RU2530627C2 - Method for rapid determination of cholesterol in immune complexes - Google Patents
Method for rapid determination of cholesterol in immune complexes Download PDFInfo
- Publication number
- RU2530627C2 RU2530627C2 RU2012155495/15A RU2012155495A RU2530627C2 RU 2530627 C2 RU2530627 C2 RU 2530627C2 RU 2012155495/15 A RU2012155495/15 A RU 2012155495/15A RU 2012155495 A RU2012155495 A RU 2012155495A RU 2530627 C2 RU2530627 C2 RU 2530627C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immune complexes
- cholesterol
- precipitate
- pvp
- peg
- Prior art date
Links
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 title claims abstract description 48
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 30
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 abstract description 15
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 abstract description 15
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 9
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 6
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 5
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 4
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 108010071584 oxidized low density lipoprotein Proteins 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к клинической биохимии и может быть использовано для определения холестерина в иммунных комплексах (ХИК) в сыворотке крови человека.The invention relates to clinical biochemistry and can be used to determine cholesterol in immune complexes (CIC) in human serum.
В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований методы определения ХИК. Учитывая важную патогенетическую роль иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности (ммЛПНП), при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для лабораторных исследований способов определения ХИК (Собенин И.А. и др., 2012; Burut D.F.P. et al., 2010).Currently, in clinical laboratory practice, there are no methods for determining HIC available for routine studies. Given the important pathogenetic role of immune complexes containing multi-modified low-density lipoproteins (LDL) in case of atherosclerosis, it remains relevant to develop simple methods for determining CIC available for laboratory studies (I. Sobenin et al., 2012; Burut DFP et al., 2010).
Известны способы определения ХИК в сыворотке крови преципитацией их 2,5%, 3,5% и 4% растворами полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 (ПЭГ-6000) в течение 24 часов. Агрегированные иммунные комплексы, содержащие множественно модифицированные ЛПНП, осаждают центрифугированием, промывают преципитат 3 раза буфером, содержащим соответствующую концентрацию ПЭГ-6000, и определяют в преципитате холестерин после экстракции. (Szondy E et al., 1983; Тертов В.В. и др. 1989; Lopes-Virella M.F. et al., 2007; Virella G. et al., 2008).Known methods for determining HIC in serum by precipitation with 2.5%, 3.5% and 4% solutions of polyethylene glycol with a molecular weight of 6000 (PEG-6000) for 24 hours. Aggregated immune complexes containing multi-modified LDL are precipitated by centrifugation, the precipitate is washed 3 times with a buffer containing the appropriate concentration of PEG-6000, and cholesterol is determined in the precipitate after extraction. (Szondy E et al., 1983; Tertov V.V. et al. 1989; Lopes-Virella M.F. et al., 2007; Virella G. et al., 2008).
Недостатком приведенных способов является низкая специфичность, длительность процедуры, неполная преципитация иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины низкой плотности и, как следствие, низкие значения ХИК.The disadvantage of the above methods is the low specificity, duration of the procedure, incomplete precipitation of immune complexes containing multiple modified low density lipoproteins and, as a result, low CIC values.
В качестве прототипа использован способ определения уровня циркулирующих иммунных комплексов с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 (ПЭГ-3350) (Шойбонов Б.Б. и др., 2012). Использование ПЭГ-3350 при концентрации 5% позволило авторам преимущественно преципитировать из сыворотки циркулирующие иммунные комплексы.As a prototype, a method was used to determine the level of circulating immune complexes using polyethylene glycol with a molecular weight of 3350 (PEG-3350) (B. Shoybonov et al., 2012). The use of PEG-3350 at a concentration of 5% allowed the authors to predominantly precipitate circulating immune complexes from serum.
Задачей настоящего изобретения является разработка экспресс-способа определения уровня холестерина в иммунных комплексах для рутинных исследований с высокой точностью и с минимальной затратой времени.The objective of the present invention is to develop an express method for determining the level of cholesterol in immune complexes for routine studies with high accuracy and with a minimum investment of time.
