RU2538685C1 - Method for rapid analysis of cholesterol in immune complexes - Google Patents
Method for rapid analysis of cholesterol in immune complexes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2538685C1 RU2538685C1 RU2013148042/15A RU2013148042A RU2538685C1 RU 2538685 C1 RU2538685 C1 RU 2538685C1 RU 2013148042/15 A RU2013148042/15 A RU 2013148042/15A RU 2013148042 A RU2013148042 A RU 2013148042A RU 2538685 C1 RU2538685 C1 RU 2538685C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immune complexes
- cholesterol
- peg
- cics
- buffer
- Prior art date
Links
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 title claims abstract description 44
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 23
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 abstract description 11
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 abstract description 11
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 abstract description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-UHFFFAOYSA-N 3-cholesterol Natural products C1C=C2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для определения холестерина в иммунных комплексах (ХИК) в сыворотке крови человека.The invention relates to clinical biochemistry and can be used to determine cholesterol in immune complexes (CIC) in human serum.
В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований методы определения ХИК. Учитывая важную патогенетическую роль иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ммЛПНП), при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для лабораторных исследований способов определения ХИК [1, 4].Currently, in clinical laboratory practice, there are no methods for determining HIC available for routine studies. Considering the important pathogenetic role of immune complexes containing multi-modified low-density lipoproteins (LDL) in case of atherosclerosis, the development of simple methods for determining CICs available for laboratory studies remains relevant [1, 4].
Известны способы определения ХИК в сыворотке крови преципитацией их 2,5%, 3,5% и 4% растворами полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 (ПЭГ-6000). Агрегированные иммунные комплексы, содержащие множественно модифицированные ЛПНП (ммЛПНП), осаждают центрифугированием, промывают преципитат буфером, содержащим соответствующую концентрацию ПЭГ-6000 и определяют в преципитате холестерин после экстракции [2,5-7].Known methods for the determination of CIC in serum by precipitation of 2.5%, 3.5% and 4% solutions of polyethylene glycol with a molecular weight of 6000 (PEG-6000). Aggregated immune complexes containing multi-modified LDL (mmLDL) are precipitated by centrifugation, washed with precipitate with a buffer containing the appropriate concentration of PEG-6000, and cholesterol is determined in the precipitate after extraction [2.5–7].
Недостатком приведенных способов является длительность процедуры, неполная преципитация иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности, и как следствие - низкие значения ХИК.The disadvantage of these methods is the duration of the procedure, the incomplete precipitation of immune complexes containing multiple modified low-density lipoproteins, and as a result, low values of CIC.
В качестве прототипа использован способ определения уровня циркулирующих иммунных комплексов с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 [3].As a prototype, a method was used to determine the level of circulating immune complexes using polyethylene glycol with a molecular weight of 3350 [3].
Задачей настоящего изобретения является разработка простого способа экспресс-определения уровня холестерина в иммунных комплексах для рутинных исследований с высокой точностью и с минимальной затратой времени.The objective of the present invention is to develop a simple method for the rapid determination of cholesterol in immune complexes for routine studies with high accuracy and with a minimum investment of time.
Эта задача решается тем, что специфическую преципитацию циркулирующих иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП (ЦИК-ммЛПНП), проводят путем обработки сыворотки крови человека буферным раствором, содержащим препарат ПЭГ-3350, инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре, затем образовавшиеся агрегаты ЦИК-ммЛПНП осаждают центрифугированием, декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПЭГ-3350 и определяют содержание холестерина в преципитированных иммунных комплексах с использованием ферментативного набора. При уровне содержания ХИК свыше 8,4 мг/дл констатируют повышенный уровень.This problem is solved by the fact that the specific precipitation of circulating immune complexes containing mmLDPE (CIC-mmLDPE) is carried out by treating human blood serum with a buffer solution containing PEG-3350, incubated for 10 minutes at room temperature, then the resulting CIC-mmLDPE aggregates precipitated by centrifugation, decanted, the resulting precipitate was dissolved in a buffer without PEG-3350 and the cholesterol content in the precipitated immune complexes was determined using an enzymatic kit. Above 8.4 mg / dl, a CIC level is found to be elevated.
