ES2459743T3 - Preparación de liberación sostenida para terapia de regeneración tisular - Google Patents

Abstract

Microesfera de accion prolongada de dos a cuatro semanas, que comprende acido ({5-[2-({[(1E)- fenil(piridin-3-il)metilen]amino}oxi)etil)-7,8-dihidronaftalen-1-11}oxi)acetico o su sal como farmaco y un copolimero de acido lactico/acido glicolico, en la que (i) una cantidad de copolimero de acid° lactico/acido glicolico en partes en peso del farmaco es de desde 3 hasta 10 partes en peso, (ii) la microesfera tiene un tamer) de particula promedio de desde 20 hasta 50 μm, y (iii) el copolimero de acido lactico/acido glicolico tiene un peso molecular promedio en peso de desde 10.000 hasta 50.000 y una razon de composición de acido lactico/acido glicólico de desde 75/25 hasta 50/50, y que satisface al menos una de las siguientes condiciones (1) a (2): (1) una razon restante del farmaco tras una hora en una prueba de liberación es de al menos el 90%; (2) una raz6n restante del farmaco tras un dia en una prueba de liberación es de al menos el 82%.

Description

Preparación de liberación sostenida para terapia de regeneración tisular

Campo técnico

La presente invención se refiere a microesf~~ras que comprenden ácido ({5-[2-{{(1 E)-fenil(piridin-3iI)metilen]amino}oxQetiij-7,8-dihidronaftalen-1-il}oxi)acético '1 un copol lmero de copolfmero de ácido láctico/ácido glioolico.

Antecedentes de la técnica

Hasta ahora se ha investigado el desarrollo de inyecciones de liberación lenta, a largo plazo, que pueden liberar de manera conlinua un fármaco con el objetivo de minimizar el numero de veces que se administra un medicamento y por tanto mejorar el cumplimiento con el fármaco. En particular, se han realizado numerosos estudios sobre métodos de liberaciÓn controlada que implican el uso de micrc,esferas de fármacos (algunas veces abreviadas como "ME") que usan un poUmero que tiene una escasa solubilideld en agua. Se emplea un polimero biodegradable como este pollmero de modo que, tras la liberación del fármaco, la base no queda en el sitio de administración. En particular, se usan polimeros de poli(ácido láctico) (algunas veces abreviados como "PLA") o copollmeros de ácido láctico/ácido glicólico (algunas veces abreviados como ' PLGAj, que tienen un registro establecido de uso, por ejemplo, en hilos para suturas quirúrgicas y pernos para anclajes óseos. Estos polímeros se emplean en inyecciones del derivado de LH-RH Leuplin (nombre comercial), que se venden comercialmente como inyecciones de liberación lenta, y en el derivado de somatostatina de aedón prolongada Sandostatin (nombre comercial) LAR.

Los fármacos comúnmente encapsulados dentro de rnicroesferas incluyen péptidoS, protelnas y ácidos nudeicos, tales como péptidos fisiológicamente activos, diversos tipos de hormonas, factores de crecimiento, anticuerpos, genes y diversos factores de crecimiento/diferenciación celular. En la fabricación de microesferas, en general se sabe que cuando el fármaco que va a encapsularse tiene un peso molecular superior, puede fabricarse más fácilmente microesferes que tienen una ráfaga inicial baja y cuya liberación se controla fácilmente.

En cambio, por varios motivos, induyendo la gran ráfaga inicial, la difICUltad de liberación controlada y el bajo contenido de fármaco (razón de encapsulaclón), se ha encontrado una gran djficultad en los esfuerzos por preparar microesferas que contienen fármacos de bajo peso molecular; Hevar a cabo la liberaciÓfl estable de tales fármacos in vivo '1 controlar la tasa de liberación ha demostrado Sl!r extremadamente dificil. Como resultado, aunque hay casos en los que se han encapsulado compuestos de bajo peso molecular (véase el documento de patente 1), ninguno está comercialmente disponible como preparaciones f~mnacéuticas.

Mientras lanto, el compuesto ácido ({5-[2-({[(1 E)-fenjl(piridin-3-il)metilenlamino}oxi)eti~-7,8-dihidronaflalen-1 il}oxi)acélico (abreviado a continuación como "el presente fármaco") es un compuesto de bajo peso molecular que tiene un esqueleto quimicamente estable distinto de prostaglandina (PG), una acción agonista de receptores de PGI2 (IP) Y una actividad de inhibición de tromboxano (TX) Aa. sintelasa. El presente fármaco, debido a que tiene una acci6n agonisla de PGI2, se conoce para usarse en la prevención y/o el tratamiento, por ejemplo, de trombosis, arteriosclerosis, cardiopatía isquémica, úlcera gástricas e hipertensión (documento de patente 2) .

Sin embargo, las preocupaciones cuando se administra el presente fármaco por vla oral incluyen efectos secundarios tales como dolor en la parte superior dell~bdomen y diarrea. Cuando se administra por via intravenosa, efectos secundarios tales como una acción hipotensiva asociada con vasodilatación, sofocos y cefaleas, etc. son una preocupaciOn. En particular, cuando se emplea el presente fármaco, de las enfermedades mencionadas anteriormente, para enfermedades cardiovasculares tules como arteriosclerosis y cardiopatia lsquémica, etc. desde e! punto de vista de los efectos secundarios y del sistema terapéutico, para prevenir la exposici6n a una alla concentración de! fármaco en el tracto digestivo y un repentino aumento de la concentraciÓn en sangre del fármaco, para minimizar la carga sobre el paciente y para maximizar los efectos del fármaco, existe un gran deseo de preparaciones que puedan mantener de manera continua la concentraciOn de fánnaco con el menor número posible de administraciones, incluyendo formas farmacéuticas de un tipo que mantenga de manera continua la concentración del fármaco en el tejido en el sitio de en'fennedad o formas farmacéuticas de lipa de mantenimiento de la concentración en sangre tales romo infusiones intravenosas po!' goteo.

Se ha investigado la administraciÓfl local de microesferas que contienen el presente fármaco como método para resolver lOS problemas anteriores, induyendo la aparición de efectos secundarios y un repentino aumento de la concentración en sangre del fármaco. Por ejemplo, el documento de patente 3 da a conocer una preparación de acción prolongada que contiene el presente fármaco y PLGA, '1 mendona que esta preparación fue eficaz cuando se administr6 localmente en un modelo de arteriosclerosis oblilerante (ASO) en rala. Sin embargo, dado que las microesferas descritas en el documento de patente 31 tenlan un bajo rontenido de fármaco, la dosis a las que se administran las propias mlcroesferas aumenta, dando lugar a un problema de acidez. Además, el periodo de liberación para el presente fármaco es corto y la tasa de liberación no es constante, como resultado de lo cual estas microesferas de la técnica anterior no han logrado mantener la concentración en sangre óptima para que su~an los efectos del fármaco a lo largo de un periodo de tiempo fijado.

Documento de patente 1: JP-9-263545 A

Documento de patente 2: JP'&-87811 A

Documento de patente 3: WO 20041032965

Descripción de la invención

Problemas que resuelve la invención

El objelo de la invención es proporcionar microesferas seguras, fáciles de usar, que liberen de manera continua el presente fármaco a lo [argo de un periodo de liempo prolongado, puedan incluir un alto contenido del fármaco, liberen el fármaco a una tasa fijada y, durante el periodo de liberación, mantengan el fármaco en un intervalo de concentración en sangre óptimo para que se manifiesten los efectos del fármaCo.

Medios para resolver los problemas

Los inventores han realizado investigaciones con el objetivo de resolver los problemas anteriores. Como resultado, han encontrado que, en microesferas que comprenden el presente fármaco y PLGA (microesferas que también se denominan a continuación "las microesferas de la invenciónl, una combinación especIfica de características tales como el peso molecular promedio en peso del PLGA, la razón de ácido láctico/ácido gliCÓlico en el PLGA, el tamano de partlcu[a promedio de las microesferas, la razón en peso del presente fármaco y el PLGA, o similares, tiene los efectos imprevistos de conferir la capacidad de liberar de manera continua el fármaco a lo largo de un periodo prolongado de una semana o más y permitir incluir el fármaco dentro de las microesferas en un contenido superior, permitiendo por lanto fijar la dosis de microesferas dHntro de un intervalo óptimo al que no surge un problema de acidez. Además, los inventores han descubierto que las microesferas del presenle fármaco pueden suprimir una refaga inicial (es decir, el porcentaje del fármaco que queda en una prueba de liberación puede mantenerse a, o por encima de, un valor fijado) y, durante el periodo de liberación, pueden mantener la concentración en sangre del fármaco en el intervalo óptimo para que se manifiesten los efectos del fármaco.

Por consiguiente, los problemas de la invención se resuelven mediante:

Una microesfera de acción prolongada de dos a cuatro semanas, que comprende ácido ({5-[2-({l(1E)-fenil(piridin-3iI)metilen]amino}oxi)etiI]-7,8-dihidronaftalen-1-il}oxi)acé,tico como fármaco y un copolimero de ácido láctico/ácido glicólico, en la que

(i)

una cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glicólico en partes en peso del fármaco es de desde 3 hasta 10 partes en peso,

(ii)

la microesfera tiene un tamano de partícula promedio de desde 20 hasta SO Ilm, y (¡ji) e[ copolimero de ácido láctico/ácido glicólico tiene un peso molecular promedio en peso de desde 10.000 hasta

50.000 y una razón de composición de ácido láctico/ácido glicólico de desde 75/25 hasta SO/50, y que satisface al menos una de las siguientes condiciones (1) a (2):

(1)

una razón restante del fármaco tras una hora en una prueba de liberación es de al menos el 90%;

(2)

una razón restante del fármaco Iras un dia en una prueba de tiberación es de al menos el 82%. Las siguientes realizaciones describen la presente invE!Oción: La microesfera según la presente invención, en la que el contenido de copolimero de ácido láctico/ácido glioolico en

partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta 8 partes en peso.

La microesfera segun la presente invención, en la qlJe la microesfera tiene un tamano de partlcula promedio de desde 25 hasta 35 Ilm. La microesfera segun la presente invención, en la qUE! la razón de copolimero de ácido láctico/ácido glicólico es de

50/50.

La microesfera segun la presente invención, en la que la concentración en sangre del fármaco es de desde 0,01 ng/ml hasta 150 ng/ml. Una microesfera de acción prolongada de dos semanas, que comprende ácido ({5-[2-({[( 1 E)-fenil(piridin-3-il)metilen1a mino}oxi)etil]-7 ,8-dihidronaftalen-1-il}oxi)acético como

fármaco y un copollmero de ácido láctico/ácido glioolio:>, en la que

(i) una cantidad de copolimero de ácido lácticoJácido glicólico en partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta

S

IS

8 partes en peso,

(ii) la microesfera tiene un tamano de partícula promedio de desde 25 hasla 35 ~m, y

(iii) el copollmero de ácido láctico/ácido glicólico tiene un peso molecular promedio en peso de desde 10.000 hasta 30,000 y una razón de composiCión de ácido láctico/áddo gl1cólico de SO/SO,

y que satisface la siguiente condidÓfl (1):

(1) una razón restante del fármaco tras una hora en una prueba de liberación es de al menos el 90%.

Una microesfera de acción prolongada de cuatro semanas, que comprende ácido ({5-[2-({[(lE)-fenil(piridln-3il)metilen)amlno}oxi)elil}-7,8-dihidronaftalen-l-il}oxi)acélico como fármaco y un copolfmero de ácido láctico/ácido glic6lico, en la que

(1)

una cantidad de copol1mero de ácido láctico/ácido glicóllco en partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta 8 partes en peso,

(ii)

la microesfera tiene un tamano de particula promedio de desde 25 hasta 35 ~m, y

(iii) el copollmero de ácido láctico/ácido glic61ico tiene un peso molecular promedio en peso de desde 30.000 hasta

50.000 y una razón de composición de ácido láctico/ácido glic6lico de 50/50, y que satisface la siguiente coodici6rl (l):

(1) una razón restante del fármaco tras un día en una prueba de liberación es de al menos el 82%. Las realizaciones preferidas de la presente invención se exponen en las reivindicaciones dependientes. El fármaco usado en la presente invención es ácido ({5-(2-({[(1E)-fenil(piridin-3-iI)melilen]amino}oxi)etil}-7,8

dihidronaftalen-l-il}oxi)acético (n.o de registro CAS 176391-41-6) de fórmula (A).

N

v

(A)

El presente fármaco se menCiona en el ejemplo 2(g) del documento JP-6-87811 A, Y puede prepararse según un método descrito en la misma publicaCión. Altemativarnente, puede usarse una sal del presente fármaco, tal como una sal de sodio o una sal de clorhidrato, en lugar del presente farmaco.

Tal como se usa en el presente documento, el término "microesferas· se refiere a microesferas que comprenden el presente farmaco y PLGA,

El PLGA usado en la presente invención es un polímero blodegradable. Cuando se administran in vivo microesferas compuestas por PlGA, en primer lugar, las molecula:s de agua penetran rápidamenle en el pollmero e hidmt3n el PlGA, haciendo que se hinche y provocando que la hidrólisis avance por su totalidad, como resultado de lo cual el peso molecular del PlGA disminuye gradualmente. l os fluidos corporales (humedad) infiltran las microesferas en el plazo de aproximadamente 24 horas, conduciendo a un hinchamIento suficiente. A medida que avanza la disminución en el peso molecular del PlGA, la estructllra dominante se rompe y se debil~a, y el fármaco presente en la misma se difunde hacia el exteriOf enlre los enlaces de PLGA debilitados y se libera mediante disolución. la hidrólisis de PLGA se produce de manera tanto enzinlática como no enzlmática, comenzando con la infiltraciÓn de fluidos corporales (humedad), liberándose gradualmente el fármaco a medida que avanza la hidrólisis.

El PLGA usado en la presente invención puede produc:irse mediante un método bien conocido en si mismo, o puede adquirirse como producto comercial. los ejemplos i l~lstralivos del PlGA usado en la presente invención incluyen Pl GA-7510 (producido por Wako Pure Chemical Indu~tries, lid.; ácido Ol-Iáctico/ácido glic6lico = 75125; peso molecular promedio en peso, 10.0(0), PlGA-7515 (producido por Wako Pure Chemlcal Industries, lid.; ácido Dlláctico/ácido glicólico =75125; peso molecular promedio en peso, 15.000), PLGA-7520 (producido por Wako Pure Chemlcallndustries, lid.; ácido OL-Iáctico/ácido glicólico =75125; peso molecular promedio en peso, 20.000), PlGA

ss

5010 (producido por Wako Pure Chemical Industries, LId.; ácido DL-Iáctico/ácido glicólico =50/50; peso molecular promedio en peso, 10.000), PlGA-5015 (producido por Wako Pure Chemicallndustries, Ud.; ácido Dl-Iáctico/ácido glicólico =50150; peso molecular promedio en peso, 15.000), PLGA-5020 (producido por Wako Pure Chemical Industries. LId.; ácido DL-Iáctico/ácido glicólico = 50l50; peso molecular promedio en peso, 20.000), PLGA5-50 (también denominado PLGAS-1 : producido por Milsui Chemicals, lne.; ácido DL-Iáctico/ácido glicólico = 50/50; peso molecular promedio en peso, 50.000), PLGA75-50 (producido por Mitsui Chemicals, lne.; ácido DL-Iáctioo/ácido glic6lico =75125; peso molecular promedio en peso, SO.OOO), H1702-2 (producido por Mitsui Chemicals, Inc.; ácido Dl-Iáeticolácido glicólico =50/50; peso molecular promedio en peso, 18.000), H1702-3 (producido por Mitsui Chemicals, Ine,; ácido OL-Iáctico/ácido glicólico = 50/50; peso molecular promedio en peso, 35.000) y H1702-4 (producido por Mitsui Chemicals, lne.; ácido Ol-Iáctico/ácido gliOOlico =S0/50; peso molecular promedio en peso, 46.000), etc. Algunos de estos PLGA tienen un bajo punto de corte de peso molecular (peso molecular promedio en peso de desde 1 hasta 3.000) o similar.