Эта задача решается тем, что специфическую преципитацию циркулирующих иммунных комплексов сыворотки, содержащих ммЛПНП, проводят путем обработки сыворотки 0,01 М Трис-HCl-буфером, содержащим 8,3%-ный ПЭГ 3350, 3,3%-ный ПВП 12600 и 0,15 М NaCl, pH 7,4, инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре, затем образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждают центрифугированием, декантируют, полученный преципитат растворяют в буфере без ПЭГ-3350 и ПВП-12600 и определяют содержание холестерина в преципитированных иммунных комплексах с использованием стандартного ферментативного набора. При концентрации ХИК свыше 8,3 мг/дл констатируют повышенный уровень.This problem is solved in that the specific precipitation of circulating immune serum complexes containing mmLDPE is carried out by treating the serum with 0.01 M Tris-HCl buffer containing 8.3% PEG 3350, 3.3% PVP 12600 and 0 , 15 M NaCl, pH 7.4, incubated for 10 minutes at room temperature, then the formed aggregates of immune complexes are precipitated by centrifugation, decanted, the resulting precipitate is dissolved in buffer without PEG-3350 and PVP-12600 and the cholesterol content in precipitated immune complexes is determined using stand art enzymatic set. At a CIC concentration of more than 8.3 mg / dl, an elevated level is noted.
Способ определения ХИК включает:A method for determining HIC includes:
1) буфер-1 для преципитации ХИК, который содержит смесь 8,3% полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3350 и 3,3% поливинилпирролидона с молекулярной массой 12600 в 0,01 М трис-HCl-буфере с pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl;1) buffer-1 for precipitation of CIC, which contains a mixture of 8.3% polyethylene glycol with a molecular weight of 3350 and 3.3% polyvinylpyrrolidone with a molecular weight of 12,600 in 0.01 M Tris-HCl buffer with a pH of 7.4 containing 0, 15 M NaCl;
2) буфер-2 для растворения преципитата ХИК представляет собой 0,01М Трис-HCl-буфер, pH 7,4, содержащий 0,15 М NaCl.2) buffer-2 for dissolving the HIC precipitate is 0.01 M Tris-HCl buffer, pH 7.4, containing 0.15 M NaCl.
Экспресс-способ определения холестерина иммунных комплексов осуществляют следующим образом. Проводят забор крови натощак из локтевой вены человека, отделяют сыворотку и определяют уровень холестерина в иммунных комплексах путем обработки сыворотки крови Буфером-1 для преципитации ХИК в соотношении 1:1,2 инкубацией в течение 10 мин при комнатной температуре, осаждением преципитата центрифугированием, декантацией и последующим растворением его в исходном объеме в Буфере-2; уровень ХИК определяют с использованием ферментативного набора «Холестерин» и при содержании ХИК свыше 8,3 мг/дл констатируют повышенный уровень.The express method for determining cholesterol of immune complexes is as follows. Fasting is carried out on an empty stomach from the human ulnar vein, serum is separated, and the cholesterol level in the immune complexes is determined by treating blood serum with Buffer-1 to precipitate HIC in a ratio of 1: 1.2 by incubation for 10 min at room temperature, precipitating the precipitate by centrifugation, decantation and its subsequent dissolution in the initial volume in Buffer-2; the CIC level is determined using the enzyme kit "Cholesterol" and when the CIC content is more than 8.3 mg / dl, an elevated level is observed.
Комплемент-связывающую способность иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП, исследуют с помощью гемолитических тестов с использованием комплемента морской свинки, стандартизованных (1,5×108 кл/мл) эритроцитов барана, сенсибилизированных кроличьими антителами (ЕА), в вероналовом солевом буфере, содержащем 0,5 мМ MgCl2 и 0,15 мМ CaCl2 (VBS2+).The complement-binding ability of immune complexes containing multi-modified LDL is investigated using hemolytic tests using guinea pig complement, standardized (1.5 × 10 8 cells / ml) sheep erythrocytes sensitized by rabbit antibodies (EA), in veronal saline buffer, containing 0.5 mM MgCl 2 and 0.15 mM CaCl 2 (VBS 2+).
Содержание IgG в составе преципитата определяют с использованием реакции торможения гемагглютинации (РТГА) эритроцитов барана, сенсибилизированных гетерофильными антителами человека, антителами барана против IgG человека. В качестве стандарта используют препарат человеческого IgG с концентрацией 1 мг/мл.The IgG content in the precipitate is determined using the ram hemagglutination inhibition test (RTGA) of sheep erythrocytes sensitized by heterophilic human antibodies, and ram antibodies against human IgG. A human IgG preparation with a concentration of 1 mg / ml is used as a standard.
