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ES2677005T3 - Composición parenteral que comprende microesferas con un diámetro entre 10 y 20 micras - Google Patents

Composición parenteral que comprende microesferas con un diámetro entre 10 y 20 micras Download PDF

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ES2677005T3
ES2677005T3 ES09781530.2T ES09781530T ES2677005T3 ES 2677005 T3 ES2677005 T3 ES 2677005T3 ES 09781530 T ES09781530 T ES 09781530T ES 2677005 T3 ES2677005 T3 ES 2677005T3
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Bernardo Nadal Ginard
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Coretherapix SL
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Publication date
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Abstract

Una formulación farmacéutica para administración intraarterial aguas arriba de un tejido diana, que comprende partículas esféricas que contienen un ingrediente activo y un excipiente biodegradable, en donde: el diámetro medio de las partículas es de 15 micras y el 99 % o más de las partículas tienen un diámetro de 15 ± 1 micras; el diámetro de 15 ± 1 micras hace posible la retención de partículas en un tejido diana después de la administración de la formulación farmacéutica aguas arriba del tejido diana; y la formulación está sustancialmente libre de partículas con un diámetro mayor que 50 micras y menor que micras; de tal manera que cuando la formulación se administra aguas arriba del tejido diana, la capacidad del ingrediente activo de pasar a través del tejido diana y pasar a la circulación sistémica se restringe gracias al atrapamiento de las partículas en los capilares del tejido diana.

Description

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DESCRIPCION
Composicion parenteral que comprende microesferas con un diametro entre 10 y 20 micras Compuestos y metodos Campo de la invencion
La presente divulgacion se refiere a formulaciones farmaceuticas adecuadas para dirigirse a un tejido y/u organo u organos particulares con un ingrediente activo formulado, por ejemplo cuando se administra aguas arriba del organo o tejido diana. La divulgacion se refiere tambien al uso de las mismas en tratamiento y a los metodos de preparacion de las formulaciones.
En particular, se emplean diferentes factores de crecimiento y citocinas para estimular la capacidad regenerativa intnnseca de los tejidos solidos mediante la activacion de su poblacion de celulas madre residentes utilizando un dispositivo, tal como un cateter, para la administracion localizada de los compuestos activos al tejido diana.
Antecedentes de la invencion
La mayor parte de los medicamentos/productos farmaceuticos se administran por via sistemica, por ejemplo, por via oral, por via intravenosa, por vacuna, por via intramuscular o similares. Son excepciones notables los stents recubiertos con ingredientes activos, ciertas formulaciones respiratorias administradas directamente a los pulmones, ciertas radioterapias que se dirigen a zonas diana y ciertos tratamientos dermatologicos, oftalmologicos y otologicos que se administran topicamente.
Sin embargo, cuando sea apropiado, sena ventajoso poder administrar el producto farmaceutico principalmente a un tejido u organo enfermo, porque esto podna reducir la dosis requerida y tambien minimizar los efectos secundarios. Tal estrategia sena particularmente ventajosa para dos areas principales de la medicina: a) la administracion de factores de crecimiento y citocinas capaces de activar el crecimiento y la diferenciacion de celulas madre residentes en un tejido particular. Debido a la potente actividad biologica de estas moleculas, sena deseable limitar su accion al tejido deseado, con un derrame mmimo o nulo en el resto del cuerpo; b) la administracion de agentes quimioterapeuticos para el cancer porque si se pudieran dirigir espedficamente al tejido canceroso, entonces sena posible la administracion de dosis mas altas a las celulas diana, a la vez que se reducinan los terribles efectos secundarios toxicos de los mismos, al menos en gran medida.
En situaciones mas agudas, tales como en ataques cardfacos e ictus, senan posibles mejores tratamientos, en particular los dirigidos a regenerar el tejido danado, si los organos afectados pudieran ser el objetivo espedfico. En situaciones cronicas, tales como la enfermedad de Parkinson, la diabetes o la fibrosis pulmonar, la administracion local de agentes capaces de reconstituir el tipo o tipos de celulas deficientes tiene el potencial de mejorar el pronostico de la enfermedad.
Sin embargo, la administracion reproducible de ingredientes activos al tejido diana o a un organo diana de una manera terapeuticamente eficaz es influida en gran medida por los componentes (incluidos los excipientes) empleados, sus caractensticas ffsicas, la dosis y el modo de administracion.
El documento WO2007/055561 se refiere a metodos para la regeneracion vascular a traves de la modulacion de la actividad de R-Ras. Se puede administrar una protema R-Ras en una composicion de liberacion controlada que comprende microesferas biodegradables impregnadas con la protema R-Ras, que se pueden unir a un peptido localizador (homing) para administrar la composicion a una localizacion requerida. Las microesferas pueden tener un diametro de 10-50 pm.
El documento W02004/022000 se refiere a microesferas para la liberacion controlada casi lineal de un antibiotico. Las microesferas se destinan a la implantacion o inyeccion dentro del cuerpo en un sitio de infeccion real o potencial. Se ejemplifican microesferas de aproximadamente 15-20 pm y 7,46 pm de diametro.
El documento EP1350518 se refiere a formulaciones para la liberacion prolongada controlada de GM-CSF. Las formulaciones se basan en micropartmulas solidas formadas por polfmeros sinteticos biodegradables y que tienen un tamano entre 10 y 100 pm.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1: Muestra la distribucion y caracterizacion de las celulas cardfacas c-kitpos en el corazon de porcino adulto.
Figura 2: Muestra imagenes de microscopfa optica que presentan varias celulas cardfacas porcinas expandidas
Figura 3: Muestra la tincion por H&E de corazones porcinos tratados con GF
Figura 4: Muestra evidencia de activacion de CSC endogenas
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Figura 5: Muestra bandas de regeneracion de celulas pequenas recien formadas Figura 6: Muestra varias imagenes de tejido recien formado
Figura 7: Muestra una imagen de microscopio optico de partfculas de PLGA (acido poli(lactico-co-glicolico)) con IGF-1 preparado como en el Ejemplo 1.
Figura 8 Muestra una micrograffa electronica de partfculas de PLGA con IGF-1 preparado como en el Ejemplo 1. Figura 9: Muestra secciones de corazon porcino.
Figura 10: Muestra secciones de miocardio porcino despues de la administracion de microesferas de poliestireno o de PLGA y microesferas de factor de crecimiento.
Figura 11: Muestra secciones de corazon porcino en las que se destacan las celulas madre cardiacas endogenas. Figura 12: Muestra imagenes histologicas de musculo cuadriceps control y danado.
Figura 13A: Compara el efecto del numero de miocitos cardfacos regenerados en cerdos post AMI (infarto de miocardio agudo) tratados con una combinacion de dos tipos de microesferas.
Figura 13B: Muestra la fraccion de eyeccion del ventnculo izquierdo antes, inmediatamente despues y 4 semanas despues del AMI determinada por ecocardiograffa de los cerdos tratados con diferentes combinaciones de microesferas.
La presente divulgacion proporciona una formulacion farmaceutica para administracion intraarterial aguas arriba de un tejido diana, que comprende partfculas esfericas que contienen un ingrediente activo y un excipiente biodegradable, en donde:
el diametro medio de las partfculas es de 15 micras y el 99 % o mas de las partfculas tienen un diametro de 15 ± 1 micras;
el diametro de 15 ± 1 micras hace posible la retencion de partfculas en un tejido diana despues de la administracion de la formulacion farmaceutica aguas arriba del tejido diana; y
la formulacion esta sustancialmente libre de partfculas con un diametro mayor que 50 micras y menor que 5 micras;
de tal manera que cuando la formulacion se administra aguas arriba del tejido diana, la capacidad del ingrediente activo de pasar a traves del tejido diana y pasar a la circulacion sistemica se restringe gracias al atrapamiento de las partfculas en los capilares del tejido diana.
Es decir, el ingrediente activo se retiene en el tejido diana mientras que su capacidad para atravesar el tejido diana y pasar a la circulacion sistemica esta severamente restringida o anulada. Por lo tanto, en un aspecto particular de la invencion, se proporciona una formulacion farmaceutica como se ha definido antes para la administracion intraarterial aguas arriba de un tejido cardfaco.
En un aspecto de la invencion, se proporciona una formulacion farmaceutica como se ha definido antes para la administracion intraarterial a un tejido cardfaco, comprendiendo dicha composicion farmaceutica partfculas que contienen un ingrediente activo, seleccionado del grupo que consiste en HGF e IGF-1, y un excipiente biodegradable, en donde el 90 % o mas de las partfculas tienen un diametro entre 10 y 20 micras, de tal modo que cuando se administra la formulacion aguas arriba del tejido cardfaco, la capacidad del ingrediente activo para atravesar el tejido cardfaco y pasar a la circulacion sistemica esta restringida .
Aunque no se desea limitarse a la teona, se cree que las formulaciones de la presente divulgacion, cuando se administran en la sangre arterial aguas arriba del tejido u organo diana, se transportan hasta el tejido u organo diana por la circulacion y debido al tamano de partfcula y al centro de distribucion, en otras palabras, quedan atrapadas o cogidas en los capilares del tejido u organo, que tienen un diametro de aproximadamente 5-10 pm. Las partfculas que se alojan en los capilares y bloquean el flujo sangumeo generalmente no son deseables, pero el numero de capilares afectados por la formulacion de la divulgacion es relativamente pequeno, particularmente porque la formulacion permite emplear dosis terapeuticas muy bajas. Ademas, el excipiente biodegradable se funde, se disuelve, se degrada o de alguna forma se disocia del ingrediente activo y, por lo tanto, finalmente se elimina el "bloqueo". Por lo tanto, el movimiento de la partfcula se restringe/retrasa por el alojamiento en los capilares, un proceso reversible que hace que los capilares vuelvan a la condicion natural despues de un corto penodo. El retrasar el movimiento de las partfculas durante un penodo corto permite que el ingrediente activo se mantenga cerca del objetivo durante un penodo de tiempo apropiado para facilitar la accion local o la absorcion del ingrediente activo en el espacio extravascular del tejido.
La formulacion se disena de tal manera que la mayor parte, si no todo el ingrediente activo se libera de las partfculas mientras estan inmovilizadas en el lecho vascular del tejido diana. Una vez que se libera la carga activa, las
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partfculas estan disenadas para ser degradadas y para que sus materiales constituyentes sean liberados a la circulacion general para ser o metabolizados o eliminados a traves del tngado y/o el rinon.
La presente divulgacion proporciona una formulacion farmaceutica para administracion parenteral a un tejido diana que comprende partfculas esfericas que contienen un ingrediente activo y un excipiente biodegradable, en donde
el diametro medio de las partfculas es de 15 micras y el 99 % o mas de las partfculas tienen un diametro de 15 ± 1 micras;
el diametro de 15 ± 1 micras hace posible la retencion de partfculas en un tejido diana despues de la administracion de la formulacion farmaceutica aguas arriba del tejido diana; y
la formulacion esta sustancialmente libre de partfculas con un diametro mayor que 50 micras y menor que 5 micras;
de tal manera que cuando la formulacion se administra aguas arriba del tejido diana, el ingrediente activo es retenido en el tejido u organo diana durante un penodo terapeuticamente eficaz.
En particular, las formulaciones de la presente divulgacion permiten emplear cantidades mas bajas de los ingredientes activos porque la mayor parte del ingrediente activo se retiene en el tejido objetivo en lugar de pasar a la circulacion sistemica. Esto parece aumentar la ventana terapeutica del ingrediente activo. Esto es, el intervalo de dosis en el que el ingrediente es terapeuticamente activo se incrementa permitiendo que se puedan administrar cantidades absolutas mas pequenas. La administracion local de una dosis mas baja significa que es probable que se minimicen los efectos secundarios.
Las dosis adecuadas estan, por ejemplo, en el intervalo de 0,05 pg/kg a aproximadamente 10 pg/kg, tal como 10 |jg/kg a aproximadamente 0,5 pg/kg, en particular 0,15, 0,2, 0,25, 0,35, 0,4 o 0,45 pg/kg.
La administracion de dosis mas bajas por via local para el efecto terapeutico es particularmente importante para moleculas potentes, por ejemplo, factores de crecimiento, que se sabe que tienen potencial para estimular la oncogenesis. Estos efectos secundarios potencialmente daninos limitan la utilidad de tales moleculas aunque en circunstancias correctas producen efectos terapeuticamente beneficiosos.
Las formulaciones de la presente divulgacion no emplean microesferas que comprenden un poliestireno, sflice u otra perla no biodegradable con ingrediente activo unido a la misma, porque los materiales elasticos duraderos, es decir materiales no biodegradables tales como el poliestireno y la sflice pueden causar danos a los capilares locales, y pueden actuar como cuerpos extranos y producir reacciones inflamatorias locales. Ademas, tales perlas no biodegradables podnan eventualmente tener acceso a la circulacion sistemica y pueden entonces, por ejemplo, acumularse en un tejido distante tal como los pulmones y el tngado, todos los cuales son indeseables.
Generalmente, cada partfcula comprendera ingrediente activo y excipiente. No se pretende que la descripcion de la formulacion se refiera a partfculas discretas de ingrediente activo y partfculas separadas de polfmero biodegradable en una mezcla simple.
La expresion sustancialmente libre de partfculas de mas de 50 micras, como se emplea supra, se pretende que se refiera a formulaciones que cumplen los criterios para ser administradas como una formulacion parenteral establecida en la farmacopea de Estados Unidos y/o en la farmacopea europea.
En una realizacion, sustancialmente libre puede incluir contener menos del 5 % de dichas partfculas, particularmente menos del 1 %, por ejemplo menos del 0,5 %, tal como menos del 0,1 %.
En una realizacion, la formulacion no contiene partfculas de menos de 1 micra de diametro.
En una realizacion, la formulacion no contiene partfculas de menos de 5 micras de diametro.
En una realizacion, al menos el 80 % de las partfculas con el ingrediente activo son retenidas en el tejido diana despues de la administracion.
En una realizacion, las partfculas del ingrediente activo se retienen en el tejido u organo diana durante un penodo en el intervalo de 5 minutos a 24 horas, por ejemplo de 30 minutos a 5 horas, tal como 1, 2, 3 o 4 horas.
El penodo en que la formulacion es retenida en el tejido u organo relevante depende principalmente del excipiente o de la combinacion de excipientes empleados. Por lo tanto, las propiedades requeridas del excipiente in vivo son:
• que sea biocompatible (es decir, en general no toxico y adecuado para administracion a humanos y/o animales),
• que dentro de un marco de tiempo apropiado despues de la administracion, contribuya a mantener la integridad de la partfcula suficientemente para que el movimiento de la partfcula se retarde, por ejemplo, alojandose en un capilar o arteriola en el tejido u organo diana, y
• que sea biodegradable (es dedr, es capaz de ser procesado o metabolizado) por el cuerpo para liberar el
ingrediente activo y despues de que se haya liberado el ingrediente activo.
Por lo tanto, un excipiente polimerico biodegradable adecuado para uso en la presente divulgacion es un polfmero o copolfmero que no tenga un largo tiempo de residencia in vivo, es decir, que no incluya entidades tales como 5 poliestireno, polipropileno, polietileno de alta densidad y material con propiedades similares. Los polfmeros biodegradables deben ser no toxicos y se deben descomponer en subunidades no toxicas preferiblemente localmente, de tal manera que la cantidad de fragmentos/restos circulantes del excipiente sea minima.
Los excipientes adecuados se pueden encontrar en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) e incluyen polfmeros inorganicos asf como organicos, naturales y artificiales. Los ejemplos pueden incluir polfmeros tales como 10 acido polilactico, poli-glicolida o una combinacion de los mismos, a saber, acido poli(lactico-co-glicolico), policaprolactona (que tiene una velocidad de biodegradacion mas lenta que el acido poli(lactico-co-glicolico)), polihidroxibutirato o combinaciones de los mismos. Tambien pueden ser adecuados poliuretanos, polisacaridos, protemas y poliaminoacidos, carbohidratos, quitosano, heparina, acido polihialuronico, etc. El excipiente generalmente esta en forma de una partfcula, una esfera aproximada (microesfera) a la que se puede unir el 15 ingrediente activo o con la que se asocia el ingrediente activo o se incorpora dentro.
Los liposomas son excipientes polimericos no biodegradables dentro del significado de la presente divulgacion. Los liposomas son vesfculas de una bicapa de fosfolfpidos que generalmente comprenden colesterol. Para enfermedades tales como infarto de miocardio inducido por arterioesclerosis, se monitorizan los niveles de colesterol como uno de los factores de riesgo para la enfermedad y, por lo tanto, puede ser aconsejable evitar la 20 administracion de formulaciones que contienen colesterol a tales pacientes. Ademas, los pacientes con cirrosis hepatica pueden tener una mayor dificultad para metabolizar los lfpidos y las grasas de la dieta, por lo tanto, la administracion de liposomas a dichos pacientes puede no ser aconsejable.
En una realizacion, el excipiente biodegradable no es un hidrogel (una fase continua de una fase dispersa coloidal correspondiente).
25 Asf, tanto la velocidad de "liberacion" del ingrediente activo como la velocidad de "disolucion" de la partfcula se pueden modificar cambiando el excipiente y/o el metodo de union del ingrediente activo al excipiente, de modo que, por ejemplo, el empleo de policaprolactona proporcionana una partfcula que tarda mas tiempo en disolverse o desintegrarse que una partfcula correspondiente que emplea acido poli(lactico-co-glicolico). Si el ingrediente activo esta incluido dentro del excipiente, se liberara mas lentamente que si esta en la superficie de la partfcula. Si esta en 30 la superficie y unido por carga electrostatica, se liberara mas rapidamente que si estuviera unido covalentemente.
En una realizacion, el excipiente comprende acido poli(lactico-co-glicolico).
En una realizacion, sustancialmente todas las partfculas, por ejemplo, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de las partfculas comprenden acido poli(lactico-co-glicolico).
En una realizacion, el acido poli(lactico-co-glicolico) esta en la relacion 75:25, respectivamente.
35 En una realizacion, el excipiente comprende dos o mas polfmeros distintos, el termino polfmero incluye copolfmeros. En una realizacion, el excipiente puede incluir un polfmero de acrilato, por ejemplo un polfmero de metacrilato.
En una realizacion, la partfcula comprende alginato.
En una realizacion, el excipiente comprende una forma biodegradable de poliuretano.
En una realizacion, el excipiente esta en forma de una microesfera.
40 En una realizacion, la divulgacion emplea una formulacion de microesferas de alcohol polivimlico.
En una realizacion, las microesferas no son albumina.
En una realizacion, el ingrediente o ingredientes activos empleados se encapsulan dentro de una cubierta biodegradable, por ejemplo, seleccionada de la cadena Eudragit.
En una realizacion, una o mas moleculas de ingrediente activo estan incluidas dentro de la partfcula.
45 Para que los compuestos activos funcionen, como se describe en la presente descripcion, necesitan ser administrados a la circulacion como una micropartfcula que debido a su tamano, morfologfa y composicion viajara con el flujo sangumeo para alcanzar su tejido diana. En la diana, la partfcula debe liberar su carga activa de una manera controlable. Para lograr este objetivo, una vez descargada, la partfcula debe ser degradada y sus constituyentes deben ser metabolizados o administrados a la circulacion sistemica para ser eliminados por los 50 sistemas de excrecion normales del cuerpo.
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Para lograr estos objetivos, las micropartfculas deben cumplir las siguientes caractensticas:
Las micropartfculas deben ser de tamano y morfologfa uniformes con el fin de asegurar que lleguen y se alojen en el nivel disenado del sistema circulatorio. La uniformidad de tamano y forma se controla mejor cuando las partfculas son esfericas.
La mayor parte de los lechos capilares permiten el paso libre de partfculas con un diametro < 6 micras de diametro, las microesferas de esta divulgacion deben tener un diametro de ~ 15 micras. Las partfculas en el intervalo de 20 micras de diametro o mayor se alojan en arteriolas precapilares o arteriolas y bloquean el flujo de sangre a varios capilares a la vez. Por lo tanto, podnan crear infartos microscopicos. Por lo tanto, para la administracion de terapias regenerativas, el diametro mas adecuado de las microesferas esta en el intervalo de 15 micras. El tiempo requerido para liberar el compuesto activo una vez que las microesferas hayan alcanzado su diana puede variar desde minutos hasta dfas e incluso semanas, dependiendo del tipo de microesfera y del objetivo terapeutico.
Las microesferas deben estar hechas con un compuesto biodegradable y no toxico. La estabilidad de la partfcula y su tiempo de degradacion dependeran de la composicion y del tipo de la microesfera. Puede estar disenada para administrar su carga antes de que empiece a degradarse; alternativamente, puede estar disenada de manera que la administracion de su carga tenga lugar cuando la partfcula se desintegra.
La naturaleza del polfmero utilizado como excipiente, su tamano, la labilidad de los enlaces entre los monomeros y el grado de reticulacion, si la hubiera, afectaran a la velocidad de liberacion del ingrediente activo asf como a la estabilidad y degradabilidad de la partfcula.
En todas las realizaciones, las microesferas deben ser lo suficientemente estables en solucion para que no se rompan ni se degraden sustancialmente durante su administracion a la circulacion y durante el tiempo requerido para que alcancen el lecho vascular objetivo.
