MX2014006884A - Aparato, sistema y metodo para identificar celulas tumorales circulantes. - Google Patents

Abstract

Se proporciona el aparato, sistemas y métodos para la identificación de diversos objetos, en particular células tumorales circulantes. En un aspecto, el sistema incluye, más no se limita a, un sistema de exploración, un sistema de almacenamiento de imágenes y un sistema de análisis. El sistema de análisis preferentemente identifica los objetos deseados, como pueden ser células completas, con base en estos criterios, los cuales pueden incluir el área o volumen nuclear de la célula, el estatus negativo de CD-45 y el estatus positivo de citoqueratina. Preferentemente se incluye un portaobjeto para contener las células durante el paso de adquisición de la imagen, el pozo incluye una superficie de fondo plana, un borde en la periferia del pozo definiendo los lados del pozo, el borde estando junto a la superficie del fondo del pozo y proporcionando un sello para el paso de líquidos entre estos. La invención presente prevé un solo pozo para la adquisición de la imagen, prevé prácticamente una monocapa de objetos, por ejemplo, células.

Description

APARATO, SISTEMA Y MÉTODO PARA IDENTIFICAR CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere, en general, al diagnóstico médico, y más específicamente a la identificación y clasificación de las células tumorales circulantes (las CTC).

INFORMACIÓN ANTERIOR El campo de la investigación de las células tumorales circulantes ha evolucionado con rapidez en respuesta a una necesidad médica importante hasta ahora no cumplida de supervisión longitudinal de la enfermedad en pacientes con cánceres epiteliales (carcinomas). La predicción y supervisión de la respuesta de las terapias y la progresión de la enfermedad son particularmente importantes debido a los cambios en la capacidad de respuesta de la terapia ante la enfermedad durante el curso de un cáncer de un paciente. En los tumores líquidos como la leucemia, las células malignas pueden muestrearse fácilmente a partir de la circulación de la sangre en muchos puntos durante la enfermedad, y se aplican ajustes apropiados a la terapia. No obstante, los tumores sólidos como los carcinomas generalmente son muestreados solo en el momento del diagnóstico inicial, puesto que las biopsias de tejido son procedimientos invasivos con los riesgos ya conocidos. En ocasiones un muestreo repetido del tumor se recolecta en el momento en que se vuelve aparente por primera vez la metástasis distante, para confirmar que lesiones distantes de hecho representan la metástasis del tumor primario conocido del paciente.

En la comprensión actual del comportamiento del cáncer, si bien se han hecho progresos en la comprensión de las formas de los tejidos sólidos de los carcinomas primarios y metastásicos en sus respectivos microentornos, existe una brecha considerable en la comprensión del comportamiento del carcinoma durante la fase liquida, en donde éste ocupa y se dispersa por la circulación de la sangre. Para canceres que se presentan principalmente como sólidos, el componente circulante elusivo y escaso contiene dentro de éste las células que dan origen a futuras metástasis distantes, y como tal, representa un objetivo convincente para la invención.

La investigación para caracterizar completamente la importancia clínica de esta fase fluida de los tumores sólidos ha sido impedida por la falta de herramientas experimentales de fácil acceso y confiables para la identificación de las células tumorales circulantes (las CTC). El carácter desconocido y la poca frecuencia de las CTC en la sangre, combinados con la dificultad para distinguir entre células epiteliales cancerosas contra normales, ha impedido significativamente la investigación acerca de qué tan importante podría ser la fase fluida desde el punto de vista clínico. La biopsia en la fase líquida ideal encontraría números significativos de las CTC en la mayor parte de los pacientes con cáncer epitelial, y preservaría y presentaría las CTC ante un patólogo y/o investigador en un formato que permita no solo su enumeración sino además el análisis molecular, morfológico y/o fenotípico. Además, se preservarían todas las demás poblaciones de células tipo CTC dentro de la muestra para análisis posterior.

En la actualidad, la única teenología aprobada por la FDA para la detección de las CTC se basa en el enriquecimiento inmunomagnético. Esta prueba actual "estándar de oro" se denomina CellSearch® y emplea un paso de enriquecimiento inmunomagnético para aislar células que expresen la molécula de adhesión de las células epiteliales (EpCAM) [1]. Además, para que sea identificada como una CTC, la célula debe contener un núcleo, expresar citoqueratina citoplásmica y tener un diámetro mayor de cinco micrones. Esta teenología ha descubierto la utilidad pronóstica de enumerar y vigilar las cuentas de las CTC en pacientes con cánceres metastásicos de mama, próstata, y colorrectales; no obstante, la sensibilidad de este sistema es baja, porque no encuentra o encuentra pocas CTC en la mayoría de los pacientes [2, 3]. La mayoría de las tecnologías de seguimiento de las CTC han reportado mayor sensibilidad y están buscando variaciones de la estrategia de enriquecimiento; sin embargo, estos abordajes sesgan directamente los episodios detectables hacia aquellos que tengan suficiente expresión de la proteína seleccionada para el paso de enriquecimiento inicial [4-8].

Abundan trampas en el campo de la biología de las CTC. Entre los problemas más difíciles están la sensibilidad y la especificidad. La tasa de resultados positivos biológicos verdaderos en pacientes de cáncer es desconocida, y la tasa de células epiteliales benignas circulantes en personas sanas o personas con enfermedad no maligna, del mismo modo no se conoce con certeza. Para la sensibilidad - una prueba positiva en presencia de la enfermedad (en este caso la presencia biológica de las CTC) - la estrategia comúnmente utilizada en lugar de un conocimiento seguro es realizar experimentos de adición colocando células de lineas celulares en la sangre entera, o incluso datos publicados de otros investigadores que utilizan teenologías que pueden variar significativamente. Ambos abordajes son problemáticos y el problema persiste en el área. La especificidad - una prueba negativa en ausencia de la enfermedad - puede ser abordada al menos en parte evaluadnos las muestras del paciente que, de acuerdo con nuestra comprensión actual del cáncer, debe ser negativa para las células cancerosas circulantes.

Para este fin, la sangre de donadores sanos generalmente se utiliza como un testigo negativo, y aunque los números publicados varían, en general, solo pocos números de CTC se encuentran en las personas clínicamente sanas. Para los resultados que se mencionan en la presente, la población de donadores sanos consiste en voluntarios que no sean miembros del laboratorio de edades variables, que no se sepa que tengan cáncer pero que no hayan sido sometidos a evaluaciones médicas exhaustivas para detectar cánceres ocultos. Puesto que todo cáncer es, desde luego, inicialmente asintomático, encontrar una población verdaderamente negativa para la determinación de la especificidad sería un esfuerzo costoso y de largo plazo, puesto que seria necesario hacer pruebas médicas invasivas en los individuos aparentemente sanos, o incluso esperar un tiempo suficiente para garantizar que ellos no manifiestan algún tipo de carcinoma durante los años subsecuentes.

En la téenica anterior se han utilizado diversos formatos para presentar muestras de pacientes para ensayos. Estos formatos han incluido sistemas fluidos, como pueden ser los sistemas a base de citometria de flujo, y sistemas estáticos. La FIG.1 muestra una vista en planta de una placa de tres pozos como se utilizan en los sistemas de imagenologia estática de la técnica anterior. Un portaobjetos tiene tres regiones de pozos de igual tamaño. Por ejemplo, cada región de pozo 10 es de 1.45 cm cuadrados. El área total resultante de los pozos para el portaobjetos es 6.3 cm2. La periferia de los pozos es 17.4 cm. El porcentaje del portaobjetos total ocupado por los tres pozos es el 23.6%. Un número estimado de células por portaobjetos es en el intervalo desde 1.25 hasta 1.5 millones de células.

La FIG.2 muestra una vista en planta de una placa de doce pozos utilizada en la técnica anterior. Un portaobjetos contiene doce regiones de pozos de igual tamaño 12. Por ejemplo, cada región de pozo es un circulo con un diámetro de 0.5 cm. El área total resultante de los pozos para el portaobjetos es 2.4 cm2. La periferia de los pozos es 19 cm. Por último, el porcentaje del portaobjetos total ocupado por los tres pozos es 12.8%. Un número estimado de células por portaobjetos es en el intervalo desde 500 hasta 600 mil células.

A pesar del intenso esfuerzo, la detección de las CTC hasta ahora ha sido desafiante. Lo gue se reguiere es un sistema sensible y especifico que pueda detectar de manera eficiente, expedita y barata las CTC.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proporciona el aparato, sistema y método para la identificación de diversos objetos, en particular las CTC.

Como tal, en un aspecto, la invención proporciona un sistema para ensayar células. El sistema incluye un pozo de la presente invención, un sistema de iluminación, un sistema de imagenologia, un módulo de análisis gue tenga funcionalidad para analizar criterios de selección de las células y una salida de usuario. En las modalidades el sistema puede incluir, más no se limita a, un sistema de exploración, un sistema de almacenamiento de imagen y un sistema de análisis. El sistema de análisis preferentemente identifica los objetos deseados, como pueden ser células completas, con base en diversos criterios, los cuales pueden incluir el área o volumen nuclear de la célula, el estatus negativo para CD-45 y el estatus positivo para citoqueratina. Preferentemente se incluye un portaobjetos que lleva un pozo para contener las células durante el paso de captación de la imagen, el pozo, incluida la superficie plana del fondo, un borde en la periferia del pozo que define los lados del pozo, el borde estando junto a la superficie del fondo del pozo y proporcionando un sellado de fluidos entre éstos.

En otro aspecto, la invención proporciona un pozo para ensayar células el cual está colocado sobre una superficie de un sustrato. El pozo consiste en una superficie plana del fondo y un borde formando una periferia del pozo, el borde estando junto a la superficie del fondo y proporcionando un sellado de fluidos entre estos. Las modalidades de la invención establecen un solo pozo de imagenologia, proporcionando considerablemente una monocapa de objetos, por ejemplo células. El pozo tiene un área preferentemente mayor de 7.5 c 2, más preferentemente mayor de 10 cm2, y considerablemente de mayor preferencia 11.7 cm2. El perímetro del pozo es considerablemente de preferencia 12.5 cm, considerablemente de mayor preferencia 14.5 cm y considerablemente de mayor preferencia 15.7 cm, correspondientemente. El porcentaje de la superficie alta del portaobjetos cubierto por el pozo es considerablemente de preferencia 40%, más preferentemente 53% y considerablemente de mayor preferencia 62%. Los tamaños de los pozos son para permitir la imagenología de una monocapa de preferentemente 1.6 a 1.9 millones de células, más preferentemente 2.1 a 2.6 millones de células, y más preferentemente, 2.5 a 3 millones de células, respectivamente. Los pozos de imagenología preferidos tienen un total de cuatro lados. Al reducir el número de lados (en comparación con la téenica anterior, por ejemplo, el portaobjetos de 3 pozos tiene 12 lados) y su perímetro, los efectos de los bordes asociados con el contorno de la pared lateral se llevan al mínimo.

