RU2576780C2 - Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины - Google Patents
Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины Download PDFInfo
- Publication number
- RU2576780C2 RU2576780C2 RU2014116656/15A RU2014116656A RU2576780C2 RU 2576780 C2 RU2576780 C2 RU 2576780C2 RU 2014116656/15 A RU2014116656/15 A RU 2014116656/15A RU 2014116656 A RU2014116656 A RU 2014116656A RU 2576780 C2 RU2576780 C2 RU 2576780C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rhd
- primers
- kit
- gene
- tubes
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title abstract 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 101150108975 Rhd gene Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 4
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 208000018712 Hemolytic disease due to fetomaternal alloimmunization Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010063676 Rhesus incompatibility Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001031 fetal erythroblastosis Diseases 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и предназначено для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины. Предложен набор с лиофилизированными праймерами, содержащий готовые к амплификации реакционные пробирки с лиофилизированными праймерами и праймерами-зондами для экзонов RHD-5 и RHD-7 гена RHD. Все смеси в реакционных пробирках подготовлены для реакции в необходимых объемах, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации. Изобретение обеспечивает создание набора, эффективного для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины с увеличенным сроком годности, с возможностью транспортировки в дальние регионы без строгого соблюдения температурного режима. 1 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике и используется для диагностики резус-фактора плода по крови резус-отрицательной беременной женщины для своевременной профилактики гемолитической болезни плода и новорожденного.
Известен «Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления» по патенту РФ №2296328 от 21.09.2005, опубликовано 27 03.2007, МПК G01N 33/50, C12Q 1/68, включающий выделение ДНК; проведение полимеразной цепной реакции для определения мутаций и/или полиморфизма гена, состоящей из начального плавления, ряда циклов из плавления, отжига и синтеза и финального синтеза; проведение гидролиза продуктов полимеразной цепной реакции эндонуклеазами рестрикции Hindi I и BstFNI, а также электрофорез в полиакриламидном геле.
Самым близким к заявляемому изобретению по технической сущности является способ определения ДНК гена резус-фактора и диагностический набор для его осуществления, описанный в заявке на изобретение №2010130842 от 23.07.2010 г., опубл. 27.01.2012 г., включающий диагностический набор для определения ДНК гена резус-фактора, включающий компоненты 67 мМ трис-HCl, pH 8,8 при 25°C; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 6,7 мМ MgClg; 6,7 мкм ЭДТА; 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 0,2 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 10 ед./мкл, отличающийся тем, что все компоненты для проведения полимеразной цепной реакции (за исключением ДНК-полимеразы) смешаны в одном объеме, а в набор дополнительно включены ДНК для проведения положительного контроля полимеразной цепной реакции вода ампулированная и следующие олигопраймеры:
RHD-7-F: GGGTGTTGTAACCGAGTGCTG
RHD-7-R: CCGGCTCCGACGGTATC
RHD-7-FAM: FAM-CCCACAGCTCCATCATGGGCTACAA-BHQ1
RHD-5-F: CGCCCTCTTCTTGTGGATG
RHD-5-R: GAACACGGCATTCTTCCTTTC
RHD-5-FAM: FAM-TCTGGCCAAGTTTCAACTCTGCTCTGCT-BHQ1
GAPDH-F: TGCTCCCACTCCTGATTTCTG
GAPDH-R: TTCTCTAAGTCCCTCCTACAAAAG
GAPDH-F AM: FAM-TTCCCCTCTTCCCACCCGCCCC-BHQ1
Но данные диагностические наборы имеют ограниченный срок годности до 1 года и чувствительны к перепадам температур, поэтому требуют сохранения температурного режима при хранении и транспортировке, что затрудняет транспортировку в дальние регионы. А также поставка в виде стоковых растворов праймеров и Taq-полимеразы требует затрат времени и большого числа манипуляций при подготовке к амплификации, в частности надо произвести подсчет необходимого объема в зависимости от числа образцов, «раскапывание» по реакционным пробиркам. Важным обстоятельством является то, что фетальная ДНК сильно разбавлена и ее количества может не хватить для реакции амплификации, т.о. будет наблюдаться ложноотрицательный результат.
