MX2014008928A - Metodo para detectar celulas tumorales circunlantes 5t4-positivas y metodos de diagnostico de cancer 5t4-positivo en un sujeto mamifero. - Google Patents
Metodo para detectar celulas tumorales circunlantes 5t4-positivas y metodos de diagnostico de cancer 5t4-positivo en un sujeto mamifero.Info
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Abstract
Se proveen métodos para detectar células tumorales circulantes 5T4-positivas en un sujeto mamífero; se proveen métodos de diagnosticar cáncer 5T4-positivo en un sujeto mamífero; los métodos de detección o diagnóstico indican la presencia de cáncer metastásico 5T4-positivo o cáncer 5T4-positivo de etapa temprana.
Description
MÉTODO PARA DETECTAR CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES 5T4- POSITIVAS Y MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE CÁNCER 5T4-POSIT1VO
EN UN SUJETO MAMÍFERO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención en general se refiere a un método para detectar células tumorales circulantes 5T4-positivas en un sujeto mamífero y a métodos para diagnosticar cáncer 5T4-positivo en un sujeto mamífero.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El antígeno 5T4 humano es expresado en numerosos tipos de cáncer y está sustancialmente ausente de tejidos normales. Recientemente, se han desarrollado anticuerpos monoclonales de alta afinidad que específicamente se unen al antígeno 5T4 y se han conjugado agentes citotóxicos a los anticuerpos 5T4 para formar conjugados de fármaco de anticuerpo para usarse en el tratamiento de cáncer 5T4-positivo (patentes de E.U.A. Nos. 8,044,178 y 8,309,094). Entonces, prosigue que la evaluación de expresión 5T4 podría ser una propuesta útil para identificar pacientes con cáncer 5T4-positivo. Una propuesta sería la detección del antígeno 5T4 en células tumorales circulantes (CTCs) en pacientes con cáncer.
Se han observado células tumorales circulantes en la sangre
periférica de pacientes con cánceres derivados del epitelio a concentraciones ultra bajas (Kraeft y otros, Clin Cáncer Res 10: 3020-3028, 2004). El número de estas células ha sido mostrado que se correlaciona con el resultado por cohortes de pacientes con cáncer de mama metastásico con enfermedad progresiva al momento de la muestra (Cristofanilli y otros, N Engl J ed 351 : 781-791 , 2004). Por esta razón, su caracterización es de interés biomédico considerable a fin de entender cómo estas células pueden viajar vía el torrente sanguíneo a sitios anatómicamente distantes y formar enfermedad metastásica. Por consiguiente, identificar CTCs asociados con cáncer 5T4-positivo podría proveer una herramienta diagnóstica valiosa para la identificación de pacientes.
En la actualidad, se detectan CTCs y se analizan primariamente a través de marcadores inmunocitoquímicos tales como EpCam y el uso de tinción nuclear con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol), una tinción fluorescente que se une fuertemente a regiones ricas en A-T en ADN. Aunque estas propuestas han sido exitosas en enumerar y distinguir CTCs, difieren de propuestas citopatológicas estándar ya que omiten la correlación con tinción morfológico estándar sobre lo cual la patología diagnóstica es dependiente. Esto crea dificultad en comparar CTCs con células tumorales de otros sitios obtenidos por procedimientos diagnósticos de rutina. Aunque la habilidad de detectar CTCs tiene el potencial de ayudar en el tratamiento diagnóstico e individualizado de cáncer y eficacia de tratamiento, el entendimiento de la biología de CTCs se podría mejorar al incluir métodos citopatológicos
estándar. Existe una necesidad en la técnica por utilizar toma de imágenes de alta resolución de CTCs con método de tinción de patología diagnóstica convencional y microscopía de campo brillante para conferir el potencial de hacer diagnóstico citopatológico estándar de circular células de carcinoma 5T4-positivas circulantes y avanzando la adopción de diagnóstico usando CTCs 5T4-positivas en la clínica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En una modalidad, la presente invención provee un método para detectar células tumorales circulantes 5T4-positivas en un sujeto mamífero que se sospecha tiene cáncer 5T4-positivo que comprende: probar una muestra de sangre del sujeto, en donde la muestra de sangre comprende una población celular; montar la muestra de sangre en un sustrato; detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a células nucleadas; detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en la muestra de sangre que se une a las células tumorales circulantes; detectar la presencia o ausencia de un tercer marcador en la muestra de sangre que se une a la población celular o una subserie de la población celular que no se determinan como células tumorales; detectar la presencia o ausencia de un cuarto marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a las células tumorales circulantes en donde dicho cuarto marcador es antígeno 5T4 humano; y, analizar la población celular
detectada por el primer, segundo, tercer y cuarto marcador para identificar y caracterizar las células tumorales circulantes.
En otra modalidad, el método para detectar la presencia o ausencia de células tumorales circulantes 5T4-positivas en un sujeto mamífero que se sospecha tiene un cáncer 5T4-positivo indica la presencia de cáncer 5T4-positivo de etapa temprana, un estado libre de enfermedad, o un estado de enfermedad no medible en el sujeto mamífero.
En otra modalidad, la presencia o ausencia de las células tumorales circulantes en la muestra de sangre indica manejo de terapia durante terapia de cáncer 5T4-positivo o recuperación de cáncer.
En otra modalidad, la población celular es una población celular mixta, el sustrato es un sustrato plano, un dispositivo micro fluido, o un cartucho que sostiene una población enriquecida de células.
En otra modalidad, montar la muestra de prueba en el sustrato forma una monocapa biológica.
En otra modalidad, la población celular es analizada por detalle nuclear, contorno nuclear, presencia o ausencia de nucléolos, calidad de citoplasma, o cantidad de citoplasma, en donde dicho análisis usa DAPI.
En otra modalidad, la población celular es analizada al medir células intactas con una relación alta nuclear a citoplásmica, células intactas con una relación baja nuclear a citoplásmica, células apoptóticas tempranas, o células apoptóticas tardías, e identificar las células tumorales circulantes.
En otra modalidad, el primer marcador, el segundo marcador, el
tercer marcador y el cuarto marcador es un marcador fluorescente.
En otra modalidad, el primer marcador es una tinción citológica para identificar la célula tumoral circulante por morfología, tamaño o relación nuclear a citoplásmica.
En otra modalidad, la tinción citológica es DAPI.
En otra modalidad, la tinción citológica es tinción Wright-Giemsa.
En otra modalidad, el segundo marcador o el tercer marcador es un marcador específico de célula.
En otra modalidad, el marcador específico de célula es citoqueratina, CD45, M30, receptor de quimosina, CXCR1 , CXCR4, CD44, CD24, VEGFR-1 , VEGFR-2, VEGFR-3, EGFR o HuR.
En otra modalidad, detectar la presencia del primer marcador, la presencia del segundo marcador, la presencia del tercer marcador o la presencia del cuarto marcador, además comprende analizar la población celular por fijación celular al sustrato, escaneando la población celular en el sustrato y tomar imágenes de las células por microscopía digital usando traslado.
En otra modalidad, la detección de células tumorales circulantes 5T4-positivas en la muestra de sangre indica presencia de cáncer 5T4-positivo, en donde dicho cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste de carcinomas de la vejiga, mama, cérvix, colon-recto, endometrio, riñon, hígado, pulmón, esófago, ovario, próstata, páncreas, piel, estómago y testículos. Preferiblemente, dicho cáncer se selecciona a partir del grupo que
consiste de carcinomas colorectales, de mama, pancreáticos, y pulmonares de célula no pequeña.
