RU2646498C2 - Способы детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и способы диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего - Google Patents
Способы детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и способы диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646498C2 RU2646498C2 RU2014127474A RU2014127474A RU2646498C2 RU 2646498 C2 RU2646498 C2 RU 2646498C2 RU 2014127474 A RU2014127474 A RU 2014127474A RU 2014127474 A RU2014127474 A RU 2014127474A RU 2646498 C2 RU2646498 C2 RU 2646498C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- marker
- blood sample
- cells
- absence
- circulating tumor
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 98
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 83
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 title claims abstract description 80
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 79
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 186
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 106
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 100
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 100
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 102000006388 human trophoblastic glycoprotein 5T4 Human genes 0.000 claims description 14
- 108010083654 human trophoblastic glycoprotein 5T4 Proteins 0.000 claims description 14
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 14
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 13
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 13
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical group C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims description 11
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims description 11
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 9
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 7
- 102000001417 CXC chemokine receptor 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 108010018976 Interleukin-8A Receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 claims description 6
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 5
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims description 5
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 4
- BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 1-[4-[6-amino-5-[(Z)-methoxyiminomethyl]pyrimidin-4-yl]oxy-2-chlorophenyl]-3-ethylurea Chemical compound CCNC(=O)Nc1ccc(Oc2ncnc(N)c2\C=N/OC)cc1Cl BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 0.000 claims description 3
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001012265 Pisum sativum Membrane-associated 30 kDa protein, chloroplastic Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 108010053100 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100033179 Vascular endothelial growth factor receptor 3 Human genes 0.000 claims description 3
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 2
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 238000007726 management method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 208000011317 telomere syndrome Diseases 0.000 description 87
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 62
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 14
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 13
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 13
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 10
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000010817 Wright-Giemsa staining Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- 208000007934 ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- -1 Dynabeads.TM.) Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N [4-[[(2S)-5-(carbamoylamino)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)hexanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]pentanoyl]amino]phenyl]methyl N-[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1S,2R)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-methylamino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-N-methylcarbamate Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]([C@@H](CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)c1ccccc1)OC)N(C)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)OCc1ccc(NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCCN2C(=O)CCC2=O)C(C)C)cc1)C(C)C IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000011337 individualized treatment Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002416 scanning tunnelling spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000005315 stained glass Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- BLUGYPPOFIHFJS-UUFHNPECSA-N (2s)-n-[(2s)-1-[[(3r,4s,5s)-3-methoxy-1-[(2s)-2-[(1r,2r)-1-methoxy-2-methyl-3-oxo-3-[[(1s)-2-phenyl-1-(1,3-thiazol-2-yl)ethyl]amino]propyl]pyrrolidin-1-yl]-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-methylamino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-3-methyl-2-(methylamino)butanamid Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C=1SC=CN=1)CC1=CC=CC=C1 BLUGYPPOFIHFJS-UUFHNPECSA-N 0.000 description 1
- KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione Chemical class C1=CC=C2C(=O)NNC(=O)C2=C1 KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012115 Alexa Fluor 660 Substances 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003091 anti-genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 108010044540 auristatin Proteins 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000339 bright-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000003583 cytomorphological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000003914 endometrial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 229920002457 flexible plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010339 medical test Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 201000008261 skin carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 210000005102 tumor initiating cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012285 ultrasound imaging Methods 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Natural products Cc1cc2C=CC(=O)Oc2cc1OCC=CC(C)(C)O HFTAFOQKODTIJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70589—CD45
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована при диагностике 5Т4-положительного рака. Способы по изобретению включают тестирование образца крови от млекопитающего, где образец крови содержит популяцию клеток, закрепление образца крови на подложке, детектирование в образце крови наличия или отсутствия ядросодержащих клеток с использованием первого маркера, детектирование наличия или отсутствия в образце крови экспрессии на клетке второго маркера, детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке третьего маркера, детектирования в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке четвертого маркера, где четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4 и анализ первого, второго, третьего и четвертого маркеров в популяции клеток для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток. Использование изобретений позволяет выявить антиген 5Т4 на циркулирующих опухолевых клетках, провести морфологическую классификацию их молекулярной характеристики для скринига, мониторинга и ведения пациентов с раком. 3 н. и 28 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение, в целом, относится к способу детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего и к способам диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Человеческий антиген 5Т4 экспрессируется при многочисленных типах рака и по существу отсутствует в нормальных тканях. Недавно были разработаны высокоаффинные моноклональные антитела, которые специфически связываются с антигеном 5Т4, и с антителами к 5Т4 были конъюгированы цитотоксические агенты с образованием конъюгатов антитело-лекарственное средство для применения в лечении 5Т4-положительного рака (патенты США №8044178 и 8309094). Из этого следует, что оценка экспрессии 5Т4 может представлять собой полезный подход для идентификации пациентов с 5Т4-положительным раком. Один подход будет состоять в выявлении антигена 5Т4 на циркулирующих опухолевых клетках (СТС) у пациентов с раковым заболеванием.
Циркулирующие опухолевые клетки были обнаружены в периферической крови пациентов с раками эпителиального происхождения в ультранизких концентрациях (Kraeft et al., Clin Cancer Res 10: 3020-3028, 2004). Было показано, что число этих клеток коррелирует с результатом для групп пациентов с метастатическим раком молочной железы с прогрессирующим на момент взятия образцов заболеванием (Cristofanilli et al., N Engl J Med 351: 781-791, 2004). По этой причине их характеристика представляет значительный биомедицинский интерес для понимания того, как эти клетки могут перемещаться по кровотоку к анатомически отдаленным районам и вызывать метастатическое заболевание. Следовательно, определение СТС, ассоциированных с 5Т4-положительным раком, может обеспечить ценное диагностическое средство для идентификации пациента.
В настоящее время СТС выявляют и анализируют, главным образом, с помощью иммуноцитохимических маркеров, таких как EpCam, и путем применения окрашивания ядер DAPI (4ʹ,6-диамидино-2-фенилиндол), флуоресцентного красителя, который прочно связывается с А-Т-богатыми областями ДНК. Хотя эти подходы были успешными при подсчете и распознавании СТС, они отличаются от стандартных цитопатологических подходов, так как они пренебрегают корреляцией со стандартным морфологическим окрашиванием, от которого зависит диагностическая патология. Это создает трудности при сравнении СТС с опухолевыми клетками из других очагов, полученными путем рутинных диагностических процедур. Хотя способность выявлять СТС потенциально может помочь в диагностике и индивидуализированном лечении рака и способствовать эффективности лечения, понимание биологии СТС может быть усовершенствовано путем включения стандартных цитопатологических методов. В данной области техники существует необходимость применения детальной визуализации СТС с высоким разрешением с традиционными методами диагностики патологии окрашиванием и светлопольной микроскопией для подтверждения потенциальной возможности выполнения стандартной цитопатологической диагностики циркулирующих 5Т4-положительных клеток карциномы и ускорения внедрения клинической диагностики с использованием 5Т4-положительных СТС.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном воплощении настоящего изобретения предложен способ детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, включающий тестирование образца крови от субъекта, где образец крови содержит популяцию клеток; закрепление образца крови на подложке; детектирование в образце крови наличия или отсутствия первого маркера, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия второго маркера, который связывается с циркулирующими опухолевыми клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия третьего маркера, который связывается с популяцией клеток или субпопуляцией популяции клеток, которые не определены как опухолевые клетки; детектирование в образце крови наличия или отсутствия четвертого маркера, который избирательно связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и анализ популяции клеток, выявленной при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров, для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
В другом воплощении способ детектирования наличия или отсутствия 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, указывает на наличие ранней стадии 5Т4-положительного рака, на состояние отсутствия болезни или на состояние неопределяемого заболевания у млекопитающего.
В другом воплощении наличие или отсутствие циркулирующих опухолевых клеток в образце крови служит контролем лечения во время лечения 5Т4-положительного рака или выздоровления от рака.
В другом воплощении популяция клеток представляет собой смешанную популяцию клеток, подложка представляет собой плоскую подложку, микроструйное устройство или картридж, который несет обогащенную популяцию клеток.
В другом воплощении закрепление тестируемого образца на подложке формирует биологический монослой.
В другом воплощении популяцию клеток анализируют по деталям ядра, контуру ядра, наличию или отсутствию ядрышек, качеству цитоплазмы или количеству цитоплазмы, где указанный анализ проводят с использованием DAPI.
В другом воплощении популяцию клеток анализируют путем определения интактных клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, интактных клеток с низким ядерно-цитоплазматическим отношением, ранних апоптотических клеток или поздних апоптотических клеток и распознавания циркулирующих опухолевых клеток.
В другом воплощении первый маркер, второй маркер, третий маркер и четвертый маркер представляют собой флуоресцентные маркеры.
В другом воплощении первый маркер представляет собой цитологический краситель для распознавания циркулирующих опухолевых клеток по морфологии, размеру или ядерно-цитоплазматическому отношению.
В другом воплощении цитологический краситель представляет собой DAPI.
В другом воплощении цитологический краситель представляет собой краситель Райта-Гимзы (Wright-Giemsa).
В другом воплощении второй маркер или третий маркер представляет собой клеточноспецифичный маркер.
