RU2678986C1 - Antiviral agent based on humic acids - Google Patents
Antiviral agent based on humic acids Download PDFInfo
- Publication number
- RU2678986C1 RU2678986C1 RU2018110484A RU2018110484A RU2678986C1 RU 2678986 C1 RU2678986 C1 RU 2678986C1 RU 2018110484 A RU2018110484 A RU 2018110484A RU 2018110484 A RU2018110484 A RU 2018110484A RU 2678986 C1 RU2678986 C1 RU 2678986C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- humic acids
- aqueous solution
- concentration
- virus
- hfhc
- Prior art date
Links
- 239000004021 humic acid Substances 0.000 title claims abstract description 64
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 16
- 239000003077 lignite Substances 0.000 claims abstract description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 18
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 12
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 claims description 10
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- PCSKKIUURRTAEM-UHFFFAOYSA-N HMF acid Natural products OCC1=CC=C(C(O)=O)O1 PCSKKIUURRTAEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 24
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 8
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 3-nitrobicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic acid Chemical compound C1C2C=CC1C(C(=O)O)C2(C(O)=O)[N+]([O-])=O QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 4
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 4
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M crystal violet Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C+](C=1C=CC(=CC=1)N(C)C)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 ZXJXZNDDNMQXFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229960001235 gentian violet Drugs 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000712464 Orthomyxoviridae Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- -1 alcohol hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 235000019841 confectionery fat Nutrition 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 230000001882 diuretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002443 hepatoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012479 in-house spinning solution Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005582 sexual transmission Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000017960 syncytium formation Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/02—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution from inanimate materials
- A61K35/10—Peat; Amber; Turf; Humus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/12—Ketones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
- A61K31/18—Sulfonamides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к препаратам для профилактики и лечения вирусных заболеваний, в частности, вызванных вирусами гриппа, простого герпеса 1-го и 2-го типа, иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и вируса Западного Нила и может быть использовано в медицине, а именно в вирусологии, фармакологии и биотехнологии.The invention relates to preparations for the prevention and treatment of viral diseases, in particular caused by influenza viruses, herpes simplex type 1 and type 2, human immunodeficiency (HIV-1) and West Nile virus and can be used in medicine, namely Virology, Pharmacology and Biotechnology.
Гуминовые кислоты представляют собой высокомолекулярные гетерополимеры и являются составной частью объектов природного происхождения (торф, почва и бурый уголь). Для молекул гуминовых кислот характерны нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и полидисперстность. Структурные единицы гуминовых кислот представляют собой ароматические конденсированные системы с боковыми цепями и гетероциклами. Функциональными группами являются карбоксильные, карбонильные, фенольные и спиртовые гидроксиды, хиноидные группировки, метоксилы, амино- и амидогруппы, моно-, ди-, полисахариды, пептиды, минеральные компоненты. Биологическая активность гуминовых кислот может быть обусловлена наличием в этих соединениях разнообразных функциональных групп; коллоидными свойствами и компонентным составом. Наличие в ГВ разнообразных функциональных групп обуславливает, во-первых, участие этих соединений в химических реакциях окисления-восстановления, а, во-вторых, реакционную способность в целом, включая ионный обмен и образование хелатных соединений. Будучи коллоидами, ГВ проявляют поверхностно-активные и электро-поверхностные свойства. Эти свойства определяют гидрофильно-гидрофобные и электростатические взаимодействия гумусовых соединений. Гуминовые вещества, являясь гетерополимерами, могут служить источником структурных фрагментов органических макромолекул при биосинтезе, происходящем в живых организмах (Попов А.И., Зеленков В.Н., Теплякова Т.В. Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 1. Биохимический аспект (обзор литературы) // Вестник Российской Академии естественных наук, 2016. - №1. - С. 11-18) [1]. Известно, что гуминовые вещества обладают широким спектром терапевтического действия: адаптогенным, антитоксическим, гепатопротекторным, противомикробным, диуретическим и противовоспалительным действием (Попов А.И., Зеленков В.Н., Теплякова Т.В. Биологическая активность и биохимия гуминовых веществ. Часть 2. Медико-биологический аспект. Обзор литературы) // Вестник Российской Академии естественных наук, 2016. - №5. - С. 9-15) [2]. Кроме того было показано, что гуминовые кислоты обладают противовирусной активностью в отношении вирусов иммунодефицита человека (Корнилаева Г.В., Перминова И.В., Гилязова А.В. и др. Гуминовые вещества как перспективные соединения для создания микробицидных препаратов // Российский иммунологический журнал. 2010. Т. 4 (13), №3. С.255-260) [3], а также (Теплякова Т.В., Гашникова Н.М., Балахнин С.М., Косогова Т.