En la presente memoria descriptiva, el peso molecul ar promedio en peso de PLGA se refiere al peso molecular promedio equivalente de poliestireno medido mediante cromatografla de penneación en gel (CPG).

Pueden usarse ácido L-Iáctico, ácido O-láctico o ácido OL-Iáctico como ácido láctico en el PLGA. Se prefiere ácido OL-Iáetico.

Cuando se usan las microesferas de la invención para prevenir y/o tratar, de las indicaciones mencionadas a continuación, arteriosclerosis obliterante, ictus, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, asma, diabetes y complicaciones de la misma, angina, infarto de miocardio, insuficiencia renal, osteoartritis, artritis reumatoide u osteoporosis, el periodo de liberación lenta es preferibl4~mente de desde dos hasta cuatro semanas.

En las mieroesferas de la invenciÓn, el peso molecular promedio en peso del PlGA puede seleccionarse de la siguiente manera segun el periodo de liberación lenta seleccionado como diana. Por ejemplo, en el caso de un periodo de liberación lenta de dos a cuatro semanas, se prefiere un peso molecular promedio de desde aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 50,000. De este intervalo, cuando se selecciona como diana un periodO de liberación lenta de dos semanas, el peso molecular promedio en peso del PlGA es preferiblemente de desde aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 30.000, más preferiblemente desde aproximadamente

10.000 hasta aproximadamente 20.000 y lo más preferiblemente desde aproximadamente 20.000. Cuando se selecciona como diana un periodo de liberación lenta de cuatro semanas, el PLGA peso molecular promedio en peso es preferiblemente de desde aproximadamente ,30.000 hasta aproximadamente 50.000, más preferiblemente desde aproximadamente 40,000 hasta aproximadam4~nte 50.000 y lo más preferiblemente de aproximadamente

50.000.

La razón de ácido láctico/ácido gliOOlico en el PlGA puede seleccionarse de la siguiente manera segun el periodo de liberación lenta seleccionado como diana. Por ejemplo, cuando se selecciona como diana un periodo de liberación de dos a cuatro semanas, la razón es preferiblemente de desde 75125 hasta 25175 (plp), más preferiblemente desde 75125 hasta 50/50 (p/p) Y lo más preferiblemente de 50.150 (plp).

En mieroesferas preparadas usando PLGA, la tasa de liberaciÓn se ralentiza a un tamaño de partlcula promedio mayor. Sin embargo, en casos en los que las microesferas se administran por vla subcutánea, intramuscular o local dentro del Órgano enfenno, a un tamaño de partlcula promedio de 10 ¡..1m o menos, cuando las microesferas fluyen hacia fuera al interior del sistema vascular, pueden circular a través de todo el organismo, detenerse en sitios no diana tales como los pulmones, el higado o los riñones, y liberar el fármaco en esos sillos, como resultado de lo cual puede que no logren aparecer los efectos del fármaco. Por otro lado, a un tamaño de partícula de 70 ¡.tm o más, el paso a través de la jeringa (que tiene un calibre de 25iG a 27G) usada durante la administración empeora, además de eso, cuando tales microesferas fluyen al interior del sistema vascular, pueden obstruir los capilares, desencadenando un estado isquémico.

Por tanto, el tamaño de partícula promedio de las microesferas de la invención puede ajustarse de manera adecuada para evitar los prOblemas anteriores y según el periodo de liberación lenta seleccionado como diana. Por ejemplo, en casos en los que el periodo de liberación lenta es de desde dos hasta cuatro semanas, el tamaño de partlcula promedio es preferiblemente de desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 ¡..1m y más preferiblemente desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 !-1m.

En la presente invenciÓn. el tamai'lo de particula promedio de las microesferas puede ajustarse en combinación adecuada con el tipo de homogeneizador de emul,si6n usado durante la prodUCCión de PlGA (por ejemplo, Physcotron (producido por Nichion Irika Kikai Seisakusho), Homo Mixer (producido por Primix Corporation), Uní Mixer (Primix Corporation), TK Robomix (Primix Corporalion) etc.) y la velocidad de rotación durante la agitación.

Tal como se usa en el presente documento, "tamaño de partícula promedio de las microesferas de la invención~ se refiere al tamaño de partlcula promedio (diámetro medio ponderadO) de partlculas principales de las mismas, y puede medirse, por ejemplo, con un analizador de la distribución de tamaño de partícula de tipo por difracción de láser comúnmente usado (por ejemplo, SALO-2100 (fabricado por Shimadzu Corporation) O un contador Coulter (Multisizer3, fabricado por Beckman Coulter, Ine.). los tamaños de partlcula promedios de microesferas menCionados en esta memoria descriptiva son valores medidos mediante el métOdo del contador Coulter.

En la presente invención, la razón en peso del presenl:e fármaco y el PLGA en las microesferas, expresada como el número de partes en peso de PLGA por partes en peso del fármaco, es preferiblemente de desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10, más preferiblemente desde aproximadamente 3,5 hasta aproximadamente 9 y lo más preferiblemente desde aproximadamente 4 hasta apro)fimadamente 8.

Cuando la razón de encapsulaciOn del presente fármaco incluido en el PlGA (la "razón de encapsulaci6n" puede convertirse en el contenido correspondiente del presente férmaco) es baja. la dosis de PlGA aumenta. Con respecto a la seguridad del propio PLGA. en desarrollo para su uso, por ejemplo, en inyeociones Leuplin e inyecciones intramusculares Sandostatin LAR, se ha confirmado que PLGA está libre de toxicidad. Se sabe que cuando se administra una gran cantidad, las concentraciones de ácido láctico y/o ácido glic6lico hldrolizados aumentan en el sitio de administración, provocando un problema de acidez. Por tanto, es deseable reducir lo mas posible la cantidad de PLGA en el momento de la administraciÓn; para ello, existe la necesidad de aumentar la razÓn de encapsulaciÓn del presente fármaco. Por otro lado, cuando se aumenta la razón de encapsulaci6n del presente fármaco, la estructura de superficie de las partlculas de microesferas se tensa, como resultado de lo cual aumenta la ráfaga inidal. Por tanto, la raz6n de encapsulad6n es preferiblemente de desde aproximadamente el 9% hasta aproximadamente el 25% Qo que oorresponde a un alOtenido de fármaco en el que la cantidad de PLGA en partes en peso del fármaco es de desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 partes en peso), más preferiblemente desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 22% (lo que corresponde a un contenido de fármaco en el que la cantidad de PLGA en partes en peso del fármaco es de desde aproximadamente 3,5 hasta aproximadamente 9 partes en peso) y lo más preferiblemente desde aproximadamente el 11% hasta aproximadamente el 20".4 (lo que corresponde a un a>ntenido de fármaco en el que la cant!dad de PLGA en partes en peso del fármaco es de desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes en peSO).

En las microesferas de la invenci6n, el contenido, O lel razón de encapsulaci6n, del presente fármaco incluido en el PLGA se expresa mediante la siguiente f6rmula.

Raz6n de encapsulación (%) '" (contenido nledido de fármaco/cantidad de microesferas) X 100

La raz6n de encapsulad6n puede medirse mediante el método descrito a continuaci6n en los ejemplos de realización.

En la presente invención, microesferas "de acción prolongada de dos a cuatro semenas· se refiere a microesferas que tienen la capacidad de liberar de manera continua el fármaco encapsulado en las microesferas de la invenci6n durante un periodo de desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente cuatro semanas tras la administración. Microesferas "de acción prolongada di;! dos semanas" o "de acción prolongada de cuatro semanas· se refieren a la capacidad de liberar de manera continua una dosis eficaz del fármaco encapsulado en las microesferas de la Invendón durante un periodo de aproximadamente dos semanas o de aproximadamente cuatro semanas tras la administración. Además, en la preserlte memoria descriptiva, tanto la expresión "acción prolongada de dos semanas" como la expresión "que tiene un periodo de liberación lenta de dos semanas' tienen el mismo significado, y tanto la expresión "acción prolongada dEl cuatro semanas" como la expresión "que tiene un periodo de liberación lenta de cuatro semanas· tienen el mismo significado.

En la presente invención, la expresión "liberar el fármaco a una tasa fijada durante aproximadamente cuatro semanas tras la administración" significa que el presente fármaco encapsulado dentro de las miCtoesferas de la invendón se libera de manera continua y a una tasa fijada, es decir, de manera constante, durante aproximadamente cuatro semanas tras la administración. En este caso, el método de confirmar que el presente fármaco se libera a una lasa fijada, tal como resultará evidente para los expertos en la técnica, implica confirmar que, en la prueba de liberación in vitro descrita a continuación. la razón restante del presente fármaco cambia linealmente con el tiempo; es decir, experimenta lJOa liberaci6n de orden cero. Mediante esta capacidad, la concentración eficaz del presente fármaco en la sangre o la concentración eficaz del presenle fármaco en el sitio de enfermedad pueden mantenerse de manera contlrlua y constante dentro del periodo de liberación indicado anteriormente. Tal como se indicó anteriormente, el periodo de liberación preferido es de dos semanas o de cuatro semanas.

Las concentraciones en sangre del fármaco en ratas que se obtuvieron en los ejemplos de realización descritos a continuación son concentraciones adecuadas para evitar efectos secundarios (por ejemplo, pérdida de peso, diarrea, efectos hipotens;vos) en la rata o similar y para manifElstar los efectos del fármaco. Tal como resultará evidente para los expertos en la técnica, esta concentración en sangre puede extrapolarse a la concentración en sangre del fármaco en seres humanos.

Cuando la concentración en sangre del presente fármaco en seres humanos supera aproximadamente 150 ng/ml, además de un efecto de inhibIción de la agregación pl:¡¡,quetaria, existe una preocupación de que aparecerán sofocos faciales, pesadez de cabeza y un efecto hipotenslvo transitorio. Por otro lado, cuando la concentración en sangre y/o la concentración local en tejidO con enfermedad del presente fármaco está por debajO de aproximadamente 0,01 ng/ml, existe la posibilidad de que los efectos del fánnaco no aparecerán completamente.

Dado que los resultados de concentración en sangre obtenidos de ratas generalmente se extrapolan a seres humanos usando valores numéricos que oscilan entre aproximadamente 1/100 y aproximadamente 100 veces la concentración en sangre obtenida en ratas, se conjetura que la concentración en sangre del fármaco adecuada para manifestar efectos del fármaco en seres humanos es de desde aproximadamente 0,01 ng/ml hasta aproximadamente 150 ng/ml.

En la presente invención, la expresión ~mantener la concentradón en sangre del fármaco~ significa, cuando se administran sistémicamente las miaoesferas de la invención, mantener la concentraciÓfl en sangre del presente fármaco en un intervalo adecuado para evitar efectos secundarios y manifestar los efectos del ftmnaco en seres humanos. Tal intervalo es preferiblemente de des.de aproximadamente 0,01 ng/ml hasta aproximadamente 150 ng/ml y más preferiblemente desde aproximadamente 0,1 ng/ml hasta aproximadamente 60 ng/ml. En casos en los que las microesferas del presente fármaco se administran al sitio de enfermedad con el fin de mantener la concentradón local de manera continua a una alta concentración, la concentración en sangre del presente fármaco que fluye hacia fuera a la sangre, aunque también depende del sitio del órgano, etc, al que se administran las microesferas, es normalmente de desde aproximadamente l /lO hasta aproximadamente 1/100 del intervalo de

desde aproximadamente 0,01 ng/ml hasta aproximadamente 150 ng/ml,

l a forma de administración de las microesferas de la invención se muestra a modo de ejemplo mediante inyecciones subcutáneas, intradérmicas, intramusculares e intrava~iculares, inyecciones al órgano local de enfermedad, tal como inyecciones en el sistema nervioso central o el miocardio, etc.; agentes de inclusión mezclados con cemento óseo, un material de prótesis ósea artificial (j3-TCP; fosfato de tricalcio) o un hidrogel de gelatina. etc.; endoprótesis de elución de fánnaco (DES); agentes que se administran por vla transmucosa, tales como en el recto, la cavidad uterina o bucal. etc.; agentes orales. supositorios. gotas nasales. inhalantes, colirios; y administración a las cavidades de las articulaciones o al sitio focal. etc. tales como un tumor, etc. o similares.

Manteniendo la razón restante del presente fármaco tras una hora a al menos aproximadamente el 90% en microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de dos semanas, o manteniendo la razón restante del presente fármaco tras un dia a al menos aproximadamente el 82% en miaoesferas que tienen un periodo de liberación lenta de cuatro semanas, puede suprimirse una ráfaga Inicial. En otras palabras, es posible suprimir la cantidad del presente fármaco inicialmente liberada, suprimir un aumento transitorio de la concentración en sangre del fármaco y suprimir un efecto hipotensivo, etc. qUE! acompar'la a un aumento transitorio de la concentración en sangre del fármaco.

En la presente invención, el método de evaluar el grado de ráfaga inicial no está sujeto a ninguna limitación particular. Un ejemplo de un método de este tipo es la prueba de liberación in vitro descrita en los siguientes ejemplos de realización. En la presente invendón, en una prueba de liberación in vitre, se determinó que la ráfaga inicial se suprimla en microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de dos semanas manteniendo la razón restante del presente fármaco tras una hora a al menCls aproximadamente el 90%. y en microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de cuatro semanas manteniendo la razón restante del presente fármaco tras un dia a al menos aproximadamente el 82%.

En la presente invención, pueden incluirse aditivos con el fin de aumentar el efecto de supresión de la ráfaga inicial. los ejemplos preferidos incluyen sustancias que aumHntan la viscosidad de la fase acuosa interna o se endurecen bajo los efectos de la temperatura o la adición de iones, sustancias que tienen residuos básicos que llevan una carga eléctrica positiva, y sustancias que interaccionan con poUmeros macromolerulares y aumentan la viscosidad de emulsiones oJw o w/olw. los ejemplos ilustrativos induyen gelatina, agar, ácido alglnico. poli(alcohol vinllico), polietilengliCOl (PEO) o é.Odo algínico, un aminoácido basico tel como I¡sine, etc., polipéptidos que contienen un aminoácido básico, bases orgánicas tales como N-rnetilglucamlna, etc., o maaomoléculas básicas naturales o sintéticas (induyendo quitosanos tales como un hidroxipropiltrimonio-quitosano, etc.) o similares (a concentraciones en la fase acuosa intema de desde aproximadamente el 0,05% hasta aproximadamente el 80%).

Además, en la presente invención, para aumentar el efecto supresor de la ráfaga inicial. pueden excluirse PlGA que tienen un bajo peso molecular de aproximadamente 3.000 o menos presentes en el momento de la producción de microesferas.

los métodos para producir las microesferas de la invEmción se muestran a modo de ejemplo mediante métodos de secado en agua (por ejemplo. métodos de olw, métodos de w/o, métodos de w/olw, etc.), métodos de separación de fases, métodos de secado por pulverización. métod()s de granuladón usando fluidos supercríticos. métodos en general segun OJalquiera de los anteriores y métodos descritos en los ejemplos de realización en el presente documento o similares.

A continuación se describen en detalle métodos de producción para un método de secado en agua (método de olw) y un método de secado por pulverización.