В другом воплощении клеточноспецифичный маркер представляет собой цитокератин, CD45, М30, хемокиновый рецептор, CXCR1 (С-Х-С хемокиновый рецептор 1), CXCR4, CD44, CD24, VEGFR-1 (рецептор фактора роста эндотелия сосудов-1), VEGFR-2, VEGFR-3, EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) или HuR (человеческий антиген R).
В другом воплощении детектирование наличия первого маркера, наличия второго маркера, наличия третьего маркера или наличия четвертого маркера дополнительно включает анализ популяции клеток путем прикрепления клеток к подложке, сканирование популяции клеток на подложке и визуализацию клеток путем цифровой микроскопии с использованием перемещения.
В другом воплощении детектирование 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови указывает на наличие 5Т4-положительного рака, где указанный рак выбран из группы, состоящей из карцином мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, колоректальной карциномы, карцином эндометрия, почки, печени, легкого, пищевода, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, кожи, желудка и семенника. Предпочтительно, указанный рак выбран из группы, состоящей из колоректальной карциномы, карцином молочной железы, поджелудочной железы и немелкоклеточной карциномы легкого.
В другом воплощении в изобретении предложен способ диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего, который предположительно имеет 5Т4-положительный рак, включающий тестирование образца крови от субъекта, где образец крови содержит популяцию клеток; закрепление образца крови на подложке; детектирование в образце крови наличия или отсутствия первого маркера, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия второго маркера, который связывается с циркулирующими опухолевыми клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия третьего маркера, который связывается с популяцией клеток или субпопуляцией популяции клеток, которые не определены как опухолевые клетки; детектирование в образце крови наличия или отсутствия четвертого маркера, который избирательно связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и анализ и количественная оценка популяции клеток, выявленной при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров, для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
В другом воплощении в изобретении предложен способ, где указанное количественное определение человеческого антигена 5Т4 на циркулирующих опухолевых клетках применяют для генерирования Η-индекса (H-score), где указанный Η-индекс применяют для выбора популяции пациентов с 5Т4-положительным раком, и где указанные циркулирующие опухолевые клетки охарактеризованы с применением оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4.
В другом воплощении в изобретении предложен способ скрининга конъюгата антитело-лекарственное средство для лечения 5Т4-положительного рака у млекопитающего, который предположительно имеет рак, включающий введение терапевтически эффективного количества конъюгата антитело-лекарственное средство субъекту, предположительно имеющему рак; тестирование образца крови от субъекта до или после лечения лекарственным средством-кандидатом, где образец крови содержит популяцию клеток, предположительно содержащую 5Т4-положительные циркулирующие опухолевые клетки; закрепление образца крови на подложке; детектирование в образце крови наличия или отсутствия первого маркера, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия второго маркера, который связывается с циркулирующими опухолевыми клетками; детектирование в образце крови наличия или отсутствия третьего маркера, который связывается с популяцией клеток или субпопуляцией популяции клеток, которые не определены как опухолевые клетки; детектирование в образце крови наличия или отсутствия четвертого маркера, который избирательно связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и анализ популяции клеток, выявленной при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров, для распознавания циркулирующих опухолевых клеток в образце крови до лечения конъюгатом антитело-лекарственное средство по сравнению с образцом крови после лечения конъюгатом антитело-лекарственное средство, где изменение в соотношении 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и 5Т4-отрицательных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови после лечения по сравнению с соотношением 5Т4-положительных и 5Т4-отрицательных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови до лечения может показывать эффективность конъюгата антитело-лекарственное средство в уменьшении 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток, где указанное соединение-конъюгат антитело-лекарственное средство представляет собой aHTH-5T4-A1-mcMMAF.
В другом воплощении в изобретении предложен способ детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, включающий тестирование образца крови от субъекта, где образец крови содержит популяцию клеток; закрепление образца крови на подложке; детектирование в образце крови наличия или отсутствия первого маркера, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками, где указанный первый маркер представляет собой DAPI; детектирование в образце крови наличия или отсутствия второго маркера, который связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный второй маркер представляет собой цитокератин; детектирование в образце крови наличия или отсутствия третьего маркера, который связывается с популяцией клеток или субпопуляцией популяции клеток, которые не определены как опухолевые клетки, где указанный третий маркер представляет собой CD45; детектирование в образце крови наличия или отсутствия четвертого маркера, который избирательно связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и анализ популяции клеток, выявленной при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров, для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1а показано сравнение диапазона экспрессии 5Т4, применяемое в расчете Н-индекса.
На Фиг. 1б представлены калибровочные клеточные линии, отображающие пороговые значения, установленные для низкого, среднего и высокого уровня экспрессии 5Т4 при немелкоклеточном раке легкого (NSCLC).
На Фиг. 2а показана диаграмма разброса данных экспрессии 5Т4 как для единичных СТС, так и для кластеров СТС в образцах от пациентов с NSCLC, проанализированных с помощью оптимизированного 4-цветного диагностического анализа 5Т4.
На Фиг. 2б показаны данные по 17 образцам от пациентов с NSCLC, проанализированных с помощью оптимизированного 5Т4 4-цветного диагностического анализа и Η-индексы, рассчитанные с использованием калибровочных клеточных линий.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такое же значение, как обычно понимает специалист в данной области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя любые способы и материалы, похожие или эквивалентные таковым, описанным здесь, могут быть применены на практике для тестирования настоящего изобретения, предпочтительными материалами и способами являются описанные здесь. В описании и формуле настоящего изобретения будет применяться следующая терминология.
5Т4 относится к онкофетальному антигену 5Т4, 72 кДа сильногликозилированному трансмембранному гликопротеину, содержащему 42 кДа негликозилированный кор (смотрите патент США №5869053). Человеческий 5Т4 экспрессируется при многочисленных типах рака, включая карциномы мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, ободочной кишки, эндометрия, почки, легкого, пищевода, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, кожи, желудка и яичек, но не ограничиваясь ими. Было показано, что высокоонкогенные клетки, также называемые раковыми стволовыми клетками или клетками, инициирующими опухоль, имеют высокие уровни экспрессии 5Т4 (WO2010/111659). Антитела против 5Т4 включают антитела, которые специфически связываются с человеческим антигеном 5Т4 (смотрите патент США No.8044178).
Термин "биологический монослой" относится к образцу крови, который может находиться на различных стадиях выделения или очистки клеток. Например, биологический монослой может быть частично очищенным и содержать одноядерные и другие клетки, после того как прошел лизис эритроцитов.
Выражение "сортировка популяции клеток перед закреплением образца на подложке" относится к удалению субпопуляции популяции клеток из образца, например образца крови. Сортировка может осуществляться путем избирательного лизиса клеток и центрифугирования субфракции клеток. Также сортировка может осуществляться с использованием флуоресцентного маркера клеток и сортировки клеток с активированной флуоресценцией. Сортировка клеток по клеточным маркерам может осуществляться в форме положительного отбора на циркулирующие опухолевые клетки или в форме отрицательного отбора для удаления неопухолевых клеток.
"Подложка" держит тестируемый образец, например образец крови, содержащий клетки, закрепленные для детектирования и анализа. В одном аспекте подложка может быть плоской. Еще в одном аспекте подложка может иметь некоторую кривизну.
Термины "субъект", "млекопитающее" или "пациент" относятся к любому пациенту-млекопитающему или субъекту, к которому можно применять способы по данному изобретению. "Млекопитающее" относится к пациентам-людям и приматам, не являющимся людьми, а также к экспериментальным животным, таким как кролики, крысы и мыши, и другим животным. В иллюстративном воплощении настоящего изобретения для идентификации субъектов-пациентов, подлежащих лечению в соответствии со способами по данному изобретению, применяют общепринятые способы скрининга для определения факторов риска, ассоциированных с целевым или предполагаемым заболеванием или состоянием, например 5Т4-положительным раком, или для определения статуса существующего заболевания или состояния у субъекта. Эти способы скрининга включают, например, общепринятые обследования для определения факторов риска, которые могут быть ассоциированы с целевым или предполагаемым заболеванием или состоянием. Эти и другие рутинные способы позволяют клиническому специалисту отобрать пациентов, нуждающихся в терапии с применением способов и композиций по данному изобретению.
Термины "образец крови", "препарат крови", "тестируемый образец" и "проба крови" применяют взаимозаменяемо, и они определены как количество крови, взятой или полученной от субъекта, обычно путем венепункции или чрескожного прокалывания вены острым негнущимся тонким зондом или канюлей, несущими гибкий пластиковый катетер, или стальной иглой, соединенной со шприцом или катетером, для применения в медицинских тестах, включая диагностические анализы.
"Рак", "злокачественная опухоль", "солидная опухоль" или "гиперпролиферативное заболевание" применяют как термины-синонимы, и они относятся к любому из ряда заболеваний, которые характеризуются неконтролируемой, патологической пролиферацией 5Т4-положительных клеток, способностью пораженных 5Т4-положительных клеток распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему к другим частям тела (то есть метастазировать), а также любым из ряда характерных структурных и/или молекулярных признаков.