А. Антиретровирусная активность экстрактов из чаги, меланина и гуминовых соединений. Современная микология в России // Материалы 3-го съезда микологов России. Т. 3. М.: Национальная академия микологии, 2012. С. 419-420) [4], простого герпеса и гриппа (Ilycheva T.N., Balakhnin S.M., Gashnikova N.M. et al. Antiviral Activity of Humic Substances // Third International Conference of CIS IHSS on Humic Innovative Technologies Tenth International Conference daRostim «Humic Substances and Other Biologically Active Compounds in Agriculture» HIT-daRostim-2014 November 19-23, 2014, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia. P. 42. J Immunol Methods. 1983 Dec 16; 65(1-2): 55-63) [5].Humic acids are high molecular weight heteropolymers and are an integral part of objects of natural origin (peat, soil and brown coal). Humic acid molecules are characterized by an irregular structure, heterogeneity of structural elements, and polydispersity. The structural units of humic acids are aromatic condensed systems with side chains and heterocycles. Functional groups are carboxyl, carbonyl, phenolic and alcohol hydroxides, quinoid groups, methoxyls, amino and amido groups, mono-, di-, polysaccharides, peptides, mineral components. The biological activity of humic acids may be due to the presence of various functional groups in these compounds; colloidal properties and component composition. The presence of various functional groups in the HS determines, firstly, the participation of these compounds in chemical oxidation-reduction reactions, and, secondly, the reactivity as a whole, including ion exchange and the formation of chelate compounds. Being colloids, HS show surface-active and electro-surface properties. These properties determine the hydrophilic-hydrophobic and electrostatic interactions of humic compounds. Humic substances, being heteropolymers, can serve as a source of structural fragments of organic macromolecules during biosynthesis in living organisms (Popov A.I., Zelenkov V.N., Teplyakova T.V. Biological activity and biochemistry of humic substances. Part 1. Biochemical aspect (literature review) // Bulletin of the Russian Academy of Natural Sciences, 2016. - No. 1. - P. 11-18) [1]. It is known that humic substances have a wide range of therapeutic effects: adaptogenic, antitoxic, hepatoprotective, antimicrobial, diuretic and anti-inflammatory effects (Popov A.I., Zelenkov V.N., Teplyakova T.V. Biological activity and biochemistry of humic substances. Part 2 Medical-biological aspect. Literature review) // Bulletin of the Russian Academy of Natural Sciences, 2016. - No. 5. - S. 9-15) [2]. In addition, it was shown that humic acids have antiviral activity against human immunodeficiency viruses (Kornilayeva G.V., Perminova I.V., Gilyazova A.V. et al. Humic substances as promising compounds for creating microbicidal preparations // Russian Immunological Journal 2010. T. 4 (13), No. 3. P.255-260) [3], as well as (Teplyakova T.V., Gashnikova N.M., Balakhnin S.M., Kosogova T.A. Antiretroviral Activity of Extracts from Chaga, Melanin, and Humic Compounds: Modern Mycology in Russia // Materials of the 3rd Congress of Mycologists R Russia, T. 3. M .: National Academy of Mycology, 2012. S. 419-420) [4], herpes simplex and influenza (Ilycheva TN, Balakhnin SM, Gashnikova NM et al. Antiviral Activity of Humic Substances // Third International Conference of CIS IHSS on Humic Innovative Technologies Tenth International Conference daRostim "Humic Substances and Other Biologically Active Compounds in Agriculture" HIT-daRostim-2014 November 19-23, 2014, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia. P. 42. J Immunol Methods. 1983 Dec 16; 65 (1-2): 55-63) [5].
Известно применение природных препаратов гуминовых кислот, выделенных из почвы, для лечения ВИЧ-инфекции (заявка США №20040137085, МПК А61К 35/78, опубл. 15.07.2004 г.). Препарат изготавливается американской компанией Aldrich Chemical Company и упоминается в заявке как AVC. Подавление ВИЧ-инфекции происходит при контакте лейкоцитов ВИЧ-инфицированного человека с препаратом гуминовой кислоты. Заявлен также метод иммуностимуляции интерлейкина-2, метод усиления иммунного ответа на вакцинацию с использованием гуминовой кислоты в качестве адъюванта при вакцинации пациента с ВИЧ-инфекцией.It is known the use of natural preparations of humic acids isolated from the soil for the treatment of HIV infection (US application No. 20040137085, IPC A61K 35/78, publ. July 15, 2004). The drug is manufactured by the American company Aldrich Chemical Company and is referred to in the application as AVC. Suppression of HIV infection occurs when the leukocytes of an HIV-infected person come in contact with a humic acid preparation. A method of immunostimulating interleukin-2, a method of enhancing the immune response to vaccination using humic acid as an adjuvant for vaccinating a patient with HIV, is also claimed.
Однако в указанной заявке США рассматривается применение гуминовых кислот только для лечения ВИЧ-инфекции и нет данных о их применении для лечения других вирусных заболеваний.However, in this application the United States considers the use of humic acids only for the treatment of HIV infection and there is no data on their use for the treatment of other viral diseases.
Известно противовирусное средство на основе гуминовых кислот, полученных из медицинского лигнина (марки "Полифепан", peг. N 80/1211/3 - неспецифического энтерального сорбента) путем его окисления при 150-170°С в течение 0,5-1,5 ч при давлении 2,0-2,5 МПа (патент РФ №2172176, МПК А61К 35/78, опубл. 20.08.2001 г. ). Препарат эффективен против вируса простого герпеса 2-го типа, вируса гриппа типа A (PR-8), а также вируса саркомы Рауса BH-RSV(RAV-1) серологической подгруппы А.Known antiviral agent based on humic acids obtained from medical lignin (brand "Polyphepan", reg. N 80/1211/3 - non-specific enteric sorbent) by oxidation at 150-170 ° C for 0.5-1.5 hours at a pressure of 2.0-2.5 MPa (RF patent No. 2172176, IPC AK61/35/78, publ. 08/20/2001). The drug is effective against herpes simplex virus type 2, type A influenza virus (PR-8), as well as Routh sarcoma virus BH-RSV (RAV-1) serological subgroup A.