(1) Método de secado en agua (método de olw)

En este método, en primer lugar se prepara una disolución en disolvente orgánico de PlGA o una disolución mixta en disolvente orgániCO/disolvente de tipo alcohol de PLGA. El disolvente orgánico tiene preferiblemente un punto de ebullición de 1200C o menos. Los ejemplos ilustrativo~;; del disolvente orgánico incluyen hidrocarburos halogenados (por ejemplo, diclorometano, cloroformo, etc.), ésteres alifáticos (por ejemplo. acetato de etilo, etc.), éteres, hidrocarburos aromáticos, cetonas (por ejemplo. acetona, etc.), alcoholes (por ejemplo, metanol, etanol, etc.), ácidos carboxilicos alifáticos (por ejemplo, ácido acético, etc.), dimetilsulfóxido (DMSO) y dimetilformamida (DMF), etc. Alternativamente, pueden mezclarse dos o más de estos en razones adecuadas y usarse juntos. El disolvente orgánico es preferiblemente diclorometano o acetona. Los ejemplos del disolvente de tipo alcohol incluyen metanol, elanol y propanol, etc. Se prefiere metanol o etanol. La razón volumétrica (vlv) del disolvente orgánico/disolvente de tipo alcohol es preferiblemente de desde aproximadamente 1/1 hasta aproximadamente 20/1 y más preferiblemente desde aproximadamente 2/1 hasta aproximadamente 10/1.

La concentración de PLGA en la disolución en disolvente orgilOico o en la disolución mixta en disolvente orgánico/disolvente de tipo alcohol varia según el peso molecular promedio en peso de PLGA, la clase del disolvente orgánico y el disolvente de tipo alcohol, o similares, pero se selecciona generalmente de desde aproximadamente el 0,01 % hasta aproximadamente el 800A. (p/v), preferiblemente desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 40% (p/V) Y más preferiblement~~ desde aproximadamente el 1 % hasta aproximadamente el

20% (pi,).

El presente fármaco se ai'lade y se disuelve en la disolución en disolvente orgánico o la disolución mixta en disolvente orgánico/disolvente de tipo alcohol de PLGA asl obtenida. La cantidad de este fármaco que se ai'lade varia con factores tales como periodo de liberación objetivo, etc. pero la concenlración de PLGA en la disolución en disolvente orgánico o la disolución mixta en disolvente orgánico/disolvente de tipo alcohol es generalmente de desde aproximadamente el 0,001 % hasta aproximadamente (!I 90% (plv), preferiblemente desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 50% (plv) Y más preferiblemente desde aproximadamente el 0,3% hasta aproximadamente el 30% (plv). Cuando sea necesario, pueden disolverse antioxidantes y/o aditivos, junto con el fármaco, en la disolución en disolvente orgánico o la disolución mixta en disolvente orgánico/disolvente de tipo alcohol de PLGA.

A continuación, se añade la disolución preparada tal como se describió anteriormente a una fase acuosa y se forma una emulsión de aceite en agua usando un agitador, ~~mulsificador o similar. El volumen de la fase acuosa en este momento es generalmente de desde aproximaclamente 1 vez hasta aproximadamente 10.000 veces, preferiblemente desde aproximadamente 2 veces hasta aproximadamente 5.000 veces y más preferiblemente desde aproximadamente 10 veces hasta aproximadamente 1.000 veces el volumen de la fase de aceite. Puede añadirse un agente emulsionante a la fase acuosa. El agente emulsionante puede ser generalmente cualquiera que pueda formar una emulsión de aceite en agua estable. L.os ejemplos ilustrativos del agente emulsionante incluyen tensioactivos aniónicos, tensioactivos no iónicos, del"ivados de polioxietileno-aceite de ricino, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico), carboximelilcelulosa, lecilina y gelatina, etc. Estos pueden combinarse y usarse de manera adecuada. Un ejemplo preferido del agente emulsionante es poli(alcohol vinllico) (PVA). La concentración del agente emulsionante en la fase acuosa externa es de preferiblemente desde aproximadamente el 0,001 % hasta aproximadamente el 20% (pIv), más preferiblemente desde aproximadamente el 0,01% hasta aproximadamente el 10% (p/v) y lo más preferiblemente desde aproximadamente el 0,05% hasta aproximadamente el 5% (p/v).

Ajustando adecuadamente la velocidad de agitación durante la formación de la emulsión de aceite en agua, es posible ajustar el tamaño de partícula de las microesferas resultantes. Por ejemplo, a una velocidad de rotación rápida, el tamai'lo de partícula de las microesferas obtenidas será menor; a la inversa, a una velocidad de rotación más lenta, el tamaño de partícula será mayor.

Se emplea un método comúnmente usado para eliminar por evaporación el disolvente de la fase de aceite. La evaporación del disolvente puede llevarse a cabo a presión normal o con reducción gradual de la presión mientras se agita, por ejemplo, con un agitador o un agitador magnético, etc., o puede llevarse a cabo usando un evaporador rotatorio, etc. mientras se ajusta el grado de vacio. Las microesferas asl obtenidas se recogen mediante separación por centrifugación o filtración, entonces se separan principio activo libre, agente emulsionante y similares que se adhieren a las superficies de las microesferas mediante lavado varias veces times con, por ejemplo, una disolución de tensioaclivo o alcohol, tras lo cual se dispersan de nuevo las microesferas en agua destilada (agua purificada) y se liofilizan. En el método de aceite en agua descrito nnteriormente, las microesferas pueden producirse, en vez de eso, mediante dispersión del fármaco en una disolución en disolvente orgánico de PLGA; es decir, mediante un método de s/oJw. Además, para potenciar la dispersibilidad de las microesferas producidas en una disolución inyectable, suprimir la aglomeración y así obtener una inyección de mlcroesferas de liberación lenta, estable, la liofilizaciOn puede llevarse a cabo después de ai'laclir en primer lugar dispersantes, conservantes, agentes de tonicidad, excipientes y antioxidantes. Añadir estos aditivos suprime la tendencia de las microesferas a aglomerarse mutuamente y potenCia la capacidad de suspensión, haciendo asl posible mejorar la capacidad para pasar a través de una aguja de jeringa.

(2) En casos en los que las microesferas de la invención se producen mediante un procedimiento de secado por pulverización, se pulveriza un disolvente orgánico o I~mulsión en el que están disueltos el PLGA y los principios activos en la cámara de secado de un secador por plJlverización usando una boquilla, haciendo que el disolvente orgánico o el agua dentro de las gotitas de liquido finamente divididas se evapore en un tiempo muy corto, produciendo así mlcroesferas. La boquilla puede ser cualquiera de diversos tipos, incluyendo boquillas de dos

IIquidos, boquillas de cuatro liquldos, boquillas presuri:tadas y boquillas de disco giratorio, etc. En este momento, si se desea, para prevenir la aglomeración de las microesferas de manera simultanea con la pulverización de la emulsión de aceite en agua, es eficaz pulverizar un disolvente orgánico o una disolución acuosa de un antifloculanle (por ejemplo, manitol, lactosa, gelatina, etc.) desde otra boquilla. Si es necesario, para las microesferas asl obtenidas, la eliminación de humedad y disolvente dentro de las microesferas se lleva a cabo de manera más completa con calentamiento y a una presión reducida.

los ejemplos de dispersantes incluyen manilol. lactosa, glucosa, Tween 80 (nombre comercial), HC0-60 (nombre comercial), eMe-Na (nombre comercial), alginato de sodio, almidones (por ejemplo, almidón de maiz, etc.), glicina, fibrina y colágeno, etc.

Los ejemplos de conservantes Incluyen metilparabeno y propilparabeno, etc.

Los ejemplos de agentes de tonicidad incluyen cloruro de sodio, manitol, sorbitol y glucosa, etc.

Los ejemplos de excipientes Incluyen manitol, sorbllol, lactosa y glucosa, etc.

Los ejemplos de antioxidantes incluyen parabenos (por ejemplo, metilparabeno, etc.), ácido sórbico y sales del mismo, butilhidroxianisol (BHA), dibutilhidroxitolueno (BHT), a·tocoferol, palmitato de ácido asc6rbico, ácido nordihidroxiguaiarétlco, ésteres de guaiacol, 1,3-butilenglicol, deshidroacetato de sodio, galato de propilo, etc., sales que producen iones de metales trivalentes (por ejemplo, cloruro de aluminio, alumbre, alantolnato de aluminio).

Dado que las mlcroesferas que contienen el presente fármaco y PLGA, descritas en el ejemplo de preparación 2 del documento de la publicaci6n de patente intemacional WO 2004/032965 tienen un contenido de fármaco muy bajo de aproximadamente el 5%, debe administrarse una gran cantidad para obtener efectos del fármaco suficientes. Como resultado, la cantidad del propio PLGA administrad,o también aumenta, lo que puede dar lugar, tal como se mencionó anteriormente a problemas de acidez tras la administración. En la presente Invención, se aumentó el contenido de fármaco (razón de encapsulación) con e-I fin de superar el prOblema anterior. Sin embargo, aumentar simplemente el contenido de fármaco conduce, tal como se indica en los siguientes ejemplos, a la aparición de una ráfaga inicial del fármaco. Por este motivo, ajustando también adecuadamente y combinando el peso molecular promedio en peso del PLGA, la razón de ácido láctico/ácido glic6lico en el PLGA, el tamano de partlcula promedio de las microesferas y la razón en peso del fármaco y el PLGA, se descubrieron microesferas que suprimen una ráfaga inicial del fármaco y pueden lograr la liberación del fármaco a una tasa fijada (liberación de orden cero) a lo largo de un periodo de desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente cuatro semanas Iras la administración. También se descubrió que las microesferas de la invención pueden, durante el periodo de liberación lenta, evitar efectos secundarios y mantener la concentración en sangre del fármaco dentro de un intervalo que es óptimo para que se manifiesten los efectos del fármaccl.

En la presente invención, para producir microesferas que tienen un periodo de liberaci6n lenta de desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente cuatro semanas y que tienen las caracterlsticas descritas anteriormente, es preferible (1) fijar eltamai'lo de partlcula promediO de las microesferas a desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 tJm, (2) fijar la cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glic61ico en partes en peso del fármaco a desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 partes en peso, y (3) fijar el peso molecular promedio en peso del copollmero de ácido láctico/ácido glicólico a desde aproximadamente 10.000 hasta aproXimadamente 50.000 y fijar la razón de ácido láctico/ácido glic61ico a desde aproximadamente 75125 hasta aproximadamente 50150; y es incluso más preferible (1) fijar el tamano de partlcula promedio de las microesferas a desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 jJm. (2) fijar la cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glic61ico en partes en peso del fármaco a desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes en peso, y (3) fijar el peso molecular promedio en peso del copol1ml~ro de ácido láctico/ácido glicOlico a desde aproximadamente

10.000 hasta aproximadamente 50.000 y fijar la razón de ácido láctico/ácido glic61ico a aproximadamente 50150.

De lo anterior, para producir microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de dos semanas, (1) el lamai\o de partrcula promedio de ras mlcroesferas se fija a desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 jJrn, (2) la cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glic6lico en partes en peso del fármaco se fija a desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes en peso, y (3) el peso molecular promedio en peso del copolimero de ácido láctico/ácido glic6lico se fija a de$de aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 20.000 y la razón de ácido láctico/ácido glic6lico se fija a aproximadamente 50150. Para producir miaoesferas que tienen un periodo de liberación lenta de cuatro semanas, (1) er tamano de partrcura promedio de las microesferas se fija a desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 tJm, (2) la cantidad de copolfmero de ácido láctico/ácido gJic6lico en partes en peso del fármaco se fija a de!;de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes en peso, y (3) el peso molecular promedio en peso del copolimero de ácido láctico/ácido glic6lico se fija a desde aproximadamente 50.000 y la razón de acido láctico/ácido glicólico se fija a aproximadamente 50150.

Tal como se mencionO anteriormente con respecto a las microesferas de la invención en las que cada una de las condiciones constituyentes se han fijado dentro de los intervalos preferidos, en las pruebas de liberación In vitro descritas en los siguientes ejemplos, dado que las microesferas con un periodo de liberación lenta de dos semanas tienen una razón restante del fármaco tras una hora desde la administraciOn de al menos aproximadamente el 90% y

las microesferas con un periodo de liberación lenla de cuatro semanas tienen una razón restante del fármaco tras un dla desde la administraciOn de al menos aproximadamente el 82%. ambas suprimen una ráfaga inicial. Además, lal como se muestra en los siguientes ejemplos. las microesferas anteriores también tienen la capacidad de mantener una concentración eficaz en sangre durante los periodos de liberaciOn lenta respecti\los.

(Aplicaciones como preparaciones farmacéuticas)

El presente fármaco liene una acciórl agonista de receptOfes de PGI2, una acciOn de inhibiciOn de la T~sintelasa, una acciOn de promoción de la producción de factor de reparación endógeno, una acción de inducción de la diferenciación de células madre y una acción de aceleración de la angiogénesis. elc., y por tanto, este fármaco y estas mlcroesferas que contienen este fármaco son útiles como agentes preventivos y/o terapéuticos para diversos tipos de trastornos de órganos, incluyendo enfermEtdades de los vasos sanguíneos y linfáticos (por ejemplo, arteriosclerosis obliterante (ASO), enfermedad de Buerger, enfermedad de Raynaud, arteriosclerosis, linfedema, etc.), cardiopatla (por ejemplo, infarto de miocardio, angina, taquiarritmla ventricular, insuficiencia cardiaca congestiva, arteriopalia coronaria, cardiomiopatla idiopática, cardiomiopatía dilatada, fibrilación auricular, miocarditis, etc,), enfermedades de degeneración de los nelVios (por ejemplo, encefalopatla Isquémica, accidentes cerebrovasculares, ictus (infarto cerebral, hemorragia cerebral, etc,), enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, neuropatla diabética, estenosis del conducto vertebral, demencia, enfermedad de moyamoya, lesiones de la médula espinal, esclerosis lateral amiotr6fica (ELA), aneurisma cerebral, etc,), enfermedades pulmonares (por ejemplo, neumonla aguda, fibrosis pulmonar, hipert4~nsión pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), slndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), lesión pulmonar aguda (LPA), sindrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), sarcoidosis, neumonia intersticial, neumonitis por hipersensibilidad, asma, etc.), enfermedad de los huesos/cartllagos (por ejemplo. osteoartritis (OA) de las vertebras o la rodilla, etc" artritis reumatoide (AR), osteoporosis, fractura ósea, osteonecrosis, lesión perióstica, terapia de regeneración del eslemón asociada con cirugía cardiopulmonar, etc.), enfermedades hepáticas (por ejemplo, hepatitiS fulminante, hepatitis aguda, Círrosis, hepatitis crónica, hígado graso, elc.), enfermedades renales (por ejemplo, insuficiencia renal aguda, trastomo renal isquémlco, slndrome de aplastamiento, insuficiencia renal necrótica, enfermedad glomerular, glomerulonefritis, nefroesdemsiS, glomerulonefritls proliferativa, enfermedad tubulointersticial, trastornos renovasculares, enfermedad renal quistica, nefropalla tóxica, anomallas en el transporte tubular, trastornos renales en pacientes sometidos a diálisis, nefropatla, etc.), enfermedades pancreáticas (por ejemplO, diabetes, pancreatitis crÓf"lica, pancreatitis aguda, etc.), enfermedades del tracto digestivo (por ejemplo, esofagitis, gastritis. úlcera gástrica, úlcera duodenal, enfermedad inflamatoria del intestino. colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn. etc.), trasplantes de 6rganosltejidos (trasplante de coraz6n, trasplante de hlgado, trasplante de riMn, trasplante de pulmón, trasplante de páncreas, trasplante de colgajo miocutáneo, trasplante de esófago, trasplante de piel, trasplante de vasos sangulneos/tinfáticos, traspl~lnte de células madre hematopoyéticas, trasplante de huesos/cartílagos, etc.), complicaciones diabéticas (por ejemplo, trastornos de los nelVios, úlceras cutáneas, nefropalla, etc.), trastornos de células endoteliales vBlsculares (por ejemplo, prevención de reestenosis tras ACTP (angioplastia coronaria transluminal percutánea, etc.), '!lnfermedades dentales (por eJemplo, enfennedad periodontal, heridas por extracción de dientes, heridas de la cavidad bucal, trastornos de tejido óseo periodontal, periodontitis, etc.), enfennedades de la piel (por ejemplo, úlceras de decúbito, enfermedad de alopecia, alopecia areata, úlceras cutáneas, etc.), enfennedades oftálmicas (por ejemplo, glaucoma, etc.), enfermedades de los oldos y de la nariz (por ejemplo, sordera, sordera neurosensorial, etc.), fallo multiorgánico (FMO), enfermedades alérgicas y enfermedad del colágeno, o similares. El presente fármaco y las microesferas que lo contienen son especialmente prometedores como agente para prevenir y/o tratar las siguientes enfermedades de los vasos sanguíneosllinfáticos: ASO, enfermedad de Buerger, linfedema y úlceras diabétiC;<ls; las siguientes cardiopatías: infarto de miocardio, angina e insuflclencla cardiaca; las siguientes enfermedades putmol'\8res: fibrosis pulmonar, hipertensi6n pulmonar, asma y EPOC; las siguientes enfennedades renales: insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica y nefropalla diabética; las siguientes enfermedades de los huesos/cartUagos: OA, AR, osteoporosis, fracturas óseas; las siguientes enfermedades de degeneración de los nervios: ictus, enfermedad de Parkinson, lesiones de la médula espinal y trastornos diabéticos de los nervios: y las siguientes enfermedades hepáticas: hepatitis aguda, hepat~is fulmInante, cirrosis y reestenosis tras ACTP.