Предлагаемое изобретение направлено на получение следующего технического результата: создание набора для ПЦР-диагностики гена резус-фактора развивающегося плода по крови беременной женщины, обладающего большей чувствительностью и специфичностью, с подготовленными реакционными пробирками к амплификации, с увеличенным сроком годности до 5 лет, с возможностью транспортировки набора в дальние регионы без строгого соблюдения температурного режима, при этом увеличить точность и скорость процесса постановки теста при уменьшении трудозатрат.
Поставленная задача решается за счет того, что набор с лиофилизированными праймерами для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины, содержащий готовые к амплификации реакционные пробирки с лиофилизированными праймерами и праймерами-зондами для экзонов RHD-5 и RHD-7 гена RHD (3 пробирки на пробу) и гена GAPDH, дополнительно пробирки с положительной контрольной ДНК, с деионизированной водой, с ПЦР-буфером, включающим компоненты 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°С; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 6,7 мМ MgClg; 6,7 мкм ЭДТА; 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 0,2 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 10 ед./мкл, причем все смеси в реакционных пробирках подготовлены для реакции в необходимых объемах, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации, которая состоит из основного режима сушки при давлении 0,770 мбар, -15°/60 мин, -10°/30 мин, -5°/30 мин, 0°/30 мин, и финальной сушки при давлении 0,040 мбар, 4°/120 мин. Основной причиной гемолитической болезни новорожденных является иммунологическая несовместимость плода и матери. Несовместимость по резус-фактору составляет до 95% клинически значимых случаев. В качестве профилактики резус-сенсибилизации используют антирезус-иммуноглобулин, что подтверждает свою эффективность в 80% случаев. Однако при беременности резус-отрицательным плодом нет необходимости введения иммуноглобулина, так как этот белковый препарат в данном случае будет бесполезным, небезопасным и затратным в финансовом плане. В связи с этим пренатальное определение резус-фактора не инвазивным методом на ранней стадии беременности (10-12 недель) решает вопрос своевременной профилактики у резус-отрицательных беременных при положительном резус-факторе плода и исключает ненужные процедуры при резус-отрицательной принадлежности плода. Основа анализа - ПЦР-реакция с флуоресцентной спектрометрией (Real-time) с помощью праймеров и праймеров-зондов. Праймеры и праймеры-зонды доводят до необходимой концентрации и ставят реакцию для проверки работоспособности и контроля контаминации на ДНК Jurkat и деионизированной воде. При ожидаемом результате стоковые растворы праймеров и праймеров-зондов аликвотируются в реакционные пробирки. Для сохранения работоспособности микрообъема праймера используется лиофилизация, что позволяет не зависеть от перепада температур при транспортировке и хранении, а также увеличить срок годности набора с одного года до пяти лет. А содержание дополнительного объема праймера для постановки ПЦР-реакции на определение гена RHD (3 пробирки, вместо стандартных 2) увеличивает чувствительность метода. Все смеси праймеров в необходимых пропорциях добавлены в амплификационные пробирки, совместимые с используемым амплификатором, что уменьшает время постановки и риск контаминации за счет уменьшения числа манипуляций, т.е. увеличивается точность и уменьшаются трудозатраты. Лиофилизация смеси праймеров и праймеров-зондов проводится в лиофильной сушке ALPHA 1-4 LSC №102041. Праймеры в необходимых концентрациях подготовлены к реакции, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации, которая состоит из основного режима сушки при давлении 0,770 мбар, -15°/60 мин, -10°/30 мин, -5°/30 мин, 0°/30 мин. Финальная сушка - при давлении 0,040 мбар, 4°/120 мин. Процесс лиофилизации позволяет сохранить стабильность праймера, транспортировать и хранить набор без строгого соблюдения температурного режима, также позволяет увеличить срок годности набора с одного года до 5 лет. Все смеси праймеров и праймеров-зондов в необходимых концентрациях подготовлены для реакции и добавлены в реакционные пробирки, сводя процесс подготовки образцов к амплификации к одному действию, а именно добавлению раствора ДНК, что позволяет ускорить процедуру подготовки образцов к амплификации. По результатам исследований дополнительная амплификационная пробирка, используемая в предлагаемом наборе, позволяет увеличить чувствительность с 97,2% до 98,4%, а специфичность с 94,4% до 95,2% соответственно.