En otra modalidad, la invención provee un método de diagnosticar cáncer 5T4-positivo en un sujeto mamífero que se sospecha tiene cáncer 5T4-positivo que comprende: probar una muestra de sangre del sujeto, en donde la muestra de sangre comprende una población celular; montar la muestra de sangre en un sustrato; detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a células nucleadas; detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en la muestra de sangre que se une a las células tumorales circulantes; detectar la presencia o ausencia de un tercer marcador en la muestra de sangre que se une a la población celular o una subserie de la población celular que no se determinan como células tumorales; detectar la presencia o ausencia de un cuarto marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a las células tumorales circulantes en donde dicho cuarto marcador es antígeno 5T4 humano; y, analizar y cuantificar la población celular detectada por el primer, segundo, tercer y cuarto marcador para identificar y caracterizar las células tumorales circulantes.
En otra modalidad, la invención provee un método en donde dicha cuantificación del antígeno 5T4 humano en las células tumorales circulantes se usa para generar una calificación H, en donde dicha calificación H se usa para seleccionar una población de pacientes con cáncer 5T4-positivo, y en donde dichas células tumorales circulantes se caracterizan
utilizando un ensayo de 4 colores 5T4 optimizado.
En otra modalidad, la invención provee un método de filtrar un conjugado de anticuerpo-fármaco para tratamiento de cáncer 5T4-positivo en un sujeto mamífero que se sospecha tiene cáncer que comprende: administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado de anticuerpo-fármaco al sujeto que se sospecha tiene cáncer; probar una muestra de sangre del sujeto antes y después del tratamiento con el candidato de fármaco, en donde la muestra de sangre comprende una población celular que se sospecha contiene células tumorales circulantes 5T4-positivas; montar la muestra de sangre en un sustrato; detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a células nucleadas; detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en la muestra de sangre que se une a las células tumorales circulantes; detectar la presencia o ausencia de un tercer marcador en la muestra de sangre que se une a la población celular o una subserie de la población celular que no se determinan como células tumorales; detectar la presencia o ausencia de un cuarto marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a las células tumorales circulantes en donde dicho cuarto marcador es antígeno 5T4 humano; y, analizar la población celular detectada por el primer, segundo, tercer y cuarto marcador para identificar la célula tumoral circulante en la muestra de sangre antes del tratamiento con el conjugado de anticuerpo-fármaco comparado después del tratamiento con el conjugado de anticuerpo-fármaco, en donde un cambio en la relación de las células tumorales
circulantes 5T4-positivas a células tumorales circulantes 5T4-negativas en la muestra de sangre después del tratamiento en comparación con la relación de células tumorales circulantes 5T4-positivas a 5T4-negativas en la muestra de sangre antes del tratamiento pueden indicar la eficacia del conjugado de anticuerpo-fármaco en la reducción de células tumorales circulantes 5T4-positivas, en donde dicho compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco es anti-5T4-A1 -mcMMAF.
En otra modalidad, la invención provee un método para detectar células tumorales circulantes 5T4-positivas en un sujeto mamífero que se sospecha tiene cáncer 5T4-positivo que comprende: probar una muestra de sangre del sujeto, en donde la muestra de sangre comprende una población celular; montar la muestra de sangre en un sustrato; detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a células nucleadas en donde dicho primer marcador es DAPI; detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en la muestra de sangre que se une a las células tumorales circulantes en donde dicho segundo marcador es citoqueratina; detectar la presencia o ausencia de un tercer marcador en la muestra de sangre que se une a la población celular o una subserie de la población celular que no se determinan como células tumorales, dicho tercer marcador es CD45; detectar la presencia o ausencia de un cuarto marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a las células tumorales circulantes en donde dicho cuarto marcador es antígeno 5T4 humano; y, analizar la población celular detectada por el primer, segundo, tercer y cuarto
marcador para identificar y caracterizar las células tumorales circulantes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra el diagrama de dispersión de expresión 5T4 para CTCs individuales y agrupaciones de CTC de muestras de paciente con NSCLC analizadas con el ensayo diagnóstico de 4 colores 5T4 optimizado.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual se refiere la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en la presente se puedan usar en la práctica para probar la presente invención, los materiales preferidos y métodos se describen en la presente. Al describir y reclamar la presente invención, se usará la siguiente terminología.
5T4 se refiere al antígeno oncofetal 5T4, una glicoproteína de transmembrana altamente glicosilada de 72 kDa que comprende un núcleo no glicosilado de 42 kDa (ver patente de E.U.A. No. 5,869,053). Se expresa 5T4 humano en numerosos tipos de cáncer, incluyendo pero sin limitación a carcinomas de la vejiga, mama, cérvix, colon, endometrio, riñon, pulmón,
esófago, ovario, próstata, páncreas, piel, estómago y testículos. Las células altamente tumorígenas, también denominadas células madre de cáncer o células que inician por tumor han demostrado tener niveles altos de expresión de 5T4 (WO2010/111659). Los anticuerpos anti-5T4 incluyen anticuerpos que específicamente se unen al antígeno 5T4 humano (ver patente de E.U.A. No. 8,044,178).
"Monocapa biológica" se refiere a una muestra de sangre que puede existir en varios estados de separación o purificación celular. Por ejemplo, la monocapa biológica se puede purificar parcialmente y contener células mononucleares y otras células después de ocurrida la lisis de glóbulos rojos.
"Clasificar la población celular antes de montar la muestra en un sustrato" se refiere a eliminar una sub-serie de la población celular de la muestra, por ejemplo, la muestra de sangre. La clasificación puede ocurrir por lisis celular selectiva y centrifugación de una sub-fracción de células. La clasificación también puede ocurrir usando un marcador celular fluorescente y clasificación celular activada por fluorescencia. La clasificación celular para un marcador celular puede ocurnr como una selección positiva para células tumorales circulantes o como una selección negativa para eliminar células no tumorales.
El "sustrato" mantiene la muestra de prueba, por ejemplo, una muestra de sangre que contiene células montadas para detección y análisis. En un aspecto, el sustrato puede ser plano. En otro aspecto, el sustrato puede
tener algo de curvatura.
"Sujeto", "sujeto mamífero" o "paciente" se refiere a cualquier paciente mamífero o sujeto al cual se pueden aplicar los métodos de la invención. "Mamífero" o "del mamífero" se refiere a pacientes humanos y primates no humanos, así como animales experimentales tales como conejos, ratas y ratones y otros animales. En una modalidad ejemplar de la presente invención, para identificar pacientes sujetos para el tratamiento de conformidad con los métodos de la invención, se emplean métodos de selección aceptados para determinar factores de riesgo asociados con una enfermedad o condición focalizada o sospechada, por ejemplo, cáncer 5T4-positivo, o para determinar el estado de una enfermedad o condición existente en un sujeto. Estos métodos de selección incluyen, por ejemplo, chequeos convencionales para determinar factores de riesgo que se pueden asociar con la enfermedad o condición focalizada o sospechada. Estos y otros métodos de rutina permiten al médico seleccionar pacientes en necesidad de terapia usando los métodos y formulaciones de la invención.
