RU2564437C2 - Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота - Google Patents
Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота Download PDFInfo
- Publication number
- RU2564437C2 RU2564437C2 RU2013158431/15A RU2013158431A RU2564437C2 RU 2564437 C2 RU2564437 C2 RU 2564437C2 RU 2013158431/15 A RU2013158431/15 A RU 2013158431/15A RU 2013158431 A RU2013158431 A RU 2013158431A RU 2564437 C2 RU2564437 C2 RU 2564437C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- added
- minutes
- mcl
- cattle
- well
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 31
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 22
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 14
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 title description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 title description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N Levamisole Chemical compound C1([C@H]2CN3CCSC3=N2)=CC=CC=C1 HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229960001614 levamisole Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims abstract description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 3
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 claims description 3
- MUUHXGOJWVMBDY-UHFFFAOYSA-L tetrazolium blue Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 MUUHXGOJWVMBDY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract 3
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 16
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 8
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 8
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 6
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 3
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003641 microbiacidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000019254 respiratory burst Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для оценки повышенной чувствительности крупного рогатого скота к лейкозной инфекции. Способ включает выделение нейтрофильных гранулоцитов из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см3), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96 луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа. В одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (БЦЖ) в оптимальном разведении в забуференном физиологическом растворе или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест), затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия, перемешивают, инкубируют 20 минут при температуре 37°С, центрифугируют при 500 g 10 минут. Затем отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта. Раствор центрифугируют 5 минут при 500 g, отделяют надосадочную жидкость. В клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора. Центрифугируют 5 минут при 500 g. Добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°С 20 минут, добавляют по 70 мкл 2 М раствора КОН, тщательно перемешивают. Результаты реакции фиксируют с помощью иммунохимического анализатора и выражают в условных единицах оптической плотности. После учета реакции определяют коэффициент стимуляции, при этом при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Результаты реакции определяют по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм. Коэффициент стимуляции (КС) определяется отношением индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню. При КС ≤0,95 животное считают с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции крупного рогатого скота. Заявленный способ позволяет быстро и достоверно проводить оценку чувствительности к инфекции ВЛКРС и дает возможность диагностировать развитие инфекционно-воспалительных процессов у больных лейкозом животных. 4 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к лабораторным методам исследований, и может быть использовано для выявления у крупного рогатого скота предрасположенности к лейкозу путем исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов.
Среди хронических инфекционных болезней сельскохозяйственных животных в последние годы удельный вес лейкоза крупного рогатого скота возрос до 60-63%.
Современная система борьбы с лейкозом базируется на выявлении и удалении из стада больных и инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Однако выявить инфицированных животных в инкубационной стадии не удается из-за уровня антител ниже пороговой чувствительности серологических реакций. Поэтому выявление повышенной чувствительности у крупного рогатого скота к инфекции ВЛКРС на основе методов оценки состояния иммунной системы является одним из важных элементов превентивных мер по управлению эпизоотическим процессом.
Среди интегральных показателей иммунобиологической защиты наиболее адекватным параметром является фагоцитарная активность нейтрофилов крови. Системой фагоцитоза фиксируются многочисленные изменения внутренней среды организма. Особенно показательны в этом отношении нейтрофилы. Обмениваясь в циркуляции каждые 4-5 часов, они как бы фотографируют сдвиги, происходящие в этот период, являясь зеркалом гомеостаза.
О функциональном состоянии ключевой клетки системы антимикробной резистентности организма, реагирующей на любые изменения гомеостаза, позволяет судить исследование кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов. Одним из основных и наиболее объективных методов исследования кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов является тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), который основан на способности гранулоцитов фагоцитировать бесцветный краситель тетразолиевого ряда - НСТ и затем восстанавливать его в нерастворимый формазан темно-синего цвета с помощью НАД Н- и НАДФ Н-оксидаз.