При определении гена резус-фактора сотрудник лаборатории после выделения ДНК при постановке амплификации использует тонкостенные оптически-прозрачные пробирки, совместимые с используемым амплификатором, в которых уже находится необходимый объем праймера, добавляет ПЦР-смесь в пробирку с выделенной ДНК и уже из нее аликвотирует по 20 мкл раствора в подготовленные пробирки, затем запускает программу амплификации. Определение гена резус-фактора проводится с помощью полимеразно-цепной реакции следующим образом: начальное плавление 5 мин при температуре 95°С, далее проводят цикл 60 раз, включающий плавление при 94°С в течение 15 с, отжиг и синтез при температуре 60°С в течение 1 мин, во время отжига проводят детекцию с помощью флуоресцентной спектрометрии. Регистрируется накопление специфического продукта амплификации путем изменения интенсивности флуоресцентного сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой в режиме «реального времени». По каналу, соответствующему флуорофору FAM, детектируется продукт амплификации ДНК гена RHD и гена GAPDH. В предлагаемом техническом решении используется дополнительная реакционная пробирка, т.е. для каждого образца проводится амплификация гена GAPDH, как контроль выделения ДНК, 7 экзона гена RHD и две пробирки для 5 экзона гена RHD, а смеси праймеров и праймеров-зондов для каждого экзона гена RHD и гена GAPDH, содержащиеся в амплификационных пробирках, лиофилизированны.
Проверка работоспособности проводилась на образцах крови 80 пациенток, срок беременности 27-35 недель. При рождении ребенка резус-фактор был определен серологическим методом. По результатам исследований набор и способ может использоваться для диагностики со следующими аналитическими характеристиками: чувствительность 98,4%, специфичность 95,2%.
Claims (1)
- Набор с лиофилизированными праймерами для ПЦР-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины, содержащий готовые к амплификации реакционные пробирки с лиофилизированными праймерами и праймерами-зондами для экзонов RHD-5 и RHD-7 гена RHD (3 пробирки на пробу) и гена GAPDH, дополнительно пробирки с положительной контрольной ДНК, с деионизированной водой, с ПЦР-буфером, включающим компоненты 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°С; 16,6 мМ (NH4)2SO4; 6,7 мМ MgClg; 6,7 мкм ЭДТА; 170 мкг БСА, смесь четырех основных dNTP в концентрации 0,2 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу 10 ед./мкл, причем все смеси в реакционных пробирках подготовлены для реакции в необходимых объемах, подвергнуты заморозке в жидком азоте, затем высушены по программе лиофилизации, которая состоит из основного режима сушки при давлении 0,770 мбар, -15°/60 мин, -10°/30 мин, -5°/30 мин, 0°/30 мин, и финальной сушки при давлении 0,040 мбар, 4°/120 мин.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014116656/15A RU2576780C2 (ru) | 2014-04-25 | 2014-04-25 | Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014116656/15A RU2576780C2 (ru) | 2014-04-25 | 2014-04-25 | Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014116656A RU2014116656A (ru) | 2015-11-27 |
| RU2576780C2 true RU2576780C2 (ru) | 2016-03-10 |
Family
ID=54753255
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014116656/15A RU2576780C2 (ru) | 2014-04-25 | 2014-04-25 | Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2576780C2 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2296328C1 (ru) * | 2005-09-21 | 2007-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ГЕН" | Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления |
| WO2010009440A2 (en) * | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Biocept, Inc. | Non-invasive fetal rhd genotyping from maternal whole blood |
-
2014
