoparticulares elaborados a base de ésteres de sorbitán.
CN107970228A (zh) 一种以壳聚糖-tpp-kgm为复合壁材的纳米微囊的制备方法
CN106399291A (zh) 一种半乳糖基接枝改性的海藻酸盐微球及应用
CN106701730A (zh) 含半乳糖基壳聚糖分子的海藻酸盐水凝胶微球载体及应用
CN104324032B (zh) 抗结核药物三联复方微球血管靶向栓塞缓释剂及其制备方法和用途
Pandey et al. Alginate as a drug delivery carrier
Zhang et al. Nano-lipid contrast agent combined with ultrasound-guided SGB in nursing treatment of lymphedema after breast cancer surgery
JPS61501989A (ja) 人工代用血液およびその製造方法
CA3083357C (en) Anisotropic nanoparticle compositions and methods
Rees The ultrastructure of the cysticercoid of Tatria octacantha Rees, 1973 (Cyclophyllidea: Amabiliidae) from the haemocoele of the damsel-fly nymphs Pyrrhosoma nymphula, Sulz and Enallagma cyathigerum, Charp
CN107362135B (zh) 大黄酸静脉注射脂质微泡及其制备方法
CN105963778A (zh) 一种内层释放no气体的多结构人工血管支架及其制备方法
WO2020045162A1 (ja) 薬物送達用担体
EP0599942A1 (en) A method of making biocompatible capsules containing cells.
CN102670611B (zh) 抗结核药物三联复方微球血管靶向栓塞缓释剂及其制备方法和用途
ES2302770T3 (es) Mezcla de sustancias activas de extractos del genero vaccinium y compuestos de caroteno.
Kim et al. Long-term insulinotropic activity of glucagon-like peptide-1/polymer conjugate on islet microcapsules