Этап 1. Подбор оптимальной концентрации ПВП-12600 (при постоянной концентрации 4,5% ПЭГ-3350) для осаждения иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные ЛПНП (ммЛПНП) из пулированной сыворотки крови здоровых доноров.Stage 1. Selection of the optimal concentration of PVP-12600 (at a constant concentration of 4.5% PEG-3350) for the deposition of immune complexes containing multiply modified LDL (mmLDPE) from the pulled blood serum of healthy donors.
1.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при возрастающих концентрациях ПВП-12600 в присутствии 4,5% ПЭГ-3350. К 50 мкл пулированной сыворотки крови здоровых доноров добавляли от 10 до 40 мкл раствора 20% ПВП (молекуляная масса 12600±2700), тщательно перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин при 23°С. Супернатант тщательно декантировали, и преципитат растворяли в 50 мкл буфера-2.1.1. Preparation of serum precipitate with increasing concentrations of PVP-12600 in the presence of 4.5% PEG-3350. 10 to 40 μl of a solution of 20% PVP (molecular weight 12600 ± 2700) was added to 50 μl of the pulled blood serum of healthy donors, thoroughly mixed, and incubated for 10 min at room temperature. The resulting aggregates of immune complexes were besieged by centrifugation at 6000 rpm for 5 min at 23 ° C. The supernatant was carefully decanted, and the precipitate was dissolved in 50 μl of buffer-2.
1.2. Определение холестерина и общих белков в ПЭГ-преципитатах, приготовленных при разных концентрациях ПВП-12600 и постоянной концентрации 4, 5% ПЭГ-3350. В преципитатах после растворения в 50 мкл буфера-2 определяли содержание холестерина и общего белка с использованием наборов реагентов фирмы «ЗАО Эколаб» (Россия). Общий белок в преципитате представлял собой циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), содержащие как ммЛПНП в качестве антигена, так и другие антигены. Полученные результаты представлены в таблице 1.1.2. Determination of cholesterol and total proteins in PEG precipitates prepared at different concentrations of PVP-12600 and a constant concentration of 4.5% PEG-3350. In the precipitates, after dissolution in 50 μl of buffer-2, the content of cholesterol and total protein was determined using reagent kits from ZAO Ekolab (Russia). The total protein in the precipitate was circulating immune complexes (CICs) containing both LDLM as an antigen and other antigens. The results are presented in table 1.
1.3. Определение степени связывания комплемента морской свинки циркулирующими иммунными комплексами в преципитатах, приготовленных при возрастающих концентрациях ПВП и постоянной концентрации 4,5% ПЭГ-3350. К 10 мкл растворов преципитатов, разбавленных в соотношении 1:99 буфером VBS2+, добавляли 20 мкл раствора, разбавленного 1:19 раствора комплемента морской свинки. Общий объем доводили до 0,3 мл буфером VBS2+ и инкубировали 20 мин при 37°С. После предварительной инкубации добавляли 200 мкл ЕА и повторно инкубировали 30 мин при 37°С. После 30-минутной инкубации реакцию останавливали добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15М NaCl, центрифугировали и определяли величину лизиса эритроцитов по выходу гемоглобина в супернатант. Контрольная проба не содержала преципитата иммунных комплексов. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствовал о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле1.3. Determination of the degree of binding of guinea pig complement by circulating immune complexes in precipitates prepared at increasing concentrations of PVP and a constant concentration of 4.5% PEG-3350. To 10 μl of precipitate solutions diluted 1:99 with VBS 2+ buffer, 20 μl of a solution diluted 1:19 of guinea pig complement solution was added. The total volume was adjusted to 0.3 ml with VBS 2+ buffer and incubated for 20 min at 37 ° C. After preliminary incubation, 200 μl of EA was added and re-incubated for 30 min at 37 ° C. After a 30-minute incubation, the reaction was stopped by adding 2.5 ml of a cold 0.15 M NaCl solution, centrifuged, and the erythrocyte lysis was determined by the hemoglobin yield in the supernatant. The control sample did not contain a precipitate of immune complexes. Reduced hemolysis in experimental samples compared with the control testified to the presence of complement binding. The degree of lysis of red blood cells (U) was determined by the formula
У(%)=[(Х-К)/(Н-К)×100],Y (%) = [(XK) / (HK) × 100],
где Н, R и X - величины оптической плотности А405 в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяли по формулеwhere H, R and X are the optical density values A 405 in the hemolytic systems of the control sample, in the control of EA spontaneous lysis and in the experimental sample, respectively. The degree of complement fixation (CCK) was determined by the formula
ССК(%)=100-У.SSK (%) = 100-U.