"Muestra de sangre", "espécimen de sangre", "muestra de prueba" y "muestra de sangre" se usan de manera intercambiable y se definen como una cantidad de sangre extraída o tomada de un sujeto, en general por un venipunción o punción transcutánea de una vena por un estilete rígido filoso o cánula portando un catéter de plástico flexible o por una aguja de acero añadida a una jeringa o catéter, para usarse en pruebas médicas que incluyen ensayos diagnósticos.
"Cáncer", "malignidad", "tumor sólido" o "trastorno hiperproliferante" se usan como términos sinónimos y se refieren a cualquiera de un número de enfermedades que se caracterizan por proliferación anormal no controlada de células 5T4-positivas, la habilidad de esparcir localmente células 5T4-positivas afectadas o a través del torrente sanguíneo y sistema linfático a otras partes del cuerpo (es decir, mestastatizar) así como cualquiera de un número de aspectos estructurales y/o moleculares característicos.
Un "primer marcador", un "segundo marcador", un "tercer marcador" y un "cuarto marcador" identifican una célula tumoral circulante por una tinción citológica o por un marcador específico celular. El primer marcador es una tinción citológica que incluye, pero no se limita a DAPI, tinción Wright-Giemsa, u otras tinciones citológicas conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, B.F. Atkinson, Atlas of Diaqnostic Cvtopathology, 2a edición, W.B. Saunders Company, Ed., 2003, incorporado a la presente por referencia en su totalidad. Los segundos y terceros marcadores son marcadores específicos celulares que incluyen, pero no se limitan a, marcadores para citoqueratina, CD45, M30, receptor de quimiocina, CXCR1 , CXCR4, CD44, CD24, isoformas de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-1 , VEGFR-2, VEGFR-3), receptor de factor de crecimiento epitelial (EGFR), o HuR de factor de estabilidad de mARN. El cuarto marcador se refiere al antígeno 5T4.
Estos marcadores identifican varios tipos celulares, incluyendo células de origen hematopoyético, citoqueratinas en células epiteliales, células de cáncer de mama, células de cáncer de próstata, CD44, receptor de
superficie celular que reconoce ácido hialurónico, receptores de quimiocina, tales como CXCR1 o CXCR4.
"Clasificar" en el contexto de células como se usa en la presente se refiere a tanto clasificación física de las células, como se puede lograr usando, por ejemplo, clasificador celular activado con fluorescencia, así como a análisis de células basadas en expresión de marcadores de superficie celular, por ejemplo, análisis FACS en ausencia de clasificación.
"Analizar la población celular por detalle nuclear, contorno nuclear, presencia o ausencia de nucléolos, calidad de citoplasma, o cantidad de citoplasma" y "analizar la población celular al medir células intactas con una alta relación nuclear a citoplásmica, células intactas con una relación baja nuclear a citoplásmica, células apoptóticas tempranas, o células apoptóticas tardías, e identificar las células tumorales circulantes" pueden ocurrir utilizando técnicas y métodos analíticos como se describe en B. F. Atkinson, id.
"Administración de terapia de cáncer o recuperación de cáncer" se refiere a pruebas diagnósticas in vivo o in vitro para determinar la etapa de progreso de cáncer o la efectividad de un tratamiento de terapia de cáncer particular.
"Células tumorales circulantes (CTCs)" se refiere a células tumorales intactas o grupos de células tumorales que son positivas para citoqueratina de charola y negativo para CD45. Las CTCs también incluyen células que son positivas para 5T4 y negativas para CD45; células que son
positivas para citoqueratina de charola y 5T4 y negativos para CD45; y células que son morfológicamente consistentes con células malignas. Métodos para categorizar y detectar CTCs se han registrado previamente (WO201 1/028905, WO201 1/050103, y US2009/0317836, incorporadas a la presente por referencia).
"Calificación H" es una calificación pesada que suma los porcentajes de CTCs dentro de cada categoría (baja, mediana y alta) multiplicada por sus valores de categoría respectivos, generando una calificación entre 0 y 300.
Estos son varios métodos de detectar células tumorales circulantes conocidos en la técnica. El nivel bajo de concentración de células epiteliales malignas en muestras de sangre, aproximadamente una en un células nucleadas totales 106 a 107 las hace difíciles de detectar. La detección y enumeración de CTCs se ha intentado con varios métodos incluyendo: PCR, citometría de flujo, propuestas inmunológicas a base de imagen, técnicas ¡nmunomagnéticas, técnicas microfluidas y tecnología de microchip.
Por ejemplo, el sistema AdnaTest Breast Cáncer® utiliza reacción en cadena de reversa de transcriptasa - polimerasa (RT-PCR) para detectar células tumorales circulantes (AdnaGen AG, Langenhagen, Alemania; OncoVista, Inc., San Antonio, TX). La prueba muestra un procedimiento de enriquecimiento de CTC que utiliza una mezcla propietaria de cuenta inmunomagnética cubierta con uno a tres anticuerpos a antígenos de superficie epitelial. El número de CTCs entonces se determina
indirectamente por un método de RT-PCR semicuantitativo.
Se desarrolló el CellSearch System™ (Veridex LLC, Warren, NJ) para el propósito de detectar CTCs en sangre entera. El sistema CellSearch involucra una técnica de mezclar una muestra de sangre con partículas de hierro revestidas con un anticuerpo que se fija a células epiteliales. Las células epiteliales entonces se distinguen de leucocitos por anticuerpos que han sido etiquetados con un tinte fluorescente, de modo que las células cancerosas se pueden distinguir y contar con facilidad.
El OncoQuick™ (Greiner Bio-One-, Inc. Longwood, FL) es otro sistema de prueba que ha sido desarrollado para detectar células tumorales circulantes. Este sistema es un sistema de gradiente de densidad mejorado que combina centrifugación de gradiente de densidad y las técnicas inmuno-basadas.
Un método de enumerar el número de CTCs en una muestra de un paciente que comprende fluir dicha muestra a través de un dispositivo micro fluido que selectivamente enriquece una o más células tumorales circulantes se describe en la solicitud de patente de E.U.A. No. 2010/0233693, que se incorpora a la presente por referencia. El dispositivo micro fluido puede enriquecer una o más CTCs con base en tamaño, afinidad, habilidad de deformar o forma.
Un método de aislar y analizar CTCs utilizando un dispositivo de micro-canal se describe en la solicitud de patente de E.U.A. No. 2010/0255479. Este método provee para capturar dianas biológicas de
solución al pre-etiquetar o pre-mezclar una muestra que contiene una CTC con una pareja de unión que especialmente se une a las células mejorando la captura de la CTC en un dispositivo de micro-canal.
Cada uno de los métodos antes mencionados de detectar células tumorales circulantes requiere un paso de enriquecimiento celular. Una característica que distingue de la presente invención es un ensayo libre de enriquecimiento que demuestra la habilidad de identificar números significativos de CTCs en una mayoría de pacientes con cáncer 5T4-positivo.
Un aspecto de la presente invención en general se refiere a un método para detectar células tumorales circulantes 5T4-positivas (CTCs) en un sujeto mamífero o un método de diagnosticar un cáncer 5T4-positivo de etapa temprana en un sujeto mamífero. La presente invención además se refiere a un método de seleccionar un compuesto candidato de fármaco en un sujeto mamífero para tratamiento de cáncer 5T4-positivo.