Однако в описании к патенту на изобретение отсутствуют данные о допустимой токсичности противовирусного средства на основе гуминовых кислот, полученных из медицинского лигнина.However, in the description of the patent for the invention there is no data on the permissible toxicity of an antiviral agent based on humic acids obtained from medical lignin.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является средство против передачи ВИЧ/СПИД половым путем, выполненное в виде суппозитория, содержащего фармакологически приемлемую основу и активную субстанцию (патент РФ №2531945, МПК А61К 35/02, опубл. 27.07.2014 г.). В качестве активной субстанции с анти-ВИЧ-активностью используют фракцию гуминовых кислот, выделенных из окисленного бурого угля, а в качестве основы используется масло какао или твердый кондитерский жир и эмульгатор. Выделение фракции гуминовых кислот (НАС-1) осуществляют путем обработки бурого угля 1%-ным раствором гидроксида натрия (NaOH) и нагревании смеси в течение 2 часов на кипящей водяной бане (при температуре 80°С). После охлаждения продукты реакции центрифугируют, раствор декантируют, нерастворившийся остаток промывают один - два раза 100 мл 1%-ого раствора гидроксида натрия и вновь центрифугируют, собирая основной экстракт и промывные воды в один приемник. К полученному раствору добавляют раствор концентрированной соляной кислоты до рН 2 для осаждения гуминовых кислот. Образовавшийся осадок гуминовых кислот отделяют центрифугированием и обессоливают с помощью диализа. Полученный препарат гуминовых кислот высушивают при 80°С в сушильном шкафу.The closest analogue (prototype) is an agent against sexual transmission of HIV / AIDS, made in the form of a suppository containing a pharmacologically acceptable base and an active substance (RF patent No. 2531945, IPC A61K 35/02, published on July 27, 2014). As an active substance with anti-HIV activity, a fraction of humic acids isolated from oxidized brown coal is used, and cocoa butter or solid confectionery fat and an emulsifier are used as the basis. The separation of the fraction of humic acids (HAC-1) is carried out by treating brown coal with a 1% solution of sodium hydroxide (NaOH) and heating the mixture for 2 hours in a boiling water bath (at a temperature of 80 ° C). After cooling, the reaction products are centrifuged, the solution is decanted, the insoluble residue is washed once or twice with 100 ml of 1% sodium hydroxide solution and centrifuged again, collecting the main extract and washings in one receiver. To the resulting solution was added a solution of concentrated hydrochloric acid to pH 2 to precipitate humic acids. The resulting precipitate of humic acids is separated by centrifugation and desalted using dialysis. The resulting preparation of humic acids is dried at 80 ° C in an oven.
Однако в описании к патенту РФ №2531945 рассматривается применение гуминовых кислот только для лечения ВИЧ-инфекции и нет данных о применении данного препарата для лечения других вирусных заболеваний, в частности, вызванных вирусами гриппа, простого герпеса 1-го и 2-го типа, Западного Нила. Кроме того, известно, что в составе гетерогенных молекул гуминовых кислот (ГК), в частности, содержатся пептидные цепочки различного состава и длины (http://powermatrix-spb.ru/guminovyie_kisloty), которые могут высвобождаться из молекул ГК в процессах клеточного метаболизма и оказывать токсическое действие на клетки человека.However, the description of the patent of the Russian Federation No. 2531945 discusses the use of humic acids only for the treatment of HIV infection and there is no data on the use of this drug for the treatment of other viral diseases, in particular caused by influenza viruses, herpes simplex type 1 and type 2, Western Nile. In addition, it is known that the composition of heterogeneous molecules of humic acids (HAs), in particular, contains peptide chains of various compositions and lengths (http://powermatrix-spb.ru/guminovyie_kisloty), which can be released from HAs in the processes of cellular metabolism and have a toxic effect on human cells.
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение препарата гуминовых кислот из окисленного бурого угля с более низким содержанием токсичных веществ и более широким спектром противовирусного действия в отношении вирусов, патогенных для человека.The technical result of the claimed invention is to obtain a preparation of humic acids from oxidized brown coal with a lower content of toxic substances and a wider spectrum of antiviral activity against viruses pathogenic to humans.
Указанный технический результат достигается тем, что в противовирусном средстве, содержащем водный раствор водорастворимой фракции гуминовых кислот (ВФГК), полученных из окисленного бурого угля, согласно изобретения, в качестве ВФГК оно содержит водорастворимую фракцию гуминовых кислот, обработанную ферментом трипсином в соотношении ВФГК и трипсин (25-35):1 в буферном растворе 1М Трис в течение не менее 5-6 часов с последующим осаждением ВФГК путем закисления до значения рН равного или менее 2,0 единиц с содержанием ВФГК в водном растворе в концентрации от 1,5 до 150 мкг/мл.The specified technical result is achieved by the fact that in an antiviral agent containing an aqueous solution of a water-soluble fraction of humic acids (HFCA) obtained from oxidized brown coal, according to the invention, as HFCA it contains a water-soluble fraction of humic acids treated with trypsin enzyme in the ratio of HFCA and trypsin ( 25-35): 1 in 1M Tris buffer solution for at least 5-6 hours, followed by precipitation of HFGC by acidification to a pH value of equal to or less than 2.0 units containing HFHC in an aqueous solution in concentrations from 1.5 to 150 μg / ml.
Средство содержит:The tool contains:
- водный раствор ВФГК в концентрации от 4,2 до 5,4 мкг/мл, обладающий активностью против вируса Западного Нила (ВЗН);- an aqueous solution of HFHC in a concentration of from 4.2 to 5.4 μg / ml, having activity against West Nile virus (WNV);
- водный раствор ВФГК в концентрации от 1,5 до 5,5 мкг/мл, обладающий активностью против вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ-2);- an aqueous solution of HFHC in a concentration of from 1.5 to 5.5 μg / ml, having activity against herpes simplex virus type 2 (HSV-2);
- водный раствор ВФГК в концентрации от 3,0 до 4,0 мкг/мл, обладающий активностью против вируса гриппа A/H1N1/California/2009;- an aqueous solution of HFHC in a concentration of from 3.0 to 4.0 μg / ml, having activity against the influenza virus A / H1N1 / California / 2009;
- водный раствор ВФГК в концентрации от 100 до 150 мкг/мл, обладающий активностью против вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1);- an aqueous solution of HFHC in a concentration of from 100 to 150 μg / ml, having activity against herpes simplex virus type 1 (HSV-1);
- водный раствор ВФГК в концентрации от 45 до 55 мкг/мл, обладающий активностью против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1).- an aqueous solution of HFHC in a concentration of from 45 to 55 μg / ml, having activity against human immunodeficiency virus (HIV-1).