Полученные результаты представлены в таблице 1.The results are presented in table 1.
1.4. Определение содержания IgG в преципитате.1.4. Determination of IgG content in the precipitate.
1.4.1. Приготовление эритроцитов барана, сенсибилизированных гетерофильными антителами человека. Предварительно определяли титр гетерофильных антител в сыворотке крови человека. Использовали инактивированную прогреванием при 56°С в течение 20 мин сыворотку крови человека с титром гетерофильных антител 1:512 для получения иммунного комплекса (эритроциты барана-антитела человека (ЕАч) в субагглютинирующей дозе). После 30 мин инкубации сформированный комплекс ЕАч отделяли центрифугированием, осадок 3 раза промывали 0,15 М раствором NaCl при центрифугировании и готовили 1% взвесь ЕАч.1.4.1. Preparation of sheep erythrocytes sensitized by heterophilic human antibodies. The titer of heterophilic antibodies in human serum was previously determined. Used inactivated by heating at 56 ° C for 20 min human blood serum with a titer of heterophilic antibodies 1: 512 to obtain the immune complex (sheep red blood cells-antibodies (EA h ) in a subagglutinating dose). After 30 min incubation, the formed EA h complex was separated by centrifugation, the precipitate was washed 3 times with a 0.15 M NaCl solution by centrifugation, and a 1% suspension of EA h was prepared.
1.4.2. Определение титра антител барана к IgG человека с использованием, приготовленного иммунного комплекса (ЕАч). Предварительно титровали препарат антител барана в 96-луночных круглодонных иммунологических плашках, добавляли равный объем 1% суспензии ЕАч, тщательно перемешивали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации определяли конечное разведение антител барана, при котором наблюдается полная гемагглютинация. Данное разведение считается 1 гемагглютинирующей единицей (ГАЕ). В нашем случае 1 ГАЕ был титр равный 1:32400. Для РТГА использовали разведение препарата антител против IgG человека 1:8100 (4 ГАЕ).1.4.2. Determination of the titer of ram antibodies to human IgG using a prepared immune complex (EA h ). The ram antibody preparation was pre-titrated in 96-well round-bottom immunological plates, an equal volume of a 1% suspension of EA h was added, thoroughly mixed and incubated for 1 h at room temperature. After incubation, the final dilution of ram antibodies was determined, in which complete hemagglutination is observed. This dilution is considered 1 hemagglutinating unit (GAE). In our case, 1 GAE had a titer of 1: 32400. For RTGA, a dilution of an anti-human IgG antibody preparation of 1: 8100 (4 GAE) was used.
1.4.3. Проведение РТГА. Предварительно титровали преципитаты иммунных комплексов, разведенных 1:99, на 12 лунок в 96-луночных круглодонных иммунологических плашках. В качестве стандарта титровали препарат IgG с исходной концентрацией 1 мг/мл. После титрования преципитатов и стандартного препарата IgG добавляли равный объем разбавленного раствора антител против IgG человека, содержащего 4 ГАЕ, т.е. препарат антител был разбавлен 1:8100. Тщательно перемешивали и добавляли равный объем 1% суспензии иммунных комплексов (ЕАч), повторно перемешивали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации определяли для каждой пробы лунку, где наблюдается торможение гемагглютинации. Расчеты проводили с использованием данных по торможению гемагглютинации стандартного раствора IgG человека. Полученные данные представлены в таблице 1.1.4.3. Conducting RTGA. Precipitates of immune complexes, diluted 1:99, were pre-titrated into 12 wells in 96-well round-bottom immunological plates. As a standard, an IgG preparation was titrated with an initial concentration of 1 mg / ml. After titration of the precipitates and standard IgG preparation, an equal volume of a diluted solution of anti-human IgG antibodies containing 4 GAE was added, i.e. the antibody preparation was diluted 1: 8100. The mixture was thoroughly mixed and an equal volume of a 1% suspension of immune complexes (EA h ) was added, re-mixed and incubated for 1 h at room temperature. After incubation, a well was determined for each sample, where hemagglutination inhibition was observed. The calculations were performed using data on the inhibition of hemagglutination of a standard solution of human IgG. The data obtained are presented in table 1.