El factor de reparación endógeno cuya producción induce, promueve o amplifica el presente fármaco varia dependiendo de las células de producción, y se sabe que incluye, por ejemplo: factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), diversos factores de crecimiento de fibroblastos (aIb FGF), factor de crecimiento de transfonnaciÓll afl3 (TGF-alP), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), angiopoyetina, factor de inducción de hipoxia (HIF), factor de crecimiento similar a insulina (IGF), protelna morfogenétlca ósea (BMP), factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF), factor de crecimiento epidérmiCO (EGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor necrotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotr6flco derivado de células de la gUa (GONF), factor de células madre (SCF), factor estimulante de colonias de granulocltos (G-CSF), factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF), factor estimulante de colonias de granu1ocitos y macrófago (GM-CSF), factor de crecimiento de quera1tinocitos (KGF), factor de crecimiento de condrocitos (GDF) y famillos relocionodos de foctores de crecimiento. I=:n el Iren$Curso de la$ presentes investigaciones, se ha descubierto una nueva acción de inducción de la prod.ucción de factor derivado de células del estroma (SDF-1). Se ha encontrado que SDF-1 es una citocina que no está limitada sólo a la hemopoyesis, sino que sirve como clave para la regulación de la cinética de células madre y células precursoras en el transcurso del desarrollo. Por ejemplo, el presente fánTI8CO induce la producción de VEGF-A , HGF, EGF Y SOF-1 a partir de fibroblastos. Otros fármacos que producen los factores de reparación endógenos mencionados anteriormente incluyen otros agonistas de receptores de prostaglandina (PG)lz (por ejemplo, beraprost. ¡Iaprast, NS-304, etc.), agonistas de receptor EP2 y EP4 (ambos de los cuales son receptores de PGE2) y mezclas de estos agonistas (por ejemplo, PGEI, PGE2• PGI2 Y derivados de los mismos, etc.). Para lograr los obje~tos de la presente invención, pueden usarse los fármacos mencionados anteriormente en lugar del presente fármaco.

las rnicroesferas de la invención, cuando se adrninistran por via subcutánea, intramuscular y/o mediante implantación tisular, se liberan lentamente a lo largo de un periodo de tiempo prolongado, manteniendo asi la concentraci6n en tejido local y/o concentraci6n en sangre del fármaco. El fármaco cuya concentración se mantiene de ese modo aumenta el flujo sanguineo en los vasos sanguíneos restantes, por ejemplo, mediante efectos vasodilatadores y actividad de inhibici6n de la agregad6n plaquetaria, etc., debido a la inherente actividad agonista de receptores de PGI2 actividad de inhibici6n de la TEA2 sintetasa, etc. Además, dado que el presente fármaco promueve la producci6n de diversos factores de rElparaci6n end6genos, tiene un efecto de promoci6n de la regeneraci6n tisular debido, por ejemplo, a una actividad de promoci6n de la vascularizaci6n1regeneraci6n y una actividad de inducción de la diferenciación de células madre, y por tanto tiene efectos selectivos sobre una variedad de enfermedades.

El periodo de liberaci6n y el método de administraci6n se seleccionan de manera adecuada según la enfermedad y el método de tratamiento de la misma al tiempo que se tienen en cuenta consideraciones tales como seguridad, conveniencia, baja invasividad, la carga sobre el paciente y el cumplimiento o similares.

Dado que las microesferas de la invenci6n tienen un periodo de liberación lenta de desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente cuatro semanas, de las enfermedades mencionadas anteriormente, son particularmente útiles para prevenir y/o tratar enfermedades de los vasos sangulneosllinfáticos (por ejemplo, ASO, enfermedad de Buerger, enfermedad de Raynaud, linfedema, prevención de reestenosis tras ACTP, etc.), cardiopatia (por ejemplo, infarto de miocardio, angina. insuficiencia cardiaca, cardiomiopalla dilatada, etc.), enfermedades renales (por ejemplo, insuficiencia renal aguda. insuficiencia renal crónica, nefropatla diabética, etc.), enfermedades de degeneración de los nervios (por ej,emplo, ictus, enfermedad de Par1<.inson, neuropatla diabética. lesiones de la médula espinal, etc.), enfermedade$ pulmonares (por ejemplo. hipertensi6n pulmonar, fibrosis pulmonar, asma, EPOC, etc.) y enfermedades de· los huesoslcartllagos (por ejemplo, osteoporosis, artritis reumatoide, osteoartritis, fractura 6seas, enfermedad periodontal, etc.).

Los métodos de administraci6n preferidos para el uso de las microesferas de la invención sobre estas enfermedades incluyen la administraci6n directa al sitio de enfermedad mediante técnicas que conllevan la inclusión en una inyección administrada por vía subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravascular o local en el tejido en el sitio de enfermedad, tal como el sistema nervioso cenlral o el músculo cardiaco; en un agente de inclusi6n mezclado con cemento 6seo, material de prótesis ósea artificial (P-TCP; fosfato de tricalcio), hidrogeles de gelatina o similares; yen hllos para suturas, pernos, películas o láminas; y métodos que implican recubrir sobre una endopr6tesis o similares. Además, la administraci6n puede llevarse a cabo en fOnTIa de un agente administrado por vía transmucosa en el recto, otero, cavidad bucal, etc.; como un agente oral, :supositorio, gotas nasales, inhalante, colirio; a una cavidad de las articulaciones; por via percutánea, como pomada () como parches cutáneos adhesivos; o al sitio de enfermedad tal como un tumor.

[Toxicidad]

El presente fármaco y las microesferas de la invención tienen una baja toxicidad y son suficientemente seguros para su uso como medicamentos.

Efecto de la invención

El presente fármaco y las microesferas de la invención son útiles para prevenir y/o tratar cardiopatias, enfermedades de los vasos sanguineos/linfáticos, enfenTIedades pulmonares, enfermedades renales. enfermedades hepáticas, enfermedades pancreáticas. enfermedades de los huesos/cartílagos, atergias y enfermedades de degeneraci6n de los nervios. Dado que las microesferas de la invención liberan el presente fármaco a una tasa fijada a lo largo de un periOdO de desde aproximadamente dos semanas hasta aprOXimadamente cuatro semanas tras la administración, son particulanTIente útiles para prevenir y/o tratar ASO, infarto de miocardio, angina, ictus. diabetes y complicaciones de la misma, insuficiencia renal, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, asma, CA, AR Y osteoporosis. Además, las microesferas de la invenci6n suprimen una ráfaga inicial del presente fármaco y, durante un periodo de desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente cuatro semanas tras la administración, pueden mantener la concentraci6n en sangre del fármaco en un intervalo que evita efectos secundarios y es adecuado para que se manifiesten los efectos del fármaco.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra, en una prueba de liberación in vitro, el cambio a lo largo del tiempo de la razón restante del fármaco en las microesferas preparadas en el ejemplo de preparaci6n 1-4;

la figura 2 muestra, en una prueba de liberación in vitro, el cambio a lo largo del tiempo de la razón reslante del fármaco en las microesferas preparadas en el ejemplo de preparación 2-3; y

la figura 3 muestra, en un modelo de 4-VQ en rata, la cinética en sangre del presente fármaco cuando se administraron las microesferas producidas en el ejemplo de preparación 2-2 una única vez (10 mglkg) por vis subcutánea.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

la presente invención se ilustra más completamente a continuación en los ejemplos de preparación y ejemplos de realización.

Ejemplo de preparación 1. Preparación de microesfera:s (método de o/w)

Se disolvieron el presente férmaco y PLGA en diclorometano o una disolución mixta de diclorometano y metanol (o dimetilsulfóxido, ácido aCético). Se anadió la disolución resunante a desde 300 mi hasta 40.000 mi de una disolución acuosa (ajustada a pH 3,0 con ácido clorhldrlco 1 N) de poli(alcohol vinlllco) al 0,1% (producido por nacalai tesque) con agitación a desde 1.000 hasta 5.000 rpm usando IJn instrumento Physcotron (NS-60, fabricado por Nichion Irika Kikai Seisakusho), tras lo cual se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante un periodo de desde 30 segundos hasta 3 minutos para formar una emulsión de aceite en agua. Se agitó la emulsión de aceite en agua a temperatura ambiente durante 4 horas para evaporar el diclorometano y solidificar la fase de aceite, que entonces se centrifugó

(3.000 rpm, 10 minutos) usando una centrifugadora (HIMAC-CR5B2, fabricada por Hitachi, Ud.). Se descartó el sobrenadante, se dispersO el residuo en agua purificMa (de 30 a 50 mI) y se centrifugó la dispersión (3.000 rpm, 10 minutos). Volvió a descartarse el sobrenadanle, se dispersO el residuo en una disolución de Tween al 0,2% (pIv) (de 30 a 50 mi) y se centrifugó la dispersión (3.000 rpm, 10 minutos). Se descartó el sobrenadante una vez mas, tras lo cual volvió a dispersarse el residuo con agua purificada (JO mi), se centrifugó la dispersión resultante (3.000 rpm , 10 minutos) y se descartó el sobrenadante. Se congeló el precipitado con nieve carbónica-metanol, después se seCó a presión reducida (12 horas), produciendo as1 microesferas del presente fánnaco. En el ejemplo de preparación 13, como PLGA se usó como PLGA-5010 del que se hablan cortado los componentes de bajo peso molecular (que tenlan pesos moleculares promedios en peso de 1 a 3.000) mediante un método conocido.

Se midió el !amano de partícula promedio de las microesferas resunantes usando un contador Coulter (Mullisizer3, fabricado por Beckman Coulter).

Además, se midió el contenido del presente fánnaco (razón de encapsulación) en las microesferas resultantes mediante el siguiente método.

Se ai'iadieron las microesferas (aproximadamente 10 mg) producidas tal como se describió anterionnente a 50 mi de acelonitrilo y se llevó a cabo un tratamiento por unraS<lnldos durante 10 minutos, disolviendo as! las microesferas. A continuación, se añadieron 100 111 de una disolución A de patrón interno (IS) y 500 111 de una fase móvil (pH 3,0) a, y se mezclaron íntimamente con, 400 111 de la disolución preparada tal como se describió anterionnente. Se centrifugó la disolución mixta resultante (12.000 rpm, 3 minutos) y se midió el contenido del presente fármaco presente en 10 I1J del sobrenadanle resultante mediante cromatografía de liquidos de ana resolución (HPLC), basándose en lo cual se calculó la razón de encapsulación del fármaco en las microesferas.

Razón de encapsulación (%) = (contenido de fánnaco medido/cantidad de microesferas) X 100

Condiciones de HPLC

Aparatos: Cromatógrafo (Shimadzu LC-10AT; fabricado por Shimadzu Corporation), detector UV (Shimadzu SPD10A: Shimadzu Corporation), analizador de datos (Shirnadzu C-R7A; Shimadzu Corporation).

Detección: UV -265 nm

Columna: SHISEIDO CAPCELLPACK C18 UG120 (4,€1 mm de d.!. x 150 mm); fabricada por Shiseido Co., Ltd.

Temperatura de columna: temperatura constante próxima a 250C

Fase móvil: Acetonitrilo:agua:trietilamina = 1000:900:3 (se ajusta una disolución mixta de agua y trietilamina a pH 3 con ácido fosfórico)

Velocidad de flujo: 1,0 ml/min.

Patrón intemo (IS): n-propilparabeno

Tiempo de elución dellarmaco: 7 minutos

Tiempo de elución del IS: 4 minutos Método de preparación de la disolución A de IS

En primer lugar, se pesaron 100 mg del patrón interne) y se llevaron a 100 mi con etanol. Entonces se llevaron diez mililitros de la disolución resultante a 100 mi con etanol. Se usó la disolución resultante como disolución A de IS.

Los resultados de las preparaciones anteriores y las medidas se mueslran en las siguientes tablas 1 a 4. En las

5 siguientes tablas, "PUGA" se refiere a la razón de poli(ácido láctico) (PL)/ácido glic6lico (GA) en el PLGA. La velocidad de rotación se refiere a la velocidad de rotación cuando se agita la disolución mixla que contiene el presente fármaco y PLGA Y la disolución acuosa de ¡>l:>li(alcohol vinllico) al 0,1% usando un instrumento Physcotron para producir una emulsión de aceite en agua. CH2Ch se refiere a diclorometano, MeOH se refiere a metanol y DMSO se refiere a dimelilsulfóxido.

10 Tabla 1

Tabla 2

Tabla 3

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~ !!8"O_c(\) :¡::QlS!¡¡¡"O~E" ~" o S ~<3. 8....J ~ ¡::o..B ~ Cantidades formuladas ... o <:( o .!!Ló g <':l "Ul gQ)Q)_J 15Q) 8 CoC!.. 0..0 c-o.E c..Q)~~ J!l~• o BQ)~ o~• g() '6 o o"O m ._ ,ga-gEIllt E :::1.E(\)e-~ Co Q. o Q):g ~. o-~ >Q ¡ilo~ ~ ~~ "'~o o

2-1 2-2

20 mg 250 mg PLGA5-50 (100 mg) ~LGA5~~~1000 m 50.000 50.000 50150 SO/50 CH2~I(t mi)MeOH 05ml CH2CI~ \~O mi) MeOH 2ml 31 ,2 30,3 14,8 14,9

2-3 2-4

3320 mg 44 mg r,LGA5-;g)13300 m ~~GA~~,O200m 50.000 50.000 50/50 50/50 CH2Cb l \~32, 9 ~;)MeOH 53 1 mi CH2Cb (2 mi) MeOH (1 mi 31 ,7 35,0 16,5 16,4

2-5

35 mg PLGA5-50 (200 mal 50.000 50/50 CH2CI2 (2 mi) MeOH l1 mi 34,8 12,2

Ejemplo 1 Prueba de liberaciÓn in vitro

Se al'iadieron las microesferas producidas en el ejemplo de preparación 1 a un tampón fosfato 1115 M que contenía Tween 80 al 0,2% (p/v) (pH 7) de tal manera que se fijÓ la concentración del presente fármaco a 30 ~glml, después se dispersaron uniformemente mediante agitación con vórtex (10 segundos) y sonicación (20 segundos). Se dispensó la dispersión en porciones de 1 mi en recipinntes y se mantuvo en reposo en una incubadora a 3JOC. Se tomaron muestras de cada recipiente a lo largo del tiempo y se centrifugaron (12.000 rpm, 5 min.), se descartó el sobrenadante y se congeló el sedimento resultante o:m nieve carbónica-metanol y se secó a presión reducida. A continuación. se anadieron 500 111de acetonitrilo a e.stos sedimentos y se disolvieron las microesferas mediante tratamiento por ultrasonidos. A esta disolución se le al'iadieron y se mezclaron Intimamente 500 1.11 de disolución B de IS. A continuación, se pesaron 500 J.l1 de esta disolución mixta, se diluyeron con 500 J.l1de fase móvil (pH 3) Y se centrifugaron (12.000 rpm, 3 min .). tras lo cual se midió mediante HPLC la cantidad restante del fármaco presente dentro de las microesferas en 10 J.l1 del sobrenadante r,esuHante.