Un método para detectar CTCs 5T4 positivas en el sujeto mamífero se provee que comprende obtener del sujeto mamífero sospechoso de tener cáncer, una muestra de sangre que comprende una población celular mixta sospechosa de contener CTCs, montando los glóbulos y CTCs en un sustrato para formar una monocapa biológica, detectar en la monocapa biológica un primer marcador que selectivamente se une a células nucleadas, detectar en la monocapa biológica un segundo marcador que se une a CTCs, detectar en la monocapa biológica un tercer marcador que se une a la población celular mixta o una sub-serie de la población celular mixta, detectar
en la monocapa biológica un cuarto marcador que selectivamente se une a células 5T4-positivas, analizar la población celular detectada por el primer, segundo, tercero y cuarto marcador para identificar CTCs; la presencia de las CTCs en la muestra de sangre indicando la presencia de cáncer 5T4-pos¡tivo o cáncer 5T4-positivo de etapa temprana en un sujeto mamífero. La presencia o ausencia de las CTCs en la muestra de sangre puede indicar la presencia o ausencia de un estado libre de enfermedad o un estado de enfermedad no medible en el sujeto mamífero.
El método provee un protocolo de fijación celular para identificar células derivadas del epitelio dentro de una muestra de sangre, en conjunto con un método para detectar CTCs 5T4-positivas en sangre de pacientes con cáncer. En este protocolo, los glóbulos blancos vivos (WBCs), por ejemplo, leucocitos, y otras células en la sangre se aislan en un portaobjetos, por ejemplo, como una monocapa biológica. Los leucocitos incluyen, pero no se limitan a: T-linfocitos; monocitos, eosinófilos y neutrófilos, involucrados en fagocitosis; y, basófilos involucrados en respuesta inflamatoria.
El método provee además marcación de manera fluorescente de los WBCs y CTCs fijos en portaobjetos adhesivos revestidos de manera especial. Las células son marcadas de forma fluorescente con un primer marcador que selectivamente se une a células nucleadas en donde dicho primer marcador es DAPI, un segundo marcador que se une a las células tumorales circulantes dentro de dicho segundo marcador es citoqueratina (CK) un componente esencial de CTCs, de un tercer marcador que se une a la
población celular o una sub-serie de la población celular que no se determinan por ser células tumorales dicho marcador es CD45, y un cuarto marcador que selectivamente se une a las células tumorales circulantes en donde dicho cuarto marcador es antígeno 5T4 humano. El portaobjetos entonces es escaneado para sitios de fluorescencia y analizado con computación de alto desempeño que utiliza algoritmos que pesa los parámetros celulares detectados por los primeros, segundos, terceros y cuartos marcadores para identificar y caracterizar las células tumorales circulantes.
El método provee además métodos que utilizan microscopía fluorescente y el protocolo de fijación celular para investigar la prevalencia de CTCs en pacientes con cáncer 5T4-positivo. Una ventaja adicional del método permite a un patólogo reubicar y examinar las células de interés para confirmación y caracterización patológica. En la presente invención, el protocolo incluye además quitar la cubierta y/o solubilizar el medio de montaje soluble en agua en cada portaobjetos tintado de manera fluorescente y volver a tintar las mismas células usando un segundo marcador celular, por ejemplo, una tinción Wright-Giemsa estándar, para proveer percepciones adicionales en morfología de CTC, tamaño y heterogeneidad. Las células raras individuales CK+ conocidas y grupos celulares raros que se ubicaron por computación de alto desempeño y el protocolo de fijación celular se pueden evaluar de forma morfológica. Aunque las imágenes fluorescentes de CTCs han ayudado en su identificación verificada, la tinción Wrigth-Giemsa ha provisto información citológica adicional acerca de CTCs. En otro aspecto de
la invención, el método se puede usar para evaluar diferentes marcadores celulares que son específicos para un estado de enfermedad, tipo celular o estado celular.
La habilidad de detectar y caracterizar CTCs tiene el potencial de ayudar en el tratamiento diagnóstico e individualizado de pacientes con cáncer 5T4-positivo. Debido a su rareza, se requieren métodos especiales para investigar CTCs. La presente invención provee una propuesta de biopsia de fase fluida que permite el uso de métodos citopatológicos estándar para caracterización morfológica detallada de CTCs en sangre obtenida de pacientes con cáncer y provee detalles de características citológicas de un espectro de CTCs sin usar enriquecimiento a base de proteína de superficie. Las células nucleadas recuperadas de sangre entera son depositadas en portaobjetos adhesivos, marcados de manera inmunofluorescente y analizados para CTCs 5T4-positivas por microscopía digital. Acoplar estas técnicas con métodos de tinción de rutina permite identificación y evaluación de CTCs usando microscopía de luz. Usando métodos patológicos convencionales para observar las células, CTCs exhiben un alto grado de pleomorfismo inter- e intra-paciente en preparaciones de sangre entera, y se identifican CTCs intactas con relaciones altas a bajas nucleares a citoplásmicas junto con CTCs exhibiendo distintivos apoptóticos. Las observaciones morfológicas sugieren que el espectro completo de células presentes en sitios tumorales primarios y metastásicos también se puede observar circulando en sangre, y además provee una estructura posible de
clasificación morfológica dentro de la cual investigar las propiedades de subseries celulares involucradas en metástasis.
Microscopía Digital Automatizada. Se alimentan coordinados de células potenciales en el sistema de imágenes de caso raro (REIS), un sistema de microscopia digital de escaneo completamente automatizado. Los componentes de hardware del REIS y el software de escaneo propietario han sido descritos en detalle en cualquier lugar (Krivacic y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101 : 10501-10504, 2004).
Mediciones. Se analizan objetos fluorescentes detectados con operaciones de filtro de software para diferenciar células raras de positivos falsos. Ya que las células en general son más pequeñas que la resolución de mancha de láser (20 µ?t?), el primer filtro pasa todos los objetos que están debajo de un umbral de tamaño (20 µ?t?). Un segundo filtro analiza la relación entre las intensidades de la fluorescencia de canales diferentes para eliminar agregados de colorante homogéneo, un artefacto común de tinción de inmunofluorescencia.
Se puede preparar una muestra como una monocapa biológica al extraer una muestra de un fluido biológico que incluye, pero no se limita a, sangre o partes de sangre de un sujeto. En un aspecto, la muestra es una monocapa de células. La muestra de fluido es tratada con un material fluorescente, tal como pero sin limitación a un tinte marcador, que
selectivamente se une a clases diferentes de moléculas biológicas, que pueden estar en la superficie o dentro de la célula, tales como proteínas, ácidos nucleicos u otras moléculas. Los marcadores adecuados son conocidos en la técnica para hacer un número de tipos celulares diferentes de interés clínico, incluyendo tipos celulares de cáncer seleccionados, células de feto, u otras células apropiadas a ser consideradas. Los marcadores para numerosas otras células tales como células cerebrales, entre otros, se pueden desarrollar. El material emite una salida característica, tal como fluorescencia o fosforescencia, responsiva a una irradiación de excitación seleccionada, tal como irradiación por una longitud de onda seleccionada o espectro de luz, irradiación de rayos x, irradiación a completarse con electrones, o similares. La luminiscencia característica típicamente tiene una longitud de onda característica o rango espectral de longitudes de onda. Mientras que los colorantes son el proceso de etiqueta predominante, existen otras técnicas incluyendo el luso de marcadores conocidos como puntos quantum y sondas de nano-partícula de ADN.