НСТ-тест ставят в двух вариантах: спонтанном и индуцированном (с антигеном). Спонтанный НСТ-тест отражает степень функционального раздражения нейтрофилов in vivo, являясь своеобразным зеркалом гомеостаза. Индуцированный НСТ-тест характеризует потенциальную способность нейтрофилов ответить «респираторным взрывом» на адекватное раздражение. Отношение показателей индуцированного НСТ к спонтанному тесту рассматривают как биохимический критерий готовности нейтрофила к завершенному фагоцитозу (полному уничтожению объекта) и называют функциональным резервом (Я.А. Юцковская, Е.В. Маркелова и др. / Патент РФ №2216739, кл. G01N 33/52).
Известен способ определения функциональной активности нейтрофилов по реакции восстановления нитросинего тетразолия (патент РФ №2415423, кл. G01N 33/48), который основан на микроскопическом подсчете в камере Горяева нейтрофильных гранулоцитов, содержащих в цитоплазме диформазан. Недостатками данного способа являются отсутствие количественной регистрации кислородных радикалов, генерированных пулом нейтрофилов, и субъективность учета результатов реакции.
Перспективным в этом плане является исследование кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов с помощью теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), основанного на оптическом измерении экстрагированного диформазана, позволяющего вести автоматизированный учет реакции и, соответственно, объективнее оценить функциональную активность клеток.
Наиболее близким техническим решением к заявленному является методика определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия [B.C. Власенко, М.А. Бажин, Т.С. Дудоладова и др. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе: методические рекомендации / ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии. - Омск, 2010]. Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота включает выделение нейтрофильных гранулоцитов центрифугированием на градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см3), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа. В одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора (ЗФР) или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (ППД-туберкулина, БЦЖ) в оптимальном разведении в ЗФР или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест). Затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия и осторожно перемешивают содержимое лунок, после чего планшеты с ингредиентами инкубируют 20 минут при температуре 37°C. После инкубации планшет с пробами центрифугируют при 500 g 10 минут, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и раствор центрифугируют 5 минут при 500 g. Отделяют надосадочную жидкость, в клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора и центрифугируют 5 минут при 500 g. Для растворения образовавшегося диформазана добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°C 20 минут. Для визуализации реакции после инкубации в лунки добавляют по 70 мкл 2 М раствора KOH, тщательно перемешивают. Результаты реакции фиксируют на иммуно-химическом анализатора при длине волны 630 нм и выражают в условных единицах оптической плотности. После учета реакции определяют коэффициент стимуляции (К ст. НСТ) по формуле: отношение оптической плотности в стимулированных лунках к оптической плотности в контрольных лунках.
Этот метод позволяет объективно оценивать различные состояния иммунной системы, в том числе выявлять иммунную недостаточность, вызванную вирусом лейкоза, но только в комплексе с другими иммунологическими параметрами после обработки полученных данных с помощью дискретно-динамического анализа. Отдельно взятый метод не позволяет достаточно эффективно выявить животных с предрасположенностью к лейкозу.
Техническим результатом заявленного способа является повышение точности и достоверности при выявлении животных с повышенной чувствительностью к инфекции ВЛКРС.
Технический результат достигается тем, что способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота включает выделение нейтрофильных гранулоцитов из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см3), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа, в одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора (ЗФР) или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (БЦЖ) в оптимальном разведении в ЗФР или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест), затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия, перемешивают, инкубируют 20 минут при температуре 37°C, центрифугируют при 500 g 10 минут, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и раствор центрифугируют 5 минут при 500 g, отделяют надосадочную жидкость, в клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора, центрифугируют 5 минут при 500 g, добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°C 20 минут, добавляют по 70 мкл 2 М раствора KOH, тщательно перемешивают, результаты реакции фиксируют с помощью иммунохимического анализатора и выражают в условных единицах оптической плотности, после учета реакции определяют коэффициент стимуляции, при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола в конечной концентрации 0,5 мкг/мл, результаты реакции определяют по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм, коэффициент стимуляции (КС) определяется отношением индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню, при КС≤0,95 животное считают с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции крупного рогатого скота.