Se calcu ló la razón reslante (%) del presente fármaco tomando que la concentradón de fármaco cuando todo el fármaco habla eluido (30 J.lg/ml) era del 100%.

Tal como se mencionó anteriormente, en microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de dos semanas, se considera que se ha suprimido una ráfaga inicial si la razón reslante del fármaco tras una hora es de al menos el 90%. De manera similar, en microesferas que tienen un periodo de IiberaciOn lenta de cuatro semanas. se considera que se ha suprimido una ráfaga inicial si la razón restante del fármaco Iras un dia es de al menos el 82%.

Condiciones de HPLC

Aparatos: Cromatógrafo (Shimadzu LC-10AT; fabricado por Shimadzu Corporation), detector UV (Shimadzu SPD10A: Shimadzu Corpomtion), analizador de datos (Shimadzu C-R7A; Shimadzu Corporation).

Detección: UV -265 nm

Columna: SHISEIDO CAPCELLPACK C18 UG120 (4,6 mm de dj. x 150 mm); fabricada por Shiseido Co., Ud.

Temperatura de columna: temperatura constante próxima a 25°C

Fase mOvil: Acetonitrilo:agua:trietilamina = 1000:900:3 (se ajusta una disolución mixta de aguallrietilamina (900:3) a pH 3 con ácido fosfórico)

Veloddad de flujo: 1,0 mUmin.

S

Patrón intemo (IS): n-propilparabeno

MétOdo de preparación de la disolución B de IS

10

En primer lugar, se pesaron 100 mg del patrón interno y se llevaron a 100 mi con etanol. Entonces se llevaron diez mililitros de la disolución resultante a 100 mi con etanol. Volvieron a llevarse diez mililitros de la última disolución a 100 mi con etanol. Se usó la disolución resultante como disolución B de IS. A continuación en las tablas 5 a 8 se muestran los resultados calculados.

Tabla 5

Ejemplo de preparación

Razón restante %

comparativo

1 hora 6 horas 1 dla 4dias 7dlas 10 dlas 14 días 17 dlas

1-1

735 581 38,0 181 161 141 7,9 26

1-2

36,2 307 116 1.7 11 1,3 10 -

1-3

8,9 2,0 1,4 09 -- - -

1-4

45,2 417 47 8 -

1-5

52,8 40,5 46,9 - - --

1-6

540 469 50,5 - - -

1-7

SO,3 44,7 46,8 - -

Tabla 6

Ejemplo de preparación

RazÓn restante %

1 hora

6 horas

1 dla

7dlas

14 dlas

17 dlas

4 dlas

10 dlas

1-1

91 ,9

88 ,6

83,5

36,6

1-2

90,5

78 ,5

75 1

1-3

71 ,7

-

1-4

90,2

79,6

78 ,9

62,5

A partir de los resultados en la tabla 5, dado que las microesferas obtenidas en los Ejemplos de preparación comparativos 1-1 a 1·7 tenlan un pequeño tamaño do partlcula promedio y/o una alta raz6n de encapsuladón, en 15 cada caso, la razón restante del fármaco tras una horél fue inferior al 90%, lo que indica que se había prOducido una ráfaga inicial. En cambio, a partir de los resultados de la tabla 6, las microesferas obtenidas en los ejemplos de preparaciOn 1-1 a 1-4 tenlan una razOn restante del presente fármaco tras una hora de al menos el 90%, lo que indica que se habla suprimido una ráfaga inicial. Además, las microesferas obtenidas en los ejemplos de preparación 1-1 a 1-4 alcanzaron una liberaciOn sO!itenida del presente fármaco durante aproximadamente dos

20 semanas. Además, tal como puede observarse en la tigura 1, que muestra el transcurso a lo largo del tiempo de la razón restante del fármaco en el ejemplo de preparación 1-4, la razón restante del presente fármaco disminuye linealmente a lo largo del tiempo, lo que significa que se logra una liberación de orden cero.

Tabla 7

Ejemplo de preparación

RazOn restante %

comDarativo

1 hora

6 horas

1 dia

7dlas

14 dlas

21 días

28 días

35 días

2-1

60 4

37,7

2-2

43,2

81,5

-

-

2-3

59,2

45,5

-

-

2-4

40,6

47,6

53,8

-

-

2-5

-

-

-

2-6

43,3

-

2-7

41 ,3

·495

-

-

-

2-8

41 ,3

·495

-

Tabla 8

78,2 66,0 SO,1 10,1 4,5 2-4

2-3 90,7

89:8

2-5 935

A partir de los resultados en la tabla 7, dado que las microesferas obtenidas en los ejemplos de preparación comparativos 2-1 a 2-8 tenian un pequeno lamano d,e partícula promedio y/o una alta razón de encapsulación, la razón restante del presente fármaco tras un día fue inferior al 82% en cada caso, lo que indica que se habla producido una ráfaga inicial. En cambio, a partir de los resultados en la tabla 8, las microesferas obtenidas en los ejemplos de preparación 2-1 a 2-5 tenian una razón restante del presente fármaco Iras un día de al menos el 82%, lo que indica que se había suprimidO una ráfaga ¡nidal. Además, las microesferas obtenidas en los ejemplos de preparación 2-1 a 2-5 alcanzaron una liberación sostenida del presente fármaco durante aproximadamente cuatro semanas. Además, tal como puede observarse en la figura 2, que muestra el transcurso a lo largo del tiempo de la razón restante del fármaco en el ejemplo de prepamción 2-3, la razón restante del presente fármaco disminuye linealmente a lo largo del tiempo, lo que significa que se logra una liberación de orden cero.

Se encontró que las microesferas que tenian un periodo de liberación de dos semanas, al prepararse de modo que

(1) las microesferas tenian un tamano de particula promedio de desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 ¡.lm, (2) la cantidad de copolimero de ácido lácticcrlácido glic6lico en partes en peso del fármaco era de desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes. en peso y (3) el copolimero de ácido láctico/ácido glic6lico tenia un peso molecular promedio en peso de desde~ aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 20.000 y una razón de áddo láctico/ácido glicólico de aproximadamente SO/50, podian liberar el presente farmaco a una tasa constante. Además, se encontró que las microesferaa que tenian un periodo de liberación de cuatro semanas, al prepararse de modo que (1 ) las microesferas tenlan un tamatlo de particula promedio de desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 35 ¡.lm, (2) la cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glic6lico en partes en peso del farmaco era de desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8 partes en peso y (3) el copolimero de ácido lactico/ácido gtic61ico tenia un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 50.000 y una razón de ácido láctico/ácido glicólico de aproximadamente SO/50, podlan liberar el presente fánnaco a una tasa constante.

Ejemplo 2 Prueba de medición de la concentración en :sangre

A ratas Crl:CO macho (Sprague-Oawley) (SPF; CharlE$ River Japan; 8 semanas de edad) se les administraron por vía subcutánea las diversas preparaciones (microesfmas) moslradas en la tabla 9 a continuación a una dosis de 5 mllkg en condiciones no en ayunas. Usando tres animales de cada grupo (6 animales de cada uno de los grupos de prueba 5 y 6), se extrajeron aproximadamente 0,5 mi de sangre heparinizada en condiciones sin anestesia de la arteria carótida de la rata en diversos puntos de extracción de muestras de sangre (3 horas, 8 horas, 24 horas (1 día), 3 días, 7 dlas, 10 días, 14 días, 17 dias, 21 ellas, 24 dlas, 28 dias tras la administración). Se centrifugó la sangre así obtenida a 12.000 rpm durante 2 minutos y se recogió el sobrenadante como plasma.

Se llevaron a cabo mediciones de la concentración en sangre del presente fármaco en el plasma resultante mediante un método de CUEMIEM. El pretratamien'to del plasma consistió en atladir una disolución de patrón interno al plasma y diluir con agua, después cargar en una columna de cartucho de extracción en fase sOlida (DOSB) Y desproteinización aclarando con agua, seguido por elución con metanol, concentradón y secado hasta sequedad. Se disolvió el residuo así obtenido ai'iadiendo el 0,1% de ácido acético acuosolacetonitrilo, y se vertió la disolución resultante en el aparato de CUEMIEM.

Condiciones de HPLC

HPlC: Shimadzu 10A

Columna: CAPCELlPAK C18MG120 (2,0 mm de d.i. X 150 mm; 5¡.lm; Shiseido)

Fase móvil: el 0,1% de ácido acético acuosolacetonitrilo (50:50, %en volumen)

Velocidad de flujo: 0,2 ml/min.

Condiciones de EM/EM

EM/EM: API4000

Modo de ionización: ESI

Modo de polaridad de iones: positivo

Iones monitorizados:

Presente fármaco (ión precursor (miz)": 429,2; ión de producto (miz)·: 79,2)

Patrón interno (ión precursor (miz)": 445.4: ión de producto (miz)·: 168,1)

*: razón de masa con respecto a carga Tiempo de retención para el presente fármaco: 8,15 minutos Grupo de prueba 1: se administraron microesferas de la preparación de prueba 1 por vía subcutánea a una dosis del

presente fármaco de 10 mglkg.

Grupo de prueba 2: se administraron microesferas de la preparación de prueba 2 por vla subcutánea a una dosis del presente fármaco de 10 mg/kg. Grupo de prueba 3: administrado por vía subcutánea a una dosis del presente fármaco de 10 mglkg. Grupo de prueba 4: administrado por via oral a una dosis del presente fármaco de 10 mglkg. Se formularon las preparaciones de prueba usadas CCIO los grupos de dosis respectivos tal como se muestra en la

tabla 9. Se prepararon cada una de las preparaciones de prueba en general según el método descrito en el ejemplo de preparación 1. Tabla g

Cantidades formuladas

e

.8. 'OD ~~••~~ 00 ii:~

-g 281J_ C IV:¡:;<1I$lEC"1;)~ ...a o.$' <11 ce 'g~ ~ a9'E¡::a..J! (;¡.2 o ceo"S1J</lC:> ~~1tl~8.~ O-oeCQjEo.<1I1J .: (!):o O- o O1J J!! ._ ,g in.~ E IV 1:: E :f. EIVo~.~.t~ ·00 '0 ~ . e--o ª~N ~_ &' ~ e

o

1

3320 mg tlGA5-!,13300 m 50.000 50150 31 ,7 16,5

2

110 mg PlGA5-SO 20.000 SO/SO 28,6 16,3

(500 mal

En las tablas 10 Y 11 a continuación se muestra el cambio a lo largo del tiempo de las concentraciones en sangre del presente fármaco en cada uno de los grupos de pruebél.

Tabla 10

Grupo de

Concentración en san re del resente fánnaco n mi

prueba

3 horas 8 horas 1 dla 3dlas 7 días 10 días

1

27927 5791 011 2 SO 1 16 179

2

27480 8049 S25 397 2687 2795

14 dlas

17 días 21 dlas 24 días 28 dias

1

11 ,36 2183 089 20S 0,73

2

S 41 22S () 26 010 005

Tabla 11

Tal como resulta evidente a partir de los resultados anteriores, la administración subcutánea (grupo de prueba 3) y la administración oral (grupo de prueba 4) del presente ·ránnaco mostraron altas concentraciones en sangre desde 1 hora hasta 8 horas tras la administración; dos días tralS la administración, la concentración en sangre fue inferior a 0,2 ng/ml. En cambio, de las microesferas de la presente invención, en el grupo de prueba 1 que tenia un periodo de liberación lenta de cuatro semanas, la concentración en sangre del fánnaco se mantuvo de manera continua durante el periodo de desde 1 dla hasta 28 dlas tras la administración dentro de un intervalo de desde aproximadamente 0,7 ng/ml hasta aproximadamente 22 ng/ml. De mane'ra similar, en el grupo de prueba 2 que tenia un periOdO de liberación lenta de dos semanas, la concenlraciOn en sangre del fánnaco se mantuvo de manera continua durante el periOdO de desde 1 dla hasta 14 dias tras la administración dentro de un intervalo de desde aproximadamente 4 ng/ml hasta aproximadamente 30 ng/ml. Además, durante el periodo de medición, no se observó ningún signo indicativo de efectos secundarios (por ejemplo, diarrea, acción hipotensiva) en ninguno de los grupos de prueba.

Por tanto, de las microesferas mostradas en el ejempto 1 anterior, tanto las microesferas que tienen un periodo de liberación lenta de dos semanas como las microesfera!; que tienen un periodo de liberación lenta de cuatro semanas demostraron la capacidad de mantener de manera o:)Otinua una concentración en sangre suficiente para que se manifieste la acdón farmacológica del presente fármaco al tiempo que se evitan efectos secundarios.

Ejemplo 3 Efectos de promoción de la producción de SOF-1 y EGF del presente fármaco

Se obtuvo y se usó un kit de angiogénesis (Kurabo Industries lid.) compuesto por células endoteliales de la vena umbilical humanas normales y fibroblastos cutáneos humanos normales.

MétOdo de creCimiento

Usando una incubadora de dióxido de carbono (BNA-121 D) Y usando cultivo de angiogénesis 2 proporcionado con el kit de angiogénesis como cultivo liquido, se llevó a cabo el cultivo en un entamo húmedo a 3JOC con el 5% de dióxido de carbono/el 95% de aire.

Procedimiento de prueba

Inmediatamente Iras recibirse el kit, se cultivaron las células durante 3 horas, tras lo cual se sustituyó el cultivo I1quido y se continuó el cultivo. Tres dlas después de iniciar el cultivo, volvió a suslituirse el cultivo liquido. Seis dlas después de inidar el cultivo, se llevó a cabo el tratamiento con el presente fármaco sustituyendo el cultivo liquido. Se fijó la concentración de tratamiento a 100 nmolll en cada caso. Se llevó a cabo el tratamiento con DMSQ corno control negativo. Seis, 24, 48 Y 72 horas tras el tratamiento con el presente fármaco, se recogió el sobrenadante de cultivo y se proporcionó para la medición de los factores de crecimiento. Los factores de crecimiento medidos fueron EGF y SDF-1 .

Se midió el sobrenadanle de cultivo con los siguientes kits de EUSA

Inmunoensayo de EGF humano (R&O Systems Inc., DEGOO)

Inmunoensayo de SOF-la humano (R&D Systems Inc., OSAOO)

En la tabla 12 a continuación se muestran los resulta.:los de medición 72 horas Iras el tratamiento con el presente fármaco.

Tabla 12

Fador de crecimiento

GnJ o control de disolvente Iml Gru o de fármaco /mI

EGF

3830±423 4995 ±442

SDF-1

304±242 383:t 36 O"

": P < 0,05 (prueba de la t de Student)

Los resultados anteriores muestran que 72 horas tras el tratamiento con el presente fármaco, EGF y SDF-l hablan aumentado significativamente con respecto al grupo control de disolvente.

Por tanto, el presente fármaco demostró una actividad angiogénica y una actividad de promoción de la regeneración tisular basándose en estos efectos de promoción de la producción de factores de crecimiento.