En una realizacion adecuada de la divulgacion, cada partfcula llevara un unico tipo de compuesto activo. Cuando se cree que una mezcla de compuestos es beneficiosa para fines terapeuticos, se puede administrar una mezcla de micropartfculas, cada una cargada con un unico tipo de compuesto. Este diseno simplifica la produccion de los compuestos terapeuticos y ofrece una mayor flexibilidad terapeutica, permitiendo asf que se preparen rapidamente medicamentos individualizados para satisfacer las necesidades espedficas individuales del paciente.
En una realizacion, la partfcula o partfculas empleadas tienen solo un tipo de molecula activa unida a ellas.
En una realizacion, la partfcula o partfculas empleadas tienen una mezcla, tal como dos, tres o cuatro moleculas activas unidas a ellas.
El compuesto activo puede ser cargado en la partfcula en el momento de su formacion y, por ejemplo, se puede dispersar por toda la partfcula.
El compuesto activo puede estar encapsulado dentro de la partfcula donde el excipiente forma la cubierta de la microesfera.
En una realizacion, el ingrediente o ingredientes activos se unen a la partfcula o partfculas mediante enlaces covalentes, por ejemplo, un polipeptido o protema se une a una microesfera a traves de reticulacion por tratamiento con un aldetudo tal como formaldetudo o glutaldetudo, por ejemplo emulsionando la microesfera (o ingrediente de las microesferas) en presencia del ingrediente o ingredientes activos, un aldetudo adecuado y homogeneizando la mezcla en condiciones adecuadas para formar partfculas del tamano requerido. Alternativamente, el ingrediente activo se puede unir a un grupo carboxilato localizado sobre la microesfera del excipiente.
En una realizacion, el ingrediente o ingredientes activos se unen a la partfcula o partfculas por fuerzas electrostaticas (carga).
En una realizacion, el ingrediente o ingredientes activos se unen a una partfcula o partfculas a traves de un polielectrolito tal que, por ejemplo, comprende iones de sodio, potasio, magnesio y calcio con contraiones de cloruro en solucion acuosa.
En una realizacion, el ingrediente o ingredientes activos se unen a una partfcula o partfculas entre capas de polielectrolitos.
El compuesto activo se puede cargar sobre la superficie de la partfcula ya sea por carga (fuerzas electrostaticas) o unido covalentemente. En una realizacion, el ingrediente o ingredientes activos se unen a la partfcula por carga electrostatica.
En una realizacion, el ingrediente o ingredientes activos se unen a la partfcula por polielectrolitos, por ejemplo por medio de una cubierta de polielectrolito que cubre la partfcula sobre la cual se une el ingrediente activo por carga.
El compuesto activo puede formar una unica capa sobre la superficie de la partfcula o se puede depositar en
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multiples capas, ya sean contiguas o separadas por capas de polielectrolito.
El compuesto activo se puede unir a la partfcula por medio de "enlazadores" que por un lado se unen a la matriz de excipiente y por el otro al compuesto activo. Estos enlaces pueden ser electrostaticos o covalentes.
Las micropartfculas se pueden estabilizar, por ejemplo, por liofilizacion. La micropartfcula tambien puede ser estable cuando se congela.
En una realizacion, el excipiente se degrada rapidamente en el intervalo de minutos a horas, o durante un penodo mas largo tal como semanas a meses.
En una realizacion, la formulacion es tal que, una vez en la circulacion, uno o mas ingredientes activos se liberan rapidamente, por ejemplo, en un penodo en el intervalo de 1 a 30 minutos a aproximadamente 1 a 12 horas.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a una poblacion mixta de partfculas, es decir, partfculas con diferentes velocidades de "disolucion", que se pueden usar para proporcionar una formulacion con liberacion controlada o pulsada.
Por lo tanto, las formulaciones de la divulgacion pueden comprender partfculas con diferentes cineticas de liberacion y velocidades de degradacion.
En una realizacion, el ingrediente activo se libera a lo largo de un penodo de 1 a 24 horas.
En una realizacion, el ingrediente activo se libera a lo largo de un penodo de 1 dfa a 7 dfas.
Por lo tanto, en una o mas realizaciones, toda la formulacion de la divulgacion se metaboliza dentro de los 7 dfas de la administracion.
En una realizacion una vez en la circulacion del individuo, el ingrediente o ingredientes activos se liberan muy lentamente, a lo largo de un penodo de semanas a meses, por ejemplo de 1 semana a 1, 2 o 3 meses.
En una realizacion, la poblacion de partfculas esta bien caracterizada y, por ejemplo, tiene las mismas caractensticas. Es decir, las propiedades ffsicas y/o qmmicas de cada partfcula estan dentro de un intervalo definido estrecho.
En una realizacion, el tamano de las microesferas se monodispersa.
Asf, en una realizacion, las partfculas de la formulacion tienen un tamano medio de partfcula con una pequena desviacion estandar, de tal modo que al menos el 99 % de las partfculas tienen un tamano de partfcula de +/- 1 micra de la media (15 +/- 1 micras). En una realizacion, la formulacion comprende una poblacion de partfculas caracterizada porque las poblaciones contienen al menos dos tipos distintos de partfculas, por ejemplo, las partfculas distintas pueden tener diferentes ingredientes activos, recubrimientos, tamano de partfcula o una combinacion de los mismos.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a una poblacion mixta de partfculas que comprenden partfculas de ingrediente activo en mezcla con partfculas de uno o mas ingredientes activos distintos adicionales.
Parece que el tamano de partfcula y la distribucion de la formulacion influye en el perfil de la formulacion in vivo, incluyendo como se distribuye la formulacion en el tejido. Parece que es insuficiente tener simplemente un tamano medio de partfcula dentro del intervalo de 10 a 20 micras porque esto permite que algunas partfculas tengan un tamano de partfcula mucho mas grande y tambien un tamano de partfcula mucho mas pequeno. Esta variacion puede causar problemas in vivo porque, por ejemplo, las partfculas pequenas no son retenidas en el tejido relevante y las partfculas mas grandes pueden danar el tejido.
La cantidad de ingrediente activo:excipiente empleada puede estar en la relacion de 1 %:99 % p/p, 5 %:95 % p/p, 10 %:90 % p/p, 20 %:80 % p/p, 30 %:70 % p/p, 40 %:60 % p/p, 50 %:50 % p/p, 60 %:40 % p/p, 70 %:30 % p/p, 80 %:20 % p/p o 90 %:10 % p/p, dependiendo de que perfil de liberacion se requiere. Si se requiere que el ingrediente activo se libere rapidamente o inmediatamente in vivo, se puede elegir una relacion mas alta de ingrediente activo a excipiente.
En una realizacion, la microesfera empleada tiene una semivida de aproximadamente 16 horas.
En una realizacion, la formulacion se liofiliza.
En otra realizacion, la formulacion se congela.
Las partfculas de la divulgacion son no magneticas en una extension apreciable.
El ingrediente activo puede ser cualquier medicamento o producto farmaceutico que se pueda administrar en forma de una partfcula segun la divulgacion.
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En una realizacion, se administran 15 x 106 partmulas (microesferas), se administran tal como 14 x 106, 13 x 106, 12 x 106, 11 x 106, 10 x 106, 9 x 106, 8 x 106, 7 x 106, 6 x 106, 5 x 106, 4 x 106, 3 x 106, 2 x 106 o 1 x 106 partroulas.
Una partmula como se emplea en la presente memoria puede comprender, por ejemplo, un farmaco micronizado, entidades semisolidas o hidratadas tales como protemas o ingredientes activos derivados biologicamente formulados como partroulas discretas, siempre que la partroula mantenga su estructura durante un penodo suficiente para realizar la funcion requerida. La divulgacion se extiende tambien a partroulas con un nucleo Kquido a condicion de que la integridad externa de la partroula sea tal que pueda realizar su funcion in vivo. La divulgacion no se extiende a partroulas con un nucleo de gas.
Las microesferas se pueden fabricar emulsionando una solucion de polfmero, seguido por la evaporacion del disolvente. En otros casos, se emulsionan los monomeros seguido por polimerizacion termica o por UV. Alternativamente, un polfmero fundido se emulsiona y se enfna sucesivamente para solidificar las gotitas. Se puede obtener una reduccion del tamano de la emulsion homogeneizando o sometiendo a ultrasonidos el volumen. Las microesferas se pueden recoger filtrando y/o centrifugando la mezcla de reaccion.
Las microesferas y microcapsulas biodegradables de biopolfmeros para la liberacion controlada y la administracion dirigida de diferentes compuestos farmaceuticos y macromoleculas terapeuticas se conocen desde hace mucho tiempo en una serie de formas, particularmente las de diametros relativamente grandes como se describe en la presente divulgacion (vease D.D. Lewis "Biodegradable polymers and drug delivery systems" M. Chasin and R. Langer, editors (Marcel Dekker, New York, 1990); J.P. McGee et al., J. Control. Release 34:77, 1995).
Las microesferas y las microcapsulas se producen rutinariamente mediante metodos ffsico-mecanicos tales como pulverizacion de los monomeros constituyentes en microgotitas del tamano correcto seguido por una etapa de secado o de polimerizacion. Tales micropartroulas se pueden formar tambien mediante emulsificacion seguida de la eliminacion del disolvente emulsionante (B. Miksa et al., Colloid Polym. Sci. 273: 47, 1995; G. Crotts et al., J. Control. Release 35:91, 1995). El principal desafro de estos metodos es la produccion de una poblacion monodispersa de partroulas en forma y tamano. Esto, por ejemplo, se puede lograr empleando una tecnica de enfoque de flujo en la que se usa un nebulizador capilar para formar microgotitas del tamano apropiado. En el procedimiento, los componentes se sumergen en una solucion de recogida/disolvente que sirve para disolver/suspender los componentes de la micropartroula, seguido por la evaporacion del disolvente para proporcionar micropartroulas solidificadas.
Este procedimiento puede requerir que todos los componentes de la micropartroula se combinen en una unica mezcla (el compuesto enfocado) a partir de la cual se generan las microgotitas que formaran las micropartroulas. Como muchos de los polfmeros utilizados para la administracion de farmacos son hidrofobos, mientras que la mayona de las macromoleculas terapeuticas, y particularmente las protemas, son hidrofilas, la mezcla requiere emulsionarse para asegurar que se obtiene una composicion homogenea antes de que se formen las micropartroulas.
Alternativamente, se pueden preparar las partroulas, por ejemplo, aspirando una solucion de ingrediente activo a las microesferas en una corriente de conveccion, desde una boquilla con una carga electrica neta hacia una placa o entidad con una contracarga, en una disposicion de tipo anodo/catodo.
En una realizacion, las partroulas empleadas tienen una carga electrica neta, por ejemplo, una carga positiva o una carga negativa. Esto puede ayudar, por ejemplo, a que el movimiento de la partroula sea retardado en el tejido u organo diana. Esta carga neta se puede equilibrar en la formulacion para administracion mediante esferas de contraion (por ejemplo sin ingrediente activo) de una dimension pequena, por ejemplo menos de 5 micras, que no son retenidas dentro del tejido diana despues de la administracion.
En una realizacion, el ingrediente activo es una molecula biologica o derivada de la misma, por ejemplo, una protema tal como un anticuerpo o un factor de crecimiento, una citocina o una combinacion de entidades.
En particular, las formulaciones de la divulgacion son, particularmente utiles para seleccionar/activar las celulas madre residentes que se encuentran en el tejido relevante.
En una realizacion preferida, la divulgacion se utiliza para activar las celulas madre, progenitoras y/o precursoras residentes de un tejido u organo particular para estimular la regeneracion de dicho tejido u organo.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a la administracion localizada de ligandos para los receptores expresados por las celulas madre presentes en el tejido posnatal para iniciar la regeneracion del mismo. El ligando puede ser, por ejemplo, una hormona del crecimiento como se describe en la presente memoria.
En una realizacion, los ligandos se administran para activar a los receptores presentes en las celulas madre mas indiferenciadas presentes en cada tejido diana. Estas celulas expresan los llamados "genes de multipotencia", tales como Oct 4, Sox2, Nanog, etc. y tienen una potente capacidad regenerativa (de aqrn en adelante, conocidas como celulas madre que expresan Oct4).
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En una realizacion, el ligando se administra al corazon para minimizar y/o regenerar el dano tisular causado, por ejemplo, por un infarto de miocardio.
Cuando una arteria esta obstruida, el efecto principal es una perdida del tejido aguas abajo de la obstruccion. La consecuencia espedfica de la obstruccion de una arteria coronaria es un infarto de miocardio (MI, por sus siglas en ingles) que produce la perdida irreversible de una porcion del musculo cardfaco. Esta perdida da como resultado una disminucion de la capacidad contractil del miocardio y de la capacidad de bombeo del corazon lo que, cuando es suficientemente importante, limita su capacidad de proporcionar el gasto cardfaco apropiado y produce una limitacion grave y progresiva de la capacidad de la persona (revisado en Nadal-Ginard et al., Circ. Res. 2003; 92: 139).
Solo en los Estados Unidos y en la Union Europea son tratados cada ano mas de 1,5 millones de infartos de miocardio y hay mas de 11 millones de supervivientes de infarto de miocardio (American Heart Association, 2007; British Heart Association, 2007). De estos, mas del 30 % mueren durante el primer ano posterior al infarto. La supervivencia post-MI depende en gran medida del tamano del infarto (% de la masa muscular perdida) debido al suceso isquemico. Cuando la perdida afecta ~40-45 % de la masa del ventnculo izquierdo, produce un shock cardiogenico irreversible que es uniformemente letal (Page et al., 1971. N. Engl. J. Med. 285; 133). Esta perdida segmentaria de miocardio produce una reorganizacion del miocardio restante con aumento de muerte celular por apoptosis, hipertrofia de los miocitos supervivientes, aumento de fibrosis del tejido y dilatacion de la camara ventricular (Pfeffer, M.A. & Braunwald, E., 1990. Circulation 81: 1161). Esta reorganizacion, conocida como "remodelacion", debido a sus efectos negativos sobre la contractilidad, frecuentemente evoluciona hacia la insuficiencia cardfaca (CF). Despues del primer episodio de insuficiencia cardfaca despues de infarto de miocardio, la media de supervivencia es <5 anos con una mortalidad anual de ~ 18 % (American Heart Association, 2000).
La mayona o todas las terapias para tratar la perdida de tejido parenquimatoso, debida a isquemia o a otras causas, estan dirigidas a preservar o mejorar la funcion del tejido superviviente. En el caso de un infarto de miocardio, todas las terapias actualmente en uso para tratar las consecuencias de la perdida del musculo contractil cardfaco estan dirigidas a preservar o mejorar la funcion contractil del tejido superviviente y a reducir la perdida continuada de estas celulas musculares por apoptosis o por necrosis (vease Anversa & Nadal-Ginard, 2002. Nature 415: 240; Nadal- Ginard et al., 2003. Circ. Res. 92:139). En la actualidad no existe una sola terapia aprobada disenada para regenerar o reemplazar los miocitos perdidos en el infarto de miocardio y, de esta manera, restablecer la funcion contractil del corazon. Ademas, todas las estrategias experimentales descritas hasta ahora estan dirigidas a mejorar el flujo sangumeo hacia el area isquemica/necrotica estimulando el aumento de la red capilar, muy a menudo por administracion directa o indirecta al area afectada de factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en la forma de protema o en la forma de cDNA. Ni una sola terapia se dirige a las celulas madre residentes en el tejido para estimularlas a multiplicarse y diferenciarse con el fin de regenerar juntos el parenquima y la microcirculacion perdidas por el accidente vascular.
El objetivo de las estrategias terapeuticas para el infarto de miocardio agudo es restaurar el flujo sangumeo del musculo danado tan pronto como sea posible para evitar una perdida muscular adicional. Estas terapias de reperfusion incluyen el uso de agentes trombolfticos, angioplastia de balon o cirugfa de derivacion. En los Estados Unidos en 1998 se realizaron > 500.000 angioplastias y un numero similar de derivaciones quirurgicas. Estas terapias a menudo son satisfactorias para restablecer el flujo sangumeo al musculo isquemico, pero ninguna puede reemplazar una sola celula muscular ya perdida en el momento de la intervencion. Si esta perdida ha sido sustancial, la consecuencia a largo plazo es una incapacidad de generar el gasto cardfaco requerido lo que evolucionara inexorablemente a insuficiencia cardfaca terminal.
Hasta ahora, la unica opcion para tratar eficazmente la insuficiencia cardfaca terminal ha sido el trasplante de corazon con todos los problemas medicos (terapia inmunodepresora), logfsticos y economicos que conlleva. Incluso si se pudieran eludir estos problemas, la escasez de donantes hace que esta terapia este disponible para > 1 % de los pacientes con insuficiencia cardfaca.
Las formulaciones de la presente divulgacion permiten que la administracion de las moleculas terapeuticamente activas se realice en una forma en la que se puedan dirigir espedficamente al tejido u organo tal como el corazon para regenerar el tejido, por ejemplo, danado por la obstruccion de una arteria, mediante la estimulacion de las celulas madre ya presentes en el tejido a regenerar.
Terapia con celulas madre para la regeneracion tisular.- Recientemente se han desarrollado algunos metodos experimentales como alternativas al trasplante de organos que se dirigen a reemplazar algunas de las celulas perdidas por el organo o tejido de interes. Estos procedimientos se han inspirado en el exito de los trasplantes de medula osea llevados a cabo durante mas de medio siglo. La capacidad de una pequena poblacion de celulas de la medula osea para generar todos los tipos de celulas sangumeas, cuando se trasplanta a un individuo inmunologicamente competente, ha probado convincentemente que los tejidos adultos conteman "celulas madre" capaces de generar y regenerar un tejido o un organo completo. Este avance conceptual ha llevado al desarrollo de estrategias experimentales para reparar tejidos danados utilizando diferentes tipos de celulas madre aisladas del individuo a tratar (terapia celular autologa) o aisladas de un individuo diferente del que las recibe (terapia celular heterologa) . Estas celulas o se afslan en masa o se expanden primero en cultivo antes de ser trasplantadas para
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producir la reparacion deseada del tejido afectado. Estas estrategias de terapia celular aprovechan las propiedades regenerativas naturales de las celulas madre para la regeneracion tisular.
El termino "celula madre" se utiliza en la presente memoria para identificar una celula que tiene las propiedades de autorrenovacion (generar mas celulas como ella), es clonogenica (se puede expandir a partir de una sola celula) y es pluripotente; es decir, puede producir una progenie que se diferenciara en diferentes tipos de celulas, a menudo presentes en el tejido donde residen. Es decir, las celulas originadas a partir de una celula madre adquiriran especializaciones celulares particulares caractensticas del tejido u organo del que se origino la celula madre o al que se trasplanta (Stem Cells: A Primer. 2000. National Institutes of Health USA).
El termino "pluripotente" se refiere a celulas que son capaces de diferenciarse en varios tipos de celulas diferentes. En el contexto de esta solicitud, el termino "tetrapotente" se refiere a una celula que, aunque podna no ser totipotente (capaz de generar un individuo completo), es capaz de generar cuatro tipos de celulas diferentes; p.ej. cardiomiocitos, celulas endoteliales vasculares y celulas de musculo liso y fibroblastos de tejido conjuntivo.
El termino "celula progenitora" se refiere a un descendiente de una celula madre que ya se ha comprometido con una ruta de diferenciacion particular y, por lo tanto, tiene un potencial de diferenciacion mas restringido que la celula madre. La celula progenitora tiene una gran capacidad de amplificacion y, aunque todavfa no expresa marcadores de diferenciacion, tiene la capacidad de crear una progenie mas diferenciada que ella misma. Por ejemplo, el termino se puede referir a una celula indiferenciada o a una celula que se ha diferenciado en una extension menor que su diferenciacion final. Esta celula es capaz de proliferacion y de dar lugar a mas celulas progenitoras, por lo tanto, tiene la capacidad de generar un gran numero de celulas madre que a su vez pueden dar lugar a celulas hijas diferenciadas o diferenciables. En particular, el termino celula progenitora se refiere a una celula madre generalizada cuyos descendientes (progenie) se especializan, a menudo en diferentes direcciones, por ejemplo, adquiriendo caracteres completamente individuales, como ocurre en la diversificacion progresiva de celulas y tejidos embrionarios. Una celula progenitora esta mas diferenciada que una verdadera celula madre porque ya ha restringido algo la multipotencia de la celula madre de la que se origino.
Como se usa en la presente memoria, a menos que el contexto indique lo contrario, las celulas madre se refieren a celulas madre, celulas progenitoras y/o celulas precursoras.
La diferenciacion celular es un proceso complejo que generalmente ocurre a traves de muchas divisiones celulares. Una celula diferenciada puede derivarse de una celula multipotente que se deriva a su vez de una celula multipotente, y asf sucesivamente. Aunque cada una de estas celulas multipotentes se pueden considerar celulas madre, la variedad de tipos de celulas que cada una puede generar puede variar considerablemente. Algunas celulas diferenciadas tienen tambien la capacidad de dar lugar a celulas de mayor potencial de desarrollo. Dicha capacidad puede ser natural o se puede inducir artificialmente tras el tratamiento con diversos factores como se ha demostrado recientemente con las iESC (celulas madre embrionarias inducidas) (Takahashi et al., 2007, Cell 131: 112).