Отличительными признаками предложенного способа являются: при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола, а учет результатов реакции регистрируется по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм. Использование двухволнового метода измерения рекомендуется для уменьшения ошибок, вызванных присутствием в растворе посторонних окрашенных веществ или его мутностью [М.А. Годков, В.Ю. Зинкин / Патент РФ №2218567, кл. G01N 33/52 от 10.12.2003].
Левамизол - левовращающий оптический изомер тетрамизола, оказывающий влияние на механизмы иммунологической защиты организма. Основное его действие проявляется в усилении активности фагоцитов и Т-лимфоцитов в иммунологически дефектном организме, но не у здоровых [Последние достижения в клинической иммунологии / Под ред. Р.А. Томпсона. - М.: Медицина, 1983. - С.465-472].
Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.
Пример 1. В неблагополучном по лейкозу хозяйстве отбирают кровь от 5 коров, которых по результатам диагностических исследований признают носителями ВЛКРС (РИД-позитивные). Проводят исследование крови путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по предлагаемому способу для изучения влияния различных концентраций левамизола (0,01; 0,1; 0,5; 5 и 50 мкг/мл) на оптическую плотность раствора диформазана при определении уровня индуцированной вакциной БЦЖ активности. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.
| Таблица 1 | |||||
| Влияние различных концентрации левамизола на оптическую плотность раствора диформазана при определении уровня индуцированной активности, у.е. оп. пл. | |||||
| Символы статистики | левамизол, мкг/мл | ||||
| 0,01 | 0,1 | 0,5 | 5,0 | 50,0 | |
| М m± |
221,0 | 271,0 | 296,60 | 293,60 | 246,0 |
| 12,23 | 14,15 | 16,17 | 13,83 | 14,8 | |
Из таблицы 1 видно, что линейное увеличение плотности наблюдается при увеличении концентрации левамизола от 0,01 до 0,5 мкг/мл. Дальнейший подъем концентрации левамизола приводил к нелинейному изменению оптической плотности и даже ее уменьшению. Таким образом, для оценки восстановительно-окислительного метаболизма нейтрофилов у инфицированных ВЛКРС животных предпочтительно использовать левамизол в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.
Пример 2. В неблагополучном по лейкозу хозяйстве исследуют 15 коров, которых по результатам диагностических исследований делят на 2 группы: 1-я группа - 5 здоровых (не реагирующих в РИД) коров и 2 группа - 10 животных вирусоносителей (РИД-положительные). Проводят исследование крови путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известной методике и по предлагаемому способу с добавлением левамизола при определении уровня индуцированной активности.
С этой целью выделяют нейтрофильные гранулоциты из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина 1,077 г/см3, затем в три параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа вносят по 100 мкл клеточной взвеси. В одну лунку планшета добавляют 50 мкл, на пример физиологического раствора, (спонтанный НСТ-тест), в другую - 50 мкл предварительно растворенную, на пример, в физиологическом растворе (1000 мкг/мл) вакцину БЦЖ и 50 мкл левамизола в конечной концентрации, не превышающей 0,5 мкг/мл (индуцированный вариант по предлагаемому способу), а в третью - вакцину БЦЖ в физиологическом растворе (1000 мкг/мл) (индуцированный вариант по известному способу).