Ejemplo 4. Investigación de efedos en un modelo de oclusión-desobliteración de la arteria carótida común (4-VQ)

1) Preparación de animales para el modelo de odusión-desobliteración de la arteria carótida común (4-VQ) en rata

A rotos Crlj:MI m3cho de nueve semanas de edad SEl les administró por vla intraperitoneal pentobarbital sódico y, mientras estaban baja anestesia, se fijaron en la posición decúbito plono a un instrumento de eslereotaxia cerebral. Se realizó una incisión occipital en la piel y la capa muscular de la región del cueno, se expUSieron los foramenes pterigoideos izquierdo y derecho de la primera vértebra cervical y se termocoagularon las arterias vertebrales insertando la punta de un soldador en cada foramEtn pterigoideo, ocluyendo asl permanentemente las arterias vertebrales bilaterales. A continuación, se realizó una incisión central en la región anlerior del cuello, se expusieron y se desprendieron las arterias carótidas comunes a ambos lados, se hizo pasar un tubo de silicona bajo las arterias y se colocó de manera anular alrededor de las arterias, tras lo cual se cosió la piel de la región del cuello. En el dla tras la cauterización de las arterias vertebrales, !ie anestesiaron los animales con dietil éter, despuéS se inmovilizaron en la posición decúbito supino. Se expusieron ambas arterias carótidas comunes usando el tubo de silicona que se habla colocado en las arterias cnrótidas comunes en la reglón del cuello y se ocluyeron temporalmente durante 10 minutos con pinzas Sugita, despues volvieron a abrirse. Aparte de isquemia y desobliteración, también se llevó a cabo el mismo procedimiento en un grupo normal (grupo de prueba 1).

2) Estudio histopatolOgico

Tras la isquemia y desobliteraciOn de cuatro punt!>s de las ralas, se proporcionó un periOdO de dosificación eSpecifico ele 8 dlas o 42 dlas 1" un periodo libre de férmaco (de al menos 2 semanas). Entonces se anestesiaron 10$ animales con pentobarbital sódico, se sometieron a pertuslón y se fijaron, en orden, con solución salina fisiológica, paraformaldehido al 4% y disoluciOn de Bouin, y se extirparon los cerebros. Se cortó tejido cerca del bregma, 3,3 mm, a partir del cerebro fijado en disolución de Bouin. Tras la deshidratación y la eliminación de cera, se incrustó

la muestra en parafina. Se prepararon cuatro secciones de 10 !-1m de grosor a partir del sitio bregma, aproximadamente 3,3 mm. Se midió el número de neuronas en CA1 en una de las secciones usando tinción de Nissl. Se tiM otra de las secciones con PCNA (microglia) y se tiM una tercera sección con GFAP (gl1a).

Prueba 1. Estudio sobre la administración subcutánea de prostaglandinas

Se investigaron los efectos de la administración subcutánea repetida de omoprostilo, PGE1.aCD y el presente fármaco, dos veces al dia durante 42 dlas tras la creación del modelo de 4-VO en rata (10 minutos de odusión y reperfusión), sobre el número de neuronas en la región de CA1 del hipocampo.

Los grupos consistieron en un grupo normal (grupo de prueba 1, evaluado tras recibir medio durante 42 dlas), grupos control (grupo de prueba 2, evaluado tras recibir disolvente durante 8 dias; grupo de prueba 3, evaluado tras recibir medio durante 42 días), presente fármaco (grupo de prueba 4, administrado repetidamente por vía subcutánea 10 mg/kg dos veces al dia durante 42 días), ornoprostilo (grupo de prueba 5, administrado repetidamente por via subcutánea 0,1 mglkg dos ve,ces al dla durante 42 dlas) y grupos de prostaglandina E1 (PGE1.aCD) (grupo de prueba 6, administrado repetid~lmente por via subcutánea 1,5 mg/kg dos veces al dia durante 42 días; grupo de prueba 7, administrado repetidamente por vía subcutánea 3 mg/kg dos veces al día durante 42 días). La dosis de PGE1.aCD es la dosis como PGE1. El presente fármaco y ornoprostilo se fijaron cada uno a la dosis máxima a la que no se muestra acción hipotensi\Ia.

Evaluación: Tras 8 dlas en el grupo de prueba 2, y tréls 42 dlas en los demás grupos de prueba, se sometieron los cerebros a perfusión y se fijaron, después Se til'leron con Nissl, se tiñeron con H-E o se ti"eron con GFAP, y se contó el número de neuronas en la región CA1 del hipocampo. (Se contó el número de neuronas en 10 lugares en cada una de las regiones CA1a, CA1 b Y CA 1 c, yen 20 lugares en los lados izquierdo y derecho fotografiando cada lugar y contando el número de neuronas maduras con un analizador de imágenes (Win ROOF V3,6; Mitani Corporatíon».

A continuación en la tabla 13 se muestran los resultados obtenidos con la tindón con Nissl.

Tabla 13

Grupo de prueba

Numero de neuronas por unidad de longitud recuento/mm)

1

Iz uierda L 922±191 Derecha R 96,4±169

2 3

432##±12,8 587## ±204 330##±132 547##±295

4

134-4*" ± 2.5 7 123,8*-± 30 9

5 6 7

134,6"* ± 3·2 7 105,7±240 1462·· ± 3'09 6 1411*" ± 17 8 1147··±220 1276··±388

##: P < 0,01 frente al grupo de prueba 1 (prueba de DLlnnett)

., **: P < 0,05, P < 0,01 frente al grupo de prueba 3 (prueba de Dunnett)

Se administraron el medio, el presente fármaco, PGE\.aCD y omoprostilo por vla subcutánea una vez inmediatamente tras la isquemia y reperfusión de 4-VO, y dos veces al dla desde el día 1 hasta el día 8 de la isquemia o desde el dia 1 hasta el dla 42 de la isquemia.

Tras 8 días o 42 días, se sometió el cerebro a perfusión y se fijó, tras lo cual se midieron los números de neuronas piramidales en la región CA1 del hipocampo izquierda y derecha por medio de tinción con Nissl.

Como resultado, con respecto al grupo normal (grupo de prueba 1), en la isquemia y desobliteración (4-VO), las neuronas de la región CA1 del hipocampo mostraron una disminución significativa en el día 8 (grupo de prueba 2) y el número de células no aumentó incluso tras 42 días (grupo de prueba 3). En cambio, en el día 42 de la isquemia,

las adminístraciones subcutáneas del presente fármaco, ornoprostilo y PGE1 .aCD (tanto a 1,5 mglkg como a 3 mg!kg) mostraron todas un aumento significativo en el número de neuronas piramidales de CA 1 del hipocampo con respecto al grupo al que se le administró el medio (grupo de prueba 3). Se confirmó que la administración de cada una de las sustancias de prueba tenia una acción de prevención de la neuropatla y/o una acción que promovla la regeneración de neuronas.

Prueba 2. Estudio de la administración oral repetida de·1 presente fármaco

Se confirmó la acción de promoción de la regeneración de neuronas mediante la administración oral repetida dos veces al día del presente fármaco tras un trastorno. y se investigaron los efectos de tal administración sobre el deterioro en el aprendizaje del laberinto de agua.

Grupos: Cada grupo consistía en n=12 animales

(1) EvaluaciOn del número de neuronas en la regiOn CA l del hipocampo cortada del cerebro

Grupo de prueba 1: 4.vO + medio, 8 días

Grupo de prueba 2: 4-VO + presente fllnnaco, 10 mglkg, dos veces al dla, durante 8 días

Grupo de prueba 3: 4-VO + presente fánnaco, 1 mglkg, dos veces al dla, durante 42 dias (s610 evaluaciOn del número de neuronas)

(2) Evaluación del numero de neuronas en la región CA1 cortada del cerebro (grupos 4 a 7) Iras la medición de la capacidad de aprendizaje del laberinto de agua (grupol> " a 7)

Grupo de prueba 4: noOllal (grupo simulado) + medio, 42 dlas (control noOlla])

Grupo de prueba 5: 4NO + medio, 42 días (control de disOlvente)

Grupo de prueba 6: 4-VO + presente famaco, 10 mglk!~, dos veces al dla durante 42 días

Grupo de prueba 7: 4-VO + disolvente durante 8 dias + presente fármaco, 10 mglkg, dos veces al día, durante 34 dlas (evaluaci6n de actividad regenerativa)

(3)

Patologla: Se lIev6 a cabo la perfusi6n y la fljacl6n del cerebro en el dia 8 en los grupos de prueba 1 y 2, Y en el dla tras la prueba de capacidad de aprendizaje del laberinto de agua en los grupos 4 a 7. Entonces se cont6 el numero de neuronas mediante el mismo método que el descrito anteriormente en la prueba 1. En el grupo de prueba 3, tras detenerse la administración de fármaco, se fijaron los cerebros al mismo tiempo que en los grupos de prueba 4 a 7.

(4)

Medici6n de la capacidad de aprendizaje del laberinto de agua

Usando los grupos de prueba 3 a 7. se investigaron las funciones motrices con un laberinto de agua de Monis de tal manera que se evit6 el sesgo entre los grupos.

Aparato para someter a prueba la capacidad de aprendizaje del laberinto de agua

Se usaron una plataforma acrilica transparente (aproximadamente 12 cm de diametro y aproximadamente 30 cm de altura) que no puede detectarse visualmente y una pIScina circular (aproximadamente 148 cm de diametro y aproximadamente 44 cm de allura) fabricada de clorurQ de vinilo gris y llena de agua (temperatura del agua, de 17 a 18°C) hasla una altura de aproximadamente 32 cm de 'modo que la plataforma quedaba oculta por el agua.

Se dividi6 la piscina en cuatro cuadrantes, se c;01oc6 la plataforma en el centro del cuarto cuadrante (aproximadamente 36 cm desde el centro de la piscina) y se colocaron bombillas en el perlmetro de la piscina para proporcionar una referencia espacial.

Medición de ensayos de adquisici6n de aprendizaje del laberinto de agua

Tras la dosis de fármaco final, se proporcion6 un periodo libre de fármaco de al menos 2 semanas, tras lo cual se colocó la rata en la piscina desde uno de varios punto~i A a E con su cabeza dirigida a la pared de la piscina circular y se midi6 el tiempo que tardO en alcanzar la plataforma (latencia de Objetivo; segundos) con un cronOmetro (el tiempo de medici6n fue un máximo de 90 segundcIs). Cuando la rata alcanz6 la plataforma en un plazo de 90 segundos y permaneci6 sobre la plataforma durante 30 segundos, se consideró que era consciente de la ubicación de la plataforma y se termin6 la medidOn. A las ratas que no alcanzaron la plataforma se les asigno una lalencia de objetivo de 90 segundos.

Se llevaron a cabo mediciones de latencia de objelivo dos veces al dia (una vez por la maflana y una vez por la tarde) en los dias 1 a 4. Se colOCO la rata en la piscina desde los diversos puntos A a E con su cabeza dirigida a la pared de la piscina drcular. Se registró el trayecto de nado de la rata con un monitor de TV con una cámara de vIdeo instalada sobre la piscina y se analizaron el tiempo de nado, la distanda reoonida y el numero de pases con un analizador de movimiento de imágenes de vídeo (SMART, Panlab). Además, se registraron los movimientos de nado usando un grabador de video en OVO. En las tablas 14 a 17 a continuaci6n se presentan los resultados.

1) Numero de neuronas en la regi6n CAl del hipocampo de 10$ grupos de prueba 1 '12

Tabla 14

Grupo de prueba

Numero dH neuronas or unidad de Ion itud recuento/mm

Iz uier.da l

Derecha R

1

1103 ±601 2005±3900

2

90,97"*:t 53 70 8970.... ±5189

H: P < 0,01 frente al grupo frente al grupo de prueba 1 (prueba de Dunnelt)

Tal como resulta evidente a partir de los resultados anteriores, la administración oral tras la isquemia y reperfusión en el grupo de prueba 2 ya mostró en el dia 8 una supresión significativa en la disminución del número de neuronas en la región CAl del hipocampo con respecto al grupo de prueba 1, confirmando por tanto la existencia de una actividad de prevención de neuropatla.

2) Número de neuronas en la región CA1 del hipocampo de los grupos de prueba 3 a 7

Tabla 15

H: P < 0,01 frente al grupo de prueba 4 (prueba de la t de Aspin-Welch o prueba de la t de Student)

#: P < 0,05 frente al grupo de prueba 5 (prueba de la t de Aspin-Welch)

aa: P < 0,01 frente al grupo de prueba 5 (prueba de Dunnetl)

+: P < 0,1 frente al grupo de prueba 5 (prueba de la t de Student)

El grupo al que se le administró el medio (grupo de prueba 5, tras 42 dlas en un modelo de 4-VO) mostró una disminución significativa del número de neuronas en CA1 del hipocampo con respecto al grupo normal (grupo de prueba 4). En cambio, la administración oral del preSE!nte farmaco a un nivel de 1 mglkg (grupo de prueba 3) y un nivel de 10 mglkg (grupo de prueba 6) mostraron auml~ntos significativos del número de neuronas en la región CA1 del hipocampo con respecto al grupo de prueba 4. AdBmas, se sabe que, en este sistema de evaluación, la muerte de neuronas en la región CA1 del hipocampo e~; completa tras aproximadamente 5 dlas de isquemia y desoblileraciÓn. Incluso cuando se administró medio hasta el dla 8 y se administraron repetidamente por vla oral 10 mglkg del presente farmaco durante 34 días comenzando en el dla 9 (grupo de prueba 7), se observó una tendencia de aumento en el número de neuronas en la región CAl del hipocampo, Por tanto, ademas de una actividad de protección de neuronas, se confirmó que el presente farmaco tenia una actividad de promoción de la regeneración de neuronas,

3) Medición de la capacidad de aprendizaje del laberinto de agua

(1) Tiempo hasta que la rata alcanza la plataforma (latencia de Objetivo, segundos)

Tabla 16

Latencia de ob'etivo undos Ensa os de adquisición

~ .r--------,----~~~~~~~,~~----,_------~

0-"

.~

E 'c

~CII

276:1:241

425:1:123 2895:1:889 122,9:1:383

4 12

669:1:160 47,7:1:27,5 280:1:209

76,6±20,7 65,9±21,1 538±240

376±223

585±1624057###±1157

176,8±505

5 16

1529±427

6 12

718±183 588±221 413:1:288

339±232

515±119 3583*±899

1469 ±40,5 73,8±152 554±296 417:1:267

258:1:152

492±10,1 3384"*±808

7 12

Los valores en la tabla indican la media ± desviación estandar,

###: P < 0,01 frente al grupo 4

., **: P < 0,1, P < 0,05 frente al grupo 5 (analisis de dO$ factores de la varianza (8 ensayos»

(2) Distancia recorrida hasta que la rata alcanza la plataforma

Tabla 17

o o~Jl ~ o e-S S :Q :Q ti) :Q

!lo o~ -¡ N'5 .-¡¡

,2 o., -¡¡

E--• o

i5~ .::J ~ .. E -E ~l .. E il'.E

z 00 O o o e

°e °e w _

~ ~ e e e ~

Los valores en la tabla Indican la media i desviación estándar.

###: P < 0,01 frente al grupo 4

•• : P < 0,05 frente al grupo 5 (análisis de dos faclores ele la varianza (6 ensayos»

El grupo control de disolvente (grupo de prueba 5) mostró una prolongación significativa en la latencia de objetivo (segundos) y la distancia recorrida con respecto al grupo normal (grupo de prueba 4) en los ensayos de capacidad de aprendizaje del laberinto de agua. Tanto el grupo él! que se le administraron por vla oral 10 mglkg, dos veces al dla, del presente fármaco (grupo de prueba 6) como 9'1 grupo al que se le administró el medio hasta el dla 8 '1 se le administraron por vla aralia rnglkg, dos veces al dla, del presente fármaco comenzando en el dla 9 (grupo de prueba 7) mostraron una reducción significativa de la latencia de objetivo (segundos) y la distancia recorrida en los ensayos de capacidad de aprendizaje del laberinto de agua con respecto al grupo control de disolvente (grupo de prueba 5) (prueba: análisis de dos factores de la varianza; 8 ensayos).

Por tanto, se confirmó que el presente fármaco, al mostrar una actividad de protección de los nervios y una actividad de promoción de la regeneración de neuronas endógenas, no sólo aumenta el número de neuronas, sino que también ayuda en la recuperación de discapacidades en la función del aprendizaje asociadas con la neuropatla.