En otro aspecto de la invención, se provee un método para obtener una posición de una célula rara, por ejemplo, una célula tumoral circulante 5T4-positiva (CTC), dentro de una monocapa biológica. Ver, por ejemplo, la solicitud de E.U.A. No. 2004/0131241 , que se incorpora a la presente por referencia. Un portaobjetos que porta por lo menos una célula rara y tiene marcas de retícula dispuestas en posiciones que forman sustancialmente un ángulo recto, se coloca en un sujetador de portaobjetos de
un primer sistema formador de imágenes. Un primer espacio de coordenada del sistema de formación de imágenes se define, y se designan coordenadas de las marcas de retícula en el primer espacio de coordenada. Se define un segundo espacio de coordenada de un segundo sistema formador de imágenes, y se designan coordenadas de las marcas de retícula en el segundo espacio de coordenada. Usando las coordenadas designadas de las marcas de retícula del primer espacio de coordenada, se computan los parámetros de conversión de coordenada. Después, las coordenadas de por lo menos un objeto en el primer espacio de coordenada se designan, y las coordenadas de primer espacio de coordenada del objeto se convierten en coordenadas únicas en un segundo espacio de coordenada, usando los parámetros de conversión de coordenada.
Una vez que la célula rara o CTC ha sido localizada, la cubierta en la monocapa biológica puede ser quitada o el medio de montaje soluble en agua puede solubilizase en cada portaobjetos entintado de manera fluorescente. Las mismas células se pueden re-entintar usando un segundo marcador celular, por ejemplo, tinción Wright-Giemsa estándar para proveer percepciones en morfología de CTC, tamaño y heterogeneidad. Las células raras individuales de citoqueratina positivas (CK+) conocidas y grupos celulares raros se pueden ubicar y evaluar morfológicamente. Aunque las imágenes fluorescentes de CTCs han ayudado en su identificación verificada, la tinción Wright-Giemsa ha provisto información adicional acerca de CTCs.
En otro aspecto, este proceso se puede usar para evaluar
diferentes marcadores celulares que son específicos para una enfermedad, estado de enfermedad, tipo celular o estado celular. Los métodos de la presente invención ayudarán en la caracterización de CTCs. Permite verificación de alta calidad de CTCs de sangre obtenida de pacientes con cáncer 5T4-positivo sin enriquecimiento, y provee perspectivas en morfología y características de CTCs.
La búsqueda por CTCs metastásicas raras sugiere que muchas CTCs son apoptóticas e incapaces de formar metástasis y estima que sólo 1 célula cancerosa diseminada en 10,000 puede incluso establecer una metástasis. De esta manera, la detección, clasificación morfológica y caracterización molecular de estas células raras podría focalizar terapias novedosas y dirigidas, demostrando la importancia clínica de CTCs.
Tratamiento de cáncer
Un método de tratamiento de cáncer es inmunoterapia, en donde un anticuerpo específico para el antígeno 5T4 se puede conjugar a un fármaco adecuado, tal como un agente citotóxico o citoestático, un agente inmunosupresor, un radioisótopo, una toxina o similar. El conjugado de fármaco de anticuerpo (ADC) se puede usar para administrar un fármaco a una célula tumoral 5T4-positiva o célula cancerosa en un paciente. Los ADCs para el tratamiento de cánceres 5T4-positivos se han descrito en la patente de E.U.A. No. 8,309,094, que se incorpora a la presente por referencia. Ejemplos de ADCS son 5T4-A1-mcMMAF, 5T4-A1-vc MAE, y 5T4-VC-MMAD, en donde
5T4-A1 es un anticuerpo humanizado que específicamente se une al antígeno 5T4 y MMAE, MMAE y MMAD son derivados de auristatina. Las auristatinas han sido mostradas por interferir con dinámica microtubular y división nuclear y celular y tienen actividad anticáncer.
Ensayo diagnóstico
Un modalidad de la presente invención es ilustrada en el cuadro 1 en donde la cuantificación del antígeno 5T4 en CTCs se usa para generar una 'calificación H' al adicionar los porcentajes de CTCs dentro de cada categoría multiplicadas por sus valores de categoría respectivos, generando una calificación entre 0 y 300. Como se muestra en el cuadro 2, el sistema de calificación utiliza la expresión 5T4 como se determina por el ensayo de 4 colores 5T4 optimizado descrito en el ejemplo 1 usando el panel de líneas celulares de NSCLC con base en niveles de expresión de 5T4. Estos niveles fueron confirmados por experimentos de tinción inmunocitológicos (ICC) estándar. Estas líneas celulares experimentan niveles de expresión altos (líneas celulares MDA-MB-435 y NCI-H226), medianos (líneas celulares NCI-H1975 y MDA-MB-361 ) y bajos (líneas celulares NCI-H522 y NCI-H2122) de 5T4. El nivel de expresión promedio de 5T4 en cada una de estas líneas se usó para establecer umbrales para expresión alta, mediana y baja de 5T4 en este ensayo.
CUADRO 1
Comparación del rango de expresión 5T4 utilizado en el cálculo de una calificación H
CUADRO 2
Calibración de líneas celulares que ilustran umbrales establecidos para expresión baja, mediana y alta de 5T4 en un cáncer pulmonar de célula no pequeña (NSCLC).
En otra modalidad de la presente invención, se seleccionan pacientes con cáncer para la presencia de CTCs que expresan el antígeno 5T4 utilizando el ensayo diagnóstico de 4 colores de 5T4 optimizado descrito en el ejemplo 1. Este ensayo ayudará a determinar el nivel de expresión de antígeno 5T4 en CTCs al enumerar y caracterizar las CTCs, así como, determinar una correlación entre expresión de CTC de la diana 5T4 y expresión de 5T4 en el tumor primario. El diagrama de dispersión de expresión de 5T4 mostrado en la figura 1 es tanto para CTCs individuales y
grupos de CTC como se calibra por líneas celulares de control. Como se muestra en el cuadro 3, 17 muestras de paciente de cáncer pulmonar de célula no pequeña (NSCLC) se procesaron con el ensayo de 4 colores de 5T4 optimizado. De esta manera, el ensayo de 4 colores de 5T4 de la presente invención se usa para determinar una categoría de calificación H que entonces se usa en el cálculo de calificación H. Finalmente, el ensayo diagnóstico que identifica CTCs expresando diana de 5T4 se usará para identificar una población de paciente con cáncer tratable y como un medio de monitorear las CTCs en los pacientes con cáncer durante tratamiento con ADC tal como 5T4-A1 -mcMMAF.
CUADRO 3
Datos de 17 muestras de paciente con NSCLC analizadas con el ensayo diagnóstico de 4 colores 5T4 optimizado y calificaciones H calculadas
usando las líneas celulares de calibración
Otro aspecto de la presente invención es usar la calificación H como un sistema de calificación preliminar para caracterizar 5T4 en CTCs. Como se indicó antes, la calificación H es una calificación pesada que suma los porcentajes de CTCs dentro de cada categoría multiplicada por sus valores de categoría respectivos, generando una calificación entre 0 y 300. Se dividen CTCs en 4 categorías (0-3) con base en expresión de 5T4 individual como se muestra en el cuadro 1. Un mínimo de 10 CTCs debe estar presente a fin de calcular una calificación H razonablemente útil.