Затем в лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15%-ного раствора нитросинего тетразолия и осторожно перемешивают. После внесения всех ингредиентов планшет с пробами инкубируют 20 минут при 37°C. Затем для остановки реакции и осаждения клеток, содержащих диформазан, планшет центрифугируют при 500 g 10 минут (например, на центрифуге LU-418, приспособленной для центрифугирования планшетов). Для фиксации осажденных клеток и последующего отмывания фиксированных клеток сначала отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и центрифугируют раствор 5 минут при 500 g и затем добавляют 200 мкл физиологического раствора и вновь центрифугируют в том же режиме. Для растворения образовавшегося диформазана добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют в его присутствии при 60°C 20 минут. Для визуализации реакции после инкубации в лунки добавляют по 70 мкл 2 М раствора КОН и тщательным перемешиванием добиваются равномерного окрашивания раствора, результаты реакции регистрируют на иммунохимическом анализаторе по разнице экстинкций при длине волны 630 нм и 490 нм и выражают в условных единицах оптической плотности. Затем определяют коэффициент стимуляции как отношение индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню.
В таблице 2 представлены результаты постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известной методике (одно- и двухволновым методом) и по предлагаемому способу с добавлением левамизола при определении уровня индуцированной активности.
Из таблицы 2 видно, что у носителей ВЛКРС происходит усиление функциональной активности нейтрофилов в спонтанном и особенно в индуцированном варианте при постановке НСТ известным способом (259,12±9,59, 208,4±12,33 у.е. оп. пл.; Р<0,01).
| Таблица 2 | |||||
| Результаты оценки функциональной активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием у РИД-отридательных и инфицированных ВЛКРС животных, проведенном по известному и предлагаемому способу, М±m | |||||
| Группа животных | вариант постановки НСТ | ||||
| спонтанный | Индуцированный | ||||
| известный способ | предлагаемый способ | ||||
| у.е. оп. пл. | у.е. оп. пл. | КС | у.е. оп. пл. | КС | |
| РИД-отрицательные | 207,6±32,66 | 208,4±12,33 | 1,11±0,12 | 209,2±20,9 | 1,28±0,22 |
| 986,8±39,5* | 1024±45,51* | 1,04±0,04* | |||
| Носители ВЛКРС | 268,33±9,84 | 259,12±9,59 | 1,0±0,04 | 236,37±9,07 | 0,77±0,06 |
| 882,75±44,0* | 1017±38,08* | 1,16±0,05* | |||
| Достоверность, Р | >0,05 | <0,01 | >0,05 | >0,05 | <0,05 |
| >0,05* | >0,05* | >0,05* | |||
| * результаты постановки НСТ известным способом с использованием одноволнового метода (630 нм) | |||||
Несколько иная картина наблюдается при постановке НСТ известным способом с использованием длины волны 630 нм. Отмечено недостоверное снижение показателей в спонтанном варианте (882,75±44,0, 986,8±39,5 у.е. оп. пл.; Р>0,05) при отсутствии выраженных изменений при стимуляции БЦЖ.
При постановке предлагаемым способом у инфицированных животных также установлено увеличение количества активированных нейтрофилов, однако не достигало достоверной разницы (236,37±9,07, 209,2±20,09 у.е. оп. пл.; Р>0,05).
Следует отметить, что важным показателем НСТ-теста явилось не столько его повышение в спонтанном и индуцированных вариантах, сколько соотношение между стимулированным и спонтанным, т.е. коэффициент стимуляции (КС). Так, у носителей ВЛКРС при постановке НСТ известным способом при использовании как одно-, так и двухволнового метода этот показатель изменялся незначительно, тогда как при постановке предлагаемым способом с высокой степенью достоверности уменьшался (0,77±0,07, 1,11±0,12; Р<0,05).
Таким образом, исходно низкий показатель стимулированной реакции по отношению к спонтанной у животных, инфицированных ВЛКРС, при постановке предлагаемым методом, свидетельствует о снижении резистентности организма и низкой микробицидной активности нейтрофилов и, как следствие, высокой чувствительности к инфекции ВЛКРС.