"Первый маркер", "второй маркер", "третий маркер" и "четвертый маркер" распознают циркулирующую опухолевую клетку по цитологическому окрашиванию или по клеточноспецифичному маркеру. Первый маркер представляет собой цитологический краситель, включая DAPI, краситель Райта-Гимзы или другие цитологические красители, известные в данной области техники, но не ограничиваясь ими. Смотри, например, B.F. Atkinson, Atlas of Diagnostic Cytopathology. 2nd Edition, W.B. Saunders Company, Ed., 2003, включенный сюда посредством ссылки во всей своей полноте. Второй и третий маркеры представляют собой клеточноспецифичные маркеры, включая маркеры на цитокератин, CD45, М30, хемокиновый рецептор, CXCR1, CXCR4, CD44, CD24, изоформы рецептора фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3), рецептор эпителиального фактора роста (EGFR) или фактор стабильности иРНК HuR, но не ограничиваясь ими. Четвертый маркер относится к антигену 5Т4.
Эти маркеры распознают различные типы клеток, включая клетки гематопоэтического происхождения, цитокератины на эпителиальных клетках, клетки рака молочной железы, клетки рака предстательной железы, CD44, рецепторы клеточной поверхности, распознающие гиалуроновую кислоту, хемокиновые рецепторы, такие как CXCR1 или CXCR4.
Термин "сортировка" в отношении клеток, как он используется здесь, относится как к механической сортировке клеток, что может быть выполнено с применением, например, клеточного сортера с активацией флуоресценции, так и к анализу клеток на основании экспрессии маркеров клеточной поверхности, например анализа FACS (сортировка клеток с активацией флуоресценции) в отсутствие сортировки.
"Анализ популяции клеток по деталям ядра, контуру ядра, наличию или отсутствию ядрышек, качеству цитоплазмы или количеству цитоплазмы" и "анализ популяции клеток путем оценки интактных клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, интактных клеток с низким ядерно-цитоплазматическим отношением, ранних апоптотических клеток или поздних апоптотических клеток и распознавания циркулирующих опухолевых клеток" может осуществляться с применением методик и аналитических методов как описано в В.F. Atkinson, там же.
"Контроль терапии рака или выздоровления от рака" относится к диагностическим тестам in vivo или in vitro для определения стадии развития рака или эффективности определенного способа лечения рака.
Термин "циркулирующие опухолевые клетки (СТС)" относится к интактным опухолевым клеткам или кластерам опухолевых клеток, которые являются положительными по пан-цитокератину и отрицательными по CD45. СТС также включают клетки, которые являются положительными по 5Т4 и отрицательными по CD45; клетки, которые являются положительными как по пан-цитокератину, так и по 5Т4, и отрицательными по CD45; и клетки, которые морфологически совместимы со злокачественными клетками. Способы для классификации и детектирования СТС были описаны ранее (WO 2011/028905, WO 2011/050103 и US 2009/0317836, включены сюда посредством ссылки).
"Η-индекс" представляет собой взвешенный показатель, который суммирует процентное содержание СТС внутри каждой категории (низкой, средней и высокой), умноженное на их относительные величины категории, с получением показателя от 0 до 300.
В данной области техники известно несколько способов детектирования циркулирующих опухолевых клеток. Низкий уровень концентрации злокачественных эпителиальных клеток в образцах крови, приблизительно одна на 106-107 всех ядросодержащих клеток, делает их трудными для детектирования. Были попытки выявлять и подсчитывать несколькими методами, включая ПЦР (полимеразная цепная реакция), проточную цитометрию, основанные на визуализации иммунологические подходы, иммуномагнитные методы, микроструйные методы и технологию микрочипов.
Например, в системе AdnaTest Breast Cancer® применяется полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR) для детектирования циркулирующих опухолевых клеток (AdnaGen AG, Langenhagen, Germany; OncoVista, Inc., San Antonio, TX). Характерной чертой этого теста является процедура СТС-обогащения, в которой применяется запатентованная смесь иммуномагнитных шариков, покрытых одним из трех антител к антигенам поверхности эпителия. Затем число СТС опосредованно определяют с помощью метода полуколичественной RT-PCR.
CellSearch System™ (Veridex LLC, Warren, NJ) была разработана для целей детектирования СТС в цельной крови. CellSearch system включает метод смешивания образца крови с железными частицами, покрытыми антителом, которое связывается с эпителиальными клетками. Затем эпителиальные клетки отличают от лейкоцитов антителами, которые были помечены флуоресцентным красителем таким образом, чтобы раковые клетки можно было легко отличить и подсчитать.
OncoQuick™ (Greiner Bio-One-, Inc. Longwood, FL) представляет собой другую систему тестирования, которая была разработана для детектирования циркулирующих опухолевых клеток. Эта система представляет собой усиленную систему градиента плотности, которая совмещает центрифугирование в градиенте плотности и методы, основанные на иммунологических.
Способ подсчета числа СТС в пробе от пациента, включающий пропускание указанной пробы через микроструйное устройство, которое избирательно обогащает одной или более чем одной циркулирующей опухолевой клеткой, описан в заявке на патент США №2010/0233693, включенной сюда посредством ссылки. Микроструйное устройство может обогатить одной или более чем одной СТС на основании размера, сродства, способности к деформации или формы.
Способ выделения и анализа СТС с использованием микроканального устройства описан в заявке на патент США №2010/0255479. Этот способ подходит для захвата биологических мишеней из раствора путем предварительного мечения или предварительного смешивания образца, содержащего СТС, с партнером связывания, который специфически связывается с клетками, усиливая захват СТС в микроканальном устройстве.
Каждый из вышеупомянутых способов детектирования циркулирующих опухолевых клеток требует этапа обогащения клетками. Отличительная особенность настоящего изобретения состоит в анализе без обогащения, который демонстрирует способность распознавать значительные количества СТС у большинства пациентов с 5Т4-положительным раком.
Один аспект настоящего изобретения в целом относится к способу детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток (СТС) у млекопитающего или способу диагностики ранней стадии 5Т4-положительного рака у млекопитающего. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу скрининга соединения-кандидата лекарственного средства у млекопитающего для лечения 5Т4-положительного рака.
Предложен способ для детектирования 5Т4-положительных СТС у млекопитающего, который включает получение от млекопитающего, предположительно имеющего рак, образца крови, содержащего смешанную популяцию клеток, предположительно содержащую СТС, закрепление клеток крови и СТС на подложке для формирования биологического монослоя, детектирование в биологическом монослое первого маркера, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками, детектирование в биологическом монослое второго маркера, который связывается с СТС, детектирование в биологическом монослое третьего маркера, который связывается со смешанной популяцией клеток или субпопуляцией смешанной популяции клеток, детектирование в биологическом монослое четвертого маркера, который избирательно связывается с 5Т4-положительными клетками, анализ популяции клеток, выявленной при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров для распознавания СТС; наличие СТС в образце крови, указывающее на наличие 5Т4-положительного рака или ранней стадии 5Т4-положительного рака у млекопитающего. Наличие или отсутствие СТС в образце крови может указывать на наличие состояния отсутствия заболевания или состояния неопределяемого заболевания у млекопитающего.
Способ обеспечивает протокол прикрепления клеток для распознавания клеток эпителиального происхождения в образце крови в сочетании со способом детектирования 5Т4-положительных СТС в крови пациентов с раком. В этом протоколе живые белые клетки крови (WBC), например лейкоциты, и другие клетки в крови, отделяют на предметное стекло, например, в виде биологического монослоя. Лейкоциты включают Т-лимфоциты; моноциты, эозинофилы и нейтрофилы, вовлеченные в фагоцитоз; и, базофилы, вовлеченные в воспалительную реакцию, но не ограничиваются ими.
Этот способ дополнительно обеспечивает флуоресцентное мечение прикрепленных WBC и CTC на адгезивные предметные стекла со специальным покрытием. Клетки флуоресцентно метят первым маркером, который избирательно связывается с ядросодержащими клетками, где указанный маркер представляет собой DAPI, вторым маркером, который связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный второй маркер представляет собой цитокератин (СК), неотъемлемый компонент СТС, с третьим маркером, который связывается с популяцией клеток или субпопуляцией популяции клеток, которые не определены как опухолевые клетки, где указанный третий маркер представляет собой CD45, и четвертым маркером, который избирательно связывается с циркулирующими опухолевыми клетками, где указанный четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4. Затем предметное стекло сканируют на сайты флуоресценции и анализируют с помощью высокопроизводительного вычислительного процесса, который использует алгоритмы, которые оценивают клеточные параметры, определенные при помощи первого, второго, третьего и четвертого маркеров, для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
Этот способ дополнительно обеспечивает способы, использующие флуоресцентную микроскопию, и протокол прикрепления клеток для исследования распространенности СТС у пациентов с 5Т4-положительным раком. Дополнительное преимущество этого способа предоставляет патоморфологу возможность перемещать и изучать интересующие клетки для патологического подтверждения и характеристики. В настоящем изобретении протокол дополнительно включает удаление покровного стекла и/или растворение водорастворимой закрепляющей среды на каждом флуоресцентно меченом предметном стекле и повторное окрашивание тех же самых клеток с использованием второго клеточного маркера, например стандартного красителя Райта-Гимзы, для обеспечения дополнительных возможностей проникновения в морфологию, размер и гетерогенность СТС. Известные CK+-индивидуальные редкие клетки и кластеры редких клеток, которые были локализованы путем высокопроизводительного вычислительного процесса и протокола прикрепления клеток, могут быть оценены морфологически. Хотя флуоресцентные изображения СТС помогли в подтверждении их распознавания, окрашивание Райта-Гимзы обеспечило дополнительную цитологическую информацию о СТС. В дополнительном аспекте изобретения способ может быть применен для оценки различных клеточных маркеров, которые являются специфическими либо для состояния заболевания, для клеточного типа, либо для состояния клеток.