Prueba 3. Estudio de una única administración subcutánea de microesferas de la presente invención; estudio de la actividad de promoci6n de la regeneración de neurona:s y efectos sobre farmacologla del comportamiento

(1) Influencia sobre el número de neuronas en la región CAl del hipocampo

Este estudio se realizó de la misma manera que en la prueba 1 y se evaluaron los resultados basandose en el número de neuronas en CA 1 del hipocampo.

En un modelo de 4-VO en rata, tras 10 minutos de odusión y reperfusi6n, se administraron por via subcutánea sólo uno vez las microesferas producidas en el ejemplo de preparación 2_2 y se evaluó la influencia sobre el número de neuronas en la región CAl del hipocampo 42 dias después. La dosis indica la cantidad del presente fármaco incluida en las mlcroesferas. Las dosis de PLGA.ME en los grupos de prueba 1 y 2 fueron las mismas que en los grupos de prueba 3, 5, 6 Y 7.

En la tabla 18 a continuación se muestran los grupos.

Tabla 18

7

Microesferas producidas en el 10 rnglkg (una única administración subcutánea 6

ejemplo de preparación 2-2 (para e)medir ,. cinética en

justo después de la isquemia y reperfusión)

sangre

S

Grupo de prueba 1: Grupo normal (grupo simulado); a ralas normales en las que se realizó una cirugía simulada se les administró una única administración subcutánea de PlGA.ME solo como control negativo.

Grupo de prueba 2: Grupo control de disolvente; a ratas 4I-VO se les administrO una unica administración subcutánea de PLGAME solo como control negativo.

Grupo de prueba 3: las mlcroesferas producidas en el ejemplo de preparación 2-2 se administraron por vla subcutánea una vez (10 mglkg) justo después de la isquemia y reperfusión 4-VO.

Grupo de prueba 4: Las microesferas producidas e,n el ejemplo de preparación 2-2 se administraron por vla subcutánea una vez (30 mglkg) justo después de la isq¡uemia y reperfusión 4-VO.

Grupo de prueba 5: Las microesferas producidas en el ejemplo de preparaci6n 2-2 se administraron por vla subcutánea una vez (10 mglkg) 48 horas tras la isquemia y reperfusión 4-VO.

Grupo de prueba 6; Las microesferas producidas en el ejemplo de preparaci6n 2-2 se administraron por via subcutánea una vez (10 mglkg) 7 dias Iras la isquemia y reperfusi6n 4-VQ.

Grupo de prueba 7: (uso para medición de la concentración en sangre) Las microesferas producidas en el ejemplo de preparación 2-2 se administraron por via subcutánea una vez (10 mglkg) justo después de la isquemia y reperfusión 4-VO (como en el grupo de prueba 3).

Tras 42 dias, se sometieran los cerebros de rata a perfusi6n y se fijaron, tras lo cual se tiñeron con Nissl las neuronas piramidales de las regiones CA1 del hipOCélmpo izquierda y derecha y se determinaron los números de neuronas en las regiones CAl del hipocampo (se contó el número de neuronas en 10 lugares en cada una de las regiones CA1a, CA1b y CA1c y en 20 lugares en los lados izquierdo y derecho usando un analizador de imágenes). los resultados se muestran en la tabla 19.

Como resultado, el grupo control (grupo de prueba 2) mostró una disminución significativa en el número de neuronas piramidales en CA 1 del hipocampo con respecto al grupo normal (grupo de prueba 1) Y se encontró que todos los grupos a los que se les administraron por vla subcutánea las microesferas de la Invención (grupos de prueba 3 a 6) tenian un número significativamente aumentado de neuronas piramidales en CAl del hipocampo con respecto al grupo control (grupo de prueba 2).

Tabla 19

Grupo de prueba

Número de neuronas or unidad de Ion itud recuentolmm

Izquierda (l

Derecha R

1

1753:1: 14.0 1797:1:118

2

91##:1:32 91##:1:2,9

3

25,6"" :1: 14,0 28,7**:1: 15 9

4

341**:1:167 311**:1:245

5

47.2 :t 33 2 48. :t 38.3

6

47,7 :1:416 517 :1:417

los valores en la tabla indican la media:l: desviadón estándar.

##: p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Aspin-Welch)

*, ..: p < O,OS, p < 0,01 frente al grupo 2 (prueba de Dunnetl)

+, ++; p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 2 (prueba de la t de Aspin-Welch)

A partir de los resultados anteriores. se confirm6 que una única administración subcutánea de las microesferas de la invención (grupos de prueba 3 a 6) tenia una excelente actividad de prevención de neuropatia y/o actividad de promoción de la regeneración de neuronas. Además, induso con una única administración subcutánea tras 7 dlas en el grupo 6, et número de neuronas aument6 significativamente con respecto al grupo 2, demostrando la presencia de una acción de promoción de la regeneración de neuronas.

2) Prueba de respuesta a evitación pasiva

Se usó un aparato de respuesta de evitación pasiva dE! tipo de paso a través (SHOCK SCRAMBLER. Takei Sclentlfic Instruments Co., lid.). El aparato tenia, divididas por una puerta de guillotina central, una sala iluminada (260 0N) x 110 (D) x 290 (H» y una sala a oscuras (320 0N) x 320 (O) x 340 (H» que confiere un estimulo eléctrico desde una

rejilla en el suelo. Se colocó una rata en la sala iluminada, se abrió silenciosamente la puerta de guillotina y se midió el tiempo que transcurrió desde que la rala examinó la apertura hasta que entró en la sala a oscuras (latencia de respuesta). En ruanto la rala entró en la sala a oscuras, se cerró la puerta de guillotina y se aplicó un estímulo eléctrico (1 mA, 3 s, método alealorizado). Esto constituyó un ensayo de adquisición, Se llevó a cabo el ensayo de adquisición dos días antes de la extirpación del cerebro:). Se llevó a cabo un ensayo de retención un día después del ensayo de aprendizaje. Como en el ensayo de adquisición, se colocó la rala en una sala iluminada, se abrió silenciosamente la puerta de guillotina y se midió el tiempo que transcurrió desde que la rata examinó la apertura hasta que entró en la sala a oscuras (latencia de respuesta). Se fijó la latencia de respuesta del ensayo de retención a un máximo de 600 segundos. A continuación en la tabla 20 se muestran los resuHados.

Tabla 20

Los valores en la tabla indican la media ± desviación estándar.

#: p < 0,05 frente al grupo 1 (prueba de Witcoxon)

*: p < 0,05 frente al grupo 2 (prueba de Wilcoxon)

El grupo de prueba 2 tenia, con respecto al grupo de prueba 1, una latencia de respuesta en el ensayo de retención acortada, lo que indica que había surgido una discapacidad de la memoria/aprendizaje. Por otro lado, los grupos de prueba 3 a 6 mostraron, con respecto al grupo de prueba 2, una latencia de respuesta en el ensayo de retención prolongada. En particular, el grupo de prueba 5 mostró una prolongación significativa en [a latencia de respuesta.

Por tanto, las microesferas de la presente invención demostraron una actividad de prevenCión de neuropatla y/o una actividad de promoción de la regeneración de neuronas, y por lanto se confirmó que ayudaban en la recuperación funcional de neuropatía.

A partir de los resultados anteriores, con respecto a la administración subcutánea repetida del presente fármaco (prueba 1) Y a ta administración oral repetida del presente fármaco (prueba 2), se encontró que una única administración subcutánea de las microesferas de la invención (grupos de prueba 3 a 6) tenia, en cuanto a eficacia, seguridad, dosificación acumulativa del presente fármaco y cumplimiento con la dosis, excelentes actividades de prevención de neuropaUa y de promoción de la regen,eración de neuronas, y se confirmó la recuperación funcional de trastornos de la memoria y del aprendizaje.

3) Medición de la concentración en sangre

Usando muestras del grupo de prueba 7, la figura a muestra resultados que ilustran la cinética en sangre del presente fármaco. El procedimiento fue el mismo que el usado en el ejemplo 2.

A partir de lo anterior se confirmó, en ratas 4-VO, que la concentración en sangre del presente fármaco se mantiene de manera continua en un intervalo de desde 0,1 hasta 10 ng/ml durante un periodO de cuatro semanas comenzando 24 horas tras una única administración subcutánea de las microesferas de la presente invención.

lo anterior sugiere que las microesferas de la invención, dado que tienen una actividad de promoción de la regeneración de neuronas, son útiles para prevenir y/o tratar enfermedades de degeneración de los nervios, y particularmente ictus.

Ejemplo 5 Influencia sobre la velocidad de conducción nerviosa en un modelo de diabetes inducida por STZ

1) Preparación de animales para modelo de diabetes inducida por 8TZ

A ratas Sprague-Dawley hembra (de 8 a 11 semanas de edad; Japan SlC, Inc.) se les administraron por via intraperitoneal 40 mglkg de un tampón citrato (pH, aproximadamente 4,5) de estreptozotocina (8TZ; Sigma). A un grupo control normal sólo se le administró por vla intraperitoneal el tampOn citrato.

2) Medición de la glucemia

Dos semanas tras la administración de STZ, se midiemn la glucemia, la velocidad de conducción nerviosa y el peso corporal, se dividieron los animales en grupos de manera uniforme para estas propiedades, y se comenzó la administración de la sustancia de prueba. Para determinar el cambio a lo largo del tiempo en la glucemia, se midió el

nivel de glucemia 4, 8 Y 12 semanas tras el inicio de la administración de la disolución de prueba (en el dia antes de la medición de la velocidad de conducción nerviosa). Se midió el nivel de glucemia de sangre extralda de la vena caudal usando un analizador de glucemia (Anlsense 11; Bayer-Sankyo). Tras la medición de la glucemia 12 semanas después, se privaron los animales de alimentos durante al menos 16 horas y se midieron el azucar y la insulina en sangre en ayunas. Ademas, se llevó a cabo una prueba de tolerancia a 2 9 de glucosa en la que se extrajo sangre de manera similar 30, 60 Y 120 minutos tras la carga con azúcar y se midieron los valores de azúcar e insulina en sangre.

3) Medición de la velocidad de conducción nerviosa

Dos semanas tras la administración de STZ, y 4, 6 Y 12 semanas tras el inicio de la administración de la disolución de prueba, se anestesiaron los animales medlanlo la administración intrapentoneal de 30 a 45 mglkg de pentobarbital. Se retiró pelo de la región dorsolumbar de la rata y se inmovilizó el animal en la posición deaJbilo prono, Iras lo cual se insertó un electrodo de aguja para la estimulación distal (NEC Medical Systems) cerca del nervio ciético, se insertó un electrodo de aguja para la estimulación proximal cerca del tendón de Aquiles en el mismo lado y se insertó un electrodo de aguja de registro (NEC Medical Systems) en el músculo plantar en el mismo lado. Tras comprobar que la temperatura corporal estaba en un intervalo 37 a 38°C, se aplicó una estimulación con ondas cuadradas (0,5 Hz, 0,1 mseg, tensión inferior a la méxima) a los electrodos de estimulación distal y proximal usando un estimulador eléctrico (SEN-3301; Nihon Kohden Corporation). Se condujo hacia fuera el potencial provocado a través de un electrodo de medición, se introdujo a través de un amplificador bioeléctrico (AB-621G, Nihon Kohden Corporatlon) a un programa de calculo del promedio de electromiograma provocado (MTS50061 C, Medical Try System) y se calculó el promedio diez veces, y se calculó la velocidad de conducción nerviosa a partir de los tiempos de conducción distal y proximal respectivos y las distancias de intervalos entre electrodos. Se llevó a cabo la medición en la pala izquierda (lado tratado) y 101 pata derecha (lado no tratado) en cada grupo de prueba y se usaron los valores promedio respectivos de las mismas como datos.

4) Método de agrupamiento

En los grupos 2 a 5, se midió el nivel de glucemia con alimentación dos semanas tras la administración de STZ. De las ratas con niveles de glucemia superiores a 300 mgldl, se excluyeron las ratas con diabetes intensa de las mismas y se usaron las ratas restantes como animales de modelo de diabetes. Se formaron grupos de tal manera que se prepararon los grupos respectivos de manera uniforme con respecto a la velocidad de conducción nerviosa, el nivel de glucemia y el peso corporal.

5) Método de administración

Se llevó a cabo la administración segUn la vla prevista de administración para su uso dlnico. En el grupo de prueba 3, se llevó a cabo la administración forzada por via oral usando un cilindro de jeringa desechable y una sonda géSlrica para ratas. En el grupo de prueba 4, se nevó.3 cabo la administración intramuscular de manera uniforme en cuatro lugares dentro del músculo a lo largo del nervio ciétlco en la parte femoral de la pata izquierda. Para la administración subcuténea en el grupo de prueba 5, se anestesiaron los animales con éter y se llevó a cabo la administración subcutánea en la región dorsal usando un cilindro de jeringa desechable y una aguja de jeringa 25G desechable. Se calculó el volumen de disolución administrado baséndose en el Último peso corporal.

6) Grupos

A continuación en la tabla 21 se muestra la composición de los grupos.

Tabla 21

Gru ode rueba 1 2 3 4 5

Sustancia administrada normal (medio) Control de disolvente Presente fármaco Mlcroesferas producidas en el ejemplo de preparación 2-2 Microesferas producidas en el ejemplo de oreoaración 2·2 Dosis/método de administración O rnglkg (administración intramuscular Intermitente administr~~ una vez cada 3 semanas O rnglkg (administración intramuscular intermitente administrada una vez cada 3 semanaS} . 3 mglkg (administración ~~I repetida dos veces al dla 10 mglkg (administradón intramuscular intermitente administrada una vez cada 3 semanas) 10 mglkg (administración subcutánea Intermitente administrada una vez cada 3 semanas) Número de animales 10 10 10 10 10

la cantidad de microesferas administrada indica la cantidad del presente férmaco ind uida. la cantidad de

microesferas que no contienen el presente fármaco en el grupo de prueba 2 fue la misma que la cantidad de microesferas administradas a los animales en los grupos de prueba 4 y 5.

7) Transcurso en el tiempo del nivel de glucemia A continuación en la tabla 22 se muestra el cambio a lo largo del tiempo del nivel de gtucemia en cada grupo de prueba.

Tabla 22

lOA partir de los resultados en la tabla 22, el grupo de prueba 4 mostró una disminución significativa de la glucemia

Los valores en la tabla indican la media ± desviación e:stándar. # , ##: p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Welch) ., •• : p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 2 (prueba de la t de Student)

tras cuatro semanas con respecto al grupo de prueba 2. De manera similar, los grupos de prueba 4 y 5 mostraron disminuciones significativas de la glucemia tras 8 semanas y 12 semanas con respecto al grupo de prueba 2. No se observó una disminución significativa de la glucemia en ninguno de los momentos en el grupo de prueba 3.

8) Velocidad de conducción nerviosa en el lado izquierdo (lado tratado con fármaco)

La tabla 23 a continuación muestra el transcurso a lo largo del tiempo para la velocidad de conducción nerviosa en la pata izquierda (lado tratado con fármaco en cuatro grupos) en los grupos de prueba respectivos.

Tabla 23

Grupo de prueba

Velocidad de conducción nerviosa mis)

1 2

°semanas 42 3±53 37,B ±51 4-semanas 424± 39 387#± 32 B semanas 426±37 38 6## ± 3,0 12 semanas 493±29 412#±1,B

3 4

375±8,0 37,1 ± 5,4 :378±38 :~9 8 ± 3,6 40,8±34 43,4.... ± 3 6 431*±19 46,2** ± 2,2

5

353±4,5 :379±27 417*±2 7 442*" ±2 1

Los valores en la tabla indican la media ± desviación e:stándar.