Способ определения ХИК включает:The method for determining HIC includes:
1. Буфер-1 для преципитации ХИК содержит 10% полиэтиленгликоль с молекулярной массой 3350 в 0,01 М трис-HCl-буфере с pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl;1. Buffer-1 for precipitation of CIC contains 10% polyethylene glycol with a molecular weight of 3350 in 0.01 M Tris-HCl buffer with a pH of 7.4 containing 0.15 M NaCl;
2. Буфер-2 для растворения преципитата ХИК - 0,01 М Трис-HCl-буфер, pH 7,4, содержащий 0,15 М NaCl.2. Buffer-2 for dissolving HIC precipitate - 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl.
Способ экспресс-определения холестерина иммунных комплексов осуществляют следующим образом. Проводят забор крови натощак из локтевой вены человека, отделяют сыворотку и определяют уровень холестерина в иммунных комплексах путем обработки сыворотки крови Буфером-1 для преципитации ХИК в соотношении 1:3, инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре, осаждением преципитата центрифугированием, декантацией и последующим растворением его в исходном объеме Буфера-2. Содержание ХИК определяют с использованием ферментативного набора «Холестерин» и при содержании ХИК свыше 8,4 мг/дл констатируют повышенный уровень.The method of rapid determination of cholesterol immune complexes is as follows. Fasting is performed from the human ulnar vein, serum is separated, and the cholesterol level in the immune complexes is determined by treating blood serum with Buffer-1 to precipitate HIC in a ratio of 1: 3, incubating for 10 min at room temperature, precipitating the precipitate by centrifugation, decantation and subsequent dissolving it in the initial volume of Buffer-2. The CIC content is determined using the enzyme kit "Cholesterol" and when the CIC content is more than 8.4 mg / dl, an elevated level is observed.
Комплемент-связывающую способность иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП, исследуют гемолитическим методом с использованием комплемента морской свинки, стандартизованных (1,5×108 кл/мл) эритроцитов барана, сенсибилизированных кроличьими антителами (EA), в вероналовом солевом буфере, содержащем 0,5 мМ MgCl2 и 0,15 мМ CaCl2 (VBS2+).The complement-binding ability of immune complexes containing multi-modified LDL is studied by the hemolytic method using guinea pig complement, standardized (1.5 × 10 8 cells / ml) sheep erythrocytes sensitized by rabbit antibodies (EA), in a veronal saline buffer containing 0 5 mM MgCl 2 and 0.15 mM CaCl 2 (VBS 2+ ).
Содержание IgG в составе преципитата определяют с использованием реакции торможения гемагглютинации (РТГА) эритроцитов барана, сенсибилизированных гетерофильными антителами человека, антителами барана против IgG человека. В качестве стандарта используют препарат человеческого IgG с концентрацией 1 мг/мл.The IgG content in the precipitate is determined using the ram hemagglutination inhibition test (RTGA) of sheep erythrocytes sensitized by heterophilic human antibodies, and ram antibodies against human IgG. A human IgG preparation with a concentration of 1 mg / ml is used as a standard.
Этап 1. Подбор оптимальной концентрации ПЭГ-3350 для осаждения циркулирующих иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП (ЦИК-ммЛПНП) из пулированной сыворотки крови здоровых доноров.Stage 1. Selection of the optimal concentration of PEG-3350 for the deposition of circulating immune complexes containing multi-modified LDL (CIC-mmLDL) from the pulsed blood serum of healthy donors.
1.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при возрастающих концентрациях ПЭГ-3350. К 100 мкл пулированной сыворотки крови здоровых доноров добавляют от 100 до 500 мкл раствора Буфера-1, тщательно перемешивают и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждают центрифугированием при 3100 g в течение 5 мин при 23°C. Супернатант тщательно декантируют и преципитат растворяют в 100 мкл Буфера-2.1.1. Preparation of serum precipitate with increasing concentrations of PEG-3350. From 100 to 500 μl of Buffer-1 solution are added to 100 μl of the pulled blood serum of healthy donors, thoroughly mixed and incubated for 10 min at room temperature. The resulting aggregates of immune complexes are precipitated by centrifugation at 3100 g for 5 min at 23 ° C. The supernatant was carefully decanted and the precipitate was dissolved in 100 μl of Buffer-2.
1.2. Определение холестерина в ПЭГ-преципитатах. В преципитатах после растворения в 100 мкл Буфера-2 определяют содержание холестерина с использованием наборов реагентов фирмы «ЗАО Эколаб» (Россия). Полученные результаты представлены в таблице 1.1.2. Determination of cholesterol in PEG precipitates. In the precipitates, after dissolution in 100 μl of Buffer-2, the cholesterol content is determined using reagent kits from ZAO Ekolab (Russia). The results are presented in table 1.