Из данных, представленных в таблице 1, следует, что при концентрации 4,5% ПЭГ-3350 в сыворотке не наблюдается агрегация ни иммунных комплексов, содержащих множественно модифицированные липопротеины (ммЛПНП), ни нативных липопротеинов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП). Показателями агрегации и преципитации как иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, так и нативных ЛПНП и ЛПОНП, являются содержание холестерина в преципитатах. Добавление ПВП-12600 в раствор сыворотки, содержащей 4,5% ПЭГ-3350, вызывает агрегацию иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, начиная с 0,3% до 1,7%. Дальнейшее увеличение концентрации ПВП-12600 выше 1,7% в системе приводит к агрегации и преципитации нативных ЛПНП и ЛПОНП. Об этом свидетельствует отсутствие возрастания степени связывания комплемента преципитатами, полученными при концентрации ПВП-12600 свыше 1,7%. Сохранение степени связывания комплемента на уровне 65-68% и возрастание концентрации холестерина и общего белка в преципитатах при увеличении концентрации ПВП-12600 (более 1,7%) свидетельствует, с одной стороны, о полной агрегации иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, с другой стороны, об агрегации нативных ЛПНП и ЛПОНП, которые не обладают комплементсвязывающей способностью. Возрастание уровня общего белка также подтверждает агрегацию и преципитацию нативных ЛПНП и ЛПОНП. Наличие IgG в преципитахах, приготовленных в присутствии ПВП, свидетельствует об иммунных комплексах, содержащих ммЛПНП, так же как постоянный уровень IgG в преципитатах, полученных при концентрации ПВП-12600 1,7% и выше, свидетельствует о специфической преципитации иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП.From the data presented in table 1, it follows that at a concentration of 4.5% PEG-3350 in serum, no aggregation of immune complexes containing multiple modified lipoproteins (mm LDL) or native low-density lipoproteins (LDL) and very low density (VLDL) is observed. ) The indicators of aggregation and precipitation of both immune complexes containing mmLDL and native LDL and VLDL are the cholesterol content in the precipitates. The addition of PVP-12600 to a serum solution containing 4.5% PEG-3350 causes the aggregation of immune complexes containing LDL, starting from 0.3% to 1.7%. A further increase in the concentration of PVP-12600 above 1.7% in the system leads to aggregation and precipitation of native LDL and VLDL. This is evidenced by the absence of an increase in the degree of complement binding by precipitates obtained at a PVP-12600 concentration of more than 1.7%. Keeping the degree of complement binding at the level of 65-68% and increasing the concentration of cholesterol and total protein in precipitates with an increase in the concentration of PVP-12600 (more than 1.7%) indicates, on the one hand, the complete aggregation of immune complexes containing mmLDPE, on the other hand , on the aggregation of native LDL and VLDL, which do not have a complement binding capacity. An increase in total protein also confirms the aggregation and precipitation of native LDL and VLDL. The presence of IgG in precipitates prepared in the presence of PVP indicates immune complexes containing mmLDPE, as well as a constant level of IgG in precipitates obtained at a concentration of PVP-12600 1.7% or higher, indicates a specific precipitation of immune complexes containing mmLDPE.
Таким образом, при постоянной концентрации ПЭГ 3350 (4,5%) и концентрациях ПВП-12600 в диапазоне от 0,3% до 1,7% наблюдается избирательная дозозависимая агрегация и преципитация иммунных комплексов, содержащих ммЛПНП, и не наблюдается агрегация и преципитация как нативных ЛПНП и ЛПОНП, так и свободных IgG.Thus, at a constant concentration of PEG 3350 (4.5%) and PVP-12600 concentrations in the range from 0.3% to 1.7%, selective dose-dependent aggregation and precipitation of immune complexes containing mmLDL are observed, and aggregation and precipitation are not observed as native LDL and VLDL, and free IgG.