Таким образом, отличительными особенностями средства является, во-первых, пониженная токсичность (безопасность) для клеток человека, благодаря очистке и ферментативной обработке гуминовых кислот; во-вторых, широкий спектр противовирусного действия, показанный экспериментально. Согласно данным заявителя, гуминовые кислоты имеют высокую противовирусную активность в отношении пяти вирусов (см. примеры 2-6), вызывающих тяжелые заболевания человека, и относящихся к разным семействам.Thus, the distinguishing features of the product are, firstly, reduced toxicity (safety) for human cells, due to the purification and enzymatic treatment of humic acids; secondly, a wide range of antiviral effects, shown experimentally. According to the applicant, humic acids have high antiviral activity against five viruses (see examples 2-6) that cause severe human diseases and belong to different families.
Пример 1. Метод получения противовирусного средства на основе гуминовых кислотExample 1. A method of obtaining an antiviral agent based on humic acids
1.1. Выделение гуминовых кислот.25 г бурого угля Абанского месторождения, измельченные до размера частиц не более 0,2 мм, смешали с 50 мл 2% аммиака. К полученной смеси, при непрерывном перемешивании добавили 40 мл концентрированной перекиси водорода. После окончания процесса газовыделения смесь центрифугировали для отделения нерастворившейся части угля.1.1. Isolation of humic acids. 25 g of brown coal of the Abanskoye field, crushed to a particle size of not more than 0.2 mm, were mixed with 50 ml of 2% ammonia. To the resulting mixture, 40 ml of concentrated hydrogen peroxide was added with continuous stirring. After the end of the gas evolution, the mixture was centrifuged to separate the insoluble part of the coal.
1.2. Очистка гуминовых кислот. Для осаждения гуминовых кислот супернатант, содержащий растворенные гуминовые кислоты, закисляли до значения рН менее 2,0 единиц добавлением соляной кислоты и снова центрифугировали, супернатант отбрасывали. Далее проводили процедуру переосаждения (последовательно пять раз) гуминовых кислот по следующей схеме: осадок ресуспендировали в 10-ти кратном количестве воды и доводили рН до значения не менее 10,0 единиц добавлением 20% NaOH; полученный раствор гуминовых кислот затем снова закисляли до значения рН менее 2,0 единиц и центрифугировали.1.2. Purification of humic acids. To precipitate humic acids, the supernatant containing dissolved humic acids was acidified to a pH of less than 2.0 units by the addition of hydrochloric acid and centrifuged again, the supernatant was discarded. Next, the procedure was reprecipitated (successively five times) of humic acids according to the following scheme: the precipitate was resuspended in 10 times the amount of water and the pH was adjusted to a value of at least 10.0 units by adding 20% NaOH; the resulting humic acid solution was then acidified again to a pH of less than 2.0 units and centrifuged.
Осадок гуминовых кислот растворили в небольшом количестве воды и довели рН до значения 7-8 единиц. Затем гуминовые кислоты высушили при 30°С.The precipitate of humic acids was dissolved in a small amount of water and the pH was adjusted to a value of 7-8 units. Then, humic acids were dried at 30 ° C.
1.3. Ферментативная обработка. В составе гетерогенных молекул гуминовых кислот (ГК), в частности, содержатся пептидные цепочки различного состава и длины, которые могут высвобождаться из молекул ГК в процессах клеточного метаболизма и оказывать токсическое действие на клетки человека. Чтобы снизить токсичность, образцы гуминовых кислот обработали протеазой. Для этого от 4 до 5,5 г очищенных гуминовых кислот растворили в 100 мл воды, добавили 5 мл 1М Трис и 150 мг трипсина. Смесь инкубировали не менее 5-6 часов при 37°С. Затем осадили гуминовые кислоты соляной кислотой путем закисления до значения рН менее 2,0 единиц. Осадок ГК растворили в небольшом количестве воды и довели рН до значения 7-8 единиц. Далее гуминовые кислоты высушили при 30°С.1.3. Enzymatic processing. The composition of heterogeneous molecules of humic acids (HA), in particular, contains peptide chains of various compositions and lengths that can be released from the molecules of HA in the processes of cellular metabolism and have a toxic effect on human cells. To reduce toxicity, samples of humic acids were treated with a protease. For this, from 4 to 5.5 g of purified humic acids were dissolved in 100 ml of water, 5 ml of 1M Tris and 150 mg of trypsin were added. The mixture was incubated for at least 5-6 hours at 37 ° C. Humic acids were then precipitated with hydrochloric acid by acidification to a pH of less than 2.0 units. The HA precipitate was dissolved in a small amount of water and the pH was adjusted to 7-8 units. Next, humic acids were dried at 30 ° C.