En una aplicación, el enfoque utilizado en la presente para identificar las CTC en alta definición (HD-CTC) es diferente en que no depende de alguna estrategia de enriquecimiento de proteínas única. En cambio, todas las células nucleadas son retenidas y teñidas por métodos inmunofluorescentes con anticuerpos monoclonales dirigidos a citoqueratina (CK), un filamento intermedio que se encuentra exclusivamente en las células epiteliales, un anticuerpo especifico de pan leucocitos dirigido a CD45, y un colorante nuclear, DAPI. Las células sanguíneas nucleadas son captadas en múltiples canales fluorescentes para producir imágenes digitales de alta calidad y alta resolución que conservan detalles citológicos finos del contorno nuclear y de la distribución citoplásmica. Esta estrategia libre de enriquecimiento da lugar a una alta sensibilidad y alta especificidad, adicionando además citomorfologia de alta definición capaz de mostrar las características morfológicas a detalle de una población de CTC que se conozca como heterogénea. Una ventaja de este abordaje es que es posible perseguir múltiples parámetros analíticos para identificar y caracterizar poblaciones específicas que interesen.

Las modalidades de la presente invención han sido utilizadas para ensayar muestras utilizando las "HD-CTC" en pacientes de cáncer metastásico. Los aspectos innovadores importantes de este ensayo son su simplicidad, con mínimo procesamiento de las muestras de sangre y su capacidad para permitir la interpretación morfológica profesional con imágenes diagnósticas de calidad de la patología/citopatología.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método para realizar un ensayo celular. El método consiste en poner en contacto una muestra que tenga una población de células con el pozo de la presente invención, y analizar la población de células a través del sistema de la presente invención, haciendo de este modo el ensayo celular. En las modalidades, el análisis consiste en determinar las características de los tipos de células dentro de la población de células, como pueden ser las CTC.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar una CTC en una muestra. El método consiste en poner en contacto el pozo de la presente invención con la muestra, analizar la población de células a través del sistema de la presente invención; y detectar una CTC con base en el análisis, detectando con ello una CTC en la muestra. En las modalidades, más de 2, 5, 7, 10, 15, 20 o 50 células tumorales circulantes se detectan por mL de muestra.

En todavía otro aspecto, la invención propone un método para el diagnóstico de cáncer o para proporcionar un pronóstico de cáncer en un individuo. El método consiste en poner en contacto un pozo de la presente invención con una muestra que incluya una población de células del individuo, analizar la población de células a través del sistema de la presente invención, detectar una CTC en la población de células, determinar las características de la CTC, y determinar un diagnóstico o pronóstico con base en la caracterización, diagnosticando o proporcionando con ello un pronóstico del cáncer en el individuo.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método para determinar la capacidad de respuesta de un individuo a una pauta quimioterapéutica. El método consiste en poner en contacto el pozo de la presente invención con una muestra que contenga una población de células de un individuo, analizar la población de células a través del sistema de la presente invención, detectar una CTC a través del análisis, y caracterizar la CTC para determinar la eficacia de la administración de un compuesto quimioterapéutico, determinando con ello la capacidad de respuesta del individuo a la pauta terapéutica.

En todavía otra modalidad, la invención proporciona un kit o equipo. El kit incluye al menos un pozo de la presente invención, reactivos para determinar por método inmunológicos la presencia de citoqueratina o CD45 en una célula y las instrucciones para utilizar el kit para detectar una CTC en una muestra.

El aparato, los sistemas y métodos descritos en la presente demuestran el primer uso del ensayo de HD-CTC en un protocolo prospectivo comparativo el cual abordó la confiabilidad y robustez del ensayo, compara la sensibilidad en una comparación de muestras divididas con el ensayo Cellsearch®, y establece la incidencia de las HD-CTC y clúster o cúmulos de HD-CTC en pacientes con cánceres metastásicos de mama, próstata y pancreáticos asi como testigos normales. Es importante señalar que la definición de "HD-CTC" preferentemente requiere uno o más de los requerimientos que la(s) célula(s) tenga un núcleo intacto, exprese citoqueratina y no CD45, sea morfológicamente diferente de las células sanguíneas blancas benignas (WBC) circundantes, y que tengan las características citológicas acordes con las células epiteliales de morfología anormal, intactas apropiadas para el análisis corriente abajo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIG. 1 es una vista en plana de una placa de 3 pozos de la téenica anterior.

La FIG.2 es una vista en planta de una placa de 12 pozos de la téenica anterior.

La FIG.3 es un diagrama en bloque funcional de todo el sistema de HD CTC.

La FIG. 4 es un diagrama a nivel de componentes de los componentes de exploración e imagenología del sistema.

La FIG. 5 muestra los posibles portaobjetos de imágenes a través del espacio de parámetros medidos, representando la filtración de las células con base en estos parámetros.

La FIG.6 es una vista en planta de un portaobjetos representativo y el pozo.

La FIG. 7 es una vista en perspectiva de un portaobjetos representativo y el pozo.

La FIG. 8 muestra la media observada de las SKBR3 graficada contra las SKBR3 esperadas.

La FIG.9 muestra una comparación de las cuentas de CTC entre dos procesadores diferentes en 9 muestras de pacientes de cáncer diferentes. Las cuentas de CTC/mL abarcaron desde 0 hasta 203.

La FIG.10 muestra datos de pruebas comparativas de los sistemas, aparatos y métodos descritos en la presente, contra el producto CellSearch®.

La FIG. 11 muestra los resultados de pruebas graficando la cantidad de las CTC de diversas muestras, para tumores prostéticos, pancreáticos y de mama y una comparación con la población sana.

La FIG. 12 muestra la cantidad de las CTC de diversas muestras de pacientes respecto al cáncer de mama.

La FIG. 13 muestra el área nuclear normalizada contra el área nuclear para las células sanguíneas blancas (WBC) y las CTC, incluye un acercamiento de la región basal.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Antes de describir las composiciones y métodos presentes, debe entenderse que esta invención no se limita a las composiciones, métodos y condiciones experimentales especificas descritas en vista de que tales composiciones, métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente es para fines de descripción de las modalidades particulares solamente, y no se pretende que sea limitativa, puesto que el alcance de la presente invención será limitado solo en las cláusulas anexas.

Cuando se utiliza en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluye las referencias plurales a menos que el contexto indique claramente algo diferente. Así pues, por ejemplo, las referencias a "el método" incluyen uno o más métodos y/o pasos del tipo descrito en la presente que serán evidentes para los expertos en la téenica luego de hacer una lectura de esta divulgación y otras.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por los que cuentan con las habilidades ordinarias en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o las pruebas de la invención, ahora serán descritos los métodos y materiales preferidos.

En general, la referencia a "una célula tumoral circulante" está destinada a referirse a una sola célula, aunque la referencia a "células tumorales circulantes" o "cúmulos de células tumorales circulantes" está prevista para referirse a más de una célula. Sin embargo, una persona con habilidades en la téenica comprenderá que la referencia a "células tumorales circulantes" está prevista para incluir una población de células tumorales circulantes que incluye una o más células tumorales circulantes.

El término "célula tumoral circulante" (CTC) o "cúmulo" de CTC está previsto para entender cualquier célula cancerosa o cúmulo de células cancerosas que se encuentran en la muestra de un individuo. Por lo regular, las CTC han sido exfoliadas de un tumor sólido. Como tal, las CTC muchas veces son células epiteliales despojadas de los tumores sólidos que se encuentran en concentraciones muy bajas en la circulación de pacientes con cánceres avanzados. Las CTC también pueden ser mesoteliales de sarcomas o melanocitos de melanomas. Las CTC pueden también ser células que se originan de un tumor primario, secundario o terciario. Las CTC también pueden ser células madre cancerosas circulantes. Aunque el término "célula tumoral circulante" (CTC) o "cúmulos" de CTC incluye células cancerosas, también se pretende incluir células no tumorales que comúnmente no se encuentran en circulación, por ejemplo, células epiteliales o endoteliales circulantes. Por consiguiente, las células tumores y las células epiteliales no tumorales están comprendidas dentro de la definición de las CTC.

El término "cáncer" cuando se utiliza en la presente incluye una variedad de tipos de cáncer que son bien conocidos en la téenica, incluyen, más no se limitan a, displasias, hiperplasias, tumores sólidos y cánceres hematopoyéticos. Se conocen muchos tipos de cánceres que hacen metástasis y desprenden células tumorales circulantes o son metastásicos, por ejemplo, un cáncer secundario que resulta de un cáncer primario que ha hecho metástasis. Otros cánceres pueden ser, más no se limitan a, los siguientes órganos o sistemas: cerebro, cardiaco, pulmonar, gastrointestinal, del tracto genitourinario, hepático, óseo, del sistema nervioso, ginecológico, hematológico, de piel, mama y glándulas suprarrenales. Otros tipos de células cancerosas incluyen gliomas (Schwannoma, glioblastoma, astrocitoma), neuroblastoma, feocromocitoma, paraganlioma, meningioma, carcinoma adrenalcortical, meduloblastoma, rabdomioscarcoma, cáncer renal, cáncer vascular de diversos tipos, osteocarcinoma osteoblástico, cáncer prostático, cáncer de ovario, leiomiomas uterinos, cáncer de glándulas salivales, carcinoma de plexos coroideos, cáncer mamario, cáncer pancreático, cáncer de colon y leucemia megacarioblástica; y cánceres de piel que incluyen melanoma maligno, carcinoma de células básales, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Karposi, lunares atipicos (nevos displásicos), lipoma, angioma, dermatofibroma, queloides, sarcomas como fibrosarcoma o hemangiosarcoma, y melanoma.

Mediante el uso del aparato y los métodos que se describen en la presente, las CTC pueden ser detectadas y caracterizadas a partir de cualquier tipo de muestra apropiada. Cuando se utiliza en la presente, el término "muestra" se refiere a cualquier muestra apropiada para los métodos que se proporcionan en la presente invención. La muestra puede ser cualquier muestra que contenga células raras apropiadas para detección. Las fuentes de las muestras incluyen sangre entera, médula ósea, fluido pleural, fluido peritoneal, liquido cefalorraquídeo, orina, saliva y lavados bronquiales. En un aspecto, la muestra es una muestra de sangre que incluye, por ejemplo, sangre entera o cualquier fracción o componente de esta. Una muestra de sangre, apropiada para uso con la presente invención, puede ser extraída de cualquier fuente conocida que incluya células sanguíneas o componentes de estas, como puede ser venosa, arterial, periférica, de tejido, del cordón y similares. Por ejemplo, una muestra puede ser obtenida y procesada utilizando métodos clínicos bien conocidos y habituales (p. ej., procedimientos para extraer y procesar sangre entera). En una modalidad, una muestra ejemplar puede ser sangre periférica extraída de un individuo con cáncer.