1.3. Определение степени связывания комплемента морской свинки циркулирующими иммунными комплексами в преципитатах, приготовленных при возрастающих концентрациях ПЭГ-3350. К 10 мкл растворов преципитатов, разбавленных в соотношении 1:99 буфером VBS2+ добавляют 20 мкл раствора разбавленного 1:19 раствора комплемента морской свинки. Общий объем доводят до 0,3 мл буфером VBS2+,и инкубируют 20 мин при 37°C. После предварительной инкубации добавляют 200 мкл EA и повторно инкубируют 30 мин при 37°C. После 30-минутной инкубации реакцию останавливают добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугируют и определяют величину лизиса эритроцитов по выходу гемоглобина в супернатант. Контрольная проба не содержит преципитата иммунных комплексов. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствует о наличии связывания комплемента циркулирующими иммунными комплексами. Степень лизиса эритроцитов (Y) определяют по формуле:1.3. Determination of the degree of binding of guinea pig complement to circulating immune complexes in precipitates prepared at increasing concentrations of PEG-3350. To 10 μl of precipitate solutions diluted 1:99 with VBS 2+ buffer, 20 μl of a diluted 1:19 guinea pig complement solution are added. The total volume was adjusted to 0.3 ml with VBS 2+ buffer, and incubated for 20 min at 37 ° C. After pre-incubation, 200 μl of EA is added and re-incubated for 30 min at 37 ° C. After a 30-minute incubation, the reaction was stopped by adding 2.5 ml of a cold solution of 0.15 M NaCl, centrifuged, and the erythrocyte lysis was determined by the release of hemoglobin into the supernatant. The control sample does not contain precipitate of immune complexes. Reduced hemolysis in experimental samples compared with the control indicates the presence of complement binding by circulating immune complexes. The degree of lysis of red blood cells (Y) is determined by the formula:
Y(%)=[(X-R)/(H-R)×100],Y (%) = [(X-R) / (H-R) × 100],
где H, R и X - величины оптической плотности A405 в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса EA и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяют по формуле:where H, R and X are the optical density values of A 405 in hemolytic systems of the control sample, in the control of EA spontaneous lysis, and in the experimental sample, respectively. The degree of complement fixation (CCK) is determined by the formula:
CCK(%)=100-Y.CCK (%) = 100-Y.
Полученные результаты представлены в таблице 1.The results are presented in table 1.
1.4. Определение содержания IgG в ПЭГ-преципитате.1.4. Determination of IgG content in PEG-precipitate.
Предварительно титруют преципитаты иммунных комплексов, разведенные 1:99, на 12 лунок в 96-луночных круглодонных иммунологических плашках. В качестве стандарта титруют препарат IgG с исходной концентрацией 1 мг/мл. После титрования преципитатов и стандартного препарата IgG добавляют равный объем разбавленного раствора антител против IgG человека, содержащего 4 гемагглютинирующие единицы (ГАЕ), т.е. препарат антител был разбавлен 1:8100. Тщательно перемешивают и добавляют равный объем 1% суспензии иммунных комплексов эрироцитов барана, сенсибилизированных антителами человека (EAч), тщательно перемешивают и инкубируют в течение 1-1,5 ч при комнатной температуре. После инкубации определяют для каждой пробы лунку, где наблюдается торможение гемагглютинации. Расчеты проводят с использованием результатов по торможению гемагглютинации стандартным раствором IgG человека. Полученные данные представлены в таблице 1.Precipitates of immune complexes, diluted 1:99, are pre-titrated into 12 wells in 96-well round-bottom immunological plates. An IgG preparation with an initial concentration of 1 mg / ml is titrated as a standard. After titration of precipitates and a standard IgG preparation, an equal volume of a diluted solution of anti-human IgG antibodies containing 4 hemagglutinating units (GAE) is added, i.e. the antibody preparation was diluted 1: 8100. Mix thoroughly and add an equal volume of a 1% suspension of sheep erythrocyte immune complexes sensitized by human antibodies (EA h ), mix thoroughly and incubate for 1-1.5 hours at room temperature. After incubation, a well is determined for each sample, where hemagglutination inhibition is observed. The calculations are carried out using the results of inhibition of hemagglutination with a standard solution of human IgG. The data obtained are presented in table 1.