Пример 3. Проводят исследование крови у 20 коров из благополучного по лейкозу хозяйства и у 20 из неблагополучного по лейкозу хозяйства путем постановки реакции восстановления нитросинего тетразолия по известному способу и по предлагаемому способу. Вычисляют коэффициент стимуляции, по результатам которого животных делят на 3 группы. В 1-ю группу включают коров с низкими значениями коэффициента (КС≤0,95); во 2-ю - с КС от 0,96 до 1,10 и 3-ю - с высокими (КС≥1,11).
Полученные данные были сопоставлены с результатами диагностических исследований на лейкоз (табл.3, 4). С этой целью ставили реакцию иммунодиффузии (РИД), основанную на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота. Животных, сыворотка крови которых дали положительный результат в РИД, признавали зараженными вирусом лейкоза и исследовали гематологическим методом, заключающимся в подсчете лейкоцитов в единице объема крови. При обнаружении повышенного их количества выводили лейкоцитарную формулу и оценивали статус животного по лейкозу согласно «лейкозному ключу» как здорового, подозрительного по заболеванию лейкозом или больного лейкозом [Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота / Департамент ветеринарии, Минсельхоз России. - 2000. - №13-7-2/2130].
При исследовании сыворотки крови в РИД от коров из благополучного хозяйства носителей ВЛКРС не было выявлено.
| Таблица 3 | ||
| Значения коэффициента стимуляции у животных из благополучного хозяйства (n=20) |
||
| Группа животных | РИД (-) | % от общего числа |
| известный способ | ||
| 1-я группа (КС≤0,95) | 10 | 50 |
| 2-я группа (от 0,96 до 1,10) | 4 | 20 |
| 3-я группа (КС≥1,11) | 6 | 30 |
| предлагаемый способ | ||
| 1-я группа (КС≤0,95) | 2 | 10 |
| 2-я группа (от 0,96 до 1,10) | - | |
| 3-я группа (КС≥1,11) | 18 | 90 |
Из таблицы 3 видно, что у 90% животных из благополучного по лейкозу хозяйства при постановке НСТ-теста предлагаемым способом отмечена высокая микробицидная активность нейтрофилов (КС составил 1,11 и выше), тогда как при проведении НСТ-теста известным способом было установлено только 30% таких коров.
В неблагополучном хозяйстве при постановке известным способом (табл. 4) снижение коэффициента стимуляции ниже отметки 0,95 было отмечено у 12 из 20 животных (60%). При этом 8 животных являлись носителями ВЛКРС, а остальные 4 были РИД-отрицательными. В то же время при постановке предлагаемым способом со сниженным коэффициентом выявлено на 15% коров больше (75%), из них подавляющая часть была инфицирована ВЛКРС (11 из 15 голов), и только 4 животных были РИД-отрицательными.
Следует отметить, что среди 3-х животных с высоким значением коэффициента при постановке НСТ предлагаемым способом только у одного были обнаружены специфические антитела к антигенам ВЛКРС, при этом КС был резко повышен и составил 10,13. Дополнительным исследованием это животное было признано больным в гематологической стадии. Резкое повышение НСТ-положительных нейтрофилов и, как следствие, коэффициента стимуляции у больного лейкозом связано с развитием инфекционно-воспалительного осложнения. Об этом также могут свидетельствовать данные научной литературы [Тест восстановления нитросинего тетразолия у здоровых людей и больных острым лейкозом / В.Е. Логинский, В.В. Короткий // Лаб. дело. - 1978. - №1. - С.3-5].
| Таблица 4 | |||||
| Значения коэффициента стимуляции у животных из неблагополучного хозяйства (п=20) |
|||||
| Группа животных | РИД (-) | Носители ВЛКРС | Итого (%) | ||
| всего | в т.ч. гембольные | ||||
| известный способ | |||||
| 1-я группа (КС≤0,95) | 4 | 8 | - | 12(60%) | |
| 2-я группа (от 0,96 до 1,10) | 1 | 2 | - | 3(15%) | |
| 3-я группа (КС≥1,11) | 2 | 3 | 1 | 5(25%) | |
| предлагаемый способ | |||||
| 1-я группа (КС≤0,95) | 4 | 11 | - | 15(75%) | |
| 2-я группа (от 0,96 до 1,10) | - | 1 | - | 1(5%) | |
| 3-я группа (КС≥1,11) | 3 | 1 | 1 | 4(20%) | |
Менее точные результаты получены при проведении НСТ известным способом. Так, с высокой активностью нейтрофилов (КС≥1,11) было установлено 5 коров, из них носителями ВЛКРС являлись 3, в том числе гембольная (КС=16,7), как и в случае постановки реакции предлагаемым способом.