La FIG. 3 es un diagrama en bloques funcional del sistema completo. Uno o más portaobjetos 20 se preparan para el análisis. Véase la descripción detallada, más adelante, para la recolección de las muestras, su preparación y la descripción del procesamiento. Los digitalizadores 22 toman la imagen de uno o más de los portaobjetos 20. Los digitalizadores 22 preferentemente son digitalizadores multi-canales, como pueden ser digitalizadores de 4 colores. Los datos de los digitalizadores 22 se envían a un almacén de imágenes 24. El almacén de imágenes 24 puede estar compuesto de almacenamiento, preferentemente almacenamiento masivo, como puede ser los sistemas RAID, conocidos por quienes cuentan con las habilidades en la téenica. Los datos digitalizados de los almacenes de imágenes se proporcionan a uno o más módulos de análisis técnico 26, el módulo de reportes de análisis técnico 32 y/o la salida 34 para una revisión profesional, como puede ser por un especialista, para su revisión. El módulo de análisis técnico 26 sirve al menos para analizar los datos del almacén de imágenes 24 en las formas descritas con detalle más adelante. El análisis incluye, más no se limita a, analizar las células para determinar el área o tamaño nuclear (como puede ser analizando la intensidad del azul DAPI), analizar la ausencia del CD-45 (como puede ser explorando la intensidad del anticuerpo secundario asociado con el anticuerpo CD-45 y/o analizando la intensidad del anticuerpo asociado con citoqueratina. Preferentemente, el reporte del análisis técnico contiene un archivo HTML con datos, incluidos imágenes de células u objetos, en el archivo. El análisis automatizado puede ser complementado con análisis realizado por un profesional médico.

La salida del módulo del análisis técnico 26 preferentemente se proporciona a una base de datos de metadatos 28. La base de datos de metadatos incluye la información generada por todas las diferentes formas de análisis de los datos. Una ruta de control de bucle de retorno 30 permite el uso de los datos digitalizados y el análisis para luego controlar la reimagenologia de las diapositivas 20. En el caso de que se requiera otro análisis de un objeto, como puede ser una célula, el sistema puede hacer la reimagenologia del objeto. El grado de adhesión o adherencia de los objetos al portaobjetos debe ser suficiente para mantener el lugar de los objetos en el portaobjetos durante al menos la duración de la reimagenologia. En todavía un marco temporal más prolongado, el grado de adhesión o adherencia de los objetos al portaobjetos debe ser suficiente para permitir la identificación subsecuente de los objetos específicos identificados por el análisis, como se describe más adelante, para el otro procesamiento subsecuente de un objeto, como puede ser para determinar el genotipo u otro análisis subsecuente. La duración del tiempo para el almacenamiento de los portaobjetos, y el deseo que la ubicación de la célula permanezca estacionaria, puede abarcar desde horas hasta meses. Preferentemente, el sistema incluye un almacén consolidado 40, como puede ser para los datos e informes.

La información procedente de la base de datos de metadatos 28 preferentemente se proporciona a un sistema de gestión de inventario de datos. El sistema consiste en el sistema de gestión para el sistema total 38. Entre otros datos, el sistema 38 conserva la correlación de la identificación de los pacientes con los portaobjetos.

La FIG. 4 es una vista esquemática de una posible aplicación del sistema de digitalización. Una platina 42, como puede ser una platina x-y, soporta uno o más portaobjetos 20. Para el tamaño del área del pozo que se describe en la presente, cuatro portaobjetos permiten la digitalización de aproximadamente 10 millones de células, una muestra de tamaño común para un paciente. La ruta óptica puede tomar cualquier forma de acuerdo con las modalidades que se describen en la presente. Los componentes de iluminación pueden incluir la fuente luminosa 46, y la rueda de filtro de excitación opcional 48. La fuente luminosa preferentemente es un iluminador de amplio espectro. Un espejo dicroico 50 sirve para pasar la iluminación a los portaobjetos y para permitir la iluminación de retorno a la cámara 54. Una rueda de filtro de emisión optativa 52 puede ser colocada entre el espejo 50 y la cámara 54. La salida entonces se almacena como se describe antes.

La FIG. 5 muestra diversas opciones para la digitalización de objetos soportados por el portaobjetos 20. La digitalización y la obtención de imágenes pueden ser en múltiples dimensiones, preferentemente en un marco tridimensional. Preferentemente, los objetos se colocan sobre el portaobjetos en una monocapa que sea suficientemente plana para permitir la digitalización y la obtención de la imagen de los objetos en una forma eficiente, preferentemente colocada dentro de un plano monofocal. El portaobjetos plano permite la obtención de la imagen de la monocapa en una forma congruente ya que la desviación del plano de la imagen se minimiza. La obtención de la imagen sobre una superficie plana también facilita el apilamiento de las imágenes en el eje Z. Como se muestra en la FIG.5, los planos de la imagen pueden ser en diversas orientaciones, que pueden estar en una relación no planar. Como se muestra en la FIG. 5, la detección de las células candidatas CTC por lo regular depende de diversos parámetros medidos a partir de las imágenes del portaobjetos. Por ejemplo, 1-3 dimensiones podría ser el área nuclear, la intensidad de citoqueratina y la intensidad de CD-45. Los planos de la FIG. 5 representan los límites de corte de cada uno de los parámetros medidos que definen las CTC candidatas. De otro modo o además, es posible utilizar sistemas de cámaras de campos luminosos en las cuales una cámara digital incluye sensores de luz que capturan rayos luminosos aún más allá de un solo plano focal, permitiendo al software ensamblar imágenes de diversos planos de la imagen. Las lentes, como pueden ser las microlentes pueden utilizarse en asociación con los sensores de luz digitales.

Las FIGS.6 y 7 definen algunas características del portaobjetos 20. El portaobjetos puede ser de cualquier tamaño o geometría de acuerdo con las modalidades de las invenciones que se describen en la presente. En una aplicación, el portaobjetos 20 generalmente es de forma rectangular, con una longitud Ls, una amplitud Ws, y un espesor t. Las dimensiones representativas son Ls de considerablemente 7.5 cm, Ws de considerablemente 2.5 cm, y un espesor de 7 mm. El portaobjetos 20 preferentemente tiene una superficie alta 72, una superficie inferior paralela 74, los lados del revés 66, lados frontales 68 y caras terminales 70. Se puede proporcionar la identificación de portaobjetos 60, la cual sería mediante un código de barras. Estos portaobjetos están a la disposición de diversas fuentes, como puede ser de Marienfeld Laboratory Glassware.

Se proporciona un pozo 62 para contener y mantener los materiales que se van a procesar hasta la imagen. En el formato que se describe con detalle en la presente, en pozo 62 es rectangular y tiene una longitud L y una amplitud W. Las dimensiones internas representativas para el pozo 62 pueden ser, como ejemplo, L de prácticamente 5.85 cm y W de prácticamente 2.5 cm. La periferia o el perímetro del pozo 62 pueden ser definidos por un borde 64, sea de un borde estructural específico o por otros materiales, como puede ser por un borde de material hidrófobo. El borde también puede ser denominado un contorno. El borde o contorno se adaptan para recibir y contener la suspensión celular y todos los demás reactivos, soluciones, soluciones amortiguadoras u otros líquidos que se utilizan en el proceso. El borde o contorno en combinación con el lado superior de portaobjetos forman el pozo. Con estas dimensiones, el área del pozo 62 es prácticamente de 11.7 cm2 y el perímetro del pozo 62 es prácticamente de 15.7 cm. El grado de reverso del pozo 62 desde las orillas del portaobjetos 20 puede establecerse con base en otros aspectos del sistema, como pueden ser las características del sistema digitalizador. Una modalidad proporciona un solo pozo para la imagenología 62, permitiendo prácticamente una monocapa de objetos, p. ej., células, para ser procesadas en imágenes, teniendo un área preferentemente mayor de 7.5 cm2, más preferentemente mayor de 10 cm2, y más preferentemente prácticamente 11.7 cm2. El perímetro del pozo 62 considerablemente de preferencia es de 12.5 cm, considerablemente de más preferencia 14.5 cm y considerablemente de mayor preferencia 15.7 cm, en consecuencia. El porcentaje de la superficie alta del portaobjetos cubierta por el pozo es considerablemente de preferencia 40%, más preferentemente 53% y considerablemente de mayor preferencia 62%.

Los pozos preferidos para la obtención de imágenes 62 tienen un total de cuatro lados. Al reducir el número de lados (en comparación con la téenica anterior, por ejemplo, el portaobjetos de 3 pozos tiene 12 lados (véase FIG. 1)) y su perímetro, los efectos de la orilla asociados con el contorno de la pared lateral se llevan al mínimo. Los pozos son del tamaño para permitir la obtención de la imagen de una monocapa de preferentemente 1.6 a 1.9 millones de células, más preferentemente 2.1 a 2.6 millones de células y más preferentemente, 2.5 a 3 millones de células, respectivamente.

Para resumir, los siguientes parámetros definen diversas medidas de los sistemas, aparatos y métodos, cuando se obtienen imágenes de células en considerablemente una monocapa en el pozo descrito en la presente: El portaobjetos como una opción puede ser provisto con marcas de referencia. Si las células están suficientemente fijadas en el lugar, es posible utilizar otras estructuras para indizar el portaobjetos. Como un ejemplo, es posible utilizar el borde, más específicamente, el ángulo de 90 grados en la esquina del pozo puede utilizarse para referencia.

El aparato y sistemas descritos en la presente permiten aumentar y optimizar la densidad celular y llevar al mínimo los efectos de los bordes. En la modalidad preferida, un solo pozo de células se utiliza para contener al menos 1.5 millones de células, y como una opción aún más, como puede ser 3 millones de células. En la modalidad preferida, cuatro pozos laterales sirven para contener esta población de células. Por el contrario, el uso de portaobjetos de tres campos en lugar de un portaobjetos de un campo requerirla el uso de dos a tres veces tantos portaobjetos y manejar doce orillas (3x4) en cada portaobjetos en lugar de solo cuatro orillas. Cualquier distribución de liquido sufre de los efectos de las orillas no importa cuán hidrofóbicas sean las orillas. La distribución celular muestra que la densidad de las células en las orillas disminuye significativamente. Aunque puede utilizarse un portaobjetos de microscopio de tamaño normal, el tamaño no está limitado a éste. Es posible utilizar portaobjetos de vidrio más grande de acuerdo con los objetivos de las modalidades que se describen en la presente. No obstante, el uso de un portaobjetos de tamaño normal da lugar a beneficios del proceso permaneciendo con un tamaño normal, para lo cual existe una base grande de maquinas instaladas, como pueden ser sistemas de microscopios existentes, automatizados y los sistemas de almacenamiento, por mencionar algunos.

El sistema además preferentemente incluye un sola cubreobjetos por portaobjetos. El sistema sirve para optimizar la velocidad produciendo al mismo tiempo suficiente calidad. Al evitar preferentemente superficies no planas, células apiladas, el cambio de espesores de fluidos y/o el uso de múltiples cubreobjetos en cada portaobjetos, es incrementa la preparación para la obtención de la imagen y la velocidad y calidad de la recolección de los datos. Se prefiere una sola monocapa homogénea muy plana. Todavía otra ventaja del uso de un solo cubreobjetos es que para la obtención de la imagen se presenta una superficie uniforme. Una distribución de medios de montaje mucho más uniforme se proporciona utilizando un solo cubreobjetos en lugar de tres como seria necesario en un portaobjetos de tres pozos normal.