Una "celula precursora" es un descendiente de la celula progenitora que ha ido mas abajo en la ruta de diferenciacion y se ha comprometido a diferenciarse en un solo tipo de celula, aunque todavfa podna no expresar ninguno de los marcadores identificables para este tipo de celula. La celula precursora suele ser la que se somete a la ultima ronda de amplificacion antes de la aparicion del fenotipo diferenciado identificable.
Las celulas madre estan presentes en la masa celular interna del blastocisto, en las crestas genitales del embrion precoz, en la placenta y en la mayona de los tejidos de los animales adultos, incluido el ser humano. En contraste con la celula madre derivada de la masa celular interna del blastocisto, en general, las celulas madre aisladas de tejidos adultos son una mezcla de celulas madre verdaderas, progenitoras y precursoras junto con celulas en la etapa mas temprana de su diferenciacion final. Ahora se han identificado celulas madre adultas en practicamente todos los tejidos originados de cada una de las tres capas de celulas embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo), que vanan desde la medula osea, el sistema nervioso central y periferico, todos los tejidos conjuntivos, piel, intestino, tHgado, corazon, ofdo interno, etc.
Parece que estas celulas madre adultas tienen capacidad regenerativa. Sorprendentemente, a pesar de la alta prevalencia, de la gravedad y los altos costos economicos de la cardiopatfa isquemica en todos los pafses desarrollados, hasta hace poco no se habfan buscado procedimientos dirigidos a la regeneracion del miocardio adulto. Una de las razones de esta anomalfa ha sido que hasta hace muy poco el corazon se consideraba un organo terminalmente diferenciado sin ninguna capacidad regenerativa intnnseca de sus celulas contractiles (MacLellan, W.R. & Schneider, M.D. 2000. Annu Rev. Physiol. 62: 289; Reinlib L. and Field, L. 2000. Circulation 101: 182; Pasumarthi, K.R.S. and Field, L.J. 2002. Circ. Res. 90: 1044; MacLellan, WR 2001. J. Mol. Cell Cardiol. 34:87; Perin, E.C. et al. 2003. Ciculation 107: 935; vease Anversa, P. and Nadal-Ginard, B. 2002. Nature 415: 240; Nadal-Ginard, B. et al. 2003 Circ. Res. 92: 139). Este concepto se baso en el hecho experimentalmente bien documentado de que en el corazon adulto la gran mayona de los cardiomiocitos estan terminalmente diferenciados y su capacidad para reingresar en el ciclo celular ha sido bloqueada irreversiblemente. Por lo tanto, no hay duda de que estos miocitos no son capaces de reproducirse para generar nuevos miocitos.
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Una consecuencia del concepto prevalente del miocardio como un tejido sin potencial regenerativo ha sido que todas las llamadas "terapias regenerativas" experimentales implementadas hasta ahora se han basado en la introduccion dentro del corazon danado de diferentes tipos de celulas que o son miocitos fetales o se cree que tienen algun potencial para diferenciarse en este tipo de celulas o en capilares y microarteriolas con el fin de reemplazar a las celulas perdidas durante el infarto. De esta manera, se han realizado experimentos en animales trasplantando celulas precursoras de musculo esqueletico fetales y adultas, miocitos cardfacos fetales y celulas madre embrionarias en su estado indiferenciado o despues de su compromiso con la ruta de los cardiomiocitos (Kocher et al, 2001. Nature Med. 7 : 430).
Con la excepcion del precursor del musculo esqueletico (que es incapaz de convertirse en cardiocitos y que no se puede acoplar electricamente a las celulas del miocardio) (Menasche et al., 2001. Lancet 357: 279; C Guo et al., 2007, J Thoracic and Cardiovasc Surgery 134: 1332) que puede ser autologo, todos los otros tipos de celulas listados son por necesidad de origen heterologo y, por lo tanto, tienen que ir acompanados de terapia inmunodepresora o el trasplante es eliminado rapidamente por el sistema inmunitario. El hecho es que ninguna de estas estrategias ha demostrado ser muy eficaz en ensayos preclmicos y todas tienen muchos riesgos.
Una de las caractensticas mas intrigantes de algunas de las celulas madre adultas es su "plasticidad". Esta propiedad se refiere al hecho de que cuando ciertas celulas madre se colocan dentro de un tejido diferente del que se originaron, se pueden adaptar a este nuevo entorno y diferenciarse en los tipos de celulas caractensticas del tejido del hospedante en lugar del tejido del donante. Aunque la extension y la naturaleza de esta plasticidad para muchos tipos de celulas aun siguen siendo controvertidas (Wagers & Weissman, 2004. Cell 116: 636-648; Balsam et al., 2004 Nature 428, 668-673; Murray et al., 2004. Nature 428, 664-668; Chien, 2004. Nature 428, 607-608), ha generado innumerables protocolos preclmicos y ensayos clmicos.
Entre las celulas madre adultas descritas hasta ahora, las de la medula osea han sido las mas estudiadas y las que han demostrado un mayor grado de "plasticidad" (Kocher et al., 2001. Nature Med. 7: 430). Tambien se han utilizado ampliamente las denominadas “celulas madre mesenquimatosas” derivadas de tejido adiposo (Rangappa, S. et al 2003. Ann. Thorac Surg 75: 775).
La capacidad de las celulas madre derivadas de la medula osea y del tejido adiposo para repoblar las areas danadas de diferentes tejidos y organos, la relativa facilidad de su aislamiento, junto con el trabajo anterior de Asahara et al (1999; Circ. Res.85: 221 -228), han demostrado ser ventajosos para los objetivos de la terapia celular de regenerar el musculo cardfaco en animales de experimentacion (Orlic et al., 2001. Nature 410: 701; Orlic et al., 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10344; Nadal-Ginard et al., 2003. Circ. Res. 92: 139;) y en el ser humano (Tse et al., 2003. Lancet 361: 47; Perin et al., 2003. Circulation 107: 2294) Aunque ha sido cuestionado por algunos (Balsam, L.B. et al., 2004. Nature 428: 668; Murry, C.E. et al., 2004. Nature 428: 664), esta claro que las celulas madre derivadas de la medula osea, bajo ciertas condiciones, son capaces de generar cardiomiocitos, capilares y microarteriolas, particularmente cuando se trasplantan al area del borde de un infarto de miocardio experimental. (Quaini, F., et al., 2002. New Engl. J. Med. 346: 5; Bayes-Geis, A. et al., 2003. Cardiovasc. Res.56: 404; Bayes- Genis, A. et al., 2004. Eur. J. Heart Fail., 6: 399; Thiele, H. et al., 2004. Transplantation 77: 1902). No se dispone de informacion similar procedente de los numerosos ensayos clmicos de terapia celular con celulas madre derivadas de la medula osea o del tejido adiposo porque no hay datos histopatologicos fiables disponibles para la evaluacion.
Un inconveniente principal de las tecnicas utilizadas para la terapia de celulas de miocardio es la complejidad e ineficacia del propio procedimiento de trasplante de celulas. Cuando las celulas se trasplantan a traves del arbol arterial coronario, solo el 3-5 % permanece en el miocardio mientras que el resto se disemina por todo el cuerpo. Si las celulas se inyectan directamente en el miocardio, se requiere o una toracotoirna o el uso de instrumentacion compleja y lenta (sistemas tipo Noga) para identificar la zona objetivo. Esta tecnica requiere operadores especializados y solo esta disponible en centros medicos especializados. Ademas, las inyecciones intramiocardicas, ya sea por via transendocardica (Noga) o transepicardica (quirurgica), todavfa administran < 50 % de las celulas al tejido.
Sin excepcion, todas las estrategias de terapia celular utilizadas hasta el momento para producir la regeneracion del miocardio despues de infarto de miocardio en animales de experimentacion o en humanos se han desarrollado ignorando por completo el hecho de que el miocardio tiene una capacidad regenerativa intrmseca representada por sus celulas madre residentes (Nadal-Ginard, B., et al., 2003. J. Clin. Invest. 111: 1457; Beltrami et al., 2003. Cell 114: 763-776; Torella, D., et al., 2004. Circ. Res. 94: 514; Mendez-Ferrer, S. et al., 2006. Nature Clin. Prac. Cardiovasc. Med. 3 Suppl 1: 583; Torella et al., 2007, Cell. Mol. Life Sci. 64: 661).
Como se ha indicado antes, hasta hace poco, el paradigma aceptado consideraba al corazon de los marnfferos adultos como un organo posmitotico sin capacidad regenerativa. Aunque en los ultimos anos este concepto ha comenzado a evolucionar, todas las estrategias experimentales y clmicas para la regeneracion del miocardio han seguido estando basadas en el viejo dogma. Por esta razon, todos los protocolos de regeneracion cardfaca se han basado en el trasplante de celulas para proporcionar al miocardio celulas con potencial regenerativo.
Ahora parece que cuando las formulaciones de la presente divulgacion se administran en condiciones apropiadas, la capacidad regenerativa intrmseca de las "celulas madre" residentes en el tejido u organo (tal como el corazon) se
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puede estimular o activar para regenerar el tejido u organo.
Por lo tanto, en un aspecto, la divulgacion proporciona un metodo para la regeneracion de tejidos solidos en mairnferos vivos, incluyendo los seres humanos, que incluye la administracion local de ligandos para los receptores expresados por las celulas madre presentes en el tejido posnatal a regenerar. Estas son celulas que cuando se estimulan fisiologica o farmacologicamente se multiplican in situ y se diferencian en celulas parenquimatosas caractensticas del tejido u organo que las contiene.
Se ha detectado la formacion de nuevos cardiomiocitos tanto en el corazon normal como en condiciones patologicas tales como infarto de miocardio e insuficiencia cardfaca (Beltrami, AP et al., 2001. New Engl. J. Med. 344: 1750; Urbanek, K. et al., 2003. Proc. Netl. Acad. Sci. USA 100: 10440; Nadal-Ginard, B. et al., 2003. J. Clin. Invest. 111: 1457; Nadal-Ginard, B. et al., 2003. Circ. Res. 92: 139). Curiosamente, estos nuevos miocitos son significativamente mas abundantes en la zona del borde de los infartos de miocardio, donde estan en un orden de magnitud mas abundante que en el miocardio de individuos sanos de igual edad. Estas observaciones sugieren que el miocardio humano adulto tiene la capacidad de responder a aumentos agudos y cronicos de la muerte celular con un proceso regenerativo frustrado que intenta reemplazar los miocitos muertos (Anversa, P. & Nadal-Ginard, B. 2002. Nature 415: 240; Anvrsa, P. y Nadal-Ginard, B. 2002. New Engl. J. Med. 346: 1410; Nadal-Ginard, B. et al., 2003. Circ. Res. 92: 139).
Las celulas madre cardfacas (CSC) adultas se describieron por primera vez en 2003 (Beltrami et al., 2003, Cell 114: 763-776) y se confirmaron por varios autores en la misma y en otras especies (vease Torella, D., et al., 2004. Circ. Res. 94: 514; Mendez-Ferrer, S. et al., 2006. Nature Clin. Prac. Cardiovasc. Med. 3 Suppl 1: 583; Torella et al., 2007, Cell. Mol. Life Sci. 64 : 661). Estas celulas madre cardfacas son autorrenovables, clonogenicas y multipotentes porque dan lugar a cardiomiocitos, celulas vasculares endoteliales y de musculo liso, asf como a fibroblastos de tejido conjuntivo. Se identificaron mediante la expresion de marcadores de membrana asociados con las celulas madre tales como c-kit, el receptor para SCF, Scal, MDR-1 e Isl-I. Esta claro ahora que los nuevos miocitos formados en el corazon adulto se derivan de las celulas madre cardfacas residentes en el miocardio. Estas celulas madre cardfacas, cuando se inyectan en el borde de un infarto, tienen la capacidad de regenerar las celulas contractiles y la microvasculatura perdida como consecuencia de un infarto de miocardio masivo (Beltrami, et al., 2003. Cell: 114: 763-776; Laugwitz, et al., 2005; Mendez-Ferrer et al., Torella et al., 2006; Torella et al., 2007).
En el corazon de un individuo sano, casi todas las celulas madre cardfacas estan en estado de reposo (G0) o continuan su ciclo muy lentamente durante la vida del organismo. En cualquier momento dado, solo una fraccion muy pequena de estas celulas esta activa, sufriendo la replicacion y diferenciacion solo lo suficiente para reemplazar las celulas que mueren por el desgaste. En contraste, una gran parte de las celulas madre cardfacas, a veces la mayona, se activa en respuesta a un estres fisiologico o patologico. En general, existe una correlacion directa entre la magnitud del estres y el numero de celulas madre cardfacas que se activan como respuesta. Este numero de celulas madre cardfacas activadas esta directamente correlacionado tambien con el numero de nuevas celulas de miocardio generadas. Esta respuesta, que ocurre desde el raton al ser humano (Nadal-Ginard, B. et al., 2003. Circ. Res. 92: 139), revela la existencia de una ruta bioqmmica desencadenada por el estres que da como resultado la activacion de las celulas madre cardfacas.
La comunicacion entre las celulas madre residentes y su entorno, al menos en el miocardio, esta regulada por un bucle de retroalimentacion entre los cardiomiocitos, que detecta los cambios de estres en la pared producidos por el aumento de las demandas fisiologicas o patologicas en el gasto cardfaco, y las celulas madre responsables de producir un aumento en la masa muscular a traves de la generacion de nuevas celulas contractiles y de microcirculacion para nutrirlas. Los miocitos tienen una respuesta estereotfpica al estres independientemente de si es fisiologico o patologico (Ellison et al., 2007, J. Biol. Chem. 282: 11397-11409). Esta respuesta consiste en activar rapidamente la expresion y secrecion de una gran serie de factores de crecimiento y citocinas, tales como HGF (factor de crecimiento de hepatocitos), IGF-1 (factor de crecimiento insulmico tipo 1), PDGF-p (factor de crecimiento p derivado de plaquetas), una familia de FGF (factor de crecimiento de fibroblastos), SDF-1 (factor 1 derivado de celulas estromales), VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento epidermico (EGF), activina A y TGF p (factor de crecimiento transformante p), WINT3A y neuregulina, entre otros. Esta respuesta secretora, ademas de estimular la hipertrofia de los propios miocitos a traves de un bucle auto/paracrino, desencadena tambien la activacion de las celulas madre cardfacas en sus alrededores porque estas celulas expresan receptores para estos factores segregados por los miocitos y responden a ellos. Esta respuesta activa las rutas geneticas aguas abajo del receptor que son responsables de la supervivencia, multiplicacion y diferenciacion celular. Ademas, la activacion de estos receptores activa tambien un bucle de retroalimentacion en las propias celulas madre cardfacas (CSC), lo que estimula la produccion del ligando respectivo por parte de las CSC, poniendo asf en marcha una respuesta autosostenida que, en respuesta a un solo estfmulo, puede permanecer activa durante varias semanas o hasta que el aumento de masa producida haya restablecido el estres de la pared del miocardio a niveles normales. Por lo tanto, las celulas madre cardfacas responden a un estfmulo paracrino con una respuesta auto/paracrina que permite el mantenimiento de una respuesta sostenida a una estimulacion de corta duracion. De este modo, la homeostasis celular cardfaca normal se mantiene a traves de una retroalimentacion continua entre los miocitos y las celulas madre cardfacas para producir y mantener la masa muscular contractil apropiada requerida para generar el gasto cardfaco necesario. Los miocitos, que no se pueden dividir, dependen de las celulas madre cardfacas para mantener o aumentar su numero de celulas y la densidad capilar para garantizar
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su suministro de oxfgeno y nutrientes. Las celulas madre ca^acas, por otro lado, dependen y responden a las senales bioqmmicas producidas por sus miocitos circundantes para regular su estado de reposo frente a su estado activado.
Ademas de las celulas madre espedficas de tejidos descritas anteriormente, se ha encontrado recientemente que el miocardio de los mairnferos, incluido el ser humano, as^ como la mayona de los otros tejidos, contiene una pequena poblacion de celulas muy indiferenciadas que tienen muchas similitudes con las celulas madre embrionarias (las ESC) de las hace mucho tiempo que se conoce que son multipotentes; esto es, una sola celula es capaz de generar, cuando se coloca en el entorno apropiado, un organismo completo identico a aquel del que se origino. La principal caractenstica de estas celulas es su expresion de una serie de los llamados "genes de multipotencia" tales como Oct4, Sox2, Nanog, etc. (ver la solicitud provisional US numero de serie 61/127.067) que confieren multipotencia a estas celulas, de tal modo, que independientemente de su tejido de origen, parecen capaces de dar lugar a la mayor parte, si no a todos los tipos de celulas del cuerpo. En particular, las celulas que expresan Oct4 aisladas del corazon adulto son capaces de dar lugar a musculo esqueletico, neuronas, corazon, hngado, etc. Su capacidad regenerativa parece ser mas fuerte y mas amplia que la de las celulas madre espedficas de tejidos.
Se cree que las celulas que expresan Oct4 son el origen de la mayona, si no todas, las celulas madre de cada organo y que su estimulacion es la fuente principal de la capacidad regenerativa de cada tejido individual. Por lo tanto, la estimulacion de estas celulas es un objetivo principal para las estrategias terapeuticas descritas en esta memoria.
Independientemente de su capacidad y/o eficacia para generar celulas de miocardio, cuando se introduce una gran cantidad de celulas madre en un tejido, independientemente de su tejido de origen, tienen un efecto paracrino importante cuando se trasplantan al miocardio y a otros tejidos, como ha sido probado experimentalmente. La mezcla compleja de factores de crecimiento y citocinas producida por las celulas trasplantadas tiene un potente efecto antiapoptotico sobre los cardiomiocitos y otras celulas en la zona de riesgo y tambien en la activacion de las celulas madre endogenas que se multiplican y se diferencian en celulas musculares y microvasculatura . Este efecto paracrino empieza muy pronto despues del trasplante celular y se puede documentar in vitro.
A partir del trabajo realizado en los ejemplos de la presente memoria parece que para estimular las celulas madre residentes de un tejido (incluidas las celulas que expresan Oct4), en este caso el miocardio, los factores de crecimiento y las citoquinas producidas por los miocitos estresados y a los que responden las celulas madre cardfacas podnan ser tanto o mas eficaces que el trasplante de celulas para desencadenar una respuesta regenerativa. Una combinacion de factor de crecimiento insulmico tipo 1 y factor de crecimiento de hepatocitos puede ser particularmente efectiva.
En una realizacion, las celulas madre residentes se activan, por ejemplo, para estimular la regeneracion del tejido, para aumentar la densidad muscular y/o la funcion celular de las celulas diana.
Si las celulas diana son del musculo cardfaco, entonces el aumento de la funcion sena, por ejemplo, una funcion contractil aumentada o mayor.
Si las celulas diana son celulas renales, en un paciente con insuficiencia renal, entonces el aumento de la funcion puede ser un aumento de la capacidad para generar EPO.
Si las celulas diana son celulas pancreaticas, entonces el aumento de la funcion puede ser un aumento de la capacidad para generar insulina.
Parece que las formulaciones de la divulgacion son capaces de estimular/activar las celulas madre residentes en "tejido maduro" evitando asf la necesidad de administrar una terapia de "celulas madre" al paciente ya que se estimulan las celulas madre residentes para que experimenten mitosis y crezcan.
La estimulacion de las celulas madre residentes es distinta de la angiogenesis. La angiogenesis es el proceso de estimular el crecimiento de capilares (que pueden estar en tejido o tumores) (vease Husnain, K.H. et al., 2004. J. Mol. Med. 82: 539; Folkman, J., and D'Amore, P.A. 1996, Cell 87: 1153). En contraste, cuando las formulaciones de la presente divulgacion que emplean ligandos apropiados se administran a las celulas madre residentes en el tejido, tales como celulas pluripotentes, celulas progenitoras y/o celulas precursoras, se activan para generar nuevas/adicionales celulas de tejido tales como celulas musculares.