Para pacientes, se calcularán calificaciones H en dos maneras: (1) calificación H tradicional (THS) - la intensidad de 5T4 promedio de cada caso (CTC individual o grupo de CTC) se cuenta como un punto de datos individual; (2) calificación H pesado de grupo (CWHS) - cada intensidad de 5T4 promedio de cada CTC (individual o dentro de un grupo) se cuenta como un único punto de datos.
Un ejemplo de un cálculo de calificación H utilizando los valores para la categoría de calificación H y % CTCs por categoría es el siguiente: categoría de calificación H 0 (1.5% CTCs); categoría de calificación H 1 (15.0% CTCs); categoría de calificación H 2 (68% CTCs); categoría de calificación H 3 (15.5% CTCs). Calificación H = (1.5 x 0) + (15.0 x 2) + (68.0 x 2) + (15.5 x 3) = 198
La calificación H entonces se puede utilizar para seleccionar la población de pacientes que tendría la probabilidad más alta de éxito para tratamiento con un ADC tal como 5T4-A1 -mcM AF u otros ADCs específicas
de 5T4. El cuadro 3 provee el cálculo de calificación H para 14 de 17 pacientes con NSCLC utilizando el ensayo de 4 colores de 5T4 de la presente invención.
En otras modalidades, se proveen métodos para tratar cáncer, incluyendo identificar un paciente que tiene cáncer 5T4-positivo al identificar CTCs 5T4-positivas con el ensayo de 4 colores 5T4 optimizado, categorizar dicho paciente al determinar una calificación H, y administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva de un ADC que específicamente se une a un cáncer 5T4 positivo. Además, el paciente es monitoreado a intervalos durante la terapia para la presencia de CTCs 5T4-positivas utilizando el ensayo de 4 colores de 5T4 optimizado. Detectar un número reducido de las células tumorales circulantes 5T4-positivas en la muestra de sangre después del tratamiento con un ADC en comparación con el número de células tumorales circulantes 5T4-positivas en una muestra de sangre antes del tratamiento con la ADC puede indicar efectividad del compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco en tratar cáncer 5T4-positivo en el sujeto mamífero.
En otra modalidad, analizar la población celular utilizando el ensayo de 4 colores de 5T4 optimizado para identificar y caracterizar las células tumorales circulantes en las muestras de prueba antes del tratamiento con el conjugado de anticuerpo-fármaco en comparación con después del tratamiento con el conjugado de anticuerpo-fármaco, en donde un cambio en la relación de las células tumorales circulantes 5T4-positivas a 5T4-negativas
en la muestra de sangre después del tratamiento en comparación con la relación de células tumorales circulantes 5T4-positivas a 5T4-negativas en una muestra de sangre antes del tratamiento puede indicar la eficacia del conjugado de anticuerpo-fármaco en la reducción de células tumorales circulantes 5T4-positivas.
En algunas modalidades, el método de tratar cáncer incluye identificar un paciente que tiene cáncer 5T4-positivo al identificar CTCs 5T4-positivas con el ensayo de 4 colores de 5T4 optimizado y administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de un ADC que específicamente se une a un cáncer 5T4-positivo en combinación con un agente quimioterapéutico. El agente quimioterapéutico es aquél con el cual el tratamiento del cáncer no ha sido refractario. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es aquél con el cual el tratamiento de cáncer se ha descubierto ser refractario. El ADC se puede administrar a un paciente que también ha pasado por un tratamiento, tal como cirugía para tratamiento para el cáncer. En otra modalidad, el método de tratamiento adicional es terapia de radiación. Además, el paciente es monitoreado a intervalos durante la terapia para la presencia de CTCs 5T4-positivas utilizando el ensayo de 4 colores de 5T4 optimizado.
Etiqueta detectable
La etiqueta particular o grupo detectable usado en el ensayo se puede detectar por medio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico,
inmunoquímico, eléctrico, óptico o químico. El tipo particular de etiqueta no es un aspecto crítico de la invención, siempre y cuando no interfiera de forma significativa con la unión específica de un anticuerpo al marcador celular en la célula o la célula tumoral circulante usada en el ensayo. El grupo detectable puede ser cualquier material teniendo una propiedad detectable física o química. Dichas etiquetas detectables han sido bien desarrolladas en el campo de ensayos o inmunoensayos y en general, la mayoría de cualquier etiqueta útil en dichos métodos se puede aplicar a la presente invención. De esta manera, una etiqueta es cualquier composición detectable por medio espectroscópico, fotoquímico, bioquímico, inmunoquímico, eléctrico, óptico o químico. Las etiquetas útiles en la presente invención incluyen tintes fluorescentes AlexaFluor® (Invitrogen), cuentas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads ™), tintes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, y similares), radioetiquetas, otros agentes formadores de imágenes tales como microburbujas (para formación de imágenes de ultrasonido), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otros comúnmente usados en una ELISA), y etiquetas calorimétricas tales como cuentas de oro coloide o vidrio a color o plástico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex y similares).
La etiqueta se puede acoplar directa o indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Como se indicó antes, se puede usar una amplia variedad de etiquetas, con la elección de etiqueta dependiendo de la sensibilidad
requerida, facilidad de conjugación con el compuesto, requerimientos de estabilidad, instrumentación disponible y provisiones de desecho.
A menudo se fijan etiquetas no radioactivas por medio indirecto. En general, una molécula de ligando (por ejemplo, biotina) se une covalentemente a la molécula. El ligando entonces se une a una molécula anti-ligando (por ejemplo, streptavidina) que es inherentemente detectable o covalentemente unida a un sistema de señal, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente o un compuesto quemiluminiscente. Se puede usar un número de ligandos y anti-ligandos. En donde un ligando tiene un anti-ligando natural, por ejemplo, biotina, tiroxina y cortisol, se puede usar en conjunto con los anti-ligandos etiquetados que ocurren de manera natural. Alternativamente, cualquier compuesto hapténico o antigénico se puede usar en combinación con un anticuerpo.
Las moléculas también se pueden conjugar directamente para señalar compuestos generadores, por ejemplo, por conjugación con una enzima o fluoroforo. Las enzimas de interés como etiquetas primariamente serán hidrolasas, en particular fosfatasas, esterasas y glicosidasas, u oxidoreductasas, en particular peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen tintes fluorescentes AlexaFluor® (Invitrogen), fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbelliferona y similares. Los compuestos quemiluminiscentes incluyen luciferina y 2,3-dihidroftalazinadionas, por ejemplo, luminol. Para una revisión de varios sistemas de etiquetado o productores de señal que se pueden usar, ver,
patente de E.U.A. No. 4,391 ,904, que se incorpora a la presente por referencia.
Son bien conocidos a aquellos expertos en la técnica los medios para detectar etiquetas. De esta manera, por ejemplo, en donde la etiqueta es una etiqueta radioactiva, los medios para detección incluyen un contador de centelleo o película fotográfica como una autoradiografía. En donde la etiqueta es una etiqueta fluorescente, se puede detectar al excitar el fluorocromo con la longitud de onda apropiada de luz y detectar la fluorescencia resultante. La fluorescencia se puede detectar visualmente, por medio de película fotográfica, por el uso de detectores electrónicos tales como dispositivos acoplados con carga (CCDs) o fotomultiplicadores y similares. De manera similar, se pueden detectar etiquetas enzimáticas al proveer los sustratos apropiados para la enzima y detectar el producto de reacción resultante. Finalmente, se pueden detectar etiquetas calorimétricas simples simplemente al observar el color asociado con la etiqueta.