En las modalidades, una muestra procesada como se describe en la presente incluye más de aproximadamente 1, 2, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, o incluso 1000 células raras o CTC.

Aunque los métodos descritos en esta invención son útiles para detectar las CTC, como se analiza a lo largo de la presente, la invención también es útil para caracterizar las CTC. En particular, el uso de diversas combinaciones de marcadores detectables y métodos computacionales para hacer la obtención de la imagen de las células y el análisis permite una caracterización significativa útil para evaluar el pronóstico de cáncer y para vigilar la eficacia terapéutica para la detección temprana de falla del tratamiento que puede dar origen a recidiva de la enfermedad. Además, el análisis de las CTC de acuerdo con la invención permite hacer la detección de una recidiva temprana en pacientes presintomáticos que hayan completado un curso de tratamiento. Lo anterior es posible porque la presencia de las CTC ha sido asociada y/o correlacionada con progresión y propagación de tumor, deficiente respuesta al tratamiento, recidiva de la enfermedad y/o disminución de la supervivencia durante un periodo de tiempo. Asi pues, la enumeración y caracterización de las CTC permite métodos para estratificar a los pacientes de acuerdo con las características básales que predicen el riesgo inicial y el riesgo subsecuente con base en la respuesta al a terapia.

El término "individuo" cuando se utiliza en la presente se refiere a cualquier individuo o paciente para el cual se hacen los métodos presentes. En general, el individuo es humano, aunque quienes cuentan con las habilidades ordinarias en la téenica apreciarán que el individuo puede ser un animal. De este modo otros animales, incluso mamíferos como los roedores (incluidos los ratones, ratas, hámster y cobayos), gatos, perros, conejos, animales de granja como vacas, caballos, cabras, ovejas, cerdos, etc., y primates (incluidos los monos, chimpancés, orangutanes y gorilas) están incluidos dentro de la definición de individuo.

Por consiguiente, en otra modalidad, la invención proporciona un método para diagnosticar o pronosticar el cáncer en un individuo. El método consiste en detectar las CTC como se describe en la presente. Las CTC pueden ser después analizadas para diagnosticar o pronosticar cáncer en el individuo. Como tales, los métodos de la presente invención pueden ser utilizados, por ejemplo, para evaluar pacientes con cáncer y aquellos que estén en riesgo de cáncer. En cualquiera de los métodos de diagnóstico y pronóstico descritos en la presente, la presencia o la ausencia de uno o más indicadores de cáncer, como puede ser una célula cancerosa, o de cualquier otro trastorno, puede utilizarse para generar un diagnóstico o pronóstico.

En un aspecto, una muestra de sangre es extraída del paciente y procesada para detectar las CTC como se describe en la presente. Mediante el uso del método de la invención, se determina un número de CTC en la muestra de sangre y las CTC se caracterizan por análisis de los marcadores detectables y otros datos reunidos para la obtención de imágenes de las células. Por ejemplo, el análisis puede hacerse para determinar el número y caracterización de las CTC en la muestra, y a partir de esta medición puede determinarse el número de las CTC presentes en la muestra de sangre inicial.

En algunos aspectos, el análisis del número y las características de las CTC de un individuo puede hacerse en un tiempo específico en diversos intervalos para evaluar la progresión y patología en un individuo. Por ejemplo, el análisis puede hacerse en intervalos regulares como puede ser un día, dos días, tres días, una semana, dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, seis meses o un año, para rastrear el nivel y caracterización de las células epiteliales circulantes en función del tiempo. En el caso de pacientes de cáncer existente, éste proporciona una indicación útil de la progresión de la enfermedad y ayuda al médico para hacer opciones terapéuticas adecuadas con base en el aumento, disminución o falta de cambio en las células epiteliales circulantes, como puede ser la presencia de las CTC en la corriente sanguínea del paciente. Cualguier aumento, sea 2 veces, 5 veces, 10 veces o mayor en el número de las CTC durante el tiempo disminuye el pronóstico del paciente y es un indicador temprano que el paciente cambiará el tratamiento. DDeell mmiissmmoo mmooddoo,, cualquier aumento, sea 2 veces, 5 veces, 10 veces o más, indica que el paciente será sometido a otro análisis, como puede ser la obtención de una imagen para evaluar otra vez el pronóstico y la respuesta al tratamiento. Cualquier disminución, sea 2 veces, 5 veces, 10 veces o mayor, en el número de las CTC con el tiempo muestra estabilización de la enfermedad y la respuesta a la terapia de un paciente y es un indicador de que no habrá cambio en el tratamiento. Para aquellos que están en riesgo de cáncer, un aumento repentino en el número de las CTC detectado puede proporcionar una advertencia oportuna que el paciente ha desarrollado un tumor, proporcionado así un diagnóstico temprano. En una modalidad, la detección de las CTC reveladas aumenta el estadio del cáncer.

En cualquiera de los métodos que se proporcionan en la presente es posible hacer análisis adicionales para caracterizarlas CTC, para proporcionar una evaluación clínica adicional. Por ejemplo, además del análisis de la imagen, puede emplearse análisis de la expresión génica y téenicas PCR, como puede ser análisis de chip génico y multiplexado con cebadores específicos para marcadores de cáncer particulares a fin de obtener información como puede ser el tipo de tumor, del cual se originan las CTC, el estado metastásico y el grado de malignidad. Además, el tamaño de la célula, el análisis del DNA o RNA, el análisis del proteoma o análisis de metaboloma pueden hacerse como medio para evaluar información adicional respecto a la caracterización del cáncer de paciente. En algunos aspectos, el análisis incluye anticuerpos detectados para o multiplexión de PCR utilizando cebadores específicos para uno o más de los siguientes marcadores: EGFR, HER2, ERCC1, CXCR4, EpCAM, E-Cadherina, Mucina-1, Citoqueratina, PSA, PSMA, RRMl, receptor de andrógeno, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, IGF1, cMET, EML4, o receptor asociado con leucocitos (LAR).

Por ejemplo, el análisis adicional puede proporcionar datos suficientes para hacer las determinaciones de la capacidad de respuesta de un individuo a una pauta terapéutica particular, o para determinar la eficacia de un compuesto candidato en el tratamiento del cáncer. Por consiguiente, la presente invención propone un método para determinar la capacidad de respuesta de un individuo a una pauta terapéutica particular o determinar la eficacia de un compuesto candidato en el tratamiento de cáncer detectando las CTC del individuo como se describe en la presente y analizando las CTC detectadas. Por ejemplo, una vez que se administra un tratamiento farmacológico a un paciente, es posible determinar la eficacia del tratamiento farmacológico utilizando los métodos de la invención. Por ejemplo, una muestra tomada del paciente antes del tratamiento farmacológico, asi como una o más muestras celulares tomadas del paciente al mismo tiempo con o después del tratamiento farmacológico, pueden ser procesadas utilizando los métodos de la invención. Mediante la comparación de los resultados del análisis de cada muestra procesada, es posible determinar la eficacia del tratamiento farmacológico o la capacidad de respuesta del paciente al compuesto. De este modo, puede hacerse una identificación temprana de los compuestos fallidos o la validación temprana de los compuestos promisorios.

Cuatro indicadores importantes que proporcionan una idea de la actividad clínica de los compuestos candidato incluyen HER2, EGFR, CXCR4, y EphB4 RTK. HER2 proporciona un indicador de la malignidad de una célula determinando la estabilidad del mRNA y la localización subcelular de los transcritos de HER2. La resistencia de EGFR para adquirir mutaciones y/o las mutaciones adquiridas proporciona indicadores importantes de la actividad de un compuesto candidato además de posibles compuestos alternativos que pueden utilizarse en combinación con el compuesto candidato. Una evaluación del nivel de interferencia de la reparación de DNA inducida con platino proporciona una idea del estado del marcador CXCR4 y el estado metastásico. Además, la evaluación del estado del receptor tirosina sinasa de EphB4 proporciona una idea del potencial metastásico de la célula. Por consiguiente, mediante el uso de los métodos de la presente invención, los pacientes que toman tales medicamentos candidatos pueden ser vigilados tomando muestras frecuentes de sangre y determinando el número de células epiteliales circulantes, por ejemplo las CTC, en cada muestra en función del tiempo. Otro análisis de los indicadores Her2, EGFR, CXCR4 y EphB4 RTK proporciona información en cuanto a la patología del cáncer y la eficacia de los medicamentos candidatos. Del mismo modo, los marcadores ERRC1, Citoqueratina, PSA, PSMA, RRM1, receptor de andrógenos, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, IGF1, cMET, EML4 y otros proporcionan una idea en cuanto a la actividad clínica de los compuestos candidatos. El análisis de estos indicadores de la actividad clínica puede ser a través del análisis de los marcadores detectables como se indica en la presente (p. ej., inmunohistoquímica e hibridación fluorescente in situ (FISH)) u otros análisis a través de téenicas como secuenciación, genotipificación, expresión génica u otras técnicas de análisis molecular.

El análisis de las CTC proporciona un método para determinar a individuos candidatos para un ensayo clínico específico. Por ejemplo, las CTC detectadas de un candidato pueden ser analizadas para determinar si existen marcadores específicos con el fin de determinar si la pauta terapéutica específica del ensayo clínico puede ser potencialmente útil. Por consiguiente, en otra modalidad, la invención proporciona un método para determinar a un individuo candidato para un ensayo clínico. El método consiste en detectar las CTC del individuo como se describe en la presente. Las CTC pueden ser después analizadas para determinar si el individuo candidato es apropiado para el ensayo clínico específico.

El análisis de las CTC durante el ensayo clínico proporcionará información acerca si el paciente está respondiendo o no al fármaco experimental, donde ningún cambio considerable o una disminución en las CTC reveladas indica respuesta y un aumento en las CTC reveladas indica deficiente respuesta. El aumento o disminución puede ser 2 veces, 10 veces o mayor. Esta información es un indicador temprano de la eficacia del medicamento y pueden utilizarla los investigadores como una variable secundaria en el ensayo clínico.

Los siguientes ejemplos están propuestos para demostrar y no para limitar la invención.