Способность детектировать и характеризовать СТС потенциально может помочь в диагностике и индивидуализированном лечении пациентов с 5Т4-положительным раком. Вследствие их редкости, для исследования СТС требуются специальные способы. В настоящем изобретении предложен подход биопсии жидкой фазы (fluid phase biopsy), который дает возможность применения стандартных цитопатологических способов для детальной морфологической характеристики СТС в крови, полученной от пациентов с раком, и обеспечивает детали цитологических характеристик спектра СТС без применения обогащения, основанного на белках поверхности. Ядросодержащие клетки, выделенные из цельной крови, помещают на адгезивные предметные стекла, иммунофлуоресцентно метят и анализируют на наличие 5Т4-положительных СТС путем цифровой микроскопии. Сочетание этих методов с методами рутинного окрашивания дает возможность идентификации и оценки СТС с использованием световой микроскопии. Как показано с использованием общепринятых патоморфологических способов для наблюдения за этими клетками, СТС демонстрируют высокую степень плеоморфизма между пациентами (inter-patient) и у одного пациента (intra-patient) в препаратах цельной крови, и распознают интактные СТС как с высоким, так и с низким ядерно-цитоплазматическим отношением наряду с СТС, проявляющими признаки апоптоза. Морфологические наблюдения позволяют предположить, что полный спектр клеток, присутствующих в первичных и метастатических очагах опухоли, также можно наблюдать циркулирующими в крови, а также обеспечивают возможную основу морфологической классификации, в пределах которой можно изучать свойства субпопуляций клеток, вовлеченных в метастазирование.
Автоматизированная цифровая микроскопия. Координаты
предполагаемых клеток загружают в систему визуализации редких событий (rare-event imaging system, REIS), полностью автоматизированную систему сканирующей цифровой микроскопии. Компоненты аппаратного обеспечения REIS и запатентованное сканирующее программное обеспечение были детально описаны в другом источнике (Krivacic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10501-10504, 2004).
Измерения. Детектированные флуоресцентные объекты анализируют с помощью программного отбора для дифференцировки редких клеток от ложно положительных. Поскольку эти клетки обычно мельче, чем разрешение лазерного пятна (20 мкм), первый фильтр пропускает все объекты, которые меньше порога размера (20 мкм). Второй фильтр анализирует соотношение между интенсивностями флуоресценции от различных каналов для элиминации гомогенных агрегатов красителя, обычного артефакта иммунофлуоресцентного окрашивания.
Образец может быть подготовлен в виде биологического монослоя путем раскатки образца биологической жидкости, включая кровь или части крови от субъекта, но не ограничиваясь ими. В одном аспекте образец представляет собой монослой клеток. Жидкий образец обрабатывают флуоресцентным веществом, таким как маркерный краситель, который избирательно связывается с различными типами биологических молекул, которые могут находиться на поверхности или внутри клетки, такими как белки, нуклеиновые кислоты или другие молекулы, но не ограничиваясь им. Подходящие маркеры известны в данной области техники для маркировки нескольких различных типов клеток, представляющих клинический интерес, включая выбранные типы раковых клеток, эмбриональных клеток или других подходящих для рассмотрения клеток. Маркеры для многочисленных других клеток, таких как клетки мозга, клетки печени, а также клетки бактерий, могут быть разработаны среди других. Вещество испускает характерный сигнал, такой как флуоресценция или фосфоресценция, в ответ на выбранное возбуждающее облучение, такое как облучение с выбранной длиной волны или спектром света, рентгеновского облучения, облучение электронным пучком или тому подобное. Характерная люминесценция обычно имеет характерную длину волны или спектральный диапазон длин волн. В то время как окрашивание представляет собой преобладающий способ мечения, существуют другие методы, включая применение маркеров, известных как квантовые точки и зонды нано-частиц ДНК.
В другом аспекте изобретения предложен способ определения расположения редкой клетки, например 5Т4-положительной циркулирующей опухолевой клетки (СТС), внутри биологического монослоя. Смотри, например, заявку США №2004/0131241, включенную сюда посредством ссылки. Предметное стекло, которое несет по меньшей мере одну редкую клетку и имеет визирные метки, расположенные в положениях, которые образуют по существу правильный угол, помещают в держатель предметных стекол первой системы визуализации. Определяют первое координатное пространство системы визуализации, и обозначают координаты визирных меток в первом координатном пространстве. Определяют второе координатное пространство второй системы визуализации, и обозначают координаты визирных меток во втором координатном пространстве. Используя обозначенные координаты визирных меток первого координатного пространства, рассчитывают параметры преобразования координат. После этого обозначают координаты по меньшей мере одного объекта в первом координатном пространстве, и координаты этого объекта в первом координатном пространстве преобразуют в однозначно определяемые координаты во втором координатном пространстве, используя параметры преобразования координат.
Как только редкая клетка или СТС была локализована, покровное стекло может быть удалено с биологического слоя, или водорастворимая закрепляющая среда может быть растворена на каждом флуоресцентно окрашенном предметном стекле. Те же самые клетки могут быть повторно окрашены с использованием второго клеточного маркера, например стандартного окрашивания Райта-Гимзы для обеспечения проникновения в морфологию, размер и гетерогенность СТС. Известные цитокератин-положительные (CK+) единичные редкие клетки и кластеры редких клеток могут быть локализованы и оценены морфологически. Хотя флуоресцентные изображения СТС помогли в подтверждении их идентификации, окрашивание Райта-Гимзы обеспечило дополнительную информацию о СТС.
В дополнительном аспекте этот процесс может быть использован для оценки различных клеточных маркеров, которые являются специфическими или для заболевания, или для болезненного состояния, или для клеточного типа, или для состояния клетки. Способы по настоящему изобретению помогут характеризовать СТС. Они дают возможность высококачественной верификации СТС из крови, полученной от пациентов с 5Т4-положительным раком без обогащения, и обеспечивают возможность проникновения в морфологию и характеристики СТС.
Поиск редких метастатических СТС позволяет предположить, что многие СТС являются апоптотическими и неспособными к формированию метастазов и даже, по приблизительным подсчетам, только 1 диссеминированная раковая клетка из 10000 может образовывать метастазы. Таким образом, детектирование, морфологическая классификация и молекулярная характеристика этих редких клеток может иметь целью новые и направленные способы терапии, демонстрируя клиническую значимость СТС.
Лечение рака
Способ лечения рака представляет собой иммунотерапию, где антитела, специфические к антигену 5Т4, могут быть конъюгированы с подходящим лекарственным средством, таким как цитотоксический или цитостатический агент, иммуносупрессирующий агент, радиоизотоп, токсин или им подобные. Конъюгат антиген-лекарственное средство (ADC) может быть использован для доставки лекарственного средства к 5Т4-положительной опухолевой клетке или раковой клетке у пациента. ADC для лечения 5Т4-положительных раков были описаны в патенте США №8309094, включенном сюда посредством ссылки. Примерами ADC являются 5T4-A1-mcMMAF, 5T4-A1-vcMMAE и 5T4-VC-MMAD, где 5Т4-А1 представляет собой гуманизированное антитело, которое специфически связывается с антигеном 5Т4, и ММАЕ, ММАЕ и MMAD представляют собой производные ауристатина. Было показано, что ауристатины нарушают динамику микротрубочек, деление ядра и клетки и обладают противораковой активностью.
Диагностический анализ
Одно воплощение настоящего изобретения проиллюстрировано на Фиг. 1а, где количественное определение антигена 5Т4 на СТС применяют для генерации "Η-индекса" путем суммирования процентных отношений СТС в пределах каждой категории, умноженных на их относительные величины категории, получая показатель от 0 до 300. Как показано на Фиг. 1б, в системе оценки используют экспрессию 5Т4 как определено путем оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4, описанного в примере 1, с использованием панели клеточных линий NSCLC, выбранных на основании уровней экспрессии 5Т4. Эти уровни были подтверждены с помощью стандартных экспериментов по иммуноцитологическому (ICC) окрашиванию. Эти клеточные линии представляют высокий (клеточные линии MDA-MB-435 и NCI-H226), средний (клеточные линии NCI-H1975 и MDA-MB-361) и низкий (клеточные линии NCI-Н522 и NCI-H2122) уровни экспрессии 5Т4. Средний уровень экспрессии 5Т4 в каждой из этих линий применяли для установки пороговых уровней для высокой, средней и низкой экспрессии 5Т4 в этом анализе.