Таким образом, результаты оценки окислительно-восстановительного метаболизма нейтрофилов в НСТ-тесте у коров из благополучного и неблагополучного по лейкозу крупного рогатого скота позволяют прийти к выводу о том, что высокая чувствительность к инфекции ВЛКРС отмечается при значениях КС≤0,95. При этом предлагаемый способ позволяет более точно и достоверно проводить оценку чувствительности к инфекции ВЛКРС и дает возможность диагностировать развитие инфекционно-воспалительных процессов у больных лейкозом животных.
Claims (1)
- Способ оценки повышенной чувствительности крупного рогатого скота к лейкозной инфекции, включающий выделение нейтрофильных гранулоцитов из венозной крови крупного рогатого скота путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (плотностью 1,077 г/см3), внесение по 100 мкл клеточной взвеси в две параллельные лунки 96-луночного плоскодонного планшета для иммуноферментного анализа, в одну лунку планшета добавляют 50 мкл забуференного физиологического раствора или физиологического раствора (спонтанный НСТ-тест), а в другую - 50 мкл стимулятора (БЦЖ) в оптимальном разведении в забуференном физиологическом растворе или физиологическом растворе (индуцированный НСТ-тест), затем в обе лунки планшета добавляют по 50 мкл 0,15% раствора нитросинего тетразолия, перемешивают, инкубируют 20 минут при температуре 37°С, центрифугируют при 500 g 10 минут, отделяют надосадок, добавляют 200 мкл абсолютного этилового спирта и раствор центрифугируют 5 минут при 500 g, отделяют надосадочную жидкость, в клеточный осадок добавляют 200 мкл физиологического раствора, центрифугируют 5 минут при 500 g, добавляют в каждую лунку 130 мкл димексида и инкубируют при 60°С 20 минут, добавляют по 70 мкл 2 М раствора КОН, тщательно перемешивают, результаты реакции фиксируют с помощью иммунохимического анализатора и выражают в условных единицах оптической плотности, после учета реакции определяют коэффициент стимуляции, при этом при определении уровня индуцированной активности в лунку дополнительно вносят 50 мкл левамизола в конечной концентрации 0,5 мкг/мл, результаты реакции определяют по разнице экстинкций при длине волны 630 и 490 нм, коэффициент стимуляции (КС) определяется отношением индуцированного уровня клеточной активности к спонтанному уровню, при КС ≤0,95 животное считают с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции крупного рогатого скота.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013158431/15A RU2564437C2 (ru) | 2013-12-26 | 2013-12-26 | Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013158431/15A RU2564437C2 (ru) | 2013-12-26 | 2013-12-26 | Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013158431A RU2013158431A (ru) | 2015-07-20 |
| RU2564437C2 true RU2564437C2 (ru) | 2015-09-27 |
Family
ID=53611231
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013158431/15A RU2564437C2 (ru) | 2013-12-26 | 2013-12-26 | Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2564437C2 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996042015A2 (en) * | 1995-06-08 | 1996-12-27 | Coulter International Corp. | Reagent and method for differential determination of leukocytes in blood |
| RU2408018C2 (ru) * | 2008-12-22 | 2010-12-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИБТЖ СО Россельхозакадемии) | Способ оценки иммунного статуса крупного рогатого скота при лейкозе |
| RU2465588C1 (ru) * | 2011-04-22 | 2012-10-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственный наук (ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
-
2013
- 2013-12-26 RU RU2013158431/15A patent/RU2564437C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996042015A2 (en) * | 1995-06-08 | 1996-12-27 | Coulter International Corp. | Reagent and method for differential determination of leukocytes in blood |