Otras modalidades y usos serán evidentes a un experto en la técnica en luz de las presentes descripciones.
EJEMPLO 1
Ensayo diagnóstico de 4 colores de 5t4 optimizado
Se desarrolló un ensayo de 4 canales optimizado para identificación de CTCs 5T4-positivas. Las CTCs fueron teñidas con cuatros
tinciones diferentes y se midieron en cuatro canales separados. Por ejemplo, se pueden teñir CTCs con anti-CK-AlexaFluor® 555 (rojo); anti-CD45-AlexaFluor 488® (verde); anti-5T4-AlexaFluor 660® (púrpura); y, los núcleos celulares son tintado azules con DAPI. Ya que los tintes AlexaFluor® (Invitrogen) están disponibles en combinaciones de tinción alternativas de muchos colores están disponibles.
Pacientes y recolección de muestra de sangre
Se recolectaron muestras de pacientes con cáncer metastásico en tubos de sangre anti-coagulada y procesados en 24 horas. También se extrajeron muestras de sangre de controles normales.
Procesamiento de muestra de sangre para detección de CTC Se mueven muestras de sangre durante 5 minutos antes de medir un conteo de glóbulos blancos (WBC) un sistema de WBC Hemocue (HemoCue, Suecia). Con base en el conteo de WBC, se sometió un volumen de sangre a lisis de eritrocito (solución de cloruro de amonio). Después de la centrifugación, las células nucleadas fueron re-suspendidas en PBS y se fijaron como una monocapa en portaobjetos de vidrio hechos a la medida. Los portaobjetos de vidrio son el mismo tamaño como portaobjetos de microscopio estándar pero tienen un recubrimiento propietario que permite retención máxima de células vivas. Cada portaobjetos sostiene aproximadamente tres millones de células nucleadas; de esta manera, el número de células en placa
por portaobjetos dependió del conteo de WBC de los pacientes.
Para detección de CTC en pacientes con cáncer para este estudio, se usaron cuatro portaobjetos como una prueba. Los portaobjetos restantes creados para cada paciente fueron almacenados a -80°C para experimentos futuros. Se descongelaron cuatro portaobjetos de cada paciente, después las células se fijaron con 2% paraformaldehído, se permeabilizaron con metanol frío, y se bloquearon sitios de unión no específicos con suero de cabra. Posteriormente se incubaron portaobjetos con anticuerpo de citoqueratina anti-charola monoclonal (Sigma), y tinte fluorescente CD45-Alexa (Serotec) durante 40 minutos a 37°C. Después de lavados con PBS, se incubaron portaobjetos con tinte fluorescente de anticuerpo-Alexa anti-ratón de cabra (Invitrogen) durante 20 minutos a 37°C. Después de lavados con PBS, se incubaron portaobjetos con tinte fluorescente de anticuerpo-Alexa anti-5T4 durante 20 minutos a 37°C. Se contratiñe con DAPI durante 10 minutos y se monta con un medio de montaje acuoso.
Análisis de formación de imágenes y técnico
Los cuatro portaobjetos de cada paciente fueron escaneados usando un microscopio de escaneo fluorescente hecho la medida que fue desarrollado y optimizado para escaneo rápido y confiable. Cada portaobjetos fue escaneado enteramente a 10 veces la magnificación en cuatro colores y se produjeron más de 6900 imágenes. Las imágenes resultantes fueron
alimentadas a un algoritmo de análisis que identifica CTCs probablemente candidatas con base en numerosas medidas, incluyendo intensidad de citoqueratina, intensidad de CD45, intensidad de 5T4 así como forma y tamaño nucleares y citoplásmicos. Un analista técnico entonces pasó por probables candidatos generados por algoritmo y eliminó elecciones que obviamente no fueron células, tales como agregados de colorante.
Análisis e interpretación profesional
Todas las CTCs probables candidatas fueron presentadas a un hematopatólogo para análisis e interpretación a través de un reporte de Internet en donde el hematopatólogo incluye o excluye cada célula candidata como una CTC. Las células fueron clasificadas como CTCs si fueron positivas de citoqueratina, 5T4 positivas, CD45 negativas, contuvieron un núcleo de DAPI intacto sin cambios apoptóticos identif ¡cables (bulosidad, apariencia degenerada) o una apariencia interrumpida, y son morfológicamente distintos de WBCs circundantes. Las células deben tener citoplasma que sea claramente circunferencial y dentro del cual está contenido el núcleo entero. El citoplasma puede mostrar cambios apoptóticos tales como bulosidad y densidad irregular o disrupción ligera en el límite citoplásmico periférico, pero no debe ser así interrumpido que su asociación con el núcleo esté en cuestión. Las imágenes fueron presentadas como imágenes digitales, con canal fluorescente individual viendo capacidad así como una imagen compuesta. Cada imagen celular fue anotada con datos estadísticos ancilares
con respecto al tamaño nuclear relativo, intensidades fluorescentes e intensidades fluorescentes comparativas. Cada candidato de CTC fue presentado en un campo de visión con suficientes WBCs circundantes para permitir comparación contextual entre características citomorfológicas de la célula en cuestión contra las WBCs antecedentes.
Tinción Wriqht-Giemsa. Se eliminaron las cubiertas de portaobjetos tintados de manera fluorescente y se enjuagaron en PBS. El portaobjetos entonces fue inundado con tinción Wright-Giemsa (Fisher Scientific, Kalamazoo, Mich.) durante 3 minutos. 1.5 mL de regulador de fosfato a pH 6.8 (Fisher Scientific, Kalamazoo, Mich.) se agregó al portaobjetos cubierto con tinción y la tinción y regulador se mezclaron juntos al mover con cuidado durante 1 minuto. La mezcla entonces se dejó reposar en el portaobjetos durante 2 minutos más antes de enjuagar el portaobjetos con agua desionizada y se dejó secar al aire.
Los pasos utilizados en la identificación de CTC y proceso de caracterización del ensayo de 4 colores de 5T4 optimizado de la presente invención son: (1 ) preparar los portaobjetos; (2) almacenar los portaobjetos; (3) descongelar y teñir los portaobjetos; (4) escanear los portaobjetos; (5) probar algoritmos; y (6) análisis técnico y reportes.
El ensayo de CTC fue específicamente desarrollado con el ambiente clínico en mente así como la necesidad de innovación tecnológica temprana y automatización futura. Todos los procesos de laboratorio siguen
procedimientos de operación estándar estrictos que han sido optimizados, probados y validados. La recolección de datos e identificación de candidato se han automatizado usando interfaces específicas que permiten al patólogo tomar decisiones y posteriormente rastrear estas decisiones.
Este sistema promete permitir investigación nueva en la caracterización molecular de clasificación morfológica de CTCs así como aplicaciones para selección de punto-de-cuidado, monitoreo y administración de pacientes con cáncer.