EJEMPLO 1 DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS CTC Resultados experimentales CTC a HD-CTC: Mejoras de la definición El sistema preferentemente define una o más medidas para las células que han de ser utilizadas en el análisis. Diversos abordajes definen una CTC intacta con base en la investigación de los grandes números de episodios candidatos en pacientes con cánceres epiteliales, con la comparación directa con células procedentes de las formas sólidas del mismo tumor del mismo paciente [9-12]. Con base en estas definiciones, y utilizando el ensayo de las HD-CTC para depurar los criterios, se estableció una definición de una HD-CTC. Esta definición ha sido desarrollada para garantizar que una HD-CTC sea una célula que tenga el potencial más alto de ser una célula intacta que se origine de un depósito sólido de carcinoma en el cuerpo del paciente. Todas las demás poblaciones que cumplan parcialmente con estos requerimientos pero no alcancen los criterios estrictos de la inclusión que se analizan más adelante son rastreados en el análisis puesto que muchos de estos probablemente representen células tumorales fragmentadas o apoptóticas que pueden tener importancia biológica [13], pero están excluidas en la cuenta de las HD-CTC por su idoneidad no predecible para la evaluación por otras metodologías corriente abajo. Para los fines de esta solicitud pueden utilizarse diversos criterios que cumplan algunos o todos estos.

Es posible determinar las características morfológicas y acreditar las CTC en relación con sus tumores primarios, en estudios de casos de pacientes con cáncer de mama, colorrectal y pulmonar. Mediante el examen morfológico de las CTC de un paciente con un adenocarcinoma pulmonar bien definido, las células circulantes fueron identificadas con características morfológicas acordes con este tipo de tumor, incluso, por ejemplo, células con relaciones nucleares a citoplásmicas relativamente bajas. La morfología de las células tumorales identificadas en la circulación simuló la morfología encontrada en la biopsia de aspirado con aguja fina del tumor primario de este paciente [9]. Evaluadas en una cohorte más grande de pacientes de cáncer de mama requerimientos pero no alcancen los criterios estrictos de la inclusión que se analizan más adelante son rastreados en el análisis puesto que muchos de estos probablemente representen células tumorales fragmentadas o apoptóticas que pueden tener importancia biológica [13], pero están excluidas en la cuenta de las HD-CTC por su idoneidad no predecible para la evaluación por otras metodologías corriente abajo. Para los fines de esta solicitud pueden utilizarse diversos criterios que cumplan algunos o todos estos.

Es posible determinar las características morfológicas y acreditar las CTC en relación con sus tumores primarios, en estudios de casos de pacientes con cáncer de mama, colorrectal y pulmonar. Mediante el examen morfológico de las CTC de un paciente con un adenocarcinoma pulmonar bien definido, las células circulantes fueron identificadas con características morfológicas acordes con este tipo de tumor, incluso, por ejemplo, células con relaciones nucleares a citoplásmicas relativamente bajas. La morfología de las células tumorales identificadas en la circulación simuló la morfología encontrada en la biopsia de aspirado con aguja fina del tumor primario de este paciente [9]. Evaluadas en una cohorte más grande de pacientes de cáncer de mama y colorrectal, las CTC exhibieron un elevado grado de heterogeneidad Ínter- e intra-paciente en el aspecto citológico acorde con la heterogeneidad morfológica de las células que se encuentran comúnmente en el tumor primario y metastásico [10, 11].

Esta platfor a, permite hacer una revisión citomorfológica simultánea de imágenes fluorescentes con imágenes de canales individuales, aumentadas con anotación célula por célula con datos semi-cuantitativos auxiliares respecto al tamaño y la intensidad fluorescente de los objetos. Las HD-CTC se clasifican como células que son: a) positivas para citoqueratina; b) negativas para CD45, con un núcleo de aspecto no apoptótico por imagenologia DAPI. La positividad para CK se define como la señal fluorescente que esté significativamente por encima de la señal de las células circundantes. La negatividad se define como el mismo nivel o por debajo de la señal de las células circundantes. La negatividad para el CD45 se define como teniendo intensidad por debajo de la detección visual bajo las condiciones limítrofes en las que el 99% de todas las células se detectan globalmente. No se muestra una galería de las HD-CTC representativas que se encuentran en los pacientes de cáncer, sin embargo, las HD-CTC son positivas para citoqueratina, negativas para CD45, contienen un núcleo DAPI y son morfológicamente diferentes de las células sanguíneas blancas circundantes.

Se aceptan cambios apoptóticos leves en el citoplasma, como pueden ser la formación de pequeñas burbujas citoplásmicas visualizadas en el canal de citoqueratina siempre que el núcleo no aparezca apoptótico. Además de estas características se i-cuantitativas, las HD-CTC deben ser morfológicamente diferentes de las WBC normales, y deben tener una morfología que sea compatible con una célula maligna por criterios utilizados en la citopatología diagnóstica normalizada, principalmente incorporada como tamaño aumentado, pero también comprendiendo características citomorfológicas como la organización arquitectónica del núcleo y el citoplasma, la forma citoplásmica y la forma nuclear. Puede establecerse un valor límite inferior del tamaño nuclear de 1.3 veces la media del tamaño nuclear de las WBC. Aunque es alto arbitrario, puesto que no se ha establecido un consenso moderno y la verdad biológica todavía es desconocida, este límite se establece con base en la evaluación del tamaño nuclear más grande de las células identificadas como WBC en donadores sanos mostrando tinción falsa no especifica con citoqueratina (es decir, positiva para CD45 y positiva para citoqueratina). Ya que prácticamente todas las células epiteliales viables son más grandes que prácticamente todos los leucocitos en tejidos humanos fijados y teñidos de manera habitual a lo largo del espectro clínico del diagnóstico de cáncer, este abordaje es considerado como una suposición conservadora. En el otro extremo del espectro, una característica morfológica común de las HD-CTC es núcleos más grandes de hasta cinco veces el tamaño promedio de los núcleos de las WBC circundantes. Otras características comúnmente observadas incluyen contorno nuclear distingo de aquellos núcleos de las WBC circundantes (p. ej., alargamiento), dominio citoplásmico grande con una distribución excéntrica de citoplasma respecto al núcleo, forma citoplásmica poligonal o alargada y dobletes frecuentes y acumulaciones de 3 o más HD-CTC .

Tabla 1: Porcentaje de pacientes con HD-CTC por 1 mL de sangre obtenida de pacientes de cáncer metastásico de próstata, mama y pancreático asi como testigos normales.

Incidencia de las HD-CTC en pacientes con cáncer me astásico.

HD-CTC fueron enumeradas en una cohorte de 30 pacientes de cáncer de mama metastásico, 20 pacientes de cáncer prostético metastásico, 18 pacientes de cáncer pancreático metastásico y 15 testigos normales. La incidencia de las HD-CTC en los tres tipos de cánceres investigados se muestra en la Tabla 1. Utilizando este abordaje, > 5 HD-CTC/mL fueron encontradas en 80% de los pacientes de cáncer prostético (media = 92.2), 70% de los pacientes de cáncer mamario (media = 56.8), 50% de los pacientes de cáncer pancreático (media = 15.8),. y 0% de los testigos normales (media = 0.6).

La FIG. 8 muestra la media observada de SKBR3 graficada contra los SKBR3 esperados. Cuatro alícuotas de sangre testigo normal fueron adicionadas con números variables de células SKBR2 para producir 4 portaobjetos con aproximadamente 10, 30, 100 y 300 células cancerosas por portao jetos. La media de cada cuadruplicado se presenta también como barra de error señalando la desviación estándar.

Linealidad y sensibilidad del ensayo utilizando experimentos con adición.

Para analizar la linealidad y sensibilidad del ensayo, diversos números de células de la línea de células de cáncer mamario SKBR3s fueron adicionadas en sangre testigo normal por cuadruplicado y procesadas de acuerdo con el ensayo de las HD-CTC. Como se presenta en la FIG. 8, la media observada de SKBR3s es graficada contra las SKBR3s previstas y muestra el coeficiente de correlación (R2) de 0.9997.

Robustez del ensayo de la cuenta de las HD-CTC en pacientes con carcinomas.

La robustez del ensayo de las HD-CTC fue probada contra múltiples procesadores y muestras divididas. Pruebas duplicadas fueron realizadas por dos procesadores diferentes en 9 muestras de diferentes pacientes. La FIG. 9 presenta una comparación de las cuentas de HD-CTC/mL entre dos procesadores utilizando muestras divididas dando una ecuación de regresión para esta comparación de Y= 1.163x - 4.3325 con un coeficiente de correlación (R2) de 0.979. Todos los datos fueron analizados por un solo operador enmascarado para el experimento. La pendiente de la línea es mayor gue uno, lo gue sugiere una variación lineal sistémica leve entre los dos procesadores.

La FIG. 9 es una comparación de las cuentas de las CTC entre dos procesadores diferentes en 9 muestras de diferentes pacientes de cáncer. Las cuentas de las CTC/mL abarcaron desde 0 hasta 203.

Especificidad del ensayo en muestras de testigos normales.

Quince donadores sanos de un reservorio de donadores sanos institucionales fueron evaluados como una población de referencia consistente en 8 mujeres y 7 varones con un intervalo de edad de 24 a 62 años. En todos menos un testigo sano, el número de tales episodios cuando se corrigieron para el volumen fue 1 HD-CTC/mL o menos. El valor atipico fue una donadora mujer sana con una cuenta de HD-CTC de 4/mL. Luego de volver a hacer una revisión explícita de cada una de sus células, aproximadamente una tercera parte de estas cumplían fácilmente todos los criterios de inclusión, mientras que las dos terceras partes restantes cumplieron todos los criterios pero estaban casi en el límite inferior para la inclusión por uno o más criterios. Otros cuatro donadores sanos entraron en la categoría no cero, con 1 HD-CTC/mL cada uno. La nueva revisión explícita de estas células reveló un patrón semejante en el que aproximadamente una tercera parte cumplió perfectamente todos los criterios mientras que las dos terceras partes restantes de las células cumplían criterios, pero estaban casi en el límite inferior para la inclusión por uno o más criterios. Los ejemplos del último tipo del episodio incluye células que miden 30% más grandes que las WBC circundantes pero no aparecen significativamente más grandes por la evaluación morfológica, y las células están ligeramente fuera de foco y podrían tener cambios nucleares apoptóticos que no son detectables a simple vista, y por último, células ocasionales que tienen mediciones de la intensidad de citoqueratina objetiva por encima del límite de corte pero subjetivamente no parecen significativamente más brillantes que las WBC circundantes por la revisión fluorescente de un solo canal.

Comparación del ensayo de HD-CTC con CellSearch®.

Un total de 15 pacientes (5 pacientes de cáncer mamario metastásico y 10 pacientes de cáncer prostático metastásico) fueron evaluados para CTC con Cellsearch® y los ensayos para HD-CTC. Dos tubos de sangre fueron recolectados de cada paciente. Un tubo de 7.5 mL de sangre fue recolectado en tubos CellSave (Veridex, Raritan NJ) y enviados a Quest Diagnostics (San Juan Capistrano, CA) para hacer la enumeración de las CTC utilizando el ensayo Cellsearch®. Un segundo tubo de sangre fue recolectado de cada paciente y procesado de acuerdo con el protocolo de las HD-CTC 24 horas después de la extracción de la sangre, de acuerdo con el proceso normalizado de las HD-CTC para imitar el tiempo en el gue las muestras fueron procesadas en Quest Diagnostics. La Tabla 2 muestra los resultados de esta comparación lado a lado. El ensayo CellSearch® detectó 2 o más CTC por 7.5 mL de sangre en 5/15 pacientes analizados. Por el contrario, el ensayo HD-CTC detectó significativamente mayor número de CTC en significativamente más pacientes (las HD-CTC fueron identificadas en 14/15 pacientes analizados).