Пример 2. Исследование токсичности и противовирусной активности образцов гуминовых кислот в отношении вируса простого герпеса второго типа (ВПГ-2)Example 2. The study of the toxicity and antiviral activity of samples of humic acids against the herpes simplex virus of the second type (HSV-2)
Оценку активности образцов гуминовых кислот (ГК) в отношении вируса простого герпеса 2 типа проводили в культуре клеток Vero. В работе был использован штамм MS вируса простого герпеса 2 типа (получен из Американской коллекции типовых культур). Приготовленные разведения препаратов наносили на двухсуточную культуру (по 3 повтора на каждое разведение), за исключением контрольных лунок (контроль вируса и контроль клеток). Для оценки токсичности образцов ГК клетки окрашивали раствором генциан-виолета. Результаты окрашивания регистрировали с помощью фотометра 680 Земфира с управляющим компьютером BioRed RU Zemf в соответствии с инструкцией производителя. Получали показатели оптической плотности (ОП) для каждой из лунок планшета при длине волны 570 нм. Вычисляли среднее значение ОП для каждой группы из трех лунок с различными концентрациями образца. По полученным значениям строили график зависимости ОП от концентрации образца. По графикам определяли 50% токсическую концентрацию (ТС50).Evaluation of the activity of samples of humic acids (HA) in relation to herpes simplex virus type 2 was carried out in a culture of Vero cells. A strain of MS herpes simplex virus type 2 was used (obtained from the American Type Culture Collection). Prepared dilutions of the preparations were applied to a two-day culture (3 replicates per dilution), except for control wells (virus control and cell control). To assess the toxicity of HA samples, cells were stained with a gentian violet solution. Staining results were recorded using a Zemfira 680 photometer with a BioRed RU Zemf control computer in accordance with the manufacturer's instructions. Received optical density (OD) for each of the wells of the tablet at a wavelength of 570 nm. The average OD value was calculated for each group of three wells with different concentrations of the sample. Based on the obtained values, a graph was constructed of the dependence of OD on the concentration of the sample. 50% toxic concentration (TC 50 ) was determined from the graphs.
Для определения противовирусной активности в лунки добавляли вирус в дозе 2×10-5 БОЕ/клетку (объем рабочей смеси составлял 100 мкл). Учет реакции проводили на 4 сутки. Оценка активности проводилась при помощи метода ингибирования бляшкообразования. Клетки окрашивали генциан-виолетом. Процент ингибирования бляшкообразования (%ИБ) определяли по формуле: %ИБ = [1 - (число бляшек в тесте / количество бляшек в контроле вируса)] × 100. Определяли концентрацию, способную ингибировать развитие 50% бляшкообразующих единиц (БОЕ) от количества БОЕ в контроле (50% ингибирующую концентрацию - IС50). Вычисляли среднее значение %ИБ для каждой группы из двух лунок с различными концентрациями образца. По полученным значениям строили график зависимости %ИБ от концентрации образца. По графикам определяли IС50. Индекс селективности (IS) определяли как отношение 50% токсической дозы к 50% ингибирующей дозе.To determine the antiviral activity, a virus was added to the wells at a dose of 2 × 10 -5 PFU / cell (the volume of the working mixture was 100 μl). The reaction was taken into account on day 4. Assessment of activity was carried out using the method of inhibition of plaque formation. Cells were stained with gentian violet. The percentage of inhibition of plaque formation (% IB) was determined by the formula:% IB = [1 - (number of plaques in the test / number of plaques in the virus control)] × 100. The concentration capable of inhibiting the development of 50% of plaque forming units (PFU) of the number of PFU in control (50% inhibitory concentration - IC 50 ). The average% IB value was calculated for each group of two wells with different concentrations of the sample. Based on the obtained values, a graph of the dependence of% IB on the concentration of the sample was constructed. According to the graphs, IC 50 was determined. Selectivity Index (IS) was defined as the ratio of a 50% toxic dose to a 50% inhibitory dose.
Из анализа полученных данных в таблице 1 видно, что после ферментативной обработки токсичность образца гуминовых кислот для клеток человека снизилась почти в 2 раза, при сохранении уровня противовирусной активности в отношении вируса простого герпеса (ВПГ-2).From the analysis of the data obtained in table 1 it is seen that after enzymatic treatment, the toxicity of the sample of humic acids for human cells decreased by almost 2 times, while maintaining the level of antiviral activity against herpes simplex virus (HSV-2).
Пример 3. Тестирование образца гуминовых кислот на наличие противовирусной активности в отношении вируса Западного Нила (ВЗН).Example 3. Testing a sample of humic acids for the presence of antiviral activity against West Nile virus (WNV).
Оценку образцов гуминовых кислот в отношении лихорадки Западного Нила проводили на культуре клеток Vero. В работе был использован штамм Egypt 101 ВЗН (получен из Государственной коллекции вирусных штаммов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва, Россия). Для тестировании противовирусной активности использовали ВЗН в титре 103 ТЦПД50/мл: в такой дозе вирус вызывает видимое под микроскопом 100%-ное ЦПД на клетки Vero.Evaluation of humic acid samples for West Nile fever was performed on a Vero cell culture. In the study, strain Egypt 101 WNV was used (obtained from the State collection of viral strains of the Institute of Virology named after D.I. Ivanovsky of the RAMS, Moscow, Russia). To test the antiviral activity, WNV in a titer of 10 3 TTCPD / ml was used: at this dose, the virus causes a 100% CPD visible under a microscope on Vero cells.
Таким образом, в таблице 2 показано, что гуминовые кислоты обладают противовирусной активностью в отношении вируса Западного Нила, относящегося к семейству Flaviridae.Thus, Table 2 shows that humic acids have antiviral activity against West Nile virus belonging to the Flaviridae family.
Пример 4. Исследование токсичности и противовирусной активности образцов гуминовых кислот в отношении вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm09) в культуре клеток MDCK (клетки почки собаки).Example 4. The study of the toxicity and antiviral activity of samples of humic acids against influenza virus A / California / 07/09 (H1N1pdm09) in an MDCK cell culture (dog kidney cells).