Этап 2. Определение содержания холестерина иммунных комплексов в сыворотке крови доноров и больных ишемической болезнью сердца.Stage 2. Determination of the cholesterol content of immune complexes in the blood serum of donors and patients with coronary heart disease.
2.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при условиях 1,7% ПВП-12600 и 4,5% ПЭГ-3350. К 50 мкл сыворотки крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) и относительно здоровых доноров добавляли 60 мкл буфера-1 и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшиеся агрегаты иммунных комплексов осаждали центрифугированием при 23°С в течение 5 мин при 6000 об/мин. Супернатант декантировали и осадок растворяли в 50 мкл буфера-2. Полученные результаты представлены в таблице 2.2.1. Preparation of serum precipitate under conditions of 1.7% PVP-12600 and 4.5% PEG-3350. To 50 μl of blood serum of patients with coronary heart disease (CHD) and relatively healthy donors, 60 μl of buffer-1 was added and incubated for 10 min at room temperature. The resulting aggregates of immune complexes were precipitated by centrifugation at 23 ° C for 5 min at 6000 rpm. The supernatant was decanted and the pellet was dissolved in 50 μl of buffer-2. The results are presented in table 2.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, в группе относительно здоровых доноров в трех пробах содержание ХИК было заметно выше, чем в остальных пробах этой контрольной группы. Полученные данные о повышенном уровне ХИК у трех доноров, возможно, свидетельствуют о субклинической стадии атеросклероза. При исключении данных доноров из группы контроля по ХИК, средний уровень ХИК составляет 7,07±1,15, при колебании от 5,9 до 8,3 мг/дл. Следовательно, уровень ХИК до 8,3 мг/дл можно предварительно считать нормальным уровнем у здоровых людей. В группе больных ИБС в 100% случаев определяется повышенный уровень ХИК и колебания составили от 11,7 до 40,3 мг/дл.As can be seen from the data presented in table 2, in the group of relatively healthy donors in three samples, the CIC content was noticeably higher than in the remaining samples of this control group. The data obtained on the increased level of CIC in three donors may indicate a subclinical stage of atherosclerosis. With the exclusion of donor data from the CIC control group, the average CEC level is 7.07 ± 1.15, with a variation of 5.9 to 8.3 mg / dl. Therefore, a CIC level of up to 8.3 mg / dl can be previously considered a normal level in healthy people. In the group of patients with coronary heart disease in 100% of cases, an increased level of CIC is determined and fluctuations ranged from 11.7 to 40.3 mg / dl.
Таким образом, способ позволяет повысить точность количественного определения холестерина в циркулирующих иммунных комплексах сыворотки крови человека. Выявление повышенного уровня ХИК при широких скрининговых обследованиях может быть предиктором атеросклероза на доклинической стадии. Доступность реагентов и простота способа определения ХИК в лабораторной практике позволят проводить углубленное исследование патогенеза атеросклеротических заболеваний. С другой стороны, реализация изобретения позволит как контролировать эффективность проводимого лечения, так и выявлять доклинические состояния атеросклероза.Thus, the method improves the accuracy of the quantitative determination of cholesterol in circulating immune complexes of human serum. Identification of elevated levels of CIC with extensive screening tests can be a predictor of atherosclerosis in the preclinical stage. The availability of reagents and the simplicity of the method for determining CIC in laboratory practice will allow for an in-depth study of the pathogenesis of atherosclerotic diseases. On the other hand, the implementation of the invention will allow both to control the effectiveness of the treatment and to identify preclinical conditions of atherosclerosis.
ЛитератураLiterature
1. Собенин И.А., Карагодин В.П., Мельниченко А.А., Орехов А.Н. Холестерин иммунных комплексов как индикатор атеросклероза // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №3. - С.99-103.1. Sobenin I.A., Karagodin V.P., Melnichenko A.A., Orekhov A.N. Cholesterol of immune complexes as an indicator of atherosclerosis // Pathological physiology and experimental therapy. - 2012. - No. 3. - S.99-103.