В другом воплощении настоящего изобретения, проводят скрининг пациентов с раком на наличие СТС, которые экспрессируют антиген 5Т4, с использованием оптимизированного 4-цветного диагностического анализа 5Т4, описанного в примере 1. Этот анализ поможет определить уровень экспрессии антигена 5Т4 на СТС путем пересчета и характеристики СТС, а также определения корреляции между экспрессией мишени 5Т4 в СТС и экспрессии 5Т4 в первичной опухоли. Диаграмма разброса данных экспрессии 5Т4, показанная на Фиг. 2а, представлена как для единичных СТС, так и для кластеров СТС, как откалибровано по контрольным клеточным линиям. Как показано на Фиг. 2б, 17 образцов от пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC) были обработаны с помощью оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4. Таким образом, 4-цветный анализ 5Т4 по настоящему изобретению применяют для определения категории Η-индекса, что впоследствии используют в расчете Η-индекса. В конечном счете, диагностический анализ, распознающий СТС, экспрессирующие мишень 5Т4, будут применять для распознавания популяции пациентов с раком, поддающихся лечению, и как средство мониторинга СТС у пациентов с раком во время лечения ADC, таким как 5T4-A1-mcMMAF.
Еще один аспект настоящего изобретения состоит в применении Н-индекса как предварительной системы количественных показателей для характеристики 5Т4 на СТС. Как указано выше, Η-индекс представляет собой взвешенный показатель, который суммирует процентные отношения СТС в пределах каждой категории, умноженные на их относительные величины категории с получением показателя от 0 до 300. СТС подразделяют на 4 категории (0-3) на основании индивидуальной экспрессии 5Т4, как показано на Фиг. 1а. Должно присутствовать как минимум по 10 СТС для того, чтобы подсчитать достаточно полезный Н-индекс.
Для пациентов Η-индексы будут подсчитывать двумя способами: (1) Традиционный Η-индекс (THS) - средняя интенсивность 5Т4 каждого события (единичной СТС или кластера СТС) рассчитывают как одну единицу данных; (2) кластер-взвешенный Η-индекс (Cluster-Weighted Η-Score, CWHS) - среднюю 5Т4-интенсивность каждой СТС (единичной или внутри кластера) рассчитывают как одну точку данных.
Пример расчета Η-индекса с использованием величин для категории Н-индекса и % СТС на категорию представляет собой следующее: Н-индекс Категория 0 (1,5% СТС); Н-индекс Категория 1 (15,0% СТС); Н-индекс Категория 2 (68% СТС); Н-индекс Категория 3 (15,5% СТС). Η индекс=(1,5×0)+(15,0×2)+(68,0×2)+(15,5×3)=198.
Затем Н-индекс может быть применен для выбора популяции пациентов, которая будет иметь наиболее высокую вероятность успеха в лечении с помощью ADC, такого как 5T4-A1-mcMMAF или других 5Т4-специфических ADC. На Фиг. 2б показан расчет Η-индекса для 14 из 17 NSCLC пациентов с применением 4-цветного анализа 5Т4 по настоящему изобретению.
В других воплощениях предложены способы лечения рака, включающие идентификацию пациента, у которого есть 5Т4-положительный рак, путем распознавания 5Т4-положительных СТС с помощью оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4, определение категории указанного пациента путем определения Η-индекса, и введения пациенту, нуждающемуся в таком введении, эффективного количества ADC, которое специфически связывается с 5Т4-положительным раком. Более того, на протяжении лечения пациентов проверяют через промежутки времени на наличие 5Т4-положительных СТС с применением оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4. Детектирование уменьшенного числа 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови после лечения ADC по сравнению с числом 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови до лечения ADC может показывать эффективность соединения-конъюгата антитело-лекарственное средство в лечении 5Т4-положительного рака у млекопитающего.
В другом воплощении анализ популяции клеток с применением оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4 для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток в тестируемых образцах до лечения конъюгатом антитело-лекарственное средство по сравнению с таковыми после обработки конъюгатом антитело-лекарственное средство, где изменение соотношения 5Т4-положительных и 5Т4-отрицательных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови после обработки по сравнению с соотношением 5Т4-положительных и 5Т4-отрицательных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови до лечения может показывать эффективность конъюгата антитело-лекарственное средство в отношении уменьшения количества 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток.
В некоторых воплощениях способ лечения рака включает идентификацию пациента, который имеет 5Т4-положительный рак, путем распознавания 5Т4-положительных СТС с помощью оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4 и введения указанному пациенту эффективного количества ADC, который специфически связывается с 5Т4-положительным раком, в комбинации с химиотерапевтическим агентом. Химиотерапевтический агент является таким, к лечению которым, как оказалось, рак не является устойчивым. В некоторых воплощениях химиотерапевтический агент является таким, к лечению которым, как оказалось, рак является устойчивым. ADC может быть введен пациенту, который также перенес лечение, такое как хирургическое вмешательство, для лечения рака. В другом воплощении дополнительный способ лечения представляет собой радиотерапию. Более того, в течение лечения через некоторые промежутки времени у пациента контролируют наличие 5Т4-положительных СТС с применением оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4.
Детектируемая метка
Специфическая метка или детектируемая группа, применяемая в анализе, может быть детектируемой спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Конкретный тип метки не является критическим аспектом данного изобретения при условии, что она существенно не препятствует специфическому связыванию антитела с клеточным маркером на клетке или циркулирующей опухолевой клетке, применяемой в анализе. Детектируемая группа может представлять собой любое вещество, имеющее детектируемое физическое или химическое свойство. Такие детектируемые метки являются хорошо развитыми в области данных анализов или иммунологических анализов и, в целом, в большинстве случаев любую метку, полезную в таких способах, можно использовать в настоящем изобретении. Таким образом, метка представляет собой любую композицию, детектируемую спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими, электрическими, оптическими или химическими средствами. Полезные метки по настоящему изобретению включают AlexaFlour® флуоресцентные красители (Invitrogen), магнитные шарики (например, Dynabeads.TM.), флуоресцентные красители (например, флуоресцеин изотиоцианат, техасский красный, родамин и им подобные), радиоактивные метки, другие агенты визуализации, такие как микропузырьки (для ультразвуковой визуализации), ферменты (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и другие, обычно применяемые в ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), и калориметрические метки, такие как коллоидное золото или окрашенные стеклянные или пластиковые (например полистироловые, полипропиленовые, латексные и им подобные) шарики.
Метки могут быть соединены прямо или опосредованно с желаемым компонентом анализа в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Как указано выше, можно использовать широкое разнообразие меток, при этом выбор метки зависит от требуемой чувствительности, легкости конъюгирования с соединением, требований стабильности, доступной аппаратуры и средств удаления.
Нерадиоактивные метки часто прикрепляют опосредованными способами. Обычно молекула лиганда (например биотин) ковалентно связана с молекулой. Затем лиганд связывается с молекулой анти-лиганда (например, стрептавидина), который либо является детектируемым по своей природе или ковалентно связан с сигнальной системой, такой как детектируемый фермент, флуоресцентным соединением или хемилюминесцентным соединением. Можно применять несколько лигандов и анти-лигандов. Если у лиганда есть природный анти-лиганд, например биотин, тироксин и кортизол, он может быть применен в сочетании с меченым встречающимся в природе анти-лигандом. Альтернативно любое гаптеновое или антигенное соединение можно применять в комбинации с антителом.
Молекулы также могут быть конъюгированы прямо с соединениями, генерирующими сигнал, например, путем конъюгирования с ферментом или флуорофором. Ферменты, представляющие интерес в качестве меток, прежде всего будут гидролазами, в особенности фосфатазами, эстеразами и гликозидазами или оксидоредуктазами, в особенности пероксидазами. Флуоресцентные соединения включают AlexaFlour® флуоресцентные красители (Invitrogen), флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, данзил, умбеллиферон и им подобные. Хемилюминисцентные соединения включают люциферин и 2,3-дигидрофталазиндионы, например люминол. Обзор различных систем мечения или сигнал-образующих систем, которые можно использовать, смотри в патенте США №4391904, включенном сюда посредством ссылки.
Средства детектирования меток хорошо известны специалистам в данной области техники. Так, например, если метка представляет собой радиоактивную метку, средства для детектирования включают сцинтилляционный счетчик или фотографическую пленку, как в авторадиографии. Если метка представляет собой флуоресцентную метку, она может быть детектирована по возбуждению флуорохрома с соответствующей длинной световой волны и детектированию возникающей в результате флуоресценции. Флуоресценция может быть детектирована визуально, посредством фотографической пленки, путем применения электронных детекторов, таких как приборы с зарядовой связью (CCD) или фотоумножители и им подобные. Подобным образом, ферментативные метки могут быть детектированы путем обеспечения соответствующих подложков для фермента и детектирования образующегося в результате продукта реакции. Наконец, простые калориметрические метки могут быть детектированы путем простого наблюдения цвета, ассоциированного с меткой.
Другие воплощения и применения будут очевидны специалисту в данной области техники в свете настоящего описания.
Пример 1
Оптимизированный 4-цветный диагностический анализ 5Т4 Оптимизированный 4-канальный анализ был разработан для идентификации 5Т4-положительных СТС.СТС были окрашены четырьмя различными красителями и измерены по четырем отдельным каналам. Например, СТС могут быть окрашены анти-CK-AlexaFluor ®555 (красный); анти-CD45-AlexaFluor 488 ® (зеленый); aHTH-5T4-AlexaFluor 660® (пурпурный); и клеточные ядра окрашивают DAPI в голубой цвет. Поскольку AlexaFlour ® флуоресцентные красители (Invitrogen) доступны во многих цветах, доступны альтернативные окрашивающие комбинации.