Из данных, представленных в таблице 1, следует, что при концентрации от 7,5% до 8,0% ПЭГ-3350 в сыворотке наблюдается агрегация иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины (ммЛПНП). Дальнейшее увеличение концентрации ПЭГ-3350 выше 8,0% в системе приводит к агрегации и преципитации нативных ЛПНП. Сохранение степени связывания комплемента на уровне 80% и возрастание концентрации холестерина в преципитатах при увеличении концентрации ПЭГ-3350 (более 7,5%) свидетельствует, с одной стороны, о полной агрегации иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, с другой стороны, об агрегации нативных ЛПНП, которые не обладают комплемент связывающей способностью. Наличие IgG в преципитахах, приготовленных в присутствии ПЭГ, свидетельствует об иммунных комплексах, содержащих ммЛПНП, также как постоянный уровень IgG в преципитатах, полученных при концентрации ПЭГ от 7,5% и выше, свидетельствует о специфической преципитации иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП.From the data presented in table 1, it follows that at a concentration of from 7.5% to 8.0% PEG-3350 in the serum, aggregation of immune complexes containing multiply modified lipoproteins (mmLDL) is observed. A further increase in the concentration of PEG-3350 above 8.0% in the system leads to aggregation and precipitation of native LDL. Keeping the degree of complement binding at 80% and increasing the concentration of cholesterol in precipitates with an increase in the concentration of PEG-3350 (more than 7.5%) indicates, on the one hand, the complete aggregation of immune complexes containing mmLDL, on the other hand, the aggregation of native LDL that do not have complement binding ability. The presence of IgG in precipitates prepared in the presence of PEG indicates immune complexes containing mmLDPE, as well as a constant level of IgG in precipitates obtained at PEG concentrations of 7.5% or higher, indicates a specific precipitation of immune complexes containing mmLDPE.
Таким образом, при концентрации ПЭГ-3350 от 7,5% до 8,0% наблюдается избирательная агрегация и преципитация иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, и не наблюдается агрегация и преципитация как нативных ЛПНП, так и свободных IgG.Thus, at a concentration of PEG-3350 from 7.5% to 8.0%, selective aggregation and precipitation of immune complexes containing mmLDPE are observed, and aggregation and precipitation of both native LDL and free IgG are not observed.
Этап 2. Определение содержания холестерина в иммунных комплексах в сыворотках крови доноров и неврологических больных с атеросклерозом каротидных артерий.Stage 2. Determination of cholesterol content in immune complexes in blood serum of donors and neurological patients with atherosclerosis of carotid arteries.
2.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при условиях 7,5% ПЭГ-3350. К 100 мкл сыворотки крови больных с атеросклерозом каротидных артерий и относительно здоровых доноров добавляли 300 мкл буфера-1 и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждали центрифугированием при 23°C в течение 5 мин при 3100 g. Супернатант декантировали и осадок растворяли в 100 мкл буфера-2. Полученные результаты представлены в таблице 2.2.1. Preparation of serum precipitate under conditions of 7.5% PEG-3350. To 100 μl of blood serum of patients with atherosclerosis of carotid arteries and relatively healthy donors, 300 μl of buffer-1 was added and incubated for 10 min at room temperature. The resulting aggregates of immune complexes were precipitated by centrifugation at 23 ° C for 5 min at 3100 g. The supernatant was decanted and the pellet was dissolved in 100 μl of buffer-2. The results are presented in table 2.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, в группе относительно здоровых доноров средний уровень холестерина в иммунных комплексах составил 6,2±1,7 мг/дл при колебаниях от 2,3 до 8,4 мг/дл. Следовательно, уровень ХИК до 8,4 мг/дл можно предварительно считать нормальным уровнем у здоровых людей при использовании условий, разработанных в предлагаемом способе. В группе неврологических больных с инструментально подтвержденным атеросклерозом каротидных артерий в 100% случаев определяется повышенный уровень ХИК, и колебания составили от 11,0 до 38,0 мг/дл.As can be seen from the data presented in table 2, in the group of relatively healthy donors, the average level of cholesterol in the immune complexes was 6.2 ± 1.7 mg / dl with fluctuations from 2.3 to 8.4 mg / dl. Therefore, a CIC level of up to 8.4 mg / dl can be previously considered a normal level in healthy people when using the conditions developed in the proposed method. In a group of neurological patients with instrumentally confirmed atherosclerosis of the carotid arteries in 100% of cases, an increased level of CIC is determined, and fluctuations ranged from 11.0 to 38.0 mg / dl.