Клетки MDCK рассевали в 96-луночных планшетах с посевной концентрацией 300000 кл./мл по 100 мкл в лунке. Разведения исследуемых образцов гуминовых кислот готовили в поддерживающей среде. В работе использовали последовательные двоичные разведения образцов. Приготовленные разведения препаратов наносили на суточную культуру (по 2 повтора на каждое разведение), за исключением контрольных лунок (контроль вируса и контроль клеток). Для определения противовирусной активности в лунки добавляли вирус в дозе 100 ТЦИД50/лунку. Учет реакции проводили на 3 сутки. Оценка активности образцов была проведена с использованием красителя нейтрального красного. Результаты теста регистрировали с помощью фотометра 680 Земфира с управляющим компьютером BioRad RU Zemf в соответствии с инструкцией производителя. Получены показатели оптической плотности при длине волны 490 нм для каждой из лунок планшета. 50% ингибирующую и токсическую концентрации препаратов рассчитывали при помощи графиков, построенных по средним значениям оптической плотности (ОП) для каждой группы из двух инфицированных и неинфицированных лунок с различными концентрациями препарата. Для каждого разведения вычисляли среднее значение ОП. По полученным значениям строили графики зависимости ОП от концентрации препарата. По графикам определяли ТС50 и IС50. Индекс селективности (IS) рассчитывали, как отношение ТС50 к IC50.MDCK cells were scattered in 96-well plates with a seed concentration of 300,000 cells / ml, 100 μl per well. Dilutions of the studied samples of humic acids were prepared in a support medium. In the work, serial binary dilutions of the samples were used. Prepared dilutions of the preparations were applied to daily culture (2 replicates per dilution), except for control wells (virus control and cell control). To determine antiviral activity, a virus was added to the wells at a dose of 100 TCID 50 / well. The reaction was taken into account on the 3rd day. Evaluation of the activity of the samples was carried out using a neutral red dye. The test results were recorded using a 680 Zemfira photometer with a BioRad RU Zemf control computer in accordance with the manufacturer's instructions. Indicators of optical density at a wavelength of 490 nm were obtained for each of the wells of the tablet. 50% inhibitory and toxic concentrations of the drugs were calculated using graphs plotted by the average optical density (OD) for each group of two infected and uninfected wells with different drug concentrations. For each dilution, the average OD value was calculated. Based on the obtained values, graphs of the dependence of OD on the concentration of the drug were built. TC 50 and IC 50 were determined from the graphs. The selectivity index (IS) was calculated as the ratio of TC 50 to IC 50 .
Проведенное тестирование (таблица 3) подтвердило высокую противовирусную активность ГК в отношении вируса гриппа, относящегося к семейству Orthomyxoviridae.The testing performed (Table 3) confirmed the high antiviral activity of HA against the influenza virus belonging to the Orthomyxoviridae family.
Пример 5. Исследование токсичности и противовирусной активности образца гуминовых кислот в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1)Example 5. The study of the toxicity and antiviral activity of a sample of humic acids against human immunodeficiency virus (HIV-1)
Клетки. Для работы с вирусом иммунодефицита человека использованы перевиваемые лимфобластоидные клетки человека МТ-4 из коллекции культур клеток «Института вирусологии им. Д.И. Ивановского» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.Cells. To work with the human immunodeficiency virus, transplantable human lymphoblastoid cells MT-4 from the cell culture collection of the Institute of Virology named after DI. Ivanovsky "FSBI" NITsEM them. N.F. Gamalei »Ministry of Health of Russia.
Вирусы. В качестве источника вируса иммунодефицита человека использован штамм ВИЧ-1 899А (субтип В) (Германия), штамм ВИЧ-1 ИВ735 (субтип В) (Россия), штамм ВИЧ-1 ИВ741 (субтип АЕ) (Россия) из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека «Института вирусологии им. Д.И.Ивановского» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.Viruses. The HIV-1 899A strain (subtype B) (Germany), HIV-1 IV735 strain (subtype B) (Russia), HIV-1 IV741 strain (subtype AE) (Russia) from the collection of immunodeficiency virus strains were used as a source of human immunodeficiency virus Human Institute of Virology. D.I. Ivanovsky "FSBI" NITsEM them. N.F. Gamalei »Ministry of Health of Russia.
Исследование цитотоксического действия препарата. Добавление к клеткам исследуемого препарата в различных концентрациях.The study of the cytotoxic effect of the drug. Adding to the cells of the studied drug in various concentrations.
Инкубирование клеток при 37С° в атмосфере с 5% СO2 и 98% влажности 5 дней. Учет результатов: определение жизнеспособности и количества клеток при помощи красителя.Incubation of cells at 37 ° C in an atmosphere with 5% CO 2 and 98% humidity for 5 days. Analysis of results: determination of viability and cell number using dye.
Исследование противовирусного действия препарата. Добавление исследуемого препарата в различных дозах одновременно с инфицированием вирусом в дозе 0,01 ТЦИД50/клетка. Инкубирование культур клеток при 37С° в атмосфере с 5% СO2 и 98% влажности 5 дней. Учет результатов окрашиванием клеток с помощью тетразолиевого красителя (метод МТТ) со спектрофотометрией и световой микроскопией: исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПЭ) и вирусиндуцируемого синцитийобразования (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран), определению антигена вируса в культуральной жидкости, инфицированных клеток.The study of the antiviral effect of the drug. Adding the study drug in various doses simultaneously with infection with the virus at a dose of 0.01 TCID 50 / cell. Incubation of cell cultures at 37 ° C in an atmosphere with 5% CO 2 and 98% humidity for 5 days. Analysis of results by staining cells with a tetrazolium dye (MTT method) with spectrophotometry and light microscopy: study of the cytopathic effect of the virus (CPE) and virus-induced syncytium formation (syncytium is a conglomerate of several cells with a common cell membrane formed as a result of the fusion of their membranes), determination of the virus antigen in culture fluid infected cells.
Степень защиты клеток от цитодеструктивного действия вируса определяли по формуле:The degree of protection of cells from the cyto-destructive effect of the virus was determined by the formula:
А - число жизнеспособных клеток в опытной группе;A is the number of viable cells in the experimental group;
В - то же в инфицированной культуре (контроль вируса);B - the same in an infected culture (virus control);
К- то же в неинфицированной культуре (контроль клеток).The same is in an uninfected culture (cell control).