#, ##: p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Student)

., .*: p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 2 (prueba de la t de Student)

A partir de los resultados en la tabla 23, el grupo de prueba 2 mostró una disminución significativa de la velocidad de conducción nerviosa tras 4 semanas, B semanas y 12. semanas con respecto al grupo de prueba 1, confirmando la aparición de neuropaUa diabética. En cambio, los grupos de prueba 4 y 5 mostraron aumentos significativos en la velocidad de conducción nerviosa tras 8 semanas con respecto al grupo de prueba 2, y los 9rUPOS de prueba 3, 4 Y 5 mostraron aumentos significativos de la velocidad de conducción nerviosa tras 12 semanas con respecto al grupo de prueba 2, aunque este ültimo efecto fue mejor en los grupos de prueba 4 y 5 que en el grupo de prueba 3. Estos resultados demuestran la utilidad del efecto de mantenimiento de la concentración de fármaco en sangre. Tras 8 semanas y 12 semanas, el efecto de aumento de la velocidad de conducción nerviosa en el grupo de prueba 4 fue mejor que en el grupo de prueba 5, confirmando que la administración local en el sitio de enfermedad es más ülil que la administración sistémica.

9) Velocidad de conducción nerviosa en el lado derecho ~ado no tratado con fármaco)

la tabla 24 a continuación muestra el transcurso a lo largo del tiempo para la velocidad de conducción nerviosa en la pala derecha (lado no tratado con fármaco) en los grupos de prueba respeclivos.

Tabla 24

Grupo de prueba VeloGidad de conducción nerviosa (mIs)

1

o semanas 43,2±46 4 semanas 46,5±78 8 semanas 429±29 12 semanas 480±29

2 3

382#±45 38,7 ± 5,0 394# ± 3,0 ~!9 O± 2,3 377##±30 399±2,2 405#±3,1 413±2,1

4 5

386±63 36,5 ± 3,8 ~!94±37 ~!9,3± 4,3 408·±31 41,0· ± 3,1 417±3,2 438-±1,9

lOA partir de estos resultados, la administración intermitente de las microesferas de la invención proporcionó una

los valores en la tabla indican la media ± desviación estándar.

#, ##: p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Student)

-

: p < 0,05 frente al grupo 2 (prueba de la t de Student)

A partir de los resultados en la tabla 24, el grupo de prueba 2 mostró una disminución significativa de la velocidad de conducción nerviosa tras O semanas, 4 semanas, 8 ~;emanas y 12 semanas con respecto al grupo de prueba 1, confirmando la apariCión de neuropalla diabética. En cambio, los grupos de prueba 4 y 5 mostraron tendenCias de aumento significativas de la velocidad de conducción nerviosa tras 8 semanas y 12 semanas con respecto al grupo de prueba 2, siendo los efectos sustancialmente iguélles en ambos (grupos 4 y 5). No se confirmó un efecto de prolongación significativo en ninguno de los momentos en el grupo de prueba 3.

cinética en sangre continua con respecto a la administración oral repetida dos veces al día en el grupo de prueba 3, y por tanto se confirmó que era útil en cuanto a eficacia, seguridad, dosificación total y cumplimiento con la dosis. Además, en la administración intermitente de las microesferas de la invención, dado que la inyección intramuscular en el sitio de enfermedad (grupo de prueba 4) era más eficaz que la administración sistémica por vla subcutánea en la región dorsal (grupo de prueba 5). se confirmó lél utilidad de mantener una alta concentración del presente fármaco en el sitio de enfermedad.

10) Acción de mejora de la nefropatía

En la semana 12 desde el inicio de la administración de la sustancia de prueba, se transfirieron las ratas a una jaula metabólica, se les administró agua a voluntad y se recogió la orina durante 24 horas. Tras la medición de la descarga urinaria, se centrifugó la orina (1500 rpm, 25°C, 10 minutos) con una centrifugadora y se recogió el sobrenadante. Usando el analizador clínico 7170 (Hita.chi, Lid.), se midieron las proteínas urinarias totales (método de rojo de pirogalol), creatinina (método de creatinasa/F-DAOS) y azúcar en orina. La tabla 25 a continuación muestra la descarga urinaria total, la creatinina en orina total, las protelnas totales y la excreción de glucosa calculada a partir de los resultados medidos (concentra.ciones).

Tabla 25

Grupo total

Excreción total (mg!24 h)

Glucosa

Creatinina Protelnas totales

1

32±28 8031 ±5765 26,5 ± 26 7

2

139397## ± 86550 14705## ± 137 74 2169#±3706

3

111174 ± 40497 11676 ±5815 2457±2319

4

114850 ± 54081 9926±4991 104 O ±40 7

5

124280 ± 50604 156,92 ± 135,34 169,6 ± 150,2

los valores en la tabla indican la media ± desviación estándar.

#, ##: p < 0,05, p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Aspin-Welch)

A partir de los resullados en la labia 25, la glucosa en orina, la creatinina y las proteínas tolales aumentaron en el grupo de prueba 2 con respecto al grupo de prueba '1, 10 que indica la apariCión de nefropaUa diabética. Por otro lado, en los grupos de prueba 4 y 5, se observaron tendencias de disminución en la creatinina en orina total, azUcar y excreción de proteínas totales con respecto al grupo de prueba 2, lo que indica una tendencia de mejora en la función renal.

11) Prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT)

Trece semanas tras el inicio de la administración de la sustancia de prueba, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGIT) con ratas sometidas a ayunas durante 18 horas. Tras extraer sangre de la vena caudal de las ratas en ayunas, se alimentaron a fuerza por via oral 2 g1kg de glucosa. Se extrajeron de manera similar aproximadamente 500 ~I de sangre de la vena caudal :30. 60 y 120 minutos tras la administración de glucosa. de los cuales aproximadamente 400 j.ll se trataron con EDTA··2Na, después se centrifugaron (3.000 rpm, 4°C, 10 min.) con una centrifugadora. De este modo se recogió el plasma y se midió la glucemia usando un analizador dinico 7170 (Hitachi, Lid.). Se centrifugaron los aproximadamente 'IDO ~I restantes de sangre (3.000 rpm, 4°C, 10 min.) con una

centrifugadora, se recogió el suero y se midió el nivel de insulina (método de ElISA; kit de insulina de Levis (Shibayagi Ca., lid)). La tabla 26 a continuación muestra los resultados de la medición de insulina.

Tabla 26

Los valores en la tabla indican la media ± desviación e$tándar. ##: p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Student) +: p < 0,1 frente al grupo 2 (prueba de la t de Student) A partir de los resuhados en la tabla 26, el grupo de prueba 2 mostró una disminución significativa del nivel de

insulina con respecto al grupo de prueba 1. Por otro lado, el grupo de prueba 4 mostró una tendencia de aumento significativa en el nivel de insulina con respecto al grupo de prueba 2, lo que confirma un efecto de promoción de la slntesis y secreción de insulina.

12) Influencia sobre el peso corporal Se midieron los pesos corporales de las ratas antes de la administración de la sustancia de prueba y 14 semanas

tras el inicio de la administración de la sustancia de prueba. A continuación en la tabla 27 se muestran los resuhados. Tabla 27

Grupo de prueba 1 2 3 4 5

O semanas 238,2 ± ·15,3 2312±·142 2191 ± ·12,2 2297±92 230,4 ± ·11,5 Peso ca ,., 14 semanas 307,3 ± 19 7 2521## ± 24 9 2247" ± 27,8 2435±253 252,8 ± 27 7

Los valores en la tabla indican la media ± desviación e:stándar.

##: p < 0,01 frente al grupo 1 (prueba de la t de Student)

": p < 0,05 frente al grupo 2 (prueba de la t de Student)

A partir de los resultados en la tabla 27, en la semana 14 tras el inicio de la administración, el peso corporal en el grupo de prueba 2 mostró una disminución significativ~1 con respecto al grupo de prueba 1. Por otro lado, el grupo de prueba 3 muestra una disminución de peso significativa con respecto al grupo de prueba 2, pero dado que los grupos de prueba 4 y 5 fueron aproximadamente iguales al grupo de prueba 2, se confirmó que las microesferas de la invención no tenlan ninguna influencia sobre el peso corporal.

Los resultados anteriores demuestran que las microesferas de la presente invención no tienen ninguna influencia sobre el peso corporal y, en la administración intramuscular intermitente y la administraciOn subcutánea en la regiOn dorsal una vez cada tres semanas, muestran una di$minuciÓll del nivel de glucemia durante la alimentaciÓll y un efecto de elevación de la bioslntesis/secreción de insulina, debido a una acciÓn de promoción de la regeneración de

células ~ pancreáticas, durante la carga con glucosa. Además, en la administración subcutánea y por inyección intramuscular de las microesferas de la presente invEmción, se observó una acción de mejora de la velocidad de conducción nerviosa significativa. Se encontró que la administración intramuscular en el sitio de enfermedad era más eficaz, y se confirmó que era eficaz frente a neuropatia diabética. Además, se mostró que las microesferas de la presente invención eran eficaces frente a nefropatia diabética reduciendo la creatinina en orina y la excreción de protelnas totales. Las disminuciones de los niveles dE1 glucemia observadas en estos resultados fueron efectos de un grado que no muestran acciones de mejora de la nefropatla o mejora de la velocidad de conducción nerviosa significativas.

Aplicabilidad industrial

Dado que las microesferas de la presente invención tienen un periodo de liberación lenta de aproximadamente dos semanas a aproximadamente cuatro semanas Iras la administración, permiten que se incluya un contenido del presente fármaco superior, suprimen una ráfaga inicial del presente fármaco y permiten que la concentración en sangre de este fármaco se mantenga en un intervalo adecuado para que se manifiesten los efectos del fármaco, estas microesferas son útiles para la prevención y/o el tratamiento de ASO, infarto de miocardio, angina, ictus, diabetes y complicaciones de la misma, insuficiencia n~al, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, asma, OA, AR Y osteoporosis, elc.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   ,.
2. 2.
3. 3.

4. 4.

5. 5.

6. 6.
7. 7.

   Microesfera de acción prolongada de dos a cualro semanas, que comprende ácido ({5-[2-{{[{1E)fenil(piridin-3-il)metilen]amino}oxi)etil)-7,8-dihidronaflalen-1-il}oxi)acético o su sal como fármaco y un copollmero de ácido láctico/ácido glic6lico, en la que

   (i)

   una cantidad de copolimero de ácido láctio::l/ácido glicólico en partes en peso del fármaco es de desde 3 hasta 10 partes en peso,

   (ii)

   la microesfera tiene un tamaño de particula promedio de desde 20 hasta 50 ~m, y (jji) el copolimero de ácido láctico/ácido glic:ólico tiene un peso molecular promedio en peso de desde

8. 10.000 hasta SO.OOO y una razón de composición de ácido láctico/ácido gliOOlico de desde 75125 hasta 50/SO,

   y que satisface al menos una de las siguienteB condiciones (1) a (2):

   (1)

   una razón reslante del fármaco tras una hora en una prueba de liberación es de al menos el 90%;

   (2)

   una razón reslante del fármaco tras un dia en una prueba de liberación es de al menos el 82%.

   Microesfera según la reivindicación 1, en la que el contenido de copollmem de ácido láctico/ácido glicólico en partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta 8 partes en peso. Microesfera según la reivindicación 1, en la que la microesfera tiene un tamaño de partlcula promedio de

   desde 25 hasta 35 ~m.

   Microesfera según la reivindicación 1, en la Que la razón de copollmero de ácido láctico/ácido glic6lico es de 50/SO. Microesfera según la reivindicación 1, en la que la concentración en sangre del fármaco es de desde

   0,01 ng/ml hasta 150 ng/ml. Microesfera de acción prolongada de dos semanas según la reivindicación 1, en la Que

   (l)

   una cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido gliOOlioo en partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta 8 partes en peso,

   (ii)

   la microesfera tiene un tamaño de partfculEI promedio de desde 25 hasta 35 ~m, y

   (iii) el copolímero de ácido láctico/ácido glicólico tiene un peso molecular promedio en peso de desde
9. 10.000 hasta 30.000 y una razón de composición de ácido láctico/ácido gliOOlico de SO/SO, y Que satisface la siguiente condición (1):

   (1)

   una razón restante del fármaco tras una hc)ra en una prueba de liberación es de al menos el 90%. Microesfera de acción prolongada de cuatro sl~manas según la reivindicación 1, en la que

   (i)

   una cantidad de copollmero de ácido láctico/ácido glic6lico en partes en peso del fármaco es de desde 4 hasta 8 partes en peso,

   (li)

   la microesfera tiene un tamaño de partlcula promedio de desde 25 hasta 35 ~m, y

   (iii) el copolímero de ácido láctico/ácido glicólico tiene un peso molecular promedio en peso de desde
10. 30.000 hasta SO.OOO y una razón de composic.ión de ácido láctioolácido glioolioo de 50/50, y Que satisface la siguiente condición (1):

    (1) una razón restante del fármaco tras un dia en una prueba de liberación es de al menos el 82%.

    Agente Que comprende la microesfera segC¡n la reivindicación 1 para su uso en la prevención y/o el

    tratamiento de arteriosclerosis oblilerante (ASO), enfermedad de Buerger, enfermedad de Raynaud, arteriosclerosis, linfedema, infarto de miocardio, angina, taquiarritmia ventricular, insuficiencia cardiaca congestiva, arteriopatla coronaria, cardiomiol)8!ia idiopática, cardiomiopalla dilatada, fibrilación auricular, miocarditis, encefalopalia isquémica, accide.ntes cerebrovasculares, lctus, infarto cerebral, hemorragia
11. 8.

    cerebral. enfermedad de Par1tinson, enfermedad de Alzheimer, neuropatia diabética, estenosis del conduclo vertebral, demencia, enfermedad de moyamoya, lesiones de la médula espinal, esclerosis lateral amiolrófica (ELA), aneurisma cerebral, neurnonia aguda, fibrasis pulmonar. hipertensión pulmonar, enfermedad pulmonar obslructiva crOnica (EPOC), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), s lesión pulmonar aguda (LPA), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SORA), sarcoidosis, neumonla intersticial, neumonitis por hipersensibilidad, asma, osleoartritis (OA) de las vertebras o fa rodilla, artritis reumatoide (ARl, osteoporosis. fractura ósea, osteonecrosis, lesión perióslica. terapia de regeneración del esternón asociada con cirugía cardiopulmonar, hepatitis fulminante, hepatitis aguda. cirrosis, hepatitis crónica, hlgado graso, insuficiencia renal aguda, trastomo renal isquémlco, slndrome de aplastamIento, 10 insuficiencia renal cr6nica. enfermedad glomerular, glomerulonefritis, nefroesderosis, glomerulonefritis proliferativa, enfermedad tubulointersticial, trastornos renovasculares. enfermedad renal quistica. nefropatla tóxica, anomatras en el transporte tubular, trastornos renales en pacientes sometidos a diálisis, nefropatla, diabetes. panereatilis crónica, panereat;tis Elguda, esofagitis, gastritis, ulcera gástrica, úlcera duodenal, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, trasplante de corazÓn, IS trasplante de hlgado, trasplante de riMn, trasplante de pulmón, trasplante de páncreas, trasplante de colgajo miocutáneo, trasplante de es6fago, 1rasplante de piel, trasplante de vasos sanguíneoslfinfátlcos, trasplante de células madre hemalopoyética~s, trasplante de huesos/cartflagos , trastomos de los nervios, nefropalJa. reeslenosis tras ACTP (angioplastia coronaria transluminal percutánea), enfermedad periodontal, heridas por extracción de dientes, heridas de la cavidad bucal. trastornos de tejido 6seo

    20 periodontal. periodontitis, úlceras de decúbno, enfermedad de alopecia. alopecia areata, úlceras cutáneas, glaucoma, sordera, sordera neurosensorial, fallo multiorgánico (FMO), enfermedades alérgicas o enfermedad del colágeno.
12. 9. Agente según la reivindicación 8. para su uso en la prevención y/o el tratamiento de infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca, cardíomiopatia dilatadEI. miocarditis, hipertensi6n pulmonar, asma, insuficiencia renal

    2S crónica, trasplante de corazón, trasplante dl~ vasos sanguíneosJlinfálicos o trasplante de células madre hematopoyéticas.