Таким образом, способ позволяет повысить точность количественного определения холестерина в циркулирующих иммунных комплексах сыворотки крови человека. Выявление повышенного уровня ХИК при широких скрининговых обследованиях может быть предиктором атеросклероза на доклинической стадии. Доступность реагентов и простота способа определения ХИК в лабораторной практике позволит проводить углубленное исследование патогенеза атеросклеротических заболеваний. С другой стороны, реализация изобретения позволит как контролировать эффективность проводимого лечения, так и выявлять доклинические состояния атеросклероза.Thus, the method improves the accuracy of the quantitative determination of cholesterol in circulating immune complexes of human serum. Identification of elevated levels of CIC with extensive screening tests can be a predictor of atherosclerosis in the preclinical stage. The availability of reagents and the simplicity of the method for determining CIC in laboratory practice will allow for an in-depth study of the pathogenesis of atherosclerotic diseases. On the other hand, the implementation of the invention will allow both to control the effectiveness of the treatment and to identify preclinical conditions of atherosclerosis.
ЛитератураLiterature
1. Собенин И.А., Карагодин В.П., Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Холестерин иммунных комплексов как индикатор атеросклероза // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №3. - С.99-103.1. Sobenin I.A., Karagodin V.P., Melnichenko A.A., Orekhov A.N. Cholesterol of immune complexes as an indicator of atherosclerosis // Pathological physiology and experimental therapy. - 2012. - No. 3. - S.99-103.
2. Тертов В.В., Качарава А.Г., Саядян Х.С.и др. Холестеринсодержащие циркулирующие иммунные комплексы - компонент сыворотки крови больных с ишемической болезнью сердца, обуславливающий ее атерогенность // Кардиология. - 1989. - Т.29, №8. - С.35-38.2. Tertov VV, Kacharava AG, Sayadyan Kh.S. et al. Cholesterol-containing circulating immune complexes - a component of the blood serum of patients with coronary heart disease, causing its atherogenicity // Cardiology. - 1989. - T. 29, No. 8. - S. 35-38.
3. Шойбонов Б.Б., Борголов В.М., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф., Кубатиев А.А. Способ и тест-система определения циркулирующих иммунных комплексов // Патент РФ №2452962 от 10.06.2012 г. Бюл. №16.3. Shoybonov B.B., Borgolov V.M., Baronets V.Yu., Panchenko L.F., Kubatiev A.A. The method and test system for determining circulating immune complexes // RF Patent No. 2452962 from 06/10/2012 Bull. No. 16.
4. Burut D.F.P., Karim Y., Ferns G.A.A. The Role of Immune Complexes in Atherosclerosis // Angiology. - 2010. - V.61, №7. - P.679-689.4. Burut D.F.P., Karim Y., Ferns G.A.A. The Role of Immune Complexes in Atherosclerosis // Angiology. - 2010. - V.61, No. 7. - P.679-689.
5. Lopes-Virella M.F., Brent McHenry M., Lipsitz S., et al. Immune complexes containing modified lipoproteins are related to the progression of internal carotid intima-media thickness in patients with type 1 diabetes // Atherosclerosis. - 2007. - V.190. - P.359-369.5. Lopes-Virella M.F., Brent McHenry M., Lipsitz S., et al. Immune complexes containing modified lipoproteins are related to the progression of internal carotid intima-media thickness in patients with type 1 diabetes // Atherosclerosis. - 2007. - V.190. - P. 359-369.
6. Szondy E., Mezey Z., Fust G. et al. Serial measurement of circulating immune complexes in myocardial infarction // Br Heart J. - 1981. - V.46, - P.93-98.6. Szondy E., Mezey Z., Fust G. et al. Serial measurement of circulating immune complexes in myocardial infarction // Br Heart J. - 1981. - V.46, - P.93-98.
7. Virella G., Carter R.E., Saad A., et al. Distribution of IgM and IgG antibodies to oxidiesed LDL in immune complexes isolated from patients with type 1 diabetes and its relationship with nephropathy // Clin. Immunol. - 2008. - V.127, №3. - P.394-400.7. Virella G., Carter R.E., Saad A., et al. Distribution of IgM and IgG antibodies to oxidiesed LDL in immune complexes isolated from patients with type 1 diabetes and its relationship with nephropathy // Clin. Immunol. - 2008. - V.127, No. 3. - P.394-400.