Tabla 2: Comparación del ensayo HD-CTC con CellSearch® de 5 pacientes de cáncer mamario metastásico y 10 pacientes de cáncer prostético metastásico. Los valores de CellSearch® se extrapolaron al número de CTC por mL de sangre.

Rango morfológico de las HD-CTC.

Una población de HD-CTC de morfología heterogénea fue encontrada dentro y a lo largo de diversos pacientes. Las HD-CTC tenían diversas formas, tamaños e intensidades de citoqueratina. En algunos casos, las características citológicas distintivas como el tamaño grande o forma citoplásmica poligonal fueron muy distintas y monótonas dentro de la muestra del paciente. En otros casos, hubo variabilidad citomorfológica entre las HD-CTC dentro de una sola muestra. El tamaño de las células también fue variable; muchas muestras de pacientes tenían HD-CTC con núcleos uniformemente tres o cuatro veces el tamaño de los núcleos de las WBC circundantes, mientras que muestras de otros pacientes tenían células con núcleos uniformemente solo 1.3 veces el tamaño de los núcleos de las WBC circundantes. Algunos pacientes tenían un intervalo de tamaños. Un criterio de límite inferior fue seleccionado para el tamaño nuclear de las HD-CTC de 1.3 veces el núcleo promedio de las WBC, con base en la evaluación del tamaño nuclear más grande de las células identificadas como WBC que mostraban tinción falsa no específica con citoqueratina (es decir, positivas para CD45 y positivas para citoqueratina).

Mediante el uso de esta plataforma se pudo hacer una evaluación morfológica detallada, los dobletes y acumulaciones de las HD-CTC fueron identificadas en la mayor parte de los pacientes de cáncer en esta cohorte (88%), abarcando desde acumulaciones de 2 HD-CTC hasta más de 30 HD-CTC (no se muestran los datos).

Se encontraron acumulaciones en la mayoría de los pacientes con cáncer. Las acumulaciones abarcaron desde 2 hasta más de 30 HD-CTC. Cada HD-CTC fue determinada como positiva para citoqueratina, negativa para CD45, contenía un núcleo DAPI y era morfológicamente diferente de las células nucleadas circundantes.

Morfología de 'otros' tipos de células.

Otros objetos tipo célula que son positivos para citoqueratina, negativos para CD45 y contienen un núcleo pero no cumplen los criterios de inclusión, no son contadas como HD-CTC pero son rastreadas por el ensayo. El objetivo de este abordaje es tener criterios de inclusión/exclusión rigurosos para un fenotipo intacto específico de CTC, manteniendo al mismo tiempo el acceso a objetos que solo cumplen parcialmente tal criterio, pero podrían ser todavía clínicamente significativos, como pueden ser las células tumorales apopóticas, fragmentos de células tumorales o células que sufren transición de epiteliales a mesenquimales [13].

Así pues, además de rastrear las HD-CTC, en esta cohorte de pacientes se catalogaron diferentes categorías de células positivas para citoqueratina, incluso células que tenían núcleos que presentaban apoptosis, células que no tenían citoqueratina circunferencial, células que eran del mismo tamaño o más pequeñas que las WBC circundantes, y células que eran confusas o negativas para citoqueratina (no se muestran los datos). Por último, además de los diferentes tipos de células brillantes positivas para citoqueratina, muchos pacientes tenían un número considerable de células con núcleos que eran morfológicamente diferentes de las WBC circundantes, semejaban los núcleos de las HD-CTC dentro de esa muestra, y eran negativas para CD45, pero también eran confusas o negativas para citoqueratina (no se muestran los datos).

Algunas HD-CTC candidatas fueron excluidas porque carecían de diversos criterios de inclusión morfológicos o morfométricos. Por ejemplo, la intensidad observada de la citoqueratina era demasiado confusa; el tamaño nuclear era demasiado pequeño; la citoqueratina se observaba insuficientemente circunferencial (rodeaba menos de 2/3 partes del núcleo) ; la citoqueratina observada era demasiado confusa, aunque la acumulación parecía ser de múltiples células grandes; el núcleo mostraba cambios de desintegración apoptótica; el núcleo era demasiado pequeño y el citoplasma era insuficientemente circunferencial; parecía ser una célula en apoptosis tardía; el núcleo era demasiado pequeño (el mismo tamaño que los núcleos de las WBC circundantes); presentaban citoqueratina pero no circunferencial; y el citoplasma era insuficientemente circunferencial y el núcleo era demasiado pequeño.

También se encontraron diversos tipos de CTC sospechosas en un solo paciente de cáncer prostático. Por ejemplo, algunas eran negativas para citoqueratina y CD45, pero tenían un núcleo que era grande y parecía como otras HD-CTC encontradas en este paciente. También se observaron HD-CTC típicas en las que las células eran positivas para citoqueratina, negativas para CD45, con un núcleo DAPI. También se observaron acumulaciones de HD-CTC de múltiples células, p. ej., de 4 células.

A la luz del amplio debate actual acerca de la posible existencia de células de carcinoma que sufren transición epitelial-a-mesenquimal, el aspecto y el patrón de expresión de proteínas de estas células las identifica como posibles candidatos para tal tipo de célula. De otro modo, estas células podrían ser células tumorales más viejas que se han desprendido de la mayor parte de su citoplasma.

El análisis de la biopsia de fluidos mantiene la promesa de revelar la metástasis en acción. Dentro de esta población de células esquivas están las semillas cancerosas que se propagan a través del torrente sanguíneo y dan origen a las eventuales metástasis distantes. No obstante para interrogarlas y aplicar los hallazgos clínicos, las células deben ser recuperables de manera confiable en la mayoría de los pacientes de cáncer. El aparato, los sistemas y métodos descritos en la presente producen una plataforma máximamente incluyente, mínimamente destructiva, pero citológicamente selectiva que produce células de alta calidad en alta definición, en una gran cantidad de pacientes de cáncer. Al principio observada como una incidencia rara en los pacientes de cáncer de próstata [13], por primera vez se identificaron agrupaciones de estas células en la mayoría (88%) de los pacientes con cáncer metastásico.

La incidencia de las CTC utilizando el ensayo es mucho mayor que la reportada con muchas teenologías y es en el mismo intervalo que el reportado por el ensayo CTC-chip [6]. Además, una comparación directa con CellSearch® demostró que significativamente más CTC eran detectadas con el ensayo HD-CTC, en una proporción mayor de pacientes. Además de la mayor sensibilidad, el ensayo también demuestra desempeño robusto tanto en líneas de células como en muestras de pacientes. La reproducibilidad y robustez del ensayo con la determinación semi-cuantitativa de las características de cada episodio es crucial para el análisis corriente debajo de las células.

Desde el punto de vista morfológico, una población heterogénea de las CTC se encontró en y a lo largo de varios pacientes. Las CTC tenían diversas formas, tamaños e intensidades de citoqueratina. En algunos casos, las características citológicas distintivas como tamaño grande o forma citoplásmica poligonal fueron muy distintas y monótonas en la muestra del paciente. En otros casos hubo variabilidad citomorfológica entre las HD-CTC dentro de una sola muestra. El tamaño de las células también varió de manera inconsistente; muchas muestras de pacientes tenían HD-CTC con núcleos uniformemente tres a cuatro veces el tamaño de los núcleos de las WBC circundantes, otras muestras de pacientes tenían células con núcleos solo una tercera vez tan grande como los núcleos de las WBC circundantes, y otros pacientes tenían alta variabilidad de tamaño intrapaciente.

Sorprendentemente, la cohorte de pacientes demostró la frecuencia común de las agrupaciones de las HD-CTC en la mayoría de los pacientes. 88% de los pacientes de cáncer metastásico evaluados en este estudio de cohortes mostró agrupaciones que abarcaban en tamaño desde 2-30 HD-CTC. Surgen múltiples interrogantes en torno a la presencia de tales agrupaciones, incluso la reologia del tránsito a través del sistema circulatorio de tales agregados grandes, asi como interrogantes biológicas acerca de si tales acumulaciones representan 'tumorcitos' que están transportando su propio estroma microambiental con ellos a medida que viajan y de este modo pueden ser la mayor parte, o únicamente, las células tumorales circulantes verdaderamente metaestables. Investigaciones actuales están en curso para caracterizar más las acumulaciones en esta cohorte de pacientes.

Además de enumerar las HD-CTC, algunas otras categorías de células tipo CTC fueron rastreadas de manera independiente, incluso células que tenían núcleos que presentaba apoptosis, células carentes de citoqueratina circunferencial, células que eran del mismo tamaño o más pequeñas que las WBC circundantes, y células negativas para CD45 que eran confusas o negativas para citoqueratina (no se muestran los datos). Aunque muchos de estos episodios pueden de hecho representar células epiteliales malignas circulantes en diversos estadios de anoikis biológica o ruptura mecánica secundaria para igualar el procesamiento mínimo utilizado en la plataforma, otros probablemente representen positivos falsos de diversos tipos. Un objetivo inicial es identificar una población de células con una probabilidad muy alta de incluir todas las células epiteliales que pueden producir metástasis distantes y que sean apropiadas para el análisis corriente abajo utilizando metodologías secundarias. Las células de carcinoma fragmentadas, rotas, pienóticas o de otro modo dañadas no son consideradas confiables para el análisis secundario en la patología diagnóstica normalizada, y de este modo fueron excluidas para propósitos del 'conteo de las células tumorales circulantes viables' en esta plataforma de biopsias en fase fluida también. Los sistemas, aparatos y métodos de estas modalidades las localizan, enumeran y rastrean, ya que se sabe que su presencia probablemente se correlaciona en general con la biología tumoral en el paciente, manifestando la carga tumoral total o manifestando alguna ecuación compleja todavía malentendida que implica la carga tumoral y la vascularidad del tumor y la eficiencia de la vigilancia inmune vascular.

Una de las categorías no HD-CTC interesante, muchas veces observada en pacientes que tienen HD-CTC en otra parte del portaobjetos, consiste en células con núcleos que son morfológicamente diferentes de las WBC circundantes, generalmente por criterios de tamaño, y eran negativas para CD45, pero son también confusas o negativas para citoqueratina. Como una de las ventajas más significativas del ensayo de las HD-CTC es que alícuotas paralelas de células se congelan, permitiendo la selección retrospectiva de marcadores en muestras de pacientes en altos rendimientos, especificas, los estudios en curso para caracterizar además tales células están en progreso. Las posibilidades incluyen células epiteliales con citoplasma desnaturalizado o desprovisto, células que expresan de manera aberrante o carecen de manera aberrante de las proteínas típicas por su origen biológico, o posiblemente células que sufren un proceso metaplásico como la transición de epiteliales a mesenquimales. Las plataformas de ensayo e imagenología actualmente están limitadas al análisis de células fijas; sin embargo, se están haciendo esfuerzos para establecer la utilidad potencial de este abordaje para la enumeración e imagenología de las células vivas.