- 2014-04-25 RU RU2014116656/15A patent/RU2576780C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2296328C1 (ru) * | 2005-09-21 | 2007-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "ГЕН" | Способ определения предрасположенности к онкологическим заболеваниям и диагностический набор для его осуществления |
| WO2010009440A2 (en) * | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Biocept, Inc. | Non-invasive fetal rhd genotyping from maternal whole blood |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HROMADNIKOVA I. et al. Non-invasive fetal RHD and RHCE genotyping using real-time PCR testing of maternal plasma in RhD-negative pregnancies. J Histochem Cytochem. 2005 Mar; 53(3): 301-305 [Найдено 29.01.2015] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://jhc.sagepub.com/content/53/3/301.long. GONZALEZ-GONZALEZ C. et al. Application of fetal DNA detection in maternal plasma: a prenatal diagnosis unit experience. J Histochem Cytochem. 2005 Mar; 53(3): 307-314 [Найдено 29.01.2015] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://jhc.sagepub.com/content/53/3/307.long. * |
| ZHONG L. High-throughput Testing for the Determination of the Fetal Rh Factor in Maternal Plasma. Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.). Berlin, 01.10.2008, 76 p. [Найдено 29.01.2015] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://www.diss.fu-berlin.de/diss/servlets/MCRFileNodeServlet/FUDISS_derivate_000000011299/liu.pdf. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2014116656A (ru) | 2015-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhao et al. | Diagnostic potential for miRNAs as biomarkers for pregnancy-specific diseases | |
| Wang et al. | Real-time PCR evaluation of cell-free DNA subjected to various storage and shipping conditions | |
| CN103710433B (zh) | 用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN107267602B (zh) | 一种与男性生殖功能障碍相关的精子piRNA标志物组合及其应用 | |
| US10895572B2 (en) | Autophagy-related nourin gene-based RNA network as early biomarkers for cardiac patients | |
| CN107916289B (zh) | 精子piRNA和精子蛋白MitoPLD作为检测和预测男性不育的生物标志物 | |
| CN111455094B (zh) | 检测深部感染真菌的组合物、试剂盒、用途及其方法 | |
| Asadpour et al. | Ovine fetal sex determination using circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) and cervical mucous secretions | |
| RU2576780C2 (ru) | Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины | |
| RU2474823C1 (ru) | Способ прогнозирования качества эмбрионов в программе экстракорпорального оплодотворения | |
| Lim et al. | DNA fragmentation of human sperm can be detected by ligation-mediated real-time polymerase chain reaction | |
| CN104774918A (zh) | 基于实时荧光pcr的il28b基因多态性检测试剂盒 | |
| Janovičová et al. | Isolation and quantification of extracellular DNA from biofluids | |
| CN104630214B (zh) | Sry基因引物对与探针的组合和sry多位点检测试剂盒 | |
| RU2620561C1 (ru) | Способ диагностики псориаза | |
| CN118979104A (zh) | 脓毒症相关疾病早期诊断标志物及其用途 | |
| CN110106237B (zh) | Dys14多态性检测引物及试剂盒 | |
| CN104388587A (zh) | 乙型流感病毒一步法检测试剂盒及乙型流感病毒检测方法 | |
| CN107190074B (zh) | hsa_circRNA_103127在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用 | |
| RU2474822C1 (ru) | Способ прогнозирования исхода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов | |
| WO2024005656A1 (es) | Kit de sexado temprano no invasivo mediante pcr en tiempo real para paiche (arapaima gigas) | |
| CN107190073B (zh) | hsa_circRNA_104907在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用 | |
| Mbaye et al. | Determination of free DNA (cfDNA) by RT-qPCR in individuals in sperm alterations | |
| CN103923981A (zh) | Hla-b*27等位基因检测方法及其试剂盒 | |
| RU2819044C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя моракселлеза KPC (Moraxella bovis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160426 |