Claims (28)
1.- Un método para detectar células tumorales circulantes 5T4-positivas en un sujeto mamífero que se sospecha tiene cáncer 5T4-positivo, que comprende: probar una muestra de sangre del sujeto mamífero, en donde la muestra de sangre comprende una población celular; montar la muestra de sangre en un sustrato; detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a células nucleadas; detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en la muestra de sangre que se une a las células tumorales circulantes; detectar la presencia o ausencia de un tercer marcador en la muestra de sangre que se une a la población celular o una subserie de la población celular que no se determinan como células tumorales; detectar el nivel de expresión de un cuarto marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a las células tumorales circulantes en donde el cuarto marcador es antígeno 5T4 humano; y, analizar la población celular detectada por los primeros, segundos, terceros y cuartos marcadores para identificar y caracterizar las células tumorales circulantes.
2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la presencia de las células tumorales circulantes en la muestra de sangre indica la presencia de cáncer 5T4-pos¡tivo de etapa temprana en el sujeto mamífero.
3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la ausencia de las células tumorales circulantes en la muestra de sangre indica un estado libre de enfermedad o un estado de enfermedad no medible en el sujeto mamífero.
4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la presencia o ausencia de las células tumorales circulantes en la muestra de sangre indica administración de terapia durante terapia de cáncer 5T4-positivo o recuperación de cáncer.
5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la población celular es una población celular mixta.
6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el sustrato es un sustrato plano.
7 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el sustrato es un dispositivo micro fluido.
8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el sustrato es un cartucho que sostiene una población enriquecida de células.
9. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde montar la muestra en el sustrato forma una monocapa biológica.
10. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el primer marcador, el segundo marcador, el tercer marcador, o el cuarto marcador es un marcador fluorescente.
1 1. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el primer marcador se usa en analizar la población celular por detalle nuclear, contorno nuclear, presencia o ausencia de nucléolos, calidad de citoplasma o cantidad de citoplasma.
12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , en donde el análisis usa DAPI.
13 - El método de conformidad con la reivindicación 11 , que comprende además analizar la población celular al medir células intactas con una relación alta nuclear a citoplásmica, células intactas con una relación baja nuclear a citoplásmica, células apoptóticas tempranas, o células apoptóticas tardías, e identificar las células tumorales circulantes y los grupos celulares tumorales circulantes.
14.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el segundo marcador o el tercer marcador es un marcador específico de célula.
15 - El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el marcador específico de célula es citoqueratina, CD45, M30, receptor de quimiocina, CXCR1 , CXCR4, CD44, CD24, VEGFR-1 , VEGFR-2, VEGFR-3, EGFR o HuR.
16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde el marcador específico de célula es citoqueratina.
17.- El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde el marcador específico de célula es CD45.
18.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el primer marcador es una tinción citológica para identificar la célula tumoral circulante por morfología, tamaño o relación nuclear a citoplásmica.
19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde la tinción citológica es tinción Wright-Giemsa.
20. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde detectar la presencia del primer marcador, la presencia del segundo marcador, la presencia del tercer marcador, o la presencia del cuarto marcador, comprende además analizar la población celular por fijación celular al sustrato, escanear la población celular en el sustrato, y formar imágenes de las células por microscopía digital al usar reubicación.
21.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la detección de células tumorales circulantes 5T4-positivas en la muestra de sangre indica un cáncer 5T4-positivo.
22. - El método de conformidad con la reivindicación 21 , en donde el cáncer 5T4-positivo se selecciona a partir del grupo que consiste de carcinomas de la vejiga, mama, cérvix, colon, endometrio, riñon, pulmón, esófago, ovario, próstata, páncreas, piel, estómago y testículos.
23. - Un método de diagnosticar células tumorales circulantes 5T4-positivas en un sujeto mamífero que se sospecha tiene cáncer 5T4-positivo, que comprende: probar una muestra de sangre del sujeto mamífero, en donde la muestra de sangre comprende una población celular; montar la muestra de sangre en un sustrato; detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a células nucleadas; detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en la muestra de sangre que se une a las células tumorales circulantes; detectar la presencia o ausencia de un tercer marcador en la muestra de sangre que se une a la población celular o una subserie de la población celular que no se determinan como células tumorales; detectar la presencia o ausencia de un cuarto marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a las células tumorales circulantes en donde el cuarto marcador es antígeno 5T4 humano; y, analizar la población celular detectada por los primeros, segundos, terceros y cuartos marcadores para identificar y caracterizar las células tumorales circulantes.
24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, en donde la cuantificación del antígeno 5T4 humano en las células tumorales circulantes se usa para generar una calificación H, en donde la calificación H se usa para seleccionar una población de pacientes con cáncer 5T4-positivo.
25.- Un método de seleccionar actividad o eficacia de un conjugado de anticuerpo-fármaco para tratamiento de cáncer 5T4-positivo en un sujeto mamífero que se sospecha tiene cáncer, que comprende: probar una muestra de sangre de un sujeto mamífero que ha sido previamente administrado con una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado de anticuerpo-fármaco, en donde la muestra de sangre comprende una población celular; montar la muestra de sangre en un sustrato; detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a células nucleadas; detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en la muestra de sangre que se une a las células tumorales circulantes; detectar la presencia o ausencia de un tercer marcador en la muestra de sangre que se une a la población celular o una subserie de la población celular que no se determinan como células tumorales; detectar la presencia o ausencia de un cuarto marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a las células tumorales circulantes en donde el cuarto marcador es antígeno 5T4 humano; y, analizar la población celular detectada por los primeros, segundos, terceros y cuartos marcadores para identificar y caracterizar las células tumorales circulantes en la muestra de sangre antes del tratamiento con el conjugado de anticuerpo-fármaco comparado con después del tratamiento con el conjugado de anticuerpo-fármaco, en donde un cambio en la relación de células tumorales circulantes 5T4-positivas a células tumorales circulantes 5T4-negativas en la muestra de sangre después del tratamiento comparado con la relación de células tumorales circulantes 5T4-positivas a células tumorales circulantes 5T4-negativas en la muestra de sangre antes del tratamiento puede indicar la eficacia del conjugado de anticuerpo-fármaco en la reducción de las células tumorales circulantes 5T4-positivas.
26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el conjugado de anticuerpo-fármaco es anti-5T4-A1-mcMMAF.
27.- Un método para detectar células tumorales circulantes 5T4-positivas en un sujeto mamífero que se sospecha tiene cáncer 5T4-positivo, que comprende: probar una muestra de sangre del sujeto mamífero, en donde la muestra de sangre comprende una población celular; montar la muestra de sangre en un sustrato; detectar la presencia o ausencia de un primer marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a células nucleadas; detectar la presencia o ausencia de un segundo marcador en la muestra de sangre que se une a las células tumorales circulantes; detectar la presencia o ausencia de un tercer marcador en la muestra de sangre que se une a la población celular o una subserie de la población celular que no se determinan como células tumorales, en donde el tercer marcador es CD45; detectar la presencia o ausencia de un cuarto marcador en la muestra de sangre que selectivamente se une a las células tumorales circulantes en donde el cuarto marcador es antígeno 5T4 humano; y, analizar la población celular detectada por los primeros, segundos, terceros y cuartos marcadores para identificar y caracterizar las células tumorales circulantes.
28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde analizar la población celular detectada por los primeros, segundos, terceros y cuartos marcadores se utiliza para determinar la inclusión o exclusión de sujetos mamíferos para el tratamiento de cáncer 5T4-positivo.
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