Пациенты и получение образцов крови
Образцы получали от пациентов с метастатическим раком в пробирки для крови с антикоагулянтом и обрабатывали в течение 24 часов. Образцы крови также получали от нормальных контролей.
Обработка образцов крови для детектирования СТС
Образцы крови встряхивали в течение 5 минут, перед тем подсчитывали число белых клеток крови (WBC) с использованием системы Hemocue WBC (HemoCue, Sweden). На основании подсчета WBC объем крови подвергали лизису эритроцитов (раствор хлорида аммония). После центрифугирования ядросодержащие клетки ресуспендировали в PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) и прикрепляли в виде монослоя на стеклянные предметные стекла, выполненные на заказ. Стеклянные предметные стекла имеют такой же размер, как стандартные предметные стекла для микроскопии, но имеют запатентованное покрытие, которое позволяет максимально сохранять живые клетки. Каждое предметное стекло несет приблизительно три миллиона ядросодержащих клеток, таким образом, число клеток, помещенных на предметное стекло, зависит от числа WBC пациента.
Для детектирования СТС у пациентов с раковым заболеванием в данном исследовании в качестве теста использовали четыре предметных стекла. Оставшиеся предметные стекла, изготовленные для каждого пациента, хранили при -80°С для дальнейших экспериментов. Четыре предметных стекла от каждого пациента размораживали, затем клетки фиксировали 2% параформальдегидом, пермеабилизировали холодным метанолом, и сайты неспецифического связывания блокировали сывороткой козы. Затем предметные стекла инкубировали с моноклональными антителами против пан-цитокератина (Sigma) и флуоресцентным красителем CD45-Alexa (Serotec) в течение 40 минут при 37°С. После промывок PBS предметные стекла инкубировали с антителами козы против антител мыши-Alexa Fluorescent dye (Invitrogen) в течение 20 минут при 37°С. Затем, после промывок PBS, предметные стекла инкубировали с анти-5Т4-антитело-А1еха Fluorescent dye в течение 20 минут при 37°С. Клетки подвергали контрастному окрашиванию DAPI в течение 10 минут и закрепляли водной средой для закрепления.
Визуализация и технический анализ
Все четыре предметных стекла от каждого пациента сканировали с применением изготовленного на заказ флуоресцентного сканирующего микроскопа, который был разработан и оптимизирован для быстрого достоверного сканирования. Каждое предметное стекло полностью сканировали при 10-кратном увеличении в четырех цветах, и было получено свыше 6900 изображений. Полученные в результате изображения подвергали алгоритму анализа, который распознает вероятных кандидатов СТС на основании многочисленных параметров, включая интенсивность цитокератина, интенсивность CD45, интенсивность 5Т4, а также форму и размер ядра и цитоплазмы. Затем технический аналитик анализировал выдвинутых алгоритмом вероятных кандидатов и удалял кандидатов, которые с очевидностью не являются клетками, такие как агрегаты красителя. Профессиональный анализ и интерпретация
Все вероятные СТС-кандидаты были представлены гематопатологу для анализа и интерпретации посредством отчета на веб-основе, где гематопатолог включает или исключает каждую клетку-кандидат как СТС. Клетки были классифицированы как СТС, если они были положительны по цитокератину, положительны по 5Т4, отрицательны по CD45, содержали интактное по DAPI ядро без идентифицируемых апоптотических изменений (пузырения, дегенеративных внешних признаков) или нарушенного внешнего вида, и являлись морфологически отличными от окружающих WBC. Клетки должны иметь цитоплазму, которая является явно периферической, и внутри которой содержится цельное ядро. Цитоплазма может демонстрировать апоптотические изменения, такие как пузырение и неравномерная плотность или умеренное разрушение на периферической границе цитоплазмы, но не должна быть настолько разрушена, что ее связь с ядром находится под вопросом. Изображения были представлены в виде цифровых изображений с возможностью рассмотрения индивидуального флуоресцентного канала, также как и составного изображения. Каждое изображение клетки снабжали примечаниями с дополнительными статистическими данными, отражающими относительный размер ядра, интенсивности флуоресценции и сравнительные интенсивности флуоресценции. Каждый СТС-кандидат был представлен в поле зрения с достаточным числом окружающих WBC, чтобы предоставить возможность для контекстуального сравнения между цитоморфологическими признаками рассматриваемой клетки в сравнении с фоновыми WBC.
Окрашивание Райта-Гимзы. Покровные стекла удаляли с флуоресцентно окрашенных предметных стекол и смачивали в PBS. Затем предметное стекло заливали красителем Райта-Гимзы (Fisher Scientific, Kalamazoo, Mich.) на 3 минуты. Добавляли 1,5 мл фосфатного буфера pH 6,8 (Fisher Scientific, Kalamazoo, Mich.) к покрытому красителем предметного стеклу, и краситель и буфер смешивали путем осторожного покачивания в течение 1 минуты. Затем смесь оставляли на предметном стекле еще на 2 минуты перед тем, как предметное стекло смачивали деионизованной водой и оставляли сохнуть на воздухе.
Этапы оптимизированного 4-цветного анализа 5Т4 по настоящему изобретению, применяемые в процессе идентификации и характеристики СТС, представляют собой: (1) подготовку предметных стекол; (2) хранение предметных стекол; (3) размораживание и окрашивание предметных стекол; (4) сканирование предметных стекол; (5) алгоритмы прогона; и (6) технический анализ и отчеты.
Анализ СТС был специально разработан с учетом клинического контекста, а также необходимости в своевременных технологических инновациях и будущей автоматизации. Все лабораторные процессы следуют строгим стандартным технологическим процедурам, которые были оптимизированы, протестированы и подтверждены. Сбор данных и идентификация кандидатов были автоматизированы с применением специфического интерфейса, что обеспечивают возможность получения решения патоморфолога и последующего отслеживания этих решений.
Эта система является перспективной для обеспечения возможности нового исследования морфологической классификации молекулярной характеристики СТС, а также применений для скрининга в месте наблюдения за пациентом, мониторинга и ведения пациентов с раковым заболеванием.
Claims (52)
1. Способ детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, включающий:
тестирование образца крови от млекопитающего, где образец крови содержит популяцию клеток;
закрепление образца крови на подложке;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия ядросодержащих клеток с использованием первого маркера;
детектирование наличия или отсутствия в образце крови экспрессии на клетке второго маркера;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке третьего маркера;
детектирования в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке четвертого маркера, где четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и
анализ первого, второго, третьего и четвертого маркеров в популяции клеток для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
2. Способ по п. 1, где обнаружение наличия 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови указывает на наличие ранней стадии 5Т4-положительного рака у млекопитающего.
3. Способ по п. 1, где обнаружение отсутствия 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови указывает на отсутствие заболевания или на неизмеряемые проявления заболевания у млекопитающего.
4. Способ по п. 1, где обнаружение наличие или отсутствие 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови служит контролем лечения во время лечения 5Т4-положительного рака или выздоровления от рака.
5. Способ по п. 1, где популяция клеток представляет собой смешанную популяцию клеток.
6. Способ по п. 1, где подложка представляет собой плоскую подложку.
7. Способ по п. 1, где подложка представляет собой микроструйное устройство.
8. Способ по п. 1, где закрепление образца крови на подложке приводит к формированию биологического монослоя.
9. Способ по п. 1, где первый маркер, второй маркер, третий маркер или четвертый маркер детектируют с использованием флуоресценции.
10. Способ по п. 1, где первый маркер применяют в анализе популяции клеток по деталям ядра, контуру ядра, наличию или отсутствию ядрышек, качеству цитоплазмы или количеству цитоплазмы.
11. Способ по п. 10, где первый маркер представляет собой DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол).
12. Способ по п. 10, дополнительно включающий анализ популяции клеток путем определения интактных клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, интактных клеток с низким ядерно-цитоплазматическим отношением, ранних апоптотических клеток или поздних апоптотических клеток и распознавание циркулирующих опухолевых клеток и кластеров циркулирующих опухолевых клеток.
13. Способ по п. 1, где второй маркер или третий маркер представляет собой клеточноспецифичный маркер.
14. Способ по п. 13, где клеточноспецифичный маркер представляет собой цитокератин, CD45, М30, хемокиновый рецептор, CXCR1 (С-Х-С хемокиновый рецептор 1), CXCR4, CD44, CD24, VEGFR-1 (рецептор фактора роста эндотелия сосудов-1), VEGFR-2, VEGFR-3, EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) или HuR (человеческий антиген R).
15. Способ по п. 14, где второй маркер представляет собой цитокератин.
16. Способ по п. 14, где третий маркер представляет собой CD45.
17. Способ по п. 1, дополнительно включающий цитологическое окрашивание для распознавания циркулирующей опухолевой клетки по морфологии, размеру или ядерно-цитоплазматическому отношению.
18. Способ по п. 17, где цитологический краситель представляет собой краситель Райта-Гимзы.
19. Способ по п. 1, дополнительно включающий анализ популяции клеток по прикреплению клеток к подложке, сканирование популяции клеток на подложке и визуализацию клеток посредством цифровой микроскопии с использованием перемещения.
20. Способ по п. 1, дополнительно включающий количественную оценку 5Т4-антигена человека на циркулирующих опухолевых клетках для генерирования Н-индекса, где указанный Н-индекс применяют для выбора популяции пациентов с 5Т4-положительным раком.