Определение антигена вируса в культуральной жидкости инфицированных клеток проводили методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора GENSCREEN™ ULTRA HIV Ag-Ab фирмы «ВIO-RAD» согласно инструкции изготовителя. Результаты учитывали с помощью фотометра «Stat Fax-3200» производства США при длине волны 450/630 нм. Чувствительность тест-системы - менее 25 пкг/мл. Результаты представлены в таблице 4.Determination of the virus antigen in the culture fluid of infected cells was carried out by enzyme-linked immunosorbent assay using a commercial kit GENSCREEN ™ ULTRA HIV Ag-Ab company "BIO-RAD" according to the manufacturer's instructions. The results were taken into account using a US Fax Stat-3200 photometer at a wavelength of 450/630 nm. The sensitivity of the test system is less than 25 pkg / ml. The results are presented in table 4.
Полученные данные (таблица 4) показали, что образец гуминовых кислот в концентрации 50±5 мкг/мл обладал противовирусной активностью в отношении ВИЧ-1. Отмечена выраженная защита клеток от цитопатического действия вируса и снижения уровня вирусного антигена в культуральной жидкости ВИЧ-инфицированных клеток. При этом препарат был эффективен в отношении штаммов ВИЧ-1 разных субтипов, выделенных в разных регионах мира (Западная Европа и Россия).The data obtained (table 4) showed that a sample of humic acids at a concentration of 50 ± 5 μg / ml had antiviral activity against HIV-1. Marked protection of cells against the cytopathic effect of the virus and a decrease in the level of viral antigen in the culture fluid of HIV-infected cells was noted. Moreover, the drug was effective against strains of HIV-1 of different subtypes isolated in different regions of the world (Western Europe and Russia).
Пример 6. Изучение противовирусной активности соединений, содержащих гуминовые кислоты в отношении вируса герпеса простого, тип 1 (ВПГ-1)Example 6. The study of the antiviral activity of compounds containing humic acids against herpes simplex virus type 1 (HSV-1)
Материалы и методы.Materials and methods.
Клетки. Культура клеток фибробластов почки зеленой мартышки VERO-перевиваемая линия клеток, чувствительная к вирусу герпеса простого, культивировалась при 37°С и при 5,0% СO2.Cells. The green monkey kidney fibroblast cell culture VERO-transplantable cell line sensitive to herpes simplex virus was cultured at 37 ° C and at 5.0% CO 2 .
Вирус. В работе использовали вирус простого герпеса, тип 1, штамм Л2, полученный из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им Д.И. Ивановского (ВПГ-1).Virus. The study used herpes simplex virus, type 1, strain L2, obtained from the D.I. Ivanovsky (HSV-1).
Исследуемые вещества. Гуминовые кислоты.The investigated substances. Humic acids.
Схема экспериментов. В монослойную культуру клеток Vero вносили испытуемые вещества в концентрации 100, 150, 200 и 300 мкг/мл. Через 24 часа клетки, подвергнувшиеся воздействию испытуемых веществ, инфицировали вирусом ВПГ в дозе 100 ТЦИД50. Контролем служили клетки, не обработанные исследуемыми веществами и инфицированные ВПГ-1. Опытные и контрольные клетки в 96-луночных панелях помещали в инкубатор при 37°С и 5,0% СO2 до поражения 100%) клеток в контроле. Учет проводили микроскопически и методом МТТ (с помощью тетразолиевого красителя).The experimental design. Test substances were added to a monolayer culture of Vero cells at a concentration of 100, 150, 200 and 300 μg / ml. After 24 hours, cells exposed to the test substances were infected with HSV virus at a dose of 100 TCID 50 . The control was cells not treated with the test substances and infected with HSV-1. The experimental and control cells in 96-well panels were placed in an incubator at 37 ° C and 5.0% CO 2 until 100%) cells were infected in the control. The calculation was carried out microscopically and using the MTT method (using tetrazolium dye).
Результаты исследования.The results of the study.
В контрольных культурах клеток (инфицированных ВПГ-1 и не обработанных исследуемыми веществами) через 48 часов развивалось вирусиндуцированное ЦПЭ. В культурах клеток, обработанных гуминовыми кислотами обнаружена защита клеток от цитопатического действия ВПГ-1 на 75-100% при концентрации 100-150 мкг/мл, соответственно (таблица 5).In control cell cultures (infected with HSV-1 and not treated with the test substances), virus-induced CPE developed after 48 hours. In cell cultures treated with humic acids, protection of cells from the cytopathic effect of HSV-1 was found to be 75-100% at a concentration of 100-150 μg / ml, respectively (table 5).