Todas las estrategias regenerativas descritas hasta ahora tienen grandes limitaciones ya sea debido a la naturaleza de su objetivo biologico, al agente regenerativo utilizado y/o a la via y el modo de administracion. La gran mayona de las llamadas terapias regenerativas se han dirigido a regenerar la red capilar del miocardio isquemico utilizando una variedad de factores biologicos, tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), cuya funcion principal es estimular el crecimiento de las celulas endoteliales supervivientes en el tejido danado con el fin de expandir la red capilar y mejorar el suministro de sangre (Isner, J.M. and Losordo, D.W. 1999, Nature Medicine 5: 491; Yamaguchi, J., et al., 2O03, Circulation 107: 1322; Henry, T.D., et al., 2003, Circulation 2003. 107: 1359). Estas terapias ni intentan ni logran la regeneracion de las celulas parenquimatosas que realizan la funcion caractenstica del tejido u organo; p.ej. cardiomiocitos contractiles en el corazon, hepatocitos en el tngado, celulas p productoras de
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insulina en el pancreas, etc. En el mejor de los casos, estas terapias han tenido efectos modestos y ninguna de ellas ha llegado a formar parte de la practica medica estandar. Por otro lado, todas las terapias regenerativas disenadas para reemplazar las celulas funcionales del tejido u organo se han basado hasta ahora en el trasplante de celulas que se cree que son capaces de asumir las caractensticas de las celulas perdidas en el tejido diana. Estas estrategias todavfa estan en ensayos clmicos. Un inconveniente principal para todas las estrategias regenerativas utilizadas ha sido administrar el agente regenerador al tejido danado y limitar su dispersion por todo el resto del cuerpo. Este es un problema serio incluso cuando los agentes regenerativos se administran a traves del arbol arterial coronario del tejido a tratar. En los casos de terapia de celulas de miocardio por administracion coronaria, solo una fraccion muy pequena de las celulas administradas es retenida en el corazon, mientras que la mayor parte (> 95 %) entra rapidamente en la circulacion sistemica y se distribuye por todo el cuerpo. Esto ocurre tambien cuando los agentes regenerativos se inyectan directamente en el miocardio, ya sea trans-epicardicamente o trans- endocardicamente, como se ha demostrado repetidamente con la administracion de una suspension celular. Ademas, la administracion trans-epicardica requiere exponer el corazon a traves de una toracotoirna, mientras que la administracion trans-endocardica requiere un procedimiento sofisticado, lento y costoso para realizar el mapa del endocardio e identificar las regiones adecuadas para la inyeccion (un instrumento tipo Noga). un procedimiento disponible en un numero muy limitado de centros y que requiere la participacion de un manipulador experto. En ambos casos, en el mejor de los casos, el 50 % del compuesto administrado es retenido en lo danado, mientras que el resto se dispersa a lo largo de la cavidad toracica o a traves de la circulacion sistemica. Las formulaciones de la divulgacion se pueden usar en combinacion con la administracion de celulas madre a un tejido u organo diana y aumentar el numero que es retenido localmente en comparacion con otros mecanismos de administracion.
Sin embargo, esta divulgacion describe un nuevo metodo para regenerar las celulas parenquimatosas (esto es, las celulas funcionales "nobles") de un tejido u organo que no se basa ni en el trasplante celular ni en la estimulacion del crecimiento de las celulas endoteliales supervivientes con el fin de mejorar el suministro de sangre al tejido u organo de interes. En cambio, los metodos descritos aqrn se basan en la estimulacion in situ, es decir, dentro del tejido, de las celulas madre residentes de dicho tejido por medio de la administracion local de factores de crecimiento y/o citocinas espedficos que son capaces de estimular su activacion. replicacion y diferenciacion para generar las celulas parenquimatosas perdidas asf como la microvasculatura necesaria para su crecimiento, supervivencia y funcion. Esto es posible porque la mayor parte, si no todos los tejidos de marnfferos adultos, incluido el tejido humano, contienen celulas madre residentes que son capaces, cuando se estimulan adecuadamente, de regenerar los tipos de celulas que son espedficos del tejido u organo, asf como las celulas de soporte vascular y mesenquimal que las acompanan.
Debido a que algunos de los agentes regeneradores que estimulan las celulas madre son muy activos y podnan estimular el crecimiento y la translocacion de una variedad de celulas con las que interactuan, entre ellas las celulas neoplasicas latentes, la aplicacion clmica potencial de muchos de estos factores requerira la administracion de las dosis terapeuticas mas pequenas de una manera muy localizada para, en la medida de lo posible, limitar la exposicion de las celulas que se van a regenerar. Por lo tanto, cuanto mas localizada sea la administracion, menores seran las dosis requeridas y mas disminuira el riesgo de efectos secundarios no deseados debidos a la estimulacion de las celulas estacionarias en el mismo organo o en otros organos. Mas espedficamente, la divulgacion describe una nueva estrategia para el uso de dosis terapeuticas de diferentes factores de crecimiento administrados y liberados localmente, en lugar de sistemicamente o en todo el tejido, para producir la regeneracion de areas espedficas de un tejido solido. Debido a que la administracion del compuesto activo se localiza en el tejido danado, la dosis terapeutica requerida es una fraccion minima de la que sena necesaria con otros metodos de administracion disponibles. La formulacion de la divulgacion es capaz, entre otras aplicaciones, de regenerar el musculo cardfaco y su microvasculatura despues de un infarto de miocardio y/o en la insuficiencia cardfaca cronica.
En una realizacion, la formulacion se administra en el borde del tejido danado, por ejemplo en el borde o en una zona isquemica.
Los ligandos adecuados para las celulas madre incluyen factores de crecimiento tales como los listados en la Tabla 1 TABLA 1: Ejemplos de ligandos de celulas madre adecuados de la invencion HGF (factor de crecimiento de hepatocitos),
IGF (factor de crecimiento insulmico) tal como IGF-1,
PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) tal como PDGF-p,
FGF (factor de crecimiento de fibroblastos) tal como FGF (FGF-1) o bFGF (FGF-2) y FGF-4,
SDF-1 (factor 1 derivado de celulas estromales),
EGF (factor de crecimiento epidermico)
VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), eritropoyetina (EPO),
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TGF p (factor de crecimiento transformante p),
G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos),
GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos),
Protemas morfogeneticas oseas (BMP, BMP-2, BMP-4)
Activina A,
H-6
Neurotrofinas por ejemplo NGF (factor de crecimiento del nervio), neuregulina, BDNF (factor neurotrofico derivado del cerebro), NT-3 (neurotrofina-3), NT-4 (neurotrofina-4) y (neurotrofina-1), que estructuralmente no esta relacionada con NGF, BDNF, NT-3 y NT-4
TPO (trombopoyetina)
GDF-8 (miostatina), o
GDF9 (factor de diferenciacion de crecimiento 9),
Periostina
En una realizacion, el factor o factores de crecimiento empleados son humanos.
En una realizacion, el factor de crecimiento empleado se selecciona de HGF, IGF (tal como IGF-1 y/o IGF-2) y FGF, en particular HGF e IGF-1. Estos factores parecen ser particularmente eficaces para estimular las celulas madre residentes.
Tambien se pueden emplear combinaciones de factores de crecimiento y, por ejemplo, se pueden seleccionar de la lista identificada antes, tales como HGF e IGF-1 y opcionalmente VEGF.
En una realizacion, la formulacion para regenerar/activar las celulas madre no consiste en VEGF como el unico ingrediente activo sino que, por ejemplo, puede comprender una combinacion de ingredientes activos que incluye VEGF.
Sin embargo, la formulacion es adecuada para la administracion localizada de VEGF como factor de angiogenesis.
En una realizacion, la formulacion del factor de crecimiento se emplea en combinacion con un factor de angiogenesis, por ejemplo, administrado concomitante o secuencialmente por la misma via o una via diferente.
En una realizacion, la formulacion comprende una citocina, por ejemplo, seleccionada de IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, IL- 17, IL-18 y/o interferon.
En una realizacion, la formulacion comprende combinaciones de principios activos, por ejemplo, un factor de crecimiento y una citoquina.
En las formulaciones de combinacion, entonces la dosis de cada ingrediente activo puede ser, por ejemplo, la misma dosis que se emplea cuando el ingrediente activo se administra solo.
Los componentes empleados en las formulaciones y/o metodos de la divulgacion, especialmente los ingredientes activos de tipo biologico pueden ser derivados de origen natural.
En una realizacion, un ingrediente activo de tipo biologico empleado se prepara mediante tecnologfa de DNA recombinante.
En una realizacion, el ingrediente o ingredientes activos administrados pueden ser fragmentos peptfdicos de una molecula biologica, con el efecto terapeutico deseado.
En una o mas realizaciones, las moleculas empleadas son mutantes de una molecula biologica (por ejemplo, un ligando de un receptor) con el efecto terapeutico deseado que tienen la misma, mayor o menor afinidad por la molecula biologica correspondiente.
En una realizacion, la sustancia o sustancias/ingrediente activo empleado es un aptomero (una molecula pequena de RNA que se une a un receptor en lugar del ligando natural).
En una realizacion, la sustancia/ingrediente activo empleado es un anticuerpo que reconoce y se une a un receptor diana, y en particular tiene una especificidad y/o avidez adecuada por el mismo. Deseablemente, el anticuerpo tiene la actividad requerida para regular al alza el receptor o regular a la baja el receptor, produciendo de este modo activacion o bloqueo del mismo, segun sea apropiado.
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En una realizacion, el ingrediente activo es una diaquina, que es una molecula de anticuerpo artificial que reconoce y se une a dos de los receptores de interes dando como resultado la activacion o bloqueo de uno y/o del otro.
En una realizacion, la sustancia/ingrediente activo empleado es una molecula pequena con un peso molecular <5.000 Dalton.
En una realizacion, uno o mas ingredientes activos empleados pueden ser de origen sintetico.
Para que la formulacion descrita en la presente memoria se dirija al organo o tejido deseado, entonces la formulacion debe ser administrada aguas arriba del organo o tejido. Es decir, debe ser introducida en la circulacion de tal manera que el flujo de sangre lleve la formulacion al tejido/organo deseado.
La formulacion se puede introducir aguas arriba de un organo tal como el corazon empleando un dispositivo adecuado tal como un cateter. Se puede llegar a otros organos principales de esta manera. Del mismo modo, aunque es raro, tambien es posible utilizar cateteres para acceder al hngado.
En otros casos, la formulacion se puede introducir por inyeccion intraarterial estrategica antes del tejido diana.
La formulacion se puede administrar tambien por perfusion o con un dispositivo de administracion accionado por bomba tal como una bomba de jeringa, por ejemplo del tipo empleado en la administracion de heparina o morfina o agentes de contraste durante la cateterizacion. Un caudal adecuado puede ser, por ejemplo, de 0,5 mL/min.
La formulacion se puede administrar tambien a traves de los denominados cateteres de perfusion que permiten ralentizar la velocidad del flujo sangumeo aguas abajo del sitio de la inyeccion con un balon intraarterial, a la vez que se mantiene la perfusion del tejido a traves de un segundo lumen del cateter.
En una realizacion particularmente adecuada, la formulacion se administra en una arteria aguas arriba del tejido u organo diana.
En una realizacion, se utiliza un cateter para administrar la formulacion de la divulgacion en la arteria que abastece al tejido u organo diana. En particular, la formulacion se puede administrar exclusivamente (principalmente o sustancialmente) a la arteria segmentaria que abastece el area del tejido u organo.
En una realizacion, el cateter empleado es un cateter de balon.
En una realizacion, el cateter lleva una malla de filtro en su extremo distal con un tamano de poro suficientemente pequeno para evitar u obstaculizar la liberacion de agregados de micropartfculas > 50, 25 o 20 pm, segun se requiera.
En una realizacion, las celulas diana son las celulas madre cardfacas residentes en el corazon posnatal.
En una realizacion, la regeneracion obtenida incluye, conjunta o separadamente, la regeneracion de cardiomiocitos y estructuras vasculares compuestas de capilares (celulas endoteliales) y/o arteriolas (celulas del endotelio y del musculo liso vascular).
En una realizacion, la regeneracion es inducida en cualquier momento despues de un infarto de miocardio (MI) ya sea agudo o cronico, por ejemplo, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11 hasta 24 horas despues de un infarto agudo.
En una realizacion, la regeneracion es inducida en un individuo con cardiopatfa isquemica, con o sin infarto de miocardio.
En una realizacion, la regeneracion es inducida en los corazones de individuos que han desarrollado insuficiencia cardfaca (CF) aguda o cronica.
En una realizacion, la regeneracion es inducida en individuos con cardiomiopatfa isquemica, infecciosa, degenerativa o idiopatica.
En una realizacion, las celulas diana son las celulas madre residentes en el pancreas endocrino (celulas madre de los islotes de Langerhans).
En una realizacion, la regeneracion es inducida en un individuo con diabetes.
En una realizacion, las celulas diana son las celulas madre neurales del sistema nervioso central (CNS).
En una realizacion, las celulas madre diana son las celulas madre neurales de la medula espinal.
En una realizacion, la regeneracion es inducida en un individuo con una lesion de la medula espinal.
En una realizacion, las celulas diana son las celulas madre de la sustancia negra del cerebro, por ejemplo en un
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individuo con enfermedad de Parkinson.
En una realizacion, la regeneracion es inducida en un individuo con un accidente vascular cerebral (ictus).
Aunque no se desea limitarse a la teona, se cree que los ligandos empleados en las formulaciones de la divulgacion son capaces de cruzar la barrera hematoencefalica para tratar los ictus y similares. Ademas, se cree que en los accidentes vasculares cerebrales la barrera hematoencefalica se deteriora y las entidades qmmicas pueden pasar mas facilmente a traves de la barrera.
En una realizacion, las celulas diana son las celulas madre del tugado y, por ejemplo, la regeneracion es inducida en un individuo con dano hepatico tal como cirrosis.
En una realizacion, las celulas madre diana son las celulas madre de los pulmones y, por ejemplo, la regeneracion es inducida en un paciente con dano pulmonar, por ejemplo enfisema.
En una realizacion, las celulas diana son las celulas madre del musculo esqueletico y, por ejemplo, la regeneracion es inducida en un individuo con un deficit particular del musculo esqueletico, tal como osteoporosis o enfermedad de Paget.
En una realizacion, las celulas diana son las celulas madre del epitelio.
En una realizacion, las celulas madre diana son las celulas madre de los rinones.
Las celulas diana como se emplean en la presente memoria se refieren a las celulas que tienen que ser estimuladas y que tienen el potencial de proporcionar la regeneracion deseada.
La formulacion de la divulgacion proporciona parametros y materiales optimizados para asegurar la dosificacion precisa y/o reproducible del ingrediente activo relevante para el tejido u organo diana.
En una realizacion alternativa, las formulaciones de la divulgacion se pueden emplear para tratar tumores solidos, permitiendo la administracion local del antineoplasico al tejido tumoral, por ejemplo mediante inyeccion intratumoral.
Los ingredientes activos adecuados para el tratamiento de tumores incluyen etoposido, ciclofosfamida, genistema, cisplatino, andriamicina, vindesina, mitoguazona, fluorouracilo y paclitaxilo.
En una realizacion, la formulacion no es para el tratamiento del cancer.
En una realizacion, la invencion no es la administracion directa a un tumor o tejido.
Los metodos segun la divulgacion pueden emplear combinaciones de ingredientes activos administrados por separado, por ejemplo concomitantemente o secuencialmente, o formulados como una formulacion (de recipiente unico).
Las formulaciones de la divulgacion se pueden administrar como soluciones/suspensiones lfquidas, por ejemplo en un vetuculo isotonico, por ejemplo como una solucion tamponada tal como tampon de fosfato, solucion salina o de glucosa.
Las formulaciones de la divulgacion pueden comprender opcionalmente uno o mas excipientes adicionales. Los excipientes deben ser adecuados para la administracion a humanos y/o animales.
En una realizacion, la formulacion comprende albumina en solucion, que puede estabilizar, por ejemplo, las pequenas cantidades de ingrediente activo en las formulaciones, por ejemplo de 1 % a 20 % p/v de albumina, tal como la albumina de suero humano, puede ser suficiente para lograr la estabilizacion requerida.
La divulgacion tambien se extiende al uso de una formulacion tal como se define en la presente memoria para el tratamiento, particularmente para el tratamiento del infarto de miocardio; enfermedad isquemica del corazon; insuficiencia cardiaca; cardiomiopatfa isquemica, infecciosa, degenerativa o idiopatica, esclerosis, cirrosis, enfisema, diabetes y similares.
En una realizacion, la divulgacion se refiere a una formulacion como se describe en la presente memoria para uso en el tratamiento, particularmente para el tratamiento de una enfermedad descrita anteriormente.
La divulgacion se extiende tambien a los metodos de tratamiento que comprenden administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una formulacion descrita en la presente memoria a un paciente que la necesite, particularmente para el tratamiento de una enfermedad descrita anteriormente.
La divulgacion se extiende tambien al uso de un ligando, por ejemplo como se describe en la presente memoria, para estimular una celula madre residente in vivo para activar la celula.
La divulgacion incluye tambien el uso de un factor de crecimiento adecuado para la fabricacion de un medicamento
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para estimular celulas madre residentes in vivo.
La divulgacion se ilustrara ahora por referencia a los ejemplos.
Ejemplos
Introduccion
Se produjeron infartos de miocardio anteriores en cerdas hembras mediante la oclusion temporal con balon de la arteria coronaria descendente anterior, distal a la primera rama septal. Este procedimiento dio como resultado infartos apicales anteriores de tamano moderado reproducibles. Se probo el potencial de regeneracion miocardica del factor de crecimiento insulmico tipo 1 y del factor de crecimiento de hepatocitos combinados administrando localmente los factores a diferentes dosis en el miocardio de cerdo infartado. Los animales de control fueron tratados con placebo.
La viabilidad de producir efectos terapeuticos con la administracion local de pequenas cantidades de agentes terapeuticos se probo primero mediante la administracion directa de una solucion que contiene una mezcla de IGF-1 y HGF humanos recombinantes en el post-infarto de miocardio agudo producido en un modelo experimental con pechos cerrados por dilatacion con balon en la arteria coronaria izquierda descendente anterior justo debajo de la aparicion de la primera arteria septal en 23 cerdos que se compararon con 6 controles de placebo tratados de forma identica.
Materiales y metodos
Se analizaron los corazones en diferentes puntos de tiempo despues del infarto de miocardio, que van desde unos pocos dfas hasta 1 mes. Los resultados mostraron un aumento extraordinario en el numero de celulas madre y progenitoras activadas en el area isquemica y sus bordes de cerdos tratados con IGF-1 y HGF humanos. Se observo una regeneracion notable del musculo en el area isquemica, que tambien contema arteriolas y vasos recien formados. La respuesta regenerativa parecfa ser proporcional a las dosis de los factores de crecimiento administradas. A partir de estos datos preliminares, la activacion terapeutica in situ de las celulas madre cardfacas puede producir una formacion extensa de nuevo tejido miocardico y mejorar significativamente la funcion del ventriculo izquierdo en corazones de animales que son similares en tamano y anatoirna a los corazones humanos.
Aislamiento de celulas cardiacas porcinas c-kitpos
Se obtuvieron multiples muestras cardfacas (cada una de ~2 g) de diferentes regiones cardfacas (auricula derecha e izquierda, ventriculo derecho e izquierdo y apice) de cerdos blancos Yorkshire hembras (23 ± 4 kg, n = 3). Algunas muestras se fijaron y se incluyeron en parafina para analisis histoqmmico. Las otras piezas se digirieron enzimaticamente y se prepararon suspensiones de celulas cardiacas mermadas en cardiomiocitos como se ha descrito previamente con modificaciones (Beltrami, A.P. et al., 2003. Cell 114: 763). Brevemente, el tejido cardfaco triturado se digirio con colagenasa al 0,1 % (Worthington Biochemicals), tripsina al 0,1 % (Sigma), DNAsa 1 al 0,1 % en tampon de solucion salina equilibrada de Hanks (HBSS) a 37 °C y se recogio por centrifugacion la fraccion de celulas cardiacas pequenas. Las celulas cardiacas pequenas se incubaron con anticuerpo anti-CD117 (c-kit) humano (Miltentyi Biotechnology) y se clasificaron mediante separacion celular activada por fluorescencia (FACS; clasificador de celulas MoFlo (Dako Cytomation)) o microinmunoperlas activadas magneticamente (MACS). Se anadio yoduro de propidio (PI; 2 pg/mL) antes de la FACS para excluir las celulas muertas.
Las celulas cardiacas porcinas c-kitpos se analizaron en cuanto a marcadores de celulas hematopoyeticas, mesenquimatosas y endoteliales utilizando un citometro de flujo FacsCalibur (Becton Dickinson, bD). Los anticuerpos usados fueron anti CD45 porcino (Serotec, Clon: MCA1447), anti CD34 humano (BD, clon 8G12), anti CD90 humano, (BD, Clon: 5E10, reactividad cruzada de cerdo) y anti CD166 humano (BD, Clon: 3A6, reactividad cruzada de cerdo), anti CD105 humano (Caltag Laboratories, Clon: SN6, reactividad cruzada de cerdo) y anti CD133 humano (Miltenyi Biotec, clon AC133, reactividad cruzada de cerdo). Los anticuerpos antihumanos espedficos para PECAM, E-cadherina, CD11b, CD13, CD14, CD29, CD31, CD33, CD36, CD38, CD44, CD49, CD62, CD71, CD73, CD106, se compraron de BD Biosciences. Como controles negativos para todos los procedimientos de FACS se utilizaron controles de los isotipos respectivos (Pharmingen). Los datos se analizaron utilizando el software CellQuest.
Cultivo, clonacion y potencial de diferenciacion de celulas cardiacas porcinas C-kitpos
Se sembraron en placas celulas c-kitpos durante 7-10 dfas a 2 x 104 celulas/mL en medio MEM de Dulbecco/ modificado de Ham F12 (DMEM/F12) que contema FBS al 10 %, bFGF (10 ng/mL), insulina-transferrina-selenita (ITS) y EPO (2,5 U). Despues de la recuperacion, se movieron algunas celulas a un medio de formacion de cardioesferas modificado (mCSFM): DMEM/F12 a relacion 1:1, bFGF (10 ng/mL), EGF (20 ng/mL), ITS, 2-p- mercapetanol (0,1 mM) y Medio Neural Basal complementado con complementos B27 y N2 (Gibco), para la generacion de cardioesferas. Para analizar la clonogenicidad, se sembraron celulas individuales c-kitpos individualmente en pocillos de placas Terasaki recubiertas de gelatina de 96 pocillos por citometria de flujo o dilucion en serie. Se cultivaron las celulas c-kitpos individuales en medio modificado DMEM/ F12 durante 1-3 semanas cuando
se identificaron y se expandieron los clones. La clonogenicidad de las celulas ckitpos se determino contando el numero de clones generados en cada placa de 96 pocillos y se expreso como porcentaje. Se analizaron un total de 10 placas por region cardfaca. Las celulas clonogenicas y las cardioesferas se transfirieron a un medio de diferenciacion cardiogenica espedfico (modificado a partir de 42) para especificacion de miocitos, celulas del 5 musculo liso vascular y celulas endoteliales.