21. Способ по п. 1, где обнаружение наличия первого маркера, наличия второго маркера, отсутствия третьего маркера и присутствие четвертого маркера указывает на наличие 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток.
22. Способ по п. 1, где детектирование наличия 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток в образце крови указывает на наличие 5Т4-положительного рака у млекопитающего.
23. Способ по п. 22, где 5Т4-положительный рак выбран из группы, состоящей из карцином мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, толстой кишки, эндометрия, почки, легкого, пищевода, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, кожи, желудка и яичек.
24. Способ диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, включающий:
тестирование образца крови от млекопитающего, где образец крови содержит популяцию клеток;
закрепление образца крови на подложке;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия ядросодержащих клеток с использованием первого маркера;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке второго маркера;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке третьего маркера;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке четвертого маркера, где четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и
анализ и количественную оценку первого, второго, третьего и четвертого маркеров в популяции клеток для распознавания и характеристики циркулирующей опухолевой клетки.
25. Способ по п. 24, где количественное измерение человеческого антигена 5Т4 на циркулирующих опухолевых клетках используют для генерирования Н-индекса (H-score), который применяют для выбора группы пациентов с 5Т4-положительным раком.
26. Способ по п. 24, где первый маркер представляет собой DAPI, второй маркер представляет собой цитокератин и третий маркер представляет собой CD45.
27. Способ по п. 24, где обнаружение наличия первого маркера, наличия второго маркера, отсутствия третьего маркера и присутствия четвертого маркера указывает на наличие 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток.
28. Способ детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток у млекопитающего, предположительно имеющего 5Т4-положительный рак, включающий:
тестирование образца крови от млекопитающего, где образец крови содержит популяцию клеток;
закрепление образца крови на подложке;
детектирование наличия или отсутствия в образце крови ядросодержащих клеток с использованием первого маркера, где первый маркер представляет собой DAPI;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке второго маркера, где второй маркер представляет собой цитокератин;
детектирование в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке третьего маркера, где третий маркер представляет собой CD45;
определение в образце крови наличия или отсутствия экспрессии на клетке четвертого маркера, где четвертый маркер представляет собой человеческий антиген 5Т4; и
анализ и количественную оценку первого, второго, третьего и четвертого маркеров в популяции клеток для распознавания и характеристики циркулирующих опухолевых клеток.
29. Способ по п. 28, где количественную оценку 5Т4-антигена человека на циркулирующих опухолевых клетках используют для генерирования Н-индекса, где указанный Н-индекс применяют для выбора популяции пациентов с 5Т4-положительным раком.
30. Способ по п. 28, где обнаружение наличия первого маркера, наличия второго маркера, отсутствия третьего маркера и присутствия четвертого маркера указывает на наличие 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток.
31. Способ по п. 28, где анализ и количественную оценку первого, второго, третьего и четвертого маркеров в популяции клеток используют для определения включения млекопитающих в лечение 5Т4-положительного рака или исключения из него.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261590066P | 2012-01-24 | 2012-01-24 | |
| US61/590,066 | 2012-01-24 | ||
| US201361753665P | 2013-01-17 | 2013-01-17 | |
| US61/753,665 | 2013-01-17 | ||
| PCT/IB2013/050547 WO2013111054A1 (en) | 2012-01-24 | 2013-01-22 | Methods for detecting 5t4-positive circulating tumor cells and methods of diagnosis of 5t4-positive cancer in a mammalian subject |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014127474A RU2014127474A (ru) | 2016-03-20 |
| RU2646498C2 true RU2646498C2 (ru) | 2018-03-05 |
Family
ID=47844410
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014127474A RU2646498C2 (ru) | 2012-01-24 | 2013-01-22 | Способы детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и способы диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10254286B2 (ru) |
| EP (1) | EP2807485B1 (ru) |
| JP (1) | JP6254951B2 (ru) |
| KR (1) | KR101716555B1 (ru) |
| CN (1) | CN104094116B (ru) |
| AU (2) | AU2013213301A1 (ru) |
| BR (1) | BR112014018192A8 (ru) |
| CA (1) | CA2861437C (ru) |
| ES (1) | ES2724232T3 (ru) |
| IL (1) | IL233543B (ru) |
| IN (1) | IN2014DN07019A (ru) |
| MX (1) | MX361058B (ru) |
| RU (1) | RU2646498C2 (ru) |
| WO (1) | WO2013111054A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2845800C1 (ru) * | 2024-12-24 | 2025-08-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ дифференциальной диагностики рака мочевого пузыря, рака почки и рака легкого |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2803804B2 (ja) | 1992-08-21 | 1998-09-24 | 株式会社長澤製作所 | ボタン錠 |
| CN102782498A (zh) | 2009-10-21 | 2012-11-14 | 斯克里普斯研究所 | 用非稀有细胞检测稀有细胞的方法 |
| US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
| WO2015172038A1 (en) * | 2014-05-09 | 2015-11-12 | The Scripps Research Institute | Compositions and methods for fluid biopsy of melanoma |
| CN106461664A (zh) * | 2013-12-30 | 2017-02-22 | 斯克利普斯研究所 | 用于肺癌的循环肿瘤细胞诊断 |
| US10527624B2 (en) | 2014-01-27 | 2020-01-07 | Epic Sciences, Inc. | Circulating tumor cell diagnostics for prostate cancer biomarkers |
| EP3108246B1 (en) * | 2014-02-21 | 2019-10-09 | Epic Sciences, Inc. | Methods for analyzing rare circulating cells |
| WO2015155345A1 (en) * | 2014-04-11 | 2015-10-15 | Medimmune Limited | Antibodies and antibody-drug conjugates |
| CN107109477B (zh) * | 2014-08-25 | 2021-01-12 | 创新微技术公司 | 在血液中的循环细胞生物标记在检测和诊断疾病中的应用及其分离方法 |
| CN108064343B (zh) * | 2015-04-21 | 2021-07-09 | 基因泰克公司 | 用于前列腺癌分析的组合物和方法 |
| WO2017079763A1 (en) * | 2015-11-06 | 2017-05-11 | Ventana Medical Systems, Inc. | Representative diagnostics |
| KR102478639B1 (ko) | 2016-02-23 | 2022-12-19 | 노을 주식회사 | 표지 물질을 저장하는 패치, 이를 이용하는 조직 진단 방법 및 장치 |
| KR20170099738A (ko) | 2016-02-23 | 2017-09-01 | 노을 주식회사 | 접촉식 염색 패치 및 그 제조 방법 |
| KR20170099787A (ko) * | 2016-02-23 | 2017-09-01 | 노을 주식회사 | 표지 물질을 저장하는 패치, 이를 이용하는 조직 진단 방법 및 장치 |
| US10371610B2 (en) | 2016-02-23 | 2019-08-06 | Noul Co., Ltd. | Contact-type patch, staining method using the same, and manufacturing method thereof |
| KR102406596B1 (ko) * | 2016-02-23 | 2022-06-10 | 노을 주식회사 | 패치를 이용하는 ctc 진단 방법 및 장치 |
| EP3606963B1 (en) | 2017-04-03 | 2023-08-30 | F. Hoffmann-La Roche AG | Antibodies binding to steap-1 |
| WO2019005902A1 (en) * | 2017-06-27 | 2019-01-03 | Qcdx, Llc | SYSTEM AND METHODS FOR DIAGNOSING QUANTITATIVE LIQUID BIOPSY |
| CN107918013A (zh) * | 2017-09-25 | 2018-04-17 | 浙江天科高新技术发展有限公司 | 化学发光酶免测定循环肿瘤细胞中K‑Ras蛋白的方法及试剂盒 |
| JP7678424B2 (ja) | 2018-05-10 | 2025-05-16 | 学校法人順天堂 | 画像解析方法、装置、コンピュータプログラム、及び深層学習アルゴリズムの生成方法 |
| US20220002429A1 (en) * | 2018-10-24 | 2022-01-06 | Northwestern University | Tumor cell aggregation inhibitors' for treating cancer |
| JP7381003B2 (ja) * | 2019-04-26 | 2023-11-15 | 学校法人順天堂 | 疾患解析を支援する方法、装置、及びコンピュータプログラム、並びにコンピュータアルゴリズムを訓練する方法、装置、及びプログラム |
| US20230175073A1 (en) | 2021-12-07 | 2023-06-08 | Epic Sciences, Inc. | Enhanced characterization of breast cancer |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007089911A2 (en) * | 2006-01-30 | 2007-08-09 | The Scripps Research Institute | Methods for detection of circulating tumor cells and methods of diagnosis of cancer in a mammalian subject |
| WO2010070276A1 (en) * | 2008-12-15 | 2010-06-24 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Method |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4391904A (en) | 1979-12-26 | 1983-07-05 | Syva Company | Test strip kits in immunoassays and compositions therein |