Таким образом, примеры 1-6 подтверждают достижение заявляемого технического результата заявляемого изобретения, а именно: получение препарата гуминовых кислот из окисленного бурого угля с более низким содержанием токсичных веществ и более широким спектром противовирусного действия в отношении вирусов, патогенных для человека.Thus, examples 1-6 confirm the achievement of the claimed technical result of the claimed invention, namely: obtaining a preparation of humic acids from oxidized brown coal with a lower content of toxic substances and a wider spectrum of antiviral activity against viruses pathogenic to humans.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018110484A RU2678986C1 (en) | 2018-03-23 | 2018-03-23 | Antiviral agent based on humic acids |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018110484A RU2678986C1 (en) | 2018-03-23 | 2018-03-23 | Antiviral agent based on humic acids |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2678986C1 true RU2678986C1 (en) | 2019-02-05 |
Family
ID=65273762
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018110484A RU2678986C1 (en) | 2018-03-23 | 2018-03-23 | Antiviral agent based on humic acids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2678986C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2752872C1 (en) * | 2020-11-03 | 2021-08-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | SARS-CoV-2 CORONAVIRUS REPLICATION INHIBITOR BASED ON HUMIC SUBSTANCES |
| RU2753609C1 (en) * | 2020-10-16 | 2021-08-18 | Николай Иванович Милов | Antiviral humic agent |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2172176C1 (en) * | 2000-06-19 | 2001-08-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Нобель" | Method of antiviral agent preparing |
| US6630179B1 (en) * | 1998-09-23 | 2003-10-07 | Enerkom (Proprietary) Limited | Oxihumic acid and its use in the treatment of various conditions |
| RU2531945C2 (en) * | 2013-01-25 | 2014-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства | Medication against hiv/aids transmission through sexual contact |
-
2018
- 2018-03-23 RU RU2018110484A patent/RU2678986C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6630179B1 (en) * | 1998-09-23 | 2003-10-07 | Enerkom (Proprietary) Limited | Oxihumic acid and its use in the treatment of various conditions |
| RU2172176C1 (en) * | 2000-06-19 | 2001-08-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Нобель" | Method of antiviral agent preparing |
| RU2531945C2 (en) * | 2013-01-25 | 2014-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства | Medication against hiv/aids transmission through sexual contact |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "Гумивит" Рег. уд. МЗ РФ N001636.Р.643.06.2000. ТУ 9197-011-46184368-99 [онлайн]. * |
| "Гумивит" Рег. уд. МЗ РФ N001636.Р.643.06.2000. ТУ 9197-011-46184368-99 [онлайн]. РАШИДА Р.К. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ, ПОЛУЧАЕМЫХ ИЗ ТОРФА И САПРОПЕЛЯ //Казанский медицинский журнал, 2015 г., том 96, N 1, С. 84-89. * |
| РАШИДА Р.К. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ, ПОЛУЧАЕМЫХ ИЗ ТОРФА И САПРОПЕЛЯ //Казанский медицинский журнал, 2015 г., том 96, N 1, С. 84-89. СУХИХ А.С., КУЗНЕЦОВ П.В. ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ГУМИНОВЫХ И ГУМИНОПОДОБНЫХ КИСЛОТ В МЕДИЦИНЕ И ФАРМАЦИИ//Медицина Кубани. N9, 2009. C. 10-14. * |
| СУХИХ А.С., КУЗНЕЦОВ П.В. ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ГУМИНОВЫХ И ГУМИНОПОДОБНЫХ КИСЛОТ В МЕДИЦИНЕ И ФАРМАЦИИ//Медицина Кубани. N9, 2009. C. 10-14. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2753609C1 (en) * | 2020-10-16 | 2021-08-18 | Николай Иванович Милов | Antiviral humic agent |
| RU2752872C1 (en) * | 2020-11-03 | 2021-08-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | SARS-CoV-2 CORONAVIRUS REPLICATION INHIBITOR BASED ON HUMIC SUBSTANCES |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Possible mode of action of antiherpetic activities of a proteoglycan isolated from the mycelia of Ganoderma lucidum in vitro | |
| Tsai et al. | Cyanovirin-N gel as a topical microbicide prevents rectal transmission of SHIV89. 6P in macaques | |
| de Sousa Cardozo et al. | Antiherpetic activity of a sulfated polysaccharide from Agaricus brasiliensis mycelia | |
| US20050238655A1 (en) | Antiviral activity from medicinal mushrooms | |
| RU2678986C1 (en) | Antiviral agent based on humic acids | |
| KR20060017887A (en) | Substances that inhibit membrane virus proliferation, methods for their preparation, pharmaceutical compositions and methods for inhibiting viral infection | |
| KR20010071580A (en) | Compounds obtained from salvia species having antiviral activity | |
| CN106138018A (en) | Dihydroxy benaophenonel application in preparing antiviral and antitumor drug | |
| Qiu et al. | Poly (4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) is an entry inhibitor against both HIV-1 and HSV infections–Potential as a dual functional microbicide | |
| JP7544801B2 (en) | Cyanobacterial extracts, methods for their preparation and use | |
| US12453752B2 (en) | Hevamine-related plant compositions and methods | |
| KR20000069296A (en) | Extracts of Salvia Species Having Antiviral Activity | |
| Barrón et al. | Spirulina as an antiviral agent | |
| Stiles et al. | Effects of λ-carrageenan on in vitro replication of feline herpesvirus and on experimentally induced herpetic conjunctivitis in cats | |
| US6770302B2 (en) | Indian green mussel (Perna viridis) as a source of anti-HIV activity | |
| KR900005170B1 (en) | Ant-letrovirul agent | |
| Ogura et al. | Evaluation of an edible blue-green alga, Aphanothece sacrum, for its inhibitory effect on replication of herpes simplex virus type 2 and influenza virus type A | |
| WO2001078751A1 (en) | Antiviral and antibacterial pharmaceutical preparation 'armenicum' and its use for treatment of infectious diseases | |
| US20050276815A1 (en) | Antiviral activity from medicinal mushrooms | |
| RU2531945C2 (en) | Medication against hiv/aids transmission through sexual contact | |
| RU2752872C1 (en) | SARS-CoV-2 CORONAVIRUS REPLICATION INHIBITOR BASED ON HUMIC SUBSTANCES | |
| Nunn et al. | Influence of vaginal microbiota on the diffusional barrier properties of cervicovaginal mucus | |
| US7056520B2 (en) | Method and composition for the treatment of a viral infection | |
| RU2366697C2 (en) | Agent of systemic action, its application, pharmaceutical compositions, methods of treatment and prevention | |
| Carbone et al. | Evaluation of microalgae antiviral activity and their bioactive compounds. Antibiotics 2021; 10: 746 |