El ensayo de migracion celular se llevo a cabo utilizando una camara de Boyden modificada, segun las instrucciones del fabricante (Chemicon). Se colocaron 200 ng/mL de HGF o 200 ng/mL de IGF-1 en la camara inferior de una placa de 24 pocillos durante 24 horas. Para el ensayo de proliferacion, se pusieron 2,5 x 104 pCSC (celulas madre cardiacas porcinas) en placas de 24 x 35 mm y se privaron de suero durante 36 horas en medio base DMEM/F12 10 con 0 % de suero. Como control de lmea base actuaron 6 placas y se complementaron con BrdU (1 pg/mL) antes de ser fijadas y tenidas 1 hora mas tarde. Despues se anadio medio base DMEM/F12 complementado con FBS al 3 % y 200 ng/mL de HGF (n = 6 placas) o 200 ng/mL de IGF-1 (n = 6 placas) a las 12 placas restantes. Como controles actuaron 6 placas, sin factores de crecimiento anadidos al medio. Se anadio BrdU, 1 pg/mL cada 6 horas. Se fijaron las celulas despues de 24 horas y se evaluo la incorporacion de BrdU utilizando el kit del sistema de deteccion de 15 BrdU (Roche). Se hizo la tincion de contraste de los nucleos con el colorante de union a DNA, 4,6-diamidino-2- fenilindol (DAPI, Sigma) a 1 pg/mL. Se evaluaron las celulas utilizando microscopfa de fluorescencia (Nikon E1000M). Se contaron 10 campos aleatorios con un aumento de x20 para cada placa, y los numeros se expresaron como el porcentaje de las celulas BrdU positivas con respecto al numero total de celulas contadas.
Inmunocitoqmmica
20 Se cultivaron las celulas en portaobjetos de vidrio con camara (BD Falcon) durante 2 dfas, se fijaron con PFA al 4 % durante 20 min y despues se tineron. Para la tincion intracelular, se permeabilizaron las celulas utilizando Triton X- 100 al 0,1 %. Se incubaron las celulas con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C, se lavaron tres veces y despues se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado a FITC o conjugado a rojo de Texas durante 1 hora a 37 °C. Despues, se lavaron las celulas tres veces y se hizo la tincion de contraste de los nucleos con DAPI. Se 25 visualizo la fluorescencia y se tomaron imagenes con microscopfa confocal (Zeiss LSM510). Los siguientes anticuerpos se usaron para la tincion celular: Oct3/4, Nanog, Isl-1, c-kit, Flk-1, y Nkx2,5 (R & D Systems); Bmi-1, c- met e IGF-1r (Santa Cruz Biotechnology), telomerasa (Abcam). Se tineron las cardioesferas para c-kit despues de 24 horas de cultivo en un portaobjetos de vidrio con camara. Despues de 4-6 dfas de cultivo para permitir el crecimiento y la diferenciacion de las celulas de la esfera, se tineron con anticuerpos frente a la actina del musculo liso, la a- 30 actina sarcomerica (Sigma) y el factor de von Willebrand (DAKO). Todos los anticuerpos secundarios se compraron de Jackson Immunoresearch.
Analisis de transferencia Western
Las inmunotransferencias para detectar los receptores de IGF-1 (IGF-1R) y de HGF (c-met) se llevaron a cabo como se ha descrito previamente (Ellison et al., 2007, J. Biol. Chem. 282: 11397) utilizando lisados de protemas obtenidos 35 de las pCSC c-kitpos sometidas a medio de privacion de suero durante 24 horas, seguido de una complementacion con 200 ng/mL de IGF-1 o 200 ng/mL de hGf durante 10-20 minutos. Se utilizaron los siguientes anticuerpos a las diluciones sugeridas por los fabricantes: anticuerpos policlonales de conejo Abs IGF-1R, fosforo-IGF1R, Akt, fosforo- Akt, c-met (senalizacion celular), fosforo-c-met (Abcam), FAK y fosforo-FAK (Upstate).
Histologfa
40 Despues de la escision auricular, se dividieron los corazones en 5 cortes coronales desde el apice hasta la base con cortes perpendiculares al eje largo. Se obtuvieron muestras de miocardio infartado, peri-infartado y distal de cada nivel de cada cerdo. Se lavaron las muestras con PBS, se fijaron en formalina al 10 % y se incluyeron en parafina. Se prepararon secciones de 5 pm en un microtomo (Sakura) y se montaron en portaobjetos de microscopio. Las secciones se tineron con hematoxilina y eosina (H&E), segun procedimientos estandar (Ellison et al., 2007, J. Biol. 45 Chem. 282: 11397). El diametro de los miocitos se midio a traves del nucleo en las secciones de H&E (3 portaobjetos por animal) de la region de peri-infarto de los niveles C y D, en un microscopio optico (Nikon E1000M) utilizando el software Lucia G. Se analizaron un total de 200 miocitos por seccion para cada cerdo.
Para determinar la fibrosis del miocardio, se tineron las secciones del miocardio infartado con rojo sirio como se ha descrito previamente (Lee, C.G. et al., 2001. J. Exp. Med. 194: 809). Las secciones seriales se fijaron en formalina al 50 10 % en PBS durante 20 min. Despues de lavar en agua destilada durante 5 minutos, se incubaron las secciones a
temperatura ambiente durante 30 minutos en azul rapido RR al 0,1 % en tampon de borato de magnesio a pH 9 (Sigma). Despues, se lavaron las secciones en agua destilada antes de la incubacion a temperatura ambiente durante 10 minutos en rojo sirio al 0,1 % en acido pfcrico saturado (Sigma). Se lavaron las secciones adicionalmente en agua destilada antes de que fueran deshidratadas, separadas y montadas. En este protocolo, el tejido conjuntivo 55 (principalmente colageno) se tine de rojo y el musculo se tine de amarillo/naranja. La evaluacion semicuantitativa de la cantidad de tejido conjuntivo del miocardio se llevo a cabo utilizando el analisis de imagenes Lucia G con un aumento de x40. Se determino el tanto por ciento de colageno (porcentaje de area de tincion positiva) en toda la zona del infarto. Se evaluaron un total de 3 portaobjetos por animal para cada nivel, y se obtuvo la media.
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Inmunohistoqmmica y microscopfa confocal
Para identificar las CSC, se tineron secciones transversales del corazon de cerdo con anticuerpos frente al anrigeno de celulas madre, c-kit (policlonal de conejo, Dako). Las CSC c-kitpos se identificaron como linaje negativo (Linneg), por tincion negativa para marcadores de linajes hematopoyeticos, neurales y de musculo esqueletico (21). Para la cuantificacion de la distribucion de las CSC del miocardio en las diferentes regiones cardfacas de los cerdos control, se conto el numero de celulas c-kitpos (linneg) y de cardiomiocitos para un total de 5 secciones con un aumento de x63. Despues se midio el area de cada seccion transversal y se determino el numero de CSC y de cardiomiocitos por unidad de area. Los datos para las auriculas se agruparon, debido a las pocas diferencias encontradas entre el numero de CSC c-kitpos en las auriculas izquierda y derecha. El numero de las CSC se expreso por 106 miocitos.
Las celulas en ciclo se identificaron mediante tincion con BrdU (Roche) y Ki67 (Vector labs). Las celulas progenitoras dieron tincion positiva para c-kit y los factores de transcripcion, Nkx2,5 (R & D Systems), Ets-1 y GATA6 (Santa Cruz Biotechnology). Los miocitos recien formados se identificaron con anticuerpos frente a BrdU, Ki67 y a-actina sarcomerica (Sigma), troponina I cardfaca (Santa Cruz Biotechnology) o cadena pesada de miosina lenta (cardfaca) (Sigma). Las estructuras vasculares recien formadas se detectaron por tincion para BrdU y a-actina de musculo liso (monoclonal de raton, Sigma) o vWF (policlonal de conejo, Dako). Las imagenes se adquirieron utilizando microscopfa confocal (Zeiss 510 LSM). Se cuantifico el numero de las CSC, de las celulas progenitoras de miocitos (c-kitpos/Nkx2,5pos) y de los miocitos recien formados (BrdUpos y ki67pos) para las regiones de infarto, peri-infarto y distales en cada nivel. Se contaron un total de 3000 celulas (~ 20 campos) para cada region con un aumento de x63. Se evaluaron 3 portaobjetos por animal. Los numeros se expresaron como porcentaje relativo al numero total de celulas contadas. Se midio el tamano de 50 miocitos BrdUpos recien formados por animal en las regiones de infarto y peri-infarto utilizando el software Lucia G.
La densidad de capilares en la region del infarto se evaluo mediante tincion con un anticuerpo frente a vWF (DAKO). El 2° Ab utilizado fue un anticuerpo anti-conejo de burro, conjugado con HRP (Santa Cruz). La peroxidasa endogena en la seccion se bloqueo con peroxido de hidrogeno al 3 % en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente. El cromogeno 3,3-diaminobencidina (DAB) (Sigma) se utilizo para visualizar los vasos sangumeos. Se hizo la tincion de contraste de los portaobjetos con hematoxilina para la identificacion de nucleos. Se determino el numero de capilares (definidos como 1 o 2 celulas endoteliales que abarcan la circunferencia del vaso vWF-positivo) contando 10 campos/seccion en la zona del infarto en los niveles C y D a un aumento de x40. Se evaluaron un total de 3 portaobjetos/animal. El numero de capilares se expreso por 0,2 mm2.
Para detectar la apoptosis celular, se tineron las secciones con anticuerpo primario anti-caspasa-3 activada humana de conejo (R & D Systems) y un 2° Ab de burro anti HRP conjugado de conejo. El cromogeno DAB (Sigma) se utilizo para visualizar los cardiomiocitos apoptoticos. Las secciones sometieron a tincion de contraste con hematoxilina y se montaron permanentemente antes de ser examinadas con microscopio optico. El numero de miocitos positivos a caspasa-3 en la zona peri-infarto de los niveles C y D se determino contando 20 campos aleatorios/seccion a 40 aumentos. Se evaluaron un total de 3 portaobjetos/animal. La cantidad de miocitos positivos a caspasa-3 se expreso como porcentaje relativo al numero total de miocitos contados.
Analisis estadfstico
Los datos se registran como la media ± SD. La significancia entre 2 grupos se determino mediante la prueba t de Student y en comparaciones multiples mediante el analisis de varianza (ANOVA). Se utilizo el metodo post hoc de Bonferroni para localizar las diferencias. La significancia se establecio en P <0,05.
Ejemplo 1
Preparacion de microesferas de PLGA
Se prepararon dos conjuntos de microesferas de PLGA (acido poli(lactico-co-glicolico)) y alginato; un conjunto que contema una mezcla de albumina de suero humano (HSA) y factor de crecimiento insulmico tipo 1 (IGF-1), el otro conjunto que contema una mezcla de HSA y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). La HSA se utilizo para proporcionar suficiente volumen para la emulsion dadas las muy pequenas cantidades que se necesitan de los factores de crecimiento.
Las condiciones utilizadas para formar las microesferas de PLGA son las siguientes:
Se empleo un nebulizador Flow Focussing of Ingeniatrics (D = 150 pm, H = 125) en una configuracion lfquido-lfquido en la que el lfquido enfocado es la emulsion de PLGA + HSA + factor de crecimiento y el lfquido de enfoque es agua.
La fase lipfdica consistio en: PLGA al 5 % en EtOAc (acetato de etilo)
La fase acuosa consistio en: HSA al 5 %, factor de crecimiento al 0,1 %, NaCl al 0,45 %, Tween 20 al 0,25 % en H2O.
La mezcla de las dos fases se sometio a ultrasonidos durante 30 minutos.
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Las microgotitas se producen en un bano de alcohol polivimlico al 2 % (PVA, Fluka Chemica).
El tamano de las partmulas se controla por el volumen de flujo de los fluidos enfocados (Qd) y de los fluidos de enfoque (Qt). Para obtener partmulas de 15 ± 1 micras, se utilizaron un Qd = 3,5 mL/h y un Qt = 3 mL/h. La eficacia de la encapsulacion de la mezcla de HSA + IGF-1 fue del 37 %.
El tamano de las partmulas se determino por microscop^a optica y electronica (vease la Figura 8).
Se utilizaron los mismos procedimientos con modificaciones menores para preparar las partmulas de PLGA que contienen HGF.
Ejemplo 2
Optimizacion de la produccion de microesferas de PLGA monodispersas de 15 pm de diametro
Para optimizar la eficacia de la encapsulacion a fin de reducir el numero de microesferas a ser administradas, se optimizaron las condiciones utilizadas con modificacion en los siguientes parametros:
a. - Incorporacion de emulsionantes en la fase lipfdica. Se encontro que la combinacion optima era una mezcla de Tween 80 y Span 60 que produda una emulsion estable durante hasta 5 horas.
b. - Optimizacion de la concentracion de protema (albumina serica humana), HSA al 20 % en lugar de al 5 %.
c. - Optimizacion de la concentracion de NaCl en la fase acuosa a 0,2 % en lugar de 0,45 %.
d. - Optimizacion de la concentracion de PLGA a 5,5 % en lugar de 5 % en EtOAc.
e. - La concentracion de HGF-1 en la mezcla inicial era 0,4 %
Por lo tanto, la fase acuosa consistio en HSA al 20 %, IGF-1 al 0,4 %; NaCl 0,2; Tween 20 0,1; Span 60 0,15. La fase organica consistio en PLGA al 5,5 % en EtOAc (acetato de etilo).
Las micropartmulas se obtuvieron mediante un enfoque de flujo simple utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo n° 1.
El tamano de las partmulas, determinado por SEM (microscopfa electronica de barrido) fue de 14,36 pm con una SD de 0,91 y una eficacia de encapsulacion de 82,4 con un atrapamiento del 13,1 %. Las determinaciones de protemas complementadas con ensayos ELISA cuantitativos documentaron que cada 1 x 106 microesferas llevaban 3 pg de IGF-1 y 348 pg de HSA. Los ensayos biologicos in vitro del IGF-1 contenido en las microesferas analizadas en cuanto a su capacidad de unirse y activar el receptor de IGF-1 de celulas vivas muestran que despues de una ronda de liofilizacion y resuspension, el IGF-1 encapsulado mantuvo el 82 % de la actividad biologica original. Por lo tanto, cada millon de microesferas tema una actividad biologica equivalente a 2,5 pg del IGF-1 nativo.
Se utilizaron protocolos similares para encapsular HGF, con un resultado final de 1,7 pg de HGF encapsulado por 1 x 106 partmulas con una actividad biologica del 63 % del original. Por lo tanto, cada millon de microesferas de HGF puede administrar el equivalente a 1 pg de HGF activo.
La encapsulacion de SCF (factor de celulas madre), el ligando para el receptor c-kit, produjo partmulas que conteman 2,3 pg de SCF por 1 x 106 microesferas con una actividad del 76 % de la solucion original determinada mediante la activacion del receptor c-kit.
Conclusion: El procedimiento de enfoque de flujo unico utilizado es muy eficiente en la encapsulacion de una mezcla de HSA y diferentes factores de crecimiento. Cambiando la relacion inicial de HSA a factor de crecimiento es posible alcanzar valores de carga de hasta 350 pg de la protema farmacologica deseada por 1 x 106 microesferas de PLGA de 15 pm de diametro con un coeficiente de variacion < 6 %.
Ejemplo 3
Produccion de microesferas de alginato monodispersas y encapsulacion de IGF-1
Los reactivos y equipo utilizados para la produccion de las microesferas fueron los siguientes:
- Alginato: Protanal LF 10/60; FMCBioPolymer (G/M >1,5); Protanal LF10/60LS; FMCBioPolymer (G/M <1).
- HSA (albumina serica humana, 97-99 %, A9511) de Sigma-Aldrich
- IGF-1 de PreProtect
- CaCh; citrato de sodio tribasico
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- Nebulizadores FF simples en la configuracion de Uquido-gas: L2 (D = 100 pm, H = 100) y L3 (D = 100 pm, H = 100).
- Bomba Harvard 11 plus.
Despues de mas de 120 ensayos para establecer las condiciones apropiadas, se hizo evidente que una mezcla de alginatos dio mejores resultados que un solo alginato. Protanal LF10/60: Protanal LF10/60LS en una relacion de 0,7 %:3 % dio los resultados optimos. Se encontro que la distancia optima para la nebulizacion era de 10 cm. La concentracion optima de HAS en la mezcla era 14 % y del IGF-1 0,3 %. Esta mezcla se nebuliza utilizando el FF (D = 100 pm, H = 100) en la configuracion liquido-gas (APt = 300 mbar, Qd = 5 mL/h utilizando gas como fluido de enfoque. El nebulizador se coloca a 10 cm de una solucion de CaCl2 al 3 % en un bano con agitacion, se recoge por centrifugacion despues de 30 min y se lava para eliminar el CaCh. La distribucion de tamano de las partmulas se determina por citometna de flujo y SEM. La eficacia de encapsulacion de HSA por la cuantificacion de protemas y curvas estandar. La encapsulacion de hrHGF-1 se determino mediante ELISA como se describe en el Ejemplo n° 2.
El tamano de las partmulas, determinado por SEM, fue de 15,87 pm con una SD de 1,83 y una eficacia de encapsulacion de 71,4 con un atrapamiento del 11,6 %. Las determinaciones de protemas complementadas con ensayos ELISA cuantitativos documentaron que cada 1 x 106 microesferas llevaban ~2 pg de IGF-1 y 269 pg de HSA. Los ensayos biologicos in vitro del IGF-1 contenido en las microesferas analizadas en cuanto a su capacidad de unirse y activar el receptor de IGF-1 de las celulas vivas muestran que despues de una ronda de liofilizacion y resuspension, el IGF-1 encapsulado mantuvo el 67 % de la actividad biologica original. Por lo tanto, cada millon de microesferas tema una actividad biologica equivalente a ~ 1,5 pg del IGF-1 nativo.
Este protocolo se puede adaptar para ser utilizado con diferentes tipos de polfmeros tales como copolfmeros de bloque segmentados de polieter-poliester de poli(tereftalato de butileno) (PBT) y poli(oxido de etileno) (PEO) PolyActive® utilizando el nebulizador FF asf como otros metodos de pulverizacion.
Conclusion: el alginato es un polfmero adecuado para la produccion de microesferas monodispersas con un diametro aproximado de 15 pm y para encapsular grandes cantidades de protemas. Los protocolos utilizados se pueden modificar para aumentar la relacion de IGF-1 a HSA hasta 60:40, lo que aumenta la carga de compuesto activo en mas de dos ordenes de magnitud. A partir de los resultados obtenidos, el intervalo de tamanos alrededor del pico de 15 pm es mas estrecho cuando se usa PLGA que con la combinacion de alginatos analizada aqrn. Dado el gran numero de diferentes preparaciones de alginato, es probable que la homogeneidad de las micropartmulas encontradas aqrn se pueda mejorar significativamente.
Ejemplo 4
Para producir microesferas en las que el compuesto activo esta localizado en la superficie de la partmula, es posible producir las microesferas mostradas anteriormente utilizando un polielectrolito en lugar de PLGA de carga de signo opuesto al compuesto activo que se va a unir. Ejemplos de tales polielectrolitos son goma arabiga, pectinas, protemas, acidos nucleicos, polisacaridos, acido hialuronico, heparina, carboximetilcelulosa, quitosano, acido algmico y una multitud de polfmeros sinteticos. Cuando el polielectrolito tiene una carga de signo opuesto al compuesto activo, es posible unirlo a la micropartmula por absorcion a partir de una solucion del compuesto activo.
Ejemplo 5
Las microesferas de 15 pg de diametro son optimas para el atrapamiento capilar despues de la administracion intracoronaria sin derrames a la circulacion sistemica.
Se sedaron cerdos blancos Yorkshire hembras (n = 2) (27 kg) con telazol (100 mg, I.M.), se intubaron y se afeitaron. Se coloco un cateter intravenoso en una vena periferica de la oreja. Los animales se trasladaron a la sala de cirugfa, se colocaron en una tabla soporte y se fijaron a la mesa quirurgica con fijaciones de extremidades. Los animales se mantuvieron anestesiados con isoflurano (a 2,5 % con O2) y se monitorizo su EKG (electrocardiograma) de forma continua durante todo el procedimiento. Utilizando una fuente radiologica portatil (GE STENOSCOP, GE Medical Systems USA) como grna fluoroscopica, se intubo la arteria coronaria principal izquierda con un cateter grna 6F JR 3,5 de 40 cm de longitud especialmente disenado para el protocolo (Cordynamic-Iberhospitex S.A. Barcelona, Espana) Se realizo una angiograffa coronaria basal.