| EP0403559A1 (en) | 1988-03-04 | 1990-12-27 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Improvements relating to antigens |
| US5869053A (en) | 1988-03-04 | 1999-02-09 | Cancer Research Campaign Technology, Ltd. | 5T4 antigen from human trophoblasts |
| NZ500633A (en) | 1997-06-04 | 2002-10-25 | Oxford Biomedica Ltd | Vector |
| AU1290001A (en) | 1999-11-18 | 2001-05-30 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Antibodies |
| GB0126378D0 (en) | 2001-11-02 | 2002-01-02 | Oxford Biomedica Ltd | Antigen |
| US7305112B2 (en) | 2002-10-15 | 2007-12-04 | The Scripps Research Institute | Method of converting rare cell scanner image coordinates to microscope coordinates using reticle marks on a sample media |
| GT200500255A (es) * | 2004-09-10 | 2006-04-10 | Anticuerpos anti-5ta humanizados y conjugados anticuerpo anti-5ta/calicheamicina | |
| PT1994055E (pt) | 2006-03-10 | 2014-09-15 | Wyeth Llc | Anticorpos anti-5t4 e utilizações dos mesmos |
| WO2008131048A2 (en) | 2007-04-16 | 2008-10-30 | Cellpoint Diagnotics, Inc. | Devices and methods for diagnosing, prognosing, or theranosing a condition by enriching rare cells |
| EP2995953B1 (en) | 2009-03-24 | 2017-11-29 | Biocept, Inc. | Devices and methods of cell capture and analysis |
| WO2010111659A1 (en) | 2009-03-27 | 2010-09-30 | Wyeth Llc | Tumor-initiating cells and methods for using same |
| EP2473619A4 (en) | 2009-09-03 | 2013-03-27 | Scripps Research Inst | METHOD FOR CATEGORIZING CIRCULATING TUMOR CELLS |
| CN102782498A (zh) | 2009-10-21 | 2012-11-14 | 斯克里普斯研究所 | 用非稀有细胞检测稀有细胞的方法 |
| WO2011127219A1 (en) * | 2010-04-06 | 2011-10-13 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | Circulating biomarkers for disease |
| ES2652600T3 (es) | 2010-07-07 | 2018-02-05 | The Regents Of The University Of Michigan | Diagnóstico y tratamiento de cáncer de mama |
| CA2830338C (en) | 2011-04-01 | 2016-11-15 | Wyeth Llc | Antibody-drug conjugates |
-
2013
- 2013-01-22 IN IN7019DEN2014 patent/IN2014DN07019A/en unknown
- 2013-01-22 ES ES13708526T patent/ES2724232T3/es active Active
- 2013-01-22 CN CN201380006333.9A patent/CN104094116B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-01-22 EP EP13708526.2A patent/EP2807485B1/en active Active
- 2013-01-22 AU AU2013213301A patent/AU2013213301A1/en not_active Abandoned
- 2013-01-22 US US14/374,083 patent/US10254286B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2013-01-22 KR KR1020147020394A patent/KR101716555B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2013-01-22 CA CA2861437A patent/CA2861437C/en not_active Expired - Fee Related
- 2013-01-22 BR BR112014018192A patent/BR112014018192A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-01-22 RU RU2014127474A patent/RU2646498C2/ru active
- 2013-01-22 MX MX2014008928A patent/MX361058B/es active IP Right Grant
- 2013-01-22 WO PCT/IB2013/050547 patent/WO2013111054A1/en not_active Ceased
- 2013-01-22 JP JP2014553836A patent/JP6254951B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-07-07 IL IL233543A patent/IL233543B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-08-24 AU AU2018220154A patent/AU2018220154A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007089911A2 (en) * | 2006-01-30 | 2007-08-09 | The Scripps Research Institute | Methods for detection of circulating tumor cells and methods of diagnosis of cancer in a mammalian subject |
| WO2010070276A1 (en) * | 2008-12-15 | 2010-06-24 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Method |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MYERS K.A. et al. Metastasis-associated 5T4 antigen disrupts cell-cell contacts and induces cellular motility in epithelial cells// International Journal of Cancer Volume 68, Issue 1, pages 84-92, 27 September 1996 [он лайн] [найдено 10.11.2015] найдено в Интернет: 3.0.CO;2-6/epdf"http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)1097-0215(19960927)68:1<84::AID-IJC15>3.0.CO;2-6/epdf. * |
| ZHAO Y et al. 5T4 oncotrophoblast glycoprotein: janus molecule in life and a novel potential target against tumors// Cell Mol Immunol. 2007 Apr;4(2):99-104 [он лайн] [найдено 10.11.2015] найденов Интернет: http://www.cm.ustc.edu.cn/4/2/99.pdf . * |
| ZHAO Y et al. 5T4 oncotrophoblast glycoprotein: janus molecule in life and a novel potential target against tumors// Cell Mol Immunol. 2007 Apr;4(2):99-104 [он лайн] [найдено 10.11.2015] найденов Интернет: http://www.cm.ustc.edu.cn/4/2/99.pdf . MYERS K.A. et al. Metastasis-associated 5T4 antigen disrupts cell-cell contacts and induces cellular motility in epithelial cells// International Journal of Cancer Volume 68, Issue 1, pages 84-92, 27 September 1996 [он лайн] [найдено 10.11.2015] найдено в Интернет: 3.0.CO;2-6/epdf"http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)1097-0215(19960927)68:1<84::AID-IJC15>3.0.CO;2-6/epdf. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2845800C1 (ru) * | 2024-12-24 | 2025-08-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ дифференциальной диагностики рака мочевого пузыря, рака почки и рака легкого |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2015507190A (ja) | 2015-03-05 |
| US10254286B2 (en) | 2019-04-09 |
| HK1202923A1 (en) | 2015-10-09 |
| IN2014DN07019A (ru) | 2015-04-10 |
| JP6254951B2 (ja) | 2017-12-27 |
| KR101716555B1 (ko) | 2017-03-14 |
| US20150017661A1 (en) | 2015-01-15 |
| CN104094116B (zh) | 2017-05-31 |
| ES2724232T3 (es) | 2019-09-09 |
| CA2861437A1 (en) | 2013-08-01 |
| MX361058B (es) | 2018-11-23 |
| IL233543B (en) | 2018-02-28 |
| MX2014008928A (es) | 2014-10-24 |
| CN104094116A (zh) | 2014-10-08 |
| KR20140100580A (ko) | 2014-08-14 |
| WO2013111054A1 (en) | 2013-08-01 |
| RU2014127474A (ru) | 2016-03-20 |
| AU2018220154A1 (en) | 2018-09-13 |
| EP2807485A1 (en) | 2014-12-03 |
| EP2807485B1 (en) | 2019-03-13 |
| CA2861437C (en) | 2018-08-21 |
| BR112014018192A8 (pt) | 2021-03-02 |
| IL233543A0 (en) | 2014-08-31 |
| AU2013213301A1 (en) | 2014-07-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2646498C2 (ru) | Способы детектирования 5Т4-положительных циркулирующих опухолевых клеток и способы диагностики 5Т4-положительного рака у млекопитающего | |
| Lustberg et al. | Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients | |
| US6960449B2 (en) | Class characterization of circulating cancer cells isolated from body fluids and methods of use | |
| KR101604649B1 (ko) | 혈액 내 순환 흑색종 세포의 자동화된 계산 및 특징화 | |
| JP2018185316A (ja) | 循環腫瘍細胞の検出方法および哺乳類対象における癌の診断方法 | |
| US8088715B2 (en) | Detection of circulating tumor cells in peripheral blood with an automated scanning fluorescence microscope | |
| CN101036055B (zh) | 循环癌细胞上Her-2/neu蛋白的增加水平的检测以及治疗 | |
| MX2014006884A (es) | Aparato, sistema y metodo para identificar celulas tumorales circulantes. | |
| KR20170094523A (ko) | 생물학적 샘플에서 희귀 사건 분석을 위한 고감도 다중매개변수 방법 | |
| US20080113350A1 (en) | Blood test to monitor the genetic changes of progressive cancer using immunomagnetic enrichment and fluorescence in situ hybridization (FISH) | |
| WO1999044064A1 (en) | Method and compositions for differential detection of primary tumor cells and metastatic cells | |
| US20170192003A1 (en) | Compositions and methods for fluid biopsy of melanoma | |
| JP6936231B2 (ja) | 転移性去勢抵抗性前立腺癌（ｍＣＲＰＣ）患者における治療選択のためのバイオマーカーとしてのアンドロゲン受容体バリアント７ | |
| CA2704285A1 (en) | A pre-clinical method for monitoring serial changes in circulating breast cancer cells in mice | |
| EP3140656B1 (en) | Compositions and methods for fluid biopsy of melanoma | |
| EP3924733B1 (en) | Ccr5-based methods for predicting overall and progression free survival in subjects having cancer | |
| KR20240033068A (ko) | 순환성 암 관련 대식세포 유사 세포(caml)의 변화를 이용한 암 치료 반응의 예측 및/또는 모니터링 방법 | |
| CN103608681A (zh) | 用于检测肿瘤细胞的类固醇受体测定 | |
| RU2846787C1 (ru) | Способ выявления циркулирующих клеток в крови больных раком легкого с помощью проточной цитометрии с использованием опухолеспецифичных ДНК-аптамеров | |
| HK1202923B (en) | Methods for detecting 5t4-positive circulating tumor cells and methods of diagnosis of 5t4-positive cancer in a mammalian subject | |
| TW202127033A (zh) | 癌幹細胞之生物標誌 | |
| WO2025076241A1 (en) | Methods for detecting cancer in a subject |