| RU2408018C2 (ru) * | 2008-12-22 | 2010-12-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Сибирского отделения Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИБТЖ СО Россельхозакадемии) | Способ оценки иммунного статуса крупного рогатого скота при лейкозе |
| RU2465588C1 (ru) * | 2011-04-22 | 2012-10-27 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственный наук (ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ВЛАСЕНКО B.C. И ДР. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе: методические рекомендации. ГНУ СО Россельхозакадемии. Омск, 2010. с.1-31. МОРОЗОВА О.В. И ДР. Оценка чувствительности лимфоцитов к левамизолу у крупного рогатого скота при лейкозе// Ветеринарный врач, 2012, N5, с.36-39. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013158431A (ru) | 2015-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kettner et al. | Thrombocytopaenia in canine babesiosis and its clinical usefulness | |
| RU2564437C2 (ru) | Способ определения общей окислительно-восстановительной активности фагоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия при лейкозе крупного рогатого скота | |
| RU2180116C1 (ru) | Способ оценки влияния экологической обстановки на состояние иммунного статуса населения | |
| RU2465588C1 (ru) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота | |
| RU2084894C1 (ru) | Способ диагностики сифилиса | |
| Knotkova et al. | Blood profile in captive adult male leopard geckos (Eublepharis macularius). | |
| RU2549467C1 (ru) | Способ определения атерогенности иммунных комплексов | |
| Otlu et al. | CRP and LDH Levels Can Be Used for Support the COVID-19 Diagnose in Intensive Care Unit Patients | |
| Makdam et al. | Relationship between Cystatin C with some hematological and biochemical parameters in neonatal calf diarrhea | |
| Rajković et al. | “Slow kill” treatment reduces DNA damage in leukocytes of dogs naturally infected with Dirofilaria immitis | |
| EP4244622B1 (en) | Method for diagnosing and monitoring sepsis | |
| US11913960B2 (en) | ELISA assay for measuring function of properdin and kits for conducting ELISA assays using anti-properdin antibodies | |
| RZ et al. | Detection of Partial G6PD Deficiency using OSMMR2000-D Kit with Hb Normalization. | |
| RU2143696C1 (ru) | Способ выявления сенсибилизации к лекарственным аллергенам | |
| Ajayi Ajetomobi et al. | Kidney Function in Children with Severe Malaria Seen at the University of Ilorin Teaching Hospital, Ilorin | |
| RU2310196C2 (ru) | Способ определения функциональной активности симпато-адреналовой системы | |
| Wagener et al. | Hyperfructosaminemia in alpacas (Vicugna pacos) is associated with hyperglycemia, hypofructosaminemia with decreased plasma proteins, and poor nutritional status | |
| RU2283498C1 (ru) | Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе | |
| RU2415423C2 (ru) | Способ определения функциональной активности нейтрофилов по реакции восстановления нитросинего тетразолия | |
| RU2549466C1 (ru) | Экспресс-способ определения атерогенности иммунных комплексов сыворотки крови человека | |
| RU2811001C1 (ru) | Способ прогнозирования эффекторной недостаточности цитотоксических клеток по увеличению концентраций в крови молекул scd54, scd56, scd71 | |
| Mondal et al. | Journal of Bioscience and Environment Research | |
| RU2008676C1 (ru) | Способ оценки дисфункции полиморфно-ядерных лейкоцитов при гнойно-септической инфекции | |
| RU2538685C1 (ru) | Способ экспресс-определения холестерина в иммунных комплексах | |
| Moez et al. | Assessment of Level of Serum Cardiac Troponin T in Neonates with Respiratory Distress Syndrome |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171227 |