En ambos animales, se hizo avanzar un cateter grna coronario de 2 mm de diametro sobre una grna (Hi-Torque Balance Middle-Weight 0,014") hasta el origen de la arteria coronaria izquierda. A traves de este cateter se hizo avanzar un microcateter de 0,014" (0,3 mm) de diametro interno y se coloco su punta en la porcion proximal de la arteria coronaria anterior izquierda (LAD), justo debajo del origen de la primera arteria perforante. Esta es la misma localizacion utilizada para producir el infarto de miocardio experimental y para la administracion de la solucion de los factores de crecimiento descritos anteriormente. Se coloco otro cateter en el seno coronario para recoger muestras de sangre venosa cardfaca durante el procedimiento. Antes de comenzar la administracion, se recogio una muestra de sangre periferica, venosa coronaria y arterial coronaria. En el caso de extrasfstoles ventriculares abundantes o fibrilacion ventricular, se administro lidocama de 1-3 mg/kg por via intravenosa. La medicacion preoperatoria se administro como 75 mg de clopidrogel (Plavix) y 250 mg de aspirina un dfa antes del procedimiento quirurgico. La
medicacion posoperatoria consistio en 75 mg de clopidrogel (Plavix) y 125 mg de aspirina diariamente hasta el sacrificio.
Para determinar el tamano optimo de las microesferas para que sean atrapadas completamente en la red capilar, una mezcla de microesferas de poliestireno fluorescentes de diametros 2 pm, 4 pm, 6 pm, 10 pm; 12 pm y 15 pm, 5 cada una marcada con un color diferente (compradas de Invitrogen y de Polysciences Inc., Cat # F8830, F8858; F8824; microesfera de 6,0 pm coloreada Polybead Black, Megabead NIST de 12,0 pm y F8842) se mezclaron en una suspension de 20 mL de PBS a una concentracion de 1 x 106 microesferas de cada uno de los 6 tamanos por mL y se agitaron en vortex durante 5 minutos para asegurar una suspension homogenea. Esta suspension se administro en el origen de la arteria coronaria izquierda de tres cerdos a traves del cateter de angiograffa mediante 10 una bomba de Harvard a una velocidad de 1 mL/min. Despues de la administracion de cada mL (1 millon de microesferas), se suspendio la inyeccion durante 3 min durante cuyo tiempo se tomo una muestra de sangre del seno coronario. Inmediatamente despues de obtener las muestras de sangre, se prepararon portaobjetos de frotis de sangre para verificar la presencia de micropartfculas fluorescentes. Despues de la administracion completa de los 20 mL de suspension de microesferas, se recogieron muestras de sangre del seno coronario durante 3 horas 15 adicionales a intervalos de 30 minutos. Al final del experimento, se sacrificaron los animales y se extirpo y se fijo el corazon, y se tomaron muestras por secciones seguido de un examen microscopico histologico y fluorescente.
Debido a que se administraron microesferas de diferentes tamanos en igual numero, sus proporciones en el flujo venoso del seno coronario y en el miocardio debfan ser imagenes especulares entre sf. Las partmulas que atraviesan el lecho capilar deben tener una concentracion alta en la sangre del seno coronario y baja en el miocardio 20 al final del experimento. Lo contrario debena ser cierto para las partmulas que no pasan a traves del lecho capilar. Como se muestra a continuacion, solo los tamanos >10 pm son retenidos eficientemente en el miocardio pero incluso microesferas de 10 y 12 pm se filtran a traves en gran medida puesto que entre 19 y 8 %, respectivamente, de estas microesferas pasaron a la circulacion sistemica. Por otro lado, < 1 % de las partmulas de 15 pm pasaron a traves del lecho capilar y alcanzaron el seno coronario.
25 Tabla 2
Tamano de la microesfera en pm:
2 4 6 10 12 15
Salida hacia la coronaria
95 73 53 19 8 <1
Seno (calculado) en %
Retenido en el miocardio 3 h despues de la administracion en %
<3 15 41 77 90 >99
Para determinar si los resultados mostrados arriba eran o no espedficos para el miocardio o se podnan extender a otros tejidos, se utilizo el mismo protocolo para administrar una suspension identica de microesferas a traves de la arteria femoral de la pierna derecha. Se recogieron muestras de sangre de la vena femoral y se analizaron muestras 30 del musculo cuadriceps para determinar la permanencia de las diferentes microesferas en el musculo esqueletico. Los resultados se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3
Tamano de la microesfera en pm:
2 4 6 10 12 15
Flujo de salida hacia el retorno venoso (calculado) en %
92 67 59 12 11 <1
Retenido en el musculo esqueletico 3 h despues en %
<1 11 27 72 83 >99
Conclusion: El tamano mmimo de las microesferas que asegura > 99 % de retencion en el tejido de interes es de 15 35 pm de diametro. Debido a que es importante utilizar el tamano efectivo mmimo con el fin de minimizar la produccion de microfocos de isquemia por obstruccion de las arteriolas precapilares, este tamano de diametro es el optimo para la administracion local de sustancias a un tejido particular a traves de su lecho capilar.
Ejemplo 6
Administracion de las microesferas en la circulacion coronaria.
40 Se preparo una suspension de 20 mL de microesferas de poliestireno fluorescentes de 15 pm (Invitrogen, Cat #
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F8842, microesferas de poliestireno FluoSpheres®) a una concentracion de 1x106/mL en PBS y se sometio a agitacion en vortex durante 5 minutes. Se administro esta suspension a traves del cateter de angiograffa mediante una bomba de Harvard a una velocidad de 1 mL/min en el origen de la arteria coronaria izquierda principal. Despues de la administracion de cada mL (1 millon de microesferas), se suspendio la inyeccion durante 3 min, durante cuyo tiempo se hizo un EKG completo y se tomo una muestra de sangre del seno coronario. Inmediatamente despues de obtener las muestras de sangre, se prepararon portaobjetos con frotis de sangre para verificar la presencia de micropartteulas fluorescentes. El resto de la muestra se guardo para determinaciones enzimaticas. El procedimiento se continuo hasta que el electrocardiograma presento alteraciones mmimas coherentes con isquemia de miocardio. Se midio el flujo sangumeo coronario (TIMI) al comienzo del experimento y despues de la administracion de la suspension de partteulas. Se dejo que se recuperasen los dos cerdos, se volvieron a examinar a las 24 horas y se sacrificaron despues.
Resultados:
En el animal n° 1 se detectaron las primeras alteraciones del electrocardiograma despues de la administracion de 16 mL de la suspension (16 millones de microesferas). En el segundo animal, las alteraciones del electrocardiograma no aparecieron hasta despues de la administracion de 18 mL (18 millones de microesferas). En ambos animales, el flujo sangumeo coronario fue TIMI 3 (normal) al final del procedimiento. El animal n° 1 se sacrifico 24 horas despues de la terminacion de la perfusion. Se hizo un EKG completo y se recogieron muestras de sangre antes del sacrificio. El corazon fue procesado para examen macroscopico y microscopico.
El animal n° 2 a las 24 horas tema un electrocardiograma y un flujo sangumeo coronario (TIMI 3) normales. Despues de obtener un conjunto de muestras de sangre, se sacrifico el animal y se proceso el corazon para examen macroscopico y microscopico.
Todos los frotis de sangre de las muestras tomadas del seno coronario y de la circulacion sistemica de los animales n° 1 y n° 2 se examinaron por microscopfa de fluorescencia con alto y bajo aumento. No se detectaron perlas fluorescentes en ninguna de las muestras. Esto indica que el atrapamiento en la red capilar de las microesferas de 15 pm de diametro es muy eficiente. Ademas, si hay derivaciones funcionales desde las arterias coronarias al ventnculo derecho con este metodo de inyeccion a traves de las venas de Tebesio, son menores y no se detectan por los metodos empleados aqrn.
Las medidas enzimaticas (Tabla 4) muestran que el animal n° 1 desarrollo un pequeno infarto de miocardio como se demuestra por el aumento del nivel de troponina T cardfaca espedfica (TnT) en sangre (los valores superiores a 0,01 ng/mL son anormales), mientras que los valores del animal n° 2 son normales y sugieren que este animal desarrollo solo isquemia transitoria durante la administracion de las partteulas y se recupero sin ningun dano del miocardio permanente. Esta interpretacion fue confirmada por la patologfa como se muestra a continuacion. La seccion macroscopica del corazon del animal n° 1 muestra microfocos de necrosis (areas palidas) mientras que la seccion del animal n° 2 es normal. Esta conclusion fue confirmada por la histopatologfa (no se muestran datos).
Tabla 4
Marcador PRE INJ CS PRE INJ POST CS POST POST 14 H POST 24 H
CERDO 1
CK 574 669 423 567 1920 1982
MB 521 646 506 498 919 1231
TrT 0,01 0,01 0,01 0,01 1,72 1,35
CERDO2
CK 1120 1114 1099 1073 1834 1895
MB 922 791 920 523 867 739
TrT 0,02 0,01 0,04 0,01 0,01 0,01
Conclusion: La administracion de hasta 15x106 microesferas de 15 pm de diametro en el area irrigada por la arteria descendente anterior izquierda (LAD) en un corazon es bien tolerada y no produce dano al miocardio. Las dosis superiores a 15x106 microesferas tienen un alto riesgo de producir pequenas areas isquemicas que pueden dejar una cicatriz permanente. Por lo tanto, con una carga en el intervalo medio de los valores obtenidos con PLGA como el polfmero de 1 mg de protema por 1 x 106 microesferas de 15 pm de diametro, es posible administrar hasta 15 mg del agente terapeutico al lecho capilar del miocardio irrigado por la arteria coronaria izquierda.
Ejemplo 7
Administracion de microperlas de PLGA cargadas con factores de crecimiento
Una vez que se hubo determinado el intervalo de dosis de seguridad de las microesferas de 15 pm, se utilizo el mismo protocolo para administrar 10x106 microesferas de PLGA (15 pm de diametro) a la misma region del 5 miocardio. La suspension de microesferas estaba compuesta por 4x106 microesferas de PLGA cargadas con un total de 2 pg de factor de crecimiento insulmico tipo 1 recombinante humano (IGF-1); 4x106 microesferas de PLGA cargadas con un total de 1 pg de factor de crecimiento de hepatocitos recombinante humano (HGF). Estos dos tipos de microesferas se cargaron tambien con un colorante verde fluorescente para hacer mas facil su visualizacion en la sangre y en las secciones histologicas. Ademas, la suspension contema 2x106 de poliestireno fluorescente en la 10 gama naranja de Invitrogen. Las esferas de Invitrogen se incluyeron para servir como control de la estabilidad y distribucion de las microesferas de PLGA. La suspension en 10 mL de PBS fisiologico se administro a los cerdos instrumentados como se ha descrito anteriormente.
La administracion de la suspension a los dos animales transcurrio sin incidentes y no hubo signos electrocardiograficos de isquemia. El flujo sangumeo capilar fue normal durante y despues del procedimiento (TIMI 15 3). Un animal (cerdo n° 3) se sacrifico 30 minutos despues del procedimiento y el otro (cerdo n° 4) a las 24 horas
despues del procedimiento. Ambos corazones se procesaron para analisis macroscopico y microscopico.
Ni las muestras de sangre del seno periferico ni las del seno coronario de estos dos animales mostraron la presencia de perlas de Invitrogen o de PLGA en los multiples frotis de sangre. El analisis preliminar de secciones de pulmon, tugado y bazo de estos dos animales tampoco detecto la presencia de ningun tipo de microesferas.
20 Tabla 5
Marcador PRE INJ CS PRE INJ POST CS POST POST 14 H POST 24 H
CERDO3
CK 589 692 432 657
MB 527 626 560 418
TrT 0,01 0,01 0,01 0,01
CERDO4
CK 467 468 441 442 434
MB 451 505 562 378 411
TrT 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01
Leyenda para las tablas 4 y 5. Marcadores: CK, creatina cinasa; MB, la isoforma MB de creatina cinasa que es espedfica cardfaca; TrT, Troponina T cardiaca, que es el marcador mas espedfico y sensible para el dano miocardico. PRE INJ CS, muestra de sangre tomada del seno coronario al inicio del procedimiento; PRE INJ, 25 muestra de sangre sistemica tomada al inicio del procedimiento; POST CS, muestra de sangre tomada del seno coronario al final del procedimiento; POST, muestra de sangre de la circulacion sistemica tomada al final del procedimiento; POST 14 H, muestra de sangre sistemica tomada a las 14 horas despues del procedimiento; POST 24 H, muestra de sangre sistemica tomada 24 horas despues del procedimiento antes de sacrificar al animal.
Las secciones macroscopicas de estos dos animales fueron completamente normales (no se muestran). El analisis 30 de la seccion del cerdo n° 3 bajo el microscopio fluorescente mostro la distribucion de las perlas de PLGA (verde) y de las perlas de poliestireno (rojo/naranja) en los vasos capilares en la proporcion aproximada de 1:4 (Figura 10 mas adelante), como se podna esperar de la composicion de la mezcla administrada. No hubo evidencia de ningun dano microscopico al tejido en ninguna de las regiones del corazon examinadas. En el cerdo n° 4, el numero de perlas de PLGA (verde) ha disminuido ya significativamente y la relacion de estas perlas a las de poliestireno (rojo/naranja) es 35 mas proxima a 1:1 (vease la Figura 11), lo que indica que las perlas de PLGA se degradan con una semivida de ~16 horas.
Eficacia de IGF-1 y HGF administrados en microesferas para estimular a las celulas madre cardfacas residentes.
Como se ha descrito anteriormente, la combinacion de IGF-1 y HGF administrada a traves de las arterias coronarias fue muy eficaz para estimular la activacion de las celulas madre cardfacas residentes. En este ensayo preliminar se 40 monitorizo la activacion de las celulas madre en la region en que se administraron las microesferas y se comparo con una region del ventnculo izquierdo no irrigada por la arteria coronaria izquierda. Como se puede ver en las imagenes de la Figura 11, la mayor parte de las celulas madre residentes en el miocardio no tratado son quiescentes (resaltadas por flechas/cabezas de flechas) mientras que las de la region tratada han entrado en el ciclo celular, como se demuestra por la expresion del marcador del ciclo celular ki-67 (senal amarilla en el nucleo- en las Figuras, 45 las "manchas" claras en las zonas iluminadas). Por lo tanto, la administracion de factores de crecimiento en un
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sustrato solido que los administra a los capilares y los mantiene allf hasta que se descargan en el espacio intersticial circundante, es un metodo eficaz de administracion del factor de crecimiento para la estimulacion de la poblacion de celulas madre endogenas.
Conclusion: La administracion local de IGF-1 y HGF a regiones particulares del miocardio por medio de microperlas biodegradables de un diametro que no les permite que crucen los capilares y que entren en la circulacion sistemica es eficaz en la estimulacion de las celulas madre residentes de regiones particulares del tejido sin afectar a aquellas que no son el objetivo de la terapia.
Ejemplo 8
Las celulas madre y progenitoras cardfacas c-kitpos porcinas son multipotentes y fenoripicamente similares a las de otras especies animales
Se examinaron secciones histologicas de miocardio de 3 cerdos Yorkshire que pesaban 24 ± 3 kg mediante microscopfa confocal para determinar la presencia de celulas positivas para el marcador comun de celulas madre, c- kit, el receptor del factor de celulas madre (SCF), que se sabe que es expresado por la mayoria de las CSC. Las celulas pequenas positivas para c-kit (c-kitpos) se distribuyeron por todo el miocardio auricular y ventricular (Figura 1A-B) con una mayor densidad en las auriculas (no hay diferencia entre las auriculas izquierda y derecha, no se muestran datos) y el apice ventricular, en comparacion con otras regiones cardfacas (Figura 1C). Este patron de distribucion coincide con la ubicacion anatomica de las CSC c-kitpos en los corazones de otras especies animales, incluidos los seres humanos. En consecuencia, la densidad de celulas c-kitpos en el corazon del cerdo es similar al miocardio humano y al de roedor: 1 celula por ~1.000 miocitos o ~50.000 celulas c-kitpos por gramo de tejido.
Las muestras de tejido miocardico de diferentes regiones cardiacas porcinas fueron digeridas enzimaticamente para obtener una poblacion celular mermada en miocitos. Las celulas c-kitpos constituyeron 10 ± 3 %, 3 ± 2 % y 7 ± 3 % de la poblacion inicial de celulas cardiacas mermadas en miocitos de las auriculas, ventriculos y apice, respectivamente (Figura 1D).
Se separaron las celulas c-kitpos utilizando tecnologfa MACS (21) que produjo una preparacion de celulas altamente enriquecidas constituida por > 90 % de celulas c-kitpos (Figura 1E). El analisis FACS mostro que las celulas cardiacas enriquecidas c-kitpos eran negativas para el marcador pan-leucocitario CD45 y el marcador progenitor endotelial/hematopoyetico CD34 (Figura 1E). Una alta fraccion (87 %) de celulas cardiacas porcinas c-kitpos expresaron CD90, (un marcador mesenquimatico no espedfico comun) y CD166 (molecula de adhesion) (Figura 1E). Solo una pequena fraccion fue positiva para los marcadores de progenitores hematopoyeticos/endoteliales, CD105 y C D133 (Suppl Figura 1). Las celulas cardiacas c-kitpos fueron negativas cuando se analizaron para un panel de marcadores CD espedficos para otros linajes de celulas hematopoyeticas, mesenquimatosas y endoteliales, que incluyen CD13, CD14, CD31, CD38, cD44, CD33. A partir de estos analisis, se puede sacar la conclusion de que las celulas cardiacas porcinas clasificadas por c-kit son c-kitpos, CD90pos, CD166pos, CD105baja, CD133bajay CD45neg, CD34neg, CD31neg, CD44neg.
Celulas cardiacas c-kitpos recien aisladas de auriculas, ventriculos y apice se expandieron en cultivo (4 pases) y despues se depositaron como celulas individuales en placas Terasaki de 96 pocillos para generar clones de celulas individuales (Figura 2A-B). La eficacia clonal de las celulas porcinas fue similar para todas las localizaciones cardiacas y similar a la eficacia de clonacion registrada previamente de las CSC de roedores (Figura 2C) (Beltrami et al., Cell 2003). Se escogieron aleatoriamente 2 clones de las celulas derivadas de auriculas, ventriculos y apice, y se expandieron aun mas. Estos clones mostraron un tiempo de duplicacion de ~30 horas y han sido propagados hasta ahora durante mas de 65 pases y subclonados en serie cada 10 pases, sin llegar a alcanzar la parada del crecimiento ni la senescencia. Estos clones de celulas cardiacas c-kitpos han mantenido un cariotipo normal sin alteraciones cromosomicas detectables.
Las celulas cardiacas porcinas c-kitpos clonadas se analizaron en busca de marcadores de estaminalidad y compromiso con linaje cardfaco utilizando inmunocitoqmmica. Las celulas mostraron positividad para c-kit (90 ± 8 %), Flk-1 (86 ± 9 %), Oct3/4 (62 ± 11 %), Nanog (46 ± 5 %), telomerasa (81 ± 10 %), Bmi-1 (70 ± 14 %), Nkx2,5 (52 ± 8 %), Isl-1 (8 ± 6 %) (Figura 2D). Debido a que los clones se originaron a partir de celulas individuales, la amplia expresion de los genes de multipotencia en su progenie dio a entender que el nivel de expresion de estos genes en la poblacion de celulas parentales es muy alto. Desafortunadamente, la poblacion primaria de celulas c-kitpos es una mezcla de las CSC, progenitoras y precursoras, y todavfa hay marcadores espedficos para las CSC "reales". Por lo tanto, solo es posible inferir el fenotipo de estas celulas a traves del analisis de sus descendientes.
Cuando las celulas cardiacas porcinas c-kitpos clonadas se pusieron en placas en un medio de formacion de cardioesferas modificado (mCSFM) en placas bacteriologicas (Corning), crecieron en suspension y generaron clones esfericos, denominados cardioesferas (Figura 2E) (Beltrami, A.P. et al., 2003. Cell 114: 763; Oh H, Bradfute SB, Gallardo TD et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation and fusion after infarction. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100 (21): 12313-12318; Matsuura K , Nagai T, Nishigaki N et al., Adult cardiac Sca-1- positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. J Biol Chem 2004; 279 (12): 11384-11391). Cuando las cardioesferas se colocaron en placas de plastico recubiertas de laminina con medio de diferenciacion cardiogenica,
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se unieron y las celulas se dispersaron desde la esfera adquiriendo una morfolog^a plana (Figura 2E). Cuatro a seis dfas despues de poner en placas, estas celulas planas perifericas expresaron protemas espedficas de linajes de miocitos (27 ± 4 %), endoteliales (10 ± 6 %) y de celulas de musculo liso (34 ± 5 %) (Figura 2E). Estos resultados muestran que las celulas cardfacas porcinas c-kitpos tienen caractensticas de celulas madre verdaderas, es decir, expresan marcadores de estaminalidad, son clonogenicas, autorrenovables y multipotentes. Por lo tanto, las celulas madre cardfacas c-kitpos porcinas (en lo sucesivo identificadas como pCSC) tienen un patron de expresion genica y un fenotipo concordante con las CSC c-kitpos aisladas de otras especies (Ellison et al., 2007, J. Biol. Chem. 282: 11397).