Claims (1)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013148042/15A RU2538685C1 (en) | 2013-10-29 | 2013-10-29 | Method for rapid analysis of cholesterol in immune complexes |
| PCT/RU2014/000738 WO2015065238A1 (en) | 2013-10-29 | 2014-10-01 | Method for rapid determination of cholesterol in immune complexes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013148042/15A RU2538685C1 (en) | 2013-10-29 | 2013-10-29 | Method for rapid analysis of cholesterol in immune complexes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2538685C1 true RU2538685C1 (en) | 2015-01-10 |
Family
ID=53004688
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013148042/15A RU2538685C1 (en) | 2013-10-29 | 2013-10-29 | Method for rapid analysis of cholesterol in immune complexes |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2538685C1 (en) |
| WO (1) | WO2015065238A1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110124119A1 (en) * | 2009-09-18 | 2011-05-26 | Lopes-Virella Maria F | Methods For Assessing Modified LDL Immune Complexes in Subjects Having or at Risk of Coronary Artery Disease |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2413952C2 (en) * | 2009-02-02 | 2011-03-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" | Method of determining fractions of modified lipoproteins in blood |
| RU2452962C2 (en) * | 2010-08-24 | 2012-06-10 | Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Нии Общей Патологии И Патофизиологии Рамн | Method and test system for detection of circulating immune complexes |
-
2013
- 2013-10-29 RU RU2013148042/15A patent/RU2538685C1/en not_active IP Right Cessation
-
2014
- 2014-10-01 WO PCT/RU2014/000738 patent/WO2015065238A1/en not_active Ceased
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110124119A1 (en) * | 2009-09-18 | 2011-05-26 | Lopes-Virella Maria F | Methods For Assessing Modified LDL Immune Complexes in Subjects Having or at Risk of Coronary Artery Disease |
Non-Patent Citations (2)
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015065238A1 (en) | 2015-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Oni et al. | Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: evidence for monoclonal origin of abnormal red cells | |
| Larcom et al. | Erythrocytes in urinary sediment: Identification and normal limits: With a note on the nature of granular casts | |
| CN108828225A (en) | Kit, preparation method and the detection method of serum amyloid A protein assay | |
| Kobayashi et al. | Maternal microchimerism in biliary atresia | |
| Obaid et al. | Red blood cells alloimmunization and autoimmunization among transfusion-dependent beta-thalassemia patients in Alexandria province, Egypt | |
| RU2437098C1 (en) | Method for instant determination of blood atherogenicity (versions) | |
| RU2444014C1 (en) | Medium and method for detection of multiply modified blood serum lipoproteins | |
| RU2530627C2 (en) | Method for rapid determination of cholesterol in immune complexes | |
| RU2538685C1 (en) | Method for rapid analysis of cholesterol in immune complexes | |
| RU2549467C1 (en) | Method of determination of atherogenicity of immune complexes | |
| RU2452962C2 (en) | Method and test system for detection of circulating immune complexes | |
| Cooper et al. | Family history of hypertension and red cell cation transport in high school students | |
| RU2549466C1 (en) | Instant method for assessing atherogenicity of immune complexes of human blood serum | |
| Kwansa‐Bentum et al. | Elevation of free triiodothyronine (fT3) levels by Plasmodium falciparum independent of thyroid stimulating hormone (TSH) in children with uncomplicated malaria | |
| Danaei et al. | Evaluation of G6PD deficiency in malaria patients in the south-east of Iran | |
| RU2526820C1 (en) | Method for titration of group abo antibodies | |
| RU2137420C1 (en) | Method for detecting tumor risk group and making early stage tumor disease cases screening | |
| RU2632118C1 (en) | Method for selection and study of atherogenicity of immune complexes containing multiple modified lipoproteins | |
| Dohan et al. | Haematological and Demographic Study in Children Infected with Enterobiasis in Al Diwaniyah Province, Iraq | |
| RU2680848C1 (en) | Method for assessing character of autoimmune reaction of human body to multiple modified low-density lipoproteins in lytic test | |
| Cassidy et al. | Calcium and magnesium contents of gastrointestinal tissues in six species | |
| RU2343484C2 (en) | Method of determination of circulating immune complexes | |
| RU2612010C1 (en) | Method for determination of threat of hemic anemia formation during pregnancy in third trimester of gestation in case of cytomegalovirus infection exacerbation, inhibiting activity of sh-groups in red blood cells and leading to decreased hemoglobin oxygenation | |
| US20240118210A1 (en) | Ffn fluorescence release assay (ffra) and methods of using same | |
| El Hadidy et al. | Prevalence of Abnormal Serum 25-HydroxyVitamin D and Its Association with Hemoglobin Level in Pre-Dialysis Chronic Kidney Disease (CKD) Patients |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181030 |