2. Тертов В.В., Качарава А.Г., Саядян Х.С.и др. Холестеринсодержащие циркулирующие иммунные комплексы - компонент сыворотки крови больных с ишемической болезнью сердца, обуславливающий ее атерогенность // Кардиология. - 1989. - Т. 29, №8. - С.35-38.2. Tertov VV, Kacharava AG, Sayadyan Kh.S. et al. Cholesterol-containing circulating immune complexes - a component of the blood serum of patients with coronary heart disease, causing its atherogenicity // Cardiology. - 1989. - T. 29, No. 8. - S. 35-38.
3. Шойбонов Б.Б., Борголов В.М., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф., Кубатиев А.А. Тест-система определения циркулирующих иммунных комплексов // Описание изобретения к патенту РФ №2452962 от 10.06.2012 г. Бюл. №16.3. Shoybonov B.B., Borgolov V.M., Baronets V.Yu., Panchenko L.F., Kubatiev A.A. Test system for determining circulating immune complexes // Description of the invention to the patent of the Russian Federation No. 2452962 dated June 10, 2012 Bull. No. 16.
4. Burut D.F.P., Karim Y., Ferns G.A.A. The Role of Immune Complexes in Atherosclerosis // Angiology. - 2010. - V. 61, №7. - P.679-689.4. Burut D.F.P., Karim Y., Ferns G.A.A. The Role of Immune Complexes in Atherosclerosis // Angiology. - 2010. - V. 61, No. 7. - P.679-689.
5. Lopes-Virella M.F., Brent McHenry M., Lipsitz S., et al. Immune complexes containing modified lipoproteins are related to the progression of internal carotid intima-media thickness in patients with type 1 diabetes // Atherosclerosis. - 2007. - V.190. - P.359-369.5. Lopes-Virella M.F., Brent McHenry M., Lipsitz S., et al. Immune complexes containing modified lipoproteins are related to the progression of internal carotid intima-media thickness in patients with type 1 diabetes // Atherosclerosis. - 2007. - V.190. - P. 359-369.
6. Szondy E., Mezey Z., Fust G. et al. Serial measurement of circulating immune complexes in myocardial infarction // Br Heart J. - 1981. - V.46. - P.93-98.6. Szondy E., Mezey Z., Fust G. et al. Serial measurement of circulating immune complexes in myocardial infarction // Br Heart J. - 1981. - V.46. - P.93-98.
7. Virella G., Carter R.E., Saad A., et al. Distribution of IgM and IgG antibodies to oxidiesed LDL in immune complexes isolated from patients with type 1 diabetes and its relationship with nephropathy // Clin. Immunol. - 2008. - V.127, №3. - P.394-400.7. Virella G., Carter R.E., Saad A., et al. Distribution of IgM and IgG antibodies to oxidiesed LDL in immune complexes isolated from patients with type 1 diabetes and its relationship with nephropathy // Clin. Immunol. - 2008. - V.127, No. 3. - P.394-400.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012155495/15A RU2530627C2 (en) | 2012-12-20 | 2012-12-20 | Method for rapid determination of cholesterol in immune complexes |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012155495/15A RU2530627C2 (en) | 2012-12-20 | 2012-12-20 | Method for rapid determination of cholesterol in immune complexes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012155495A RU2012155495A (en) | 2014-06-27 |
| RU2530627C2 true RU2530627C2 (en) | 2014-10-10 |
Family
ID=51215924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012155495/15A RU2530627C2 (en) | 2012-12-20 | 2012-12-20 | Method for rapid determination of cholesterol in immune complexes |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2530627C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2588841C1 (en) * | 2015-05-15 | 2016-07-10 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for diagnosis of risk of combined course of atherosclerosis in patients with chronic ischaemia of lower extremities |
| RU2632118C1 (en) * | 2016-07-21 | 2017-10-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Method for selection and study of atherogenicity of immune complexes containing multiple modified lipoproteins |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2439582C1 (en) * | 2010-06-11 | 2012-01-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" | Method of predicting ischemic heart disease course |
| RU2452962C2 (en) * | 2010-08-24 | 2012-06-10 | Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Нии Общей Патологии И Патофизиологии Рамн | Method and test system for detection of circulating immune complexes |
| RU2465817C1 (en) * | 2011-06-17 | 2012-11-10 | Артур Джагафарович Эльбаев | Method for non-invasive determination of blood cholesterol concentration |
-
2012
- 2012-12-20 RU RU2012155495/15A patent/RU2530627C2/en active IP Right Revival