Las CSC porcinas expresan rutas de senalizacion de IGF-1, HGF y SCF intactas que modulan su activacion
Los resultados muestran la presencia de pCSC verdaderas en el corazon porcino. Las pCSC expresan los receptores IGF-1 y c-met in vivo e in vitro (Figura 2F). Cuando crecen en cultivo, las pCSC recien aisladas responden a la estimulacion por hrIGF-1, hrHGF y hrSCF con proliferacion celular (Figura 2G) y migracion celular (Figura 2H). Tras la union del ligando, se activaron las rutas efectoras espedficas aguas abajo en las pCSC (Figura 2I). Se obtuvieron resultados similares con las celulas procedentes de los clones de celulas individuales expandidas (no se muestran datos). Por lo tanto, las pCSC tienen acoplados funcionalmente sistemas de receptor de factores de crecimiento que pueden ser explotados in vivo para ensayar protocolos de regeneracion de miocardio.
Ejemplo 9
Produccion de infarto de miocardio en cerdos, monitorizacion de la funcion ventricular y regeneracion miocardica mediante la estimulacion in situ de celulas madre cardfacas residentes con factores de crecimiento
Todos los estudios con animales fueron aprobados por comites adecuados de la Escuela Veterinaria y Hospital de Leon, Leon, Espana. Se sedaron cerdos blancos Yorkshire hembras (n = 26) (27 ± 3 kg) con telazol (100 mg, I.M.), se intubaron y se afeitaron. Se coloco un cateter intravenoso en una vena periferica de la oreja. Los animales se trasladaron a la sala de cirugfa, se colocaron en una tabla soporte y se fijaron a la mesa quirurgica con fijaciones de extremidades. Los animales se mantuvieron anestesiados con isoflurano (a 2,5 % con O2). En los 26 animales, se hizo avanzar un cateter con balon coronario sobre una grna y se coloco en la porcion proximal de la arteria coronaria anterior izquierda (LAD), debajo del origen de la primera arteria perforante. Los cerdos recibieron 125 Ul/kg de heparina antes de ser inducido el infarto y despues perfusion de heparina (10 Ul/kg/h) durante el procedimiento de infarto. Para inducir el infarto, la arteria coronaria lAd se ocluyo mediante inflado del balon (2,5 mm de diametro) durante 75 minutos. Para medicacion antiarntmica, los cerdos fueron perfundidos continuamente durante el procedimiento con Amiodarona (Trangorex) (5 mg/kg/h) empezando 15 minutos antes del infarto. En el caso de extrasfstoles ventriculares abundantes o fibrilacion ventricular, se administro lidocama a 1-3 mg/kg por via intravenosa. La medicacion preoperatoria se administro como 75 mg de clopidrogel (Plavix) y 250 mg de aspirina un dfa antes del procedimiento quirurgico. La medicacion posoperatoria consistio en 75 mg de clopidrogel (Plavix) y 125 mg de aspirina diariamente hasta el sacrificio.
Se administraron IGF-1 y HGF (Peprotech) recombinantes humanos en dosis diferenciales (que vanan desde 2 |jg hasta 8 jg de IGF-1 y desde 0,5 jg hasta 2 jg de HGF) a 17 cerdos a traves de un cateter con balon de perfusion que se hizo avanzar inmediatamente distal al origen de la primera arteria septal 30 minutos despues de la reperfusion coronaria. Los factores de crecimiento (GF) se administraron en 15 mL de PBS a una velocidad de 2,5 mL por minuto con una reperfusion de 2 minutos despues de cada administracion de 5 mL. Se inyecto solucion salina sola en otros 9 cerdos con infarto de miocardio (grupo de control de solucion salina-placebo, CTRL) utilizando el mismo protocolo. Cinco (2 del grupo CTRL y 3 de los grupos GF) de los 26 animales murieron durante el infarto de miocardio agudo (AMI) (mortalidad aguda de ~ 30 %). Posteriormente, 3 animales murieron en el penodo posoperatorio: un animal el dfa 1 (grupo CTRL), un animal el dfa 13 (grupo CTRL) y un animal el dfa 14 (grupo GF). De los 18 cerdos restantes que completan el protocolo de estudio, 13 estaban en los grupos tratados con gF y 5 en el grupo CTRL. Espedficamente, de los 18 animales tratados con GF supervivientes, 4 recibieron una dosis 1x de los gF (2 jg de IGF-1 y 0,5 jg de HGF; GF-1x), 5 animales recibieron una dosis 2x (4 jg de IGF-1 y 1 jg de HGF; GF-2x) y 4 animales recibieron una dosis 4x (8 jg de IGF-1 y 2 jg de HGF GF-4x)). Directamente despues de la administracion de los GF o de la solucion salina sola, a todos los animales supervivientes se les implanto una bomba osmotica cargada con 10 mL de una solucion 0,5 M de BrdU durante todo el estudio. Los cerdos se sacrificaron a los 21 dfas despues del infarto de miocardio y la administracion del factor de crecimiento. El grupo al que perteneda cada cerdo se mantuvo oculto para los investigadores que llevaban a cabo el analisis inmunohistoqmmico.
Medidas de la funcion cardfaca. Se midio la funcion cardfaca mediante ecocardiograffa en la lmea base, inmediatamente despues de la oclusion coronaria y antes del sacrificio. Brevemente, se obtuvieron vistas paraesternales del eje largo y del eje corto con imagenes de eco tanto en modo M como bidimensional. Las dimensiones de LV (ventnculo izquierdo) (LVEDD y LVESD) se midieron perpendicularmente al eje largo del ventnculo en el nivel mediocordal. Se calcularon la fraccion de eyeccion del LV y la tension radial.
La inyeccion intracoronaria local de IGF-1/HGF protege la organizacion del tejido infartado y mejora la supervivencia de los cardiomiocitos despues de un infarto de miocardio agudo
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Se administraron IGF-1 y HGF recombinantes humanos (de aqu en adelante abreviados como IGF-1/HGF o GF) en dosis diferenciales a cerdos mediante inyeccion intracoronaria 30 minutos despues del infarto de miocardio agudo. Se inyectaron cerdos adicionales con el mismo volumen de solucion salina sola, constituyendo el grupo de control (CTRL).
El tamano del infarto, determinado por planimetna, como un porcentaje del area circunferencial coronal no fue diferente entre el grupo tratado con Gf y el grupo CTRL (28 ± 5 %, 26 ± 7 %, 29 ± 5 % en GF-1x, GF-2x y GF-4x, respectivamente, frente a 27 ± 4 % en CTRL). Las secciones transversales tenidas con H&E y rojo sirio del tejido cardfaco en la zona remota, del borde e infartada revelaron islas de tejido miocardico superviviente distribuidas entre el tejido cicatricial fibrotico en la zona del infarto. Estas islas de miocardio superviviente fueron mucho mas abundantes en el area infartada del miocardio tratado con GF que en los animales tratados con CTRL (Figura 3A-B). La tincion de inmunofluorescencia doble para la a-actina sarcomerica y BrdU de las secciones analizadas por microscopfa confocal revelo que estas islas consistfan principalmente en grandes cardiomiocitos a-actina sarcomerica positivos, BrdU negativos, un fenotipo que confirmaba su supervivencia como miocardio preinfartado y su naturaleza madura, incluso hipertrofica (Figura 3C). Ademas, los corazones de cerdo tratados con GF teman significativamente menos tejido fibrotico en la region del infarto, en comparacion con los CTRL (Figura 3D-F). Mas interesante aun, este descenso presento una relacion lineal positiva con la dosis de GF administrada (Figura 3F).
El estudio no se oriento espedficamente a monitorizar el efecto de la terapia GF sobre la muerte celular temprana. Sin embargo, a partir de los resultados presentados mas adelante, esta claro que la muerte de los miocitos sigue siendo muy alta en la zona de peri-infarto/borde mucho tiempo despues del suceso de oclusion/reperfusion coronaria. Esto es debido probablemente a los efectos de la remodelacion patologica, que se sabe que establece un drculo vicioso entre la adaptacion morfologica y la muerte celular continuada. Como se muestra en la Figura 3G-H, la administracion de IGF-1/HGF redujo significativamente la muerte tardfa de los miocitos de una manera dependiente de la dosis, como se muestra por una disminucion en el numero de miocitos positivos para la caspasa-3 activada, en comparacion con el grupo CTRL. Concordantes con la preservacion de la morfologfa anatomica, la supervivencia de los miocitos y la disminucion de la remodelacion, los corazones tratados con GF presentaron una disminucion de la respuesta hipertrofica de los miocitos en comparacion con los CTRL (Figura 3I). Tomados en conjunto estos hallazgos indican que la administracion de IGF-1/HGF despues de infarto de miocardio agudo tiene un efecto importante en la preservacion del numero de cardiomiocitos y de la estructura de la pared miocardica, reduciendo la carga sobre los miocitos supervivientes, lo que da como resultado una mejor remodelacion miocardica y una disminucion del estfmulo para la muerte e hipertrofia de miocitos del miocardio superviviente.
La administracion intracoronaria de IGF-1/HGF despues de un infarto de miocardio agudo activa las pCSC residentes
En corazones normales (no se muestran) y corazones post-infarto de miocardio, ~90 % de las pCSC c-kitpos expresan in situ receptores IGF-1 y c-met (HGF) que se detectan por inmunohistoqmmica (Figura 4A-B). Por consiguiente, los corazones de cerdo infartados tratados con GF muestran un aumento significativo en el numero de pCSC c-kitpos en la region del borde e incluso mas altos en el area infartada, 21 dfas despues del infarto de miocardio (Figura 4C-D). Que este aumento en las pCSC c-kitpos es el resultado de la administracion de GF se confirma por su correlacion directa con la dosis de GF administrada (Figura 4D). A la dosis mas alta de GF, el numero de pCSC c- kitpos en el area infartada es > 6 veces mayor que en los corazones del grupo CTRL (Figura 4D, SupplTable). Ademas, el aumento lineal entre las dosis 1x y 4x indica que no se ha alcanzado una dosis de saturacion para producir la maxima respuesta regenerativa. Muchas de las pCSC fueron BrdU positivas, un elemento que documenta su nacimiento despues de la produccion del infarto de miocardio (Figura 4E). Su naturaleza dclica fue confirmada por la tincion Ki-67, que marca las celulas que estan o han estado recientemente en el ciclo celular (no se muestran datos). Muchas celulas c-kitpos expresaron los factores de transcripcion Nkx-2,5, Ets-1 o Gata6 indicativos de su diferenciacion hacia los linajes cardiacos principales, es decir, miocitos, celulas endoteliales y de musculo liso (Figura 4F-I). El analisis cuantitativo revelo que el numero de celulas c-kitposNkx2,5pos (precursores de miocitos/vasculares comprometidos) aumento significativamente en las regiones infartada y del borde en los corazones de cerdo tratados con GF de una manera dependiente de la dosis de GF (Figura 4G), alcanzando niveles que fueron > 10 veces mas altos que en los corazones del grupo CTRL.
El tratamiento con IGF-1/HGF produce una regeneracion fuerte del miocardio despues de un infarto de miocardio agudo
Los corazones tratados con GF, tanto en las regiones del infarto como en las de peri-infarto/borde, albergaban una gran poblacion de miocitos BrdUpos recien formados muy pequenos que aun no hadan alcanzado el estado terminalmente diferenciado (Figura 5). Estos datos fueron confirmados por la expresion de Ki67 en los pequenos miocitos recien formados (Figura 5C y F), algunos de los cuales estaban en mitosis y citocinesis, lo que confirma su naturaleza inmadura (Figura 5I). Los miocitos BrdUpos recientemente formados tambien estaban presentes en la region peri-infarto/borde de los cerdos CTRL no tratados inyectados con solucion salina. Sin embargo, su numero era ~1/10 de los corazones tratados y estaban practicamente ausentes en la zona del infarto (Figura 5).
Como ocurrio en el caso de las pCSC, hubo una correlacion directa entre el numero de pequenos miocitos BrdUpos/Ki67pos recientemente formados con dosis de GF, tanto en las regiones del infarto como en las del borde
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(Figura 5G-H). En el miocardio tratado con GF, los pequenos miocitos BrdUpos se organizaron como grupos de bandas de regeneracion en la zona del infarto. Estas bandas de regeneracion estaban mas organizadas en su estructura, y eran mas compactas y densas con el aumento de la dosis de GF (Figura 5A-B). Finalmente, ni el numero ni la aparicion de miocitos recien formados (los BrdUpos o Ki67pos) en la region distal del infarto (el miocardio preservado) no fue significativamente diferente entre los animales tratados con GF y los CTRL (no se muestran datos).
Las estructuras vasculares BrdU positivas recien formadas tambien fueron evidentes en el borde y en el miocardio infartado (Figura 6A-C). Los corazones tratados con GF mostraron un mayor numero de capilares y arteriolas en la zona del infarto, en comparacion con los CTRL tratados con solucion salina y esta respuesta fue dependiente de la dosis (Figura 6D-F). De modo interesante, los nuevos microvasos fueron mas evidentes alrededor de las islas supervivientes de miocardio dentro de la zona infartada mencionadas antes que teman tambien una mayor densidad de pequenos miocitos BrdUpos recien formados y de bandas de regeneracion (Gandia, C. et al., 2008, Stem Cells 26: 638). Esta organizacion sugiere la produccion de factores cardiopoyeticos (Behfar, A. et al., 2007, J. Exp. Med. 2007 204: 208) por parte de los miocitos adultos preservados que actuan sobre las pCSC.
Los miocitos regenerados en la zona de infarto a los 21 dfas despues de infarto de miocardio eran inmaduros, como se demuestra por su tamano medio, asf como por el hecho de que muchos de ellos todavfa estaban en ciclo como lo demuestra la expresion de Ki-67 (Figura 5I F). De acuerdo con el papel sugerido para el papel cardiopoyetico de los miocitos maduros, los miocitos recien formados en contacto o en estrecha proximidad con los maduros (es decir, en la zona del borde) son de un tamano significativamente mayor que aquellos que estan en el medio de la cicatriz sin proximidad a tejido libre (Figura 5). Tambien es evidente que el tratamiento con GF desempena un papel en la maduracion de los miocitos, como se demuestra por el aumento del tamano medio de los miocitos con el aumento de la dosis de FG.
Dado el tamano del corazon porcino y el volumen del area infartada, no es posible determinar con exactitud ni el numero de miocitos perdidos ni el numero de miocitos regenerados por el tratamiento con GF. Sin embargo, el muestreo cuidadoso de la zona infartada y de las zonas de peri-infarto/borde no deja ninguna duda de que a los 28 dfas el corazon infartado tratado con GF ha regenerado la mayor parte de los miocitos perdidos, si no todos.
Ejemplo 10
La administracion intracoronaria de GF preserva y puede mejorar la funcion ventricular
Las imagenes ecocardiograficas mostraron que la fraccion de eyeccion del ventnculo izquierdo (LVEF) estaba significativamente reducida en los cerdos CTRL y en los tratados con GF despues de la oclusion coronaria (Figura 6G). Sin embargo, 28 dfas despues del infarto de miocardio agudo, la LVEF empeoro ligeramente en los CTRL, mientras que fue significativamente preservada/mejorada por el tratamiento con gF, en comparacion con los CTRL (Figura 6G). Con el fin de obtener una mayor comprension de la funcion cardfaca regional, se utilizo la ecocardiograffa Doppler tisular para medir la tension radial anteroseptal que mejoro notablemente en los cerdos tratados con GF, en comparacion con los CTRL (Figura 6H-I). La preservacion/mejora de la funcion cardfaca se correlaciono con el aumento de la dosis de GF (Figura 6).
Ejemplo 11
La administracion intracoronaria de hasta 50 |jg de IGF-1 encapsulados en microesferas de PLGA de 15 pm de diametro no se vierte en la circulacion sistemica.
Como se demuestra en el Ejemplo n° 5, > 99 % de las microesferas de 15 jm de diametro son atrapadas en la red capilar del tejido diana, y espedficamente el miocardio. Sin embargo, estos datos no abordan la cuestion de si cuando la molecula activa se descarga es retenida dentro del tejido o si se filtra o no a la circulacion capilar y el retorno venoso. Para explorar esta cuestion, se administraron intracoronariamente 5 x 106 microesferas cargadas con un total de 50 jg de rhIGF-1 en el origen de la arteria descendente anterior izquierda siguiendo el mismo protocolo de administracion descrito en los Ejemplos 5-7. La principal diferencia fue que se dejo un cateter en el seno coronario a traves de la vena yugular. Durante la administracion, tres horas despues del procedimiento y despues cada 12 horas durante los 3 dfas siguientes, se tomaron muestras de sangre del seno coronario y de sangre venosa a traves de una vena de la oreja. Se preparo suero y se congelaron las muestras en nitrogeno lfquido hasta que se termino la recogida. Todas las muestras se analizaron por ELISA empleando un kit de deteccion de IGF-1 humano (R & D, Minneapolis, Minnesota, USA) que no presenta reaccion cruzada con el IGF-1 porcino. Ninguna de las muestras ni del seno coronario ni del retorno venoso sistemico resultaron positivas. Se encontro que los lfmites mmimos de deteccion del ensayo eran de 52,5 ng/mL para IGF-1. Por lo tanto, aunque es posible que exista alguna fuga por debajo de los niveles de deteccion del ensayo ELISA, esta claro que la mayor parte del IGF-1 nunca dejo el miocardio.
Ejemplo 12
La administracion local intraarterial de IGF-1/HGF al musculo esqueletico danado induce la activacion de las celulas madre musculares y estimula la regeneracion.
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Para probar si el protocolo utilizado para tratar el miocardio danado era efectivo en el tratamiento de otros tejidos, se utilizo el mismo protocolo para tratar el musculo esqueletico post-isquemico de la pierna derecha de 3 cerdos en la cual se habfa producido el dano isquemico por una oclusion completa de balon de 45 min de la arteria femoral. Como en el caso del miocardio, despues de una reperfusion de 30 minutos por deflacion del balon, se preparo una suspension de 20 mL de PBS que contema microesferas de IGF-1 y HGF de 15 pm de diametro, como se describe en el ejemplo n° 2 para una dosis total de 8 pg de IGF-1 y de 2 pg de HGF. Los animales se sacrificaron 3 semanas despues y las biopsias del musculo cuadriceps se analizaron por inmunohistologfa para determinar el grado de activacion de las celulas madre en la lesion.
Como se ha descrito para el miocardio, despues de la oclusion de la arteria femoral, se implanto a los animales una bomba osmotica para administrar de modo continuo una solucion de BrdU que se sabe que marca de manera eficiente todas las celulas replicantes. De esta manera, todas las celulas nacidas despues del inicio de la terapia tienen marca BrdU, lo que permite una comparacion de la reaccion regenerativa entre los controles y los animales tratados. En cada caso, el cuadriceps de la pierna izquierda sirvio como control no danado.
Como se muestra en la figura 12 y en la tabla 6, la administracion local de IGF-1/HGF encapsulados en microesferas de PLGA de 15 pm de diametro fue muy eficaz en la estimulacion de la regeneracion del tejido muscular en la pierna tratada pero no en la contralateral en comparacion con los controles isquemicos pero tratados con placebo.
Tabla 6
Regeneracion del musculo esqueletico en respuesta a la administracion local de factores de crecimiento
N° de nucleos de miofibra marcados con BrdU por 1x103 nucleos de miofibra
Animal n°
Pierna danada Pierna contralateral
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Conclusion: La administracion local de factores de crecimiento a tejidos danados distintos del miocardio tiene un efecto estimulante en la reaccion regenerativa del tejido danado que se localiza en la zona aguas abajo del sitio de administracion de las microesferas, como se espera para un sistema de administracion que se dirige a la red capilar del tejido/organo danado.
Ejemplo 13
La inyeccion intracoronaria de IGF-1/HGF/SCF tiene un efecto mas potente en la activacion de las CSC y en la preservacion de la funcion ventricular que IGF-1/HFG solos.
Para probar si la adicion de nuevos factores al protocolo descrito en los ejemplos previos mejorana la reaccion regenerativa del miocardio post infarto, se administraron a un grupo de 3 animales las dosis mas altas de IGF-1 (8 pg) y HGF (2 pg) utilizadas en el ejemplo n° 9 junto con 4 pg de SCF. Cada uno de estos factores se encapsulo en microesferas de PLGA de 15 pm de diametro como se describe en el Ejemplo n° 2. El protocolo para la produccion del infarto, la monitorizacion y la administracion de las suspensiones de microesferas fue como se describe en los Ejemplos 5-7. Los animales fueron sacrificados a las 4 semanas despues del tratamiento.
Como se muestra en la Figura 13A y en la Figura 13B, la regeneracion producida por los protocolos de tres factores es significativamente mejor tanto en el nivel de regeneracion como tambien en la maduracion de los miocitos regenerados que por la combinacion de IGF-1/HGF. Es razonable extrapolar a partir de estos datos que, ademas de la adicion o sustraccion de partfculas con factores particulares, otras variaciones pueden implicar cambiar la dosis de un factor particular o conjunto de factores, el perfil de liberacion/descarga para un factor particular, el grado de carga, etc.
Conclusion: La presente invencion permite la formulacion de un numero casi infinito de combinaciones espedficas de compuestos terapeuticos a partir de un conjunto limitado de bloques de construccion en los que cada factor se puede usar a diferentes dosis, diferentes patrones de liberacion y se puede combinar con un numero ilimitado de otros factores. Esto permite en una sola administracion dirigirse a un tejido particular con diferentes combinaciones de agentes terapeuticos, cada uno de los cuales podna actuar en un momento diferente, sobre una celula diana diferente, y requerir una dosis efectiva diferente. Estas posibilidades son particularmente ventajosas para tejidos de diffcil acceso a los que no se puede acceder repetidamente, tales como el miocardio y la mayor parte de los organos internos.