Si bien los tamaños de las muestras de las cohortes de pacientes respectivas todavía son demasiado modestas para formular algunas conclusiones firmes, vale la pena señalar que la frecuencia de la detección y la concentración relativa de las CTC entre diferentes tipos de tumores utilizando el abordaje (próstata > mama > pancreáticas) iguala los hallazgos observados utilizando otros métodos como CellSearch®. Otros investigadores han sugerido que las diferencias biológicas o anatómicas en la vascularización tumoral, los sitios anatómicos de la metástasis y si las células tumorales se filtran a través de la circulación portal pueden explicar algunas de estas diferencias [1].

La FIG. 10 muestra datos comparativos de los sistemas, aparatos y métodos descritos en la presente, contra el producto CellSearch®. La columna de la izquierda identifica cinco tumores de cáncer de mama y diez tumores de cáncer prostático. La segunda columna establece los mL/prueba. La tercera columna muestra las CTC observadas utilizando los sistemas, aparatos y métodos de la modalidad descrita. La cuarta columna proporciona las CTC/mL calculadas. Las dos columnas de la derecha proporcionan los datos comparativos para el producto CellSearch®, reportado para 7.5 mL (en comparación con por mL de la cuarta columna.) La FIG. 11 muestra los resultados de las pruebas graficando la cantidad de las CTC para diversas muestras, para tumores prostáticos, pancreáticos y mamarios, y una comparación con la población sana. De izquierda a derecha están los datos para cáncer prostético, cáncer pancreático, cáncer mamario y para una población supuestamente sana. Estos resultados proporcionan el número de las CTC/mL por muestra de las CTC observadas utilizando los sistemas, aparatos y métodos de las modalidades que se describen en la presente.

La FIG. 12 muestra la cantidad de las CTC de diversas muestras de pacientes respecto al cáncer de mama. La gráfica de la izquierda muestra los marcadores HER2-, no en Herceptin y HER2+, Herceptin. La gráfica central muestra una comparación de no Herceptin (izquierda) frente a con Herceptin (derecha). La tabla derecha muestra negativo para HER2 (izquierda) contra positivo para HER2 (derecha) La FIG. 13 muestra el área nuclear normalizada contra el área nuclear para células sanguíneas blancas (WBC) y las CTC, incluye una amplificación de la región basa. El eje izquierdo en la gráfica de abajo es desde 0 hasta 700,000. La amplificación es desde 0 hasta 400. El beneficio de utilizar el análisis multi-paramétrico es respaldado por las FIG.16 y 17. Como se muestra en la FIG. 13, un solo parámetro, como puede ser el área nuclear, puede no reducir el número de candidatos en un portaobjetos a una cantidad rastreable. Aunque puede parecer que el uso de un límite inferior en el tamaño nuclear eliminaría la mayor parte del ruido (WBC), la amplificación muestra que el número de candidatos no-CTC es todavía grande en comparación con las HD-CTC reales. El uso de más parámetros, como puede ser la intensidad de CK y la intensidad de CD-45, sirve para filtrar efectivamente los episodios que no sean HD CTC.

En resumen, el ensayo HD-CTC: (i) encuentra números significativos de CTC en la mayoría de los pacientes con cáncer metastásico, (ii) tiene mejor sensibilidad sobre el sistema Cellsearch®, (iii) proporciona las HD-CTC en un formato ideal para la caracterización corriente abajo, (iv), permite hacer la recolección prospectiva de muestras que pueden ser almacenadas congeladas durante periodos prolongados y luego analizadas retrospectivamente a medida que se disponga de nuevos ensayos o marcadores.

Métodos experimentales Pacientes y recolección de las muestras de sangre Las muestras fueron recolectadas de los pacientes de cáncer metastásico en tubos de sangre anti-coagulada en la Scripps Clinic. Universidad de California, San Diego, Billings Clinic, y la Universidad de California, San Francisco bajo los protocolos aprobados por el Consejo de revisión institucional (IRB). Las muestras de los lugares no locales (UCSF, Billings Clinic) fueron transportados durante la noche para que la muestra fuera recibida y procesada en un lapso de 24 horas. Las muestras de los lugares locales (Scripps Clinic y UCSD) se mantuvieron a temperatura ambiente durante 16-24 horas para imitar a las muestras que llegaban de lugares no locales. Las muestras de sangre fueron también extraídas de testigos normales del servicio de donadores de sangre normales del Instituto de Investigación Scripps ("TSRI").

Procesamiento de las muestras de sangre para la detección de las HD-CTC.

Las muestras de sangre fueron sometidas a oscilación durante cinco (5) minutos antes de que se hiciera la medición del recuento de células sanguíneas blancas (WBC) utilizando el sistema Hemocue white blood cell system (HemoCue, Suecia). Con baes en el recuento de las WBC, un volumen de sangre fue sometido a lisis de eritrocitos (solución de cloruro de amonio). Después de la centrifugación, las células nucleadas fueron nuevamente suspendidas en salina amortiguada con fosfato (PBS) y unidas como monocapa en los portaobjetos de vidrio fabricados sobre especificaciones. Los portaobjetos de vidrio son del mismo tamaño que los portaobjetos normales para microscopía pero tienen un recubrimiento que permite una retención máxima de células vivas. (Un tipo de portaobjetos de adhesión puede obtenerse de al menos Marienfeld Laboratory Glassware (Alemania)). Cada portaobjetos puede contener aproximadamente 3 millones de células nucleadas, de este modo el número de células sembradas por portaobjetos dependía de la cuenta de WBC de los pacientes.

Para la detección de las HD-CTC en los pacientes de cáncer para este estudio se utilizaron cuatro (4) portaobjetos como una prueba. Los portaobjetos restantes creados para cada paciente fueron guardados a -80°C para experimentos futuros. Para cada paciente se descongelaron cuatro portaobjetos. Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 2%, fueron permeabilizadas con metanol frío y los sitios de unión no específica fueron bloqueados con suero de cabra. Los portaobjetos posteriormente fueron incubados con anticuerpos monoclonales anti-pan citoqueratina (Sigma) y CD45-Alexa 647 (Serotec) durante 40 minutos a 37°C. Despues de lavados con PBS, los portaobjetos fueron incubados con anticuerpo anti-ratón de cabra Alexa Fluor 555 (Invitrogen) durante 20 minutos a 37°C. Las células fueron contrateñidas con DAPI durante 10 minutos y montadas con un medio de montaje acuoso.

Captación de la imagen y análisis téenico Todos los cuatro (4) portaobjetos de cada paciente fueron digitalizados utilizando un microscopio digitalizador fluorescente fabricado sobre especificaciones el cual había sido desarrollado y optimizado para digitalización rápida y confiable. Cada portaobjetos fue completamente digitalizado utilizando una lente objetivo 10X en tres (3) colores y se produjeron aproximadamente 6900 imágenes. Las imágenes resultantes fueron alimentadas a un algoritmo para análisis que identifica las HD-CTC probablemente candidatas con base en numerosas medidas, que incluyan la intensidad de citoqueratina, la intensidad de CD45 así como el tamaño y forma nuclear y citoplásmica. Un analista técnico entonces revisa los posibles candidatos generados por el algoritmo y retira los que a simple vista no sean células, como pueden ser los agregados de colorante.

Análisis profesional e interpretación.

Todas las CTC probablemente cantidades se presentan ante un hematopatólogo para el análisis e interpretación a través de un informe basado en web donde el patólogo puede incluir o excluir cada célula candidata como una HD-CTC. Las células se clasifipan como HD-CTC si estas son positivas para citoqueratina, negativas para CD45, contienen un núcleo intacto de acuerdo con el DAPI sin cambios apoptósicos identificables (formación de burbujas, aspecto degenerado) o un aspecto roto, y son morfológicamente diferentes de las células sanguíneas blancas circundantes (normalmente una característica basada en la forma, aunque ocasionalmente basada puramente en el tamaño.) Estas deben tener citoplasma que sea claramente circunferencial y dentro del cual esté contenido el núcleo entero. El citoplasma puede mostrar cambios apoptóticos como formación de burbujas y densidad irregular o ruptura leve en el contorno citoplásmico periférico, pero no debe estar tan rota que su asociación con el núcleo esté en duda. Las imágenes se presentan como imagen digital, con capacidad para la observación en canales fluorescentes individuales así como una imagen compuesta. Cada imagen de célula es anotada con datos estadísticos auxiliares respecto al tamaño nuclear relativo, intensidades fluorescentes e intensidades fluorescentes comparativas. Cada candidato de HD-CTC se presenta en un campo de observación con las WBC circundantes suficientes para permitir hacer la comparación contextual entre las características citomorfológicas de la célula en cuestión contra las células sanguíneas blancas del fondo.

El ensayo HD-CTC fue desarrollado específicamente teniendo en mente el entorno clínico así como la necesidad de la innovación teenológica temprana y automatización futura. Todos los procesos de laboratorio siguen los procedimientos normalizados de operación rigurosos gue han sido optimizados, probados y validados. La recolección de los datos y la identificación de los candidatos han sido automatizadas utilizando interfaces específicas que permiten al patólogo tomar decisiones y el rastreo subsiguiente de estas decisiones. Las especificaciones para automatización completa y la adaptación a los entornos habituales surgirán a partir de este primer marco de investigación.

Experimentos con lineas celulares.

Cuatro alícuotas del donador (2 mL cada una) fueron adicionados con números variables de células SKBR-3 para producir cuatro (4) portaobjetos con aproximadamente 300, 100, 30 y 10 células cancerosas por portaobjetos. Los 16 portaobjetos fueron después procesados y analizados por un solo operario de acuerdo con el protocolo de preparación de las muestras de HD-CTC. Se utilizó un solo instrumento para captar la imagen de todos los 16 portaobjetos.