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2439582C1 (en) * | 2010-06-11 | 2012-01-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" | Method of predicting ischemic heart disease course |
| RU2452962C2 (en) * | 2010-08-24 | 2012-06-10 | Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Нии Общей Патологии И Патофизиологии Рамн | Method and test system for detection of circulating immune complexes |
| RU2465817C1 (en) * | 2011-06-17 | 2012-11-10 | Артур Джагафарович Эльбаев | Method for non-invasive determination of blood cholesterol concentration |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Творогова М.Г. Методы определения холестерина липопротеидов низкой плотности. Лабораторная медицина N8, 2006. Найдено из Интернет 17.12.2013, URL: http://www.ramld.ru/articles/article.php?id=53. Тертов В.В., Качарава А.Г., Саядян Х.С.и др. Холестерин содержащие циркулирующие иммунные комплексы - компонент сыворотки крови больных с ишемической болезнью сердца, обуславливающий ее атерогенность // Кардиология. - 1989. - Т. 29, N8. - С.35-38 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2588841C1 (en) * | 2015-05-15 | 2016-07-10 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for diagnosis of risk of combined course of atherosclerosis in patients with chronic ischaemia of lower extremities |
| RU2632118C1 (en) * | 2016-07-21 | 2017-10-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Method for selection and study of atherogenicity of immune complexes containing multiple modified lipoproteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012155495A (en) | 2014-06-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ruddy et al. | The complement system in rheumatoid synovitis I. An analysis of complement component activities in rheumatoid synovial fluids | |
| Mahoney | Bovine babesiosis: preparation and assessment of complement fixing antigens | |
| Milgrom et al. | Immunological Studies on Adrenal Glands: I. Immunization with Adrenals of Foreign Species | |
| Morgan et al. | The occurrence of A, B and O blood group substances in pseudo-mucinous ovarian cyst fluids | |
| Moskowitz et al. | Studies on the Antigens of Human Red Cells: I. The Separation from Human Erythrocytes of a Qater Soluble Fraction Containing the Rh, A and B Factors | |
| Kusnierz-Alejska et al. | Haemolytic Disease of the Newborn due to Anti-Di^ a and Incidence of the Di^ a Antigen in Poland | |
| RU2530627C2 (en) | Method for rapid determination of cholesterol in immune complexes | |
| RU2437098C1 (en) | Method for instant determination of blood atherogenicity (versions) | |
| RU2444014C1 (en) | Medium and method for detection of multiply modified blood serum lipoproteins | |
| Greenwood et al. | A study of the role of immunological factors in the pathogenesis of the anaemia of acute malaria | |
| RU2666957C1 (en) | Method for determination functional activity of c3-convertase of alternative path of human complement activation | |
| Munk‐Andersen | A dextran serum medium for the demonstration of incomplete anti‐A and anti‐B | |
| RU2452962C2 (en) | Method and test system for detection of circulating immune complexes | |
| RU2549467C1 (en) | Method of determination of atherogenicity of immune complexes | |
| RU2112984C1 (en) | Cytogenetic method for estimating functional activity of t- lymphocytes in patienт's blood | |
| RU2538685C1 (en) | Method for rapid analysis of cholesterol in immune complexes | |
| US3826821A (en) | Reagents for the diagnosis of infectious mononucleosis and preparation of same | |
| Win et al. | Mixed-type autoimmune haemolytic anaemia: Unusual cases and a case associated with splenic T cell angioimmunoblastic non-Hodgkins lymphoma | |
| JPH01105160A (en) | Detection of abnormal response lymphocyte and eragent and kit for detection to be used therein | |
| RU2632118C1 (en) | Method for selection and study of atherogenicity of immune complexes containing multiple modified lipoproteins | |
| RU2560684C1 (en) | Agent for diagnostics of bovine leukaemia and method of its application | |
| RU2549466C1 (en) | Instant method for assessing atherogenicity of immune complexes of human blood serum | |
| RU2680848C1 (en) | Method for assessing character of autoimmune reaction of human body to multiple modified low-density lipoproteins in lytic test | |
| McLeod et al. | 'Hypocryoglobulins': Enhanced Cryoprecipitation From Hypotonic Serum in Patients With Vasculitis | |
| Walls et al. | Evaluation of a hemagglutination test for amebiasis, using a commercial antigen |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161221 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20180703 |