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Leyendas de las figuras
Figura 1. Distribucion y caracterizacion de las celulas ca^acas c-kitpos en el corazon de cerdo adulto.
(A-B) Imagenes confocales representativas de celulas c-kit positivas (c-kitpos; blancas) en la auricula derecha (A) y en el ventriculo izquierdo (B) del corazon de cerdo normal. Los cardiomiocitos estan tenidos en rojo (se muestra en gris en las figuras) por a-actina sarcomerica (a-sarc act) y los nucleos estan tenidos en azul con DAPI. (C) Las celulas c-kitpos se distribuyen a traves del miocardio auricular y ventricular con una densidad mas alta en las auriculas y en el apice, en comparacion con el ventriculo derecho y el ventriculo izquierdo (RV, LV). *p <0,05 vs. RV y LV. (D) Analisis FACS representativo de celulas c-kitpos dentro de la poblacion de celulas cardfacas mermadas de miocitos para las auriculas, ventriculo (RV) y apice. (E) Las celulas c-kitpos obtenidas utilizando MACS muestran > 90 % de enriquecimiento. El analisis FACS de celulas cardiacas porcinas enriquecidas c-kitpos revelo que son negativas para los marcadores de linaje de celulas hematopoyeticas CD45 y CD34. Ademas, una alta fraccion de celulas cardiacas porcinas c-kitpos expresa los marcadores del linaje celular mesenquimatoso, CD90 y CD166.
Figura 2. Las celulas cardiacas c-kitpos porcinas expresan marcadores de estaminalidad, tienen propiedades de clonogenicidad, autorrenovacion, formacion de cardioesferas y multipotencia de celulas madre, y expresan sistemas de IGF-1/HGF de senalizacion intacta que modulan su activacion.
(A) Una imagen de microscopfa optica que muestra celulas cardiacas porcinas c-kitpos expandidas en el 4° pase. (B) Una imagen de microscopfa optica de un clon, despues de que las celulas cardiacas porcinas c-kitpos simples fueron depositadas en los pocillos de las placas Terasaki para generar clones de celulas individuales. (C) La clonogenicidad de las celulas cardiacas porcinas c-kitpos fue similar en todas las camaras cardiacas, y comparable a las CSC de raton y de roedores. (D) La tincion inmunofluorescente de las celulas cardiacas porcinas c-kitpos clonadas confirmo la expresion de c-kit (blanco), y revelo la expresion de Flk-1, Oct-4, Nanog, Tert, Bmi-1, Nkx2,5 e Isl-1 (todos se muestran en gris), lo que indica que son una mezcla de celulas madre y progenitoras cardiacas. Las imagenes son de 20 aumentos, con capturas de zoom como recuadro. (E) Las celulas cardiacas porcinas c-kitpos clonadas formaron cardioesferas (a). Cuando las cardioesferas c-kitpos (blancas) (b) se colocaron en placas recubiertas de laminina en medio cardiogenico, las celulas de la cardioesfera se extendieron fuera de la esfera (c). Cuatro a seis dfas mas tarde, las celulas sobre la periferia de la esfera aumentaron la expresion de marcadores bioqmmicos para cardiomiocitos (a-actina sarcomerica, a-Sarc Act; d), celulas de musculo liso (actina de musculo liso, SMA; e) y celulas endoteliales (factor de von Willebrand, vWF; f) (se muestran todas con fluorescencia gris). (F) La tincion inmunofluorescente muestra que las CSC porcinas c-kitpos tienen receptores de IGF-1 y HGF (gris, Igf-1R y c-met, respectivamente). (G - H) Cuando crecen en cultivo, las celulas cardiacas porcinas c-kitpos recien aisladas responden a la estimulacion de IGF-1 y HGF, por proliferacion celular (G; *p <0,05 vs. base, fp <0,05 vs. CTRL, tp <0,05 vs. HGF) y la migracion (H; fp <0,05 vs. CTRL, tp <0,05 vs. IGF-1). (I) El analisis de transferencia Western revelo que tras la union del ligando se activan las rutas efectoras espedficas de union aguas abajo en las celulas cardiacas porcinas c-kitpos. phos = fosforilado, FAK = cinasa de adhesion focal.
Figura 3 La inyeccion intracoronaria de IGF-1 y HGF mejora la remodelacion de las celulas del miocardio despues de un infarto de miocardio agudo.
(A) La tincion de H&E de corazones de cerdo tratados con GF revelo islas de tejido de miocardio superviviente en la zona de infarto (flechas), dispuestas entre las capas de regeneracion y fibroticas. (B) Estas islas de miocardio fueron poco frecuentes y menos definidas en estructura en los corazones de cerdo CTRL tratados con solucion salina. (C) Estas islas de miocardio estaban compuestas principalmente de cardiomiocitos BrdU negativos (troponina I cardiaca, cTnI, gris con sus nucleos como drculos negros en el medio de la celula), que documentan su fenotipo maduro y superviviente. Las celulas que nacen despues del infarto son BrdU positivas y sus nucleos se muestran como puntos blancos. (D-E) La tincion con rojo sirio identifico el tejido fibrotico (tincion gris) y el musculo (tincion amarilla) en secciones transversales de la zona de infarto, en corazones de cerdo tratados con GF (D) y tratados con solucion salina CTRL (E). (F) Los corazones de cerdo tratados con GF (IGF-1/HGF) teman una reduccion del porcentaje de la fraccion de area de fibrosis en la zona de infarto, en comparacion con los cerdos CTRL tratados con solucion salina. *p <0,05 vs. CTRL. fp <0,05 vs.IGF-1/HGF 1x. (G) La tincion para la caspasa-3 activada (marron, puntas de flecha) revelo miocitos apoptoticos en la zona de peri-infarto/borde del corazon de cerdo CTRL despues de AMI. (H) La inyeccion de IGF-1 y HGF dio como resultado una disminucion del numero de miocitos apoptoticos, en la zona peri-infarto/borde, en comparacion con los CTRL tratados con solucion salina. *p <0,05, vs. CTRL, fp <0,05 vs. IGF- 1/HGF 1x, tp <0,05 vs. IGF-1/HGF 2x. (I) El analisis del diametro de los miocitos mostro que los cerdos tratados con GF teman una reduccion de la respuesta hipertrofica de miocitos despues de un AMI, en comparacion con los animales CTRL tratados con solucion salina. Normal = region remota/distal del area infartada en corazones CTRL. Ap <0,05 vs. normal, *p <0,05 vs. CTRL. fp <0,05 vs. IGF-1/HGF 1x.
Figura 4. La administracion de IGF-1 y HGF despues del AMI activa las CSC endogenas, impulsando su compromiso con el linaje cardfaco
(A-B) La mayoria de las CSC porcinas ckitpos (blanco) expresan los receptores Igf-1 (A, gris) y c-met (B, gris) in vivo. El DAPI tine los nucleos en azul. (C) Un grupo de CSC c-kitpos (blanco) en el area de infarto de un corazon de cerdo tratado con GF-4x. (D) El numero de las CSC c-kitpos aumento significativamente en el borde pero mas en la region
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Figura 5. La administracion intracoronaria de IGF-1/FIGF induce una nueva formacion sustancial de miocitos despues de un AMI.
(A-B) Bandas regeneradoras de pequenos miocitos recien formados BrdUpos (blanco), (gris; a-actina sarcomerica, a- Sarc Act) en las regiones de infarto de corazones de cerdo tratados con GF-1x (A) y GF-4x (B). Observese el aumento del tamano de la banda de regeneracion despues de 4x la cantidad de administracion de GF. Tambien los miocitos son mas densos, compactos y estructurados como miocardio despues de 4x la cantidad de administracion de GF. (C) Dentro de estas bandas de regeneracion en la zona del infarto estaban pequenos miocitos proliferantes Ki67pos (blanco) (gris; a-Sarc Act). (D-E) Miocitos pequenos recien formados BrdUpos (nucleos blancos) (gris, citoplasma de a-Sarc Act) en la zona del borde despues de las dosis de GF-1x (D) y GF-4x (E). (F) Pequenos miocitos Ki67pos (blanco) (gris, a-Sarc Act) tambien estuvieron presentes en la zona del borde despues de la inyeccion de GF. (G-H) La fraccion de pequenos miocitos BrdUpos y Ki67pos aumento significativamente en el borde pero mas en la region del infarto despues de la inyeccion de GF. *p <0,05 vs. CTRL, fp <0,05 vs. IGF-1/HGF 1x, fp <0,05 vs. IGF-1/HGF 2x. (I) Un pequeno miocito mitotico Ki67pos en la zona de infarto de un corazon de cerdo tratado con GF-4x.
Figura 6. La administracion del factor de crecimiento aumento la generacion de nuevas estructuras vasculares y mejoro la funcion cardfaca en el corazon de cerdo infartado.
(A) Las estructuras arteriales recien formadas (BrdU, blanco, a-actina de musculo liso, SMA, blanco, cadena pesada de miosina, MHC, gris, DAPI, azul) fueron evidentes en la region infartada de corazones de cerdo tratados con GF. (B-C) Los capilares recien formados tambien fueron evidentes en las regiones infartadas despues de la inyeccion de IGF-1 y HGF (BrdU, blanco, vWF, gris, DAPI, gris oscuro). (D-F) El numero de capilares en cerdos tratados con GF aumento significativamente en la zona de infarto, en comparacion con los CTRL tratados con solucion salina (tincion de gris oscuro). *p <0,05 vs. CTRL, fp <0,05 vs. IGF-1/HGF 1x, fp <0,05 vs. IGF-1/HGF 2x. Las imagenes (20 aumentos) muestran la tincion de vWF (gris oscuro) en corazones CTRL tratados con solucion salina (D) y en corazones tratados con GF-4x (E). Los capilares se definieron como vasos compuestos por 1 o 2 celulas endoteliales. (G-H) Los corazones tratados con GF mostraron una mejor fraccion de eyeccion del ventnculo izquierdo (LV) (G) y una mejor tension radial (H), en comparacion con los CTRL tratados con solucion salina. *p <0,05 vs. basal, #p <0,05 vs. AMI, fp <0,05 vs. CTRL, fp <0,05 vs. GF-1x. (I) Rastreo representativo de la deformacion radial por Doppler tisular a partir de cerdos CTRL (a-c) y de cerdos tratados con GF-4x (d-f). Los cerdos CTRL (b) y los cerdos tratados con GF-4x (e) tuvieron la misma desincronizacion de la contraccion anteroseptal despues de 90 minutos de oclusion coronaria (AMI). En el sacrificio (Post-MI), la contraccion desincronizada empeoro en los cerdos CTRL (c) mientras que se mejoro en los cerdos tratados con GF (f).
Los resultados mostrados arriba demuestran que las dosis de microgramos de estos factores de crecimiento mejoran la remodelacion miocardica, fomentan la activacion de las CSC residentes, lo que produce una nueva formacion extensa de miocardio, mejorando la funcion del ventnculo izquierdo de una manera dependiente de la dosis en un corazon animal de tamano y anatoirna similar al ser humano utilizando un protocolo implementable clrnicamente. Por lo tanto, la inyeccion de IGF-1/HGF produjo una amplia variedad de efectos beneficiosos sobre la remodelacion cardfaca y la regeneracion de celulas autologas que fueron proporcionales a la dosis de GF administrada.
Figura 7. Muestra la imagen en microscopio optico de las partfculas de PLGA que contienen IGF-1 obtenidas con la formula descrita anteriormente.
Figura 8. Muestra una micrograffa electronica del mismo lote de partfculas que se muestra en la figura anterior.
Figura 9. Muestra secciones de los corazones del cerdo n° 1 (imagen izquierda) y del cerdo n° 2 (imagen derecha). La pared anterior del ventnculo izquierdo, irrigada por la arteria coronaria izquierda, del cerdo n° 1 muestra una serie de microinfartos (areas mas palidas), mientras que el miocardio del cerdo n° 2 es normal, como se ve por la coloracion uniforme.
Figura 10A. Secciones del miocardio del cerdo n° 3, sacrificado 30 minutos despues de la administracion de una mezcla de perlas de poliestireno (perlas rojas, que se muestran en la figura como grises, de mayor diametro, drculos lisos) y perlas de PLGa + factores de crecimiento (perlas verdes, que se muestran en la figura como perlas blancas, diametro mas pequeno y forma mas irregular). La aparente diferencia de tamano entre las partreulas rojas y verdes
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es debida a la mayor fluorescencia del rojo
Figuras 10B y 10C. Muestran secciones del miocardio del cerdo n° 4, sacrificado 24 horas despues de la administracion de una mezcla de perlas de poliestireno ((perlas rojas, que se muestran en la figura como grises, de mayor diametro, drculos lisos) y perlas de PLGA + factores de crecimiento (perlas verdes, que se muestran en la figura como perlas blancas, diametro mas pequeno y forma mas irregular). La relacion de perlas verdes a rojas es significativamente menor en este animal debido a la degradacion de las micropartfculas de PLGA. En los cuatro paneles de la izquierda solo se detectan las perlas rojas, mientras que en los de la derecha la proporcion es mas proxima a 1:1.
Figura 11. Muestra secciones microscopicas de dos areas del cerdo n° 4. Los miocitos estan en gris. Los nucleos en gris mas oscuro. Las celulas madre cardfacas (CSC) endogenas se identifican por una punta de flecha (superior) y una flecha (inferior). Sus membranas estan marcadas en verde mas claro. En la figura superior, los nucleos estan limpios porque las celulas son quiescentes. En la figura inferior, todas las CSC tienen una mancha gris palido en los nucleos que identifica a la protema Ki-67 como un marcador de las celulas que han entrado en el ciclo celular.
Figura 12. La administracion local de IGF-1 y HGF encapsulados en microesferas de PLGA de 15 pm mejora la regeneracion del musculo esqueletico danado.
Imagenes histologicas de musculo cuadriceps de control y danado. Panel A: Imagen histologica del musculo izquierdo (control) cinco dfas despues de producir la lesion en el musculo derecho. No se administro ningun tratamiento a esta pierna. Panel B: Seccion histologica de un cuadriceps derecho cinco dfas despues de producir el dano sin ningun tratamiento (control danado). Las puntas de flecha apuntan a dos de las varias areas extensas de necrosis celular donde una concentracion de nucleos parece que inicia una reaccion regenerativa. Panel C: biopsia derecha del cuadriceps derecho 3 dfas despues de la lesion tratada con una mezcla de microesferas cargadas con IGF-1 y microesferas cargadas con HGF con un equivalente total administrado de 16 pg de IGF-1 y 4 pg de HGF. Las puntas de flechas apuntan hacia microfibras jovenes en las areas danadas en un proceso de regeneracion. Panel D: Biopsia del mismo musculo que se muestra en el Panel C dos dfas despues (5 dfas despues de la lesion). Las fibras oscuras de menor tamano son fibras regeneradas marcadas con un anticuerpo frente a la cadena pesada de miosina embrionaria, un marcador o fibras regeneradas. La imagen en este panel es el equivalente a la del panel B. La diferencia llamativa entre las dos imagenes muestra la eficacia de la terapia.
Figura 13. Mejora de la capacidad regenerativa del miocardio por la combinacion de IGF-1/HGF/SCF administrada intracoronariamente encapsulada en microesferas de PLGA de 15 pm de diametro
El grafico de barras de la figura 13A compara el efecto en el numero de miocitos cardiacos regenerados en cerdos post-AMI tratados con una combinacion de dos tipos de microesferas, barras blancas (un tipo cargado con IGF-1 y el otro con HGF) con los animales tratados con una combinacion de tres tipos de microesferas (hrIGF-1, hrHGF y hrSCF), barras negras. Es obvio que a las tres concentraciones diferentes utilizadas, la combinacion de 3 tipos de microesferas, cada una cargada con un factor diferente, es superior a la combinacion de solo dos. CTRL = animales de control tratados con placebo; Barras blancas: dosis 1X animales que recibieron la administracion de microesferas cargadas con el equivalente de 2 pg de IGF-1 y 0,5 pg de HGF biologicamente activo; 2X = 4 pg de IGF-1 y 1 pg de HGF y 4X = 8 pg de IGF-1 y 2 pg de HGF. Barras negras: las mismas cantidades de IGF-1 y HGF que para los animales representados por las barras blancas mas microesferas cargadas con SCF equivalente a 2, 4 y 8 pg de hrSCF biologicamente activo
La Figura 13B muestra la fraccion de eyeccion del ventnculo izquierdo (LV) antes, inmediatamente despues y 4 semanas despues del AMI segun se determina por ecocardiograffa de los cerdos tratados con diferentes combinaciones de microesferas. Lmea base = fraccion de eyeccion del LV justo antes del AMI; AMI = fraccion de eyeccion del LV despues del AMI; Post-AMI = Fraccion de eyeccion del LV 4 semanas despues del AMI y de tratamiento local con GF. C = animales control tratados con placebo post-AMI; O = animales tratados con dosis 4X de IGF-1 + HGF en solucion por via intracoronaria; ▼ = animales tratados con una dosis 4X de IGF-1 + HGF encapsulada en microesferas de PLGA administradas justo aguas abajo del sitio de oclusion coronaria; A = animales tratados con una dosis 4X de IGF-1 + HGF + sCf encapsulados por separado en microesferas de PLGA administradas justo aguas abajo del sitio de oclusion coronaria.
A lo largo de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprender" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende" se entendera que implican la inclusion de un numero entero o etapa expuesto o
Las realizaciones de la divulgacion se describen aqrn como que comprenden numeros enteros. La descripcion se extiende tambien a realizaciones separadas que consisten en o consisten esencialmente en dichos numeros enteros.
Tambien se preve espedficamente que la divulgacion se extienda a combinaciones de una o mas realizaciones descritas en la presente memoria, cuando sea tecnicamente factible.

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Una formulacion farmaceutica para administracion intraarterial aguas arriba de un tejido diana, que comprende partmulas esfericas que contienen un ingrediente activo y un excipiente biodegradable, en donde:
    el diametro medio de las partmulas es de 15 micras y el 99 % o mas de las partmulas tienen un diametro de 15 ± 1 micras;
    el diametro de 15 ± 1 micras hace posible la retencion de partmulas en un tejido diana despues de la administracion de la formulacion farmaceutica aguas arriba del tejido diana; y
    la formulacion esta sustancialmente libre de partmulas con un diametro mayor que 50 micras y menor que 5 micras;
    de tal manera que cuando la formulacion se administra aguas arriba del tejido diana, la capacidad del ingrediente activo de pasar a traves del tejido diana y pasar a la circulacion sistemica se restringe gracias al atrapamiento de las partmulas en los capilares del tejido diana.
  2. 2. Una formulacion farmaceutica segun la reivindicacion 1, en donde el ingrediente activo es un factor de crecimiento seleccionado de la lista que consiste en: HGF (factor de crecimiento de hepatocitos); IGF (factor de crecimiento insulmico) tal como IGF-1; PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) tal como PDGF-p, FGF (factor de crecimiento de fibroblastos) tal como aFGF (FGF-1) o bFGF (FGF-2) y fGf-4; SDF-1 (factor 1 derivado de celulas estromales); EGF (factor de crecimiento epidermico); VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular); eritropoyetina (EPO); TGF p (factor de crecimiento transformante p); G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos); GM- CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos), protemas morfogeneticas oseas (BMP, BMP-2, BMP-4); activina A; IL-6; neurotrofinas, por ejemplo, NGF (factor de crecimiento del nervio), BDNF (factor neurotrofico derivado del cerebro), nT-3 (neurotrofina-3), NT-4 (neurotrofina-4) y neurotrofina-1; TPO (trombopoyetina); GDF-8 (miostatina); GDF9 (factor de diferenciacion de crecimiento 9) y periostina.
  3. 3. Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 2, que comprende un ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste en HGF, IGF-1 y la combinacion de los mismos.
  4. 4. Una composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la concentracion del ingrediente activo esta en el intervalo de 1 ng por 1 x 106 partmulas hasta 4 mg por 1 x 106 microesferas.
  5. 5. Una composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el tejido diana es tejido cardfaco.
  6. 6. Una composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el excipiente biodegradable se selecciona de la lista que consiste en acido polilactico, poli-glicolida, acido poli(lactico-co-glicolico), policaprolactona, polihidroxibutirato, poliuretanos, polisacaridos, protemas, poliaminoacidos, carbohidratos, quitosano, heparina y acido polihialuronico.
  7. 7. Una composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el excipiente biodegradable se selecciona de la lista que consiste en acido poli(lactico-co-glicolico) (PLGA) y alginato.
  8. 8. Una composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, para uso en la regeneracion de tejido cardfaco estimulando las celulas madre cardfacas mediante la administracion intraarterial aguas arriba del tejido diana.
  9. 9. Una composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 8, para el tratamiento de infarto de miocardio (MI) agudo o cronico, cardiopatfa isquemica, con o sin infarto de miocardio.
  10. 10. Una composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, para uso en la regeneracion de un tejido solido en un mairnfero mediante la administracion intraarterial aguas arriba del tejido diana.
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