Referencias [1] Allard WJ, Matera J, Miller MC, Repollet M, Connelly MC, Rao C, Tibbe AG, Uhr JW, Terstappen LW. 2004 Tumor cells circuíate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases Clin Cáncer Res 10 6897-6904 [2] Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, Matera J, Miller MC, Reuben JM, Doyle GV, Allard WJ, Terstappen LW, et al 2004 Circulating tumor cells, disease progression, and survival in etastatic breast cáncer N Engl J Med 351781-9.1 [3] Miller MC, Doyle GV, and Terstappen LW 2010 Significance of Circulating Tumor Cells Detected by the CellSearch System in Patients with Metastatic Breast Colorectal and Prostate Cáncer J Oncol. 617421 [ 4] Nagrath S, Sequist LV, Maheswaran S, Bell DW. Iri ia D, Ulkus L, Smith MR, Kwak EL, Digumarthy S, Muzikansk A, et al 2007 Isolation of rare circulating tumour cells in cáncer patients by microchip technology Nature 4501235-1239 [ 5] Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath S. Ulkus L, Branmgan B, Collura CV, Inserra E, Diederichs S, Lafrate AJ, Bell DW, et al 2008 Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells N Engl J Med 359366-377 [ 6] Sequist LV, Nagrath S, Toner M, Haber DA, Lynch TJ 2009 The CTC-chip: an exciting new tool to detect circulating tumour cells in lung cáncer patients. J Thorac Oncol 428 1 -283 [ 7] Pantel, AHx-Panabieres C, and Riethdorf S 2009 Cáncer mierometastases Nat Rev Clin Oncol 6339-351 [ 8] A!unni-Fabbroni M and Sandri NT 2010 Circulating tumour cells in clinical practice: Methods of detection and possible characterization Methods 50 289-297 9] Marrinucci D, Bethel K, Luttgen M, Bruce RFL Nieva J, Kuiin P 2009 Circulating tumour cells from well- differentiated lung adenocarcinoma retain cytomorphologic features of primary tumor type Arch Pathol Lab Med 1331468-71 [10] Marrinucci D, Bethel, Lazar D, Fisher J, Huynh E, Clark P, Bruce 11, Nieva J, ulm P 2010 Cytomorphology of Circulating Colorectal Tumor Cells: a small case series J Oncol 861341 [I I] Marrinucci D, Bethel K, Bruce RH, Curry DN, Hsieh B, Humphrcy M, Krivacic RT, Kroener J, Kroener L, Ladanyi A, et al .2007 Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells Hum Pathol 38 514-9 [12] Hsieh HB, Marrirmcci D, Bethel, Curry UN, Humphrey M, Krivacic RT, Kroener J, roener L, Ladanyi A, Lazarus N, et al 2006 High speed detection of circulating tumour cells Biosens Bioelectron 21 1893-1899 [13] Coumans GL, Doggen C.L Attard G, de Bono JS, Terstappers LW 2010 All circulating HpCAM+CK+CD45- objects predict overall survival in castration- resistant prostate cáncer Ann Oncol 21185 1-1857 Todas las publicaciones y patentes mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente para referencia como si cada publicación o solicitud de patente fuera especifica e individualmente indicada como incorporada para referencia. Aunque las modalidades antes mencionadas de la invención han sido descritas con algún detalle por medio de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y compresión, puede ser evidente para los que cuentan con las habilidades ordinarias en la téenica a la luz de las enseñanzas de esta invención que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a ésta sin aparatarse del espíritu o alcance de las invenciones descritas en la presente. Por consiguiente, la invención se limita solo por las siguientes cláusulas.

Claims (51)

REIVINDICACIONES

1. Un pozo para ensayar células, las cuales se colocan sobre una superficie de un sustrato, el pozo consiste en: a) una superficie inferior plana; y b) un borde que forma una periferia del pozo, el borde estando junto a la superficie inferior y proporcionando un sellado al paso de líquidos entre éstas, en donde el pozo está configurado para recibir una monocapa de al menos 1.5 millones de células dentro del borde, y en donde la superficie inferior plana del pozo tiene un área de al menos 7.0 cm2.

2. El pozo de la reivindicación 1, en donde el pozo está configurado para recibir una monocapa de al menos 2.5 millones de células.

3. El pozo de la reivindicación 1, en donde el pozo está configurado para recibir una monocapa de al menos 3 millones de células.

4. El pozo de la reivindicación 1, en donde la superficie inferior plana del pozo tiene un área de al-menos 10.0 cm2.

5. El pozo de la reivindicación 1, en donde la superficie inferior plana del pozo tiene un área de al menos 11.7 cm2.

6. El pozo de la reivindicación 1, en donde el pozo tiene un perímetro de al menos 12.0 cm.

7. El pozo de la reivindicación 1, en donde el pozo tiene un perímetro de al menos 14.0 cm.

8. El pozo de la reivindicación 1, en donde el pozo tiene un perímetro de al menos 15.0 cm.

9. El pozo de la reivindicación 1 en donde el sustrato consiste en vidrio.

10. El pozo de la reivindicación 1, en donde el sustrato es un sustrato plano que consta de longitud, amplitud y espesor.

11. El pozo de la reivindicación 1, en donde la longitud es de aproximadamente 7 a 8 cm y la amplitud es aproximadamente 2 a 3 cm.

12. El pozo de la reivindicación 10, en donde el espesor es aproximadamente 5 a 10 mm.

13. El pozo de la reivindicación 1, en donde el pozo ocupa al menos 40%, 53%, o 62% de la superficie del sustrato.

14. El pozo de la reivindicación 1, en donde la periferia es rectangular y el sustrato es rectangular.

15. El pozo de la reivindicación 1, en donde el borde es un borde estructural o un recubrimiento hidrófilo el cual impide el flujo de fluido a través del borde.

16. El pozo de la reivindicación 15, en donde el borde es un borde estructural que consiste en vidrio.

17. El pozo de la reivindicación 1, en donde el pozo tiene un perímetro de al menos 15 cm y la superficie inferior plana del pozo tiene un área de al menos 10 cm2.

18. El pozo de la reivindicación 1, en donde el sustrato consiste en un marcado fiduciario.

19. El pozo de la reivindicación 1, en donde el pozo además tiene una cubierta deslizante.

20. El pozo de la reivindicación 1, en donde la superficie inferior plana consiste en un recubrimiento adhesivo de células.

21. Un sistema para ensayar células, que consiste en: a) el pozo de cualquiera de las reivindicaciones 1-20; b) un sistema de iluminación; c) un sistema de imagenología; d) un módulo de análisis que tiene la funcionalidad para analizar criterios de selección de células; y e) una salida de usuario.

22. El sistema de la reivindicación 21, en donde los sistemas de iluminación e imagenología consisten en una fuente luminosa, una rueda de filtro de excitación, un espejo, una rueda de filtro de emisión óptica, una cámara, una cámara de campo luminoso, un módulo de almacenamiento de datos o combinaciones de estos.

23. El sistema de la reivindicación 22, en donde la fuente luminosa es un iluminador de amplio espectro.

24. El sistema de la reivindicación 21 en donde el módulo de análisis consiste en circuitería acoplada de manera operativa a una base de datos de metadatos poblada por datos analizados por el módulo de análisis.

25. El sistema de la reivindicación 21, en donde los criterios de selección de las células se seleccionan a partir de la morfología celular, el área o tamaño nuclear, ausencia o presencia de un marcador celular, intensidad de un marcador celular o una combinación de estos.

26. El sistema de la reivindicación 25, en donde el marcador celular es un marcador de la superficie celular o un marcador nuclear.

27. El sistema de la reivindicación 21, además consiste en un sistema de gestión de datos.

28. El sistema de la reivindicación 27, en donde el sistema de gestión de datos consiste en un módulo de almacenamiento de datos.

29. Un método para hacer un ensayo celular, gue consiste en: a) poner en contacto una muestra que contenga una población de células con el pozo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20; y b) analizar la población de células a través del sistema de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 28, haciendo asi el ensayo celular.

30. El método de la reivindicación 29, en donde el análisis consiste en determinar las características de los tipos de células dentro de la población de células.

31. El método de la reivindicación 30, en donde el análisis consiste en la detección de citoqueratina, CD45, el área o tamaño nuclear, la morfología celular o una combinación de estos.

32. El método de la reivindicación 29, en donde la muestra es una muestra de sangre.

33. Un método para detectar una célula tumoral circulante en una muestra que tenga una población de células, que consiste en: a) poner en contacto el pozo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 con la muestra; b) analizar la población de células a través del sistema de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 28; y c) detectar una célula tumoral circulante mediante el análisis de (b), detectando con ello una célula tumoral circulante en la muestra.

34. El método de la reivindicación 33, en donde la muestra es una muestra de sangre.

35. El método de la reivindicación 34, en donde la muestra tiene un volumen de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9o 10 mL.

36. El método de la reivindicación 33, en donde más de 2, 5, 7, 10, 15, 20 o 50 células tumorales circulantes son detectadas por mL de muestra.

37. El método de la reivindicación 33, en donde el análisis consiste en la detección de citoqueratina, CD45, el área o tamaño nuclear, la morfología celular o una combinación de estos.

38. El método de la reivindicación 37, en donde la célula tumoral circulante se caracteriza como positiva para citoqueratina, negativa para CD45 y que contiene un núcleo no apoptósico intacto por imagenología DAPI.

39. Un método para diagnosticar cáncer o proporcionar un pronóstico de cáncer en un individuo, que consiste en: a) poner en contacto el pozo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 con una muestra que contenga una población de células del individuo; b) analizar la población de células mediante el sistema de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 28; c) detectar una célula tumoral circulante mediante el análisis de (b); d) caracterizar la célula tumoral circulante; y e) determinar un diagnóstico o pronóstico mediante la caracterización de (d), diagnosticando o proporcionadnos con ello un pronóstico del cáncer en el individuo.

40. El método de la reivindicación 39, en donde la muestra es una muestra de sangre.

41. El método de la reivindicación 40, en donde la muestra tiene un volumen de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mL.

42. El método de la reivindicación 39, en donde más de 2, 5, 7, 10, 15, 20 o 50 células tumorales circulantes se detectan por mL de muestra.

43. El método de la reivindicación 39, en donde el análisis consiste en la detección de citoqueratina, CD45, el área o tamaño nuclear, la morfología celular o una combinación de estos.

44. El método de la reivindicación 43, en donde la célula tumoral circulante se caracteriza como positiva para citoqueratina, negativa para CD45 y que contiene un núcleo no apoptótico intacto mediante imagenología DAPI.

45. El método de la reivindicación 39, en donde la caracterización de la célula tumoral circulante consiste en determinar el tipo de cáncer a partir del cual se origina la célula.

46. El método de la reivindicación 39, además consiste en administrar un régimen quimioterapéutico al individuo.

47. El método de la reivindicación 46, en donde el régimen consiste en la administración de uno o más agentes quimioterapéuticos.

48. Un método para determinar la capacidad de respuesta de un individuo a un régimen quimioterapéutico, el método consiste en: a) poner en contacto el pozo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 con una muestra que contenga una populación de célula del individuo; b) analizar la populación de células utilizando el sistema de cualquiera de la reivindicaciones 21 a 28; c) detectar una célula tumoral circulante mediante el análisis de (b); y d) determinar las características de las células tumorales circulantes para establecer la eficacia de la administración de un compuesto quimioterapéutico, determinando así la capacidad de respuesta del individuo al régimen terapéutico.

49. Un kit que consiste en: a) el pozo de cualquiera de las reivindicaciones 1-20; b) reactivos para determinar por métodos inmunológicos la presencia de citoqueratina o CD45 en una célula; y c) instrucciones para utilizar el kit para detectar células tumorales circulantes en una muestra.

50. El kit de la reivindicación 46, en donde los reactivos contienen anticuerpos que se unen específicamente a citoqueratina y CD45.

51. El kit de la reivindicación 46, además contienen reactivos para hacer la tinción DAPI.